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      作為膀胱癌的分子標(biāo)記的肝癌上升-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)基因的制作方法

      文檔序號(hào):423819閱讀:257來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):作為膀胱癌的分子標(biāo)記的肝癌上升-調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)基因的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種人類(lèi)肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因,在一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的偵測(cè)、初步篩選與監(jiān)測(cè)中,以作為一分子標(biāo)記的使用,其中,自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體所取得的一樣品內(nèi)所偵測(cè)到的人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn),是為有膀胱癌存在的表征。本發(fā)明因此提供一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌,特別是膀胱移形上皮癌(TCC)的有效方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種具高精確性與方便性的用于偵測(cè)、初步篩選與監(jiān)測(cè)一被懷疑的個(gè)體體內(nèi)的泌尿(urinary)TCC的非侵襲性方法,其中一個(gè)取自一被懷疑的人類(lèi)個(gè)體的尿液樣品被分析以檢測(cè)該人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn),該基因表現(xiàn)的存在是有泌尿TCC存在的表征。
      背景技術(shù)
      泌尿上皮癌(urothelial carcinoma)是泌尿道的第二最常見(jiàn)的惡性腫瘤,并在所有泌尿道腫瘤當(dāng)中位居第二名的死因(Konety BR and Getzenberg RHUrine basedmarkers of urological malignancy.J Urol 165600-611,2001)。膀胱的移形上皮癌(TCC)與90%以上的泌尿上皮贅生物有關(guān),且其表示具有低度惡性潛質(zhì)的乳突狀表面損害或是會(huì)為侵襲性與致死性的高度腫瘤。當(dāng)膀胱癌在一局部化階段被早期檢測(cè)出時(shí),5年的存活率為94%。一旦該疾病已區(qū)域性地或遠(yuǎn)端地?cái)U(kuò)散時(shí),五年的存活率會(huì)分別地掉落至49%與6%(Droller MJIndividualizing the approach to invasive bladder cancer.Contemp.Urol.,July/August,pp.54-61,1990)。因此,在癌細(xì)胞有時(shí)間去改變其行為而成為有侵襲性之前,能檢測(cè)出表層癌復(fù)發(fā)的早期現(xiàn)象,是重要的。
      在經(jīng)排定的追蹤處理程序下的以往細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞鏡檢,是用于帶有泌尿TCC的病患的監(jiān)視的主要方法。對(duì)于低程度腫瘤使用,由于被排泄出的尿的細(xì)胞學(xué)的低敏感性,需要經(jīng)常使用非侵襲性的細(xì)胞鏡檢,因而在細(xì)胞鏡檢期間引發(fā)由尿道器械所致的有關(guān)聯(lián)的不舒服以及感染的潛在危險(xiǎn)性。一種在早期階段能特別地檢測(cè)出膀胱癌的敏感的非侵襲性檢驗(yàn)試驗(yàn)的發(fā)展,會(huì)經(jīng)由較早開(kāi)始治療而改善臨床上的結(jié)果。
      發(fā)明名稱(chēng)為“用于檢測(cè)癌癥的方法與探針組”的US 6,376,188、發(fā)明名稱(chēng)為“用于檢測(cè)尿液中的核酸序列的方法”的US 6,251,638以及發(fā)明名稱(chēng)為“用于保護(hù)尿液中的核酸序列的方法”的US 6,287,820已各別地揭示使用由染色體探針?biāo)鶚?gòu)成的套組來(lái)檢測(cè)一尿液樣品的膀胱癌檢驗(yàn)。
      發(fā)明名稱(chēng)為“比較性基因體雜合(CGH)”的US 6,335,167揭示藉由檢測(cè)核酸序列復(fù)本數(shù)目的膀胱癌檢驗(yàn),特別是偵測(cè)一測(cè)試樣品內(nèi)一獨(dú)特序列在至少一個(gè)擇自于下列群組中的位置的擴(kuò)增人類(lèi)第8染色體的q21、人類(lèi)第13染色體的q31-qter、人類(lèi)第7染色體的p15-pter、人類(lèi)第8染色體的q24-qter、人類(lèi)第11染色體的cen-p13以及人類(lèi)第9染色體的q13-qter。
      在發(fā)明名稱(chēng)為“用于檢測(cè)細(xì)胞增殖性障礙的方法”的US 6,291,163專(zhuān)利案揭示藉由偵測(cè)核酸序列來(lái)檢驗(yàn)一個(gè)體體內(nèi)的癌癥(包含膀胱癌)與前期-癌性,其特征在于下列步驟(a)在一對(duì)于該個(gè)體而言是為異種胚子的基因位置處擴(kuò)增試驗(yàn)樣品DNA,其中該基因位置包含有第一與第二對(duì)偶基因,該基因位置包含有微衛(wèi)星DNA,其中該試驗(yàn)樣品DNA是來(lái)自于一流入至該試驗(yàn)樣品內(nèi)的器官的細(xì)胞,其中該試驗(yàn)樣品是擇自于該個(gè)體所包含下列的群組尿液、痰、膽汁、糞便、唾液、淚液、血清與血漿;以及(b)藉由比較存在于該第一對(duì)偶基因處的微衛(wèi)星DNA的位準(zhǔn)相對(duì)于存在于該第二對(duì)偶基因處的微衛(wèi)星DNA的位準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)該基因位置處的一對(duì)偶基因不平衡,其中有一對(duì)偶基因不平衡是有癌癥或是前期-癌性的表征。
      發(fā)明名稱(chēng)為“用于尿液樣品中的膀胱癌早期檢驗(yàn)的方法與裝置”的WO 01/86288揭示一種用于一尿液樣品的膀胱癌早期檢驗(yàn)的方法,其包含一將萃取自存在于尿液內(nèi)的細(xì)胞的RNA加以擴(kuò)增的步驟,此為藉由使用一用于染色體端粒酶的催化組份的訊息RNA的標(biāo)記、一用于β-肌動(dòng)蛋白以證明RNA的易取得性與作為定量評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn),并組合以至少一擇自于下列群組中的額外標(biāo)記一用于一屬于細(xì)胞角蛋白家族的蛋白質(zhì)的標(biāo)記,以及一適用于檢測(cè)與贅生性浸潤(rùn)有關(guān)的發(fā)炎細(xì)胞的淋巴細(xì)胞標(biāo)記;以及一用以檢測(cè)被擴(kuò)增的物質(zhì)的最終步驟。
      發(fā)明名稱(chēng)為“癌癥的檢驗(yàn)與治療”的WO 99/63110揭示一種用于檢驗(yàn)一人類(lèi)病患的膀胱癌的方法,其包含下列步驟(i)自一病患的膀胱,較佳地是從尿道上皮(urothelium),取得一含有核酸及/或蛋白質(zhì)的樣品;以及(ii)檢測(cè)該樣品是否含有一與膀胱癌有關(guān)的Pax5核酸或蛋白質(zhì)。
      在發(fā)明名稱(chēng)為“膀胱的移形上皮癌的生物標(biāo)記”的WO 02/27329揭示可被使用作為膀胱移形上皮癌(TCC)檢驗(yàn)的一輔佐物的蛋白質(zhì)標(biāo)記、方法與套組,該案使用有差別地存在于TCC病患的樣品與一對(duì)照組(例如測(cè)不到有TCC的個(gè)體)內(nèi)的標(biāo)記。
      US 6,335,170揭示一種用于檢測(cè)一尿道上皮或膀胱癌細(xì)胞的表現(xiàn)形式的方法,其包含偵測(cè)一含有尿道上皮或膀胱癌細(xì)胞的樣品內(nèi)的一或多個(gè)基因的表現(xiàn),藉此,一第一態(tài)樣的表現(xiàn)被形成;將該第一態(tài)樣的表現(xiàn)扣除掉一第二態(tài)樣的表現(xiàn),其中該第二態(tài)樣是藉由使用該一或多個(gè)基因以及一包含主要為皮下黏膜、平滑肌或結(jié)締組織細(xì)胞的樣品而被形成,該扣除步驟形成一反映出尿道上皮或膀胱癌細(xì)胞的表現(xiàn)的第三態(tài)樣的表現(xiàn),而與存在于該樣品內(nèi)的皮下黏膜、平滑肌或結(jié)締組織細(xì)胞的比例無(wú)涉。
      其他針對(duì)膀胱癌的相關(guān)研究包含Konety BR and Getzenberg RHUrine basedmarkers of urological malignancy.J Urol 1 65600-611,2001;Droller MJIndividualizingthe approach to invasive bladder cancer.Contemp.Urol.,July/August,pp.54-61,1990;Nomura N,Miyajima N,Sazuka T,等人Prediction of the coding sequences of unidentifiedhuman genes.I.The coding sequences of 40 new genes(KIAA0001-KIAA0040)deducedby analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell lineKG-1.DNA Res 127-35,1994;Bassal S,Nomura N,Venter D,等人Characterization ofa novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlg1.Genomics 775-7,2001;Ellis WJ,Blumenstein BA,Ishak LM,等人Clinical evaluation of the BTA TRAKassay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients withrecurrent bladder tumors.The Multi Center Study Group.Urology 50882-887,1997;Sarosdy MF,Hudson MA,Ellis WJ,等人Improved detection of recurrent bladder cancerusing the Bard BTA stat Test.Urology 50349-353,1997;Seripa D,Parrella P,Gallucci M,等人Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatelliteanalysis of cells exfoliated in urine.Int J Cancer 95364-369,2001;Ponsky LE,Sharma S,Pandrangi L,等人Screening and monitoring for bladder cancerrefining the use ofNMP22.J Urol 16675-78,2001;Konety BR,Nguyen TS,Dhir R,等人Detection ofbladder cancer using a novel nuclear matrix protein,BLCA-4.Clin Cancer Res 62618-2625,2000;Rotem D,Cassel A,Lindenfeld N,等人Urinary cytokeratin 20 as a markerfor transitional cell carcinoma.Eur Urol 37601-604,2000;Sanchez-Carbayo M,UrrutiaM,Gonzalez de Buitrago JM,等人Evaluation of two new urinary tumor markersbladdertumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer.Clin Cancer Res.63585-3594,2000;Sanchez-Carbayo M,Urrutia M,Silva JM,等人Urinary tissuepolypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer.Urology 55526-532,2000;Smith SD,Wheeler MA,Plescia J,等人Urine detection of survivin and diagnosis ofbladder cancer.JAMA 285324-328,2001。
      不論如何,就申請(qǐng)人所知,以上所引述的文獻(xiàn)資料沒(méi)有一者曾報(bào)導(dǎo)過(guò)一HURP基因在膀胱癌或泌尿上皮癌中的表現(xiàn)。申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn),TCC組織樣品展現(xiàn)HURPmRNA轉(zhuǎn)錄品的可重復(fù)且顯著性的表現(xiàn)。根據(jù)此一發(fā)現(xiàn),是有可能藉由分析一人類(lèi)HURP基因在一生物性樣品(例如腫瘤組織與被排泄出的尿液)中的表現(xiàn),來(lái)發(fā)展出一用于偵測(cè)、初步篩檢或監(jiān)測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的精確、方便與非侵襲性方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      因此,在本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的方法,其包含下列步驟自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體取得一生物性樣品;以及偵測(cè)一人類(lèi)肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因于該樣品內(nèi)的表現(xiàn),該人類(lèi)HURP基因被偵測(cè)到的表現(xiàn)是為有膀胱癌存在的表征。
      在第二方面,本發(fā)明提供一種用于監(jiān)測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的方法,其包含下列步驟定期地自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體取得一生物性樣品;以及偵測(cè)一人類(lèi)HURP基因于該樣品內(nèi)的表現(xiàn),該人類(lèi)HURP基因被偵測(cè)到的表現(xiàn)是為有膀胱癌存在的表征。
      在一第三方面,本發(fā)明提供一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的引子(即引物)組,其包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      在一第四方面,本發(fā)明提供一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的檢驗(yàn)套組,其包含至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì),各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸。
      下面結(jié)合附圖及實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明,所以本發(fā)明在上述以及其他目的與特征,可借由參照下文的描述、隨文檢附的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍和伴隨的圖式而變得更為明顯,附圖中


      圖1顯示人類(lèi)HURP基因的核苷酸序列的全長(zhǎng)(序列編號(hào)1),其中互補(bǔ)于四個(gè)根據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引子的核苷酸序列被劃底線以及以粗體顯示;圖2顯示一被使用于下述實(shí)施例中的載體pET32a(Novagen Inc.)的限制圖譜,其中BamHI的限制位址被使用來(lái)插入該人類(lèi)HURP基因的一全長(zhǎng)核苷酸序列;
      圖3顯示在TCC組織中的HURP的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析,其中N=腫瘤鄰近組織,T=腫瘤組織,以及294、306、307、315、317、319、320、321、322、327、335與337=病患編號(hào);圖4顯示在TCC組織中的β-肌動(dòng)蛋白的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析,其中N=腫瘤鄰近組織,T=腫瘤組織,以及294、306、307、315、317、319、320、321、322、327、335與337=病患編號(hào);圖5顯示5個(gè)取自于良性攝護(hù)腺肥大癥病患的攝護(hù)腺泌尿上皮樣品中的人類(lèi)HURP基因表現(xiàn)的RT-PCR分析,其中左半部是為β-肌動(dòng)蛋白(307 bp),右半部為HURP(370bp);N1、N2、N3、N4與N5=5個(gè)良性攝護(hù)腺肥大癥(BPH)樣品;NC=負(fù)對(duì)照組;以及M表示呈堿基對(duì)的分子量標(biāo)記;圖6顯示被排泄出的尿液(void urine)樣品中的HURP的RT-PCR分析,其中2、6、7、8、14、15、20、5、10、11、12、13、16與18=病患編號(hào);NC=負(fù)對(duì)照組;以及M表示呈堿基對(duì)的分子量標(biāo)記;以及圖7顯示被排泄出的尿液(void urine)樣品中的β-肌動(dòng)蛋白的RT-PCR分析,其中2、6、7、8、14、15、20、5、10、11、12、13、16與18=病患編號(hào);NC=負(fù)對(duì)照組;以及M表示呈堿基對(duì)的分子量標(biāo)記。
      具體實(shí)施方案于細(xì)胞周期調(diào)控與凋亡(apoptosis)中所涉及的基因與蛋白質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)在癌癥的發(fā)展上是重要的。對(duì)于會(huì)控制細(xì)胞周期與凋亡的細(xì)胞的組份的確認(rèn),在本技藝中存在有一持續(xù)性需要。
      具有一如序列編號(hào)1中所描述的全長(zhǎng)核苷酸序列的人類(lèi)肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因(NCBI寄存編號(hào)AB076695)首先為周成功等人于肝癌研究中被確認(rèn)是一涉及細(xì)胞生長(zhǎng)的新穎癌癥-相關(guān)基因。在周成功的肝細(xì)胞癌癥研究中,從有關(guān)于特別是存在于人類(lèi)HCC組織的cDNA存庫(kù)中的新穎基因以及與在微陣列資料庫(kù)中的細(xì)胞周期依賴(lài)型表現(xiàn)的研究,一個(gè)新穎的細(xì)胞周期調(diào)控基因(CCRg)被鑒定出是為肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因(Chou等人,論文手稿被送件以供發(fā)表)。
      令人驚訝地,申請(qǐng)人首次發(fā)現(xiàn)到人類(lèi)HURP基因?qū)τ诎螂装┛勺鳛橐环N有力的分子標(biāo)記,并且可以將人類(lèi)HURP基因使用于一非侵襲性膀胱檢驗(yàn)測(cè)試,以足以敏感地檢測(cè)低程度的膀胱腫瘤并特別的排除掉大部分的非癌癥或是臨床上非具意義的病患。
      根據(jù)本發(fā)明,此處提供一種用于偵測(cè)、初步篩選或監(jiān)測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌,其包含下列步驟
      自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體取得一生物性樣品;以及偵測(cè)一人類(lèi)肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因于該樣品內(nèi)的表現(xiàn),該人類(lèi)HURP基因被偵測(cè)到的表現(xiàn)是為有膀胱癌存在的表征。
      本案方法可被應(yīng)用于膀胱的移形上皮癌(TCC)的偵測(cè)、初步篩選或監(jiān)測(cè)。
      較佳地,本案方法是使用一個(gè)包含有擇自于下列群組中的細(xì)胞的生物性樣品來(lái)進(jìn)行泌尿上皮癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞或此二者的一組合。
      較佳地,該生物性樣品是擇自于由下列所構(gòu)成的群組尿液、泌尿上皮生物檢體、血液、血漿與血清。在本發(fā)明的一較佳具體例中,該生物性樣品是為尿液。
      該人類(lèi)HURP基因具有一如圖1與序列編號(hào)1中所描述的核苷酸序列,而根據(jù)該核苷酸序列,可雜合至一人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸的寡核苷酸可被設(shè)計(jì)用來(lái)當(dāng)作一個(gè)使用生物技術(shù)領(lǐng)域所熟知的以往方法學(xué)來(lái)偵測(cè)該基因的表現(xiàn)的檢驗(yàn)探針或引子。
      作為一示范例,如圖1所示,申請(qǐng)人已設(shè)計(jì)出4個(gè)可用于本案用于偵測(cè)膀胱癌的方法中的引子,其包含第一引子對(duì)順向引子1→5’-ggatccaatagacactttggtttg-3’(序列編號(hào)2)反向引子1→5’-ggatcccacctttccttctggttc-3’(序列編號(hào)3)第二引子對(duì)順向引子2→5’-caacgaaaacagatgctc-3’(序列編號(hào)4)反向引子2→5’-tgagtagctgatcgagtc-3’(序列編號(hào)5)被預(yù)期的是,該順向引子1可與該反向引子2配對(duì),且該順向引子2可與該反向引子1配對(duì)。
      根據(jù)本發(fā)明,人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn)是藉由一來(lái)自人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品或一由人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品所轉(zhuǎn)譯出的蛋白質(zhì)的分析而被檢測(cè)。
      由人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品所轉(zhuǎn)譯出的蛋白質(zhì)的檢測(cè),可藉由使用生物技術(shù)領(lǐng)域所熟知的以往方法學(xué)而被進(jìn)行。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,人類(lèi)HURP基因表現(xiàn)的檢測(cè)是藉由檢測(cè)該生物性樣品內(nèi)的人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在而被進(jìn)行。
      較佳地,人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在是使用下列方法學(xué)中的至少一者而被進(jìn)行雜合、循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(cycling probe reaction)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、多重PCR聚合酶鏈反應(yīng)-單股構(gòu)造多形性、連接酶連鎖反應(yīng)(LCR),以限制片段長(zhǎng)度多形性核酸序列為主的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA),以及轉(zhuǎn)錄-調(diào)節(jié)的擴(kuò)增反應(yīng)(TMA)。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的檢測(cè)是使用RT-PCR而被進(jìn)行。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的檢測(cè)是藉由下列步驟而被進(jìn)行(a)自該生物樣品萃取出總RNA;(b)將源自步驟(a)的被萃取的RNA引至一種使用至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)處理,各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸;以及(c)偵測(cè)是否有一具有一核苷酸序列相同于或互補(bǔ)于該人類(lèi)HURP基因的核苷酸序列的一部分的RT-PCR產(chǎn)物已從步驟(b)的RT-PCR處理被生成,該RT-PCR產(chǎn)物的存在是為有膀胱癌存在的表征。
      較佳地,被使用于步驟(b)中的每一個(gè)引子會(huì)雜合至人類(lèi)HURP基因的至少18個(gè)核苷酸。
      較佳地,被使用于步驟(b)中的該至少一個(gè)引子對(duì)包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      較佳地,被使用于步驟(b)中的該至少一個(gè)引子對(duì)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的反向引子。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,步驟(b)中的RT-PCR處理包含一個(gè)使用一第一引子對(duì)的第一擴(kuò)增反應(yīng),該第一引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2的核苷酸序列的第一順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)3的核苷酸序列的第一反向引子;以及一個(gè)使用一第二引子對(duì)的第二擴(kuò)增反應(yīng),該第二引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的第二順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的第二反向引子。
      根據(jù)本發(fā)明,此處提供一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的引子組,其包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,該順向引子具有如序列編號(hào)2中所描述的核苷酸序列。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,該順向引子具有如序列編號(hào)4中所描述的核苷酸序列。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,該反向引子具有如序列編號(hào)4中所描述的核苷酸序列。
      在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中,該反向引子具有如序列編號(hào)5中所描述的核苷酸序列。
      根據(jù)本發(fā)明,此處提供一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的檢驗(yàn)套組,其包含至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì),各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸。
      在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中,該檢驗(yàn)套組包含一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2的核苷酸序列的第一順向引子以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)3的核苷酸序列的第一反向引子的第一引子對(duì),以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的第二順向引子以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的第二反向引子的第二引子對(duì)。
      除了上述以外,那些熟知此項(xiàng)技術(shù)人士會(huì)了解,落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種不同應(yīng)用包括使用任一種形式的評(píng)估分析。
      例如,RNA與蛋白質(zhì)可使用本技藝所知的技術(shù)從一試驗(yàn)樣品而被分離與分析。例如,他們可由新鮮或是經(jīng)冷凍的生物檢體、被福馬林固定的組織,以及諸如血液、血漿、血清、尿液或唾液的體液而被分離。
      雖可使用RT-PCR,其他技術(shù)也被預(yù)期。這些包含其他用于分析特定的mRNA物種的技術(shù),包括PCR、在原位雜合的巢式PCR、北方點(diǎn)墨法、高密度表現(xiàn)陣列、微陣列;還有用于分析特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的技術(shù),例如酵素連結(jié)免疫吸附法(ELISA)、西方氏點(diǎn)墨法與酵素分析。
      本發(fā)明將以下面實(shí)施例來(lái)作更詳細(xì)的說(shuō)明,該等實(shí)施例只是為例示說(shuō)明的目的,而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明的范圍的限制。
      實(shí)施例1HURP基因表現(xiàn)的RT-PCR分析實(shí)驗(yàn)材料與方法病患特征80個(gè)取自尿道的TCC樣品是藉由于1998年3月至2001年9月間在奇美醫(yī)學(xué)中心所做的膀胱切除術(shù)與尿道腫瘤切除術(shù)而被獲得。遠(yuǎn)端的總體正常組織也被取得以供分析,且其等被當(dāng)作是腫瘤-鄰近組織樣品。所有的組織樣品被冷凍于液態(tài)氮內(nèi)并于-86℃下被存放了不同的時(shí)段。各個(gè)冷凍塊的代表性部分被包埋于石蠟內(nèi)并以蘇木素-伊紅來(lái)染色,并由一病理學(xué)家來(lái)檢閱以評(píng)估樣品內(nèi)的腫瘤階段。
      所有標(biāo)本是使用世界衛(wèi)生組織的一修正來(lái)分級(jí),而病理學(xué)階段是根據(jù)TNM病理學(xué)階段系統(tǒng)(Epstein JI,Amin MB,Reuter VR,等人 The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial(transitional cell)neoplasms of the urinary bladder.Bladder Consensus ConferenceCommittee.Am J Surg Pathol 221435-1448,1998;and Chisholm GD,Hindmarsh JR,Howatson AG,等人TNM(1978)in bladder canceruse and abuse.Br J Urol 52500-505,1980)。
      膀胱腫瘤的階段是顯示該腫瘤已侵入多深。表層腫瘤被稱(chēng)為T(mén)a,而T1-4被使用來(lái)描述侵入至肌肉內(nèi)的增高程度。一膀胱腫瘤的分級(jí)是以I-IV(1-4)級(jí)的尺度來(lái)表示。該分級(jí)反應(yīng)出細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)表征,其中,級(jí)數(shù)I的細(xì)胞幾乎是正常的,級(jí)數(shù)II的細(xì)胞有些異常,級(jí)數(shù)III的細(xì)胞明顯地不正常,而級(jí)數(shù)IV的細(xì)胞是高度的不正常。
      RNA分離總RNA是使用UltraspecTMRNA分離系統(tǒng)(Biotecx Laboratories Inc.,Houston,Texas)而自被冷凍的組織標(biāo)本或尿液沉淀物中被分離出。在一手持的玻璃-鐵氟龍?jiān)嚬苤校蠹s0.5-1.0公克的組織于1ml的UltraspecTM試劑中被均質(zhì)化。在均質(zhì)化后,均質(zhì)物被儲(chǔ)存于4℃下歷時(shí)5分鐘,然后以0.2ml的氯仿予以萃取,接著以12,000g(4℃)予以離心歷時(shí)15分鐘。水層中的RNA以一等體積的異丙醇予以沉淀,并以75%酒精清洗兩次。RNA的含量藉由分光光度測(cè)定法來(lái)估算(在A260下測(cè)得的1個(gè)OD值等于40μg/ml的RNA),且萃取物的純度是使用A260/280的比值來(lái)估算,而在所有的情況下是大于1.75。為收集尿液,對(duì)病人一天中的第一次排泄時(shí)取得50ml干凈尿液。樣品于3,000g(4℃)下離心歷時(shí)20分鐘,細(xì)胞沉淀物以1ml的UltraspecTM試劑予以混合,并使用相同于上述的方法來(lái)作萃取。
      反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)單股互補(bǔ)DNA(cDNA)是于42℃下使用1μl的SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg,MD)以oligo-dT首次接觸法(priming)來(lái)處理以1μg的總體RNA歷時(shí)50分鐘。于70℃下加熱15分鐘后,一個(gè)第一擴(kuò)增反應(yīng)是使用含有下列的Taq聚合酶緩沖液來(lái)進(jìn)行1/10體積的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA,200μmol/L dNTPs、1UDyNAzymeTMII DNA聚合酶以及10μM的各個(gè)人類(lèi)HURP基因引子[5’-GGATCCAATAGACACTTTGGTTTG-3’(順向)與5’-GGATCCCACCTTTCCTTCTGGTTC-3’(反向)],并在94℃下進(jìn)行反應(yīng)變性達(dá)1分鐘,于55℃下進(jìn)行退火歷時(shí)1分鐘,以及于72℃下進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)歷時(shí)1分鐘,作30次循環(huán),繼而于72℃下進(jìn)行培育歷時(shí)5分鐘。
      對(duì)于尿液標(biāo)本的巢式PCR,1/10的第一擴(kuò)增產(chǎn)物被引至一使用巢式HURP引子5’-CAACGAAAACAGATGCTC-3’(順向)與5’-TGAGTAGCTGATCGAGTC-3’(反向)的第二回的擴(kuò)增反應(yīng),并在94℃下進(jìn)行變性反應(yīng)歷時(shí)1分鐘,于60℃下進(jìn)行退火歷時(shí)1分鐘,以及于72℃下進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)歷時(shí)1分鐘,作30次循環(huán),繼而于72℃進(jìn)行培育歷時(shí)5分鐘。
      以不具反轉(zhuǎn)錄酶(RT)作為一模版的例行的RT-PCR對(duì)照組是為一負(fù)控組,而以藉由將一個(gè)全長(zhǎng)HURP核苷酸序列插入至pET32a(+)載體(得自于Novagen Inc.)而被構(gòu)建成如圖2所示的pET32a-HURP作為一模板者是為正對(duì)照組。經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物與0.1μgGeneRulerTM100bp DNA階梯標(biāo)記(MBI Fermentas,Lithuania)于一1.5%的瓊脂糖凝膠中使用電泳法予以分離,并使用溴化乙錠染色以作視觀。
      數(shù)據(jù)的定量與標(biāo)準(zhǔn)化為定量HURP基因的mRNA表現(xiàn)位準(zhǔn),所有膠片以Image MasterTMVDS視訊影像系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway)拍照,并使用LISCAP影像捕捉軟體(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,version 1.0)予以紀(jì)錄。PCR產(chǎn)物的光學(xué)像素是使用ImageMasterTMTotalLab軟體(Amersham Pharmacia Biotech Inc.,version 1.11)予以定量至任意單位(arbitrary units)。
      為比較受檢測(cè)的樣品,數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化是必要的。為此一目的,β-肌動(dòng)蛋白的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被使用作為一內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn),以代表被引至PCR的cDNA模版的相當(dāng)同等的數(shù)量。平均值以值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示,并使用Student’s t檢測(cè)被比較。
      結(jié)果TCC組織樣品與對(duì)照組個(gè)體內(nèi)的HURP基因的代表性表現(xiàn)態(tài)樣如圖3與圖4所示。在11組(病患編號(hào)294N/T、306N/T、307N/T、315N/T、317N/T、319N/T、320N/T、321N/T、327N/T、335N/T、337N/T)的腫瘤部分內(nèi)有相當(dāng)多的mRNA轉(zhuǎn)錄物被擴(kuò)增出來(lái)(參見(jiàn)圖3)。只有1組的組織樣品(病患編號(hào)322N/T)于兩者皆顯示出無(wú)法檢測(cè)到HURP基因的轉(zhuǎn)錄物。作為一內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn),β-肌動(dòng)蛋白的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(參見(jiàn)圖4)被使用以表示被引至PCR的cDNA模板的相當(dāng)同等的數(shù)量。
      實(shí)施例2藉由RT-PCR分析的HURP基因表現(xiàn)的腫瘤專(zhuān)一性評(píng)估為檢測(cè)HURP的過(guò)度表現(xiàn)是否有腫瘤專(zhuān)一性,來(lái)自于良性攝護(hù)腺肥大癥(BPH)病患的攝護(hù)腺尿道上皮的HURP轉(zhuǎn)錄物是使用RT-PCR被擴(kuò)增。
      這些實(shí)驗(yàn)是使用如于上述實(shí)施例1中所描述的程序而被實(shí)施,惟獨(dú)該來(lái)自良性攝護(hù)腺肥大癥病患的攝護(hù)腺尿道上皮細(xì)胞的HURP轉(zhuǎn)錄物是使用RT-PCR而被擴(kuò)增,以檢測(cè)HURP的過(guò)度表現(xiàn)是否有腫瘤專(zhuān)一性。
      來(lái)自具有正常細(xì)胞鏡檢的BPH病患的攝護(hù)腺尿道上皮的15個(gè)標(biāo)本被收集并被引至RT-PCR。參見(jiàn)圖5,β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄物從5個(gè)BPH尿道上皮的代表性樣品中被均等地?cái)U(kuò)增出,但在這些樣品中沒(méi)有檢測(cè)到HURP轉(zhuǎn)錄物。除了這些BPH樣品的外,非膀胱對(duì)照組(包含4個(gè)來(lái)自肝臟與4個(gè)來(lái)自心臟的樣品)被測(cè)試,且在這些組織中沒(méi)有檢測(cè)到HURP轉(zhuǎn)錄物(資料未顯示)。
      實(shí)施例3藉由HURP基因表現(xiàn)的RT-PCR分析的腫瘤階段評(píng)估為檢測(cè)HURP基因過(guò)度表現(xiàn)與腫瘤級(jí)數(shù)的間的可能關(guān)是,45對(duì)的包含有一TCC與一腫瘤鄰近組織的對(duì)應(yīng)物的組織樣品的人類(lèi)HURP轉(zhuǎn)錄物被分析,并以β-肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄物來(lái)作標(biāo)準(zhǔn)化(normalized)。
      參閱表1,注意到在35個(gè)腫瘤鄰近部分(35/45,77.8%)所表現(xiàn)的HURP基因的量要低于腫瘤部分(組別I,p<0.0001),并且有10個(gè)腫瘤鄰近部分(10/45,22.2%)顯示出幾乎相同于腫瘤部分的HURP基因(組別II)。
      80個(gè)以病理學(xué)被確認(rèn)為0個(gè)級(jí)數(shù)I、37個(gè)級(jí)數(shù)II、31個(gè)級(jí)數(shù)III以及12個(gè)級(jí)數(shù)IV的TCC病患的樣品被收集,且組織樣品中的人類(lèi)HURP表現(xiàn)比值被列于表2中??磥?lái)HURP表現(xiàn)與腫瘤級(jí)數(shù)的間并無(wú)明顯的相關(guān)性。在那些9個(gè)具HURP-陰性的腫瘤中,6個(gè)為級(jí)數(shù)II,1個(gè)為級(jí)數(shù)III以及2個(gè)為級(jí)數(shù)IV。
      表1TCC腫瘤與腫瘤鄰近組織的HURP表現(xiàn)比值HURP表現(xiàn)比值*(以β-肌動(dòng)蛋白予以標(biāo)準(zhǔn)化)組別 編號(hào) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差TCC腫瘤組織腫瘤鄰近組織I 350.658±0.061 0.070±0.085 II 100.820±0.275 0.770±0.327*HURP相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白(光學(xué)像素的倍數(shù)) P<0.0001
      表2TCC病患的HURP表現(xiàn)比值HURP表現(xiàn)值HURP-陽(yáng)性 HURP-陰性病患特征 數(shù)目 (以β-肌動(dòng)蛋白予以標(biāo)準(zhǔn)化)(%) (%)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差TCC,級(jí)數(shù)I0 - - -TCC,級(jí)數(shù)II 3731/37(83.8) 6/37(16.2) 0.56±0.394TCC,級(jí)數(shù)III 3130/31(96.8) 1/31(3.2) 0.59±0.309TCC,級(jí)數(shù)IV 1210/12(83.3) 2/10(16.7) 0.54±0.129總數(shù) 8071/80(88.8) 9/80(11.2) 0.55±0.369實(shí)施例4以HURP基因表現(xiàn)作為T(mén)CC檢測(cè)的一生物標(biāo)記的評(píng)估為評(píng)估尿液-HURP作為檢測(cè)泌尿TCC的一新穎尿液分子標(biāo)記的有潛力的應(yīng)用,7個(gè)帶有新生的或再?gòu)?fù)發(fā)的TCC的額外病患藉由使用RT-PCR來(lái)對(duì)尿液-HURP作分析??傮wRNA是自尿液細(xì)胞沉淀物被萃取出并藉由oligo-dT(寡聚dT)初次接觸來(lái)作反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增反應(yīng)是以HURP專(zhuān)一性引子或β-肌動(dòng)蛋白專(zhuān)一性引子來(lái)實(shí)施。一段370堿基對(duì)的cDNA從具有TCC的所有病患的尿液細(xì)胞沉淀物被擴(kuò)增出(圖6)。相對(duì)地,7個(gè)額外病患(3個(gè)有尿道感染,2個(gè)有慢性尿道膀胱發(fā)炎,1個(gè)具有腎細(xì)胞癌,以及1個(gè)具有BPH)的尿液細(xì)胞沉淀物不具有HURP轉(zhuǎn)錄物。在受控制的實(shí)驗(yàn)中,一段307堿基對(duì)的β-肌動(dòng)蛋白-cDNA片段由對(duì)照組個(gè)體以及具有TCC的病患的尿液被無(wú)法區(qū)別地?cái)U(kuò)增出(圖7)。
      于本說(shuō)明書(shū)中被引述的所有專(zhuān)利與文獻(xiàn)以其整體被并入本案以作為參考資料。若有所沖突時(shí),本案的說(shuō)明(包含界定在內(nèi))將占上風(fēng)。
      雖然本發(fā)明已參照上述特定具體例來(lái)作描述,明顯地在不背離本發(fā)明的范圍和精神的下,可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發(fā)明只受如隨文檢附的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所示者的限制。
      序列表&lt;110&gt;周成功邱文祥黃于倫&lt;120&gt;作為膀胱癌的分子標(biāo)記的肝癌上升調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)基因&lt;130&gt;PE=23153-CM&lt;150&gt;US10/259,326&lt;151&gt;2002-09-30&lt;160&gt;5&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;2979&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人(Homo sapiens)&lt;400&gt;1agcaaaccaa tcgcaagcct cgttgagtgg aaggggtggg atcttccccg gaagttttgg60ttaaagcccc tccaatcagc ggctcggtgc ggcaagtttg aatttcgtgg aggctcgggt120tgtgagggtt cctgcttcgg agtcggcggt ggtcgtccag accgagtgtt ctttactttt180tgtttggttg aggtttcacg ctagaaggtg gctcaggatg tcttcatcac attttgccag240tcgacacagg aaggatataa gtactgaaat gattagaact aaaattgctc ataggaaatc300actgtctcag aaagaaaata gacataagga atacgaacga aatagacact ttggtttgaa360agatgtaaac attccaacct tggaaggtag aattcttgtt gaattagatg agacatctca420agagcttgtt ccagaaaaga ccaatgttaa gccaagggca atgaaaacta ttctaggtga480tcaacgaaaa cagatgctcc aaaaatacaa agaagaaaag caacttcaaa aattgaaaga540gcagagagag aaagctaaac gaggaatatt taaagtgggt cgttatagac ctgatatgcc600ttgttttctt ttatcaaacc agaatgctgt gaaagctgag ccaaaaaagg ctattccatc660ttctgtacgg attacaaggt caaaggccaa agaccaaatg gagcagacta agattgataa720cgagagtgat gttcgagcaa tccgacctgg tccaagacaa acttctgaaa agaaagtgtc780agacaaagag aaaaaagttg tgcagcctgt aatgcccacg tcgttgagaa tgactcgatc840agctactcaa gcagcaaagc aggttcccag aacagtctca tctaccacag caagaaagcc900agtcacaaga gctgctaatg aaaacgaacc agaaggaaag gtgccaagta aaggaagacc960tgccaaaaat gtagaaacaa aacccgacaa gggtatttct tgtaaagtcg atagtgaaga1020aaatactttg aattcacaaa ctaatgcaac aagtggaatg aatccagatg gagtcttatc1080aaaaatggaa aacttacctg agataaatac tgcaaaaata aaagggaaga attccttcgc1140acctaaggat tttatgtttc agccactgga tggtctgaag acctatcaag taacacctat1200gactcccaga agtgccaatg cttttttgac acccagttac acctggactc ctttaaaaac1260agaagttgat gagtctcaag caacaaaaga aattttggca caaaaatgta aaacttactc1320taccaagaca atacagcaag attcaaataa attgccatgt cctttgggtc ctctaactgt1380ttggcatgaa gaacatgttt taaataaaaa tgaagctact actaaaaatt taaatggcct1440tccaataaaa gaagtcccat cacttgaaag aaatgaaggt cgaattgctc agccccacca1500tggtgtgcca tatttcagaa atatcctcca gtcagaaact gagaaattaa cttcacattg1560cttcgagtgg gacaggaaac ttgaattgga cattccagat gatgctaaag atcttattcg1620cacagcagtt ggtcaaacaa gactccttat gaaggaaagg tttaaacagt ttgaaggact1680ggttgatgat tgtgaatata aacgaggtat aaaggagact acctgtacag atctggatgg1740attttgggat atggttagtt ttcagataga agatgtaatc cacaaattca acaatctgat1800caaacttgag gaatctgggt ggcaagtcaa taataatatg aatcataata tgaacaaaaa1860tgtctttagg aaaaaagttg tctcaggtat agcaagtaaa ccaaaacagg atgatgctgg1920aagaattgca gcgagaaatc gcctagctgc cataaaaaat gcaatgagag agagaattag1980gcaggaagaa tgtgctgaaa cagcagtttc tgtgatacca aaggaagttg ataaaatagt2040gttcgatgct ggatttttca gagttgaaag tcctgttaaa ttattctcag gactttctgt2100ctcttctgaa ggcccttctc aaagacttgg aacacctaag tctgtcaaca aagctgtatc2160tcagagtaga aatgagatgg gcattccaca acaaactaca tcaccagaaa atgccggtcc2220tcagaatacg aaaagtgaac atgtgaagaa gactttgttt ttgagtattc ctgaaagcag2280gagcagcata gaagatgctc agtgtcctgg attaccagat ttaattgaag aaaaccatgt2340tgtaaataag acagacttga aggtggattg tttatccagt gagagaatga gtttgcctct2400tcttgctggt ggagtagcag atgatattaa tactaacaaa aaagaaggaa tttcagatgt2460tgtggaagga atggaactga attcttcaat tacatcacag gatgttttga tgagtagccc2520tgaaaaaaat acagcttcac aaaatagcat cttagaagaa ggggaaacta aaatttctca2580gtcagaacta tttgataata aaagtctcac tactgaatgc caccttcttg attcaccagg2640tctaaactgc agtaatccat ttactcagct ggagaggaga catcaagaac atgccagaca2700catttctttt ggtggtaacc tgattacttt ttcacctcta caaccaggag aattttgaat2760ttaaaaataa atccaaacat tttccttcat attatcaatg cttatatatt ccttagacta2820ttgaaatttt ggagaaaatg tatttgtgtt cacttctata gcatataatg ttttaatatt2880ctgtgttcat caaagtgtat tttagatata ctctttctca agggaagtgg ggatattttg2940tacattttca acacagaata aaaaatgtac tgtgccttg 2979&lt;210&gt;2&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;用于HURP的擴(kuò)增&lt;400&gt;2ggatccaata gacactttgg tttg 24&lt;210&gt;3&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;用于HURP的擴(kuò)增&lt;400&gt;3ggatcccacc tttccttctg gttc 24&lt;210&gt;4&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;用于HURP的擴(kuò)增&lt;400&gt;4caacgaaaac agatgctc 18&lt;210&gt;5&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;用于HURP的擴(kuò)增&lt;400&gt;5tgagtagctg atcgagtc 18
      權(quán)利要求
      1.一種用于檢測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的方法,其特征在于該方法包含下列步驟(1)自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體取得一生物性樣品;以及(2)偵測(cè)一人類(lèi)肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)基因,即HURP基因,于該樣品內(nèi)的表現(xiàn),該人類(lèi)HURP基因被偵測(cè)到的表現(xiàn)是為有膀胱癌存在的表征。
      2.如權(quán)利要求1的方法,其特征在于其中該膀胱癌為膀胱的移形上皮癌。
      3.如權(quán)利要求1的方法,其特征在于其中該生物性樣品包含有擇自于下列群組中的細(xì)胞泌尿上皮癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞或此二者的一組合。
      4.如權(quán)利要求1的方法,其特征在于其中該生物性樣品是擇自于由下列所構(gòu)成的群組尿液、泌尿上皮生物檢體、血液、血漿與血清。
      5.如權(quán)利要求4的方法,其特征在于其中該生物性樣品為尿液。
      6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因具有一如序列編號(hào)1中所描述的核苷酸序列。
      7.如權(quán)利要求6的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn)的偵測(cè),是藉由偵測(cè)該生物性樣品內(nèi)的人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在來(lái)進(jìn)行。
      8.如權(quán)利要求7的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是藉由使用下列方法學(xué)的至少一者而被進(jìn)行雜合、循環(huán)探針?lè)磻?yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、多重PCR聚合酶鏈反應(yīng)-單股構(gòu)造多形性、連接酶連鎖反應(yīng),以限制片段長(zhǎng)度多形性核酸序列為主的擴(kuò)增反應(yīng),以及轉(zhuǎn)錄-調(diào)節(jié)的擴(kuò)增反應(yīng)。
      9.如權(quán)利要求7的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是使用RT-PCR而被進(jìn)行。
      10.如權(quán)利要求7的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是藉由下列步驟而被進(jìn)行(a)自該生物樣品萃取出總RNA;(b)將源自步驟(a)的被萃取的RNA引至一種使用至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)處理,各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸;以及(c)偵測(cè)是否有一具有一核苷酸序列相同于或互補(bǔ)于該人類(lèi)HURP基因的核苷酸序列的一部分的RT-PCR產(chǎn)物已從步驟(b)的RT-PCR處理被生成,該RT-PCR產(chǎn)物的存在是為有膀胱癌存在的表征。
      11.如權(quán)利要求1的方法,其特征在于其中被使用于步驟(b)中的該至少一個(gè)引子對(duì)包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      12.如權(quán)利要求10的方法,其特征在于其中被使用于步驟(b)中的該至少一個(gè)引子對(duì)包含一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的反向引子。
      13.如權(quán)利要求10所述的方法,其特征在于其中步驟(b)中的RT-PCR處理包含一個(gè)使用一第一引子對(duì)的第一擴(kuò)增反應(yīng),該第一引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2的核苷酸序列的第一順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)3的核苷酸序列的第一反向引子;以及一個(gè)使用一第二引子對(duì)的第二擴(kuò)增反應(yīng),該第二引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的第二順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的第二反向引子。
      14.一種用于監(jiān)測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的方法,其特征在于該方法包含下列步驟(1)定期地自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體取得一生物性樣品;以及(2)偵測(cè)一人類(lèi)HURP基因于該樣品內(nèi)的表現(xiàn),該人類(lèi)HURP基因被偵測(cè)到的表現(xiàn)是為有膀胱癌存在的表征。
      15.如權(quán)利要求14的方法,其特征在于其中該膀胱癌是為膀胱的移形上皮癌。
      16.如權(quán)利要求14的方法,其特征在于其中該生物性樣品包含有擇自于下列群組中的細(xì)胞泌尿上皮癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞或此二者的組合。
      17.如權(quán)利要求14的方法,其特征在于其中該生物性樣品是擇自于由下列所構(gòu)成的群組尿液、泌尿上皮生物檢體、血液、血漿與血清。
      18.如權(quán)利要求17的方法,其特征在于其中該生物性樣品為尿液。
      19.如權(quán)利要求14的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因具有一如序列編號(hào)1中所描述的核苷酸序列。
      20.如權(quán)利要求19所述的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn)的偵測(cè),是藉由偵測(cè)該生物性樣品內(nèi)的人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在來(lái)進(jìn)行。
      21.如權(quán)利要求20的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是藉由使用下列方法學(xué)的至少一者而被進(jìn)行雜合、循環(huán)探針?lè)磻?yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)、多重PCR聚合酶鏈反應(yīng)-單股構(gòu)造多形性、連接酶連鎖反應(yīng),以限制片段長(zhǎng)度多形性核酸序列為主的擴(kuò)增反應(yīng),以及轉(zhuǎn)錄-調(diào)節(jié)的擴(kuò)增反應(yīng)。
      22.如權(quán)利要求20的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是使用RT-PCR而被進(jìn)行。
      23.如權(quán)利要求20的方法,其特征在于其中該人類(lèi)HURP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄品的存在的偵測(cè),是藉由下列步驟而被進(jìn)行(a’)自該生物樣品萃取出總RNA;(b’)將源自步驟(a’)的被萃取的RNA引至一種使用至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)處理,各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸;以及(c’)偵測(cè)是否有一具有一核苷酸序列相同于或互補(bǔ)于該人類(lèi)HURP基因的核苷酸序列的一部分的RT-PCR產(chǎn)物已從步驟(b’)的RT-PCR處理被生成,該RT-PCR產(chǎn)物的存在是為有膀胱癌存在的表征。
      24.如權(quán)利要求23方法,其特征在于其中被使用于步驟(b’)中的該至少一個(gè)引子對(duì)包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      25.如權(quán)利要求23所述的方法,其特征在于其中被使用于步驟(b’)中的該至少一個(gè)引子對(duì)包含一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的反向引子。
      26.如權(quán)利要求23的方法,其特征在于其中步驟(b’)中的RT-PCR處理包含一個(gè)使用一第一引子對(duì)的第一擴(kuò)增反應(yīng),該第一引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2的核苷酸序列的第一順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)3的核苷酸序列的第一反向引子;以及一個(gè)使用一第二引子對(duì)的第二擴(kuò)增反應(yīng),該第二引子對(duì)具有一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的第二順向引子以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的第二反向引子。
      27.一個(gè)DNA序列,其特征在于該DNA序列具有一擇自于序列編號(hào)2至序列編號(hào)5中所描述序列的核苷酸序列。
      28.一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的引子組,其特征在于該引子組包含一具有一擇自于序列編號(hào)2與序列編號(hào)4中所述序列的核苷酸序列的順向引子,以及一具有一擇自于序列編號(hào)3與序列編號(hào)5中所述序列的核苷酸序列的反向引子。
      29.如權(quán)利要求28的引子組,其特征在于其中該順向引子具有如序列編號(hào)2中所描述的核苷酸序列。
      30.如權(quán)利要求28的引子組,其特征在于其中該順向引子具有如序列編號(hào)4中所描述的核苷酸序列。
      31.如權(quán)利要求28的引子組,其特征在于其中該反向引子具有如序列編號(hào)3中所描述的核苷酸序列。
      32.如權(quán)利要求28的引子組,其特征在于其中該反向引子具有如序列編號(hào)5中所描述的核苷酸序列。
      33.一種用于偵測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌的檢驗(yàn)套組,其特征在于該檢驗(yàn)套組包含至少一個(gè)具有一順向引子與一反向引子的引子對(duì),各個(gè)引子具有一核苷酸序列會(huì)雜合至一具有一核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的人類(lèi)HURP基因的至少13個(gè)核苷酸。
      34.如權(quán)利要求33的檢驗(yàn)套組,其特征在于該檢驗(yàn)套組更包含一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2的核苷酸序列的第一順向引子以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)3的核苷酸序列的第一反向引子的第一引子對(duì),以及一個(gè)具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)4的核苷酸序列的第二順向引子以及一具有一對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)5的核苷酸序列的第二反向引子的第二引子對(duì)。
      全文摘要
      肝癌上升-調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(HURP)基因能當(dāng)作人類(lèi)個(gè)體內(nèi)膀胱癌的偵測(cè)、初步篩選與監(jiān)測(cè)的一有用的分子標(biāo)記。本案揭示一種用于檢測(cè)一人類(lèi)個(gè)體體內(nèi)的膀胱癌,特別是膀胱移形上皮癌(TCC)的方法,其中,自一被懷疑具有膀胱癌的個(gè)體所取得的一樣品內(nèi)所偵測(cè)到的人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn),是為有膀胱癌存在的表征。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于偵測(cè)、初步篩選與監(jiān)測(cè)一被懷疑的個(gè)體體內(nèi)的泌尿(urinary)TCC的非侵襲性方法,其中一個(gè)取自該人類(lèi)個(gè)體的尿液樣品被分析,以檢測(cè)該人類(lèi)HURP基因的表現(xiàn),該基因表現(xiàn)的存在是泌尿TCC存在的表征。
      文檔編號(hào)C12Q1/68GK1493703SQ03178730
      公開(kāi)日2004年5月5日 申請(qǐng)日期2003年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
      發(fā)明者邱文祥, 黃于倫, 周成功 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人奇美醫(yī)院
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