專利名稱：核黃素的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產核黃素的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種用植物油或動物油作為碳源以高生產率高產量生產核黃素的方法，通過使具有油吸附特性的粘土礦物載體及其化學處理的產物或鈣化合物在用于生產核黃素的培養(yǎng)基中存在。
背景技術：
很久以來人們已經知道在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并從其收集核黃素來生產核黃素的方法。作為產核黃素微生物，已知使用阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，Candida flareri，Mycocandidariboflavina，丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridiumacetobutylicum)，以及使用產核黃素桿菌微生物(日本未審專利公開(Kokai)No.66894/1974)，Streptomyces testaceus的不同菌株(日本未審專利公開(Kokai)No.116690/1975)，產核黃素無色菌微生物(日本未審專利公開(Kokai)No.54094/1977)，產核黃素previbacterium菌微生物(日本未審專利公開(Kokai)No.110897/1977)，產核黃素酵母微生物(日本未審專利公開(Kokai)No.241895/1985)，Candida phamata(ATCC 20849)(國際專利公開No.509221/1993)。
作為培養(yǎng)基中的碳源，還已知是將糖類例如葡萄糖和蔗糖，淀粉或其水解產物，乙酸，檸檬酸，乙醇或碳氫化合物和安息香酸用于特定微生物。
然而，當油和脂肪被用作碳源時，油和脂肪必須被分散在水性培養(yǎng)基中，為達到此目的，培養(yǎng)基必須被攪拌，或分散劑或乳化劑必須被添加到該系統(tǒng)中。
在攪拌的條件下其中的油被乳化或懸浮在水中，然而，已證實微生物本身被殺死和毀壞從而導致核黃素產量的下降。
按照該方法將分散劑或乳化劑添加到系統(tǒng)中，進一步地，微生物受這些試劑不可避免的不利的影響，此外，加入的試劑混合物混入到形成的核黃素中。
發(fā)明的公開在通過利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并收集其中的核黃素來生產核黃素的方法的研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)核黃素可被高產量和高生產率制備方法是通過將植物油或動物油穩(wěn)定地分散在培養(yǎng)基中不要攪拌到破壞微生物的程度，當使具有油吸附特性的粘土礦物載體，其化學處理的產物或鈣化合物存在于培養(yǎng)基中時。
在通過利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并收集其中的核黃素來生產核黃素的方法的研究中，進一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)待被清除的廢植物油或廢動物油可通過利用其碳源吸留植物油或動物油的廢粘土被有效地利用。
也即，本發(fā)明的一個目的是提供一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物來生產核黃素的方法，其中的植物油或動物油以一種改進的方法被分散在培養(yǎng)基中，從而核黃素可被高產量和高生產率生產。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種以低成本且不需要繁瑣操作例如濃縮和重新回收核黃素的生產核黃素的方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供一種通過有效利用待被清除的廢植物油或廢動物油來回收核黃素的方法。
按照本發(fā)明提供了一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并從其中收集核黃素來生產核黃素的方法，其中要使具有油吸附特性的粘土礦物，其化學處理的產物或鈣化合物存在于培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的生產核黃素的方法中，理想的載體存在量占培養(yǎng)基的重量的0.1-10％。
依照本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，載體理想的為鏈接的粘土礦物，特定地，載體為具有70-400埃的纖維直徑和0.2-400μm的纖維長度的粘土礦物。
依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，理想的是至少部分載體是綠土粘土礦物和其酸處理的產物。
作為載體，此外，也可以使用鈣化合物，理想的為碳酸鈣。
在本發(fā)明中，對使載體存在于培養(yǎng)基中的方式沒有特定的限制。依賴于情況，然而，理想的是使載體存在于培養(yǎng)基中是處于吸留植物油或動物油的狀態(tài)，或利用廢粘土作為載體吸附植物油或動物油。
依照本發(fā)明，進一步提供了一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物在其中形成和積累核黃素并從其中收集核黃素來生產核黃素的方法，其中的碳源是吸留植物油或動物油的廢粘土。
依照本發(fā)明，進一步提供了一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物在其中形成和積累核黃素并從其中收集核黃素來生產核黃素的方法，其中的碳源是從吸留植物油或動物油的廢粘土中提取的油成分。
附圖的簡要說明

圖1是一個表示在培養(yǎng)時間，油殘留量和通過使大豆植物油存在于50cc培養(yǎng)基中產生的核黃素的量之間的關系的曲線圖(顯示核黃素在開始的48小時以后開始產生)；圖2是一個表示培養(yǎng)時間和微生物的重量增加之間的關系的曲線圖；圖3是顯示了48小時后微生物的顯微照片(A)(×600倍)以及通過用尼羅紅染色微生物的油成分的微生物的熒光顯微照片(B)(×600倍)；以及圖4是表示培養(yǎng)時間和微生物的重量增加之間關系的曲線圖(A)，培養(yǎng)時間和殘余的油濃度之間關系的曲線圖(B)，以及當1％量的海泡石被加入到培養(yǎng)基中(●)和當其不加入而以600rpm的速度攪拌時(▲)的培養(yǎng)時間和核黃素濃度之間的關系的曲線圖(C)。
發(fā)明的最佳實施方式在本發(fā)明中，產核黃素微生物被培養(yǎng)在培養(yǎng)基中利用植物油或動物油作為碳源，來形成和積累核黃素并從其中收集核黃素。在這里，一種具有吸油特性的粘土礦物，其化學處理的產物或鈣化合物置于培養(yǎng)基中。例如，一種pH已被調整并含有植物油或動物油的培養(yǎng)基被滅菌，然后，將預先已培養(yǎng)的產核黃素微生物注入和培養(yǎng)。在此情況下，上述的載體被放入培養(yǎng)基中來促進植物油和動物油的消耗從而來提高核黃素的產量和生產率。
基本上，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了如果在含有植物油或動物油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物的時候加入具有油吸附特性的粘土礦物，其化學處理的產物或鈣化合物到培養(yǎng)基中會提高核黃素的產量。例如，如果培養(yǎng)基中的核黃素的產量沒有混入粘土礦物時被視為100％，則當培養(yǎng)基被混入1％重量的海泡石甚至保持其它的條件相同時核黃素的產量增加至169％(大約1.6倍)(實驗的細節(jié)，參見實施例1)。
在核黃素的發(fā)酵中，作為有機物質的植物油或動物油被產核黃素微生物分解來積累代謝產物核黃素。依照本發(fā)明人進行的研究，可以了解導致分解的過程包括一個植物油或動物油首先被微生物攝取的過程，和一個被微生物攝取的植物油或動物油被分解的過程。
圖1是一個表示在培養(yǎng)時間，油殘留量和通過使大豆植物油存在于50cc培養(yǎng)基中產生的核黃素的量之間的關系的曲線圖，圖2是一個表示培養(yǎng)時間和微生物的重量增加之間的關系的曲線圖。
按照圖1，培養(yǎng)基中的油的量是隨著培養(yǎng)時間的推移而單調地減少。在這里，在培養(yǎng)基中的油量的減少和核黃素形成的量之間存在一個預定的時間間隔。在此的一個具體的實施例中，在經過開始后的48小時后核黃素開始產生。
圖3顯示了經過48小時后微生物的顯微照片(A)(×600倍)以及通過用尼羅紅染色微生物的油成分的微生物用熒光顯微鏡觀察時的熒光顯微照片(B)(×600倍)。在圖3(B)中，白色箭頭指示的部分是被染色的油成分。參照這些照片，在培養(yǎng)基中的植物油，首先被微生物吸收，然后被分解來積累代謝產物核黃素。
具有油吸附特性的粘土礦物或其化學處理的產物被用于本發(fā)明中來促進微生物攝取培養(yǎng)基中的植物油或動物油并且，進一步增強核黃素形成的產量。
圖4是表示培養(yǎng)時間和微生物的重量增加之間關系的曲線圖(A)，培養(yǎng)時間和殘余的油濃度之間關系的曲線圖(B)，以及當1％量的海泡石被加入到培養(yǎng)基中(●)和當其不加入而以600rpm的速度攪拌時(▲)的培養(yǎng)時間和核黃素濃度之間的關系的曲線圖(C)。
結果說明當海泡石被加入時，核黃素形成增加，然而油的吸收幾乎是相同的。
像產核黃素微生物一樣，用于本發(fā)明的穩(wěn)定存在于培養(yǎng)基水相中的具有油吸附特性的粘土礦物，其化學處理的產物的載體或鈣化合物由于其油吸附特性攝取油成分，在水中分散油形成細的顆粒，使得微生物容易攝取油成分，并促進這些作用。
這是通過作為載體的粘土礦物或其化學處理產物的加入獲得的作用和優(yōu)點。
粘土礦物或其化學處理產物以及植物油或動物油可通過各種手段或方法添加到培養(yǎng)基中。例如，粘土礦物或其化學處理產物以及植物油或動物油可單獨添加到培養(yǎng)基中或可以組合物的形式添加到培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的一個方面，粘土礦物或類似物的載體以吸留植物油或動物油的狀態(tài)被置于培養(yǎng)基中。廢粘土是獲得吸留植物油或動物油的載體的最簡單的形式。
酸性粘土或通過化學處理酸性粘土獲得的活性粘土被廣泛的用作漂白和精煉脂肪和油。然而在這種加工時產生的廢粘土又產生了如何處理的問題。即廢粘土含有大約20-大約60％重量的油。此外，廢粘土是一種粘的糊狀物形式其非常難于處理。廢粘土每年產生的量有50000噸。然而依照本發(fā)明，廢粘土被利用作為吸留植物油和動物油的載體來用于核黃素的發(fā)酵。也就是說，在廢粘土中的植物油和動物油被有效地用作一種資源使得重新利用其中植物油和動物油已被去除的粘土成為可能。這一資源的有效再利用使得有效地防止自然環(huán)境的污染成為可能。
本發(fā)明的核黃素的發(fā)酵在產生的核黃素被作為載體的粘土礦物或類似物吸附方面顯示出非常有價值的優(yōu)點。也即，在常規(guī)的發(fā)酵方法中，能量成本的相當大的量需要用來濃縮，因為形成的核黃素含在培養(yǎng)基中是一種稀釋的狀態(tài)。
依照本發(fā)明的發(fā)酵方法，另一方面，形成的核黃素被載體粘土礦物或類似物吸附。因此，吸附核黃素的載體可從培養(yǎng)基中分離，而核黃素可由分離出的載體提??；需要簡單的操作來實現(xiàn)濃縮和節(jié)約所可能涉及的成本。
本發(fā)明進一步利用從吸留作為碳源的植物油或動物油的廢粘土提取的油成分，此帶來有效利用廢粘土的優(yōu)點。
當將鈣化合物的代表性實例碳酸鈣用作載體時，進一步地，碳酸鈣阻止由因油和脂肪的分解產生的脂肪酸引起的pH值的下降，防止微生物被破壞并維持核黃素形成的高產量(參見實施例13)。從比較實施例8可以理解，進一步地，當將鎂化合物的氫氧化鎂用作與鈣相同的堿土金屬時，微生物的增殖沒有什么問題，然而卻沒有增加核黃素的產量。此歸結于油和脂肪分解形成的脂肪酸沒有用于核黃素的產生而用于增殖微生物的能源，然后當沒有碳源時用于促進孢子的形成。
用作本發(fā)明載體的粘土礦物或化學處理的產物具有油吸附特性且，通常具有纖維狀的，鱗片樣或層狀的外觀，以及在水相或油相中有好的分散性。
作為油吸附粘土礦物的優(yōu)選的實施例，可例舉鏈狀的粘土礦物。
用于本發(fā)明的鏈狀粘土礦物是纖維狀的硅酸鎂粘土礦物，代表為海泡石，綠坡縷石，坡縷石。其具有三維的鏈式結構，與二維的晶體結構例如滑石不同，其為多孔具有鏈狀結構的孔隙形成的小洞的的粘土礦物具有大的比表面面積，通過BET比表面面積方法測定其范圍為100-350m2/g且其具有吸附的功能。
與普通的也是多孔的其代表為高嶺石的層狀粘土礦物不同，海泡石具有明顯不同的特征其在水相系統(tǒng)中并不膨大。
由于于鏈式粘土礦物例如海泡石所具有的的特征，即由于纖維狀態(tài)和多孔特性，鏈式粘土礦物與微生物糾纏得較好從而使得微生物穩(wěn)定和安全，使安全的微生物具有多孔性，使得培養(yǎng)溶液和氧被很好的供應于微生物并提高了過濾的特性。
在本發(fā)明中，上述的鏈式粘土礦物可使用單一的種類，同樣也可以與二層結構的例如多水高嶺土或石棉結合或與火山纖維性礦物包括kanuma土或Akadama土結合使用。如所需要，進一步地，纖維狀粘土礦物可被用于與吸附性的粘土礦物例如沸石或酸性粘土或與巖石例如方石英，石英或長石結合使用。
優(yōu)選用于本發(fā)明的海泡石具有通式(I)表示的化學結構，(OH2)4(OH)4Mg8Si12O30·6-8H2O ---(1)其中的二維晶體結構例如滑石具有鏈式結構像當磚被交替地堆積一樣。
此外，盡管其具有一種由于通過鏈狀孔隙形成的纖維狀結構，但海泡石具有明顯不同的特征，即，不同于這些或其它的纖維性礦物的大的比表面面積和大的吸附特性。
本發(fā)明優(yōu)選使用具有范圍在100-350m2/g比表面積且吸附油量在100-300ml/100g的海泡石。當比表面積小于此范圍時，油吸附特性便不充分。另一方面，甚至當比表面積大于此范圍時，效果并不相應增加。
此外，優(yōu)選用于本發(fā)明的纖維狀海泡石，通常，具有70-400埃的纖維直徑，0.2-400μm的纖維長度以及5-500的縱橫比。
下面的表1顯示了海泡石的基本化學組成(110℃干燥2小時)。
表1海泡石的基本化學組份SiO252.50(％重量)MgO22.8Al2O31.7Fe2O30.8CaO0.8H2O+10.5H2O-11.0在本發(fā)明中，蒙脫石粘土礦物例如酸性粘土(高嶺土)，膨潤土，滑石粉，鋰蒙脫石和stevensite及其用酸處理的產物，可被用作載體。
在這些粘土礦物中，高嶺土的粘土礦物及其酸處理的產物適用于本發(fā)明的目的。這些被廣泛使用來漂白和精煉油和脂肪。
高嶺土粘土礦物例如酸性粘土是一種鋁硅酸鹽，其具有作為基本單元的三層結構，其中AlO6八面體層是夾在兩個SiO4四面體之間，很多的此種基本單元的三層結構被進一步層壓在C-軸方向來組成層狀的晶體結構。此層狀晶體結構在高嶺土粘土礦物中是共有的。
在各種高嶺土中，日本廣泛生產的酸性粘土是風化的且三層結構中的AlO6的八面體層作為高嶺土的基本單元部分被堿土金屬例如鎂或鈣取代，且氫離子與其鍵合來補償原子價。因此，如果酸性粘土被懸浮在食鹽的水性溶液中來測定其pH值，則顯示出酸性，因為氫離子被鈉離子所取代。另一方面，膨潤土顯示出中性到微弱的堿性pH，因為可交換的陽離子大部分為鈉離子且進一步顯示大的水溶脹特性。在另一方面，酸性粘土從吸收的角度來說是非常有優(yōu)點的，因為鈉離子已經被堿土金屬所取代，堿金屬組分的量是小的，水溶脹的特性是小的，且硅酸大量存在。因此，作為高嶺土，任意的日本生產的酸性粘土被廣泛使用。進一步利用稱作亞-]膨潤土(Ca-型膨潤土)的高嶺土粘土礦物。
下面的表2顯示了酸性粘土的基本化學組成(100℃干燥)。
表2SiO261.0-74.0(％重量)Al2O312.0-23.0Fe2O32.0-3.5MgO3.0-7.0CaO1.0-4.0K2O 0.3-2.0Na2O 0.3-2.0Ig.損失5.0-10.0在使用酸性粘土時，含在其中的巖石例如方石英，石英和長石可被容易地分離，通過利用比重差異的分離方法(此種分離方法例如水選法，空氣淘析法等等)。在它們中，晶體硅酸的方石英容易與堿反應且可被轉化為堿金屬硅酸鹽，以及可以，通過此方法被除去。
另一方面，酸性粘土的酸處理產物已知作為活性粘土其可被用作精煉油和脂肪的試劑。酸處理的產物可容易地通過用無機酸溶液例如硫酸或鹽酸處理酸性粘土制備，部分地洗脫含在其中的堿性組分并且洗滌。由于用酸處理，酸性粘土的層狀晶體結構部分被破壞，但硅酸(SiO2)含量的增加使得增加了比表面面積并改進了某此特性例如吸附特性。酸性粘土的酸處理產物以及，通常市售的活性粘土及其產生的中接產物，用作顯示出優(yōu)良的特性的精煉劑。
酸處理的產物通常具有下表3所顯示的組成，然而其可依據(jù)起始酸性粘土的種類或用酸處理的條件而變化。
表3SiO265.0-83.0(％重量)Al2O35.0-12.0Fe2O31.0-3.5MgO 1.0-7.0CaO 0.5-4.0K2O 0.2-2.0Na2O0.2-2.0Ig.損失 5.0-10.0理想的是酸性粘土和活性粘土以所謂的廢粘土的形式被用在本發(fā)明中吸留植物油或動物油。
可被用作載體的鈣化合物的具體例子包括天然的碳酸鈣(巖基，方解石，文石)，合成的碳酸鈣，硅酸鈣，氫氧化鈣，磷酸鈣(磷灰石，等等)。特別優(yōu)選的是使用碳酸鈣。
作為載體，可使用天然的二氧化硅，合成的二氧化硅，中空的二氧化硅，硅藻土，珍珠巖，碳酸鎂，硅酸鎂，硅酸亞鐵鎂，水鎂石，以及合成的氫氧化鎂與上述載體的組合。
在本發(fā)明中用作碳源的植物油廣泛存在天然的植物世界且主要含有脂肪酸和甘油的酯。例子包括紅花油，大豆油，菜油，棕櫚油，棕櫚仁油，棉子油，椰子油，米糠油，芝麻油，蓖麻油，亞麻子油，橄欖油，桐油，tsubaki油，花生油，爪哇木棉油，可可油，日本蠟，葵花子油以及玉米油。優(yōu)選的是用于本發(fā)明的植物油至少部分含有主要的一種不飽和的脂肪酸和甘油的酯。作為動物油，可使用魚油例如沙丁魚油，青魚油，墨魚油，竹刀魚油，以及l(fā)ever油，鯨脂油，牛油，酪乳，豬油，雞油，馬油和羊油。
用于本發(fā)明的方法的廢粘土作為通過利用漂白或精煉用的粘土來漂白或精煉油和脂肪的步驟中的副產物被分離出來。用于本發(fā)明的廢粘土含有油成分且從污染環(huán)境的角度其不應被丟棄。因此人們強烈地期望有效利用廢粘土。
也就是說，向被用來漂白或精煉的油或脂肪，加入蒙脫石的粘土礦物例如酸性粘土或通過用酸和/或堿處理上述粘土礦物獲得的以粉末試劑的形式用于漂白或精煉的活性粘土，使得二者均勻地一起攪拌且含在油和脂肪中的有色組分和雜質組分被吸附在粘土顆粒中。在漂白或精煉后分離的粘土含有大約20％到60％重量的油成分。
油和脂肪在已知的條件下被漂白，例如，通過加入基于油和脂肪重量的0.1到5％的粘土作為漂白或精煉試劑，并在90到150℃的溫度下攪拌兩種組合物5到30分鐘來完成漂白或精煉加工過程。
漂白或精煉后的混合物用任意的過濾器例如壓濾器，帶式過濾機，奧利弗過濾器，美國過濾器或減壓過濾器或增壓過濾器如離心濾器提供，來獲得精煉油和脂肪以及用作漂白或精煉試劑的所謂的廢粘土。廢粘土通常含有大約20到大約60％重量的被顆粒吸附的油組分，不過其可依據(jù)被用于精煉的起始油的種類而變化。另外一種考慮是該廢粘土具有催化的功能。
在本發(fā)明中，廢粘土可被用作碳源來用于發(fā)酵核黃素。
在本發(fā)明中任意已知的產生核黃素的微生物均可被用作產核黃素微生物。
作為產核黃素微生物，可以使用阿舒氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，Candida flareri，Mycocandida riboflavina，丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridiumacetobutylicum)，產核黃素桿菌微生物，Streptomyces testaceus的可變菌株，產核黃素無色菌微生物，產核黃素previbacterium菌微生物，產核黃素酵母微生物，Candida phamata(ATCC 20849)，等等。
在這些產核黃素微生物中，理想的是利用那些能夠攝取植物油或動物油作為碳源的微生物。優(yōu)選的例子是棉桃阿舒氏囊霉(Ashbyagossypii)ATCC10895。
本發(fā)明的發(fā)酵方法在培養(yǎng)基中使用植物油或動物油作為碳源。當然也允許結合使用除了植物油或動物油之外的其它碳源。作為可被組合使用的碳源，可以例舉出糖類例如葡萄糖，半乳糖，麥芽糖，纖維二糖，阿拉伯糖和蔗糖，糖醇例如甘油，有機酸例如乙酸，葡萄糖酸，琥珀酸，蟻酸，檸檬酸，富馬酸，谷氨酸，乳酸以及它們的鹽，以及醇例如甲醇和乙醇。
作為培養(yǎng)基中的氮源，可利用有機的或無機的銨化合物例如氨，氯化銨，硫酸銨，碳酸銨，磷酸銨和醋酸銨，脲或其衍生物以及任意的其它天然的氮源。
作為有機物質可以利用金屬鹽例如鈉，鉀，鎂，鈣，鋅，鈷，鎳，銅和錳，以及鹽酸，硫酸，磷酸或硝酸的鹽，以一種或多種的組合。
當所使用的微生物需要營養(yǎng)時，所需要的物質被加到培養(yǎng)基中。當需要時，進一步地，天然的營養(yǎng)物，各種微生物的水解產物，酵母提取物，日本米酒酒糟提取物，肉羹，蛋白胨以及降解的大豆餅可被加到培養(yǎng)基中。
根據(jù)情況，可進一步添加不同的物質例如嘌呤如鳥嘌呤，腺嘌呤以及次黃嘌呤，嘧啶如胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶，以及其糖類或磷酸化糖類的衍生物來增加核黃素形成的量。
在本發(fā)明中，核黃素可在已知的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)的條件例如溫度等處在已知的范圍中，通常從20到35℃且特別是從25到30℃。
培養(yǎng)基中的的水相和油相中也存在最佳的范圍。水相和油相以重量比，通常，從200∶1到3∶1的范圍，特別是，從50∶1到10∶1存在。
當油相的量大于上述的范圍或小于上述的范圍時，形成核黃素的速率趨于降低。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中的載體的量也存在一個最佳的范圍。理想的載體的量是從培養(yǎng)基重量的0.1到10％，尤其是從0.5到5％。
當載體的量太小時，核黃素的生產率降低且當載體的量太大時，核黃素的生長受到阻礙引起核黃素產量的下降。
當含有油組分的廢粘土被用作起始物質和作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的載體時，理想的廢粘土含有水相和油組分的重量比率為從100∶1到5∶1和，尤其是，從20∶1到5∶1。
當廢粘土相的量大于或小于上述的范圍時核黃素的產生速率趨于降低。
本發(fā)明的乳化方法不需要生硬地保持上面三種組分的加入的上述的次序，且可以選擇一種方法加載體到水中，攪拌混合物，加入油并攪拌以及乳化該混合物，然而其可依據(jù)混合油相和水相的速率，或油的使用，使用的條件或種類而變化。然而，更優(yōu)選，載體被加到油中并被攪拌以及，然后，水被加入，且混合物被攪拌和乳化來獲得更穩(wěn)定的乳化組合物。理想的攪拌以400到700rpm的速度進行。
本發(fā)明的乳化操作可以是一個常規(guī)采用的物理方法例如攪拌。在實驗室規(guī)模上，乳化操作可基于幾乎等同于普通家用混合器的具有剪切力的機械力來完成，其持續(xù)數(shù)十秒到幾分鐘。為了進行工業(yè)規(guī)模的大量的加工，可使用例如勻漿器，膠體壓榨機，射流攪拌器或螺旋式熱交換器。然而，本發(fā)明決不限于上述的物理方法，而且如需要可采用化學的方法例如一種逆乳化方法，一種凝膠乳化方法或HLB-溫度乳化方法。
為了培養(yǎng)微生物，本發(fā)明含有粘土礦物的乳化劑加入到含有用微生物和油以及脂肪的培養(yǎng)基中。然后，通過使用常規(guī)通氣攪拌容器或者諸如填充床型反應器或者氣升式氣泡塔，上述形成的乳化組分通過任一分批系統(tǒng)，半分批系統(tǒng)，重復分批系統(tǒng)或者連續(xù)系統(tǒng)根據(jù)發(fā)酵產物的特性進行培養(yǎng)。
本發(fā)明將通過實施例進行描述，但是本發(fā)明決不限于此。
(測定方法)(1)測定油的消耗量5毫升己烷被加入到5ml的培養(yǎng)液中，一起混合兩分鐘?；旌衔镌?000rpm離心分離15分鐘。己烷層移出，在105℃干燥3小時，獲得油的剩余量，然后將所述剩余油從最初所使用量減去來獲得消耗量。
(2)測定核黃素濃度。
培養(yǎng)液進行稀釋使得核黃素的濃度不高于30mg/L，然后將0.2ml的1N NaOH與0.8ml的稀釋培養(yǎng)液混合。取出混合了NaOH的培養(yǎng)液0.4ml，然后加入1mL的0.1M的磷酸緩沖液(pH6.0)?；旌衔镌?1,000rpm離心分離10分鐘，取出懸浮液，在444nm處測定其吸光度。根據(jù)在444納米波長處的吸光度×稀釋倍數(shù)×127.2971計算以mg/L單位表示核黃素的濃度。
(3)吸光度通過使用由Hitachi，Ltd生產的U-2001型進行測定。
(4)熒光顯微照相通過使用由Olympus Kogaku Co.生產的IX-70型進行觀察。
(實施例1)(在燒瓶中培養(yǎng))(預培養(yǎng))30g的CSL(玉米漿)，9g的酵母提取物以及15g的大豆油溶解在一起，向其中加入蒸餾水使體積為1升。然后加入5N的KOH調整pH值到6.8，從而制備培養(yǎng)基。
100毫升這樣制備的培養(yǎng)基加入到500mL的使瓶中并進行滅菌。然后，植入棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895并在28℃，220rpm培養(yǎng)24小時獲得預培養(yǎng)液。
(主培養(yǎng))50g的大豆油和11.1g的海泡石(商品名Aidplus ML-50D，由Mizusawa Kagaku Co生產)彼此混合。此混合物以及30g的明膠，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+溶解在1升的蒸餾水中，用5N的KOH將pH調整到6.8以制備培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中海泡石的濃度為1.1％重量(后面出現(xiàn)的實施例中，海泡石由上述Mizusawa Kagaku Co生產)。
50毫升的上述培養(yǎng)基加入到500mL的燒瓶中并進行滅菌。然后，植入1ml的預培養(yǎng)液并在28℃，220rpm培養(yǎng)7天。獲得的核黃素的濃度，產率(％)以及增長率(％)顯示在表4中。
增長率根據(jù)下列公式進行計算，增長率(％)＝(A-B)×100/B其中A為當加入海泡石時的核黃素濃度，B為不加海泡石時的核黃素濃度。
產率根據(jù)由1g的起始油(在本實施例中是大豆油)產生的核黃素的量(％)表示。
(實施例2到4)主培養(yǎng)的培養(yǎng)基以實施例1的相同方式將pH調整到6.8進行制備，除了將海泡石的量改變到22.3g，33.4g以及55.7g。在獲得的培養(yǎng)基中海泡石的濃度分別為2％重量，3％重量，以及5％重量。
將50毫升的上述培養(yǎng)基加入到500mL的燒瓶中并進行滅菌。然后，植入1ml實施例1制備的預培養(yǎng)液并在28℃，220rpm培養(yǎng)7天。獲得的核黃素的濃度，產率(％)以及增長率(％)顯示在表4中。
(比較實施例1)pH調整到6.8的主培養(yǎng)的培養(yǎng)基以實施例1的相同方式進行制備，除了不使用海泡石。
50毫升的上述培養(yǎng)基加入到500mL的燒瓶中并進行滅菌。然后，植入1ml實施例1制備的預培養(yǎng)液并在28℃，220rpm培養(yǎng)7天。獲得的核黃素的濃度，產率(％)以及增長率(％)顯示在表4中。
表4實施例1 實施例2 實施例3實施例4 比較實施例1海泡石的量1wt％2wt％3wt％ 5wt％ 0wt％核黃素濃度1,100mg/L1,001mg/L966mg/L863mg/L690mg/L產率(％) 2.2 2.0 1.91.71.4增長率59％ 45％ 4 0％ 25％ 0％
實施例5到7(小型發(fā)酵罐培養(yǎng))(預培養(yǎng))2g的酵母提取物，20g的蛋白胨，0.6g的肌醇和10g的葡萄糖溶解在1升蒸餾水中，用5N KOH將pH調整到6.8獲得培養(yǎng)基A。
此外，30g的CSL(玉米漿)，9g的酵母提取物以及15g的大豆油溶解在一起，并向其加入蒸餾水使體積為1升。然后加入5N的KOH調整pH值到6.8，從而制備培養(yǎng)基B。
50毫克培養(yǎng)基A加入到500mL的錐形瓶中并進行滅菌。然后，植入棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895并在28℃，220rpm預培養(yǎng)24小時獲得培養(yǎng)液A。
隨后，100ml培養(yǎng)基B加入到500mL的錐形瓶中并進行滅菌。然后，植入1ml上面獲得的培養(yǎng)液并開始第二次培養(yǎng)24小時獲得二次培養(yǎng)液。
(主培養(yǎng))用于主培養(yǎng)(海泡石的濃度為1％重量)的培養(yǎng)基以和實施例1大體相同的方式進行制備。2升的這種培養(yǎng)基加入一個5升的小發(fā)酵罐并滅菌。然后，植入上述獲得的二次培養(yǎng)液，并培養(yǎng)5天。提供氧氣(1vvm)同時將攪拌速度改變到400到700rpm。
表5顯示了獲得的核黃素的濃度以及增長率(％)。表5的結果為通過在不同攪拌速度進行兩次實驗獲得的結果。
(比較實施例2到4)不含海泡石的用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基以和比較實施例1大體相同的方式進行制備。2升的這種培養(yǎng)基加入一個5升的小發(fā)酵罐并滅菌。然后，植入實施例5制備的二次培養(yǎng)液的，并培養(yǎng)5天。提供氧氣同時將攪拌速度改變到400到700rpm。
表5顯示了獲得的核黃素的濃度和增長率(％)。
表5攪拌速度核黃素濃度增長率實施例5-1400rpm 1,230mg/L 583％比較實施例2-1400rpm 1 80mg/L -實施例5-2400rpm 1,094mg/L 501％比較實施例2-2400rpm 1 82mg/L -實施例6-1600rpm 2,380mg/L 54％比較實施例3-1600rpm 1,550mg/L -實施例6-2600rpm 2,500mg/L 44％比較實施例3-2600rpm 1,731mg/L -實施例7-1700rpm 1,922mg/L 27％比較實施例4-1700rpm 1,515mg/L -實施例7-2700rpm 1,580mg/L 35％比較實施例4-2700rpm 1,169mg/L -(實施例8)菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895在含有10g酵母提取物，10g葡萄糖，3g甘氨酸以及20g/L瓊脂的固體培養(yǎng)基(pH6)上于30℃培養(yǎng)2天(固體培養(yǎng))。
隨后，含有30g/L CSL，15g/L的酵母提取物以及6g/L的大豆油的蒸餾水培養(yǎng)基進行滅菌，然后向其中植入鉑環(huán)量的上述固體培養(yǎng)物，在28℃，220rpm預培養(yǎng)24小時獲得預培養(yǎng)液。
隨后，30g的明膠，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+，以及碳源溶解在1升的蒸餾水中，用5N的KOH將pH調整到6.8以制備用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。利用含有40％重量的菜油的廢粘土作為碳源。
2毫升的預培養(yǎng)液植入到這樣制備的培養(yǎng)基中進行主培養(yǎng)，并在搖床上于28℃，220rpm培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)結束后，分離出廢粘土，取出其濕重為1.5g(在105℃干燥2小時重量為0.636g)提取核黃素。提取方法包括向廢粘土中加入0.4NNaOH，然后進行劇烈攪拌以測定上清液核黃素的濃度。
結果，核黃素通過兩次提取可以回收高于80％，通過3次提取可回收高于90％。表6顯示了獲得的核黃素的濃度以及產率(％)。
(實施例9)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與實施例8大體上相似的方式進行主培養(yǎng)，但是使用125g含40％重量棕櫚油作為碳源的廢粘土進行，與實施例8相同的方式提取核黃素。表6顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(實施例10和11)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
與實施例8大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用50g提取自廢粘土的菜油或者棕櫚油作為碳源進行。
培養(yǎng)結束后，測定油的濃度和核黃素的濃度，并從測定結果計算產率(％)。
為了計算油的濃度，培養(yǎng)結束后提取2ml的培養(yǎng)液，并加入相同量的己烷，充分混合2分鐘。然后將混合物在3000rpm進行離心分離，去除上清液，蒸發(fā)掉己烷，然后進行干燥。隨后，測定油的重量以計算油的濃度。核黃素的濃度根據(jù)上述方法進行計算。
表6顯示了核黃素濃度和產率(％)。
表6實施例8實施例9 實施例10 實施例11油的種類菜油 棕櫚油提取油1提取油2核黃素濃度 1,123.2880.0 833.4 863.9產率(％)2.22.2 1.71.7提取油1從廢粘土提取的菜油。
提取油2從廢粘土提取的棕櫚油。
核黃素濃度mg/L單位表示。
(比較實施例5和6)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與實施例8大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用50g純的大豆油(由Wako Junyaku Co生產的試劑)或者菜油(由Nakaraitesk生產的試劑)作為碳源進行。
培養(yǎng)結束后，通過與實施例10和11相同的方式測定油的濃度和核黃素的濃度，并從測得的結果計算產率(％)。表7顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
表7比較實施例5 比較實施例6油的種類(新油)大豆油 菜油核黃素濃度(mg/L) 76 8.2 778.6產率(％) 1.5 1.6實施例12通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與實施例8大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用188g含40％重量棕櫚油作為碳源的廢粘土進行主培養(yǎng)10天，并以與實施例8相同的方式提取核黃素。表8顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(比較實施例7)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，通過與實施例12大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用75g純棕櫚油(Spectrum Chemical Mfg.Corp)作為碳源進行。
培養(yǎng)結束后，通過與實施例10和11相同的方式測定油的濃度和核黃素的濃度，并從測得的結果計算產率(％)。表8顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
表8實施例12 比較實施例7油的種類棕櫚油 棕櫚油(新)核黃素濃度(mg/L)2500 1600產率(％)3.8 2.5實施例13制備吸收50g菜油(PC由Shiroshi Calcium Kogyo Co.生產)的碳酸鈣125g。這種碳酸鈣以及30g的明膠，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+溶解在1升的蒸餾水中，用5N的KOH將pH調整到6.8以制備用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。50毫升的上述培養(yǎng)基加入500ml的培燒并進行滅菌。然后，在實施例1中制備的1ml預培養(yǎng)液植入并在28℃，220rpm培養(yǎng)7天。表9顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(比較實施例8)通過與實施例13相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用125g吸收了50g菜油的氫氧化鎂替代上述碳酸鈣。獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(比較實施例9)與實施例13相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用125g吸收了50g菜油的硅(MTZUCASIL P707由Mizu-Sawa Kogyo Co.制造)代替上述碳酸鈣。表9顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
表9實施例13 比較實施例8 比較實施例9載體的種類 碳酸鈣 氫氧化鎂 硅石核黃素濃度(mg/L)1200 0 390產率(％)2.4 0 0.7實施例14通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與實施例8大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用125g含40％重量牛油和豬油(牛油∶豬油＝1∶1的混合物)作為碳源的廢粘土進行主培養(yǎng)，并用與實施例8相同的方式提取核黃素。表10顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(比較實施例10)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與實施例14大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用50g純牛油作為碳源。表10顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
(比較實施例11)通過使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通過與實施例8相同的方式進行固體培養(yǎng)和預培養(yǎng)獲得預培養(yǎng)液。
另外，與比較實施例10大體上相同的方式進行主培養(yǎng)，但是使用50g純牛油作為碳源。表10顯示了獲得的核黃素濃度以及產率(％)。
表10實施例14比較實施例10 比較實施例11動物油和脂的種類牛油，豬油 牛油 豬油核黃素濃度(mg/L) 997.16335.64260.53產率(％) 1.99 0.67 0.52根據(jù)該生產核黃素的方法，即通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，通過利用植物油或者動物油作為碳源在其中形成和聚集核黃素并收集核黃素，具有油吸收特性的粘土礦物載體，其化學處理產物或者鈣化合物在培養(yǎng)基中存在使得可以穩(wěn)定地將植物油分散在培養(yǎng)基中，而且不影響攪拌操作到過度的程度從而損傷微生物，因此能夠高產量和高生產率地生產核黃素。
本發(fā)明進一步提供了通過利用植物油或者動物油作為碳源在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物的方法，其中植物油或者動物油以改良的方式分散在培養(yǎng)基中，使得能夠高產量和高生產率地生產核黃素。
本發(fā)明進一步提供了以低成本生產核黃素的方法，不需要諸如濃縮或者回收核黃素的煩瑣操作。
本發(fā)明還使得從待處理的廢植物油或者廢動物油中高效回收核黃素成為可能?；厥盏暮它S素可以用作藥物，動物食品添加劑，食品染色劑以及營養(yǎng)助劑。當通過粘土礦物攜帶時，核黃素優(yōu)選用作動物食品補充營養(yǎng)并增強腸道功能。尤其是，廢粘土可被高效利用并且同時可以減輕環(huán)境負擔。也可以添加本發(fā)明使用的載體到由家庭，快餐店，面包店等所排放的已成為處理的難題的廢食用油中，來從中產生核黃素。
權利要求
1.一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并從中回收核黃素來生產核黃素的方法，其中使具有油吸附特性粘土礦物載體，其化學處理的產物或鈣化合物存在于培養(yǎng)基中。
2.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中的載體存在的量為培養(yǎng)基重量的0.1-10％。
3.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中的載體是鏈狀粘土礦物。
4.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中的粘土礦物具有70-400埃的纖維直徑和0.2-400μm的纖維長度。
5.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中至少部分的載體是蒙脫土粘土礦物和其酸處理的產物。
6.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中的載體以吸留植物油或動物油的狀態(tài)存在于培養(yǎng)基中。
7.根據(jù)權利要求6的生產方法，其中的吸留植物油或動物油的載體是廢粘土。
8.根據(jù)權利要求1的生產方法，其中的鈣化合物是碳酸鈣。
9.一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并從中回收核黃素來生產核黃素的方法，其中的碳源是吸留植物油或動物油的廢粘土。
10.一種通過在利用植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素微生物，在其中形成和積累核黃素并從中回收核黃素來生產核黃素的方法，其中的碳源是從吸留植物油或動物油的廢粘土提取的油成分。
全文摘要
一種生產核黃素的方法，包括在植物油或動物油作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產核黃素真菌來實現(xiàn)核黃素的形成和積累以及核黃素的回收，其特征在于由能夠吸收油成分的粘土礦物或其化學處理的產物或鈣化合物組成的載體被摻入到培養(yǎng)基中。此方法使得能夠以低成本濃縮和回收核黃素，不需要費時的操作，從而，核黃素可被高生產率生產，且進一步能夠有效的利用待處理的廢植物油或動物油來回收核黃素。
文檔編號C12P25/00GK1518601SQ0380049
公開日2004年8月4日 申請日期2003年2月18日 優(yōu)先權日2002年2月19日
發(fā)明者阿部潔, 新田裕, 樸龍洙, 鄭銀熙, 明華 申請人:水澤化學工業(yè)株式會社