專利名稱：可直接檢測(cè)基因的免沖洗pcr擴(kuò)增管的制作方法
專利說明
一、技術(shù)領(lǐng)域本實(shí)用新型涉及一種用于基因擴(kuò)增和直接檢測(cè)的PCR擴(kuò)增管(PCR擴(kuò)增管是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)名詞)，尤其是指一種可直接檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的免沖洗PCR擴(kuò)增管。
二、技術(shù)背景目前，在分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床診斷過程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是不可缺少的。PCR通常是在一個(gè)封閉的管腔內(nèi)進(jìn)行，它可以將被檢測(cè)的靶基因放大數(shù)萬至數(shù)百萬倍。但是，基因擴(kuò)增之后，一般需要用電泳等方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。由于PCR方法靈敏度極高，其擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)過程中不可避免的會(huì)進(jìn)入空氣中。當(dāng)進(jìn)行下一次試驗(yàn)時(shí)，這些飄浮在空中的產(chǎn)物將可能又被擴(kuò)增出來，這就是PCR檢測(cè)容易獲得所謂“假陽性”的原因。為此，國際上一些生物技術(shù)公司發(fā)展了封閉式的基因擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)。如熒光定量PCR技術(shù)。但是，該技術(shù)需要有十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)光學(xué)檢測(cè)裝置，檢測(cè)儀器十分復(fù)雜，在我國很難推廣。同時(shí)，該技術(shù)每次試驗(yàn)只能檢測(cè)一個(gè)基因的信息，不能滿足生物信息時(shí)代人們需要對(duì)大量基因信息的檢測(cè)的要求。
基因芯片技術(shù)為人們同時(shí)檢測(cè)大量基因信息提供了工具?；蛐酒言S多不同的核酸探針(單鏈寡核苷酸)固定于玻片上。把樣品中基因的擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記熒光，并與芯片上的核酸探針進(jìn)行雜交，通過熒光掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。雖然基因芯片獲得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于細(xì)胞的mRNA表達(dá)檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用。在重要病原微生物檢測(cè)方面，至今沒有成熟的應(yīng)用實(shí)例和過硬的產(chǎn)品問世。就其主要原因在于樣品的處理、擴(kuò)增標(biāo)記、雜交、檢測(cè)等操作過程都是分開來單獨(dú)進(jìn)行的，由此導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)存在著操作繁瑣、復(fù)雜的缺陷，并因此而增加了污染的機(jī)會(huì)，降低了所得結(jié)果的可靠性。盡管目前已將基因擴(kuò)增技術(shù)與芯片檢測(cè)方法合為一體，但其特點(diǎn)是整個(gè)基因擴(kuò)增過程在一個(gè)微反應(yīng)池中進(jìn)行，因而，需要對(duì)器件的同一部位反復(fù)地升溫降溫，這將無法對(duì)結(jié)果進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤和實(shí)時(shí)定量分析。為此，國內(nèi)外一些研究者提出把基因芯片與微流體技術(shù)相結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)所有操作過程的一體化。申請(qǐng)人對(duì)此也進(jìn)行了研究，并已提出了基因擴(kuò)增微陣列探針循環(huán)檢測(cè)型生物芯片等。然而，由于這種芯片制備困難，并需要研制專門的反應(yīng)器與之配套，故其成本很高。同時(shí)，基因芯片要求靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記熒光，通過熒光信號(hào)來檢測(cè)核酸探針的雜交狀態(tài)。這就要求在樣品處理過程中要摻入熒光，這不僅提高了樣品處理的成本，增加了難度和不確定因素。而且，在這個(gè)過程中因標(biāo)記效率問題，影響檢測(cè)的可靠性。同時(shí)，由于整個(gè)操作過程的的復(fù)雜性提高，如樣品處理過程的條件控制和雜交后非特異探針的反復(fù)清洗等，不利于集成化檢測(cè)。因此，發(fā)展可以對(duì)被檢測(cè)的基因序列進(jìn)行非標(biāo)記檢測(cè)的低成本的生物芯片技術(shù)是實(shí)現(xiàn)生物芯片在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域中大量實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵之一。
三、技術(shù)內(nèi)容技術(shù)問題本實(shí)用新型提供一種能使基因擴(kuò)增、雜交及檢測(cè)一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴(kuò)增時(shí)無需摻入熒光、成本得以降低且可使所得結(jié)果的可靠性得以提高的可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管。
技術(shù)方案本實(shí)用新型即一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應(yīng)管1內(nèi)固定有分子信標(biāo)2。有益效果 ①由于本實(shí)用新型將分子信標(biāo)設(shè)置于反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)管自身能夠構(gòu)成一個(gè)相對(duì)封閉的空間，使基因擴(kuò)增、雜交及檢測(cè)一體化的操作方法可以按如下步驟在上述相對(duì)封閉的空間內(nèi)完成A)將制備好的待擴(kuò)增基因提取物、擴(kuò)增液(包括相應(yīng)的引物和酶等)加入反應(yīng)管本體中，把蓋帽緊扣在反應(yīng)管上；B)把封閉好的反應(yīng)管放置于相應(yīng)的基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增；基因擴(kuò)增儀可以使用各種流行的儀器，也可以是通過改進(jìn)的專用的擴(kuò)增雜交和檢測(cè)一體化儀器；C)將管內(nèi)擴(kuò)增后的溶液流倒固定的分子信標(biāo)區(qū)域，與管內(nèi)表面上的分子信標(biāo)進(jìn)行作用，控制一定的溫度使其進(jìn)行特異性的雜交；D)通過光學(xué)檢測(cè)方法，讀出反應(yīng)管上分子信標(biāo)的熒光信號(hào)，從而獲得基因的雜交信息。而這種方法正是由于有了本實(shí)用新型，才能通過一些簡單的操作，實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增、雜交、檢測(cè)操作的連續(xù)，而且無需在靶基因的擴(kuò)增過程中加入熒光基團(tuán)等標(biāo)記物，避免在PCR擴(kuò)增后打開擴(kuò)增管，以清洗非特異性雜交的靶基因，以及加入雜交液等操作，不僅簡化了操作步驟，更重要的是完全避免了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)假陽性并使該方法可以采用現(xiàn)有的設(shè)備或是對(duì)現(xiàn)有設(shè)備稍加改進(jìn)后的設(shè)備，降低了成本。分子信標(biāo)與普通的核酸探針(單鏈核酸探針)不同。分子信標(biāo)是由熒光基團(tuán)、熒光淬滅基團(tuán)、和雙鏈核酸的莖桿區(qū)、單鏈環(huán)形核酸區(qū)等4部分組成的。其中，單鏈環(huán)形核酸區(qū)為分子信標(biāo)與被檢測(cè)的靶基因雜交識(shí)別的區(qū)域。當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因結(jié)合后，雙鏈核酸的莖稈被打開，從而使熒光集團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間的距離改變，引起分子信標(biāo)的熒光發(fā)光性質(zhì)的改變。而普通的核酸的DNA單鏈探針是通過與被標(biāo)記有熒光分子的靶基因雜交，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的。分子信標(biāo)一般直接在溶液中檢測(cè)靶基因，但這只能檢測(cè)一種靶基因。本實(shí)用新型用固定化的分子信標(biāo)法檢測(cè)靶基因，不僅可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，而且可以無需對(duì)靶基因摻入熒光等特殊的操作處理，也無需對(duì)雜交后芯片上的非特異性吸附進(jìn)行清洗，以降低熒光背景。本實(shí)用新型就是把分子信標(biāo)直接固定于PCR擴(kuò)增管內(nèi)，在PRC擴(kuò)增管內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增和雜交檢測(cè)一體化。分子信標(biāo)內(nèi)的熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，在雜交檢測(cè)時(shí)，用于與分子信標(biāo)雜交的核酸片斷不需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，雜交后，核酸片斷與分子信標(biāo)結(jié)合，使分子信標(biāo)內(nèi)部具有的熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)在空間分開，其熒光基團(tuán)的信號(hào)可以被檢測(cè)，同時(shí)，沒有進(jìn)行雜交的分子信標(biāo)具有的熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)在空間上保持微小距離，熒光信號(hào)不能被檢測(cè)到，所以不需要進(jìn)行沖洗，減少了操作步驟，降低了檢測(cè)的難度。綜上，本實(shí)用新型能使基因擴(kuò)增、雜交及檢測(cè)一體化操作方法的操作得以簡便、成本得以降低且可使所得結(jié)果的可靠性得以提高，并可實(shí)現(xiàn)免沖洗。
②由于本實(shí)用新型能使操作方法進(jìn)行多遍擴(kuò)增、雜交及檢測(cè)，故本實(shí)用新型能夠使該方法實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)跟蹤檢測(cè)并獲得定量結(jié)果。
③本實(shí)用新型采用“將分子信標(biāo)通過化學(xué)活性基團(tuán)連接在透明窗口上”的連接，具有結(jié)合牢固，不容易脫離，可多次反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)需要的檢測(cè)樣品少，分子探針的密度高。
④本實(shí)用新型“把分子信標(biāo)固定于高分子凝膠介質(zhì)中，再固定在透明窗口上”的技術(shù)措施提高了固定分子信標(biāo)的密度，增強(qiáng)了雜交信號(hào)，使所得結(jié)果的可靠性得以進(jìn)一步提高。
⑤本實(shí)用新型“把透明窗口分割成若干區(qū)域，分別在不同的區(qū)域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標(biāo)”的方法，可以在一次PCR試驗(yàn)中對(duì)數(shù)個(gè)甚至數(shù)萬個(gè)基因片斷進(jìn)行雜交檢測(cè)，可進(jìn)行高通量的檢測(cè)。
四

圖1是本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本實(shí)用新型分子信標(biāo)的直接化學(xué)連接關(guān)系圖。
五、具體實(shí)施方案實(shí)施例1 一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應(yīng)管1內(nèi)固定有分子信標(biāo)2，在PCR反應(yīng)管內(nèi)固定分子信標(biāo)的區(qū)域上有透明窗口3，分子信標(biāo)2固定透明窗口3內(nèi)側(cè)，在透明窗口3上設(shè)有化學(xué)活性其團(tuán)層，分子信標(biāo)2設(shè)在化學(xué)基團(tuán)層上，該化學(xué)基團(tuán)層可以采用氨基層、醛基層、氰基層、巰基層等本實(shí)施例可以采取如下具體辦法將分子信標(biāo)通過化學(xué)集團(tuán)層連接固定在透明窗口上1.在聚苯乙烯等透明塑料窗口、玻璃等表面上通過等離子體激活、紫外輻射激活、和化學(xué)激活等方法，在透明窗口表面上連接化學(xué)活性基團(tuán)如氨基、醛基、氰基、巰基等，再利用上述化學(xué)活性基團(tuán)與分子信標(biāo)上的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，把分子信標(biāo)連接到透明窗口上。
2.對(duì)透明塑料窗口、玻璃表面的修飾方法有很多種，如戊二醛修飾法)、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法、多糖修飾法、BSA-NHS修飾法、水凝膠修飾法等，透明玻璃窗口的化學(xué)處理放入由1/3過氧化氫(30％)和2/3硫酸(18M)組成的溶液中，浸泡1小時(shí)(21)。再用去離子蒸餾水沖洗3遍；放入去離子蒸餾水煮沸10分鐘；在氬氣流下干燥，于干燥處保存?zhèn)溆谩?br> 氨基硅烷化處理將預(yù)處理后的基片浸入含有1％3-aminopropyltriethoxysilane(氨基硅烷)的95％丙酮/水的溶液10分鐘，取出后，用丙酮和去離子水沖洗干凈，在120℃下干燥45分鐘后，置于干燥處保存。將硅烷化后的玻片放入含3％～4％戊二醛的PBS溶液中，室溫浸泡2小時(shí)，取出，洗凈，用氮?dú)獯蹈桑糜?℃保存?zhèn)溆谩?br> BSA-NHS修飾制備將已經(jīng)硅烷化的透明塑料窗口、玻片放入含有1.76g N-N′-disuccinimidyl carbonate，1.2ml N-N′-diisopropylethylamine，和68.8ml N-N′-dimethylformamide(DMF)的溶液A中，室溫反應(yīng)3小時(shí)后取出，浸入含1％BSA的PBS溶液室溫放置12小時(shí)，然后取出放入溶液A中，室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，取出，洗凈吹干備用。
瓊脂糖修飾處理瓊脂糖加雙蒸水配制成1％的瓊脂糖水溶液，完全混合煮沸3分鐘。在每一片已經(jīng)硅烷化的透明塑料窗口上都傾倒2 ml的瓊脂糖水溶液，待凝固后于37℃下過夜干燥，室溫干燥條件下保存。使用前用20mM的NaIO4水溶液活化，再用雙蒸水洗凈即可。
巰基修飾處理配制含巰基硅烷1％的甲苯溶液，將要處理的透明塑料窗口放入溶液中，室溫下過夜。取出玻片，用三氯甲烷、丙酮等有機(jī)溶劑清洗，吹干。
聚賴氨酸修飾處理將清洗干凈的透明塑料窗口放入含3％聚賴氨酸的PBS溶液中浸泡2小時(shí)，洗凈，吹干，于4℃保存。
實(shí)施例2一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應(yīng)管1內(nèi)固定有若干分子信標(biāo)2，分別用于檢測(cè)非典型性肺炎相關(guān)的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應(yīng)管內(nèi)固定分子信標(biāo)的區(qū)域上有透明窗口3，分子信標(biāo)2固定透明窗口3內(nèi)側(cè)，本實(shí)施例把透明窗口分割成若干區(qū)域，分別在不同的區(qū)域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標(biāo)，本實(shí)施例還可以把分子信標(biāo)2固定于高分子凝膠介質(zhì)中，再固定在透明窗口3上，上述高分子凝膠介質(zhì)可選用聚丙烯酰胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等。檢測(cè)樣品經(jīng)病毒裂解處理后，放入免沖洗PCR擴(kuò)增管中，同時(shí)加入反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCT)試劑和冠狀病毒和甲型、乙型流感病毒的擴(kuò)增引物，封閉擴(kuò)增管后，進(jìn)行PCR反應(yīng)裝置上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物引入窗口區(qū)；若在檢測(cè)樣品中存在有被檢測(cè)的病毒，則在相應(yīng)的分子信標(biāo)固定區(qū)域?qū)⒖蓹z測(cè)到熒光信號(hào)。
實(shí)施例3一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由管蓋11和管體12組成，在用于PCR的反應(yīng)管1內(nèi)固定有若干分子信標(biāo)2，分別用于檢測(cè)非典型性肺炎相關(guān)的冠狀病毒的特定基因片斷和甲型、乙型流感病毒的特定基因片斷，在PCR反應(yīng)管內(nèi)固定分子信標(biāo)的區(qū)域上有透明窗口3，在本實(shí)施例中，在透明窗口3上設(shè)有透明的高分子凝膠層4(如聚丙烯酰胺、瓊脂糖、聚乙烯醇等)，再把分子信標(biāo)2固定于高分子凝膠介質(zhì)層上。
權(quán)利要求1.一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由管蓋(11)和管體(12)組成，其特征在于在用于PCR的反應(yīng)管(1)內(nèi)固定有分子信標(biāo)(2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR反應(yīng)管，其特征在于在PCR反應(yīng)管內(nèi)固定分子信標(biāo)的區(qū)域上有透明窗口(3)，分子信標(biāo)(2)固定透明窗口(3)內(nèi)側(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，其特征在于在透明窗口(3)上設(shè)有化學(xué)活性其團(tuán)層，分子信標(biāo)(2)設(shè)在化學(xué)基團(tuán)層上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，其特征在于在透明窗口(3)上設(shè)有透明的高分子凝膠層(4)，再把分子信標(biāo)(2)固定于高分子凝膠介質(zhì)層(4)上。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，其特征在于把透明窗口分割成若干區(qū)域，分別在不同的區(qū)域上組裝具有不同或相同堿基排列方式的核酸序列分子信標(biāo)。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種可直接檢測(cè)基因的免沖洗PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管上且該反應(yīng)管由管蓋和管體組成，在用于PCR的反應(yīng)管內(nèi)固定有分子信標(biāo)，在PCR反應(yīng)管內(nèi)固定分子信標(biāo)的區(qū)域上有透明窗口，分子信標(biāo)固定透明窗口內(nèi)側(cè)。本實(shí)用新型將分子信標(biāo)引入技術(shù)方案后，能使基因擴(kuò)增、雜交及檢測(cè)一體化操作方法的操作得以簡便、靶基因擴(kuò)增時(shí)無需摻入熒光、成本得以降低且可使所得結(jié)果的可靠性得以提高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK2615141SQ03221640

公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2003年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者陸祖宏, 劉全俊, 王宏 申請(qǐng)人:東南大學(xué)