專利名稱：微七皂甙及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中提取的具有藥用功效的組合物及其制備工藝。
背景技術(shù)：
植物三七是傳統(tǒng)名貴的中藥材，其中所含的有效藥用成分主要為三七皂甙，三七皂甙的應(yīng)用研究已多見報(bào)道，但對(duì)于三七的深層次研究還亟待進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種植物三七經(jīng)微生物發(fā)酵分離后提取的、具有藥用價(jià)值的組合物——微七皂甙，以及微七皂甙的制備工藝。
本發(fā)明所述的微七皂甙主要由Rg1、Rb1、Rd、Rg3、和Rh1人參皂甙元構(gòu)成，其中各人參皂甙元所占的重量百分比為Rg148-61％，Rb112-15％，Rd 10-12％，Rg34-5％，Rh15-6％，占主體成分的Rg1、Rb1、Rd含量總和≥70％。
本發(fā)明所述的微七皂甙系原植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)藥材(地下部分)經(jīng)土生曲霉(Aspergillus terreusThom)微生物固體發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物采用現(xiàn)代化學(xué)提取方法制備而成。發(fā)酵三七轉(zhuǎn)化的微七皂甙與原植物三七皂甙比較，其特點(diǎn)如下1、發(fā)酵使原三七植物總皂甙成分發(fā)生種類改變，由發(fā)酵前原三七成分(Rb1、Rd、RY-XVII、nR4、N-Fa、Re、Rg1、Rg2、Rh1、nR1、nR2、nR3、nR6)轉(zhuǎn)化為由Rb1、Rd、Rg3、Rg1、和Rh1為自然主體成分的微七皂甙。
2、發(fā)酵使原三七皂甙元Rg2、Re、nR1、nR2、nR3、nR6(人參三醇型)及RY-XVII、nR4、N-Fa(人參二醇型)等成分含量降低或消失。
3、微七皂甙的Rb1、Rg1、Rg3、Rd、和Rh1與原植物三七所含對(duì)應(yīng)人參皂甙元的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致。
4、發(fā)酵可改變原植物三七有效成分和含量；轉(zhuǎn)化形成具有抗血栓、抗腦缺血和腦缺氧作用顯著的天然藥物成分。
本發(fā)明所述的微七皂甙可單獨(dú)或者與其他成分一起作為藥物的主要藥用有效成分，經(jīng)藥效學(xué)試驗(yàn)證明所制成的藥物具有抗血小板、抗血栓形成和溶栓作用，對(duì)防治中風(fēng)、外周性血栓、腦缺血、腦缺氧等疾病有顯著功效。
本發(fā)明所述的微七皂甙的制備工藝由以下步驟組成一、取菌種土生曲霉Aspergillus terreus Thom，活化處理，采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-30℃±1℃，靜止培養(yǎng)時(shí)間72-120小時(shí)，采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度25-30℃±2℃，搖床培養(yǎng)時(shí)間72-120小時(shí)；二、取80-150目植物三七粉∶新鮮黃豆渣＝0.8-1.2∶1.2-0.8的重量比例，混合攪拌均勻，作為發(fā)酵基質(zhì)，控制水份為60-70％，PH自然，分裝于500-1000ml玻璃瓶中，封住瓶口置于121℃、15Pa壓力下殺菌0.5-1.5hr，冷卻至26-32℃；
三、在無菌狀態(tài)下將步驟(一)獲得的土生曲霉菌Aspergillusterreus液體種子按體積比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接入已消毒滅菌的發(fā)酵基質(zhì)中，充分拌勻后，封住瓶口，置于25-30℃±2℃的條件下靜止發(fā)酵10-15天，發(fā)酵第2-4天搖瓶一次；四、將步驟(三)得到的發(fā)酵物置于60℃溫度下烘干至恒重，控制水分含量不超過10％，干燥后即為三七發(fā)酵產(chǎn)物；五、稱取上述發(fā)酵產(chǎn)物，加入50-95％乙醇溶液，于70℃-90℃溫度水浴加熱回流浸提多次，每次回流時(shí)間3-5小時(shí)，過濾棄渣，浸提液在50-70℃溫度下減壓濃縮得提取液；六、將不含乙醇的濃縮提取液通過大孔樹脂柱層析，接著用水反復(fù)沖洗直至下滴的水變清為止，再用50-95％的食用乙醇沖洗大孔樹脂層析柱，直至下滴的乙醇洗脫液變清為止，收集50-95％濃度的乙醇洗脫液，于50-70℃溫度減壓濃縮洗脫液至干得粗提物，并稱其重量；七、按粗提物質(zhì)量∶95％食用乙醇的體積為1∶10-40的比例，加入95％食用乙醇溶解粗提物并過濾棄除沉淀物，按95％食用乙醇的體積∶丙酮的體積為1∶2-6的比例加入丙酮，充分?jǐn)嚢韬箪o置12-24hr，抽濾棄沉淀物，濾液在60℃下減壓濃縮至干得濃縮物；八、按粗提物的質(zhì)量∶95％食用乙醇的體積為1∶20-50比例加入95％食用乙醇溶解濃縮物，按發(fā)酵物質(zhì)量百分比加入8-10％的活性炭，置于80-90℃水浴回流1hr后，過濾棄除活性炭得脫色液；九、將經(jīng)活性炭脫色后的脫色濾液，于50-70℃下減壓濃縮至干后，置60℃溫度下烘干至恒重，即得微七皂甙。
本發(fā)明所述的菌種土生曲霉已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。
本發(fā)明所述的制備技術(shù)由兩部分組成，即微生物發(fā)酵工藝和化學(xué)提取工藝。通過土生曲霉菌的代謝過程，使得三七原皂甙成分的種類和藥用成分含量發(fā)生轉(zhuǎn)化或改變，形成自然搭配無人為修飾的具有抗血栓藥效顯著的新組方。化學(xué)提取制備技術(shù)，系三七發(fā)酵物經(jīng)過化學(xué)提取工藝，有效地分離制備出防止人類中風(fēng)疾病具有顯著藥效的新型藥物組分微七皂甙。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1土生曲霉(Aspergillus terreus Thom)是發(fā)酵植物三七，制備防治中風(fēng)疾病天然藥用成分既有特殊功效，又安全無毒的高效微生物。
取土生曲霉菌種，在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺(tái))，用接種針挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)96小時(shí)。取出活化96小時(shí)的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的一級(jí)種子固體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±1℃下培養(yǎng)96小時(shí)，即為土生曲霉菌一級(jí)種子。
采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘備用。取土生曲霉菌一級(jí)種子，在無菌條件下，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中，一級(jí)種子接種量為每支斜面接三個(gè)三角瓶，置28℃±2℃搖床培養(yǎng)96小時(shí)后，作為三七發(fā)酵二級(jí)種子用。
根據(jù)發(fā)酵規(guī)模大小，發(fā)酵料按重量比率，稱取50％三七粉(80-150目)，加入50％的新鮮黃豆渣，充分拌勻，發(fā)酵料水分不低于60-68％。三七發(fā)酵料配制好后，裝入500-1000毫升玻璃瓶中，塑料薄膜、牛皮紙封口，置滅菌鍋內(nèi)15磅滅菌60分鐘后，取出待冷卻至30-32℃，接入液體二級(jí)種子，二級(jí)種子接種量為5-10％(v/w)。搖勻后放置28-30℃±2℃下，靜止發(fā)酵12-15天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室保濕不低75-85％相對(duì)濕度，第2-3天分別進(jìn)行搖瓶一次，并注意檢查有無染菌-現(xiàn)象。發(fā)酵完畢，發(fā)酵產(chǎn)物置60℃下烘干，即得三七發(fā)酵產(chǎn)物。
取三七發(fā)酵產(chǎn)物若干，根據(jù)數(shù)量的多少，投入提取容器內(nèi)(工業(yè)用不朽鋼5噸或10噸提取罐)，按發(fā)酵產(chǎn)物干重與乙醇(60％濃度溶液)體積的比例，分別以1∶5(m/v)、1∶3、1∶3(m/v)分3次加入60％濃度的乙醇溶液，于80-90℃溫度水浴加熱回流浸提3-5小時(shí)，過濾棄渣，浸提液于50-70℃溫度下減壓(壓力0.1Pa)濃縮得提取液。采用101大孔樹脂(國產(chǎn))柱層析反復(fù)吸附提取液有效成分，以至使下滴的液體中不含泡沫。接著用水反復(fù)沖洗直至下滴的水變清為止。再用70％的食用乙醇沖洗大孔樹脂層析柱，直至下滴的乙醇洗脫液變清為止(顏色以用水沖洗時(shí)的終點(diǎn)作為參照)。收集70％濃度的乙醇洗脫液，于50-70℃溫度減壓(壓力0.1Pa)濃縮洗脫液至干得粗提物，并稱重量。
按1∶20(粗提物質(zhì)量∶95％食用乙醇的體積)比例，采用濃度為95％的乙醇溶劑溶解粗提物之后，以抽濾方式過濾粗提物溶解液，棄除沉淀物。以1∶4的比例(95％濃度的乙醇∶丙酮)對(duì)過濾液加入丙酮溶劑，即刻出現(xiàn)沉淀物，充分?jǐn)嚢桁o置12-24hr后。抽濾方式棄除沉淀物。并將濾液于60℃溫度下減壓(壓力0.1Pa)濃縮至干，即得濃縮物。濃縮物按1∶30-50的比例(粗提物的質(zhì)量∶95％濃度食用乙醇的體積)加乙醇溶解后，以8-10％的比例(粗提物質(zhì)量百分比)對(duì)濃縮物乙醇溶解液加入適量活性炭，于80-90℃溫度水浴回流1-2hr后，過濾棄除活性炭即得脫色液。將經(jīng)活性炭脫色后的脫色濾液，于50-70℃下減壓(壓力0.01Pa)濃縮至干，置60℃溫度下烘干至恒重，即得含量≥80％的微七皂甙。
權(quán)利要求
1.一種微七皂甙，其特征在于主要由Rg1、Rb1、Rd、Rg3、和Rh1人參皂甙元構(gòu)成，其中各人參皂甙元所占的重量百分比為Rg148-61％，Rb112-15％，Rd 10-12％，Rg34-5％，Rh15-6％，占主體成分的Rg1、Rb1、Rd含量總和≥70％。
2.按照權(quán)利要求1所述的微七皂甙的制備工藝，其特征在于由以下步驟組成一、取菌種土生曲霉Aspergillus terreus Thom，活化處理，采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-30℃±1℃，靜止培養(yǎng)時(shí)間72-120小時(shí)，采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度25-30℃±2℃，搖床培養(yǎng)時(shí)間72-120小時(shí)；二、取80-150目植物三七粉∶新鮮黃豆渣＝0.8-1.2∶1.2-0.8的重量比例，混合攪拌均勻，作為發(fā)酵基質(zhì)，控制水份為60-70％，PH自然，分裝于500-1000ml玻璃瓶中，封住瓶口置于121℃、15Pa壓力下殺菌0.5-1.5hr，冷卻至26-32℃；三、在無菌狀態(tài)下將步驟(一)獲得的土生曲霉菌Aspergillusterreus液體種子按體積比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接入已消毒滅菌的發(fā)酵基質(zhì)中，充分拌勻后，封住瓶口，置于25-30℃±2℃的條件下靜止發(fā)酵10-15天，發(fā)酵第2-4天搖瓶一次；四、將步驟(三)得到的發(fā)酵物置于60℃溫度下烘干至恒重，控制水分含量不超過10％，干燥后即為三七發(fā)酵產(chǎn)物；五、稱取上述發(fā)酵產(chǎn)物，加入50-95％乙醇溶液，于70℃-90℃溫度水浴加熱回流浸提多次，每次回流時(shí)間3-5小時(shí)，過濾棄渣，浸提液在50-70℃溫度下減壓濃縮得提取液；六、將不含乙醇的濃縮提取液通過大孔樹脂柱層析，接著用水反復(fù)沖洗直至下滴的水變清為止，再用50-95％的食用乙醇沖洗大孔樹脂層析柱，直至下滴的乙醇洗脫液變清為止，收集50-95％濃度的乙醇洗脫液，于50-70℃溫度減壓濃縮洗脫液至干得粗提物，并稱其重量；七、按粗提物質(zhì)量95％食用乙醇的體積為1∶10-40的比例，加入95％食用乙醇溶解粗提物并過濾棄除沉淀物，按95％食用乙醇的體積∶丙酮的體積為1∶2-6的比例加入丙酮，充分?jǐn)嚢韬箪o置12-24hr，抽濾棄沉淀物，濾液在60℃下減壓濃縮至干得濃縮物；八、按粗提物的質(zhì)量95％食用乙醇的體積為1∶20-50比例加入95％食用乙醇溶解濃縮物，按發(fā)酵物質(zhì)量百分比加入8-10％的活性炭，置于80-90℃水浴回流1hr后，過濾棄除活性炭得脫色液；九、將經(jīng)活性炭脫色后的脫色濾液，于50-70℃下減壓濃縮至干后，置60℃溫度下烘干至恒重，即得微七皂甙。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中提取的具有藥用功效的組合物及其制備工藝。本發(fā)明所述的微七皂甙主要由Rg
文檔編號(hào)C12P33/00GK1590556SQ0315768
公開日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日
發(fā)明者陳有為, 李治瀅, 楊麗源, 李紹蘭, 周斌, 張琦 申請(qǐng)人:云南省微生物研究所