專(zhuān)利名稱(chēng)：延胡索酸酶轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用延胡索酸酶轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸(下稱(chēng)LMA)的技術(shù)。
L-蘋(píng)果酸主要應(yīng)用于食品工業(yè)，它是一種優(yōu)良的酸味劑和保鮮劑，在各種果子酒，果子露、乳酸菌發(fā)酵飲料、人造奶油中添加LMA可保持天然果汁的風(fēng)味。LMA由于其特殊的酸味特點(diǎn)(酸味刺激較為緩慢，保留時(shí)間較長(zhǎng))越來(lái)越為許多消費(fèi)者所偏愛(ài)，近年來(lái)在食品工業(yè)上的應(yīng)用有逐漸取代檸檬酸的趨勢(shì)。LMA直接參與人體的新陳代謝，可用于治療貧血、肝功能不全和肝衰竭等疾病輔助劑，在醫(yī)藥工業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，LMA在印染工業(yè)和建筑業(yè)上也有其特殊用途。因此，當(dāng)前國(guó)際市場(chǎng)上對(duì)LMA的需求量逐漸地增加。
早在1921年，Yuill就報(bào)道過(guò)，在培養(yǎng)黃曲霉菌時(shí)，有少量蘋(píng)果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產(chǎn)生；1951年，Kitaharo等報(bào)道了核盤(pán)菌的蘋(píng)果酸發(fā)酵試驗(yàn)，1953年，Goodin報(bào)道了短密青霉具有產(chǎn)生蘋(píng)果酸的能力；日本學(xué)者從50年代末起，對(duì)蘋(píng)果酸發(fā)酵進(jìn)行了大力研究，阿部重雄等研究的發(fā)酵法生產(chǎn)蘋(píng)果酸最高濃度達(dá)50g/l。目前，蘋(píng)果酸的生產(chǎn)方法主要有以下幾種①馬來(lái)酸或延胡索酸通過(guò)水合反應(yīng)的化學(xué)合成法；②以延胡索酸為原料的酶轉(zhuǎn)化法；③直接發(fā)酵法(包括混合發(fā)酵和一步發(fā)酵技術(shù))和固定化法。但是從相關(guān)資料檢索表明目前LMA采用固定化酶法和發(fā)酵法，其中(1)固定化法不足之處LMA生產(chǎn)之前先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、過(guò)濾或離心、洗滌、細(xì)胞破碎，獲得延胡索酸酶，然后再進(jìn)行包埋等，工藝操作程序繁雜。而且由于延胡索酸酶離開(kāi)生物體又易于變性失活，造成轉(zhuǎn)化不徹底，殘余底物量大，易于超標(biāo)，產(chǎn)品出口受到限制。所以固定化技術(shù)對(duì)環(huán)境條件要求較高，成本居高不下，影響工業(yè)化生產(chǎn)；(2)發(fā)酵技術(shù)中的混合發(fā)酵法劣勢(shì)生產(chǎn)LMA時(shí)采用兩個(gè)菌株混合發(fā)酵，因?yàn)楦骶暌蟮臓I(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件不同而使生長(zhǎng)和合成代謝不易控制，致使轉(zhuǎn)化率和LMA產(chǎn)量均不高，最終也難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；(3)一步發(fā)酵法的缺點(diǎn)是在培養(yǎng)基中接入菌種的同時(shí)加入底物(延胡索酸)進(jìn)行共同發(fā)酵，由于菌體生長(zhǎng)、延胡索酸酶合成及底物轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)MA三個(gè)階段的生物學(xué)過(guò)程各自都需要最適的營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，因?yàn)樵谝粋€(gè)培養(yǎng)液中同時(shí)發(fā)酵和轉(zhuǎn)化而得不到滿足和難以控制，造成LMA合成水平低(8.5％)，轉(zhuǎn)化率不高(88％)、生產(chǎn)周期長(zhǎng)(90h)、成本高，限制工業(yè)化生產(chǎn)。(4)目前國(guó)內(nèi)外也見(jiàn)到純細(xì)胞轉(zhuǎn)化延胡索酸為L(zhǎng)MA的報(bào)導(dǎo)，但該法不足之處發(fā)酵結(jié)束后，需將發(fā)酵液離心或過(guò)濾、細(xì)胞洗滌、重新懸浮、再與延胡索鹽溶液混合，調(diào)節(jié)pH，轉(zhuǎn)化操作工藝繁瑣，轉(zhuǎn)化條件不成熟，因此轉(zhuǎn)化率低(90.8％)、LMA合成水平低(10.96％)、發(fā)酵周期長(zhǎng)(96h)、成本仍然居高不下。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供高效轉(zhuǎn)化底物為L(zhǎng)MA的新技術(shù)。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)首先將延胡索酸溶于NH4OH溶液中，制備成延胡索酸銨溶液(底物)；將霉菌接入培養(yǎng)基后，進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，合成延胡索酸酶，當(dāng)發(fā)酵液菌體內(nèi)酶活達(dá)到120-200u/100ml時(shí)，將不經(jīng)離心、洗滌，重懸浮和過(guò)濾的發(fā)酵液與底物一一延胡索酸銨溶液按1∶0.5-1.2直接混合，調(diào)節(jié)pH7.2-8.0，控制攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，保持溫度30℃，經(jīng)20h轉(zhuǎn)化即完成LMA的合成。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
附

圖1中，首先將延胡索酸溶于NH4OH溶液中，制成延胡索酸銨溶液(底物)；其次利用常規(guī)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)菌種種子，然后移入大罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液菌體內(nèi)酶活達(dá)到產(chǎn)酶高峰期后(120-200u/100ml)，將發(fā)酵液與延胡索酸銨溶液按1∶0.5-1.2混合，在pH7.2-8.0、攪拌轉(zhuǎn)速60r/min、溫度30℃的條件下進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化，即完成LMA的合成。
實(shí)施例1
首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升40％NH4OH溶液中，制成延胡索酸銨溶液；培養(yǎng)菌種種子，然后移入大罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液菌體酶活達(dá)到120u/100ml時(shí)，將發(fā)酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶0.5，調(diào)節(jié)pH8.0，攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對(duì)底物作用時(shí)間20h，即完成LMA的合成。
實(shí)施例2首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升50％NH4OH溶液中，制成延胡索酸銨溶液；培養(yǎng)菌種種子，然后移入大罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液酶活達(dá)到140u/100ml時(shí)，將發(fā)酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶0.8，調(diào)pH7.5，攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對(duì)底物作用時(shí)間20h，即完成LMA的合成。
實(shí)施例3首先取30公斤的延胡索酸溶于30立升60％NH4OH溶液中，制成延胡索酸銨溶液；培養(yǎng)菌種種子，然后移入大罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液酶活達(dá)到200u/100ml，將發(fā)酵液與底物——延胡索酸銨溶液混合，混合比例為1∶1.2，調(diào)pH7.2，攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，邊加邊攪拌，溫度保持30℃，酶對(duì)底物作用時(shí)間20h，即完成LMA的合成。
本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)和效益(1)本發(fā)明是單菌發(fā)酵，培養(yǎng)方式采用菌種培養(yǎng)和底物轉(zhuǎn)化分開(kāi)進(jìn)行，菌種生長(zhǎng)和延胡索酸酶合成過(guò)程無(wú)底物的干擾，使延胡索酸酶大量合成(增加2-3倍)，加入底物的數(shù)量可以根據(jù)產(chǎn)酶量由舊工藝10％增加到25-33％，由于滿足各自生物學(xué)階段的最適條件，發(fā)酵周期由原來(lái)的90h縮短至35h。(2)轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)酵液(含菌體酶)與底物溶液直接混合，免去純細(xì)胞轉(zhuǎn)化法中的離心、洗滌、細(xì)胞重新懸浮或細(xì)胞包埋等繁瑣工藝，操作簡(jiǎn)便，工藝簡(jiǎn)單，耗能少，周轉(zhuǎn)率高。(3)酶對(duì)底物轉(zhuǎn)化過(guò)程可以在最優(yōu)化條件下進(jìn)行，沒(méi)有其他生物學(xué)反應(yīng)的干擾，轉(zhuǎn)化率高，由舊工藝的88％提高到100-106％，LMA產(chǎn)量可達(dá)30％以上。(4)由于轉(zhuǎn)化徹底，殘留延胡索酸少、產(chǎn)品質(zhì)量符合出口標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種利用延胡索酸酶轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的技術(shù)，其特征在于首先將延胡索酸溶于NH4OH溶液中制備成延胡索酸鹽溶液，按1∶0.5-1.2的比例直接與含有足夠延胡索酸酶的發(fā)酵液混合轉(zhuǎn)化，制備L-蘋(píng)果酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于發(fā)酵液中菌體細(xì)胞內(nèi)含延胡索酸酶為120-200u/100ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于發(fā)酵液與延胡索酸鹽溶液混合前不經(jīng)離心、洗滌，重懸浮和過(guò)濾，混合時(shí)邊加邊攪拌，控制攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，調(diào)節(jié)pH至7.2-8.0，溫度保持在30℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間20h。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用延胡索酸酶轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)L－蘋(píng)果酸(下稱(chēng)LMA)的技術(shù)。本發(fā)明將延胡索酸溶于濃度為40－60％NH
文檔編號(hào)C12P7/40GK1523115SQ0315922
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月4日
發(fā)明者施巧琴, 吳松剛, 周曉蘭, 謝必峰, 黃建忠 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)