專利名稱：遺傳操作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)使用轉(zhuǎn)座子(transposons)在生物體中傳遞遺傳信息的方法。具體地說(shuō)，它涉及在發(fā)育的預(yù)定期誘導(dǎo)細(xì)胞遺傳改變的方法。
背景技術(shù)：
高通量(high through-put)DNA測(cè)序技術(shù)及復(fù)雜的數(shù)據(jù)捕捉和計(jì)算機(jī)分析的發(fā)展使人們完成了包括果蠅和人類(lèi)的全基因組測(cè)序。已經(jīng)鑒定到了沒(méi)有相關(guān)生物學(xué)功能的、新的“預(yù)測(cè)性”基因序列。要闡明哪些基因是人類(lèi)疾病治療和診斷的治療性靶點(diǎn)，首先需要了解其功能信息。
目前，鑒定個(gè)體基因功能及其與疾病狀態(tài)的功能關(guān)系是生物技術(shù)和醫(yī)藥工業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。鑒定疾病相關(guān)基因?qū)⒋龠M(jìn)新藥或藥物發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的發(fā)展，提供疾病的診斷性或預(yù)示性標(biāo)志物，指導(dǎo)醫(yī)生開(kāi)處方。其中后者在具有復(fù)雜遺傳因素的疾病中將尤為有用。當(dāng)患者間遺傳的差異可以測(cè)定時(shí)，可以建立個(gè)人用藥程序，鑒定特定患者對(duì)藥物作用的應(yīng)答。
有許多鑒定基因功能的方法正在應(yīng)用，多數(shù)依賴于健康和疾病狀態(tài)中基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)圖譜的對(duì)比分析。這類(lèi)途徑花費(fèi)大、耗時(shí)，結(jié)果經(jīng)常是主觀性的，缺少將基因表達(dá)變化和功能性疾病相關(guān)的體內(nèi)事件相聯(lián)系的有力證據(jù)。基因功能的證實(shí)需要在動(dòng)物模型中進(jìn)行研究，這些動(dòng)物模型系統(tǒng)將原因(即基因序列中突變，缺失或插入)直接與整體動(dòng)物中的可檢測(cè)效應(yīng)(即行為、發(fā)育、代謝等)相聯(lián)系。
小鼠和其他哺乳動(dòng)物中的基因功能研究目前僅限于A)在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的“敲除”轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)個(gè)體基因進(jìn)行辛苦的突變分析，其中胚胎干細(xì)胞通常包含通過(guò)病毒感染導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因。
B)通過(guò)烷基化試劑進(jìn)行體內(nèi)隨機(jī)突變，隨后進(jìn)行全基因組序列分析來(lái)鑒定多個(gè)突變。
敲除方法是有效的，該方法根據(jù)與已知功能基因的序列同源性來(lái)推測(cè)其功能，但是該方法耗時(shí)、耗力。
烷基化方法完全依賴于鑒定突變位點(diǎn)及對(duì)前面所測(cè)定行為特點(diǎn)和代謝數(shù)據(jù)的變化進(jìn)行分類(lèi)的全基因組測(cè)序。隨后須將鑒定到的表型和目標(biāo)小鼠基因組中的可能上百種烷基化事件中的一個(gè)事件相關(guān)聯(lián)。該方法也非常耗時(shí)，需要產(chǎn)生并維持大的小鼠文庫(kù)，并且局限于近交的小鼠系(比較性評(píng)論參見(jiàn)Abuin et al.(2002)TIB 20，36-42)。
獲得突變的另一個(gè)方法是將外源DNA導(dǎo)入基因組中。
轉(zhuǎn)座子是能夠從物種基因組中的一個(gè)位置跳躍或轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位置上的天然遺傳元件。轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)(mobilisation)依賴于轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)，轉(zhuǎn)座酶能夠與轉(zhuǎn)座子DNA旁側(cè)的序列相結(jié)合，導(dǎo)致DNA從基因組中的一個(gè)位點(diǎn)上切除，并重新插入到基因組中的其他位置上。向基因序列中的插入會(huì)導(dǎo)致基因功能的改變，這種改變反過(guò)來(lái)可導(dǎo)致整個(gè)生物體表型的可檢測(cè)性改變。
在三個(gè)“經(jīng)典”的模型動(dòng)物即蠅、蟲(chóng)和小鼠中，已經(jīng)在黑腹果蠅和線蟲(chóng)中建立了基于轉(zhuǎn)座子的有效插入方法。轉(zhuǎn)化了果蠅遺傳，果蠅中P元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因和插入誘變的導(dǎo)入[Spradling & Rubin(1982)Science 218，341-347]轉(zhuǎn)變了果蠅的遺傳特征，為其他真核生物中類(lèi)似方法學(xué)的建立提供了范例。但是，P元件的宿主范圍非常有限，因此過(guò)去十年里，采用了其他的元件作為各種復(fù)雜的真核生物中基因轉(zhuǎn)移和/或誘變的載體，這些真核生物包括線蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物、斑馬魚(yú)之類(lèi)的魚(yú)和鳥(niǎo)。
從D.hydei中分離出來(lái)的Minos為2型轉(zhuǎn)座子，是Tc1元件家族的成員。Minos已經(jīng)用于黑腹果蠅、C.capitata和史氏按蚊的胚系(germline)轉(zhuǎn)化(Loukeris，T.G.et al(1995)Proc Natl Acad Sci USA，92，9485-9；Loukeris，T.G.et al(1995)Science，270，2002-5；Catteruccia F.et al.(2000)Nature 405959-962)，通過(guò)瞬時(shí)移動(dòng)分析，發(fā)現(xiàn)它在黑腹果蠅、埃及伊蚊、史氏按蚊和家蠶的胚胎及黑腹果蠅、埃及伊蚊、岡比亞按蚊和草地夜蛾的細(xì)胞系中具有活性(Catteruccia，F(xiàn).et al(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，2157-2162；Klinakis et al(2000)EMBOReports 1416-421；Shimizu et al.Insect Mol Biol 2000 Jun；9(3)277-81)。
Gelbart WM，Blackman RK，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol(1989)3637-46中對(duì)黑腹果蠅的hobo元件作了介紹。
Ivics et al(1997)Cell 91，501-510和Horie et al(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(16)9191-9196中介紹了Salmonid型轉(zhuǎn)座子，如Sleeping Beauty(SB)轉(zhuǎn)座子，一個(gè)從魚(yú)重新構(gòu)建的Tc1/mariner樣轉(zhuǎn)座元件。
Mairiner是最初從Drosophila mauritiana分離的轉(zhuǎn)座子，但是后來(lái)在多種無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了該元件。國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/09817中描述了如何使用maieiner轉(zhuǎn)化生物體。
Hermes來(lái)源于普通家蠅。美國(guó)專利5,614,398中介紹了其在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)中的應(yīng)用，該專利整體形式在此引用作為參考。
PiggyBac是來(lái)源于桿狀病毒宿主Trichplusia ni的轉(zhuǎn)座子。Handleret al.，(1998)PNAS(USA)957520-5和美國(guó)專利6,218/185中介紹了其在Medfly胚系轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
歐洲專利申請(qǐng)0955364(Savakis et al.，其內(nèi)容在此引入作為參考)介紹了Minos轉(zhuǎn)化細(xì)胞、植物和動(dòng)物的應(yīng)用。另外還介紹了包含一個(gè)或多個(gè)Minos插入的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/07871介紹了C.elegan的Tc1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化C.elegan和人細(xì)胞系的應(yīng)用。
黑腹果蠅中的果蠅P元件在增強(qiáng)子捕獲和基因標(biāo)記中的應(yīng)用也有介紹，參見(jiàn)Wilson et al.，(1989)Genes Dev.31301；Spradling et al.，(1999)Genetics 153135。
在優(yōu)先領(lǐng)域里介紹的技術(shù)中，認(rèn)為使用用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子跳躍(或轉(zhuǎn)座)的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)座酶是必要的。其中描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有以順式或反式形式提供的轉(zhuǎn)座酶，例如通過(guò)與轉(zhuǎn)座酶基因共轉(zhuǎn)化來(lái)提供。
轉(zhuǎn)座元件介導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法是通過(guò)將兩種質(zhì)粒的混合物注射到胚盤(pán)形成前的胚胎中，兩種質(zhì)粒中的其中一種表達(dá)轉(zhuǎn)座酶(輔助因子)，但是不能轉(zhuǎn)座；另外一種攜帶有旁側(cè)為元件(供體)反向末端重復(fù)的目的基因。通過(guò)檢測(cè)顯性標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)發(fā)現(xiàn)受注射動(dòng)物已轉(zhuǎn)化的子代。
PCT/EP01/03341(WO01/71019)介紹了如何使用轉(zhuǎn)座元件來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。根據(jù)該方法，通過(guò)將轉(zhuǎn)基因生物體相雜交來(lái)提供轉(zhuǎn)座酶的功能；其中一個(gè)生物體提供轉(zhuǎn)座子功能，另一個(gè)生物體提供轉(zhuǎn)座酶功能，以便產(chǎn)生所需細(xì)胞或組織中包含轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的生物體。使用組織特異性染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域以組織特異性的方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶活性，在體細(xì)胞組織中產(chǎn)生多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)座事件(參見(jiàn)Zagoraiou et al(2001)P.N.A.S.98 11474-11478)。
轉(zhuǎn)座作用可以加以“標(biāo)記”，使得能夠快速檢測(cè)到復(fù)合體基因組中的位置變化，并通過(guò)測(cè)序分析測(cè)定旁側(cè)基因。這可以在原因(即特定基因或調(diào)控元件中的插入事件)和效應(yīng)(即可檢測(cè)表型的改變)之間建立直接的聯(lián)系。但是，通過(guò)轉(zhuǎn)座作用誘導(dǎo)基因修飾的傳統(tǒng)方法具有不利因素發(fā)生轉(zhuǎn)座的組織是含獨(dú)特轉(zhuǎn)座作用的個(gè)體細(xì)胞的嵌合體。這樣的結(jié)果是難以對(duì)轉(zhuǎn)座事件所導(dǎo)致的表型結(jié)果進(jìn)行分析，因?yàn)槊總€(gè)轉(zhuǎn)座事件都是獨(dú)特的。因而，可以看出控制轉(zhuǎn)座事件、從而在大量細(xì)胞中提供相同基因修飾的方法將對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域具有很大的貢獻(xiàn)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)(cognate)的轉(zhuǎn)座酶基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(d)誘導(dǎo)所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致子代的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
換句話說(shuō)，本發(fā)明提供了通過(guò)轉(zhuǎn)座子移動(dòng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生子代，使該子代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(b)誘導(dǎo)所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致子代的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
適當(dāng)?shù)卣f(shuō)，第一成年轉(zhuǎn)基因生物體可以市包含穩(wěn)定整合有“靜止”轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因系。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的ES細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因系。可以通過(guò)與第二成年轉(zhuǎn)基因生物體雜交來(lái)誘導(dǎo)靜止轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種能夠快速產(chǎn)生上千種突變子代如小鼠突變體的方法。
“子代”指第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間的繁殖產(chǎn)物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在胚系發(fā)育過(guò)程中特異性表達(dá)的序列。相應(yīng)地，子代的胚細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件。


圖13所示為利用雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用的示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在卵母細(xì)胞中。將雌性動(dòng)物和雄性動(dòng)物雜交后獲得突變體。
相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，子代是上述第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間雜交產(chǎn)生的雌性轉(zhuǎn)基因生物體。在該實(shí)施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在雌性子代卵子發(fā)生過(guò)程中特異性表達(dá)的序列。因而，卵子發(fā)生過(guò)程中誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)。該事件反過(guò)來(lái)在卵母細(xì)胞中引起胚系轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生，從而產(chǎn)生具有插入序列的卵母細(xì)胞。
在該實(shí)施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列來(lái)源于卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)基因的調(diào)控序列。適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列包括那些控制卵母細(xì)胞基因，如Zp3、Zp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、Figla和Mater表達(dá)的序列(例如，可參見(jiàn)Rajkovic and Matzuk，Molecular and CellularEndocrinology，187(2002)，5-9)。其他的適當(dāng)調(diào)控序列可以來(lái)源于Oct-4的調(diào)控序列。
圖14所示為利用雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子、雄性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在精子中。
相應(yīng)地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，子代是上述第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間雜交產(chǎn)生的雄性轉(zhuǎn)基因生物體。在該實(shí)施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在雄性子代精子發(fā)生過(guò)程中特異性表達(dá)的序列。因而，精子發(fā)生過(guò)程誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)。該事件反過(guò)來(lái)引起在精母細(xì)胞中胚系轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生，從而產(chǎn)生具有插入序列的精母細(xì)胞。
在該實(shí)施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列來(lái)源于精母細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中表達(dá)基因的調(diào)控序列。適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列包括那些控制精母細(xì)胞特異性mRNA如Hlt基因轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的序列(Bartell etal.Biol of Reproduction 2000；Aug；63(2)；409-16)。
適當(dāng)?shù)?，使胚系中發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的子代相交配，產(chǎn)生能夠鑒定其轉(zhuǎn)座事件的后代。具有胚系轉(zhuǎn)座作用的子代可以和正常配對(duì)物(mate)相交配，或和自身具有胚系轉(zhuǎn)座作用的配對(duì)物相交配。
在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“子代”是胚胎。相應(yīng)地，在該實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和
(d)誘導(dǎo)所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
換句話說(shuō)，本發(fā)明提供了通過(guò)轉(zhuǎn)座子移動(dòng)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種胚胎，使該胚胎一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(b)誘導(dǎo)所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
這里所述的“胚胎”可以理解為從單一的受精卵或合子發(fā)育至出生或脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物的孵出或植物的萌發(fā)時(shí)的結(jié)構(gòu)。因而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“胚胎”應(yīng)該還包括哺乳動(dòng)物胎兒。
圖15所示為使用雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子、雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座在卵細(xì)胞或早期胚胎中發(fā)生。
可以在胚胎發(fā)育的任何時(shí)間誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞或組織中轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)，例如在胚胎發(fā)育階段的預(yù)定期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。通過(guò)在發(fā)育的這種階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座，單細(xì)胞中的突變基因可以在隨后的細(xì)胞分裂中復(fù)制，產(chǎn)生轉(zhuǎn)座基因基本同質(zhì)(homogeneous)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群。因而，轉(zhuǎn)座的基因可以存在于特定組織或組織群的某些或全部細(xì)胞中。本發(fā)明因此能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和生物體，這種轉(zhuǎn)基因胚胎和生物體包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)于個(gè)體突變?yōu)橥|(zhì)的克隆細(xì)胞群。
因此，本發(fā)明的第二方面提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的方法，其中轉(zhuǎn)基因生物體中的多個(gè)細(xì)胞或組織對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)座移動(dòng)加以修飾的基因來(lái)說(shuō)是純合的，該方法包括產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因胚胎，并根據(jù)本發(fā)明的第一方面中的方法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因胚胎中的轉(zhuǎn)座。
染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄復(fù)合體來(lái)說(shuō)是可接近的，并且在胚胎發(fā)育以及成年生命過(guò)程和異常生長(zhǎng)情況如腫瘤的不同時(shí)間、不同細(xì)胞組織類(lèi)型中，轉(zhuǎn)座事件很可能是不同的，因此本發(fā)明的方法通過(guò)在發(fā)育的不同時(shí)間調(diào)控轉(zhuǎn)座作用還增加了基因組范圍轉(zhuǎn)座的可能性。
可以使用染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域，例如作用無(wú)處不在的染色質(zhì)開(kāi)放元件(UCOEs)(PCT/GB99/02357(WO0005393))、基因座控制區(qū)(LCRs)(Fraser，P.& Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365)、CpG島(CpG islands)或隔離子(insulators)來(lái)控制轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達(dá)，進(jìn)一步增加在特定基因組區(qū)域中發(fā)生轉(zhuǎn)座的可能性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的序列摻入染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域中，增加胚胎靶組織中發(fā)生轉(zhuǎn)座的可能性，從而產(chǎn)生組織中轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細(xì)胞群。例如，當(dāng)需要在特定的組織中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座時(shí)，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的序列摻入基因座控制區(qū)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)組織中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性控制。當(dāng)不存在特異性LCR而需要誘導(dǎo)組織中的轉(zhuǎn)座、和/或需要誘導(dǎo)特定組織中早期轉(zhuǎn)座時(shí)，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的序列摻入U(xiǎn)COE中。在本發(fā)明的具體優(yōu)選實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因都摻入到了染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域中。這樣有力地增強(qiáng)了胚胎發(fā)育過(guò)程中整個(gè)基因組中特定基因座上的轉(zhuǎn)座效率，從而產(chǎn)生特定轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群。
因此，本發(fā)明在第三方面中進(jìn)一步提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎，使該胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼和所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(d)誘導(dǎo)所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將第一生物體和第二生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎。其中第一生物體包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子，第二生物體是一個(gè)轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼轉(zhuǎn)座酶的可調(diào)控基因。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，通過(guò)將第一生物體和第二生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎。其中第一生物體是轉(zhuǎn)基因生物體，包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因；第二生物體包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、為轉(zhuǎn)座酶表達(dá)所必需的調(diào)控元件。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以以單一構(gòu)建體的形式提供，使轉(zhuǎn)座子移動(dòng)時(shí)能夠破壞編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，從而限制轉(zhuǎn)座子的進(jìn)一步移動(dòng)?？梢詫⒁粋€(gè)轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列置于內(nèi)含子中來(lái)達(dá)到這種目的。其中內(nèi)含子以一定的方向中斷轉(zhuǎn)座酶基因，使轉(zhuǎn)座酶基因在轉(zhuǎn)座子移動(dòng)時(shí)遭到破壞。該載體使我們能夠采用單一的雜交步驟來(lái)產(chǎn)生包含調(diào)控因子、轉(zhuǎn)座酶基因和轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因生物體。另外，轉(zhuǎn)座作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)座酶的完全失活，使新的插入物即使在誘導(dǎo)物存在的情況下也能保持穩(wěn)定。圖1示意性地說(shuō)明了這種載體在本發(fā)明中的應(yīng)用。
還可使用Cre/lox功能的摻入(其細(xì)節(jié)在Sauer，Mothods ofEnzymology；1993，Vol.225，890-900中綜述)和不同轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶組合來(lái)消除主要的轉(zhuǎn)座酶功能。但是，在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座時(shí)不破壞轉(zhuǎn)座酶的基因，例如可施用誘導(dǎo)物使轉(zhuǎn)座子能夠進(jìn)一步移動(dòng)。
在本發(fā)明的方法中，可以使用熟練技術(shù)人員已知的任意系統(tǒng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。通過(guò)應(yīng)用內(nèi)源性物質(zhì)或通過(guò)實(shí)施內(nèi)源性信號(hào)，如發(fā)育調(diào)控信號(hào)來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。
編碼受控制的轉(zhuǎn)座酶基因的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可以是誘導(dǎo)性調(diào)控序列。例如，適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)系統(tǒng)包括基于tet的系統(tǒng)、lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)、基于蛻皮素的系統(tǒng)和基于雌激素，下文中提供了細(xì)節(jié)。外源誘導(dǎo)物能夠以任意方便的方式提供，如通過(guò)向母性動(dòng)物或胚胎中注射，或者以食品或水添加劑的形式提供給母體動(dòng)物?？梢栽谂咛グl(fā)育過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。因此，可以在發(fā)育的一個(gè)或多個(gè)階段中僅施用一次誘導(dǎo)物，或重復(fù)使用。
在本發(fā)明的可替代實(shí)施方案中，胚胎發(fā)育中的特定階段生成的基因調(diào)控信號(hào)可以誘導(dǎo)編碼轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)。可以將編碼轉(zhuǎn)座酶的基因置于基因調(diào)控序列，如發(fā)育調(diào)控序列或啟動(dòng)子的控制之下，來(lái)實(shí)現(xiàn)這種控制。舉例來(lái)說(shuō)，這些發(fā)育調(diào)控序列或啟動(dòng)子包括對(duì)特定基因調(diào)控信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答的發(fā)育調(diào)控特異啟動(dòng)子，如瞬時(shí)表達(dá)的發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白。當(dāng)編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于這種控制之下時(shí)，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)僅在基因調(diào)控信號(hào)產(chǎn)生時(shí)發(fā)生，例如發(fā)生在生成瞬時(shí)表達(dá)的發(fā)育調(diào)控蛋白時(shí)；或者，可替代的是，發(fā)生在這種信號(hào)蛋白導(dǎo)入胚胎時(shí)，例如通過(guò)注射或喂養(yǎng)母體動(dòng)物導(dǎo)入胚胎時(shí)。
使用本發(fā)明的方法，可以控制編碼轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)時(shí)間，從而控制誘導(dǎo)胚胎中轉(zhuǎn)座的時(shí)間。
在需要嚴(yán)密控制轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間和效率、進(jìn)一步限制轉(zhuǎn)座時(shí)間的實(shí)施方案中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以和轉(zhuǎn)座子存在于同一個(gè)構(gòu)建體中，在轉(zhuǎn)座子移動(dòng)時(shí)編碼轉(zhuǎn)座酶的基因遭到破壞，阻止進(jìn)一步轉(zhuǎn)座酶的生成，從而限制進(jìn)一步的轉(zhuǎn)座。
可以通過(guò)選擇誘導(dǎo)時(shí)間在胚胎發(fā)育的預(yù)定階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)。例如，可以在發(fā)育的非常早期，如合子階段、四細(xì)胞胚、64細(xì)胞胚胎等階段，或發(fā)育的更晚階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。
在一個(gè)實(shí)施方案中，需要將轉(zhuǎn)座酶置于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座，其中的調(diào)控序列將驅(qū)動(dòng)早期受精卵如二細(xì)胞階段或四細(xì)胞階段受精卵中轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)。控制轉(zhuǎn)座酶在該階段表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可以來(lái)源于該階段中表達(dá)活化的基因調(diào)控序列。這些基因包括Zp3、Oct-4(Kirchof et al.Biol Reprod 2000，Dec；63(6)1698-705)和母體效應(yīng)基因，如Zp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、Figla和Mater。其他的適當(dāng)調(diào)控序列包括hsp70.1(Bevilacqua et al.Development 2000；Apr；127(7)1541-51)。
根據(jù)發(fā)育階段的不同，發(fā)生了轉(zhuǎn)座的細(xì)胞可以進(jìn)行分裂，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的幾輪細(xì)胞分裂，產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細(xì)胞群。在多次誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的情況下，細(xì)胞群對(duì)于兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座事件中每個(gè)轉(zhuǎn)座事件來(lái)說(shuō)是同質(zhì)的。因此，根據(jù)發(fā)育階段的不同，插入事件可以存在于一個(gè)或多個(gè)組織、完整組織或組織群的細(xì)胞群中。插入事件的精確性質(zhì)將決定它是否影響某些或全部胚胎組織或成年組織中的功能基因表達(dá)。因此，可以在胚胎發(fā)育過(guò)程中監(jiān)測(cè)成年細(xì)胞和組織中修飾基因的基因表達(dá)模式。
另外，在來(lái)源于干細(xì)胞的快速生長(zhǎng)的成年細(xì)胞和組織中，典型的是在組織再生過(guò)程中或細(xì)胞和組織培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的類(lèi)似細(xì)胞群。這種細(xì)胞和組織包括，但不局限于消化道襯里、肝臟和血液的細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠快速更新和/或從成年動(dòng)物的干細(xì)胞再生。類(lèi)似的，可以在腫瘤中產(chǎn)生轉(zhuǎn)座事件純合的細(xì)胞群。本發(fā)明的方法可以加以變通，在這些成年細(xì)胞中產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件純合的細(xì)胞群。
因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明中第一或第三方面的步驟(d)加以變通，誘導(dǎo)新生兒、青年或成年生物體中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)座子在生物體的組織或細(xì)胞的至少一部分中轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)，來(lái)代替誘導(dǎo)胚胎中轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)，或者優(yōu)選的是，作為誘導(dǎo)胚胎中轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的附加手段。因此，本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生在新生兒、青年或成年生物體發(fā)育的預(yù)定階段中誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細(xì)胞群。在這種實(shí)施方案中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因優(yōu)先位于基因座控制區(qū)的控制之下，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的組織特異性控制。例如，在需要誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞中轉(zhuǎn)座的情況下，轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以位于肝臟細(xì)胞中表達(dá)相關(guān)的基因座控制區(qū)的控制之下。
在合子的早期發(fā)育階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座事件的情況下，有可能建立發(fā)生轉(zhuǎn)座作用的ES細(xì)胞系。這些ES細(xì)胞系可以測(cè)序、分析并保存待用。
根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物體中進(jìn)行轉(zhuǎn)座插入所產(chǎn)生的遺傳突變，可引起生物體中新的表型變異。使用本發(fā)明的方法，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，其中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞簇或組織對(duì)于不同的轉(zhuǎn)座事件是同質(zhì)的，各轉(zhuǎn)座事件可具有或不具有表型效應(yīng)。因此，與產(chǎn)生的沒(méi)有發(fā)生插入事件的相應(yīng)細(xì)胞或組織表型相比，使用本發(fā)明的方法發(fā)育而來(lái)的胚胎或成年動(dòng)物包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞簇或細(xì)胞群，每個(gè)細(xì)胞群表現(xiàn)出一個(gè)表型變異。
當(dāng)然，轉(zhuǎn)座事件對(duì)轉(zhuǎn)基因胚胎的影響在某種程度上取決于轉(zhuǎn)座發(fā)生的發(fā)育階段。例如在單合子階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座時(shí)，胚胎從中發(fā)育的所有細(xì)胞對(duì)于插入事件來(lái)說(shuō)都是同質(zhì)的。因此，如果轉(zhuǎn)座事件，例如插入事件產(chǎn)生導(dǎo)致各細(xì)胞死亡的表型變化，就不會(huì)發(fā)育形成胚胎。當(dāng)在發(fā)育的較晚期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座事件時(shí)，各插入事件存在于源自發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的細(xì)胞分裂的細(xì)胞簇或組織中。從而使每個(gè)細(xì)胞都表現(xiàn)出相同的表型變異。例如，如果一個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)座事件，一個(gè)特定組織或特定器官的某些或所有細(xì)胞都來(lái)源于該細(xì)胞，插入事件的表型結(jié)果則局限于細(xì)胞、特定組織或特定器官。在一個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)座事件、一個(gè)特定組織或特定器官中僅某些細(xì)胞都源于該細(xì)胞的情況下，轉(zhuǎn)座事件所導(dǎo)致的表型變化將比組織中所有細(xì)胞都發(fā)生轉(zhuǎn)座事件所導(dǎo)致的表型變化小。當(dāng)轉(zhuǎn)座事件使細(xì)胞致死時(shí)，細(xì)胞將不能存活。如果存在于組成特定組織或器官的所有細(xì)胞中，該組織或細(xì)胞將不具有功能，或不發(fā)育，并且胚胎不能存活。換句話說(shuō)，轉(zhuǎn)座事件可具有非致死的表型結(jié)果。例如，轉(zhuǎn)座事件具有調(diào)節(jié)受影響細(xì)胞中酶功能的作用，產(chǎn)生與未受影響細(xì)胞相比代謝方面的相對(duì)變化。這可以導(dǎo)致產(chǎn)生一種器官，如肝臟，其中具有差異表型的組織部分與具有正常表型或第二差異表型的相同組織部分相鄰。因此，生物體中差異表型的分布依賴于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的胚胎發(fā)育階段。另外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)“第二輪”轉(zhuǎn)座可有益于檢測(cè)元件的切除所致的表型轉(zhuǎn)換，或者，更重要的是檢測(cè)相互作用基因中新的插入所導(dǎo)致的表型修飾。
轉(zhuǎn)基因生物體的細(xì)胞、組織或器官的表型變化可以追溯到那些細(xì)胞、組織或器官中的轉(zhuǎn)座事件。
相應(yīng)地，本發(fā)明的第四方面提供了檢測(cè)和鑒定轉(zhuǎn)基因生物體中遺傳突變的方法，該方法包括以下步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)為不同表型的多個(gè)細(xì)胞的存在；(c)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞的基因組中一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的位置；將轉(zhuǎn)座事件的位置和觀察到的不同表型相關(guān)聯(lián)，轉(zhuǎn)座事件的位置是與所觀察不同表型相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)遺傳性基因座的位置。
“轉(zhuǎn)座事件”是轉(zhuǎn)座子移動(dòng)所致的基因組序列改變，包括插入事件、切除事件或染色體斷裂。
通過(guò)探測(cè)轉(zhuǎn)座子的核酸序列，篩選轉(zhuǎn)座子的存在來(lái)檢測(cè)插入事件。也可以通過(guò)切除后剩下的“標(biāo)記”序列來(lái)鑒定切除。
本發(fā)明的第五方面提供了分離與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的多個(gè)細(xì)胞中表型特征相關(guān)的基因的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座作用，或根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)為所述表型特征的多個(gè)細(xì)胞的存在；(c)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞的基因組中一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的位置；(d)克隆包含插入的遺傳性基因座。
可以對(duì)轉(zhuǎn)座子插入進(jìn)行定位來(lái)精確地鑒定發(fā)生了修飾的基因座。對(duì)旁側(cè)區(qū)進(jìn)行測(cè)序就能夠鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因座而可能不必對(duì)基因座進(jìn)行測(cè)序。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子可以是天然的轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選2型轉(zhuǎn)座子，如Minos。最有優(yōu)勢(shì)的是，它是Minos?？蛇x擇的轉(zhuǎn)座子包括mariner、Hermes、piggyBac、hobo和salmonid型轉(zhuǎn)座子，如Sleeping Beauty。
本發(fā)明中還可以使用修飾的轉(zhuǎn)座子，其引入包含一個(gè)或多個(gè)異源編碼序列和/或表達(dá)控制序列。這種編碼序列可以包括可選擇及/或不選擇的標(biāo)記基因，它們可以促進(jìn)基因組中轉(zhuǎn)座子的鑒定和整合有轉(zhuǎn)座子的基因座的克隆。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括熒光和/或發(fā)光多肽，如GFP及其衍生物、熒光素酶、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。
例如，通過(guò)插入包含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子，可將這種標(biāo)記用在體內(nèi)增強(qiáng)子或沉默子捕獲和外顯子捕獲中，其中的標(biāo)記基因的表達(dá)水平受鄰近增強(qiáng)子或外顯子的調(diào)節(jié)。EP 0955364中介紹了用于外顯子和增強(qiáng)子捕獲的構(gòu)建體。使用本發(fā)明的方法，轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的多個(gè)細(xì)胞或組織可以表現(xiàn)出調(diào)節(jié)標(biāo)記基因的表達(dá)，從而能夠有效地捕獲增強(qiáng)子和/或沉默子和/或外顯子。另外，在僅有特定類(lèi)型組織的一部分細(xì)胞對(duì)于轉(zhuǎn)座事件為純合情況的實(shí)施方案中，通過(guò)和不表現(xiàn)出這種調(diào)節(jié)的相同轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中相同類(lèi)型細(xì)胞或組織相比較，鑒定對(duì)標(biāo)記基因的調(diào)節(jié)。
相應(yīng)地，本發(fā)明在第六方面中提供了分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中增強(qiáng)子或沉默子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含處于最小啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因，使該基因具有基礎(chǔ)水平的表達(dá)；(b)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織中的報(bào)道基因表達(dá)水平；(c)鑒定和克隆一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞中與基礎(chǔ)表達(dá)水平相比報(bào)道基因的調(diào)節(jié)增加或降低的遺傳性基因座；和(d)標(biāo)準(zhǔn)所述細(xì)胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
在第七方面中，提供了分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外顯子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含缺失翻譯起始序列但包括剪接受體序列的報(bào)道基因；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育所形成后代中表達(dá)報(bào)道基因的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織；和(c)從所述細(xì)胞或組織中克隆包含表達(dá)報(bào)道基因的遺傳性基因座。
圖2、3和4示意性地顯示了能夠用于產(chǎn)生本發(fā)明中用到的胚胎的基因捕獲構(gòu)建體。
圖2顯示了位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體和包含位于最小啟動(dòng)子(minimal promoter)控制之下、編碼自體熒光蛋白(AFP)的標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩個(gè)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)可以為誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子的活化所誘導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)座。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因的表達(dá)，鑒定向基因組中增強(qiáng)子位點(diǎn)處或增強(qiáng)子位點(diǎn)附近的插入。
圖3說(shuō)明了位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體和包含缺失翻譯其始序列、包括剪接受體序列的AFP熒光報(bào)道基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩個(gè)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)可以為誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子的活化所誘導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)座。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因的表達(dá)，鑒定向內(nèi)含子中以適當(dāng)取向的插入。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子可用于上調(diào)基因的表達(dá)。例如，可以對(duì)轉(zhuǎn)座子加以修飾，使之包括一個(gè)增強(qiáng)子或其他轉(zhuǎn)錄活化元件。這種轉(zhuǎn)座子在基因附近的移動(dòng)或插入上調(diào)基因或基因座的表達(dá)。該實(shí)施方案在分離癌基因發(fā)明尤其具有優(yōu)勢(shì)，克隆腫瘤中的癌基因可通過(guò)轉(zhuǎn)座子的定位加以鑒定。
圖4顯示用于產(chǎn)生本發(fā)明該方面所用胚胎的基因活化系統(tǒng)。圖4說(shuō)明了位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體和同樣位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子控制下的AFP熒光報(bào)道基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)可以為誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子的活化所誘導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構(gòu)建體的轉(zhuǎn)座。另外，如果包含AFP的轉(zhuǎn)座構(gòu)建體插入到了異位基因的上游，則該基因可以活化，TetO啟動(dòng)子誘導(dǎo)時(shí)可以觀察到基因活化的表型效應(yīng)。
在通過(guò)轉(zhuǎn)座作用誘導(dǎo)基因修飾的傳統(tǒng)方法中產(chǎn)生了細(xì)胞嵌合體，其中各細(xì)胞具有獨(dú)特轉(zhuǎn)座作用誘導(dǎo)的基因修飾，難以對(duì)緣于轉(zhuǎn)座事件的表型進(jìn)行研究。類(lèi)似的，天然和人工刺激物對(duì)轉(zhuǎn)座細(xì)胞的影響也難以進(jìn)行研究，對(duì)研究結(jié)果也難以進(jìn)行解釋。但是，相比之下，本發(fā)明的方法的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎或生物體中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞簇或組織對(duì)于單一轉(zhuǎn)座事件是同質(zhì)的，因此通過(guò)將同質(zhì)細(xì)胞簇中的報(bào)道基因表達(dá)和周?chē)?xì)胞或組織中的報(bào)道基因表達(dá)相比，易于觀察藥用或天然刺激物的作用。因而，本發(fā)明的方法可以用于研究發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的細(xì)胞對(duì)刺激物(stimuli)的應(yīng)答，刺激物為天然刺激物，如生理性刺激物，例如激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子；或人造刺激物，如藥物發(fā)現(xiàn)方法、毒理學(xué)研究等中的藥物。事實(shí)上，本發(fā)明的方法能夠?qū)崟r(shí)觀察細(xì)胞簇或組織對(duì)刺激物的應(yīng)答。
相應(yīng)地，本發(fā)明的第八方面中提供了鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中對(duì)刺激物的基因應(yīng)答的方法，該方法包括
(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座作用，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因，該基因在基礎(chǔ)水平上表達(dá)；(b)在不存在刺激物的條件下，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織中的報(bào)道基因表達(dá)水平；(c)提供刺激物；(d)鑒定和克隆一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞中的遺傳性基因座，與基礎(chǔ)表達(dá)水平相比，受刺激物的刺激后報(bào)道基因的調(diào)節(jié)增加或降低。
該方法可進(jìn)一步包括額外的步驟(e)表征所述細(xì)胞或組織中克隆的基因座。
因此本發(fā)明的該方法可以用在分子介入新靶點(diǎn)的鑒定中，這些新靶點(diǎn)包括人類(lèi)、植物或動(dòng)物疾病治療的靶點(diǎn)、殺蟲(chóng)劑、除草劑、抗真菌劑和抗細(xì)菌劑開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。
一個(gè)進(jìn)一步應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)發(fā)病(例如小鼠疾病模型中)的基因。如果一個(gè)基因(如激酶或受體)的活化參與疾病的發(fā)病過(guò)程，則50％基因失活就有可能緩解或逆轉(zhuǎn)疾病的一個(gè)或多個(gè)表型。因此，在疾病背景下，插入滅活一個(gè)或多個(gè)拷貝這種基因的轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞群將檢測(cè)為健康的細(xì)胞簇。
轉(zhuǎn)座子可以插入到基因中。優(yōu)選將轉(zhuǎn)座子插入到轉(zhuǎn)錄的基因中，使所述轉(zhuǎn)座子定位于開(kāi)放染色質(zhì)中。轉(zhuǎn)座子旁側(cè)可以伴有染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域元件，如提供組織特異性表達(dá)的基因座控制元件(Fraser，P.&Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365)或提供非組織特異性表達(dá)的普遍作用(ubiquitously-acting)的染色質(zhì)開(kāi)放元件-(UCOEs)(例如參見(jiàn)WO0005393)?？梢杂迷诒景l(fā)明方法中的其他染色質(zhì)開(kāi)放元件包括CpG富含島，正常情況下它與管家基因或組織特異性基因或隔離子相關(guān)。
另外，轉(zhuǎn)座子自身可以在轉(zhuǎn)座子末端之間包含染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域。這導(dǎo)致整合有轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)活化，促進(jìn)誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)座酶以細(xì)胞或組織特異的方式靠近染色質(zhì)。
類(lèi)似地，轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體可以包含，或旁側(cè)帶有染色質(zhì)開(kāi)放結(jié)構(gòu)域元件。
胚胎發(fā)育和成年生命過(guò)程中調(diào)控轉(zhuǎn)座的能力增加了發(fā)育的不同時(shí)間、不同組織中存在的多個(gè)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域中發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的可能性。
本發(fā)明的方法可以有利地用于產(chǎn)生基因修飾生物體文庫(kù)，其中每個(gè)基因修飾生物體中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群或組織對(duì)于發(fā)育預(yù)定階段轉(zhuǎn)座移動(dòng)所導(dǎo)致的基因修飾是同質(zhì)的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面中，提供了一種方法生成轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)，其中每個(gè)基因修飾生物體中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群或組織對(duì)于轉(zhuǎn)座移動(dòng)所導(dǎo)致的基因修飾是同質(zhì)的。該方法包括根據(jù)本發(fā)明的第一或第二或第三方面的方法用轉(zhuǎn)座子移動(dòng)來(lái)修飾細(xì)胞，其中步驟(d)在胚胎發(fā)育的預(yù)定階段進(jìn)行。
通過(guò)這種方法生成的轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)是本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面。
附圖簡(jiǎn)述圖1示意性地說(shuō)明自身滅活自主轉(zhuǎn)座子構(gòu)建體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中的應(yīng)用。第一轉(zhuǎn)基因生物體(A)和第二轉(zhuǎn)基因生物體(B)相雜交，其中A基因組中包含一個(gè)調(diào)控因子構(gòu)建體，B基因組中包含具有目的基因的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子的一個(gè)反向重復(fù)序列位于打斷轉(zhuǎn)座酶基因的內(nèi)含子中。誘導(dǎo)雜交子代(C)發(fā)生轉(zhuǎn)座子移動(dòng)時(shí)，轉(zhuǎn)座酶基因遭到破壞，從而穩(wěn)定目的基因的轉(zhuǎn)座作用，使之即使在誘導(dǎo)物存在的條件下也不再發(fā)生進(jìn)一步的轉(zhuǎn)座事件。
圖2示意性地說(shuō)明用于本發(fā)明增強(qiáng)子捕獲方法中的編碼轉(zhuǎn)座酶的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)座子，編碼轉(zhuǎn)座酶的構(gòu)建體中轉(zhuǎn)座酶基因位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子的控制之下，轉(zhuǎn)座子所包含的AFP熒光標(biāo)記基因位于最小啟動(dòng)子的控制之下。
圖3說(shuō)明用于本發(fā)明外顯子捕獲方法中的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體和轉(zhuǎn)座子，其中轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體中轉(zhuǎn)座酶基因位于誘導(dǎo)性TetO啟動(dòng)子的控制之下，轉(zhuǎn)座子所包含的AFP熒光標(biāo)記基因缺失翻譯起始序列，但包括剪接受體序列。
圖4示意性地說(shuō)明了用于基因捕獲以鑒定異位基因的轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體和轉(zhuǎn)座子。
圖5顯示Minos來(lái)源的載體pMiCMVGFP。Minos反向末端重復(fù)以粗的黑箭頭表示。這些箭頭外面的白色方框表示D.hydei基因組中原始Minos元件的旁側(cè)序列。箭頭指向用于檢測(cè)Minos切除的引物位置。小箭頭指出了GFP和轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)錄方向。黑杠表示用作探針的片段。
圖6說(shuō)明了用于本發(fā)明實(shí)施例4所述的一個(gè)實(shí)施方案中Minos轉(zhuǎn)座酶表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)。ZP3基因的6.5kb 5’旁側(cè)區(qū)和啟動(dòng)子與Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA(ILMi)和人β珠蛋白的第二內(nèi)含子以及聚腺苷酸化位點(diǎn)相連接。圖中標(biāo)出了相關(guān)的限制性酶位點(diǎn)。
圖7顯示用RT-PCR分析檢測(cè)Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。圖中標(biāo)出了進(jìn)行分析的不同組織。小鼠次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)用作內(nèi)部對(duì)照。pUC18 DNA MspI消化物用作標(biāo)記物(M)，陰性對(duì)照中使用H2O。
圖8說(shuō)明發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的不同后代的Southern印跡分析。所有的DNA樣品都用BglII消化，用32P標(biāo)記的GFP探針進(jìn)行探測(cè)。泳道1是對(duì)照(染色體14上帶有多拷貝的GFP轉(zhuǎn)座子、在卵母細(xì)胞發(fā)育中表達(dá)Minos轉(zhuǎn)座酶的雌性小鼠)。泳道2、5、6、7、8、10和11對(duì)應(yīng)于雙轉(zhuǎn)基因雌性動(dòng)物和野生型雄性動(dòng)物的子代。它們均代表不同的轉(zhuǎn)座事件。泳道2和5具有2個(gè)轉(zhuǎn)座事件的小鼠。泳道3和4對(duì)應(yīng)于泳道2中具有2個(gè)轉(zhuǎn)座事件的小鼠后代，表現(xiàn)出了插入物的分離(泳道3為2號(hào)染色體上，泳道4為14號(hào)染色體靠近著絲粒部位)。泳道9泳道8中所示小鼠產(chǎn)生的后代，表現(xiàn)出了分離。
圖9顯示小家鼠基因組中親本和四個(gè)不同Minos插入物的序列。新插入的轉(zhuǎn)座子旁側(cè)的染色體序列以大寫(xiě)字母表示，轉(zhuǎn)座子序列以小寫(xiě)字母表示，靶位點(diǎn)重復(fù)以紅色表示。標(biāo)出了插入物的染色體定位和Celera數(shù)據(jù)庫(kù)中的支架號(hào)。
圖10顯示Minos轉(zhuǎn)座事件的FISH分析。如實(shí)施例4中材料和方法所述用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚對(duì)染色體進(jìn)行染色，用GFP探針進(jìn)行探測(cè)。A組具有兩個(gè)轉(zhuǎn)座事件的小鼠8218-01(在2號(hào)染色體上和14號(hào)染色體的著絲粒部位；參見(jiàn)圖8泳道2)；紅色(箭頭所指)Tyramide擴(kuò)增后的染色(參見(jiàn)實(shí)施例4中材料與方法)。B組具有兩個(gè)轉(zhuǎn)座事件的小鼠8218-02(一個(gè)在18號(hào)染色體上，一個(gè)在14號(hào)染色體的著絲粒附近，靠近轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體的起始位置；參見(jiàn)圖8泳道5)。綠色(箭頭所指)FITC染色。黃色箭頭所指為轉(zhuǎn)座事件。
圖11顯示用于在精子或卵中特異性表達(dá)或普遍性表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的敲入(A)和常規(guī)構(gòu)建體(B)。在圖11中，加了β珠蛋白3’第二外顯子(紅色)、介入序列(綠色)和第三外顯子(紅色)。
圖12顯示轉(zhuǎn)基因小鼠和/或克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中的捕獲構(gòu)建體(trap construct)。
圖13是說(shuō)明使用雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在卵母細(xì)胞中。
圖14是說(shuō)明使用雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子，雄性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在精于中。
圖15是說(shuō)明使用雄性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座子，雌性動(dòng)物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用。轉(zhuǎn)座發(fā)生在受精卵或胚胎中。
發(fā)明詳述雖然這里提到的技術(shù)一般都是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的，但具體可參考Sambrook et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(1989)和Ausubel et al.，分子生物學(xué)中的簡(jiǎn)短方案(1999)4th版，John Wiley & Sons公司。
轉(zhuǎn)座子本發(fā)明的方法中可以使用任意轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選2型轉(zhuǎn)座子，更優(yōu)選的是選自Minos、mariner、Hermes、piggyBac和Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子。有利的是，轉(zhuǎn)座子是Minos。每個(gè)轉(zhuǎn)座子和其天然的相關(guān)轉(zhuǎn)座酶一起使用是有利的，但也可以考慮使用修飾和/或改進(jìn)的轉(zhuǎn)座酶。Minos轉(zhuǎn)座子和其相關(guān)轉(zhuǎn)座酶在美國(guó)專利5,840,865和歐洲專利申請(qǐng)EP 0955364中作了詳細(xì)介紹。
轉(zhuǎn)座子優(yōu)選包含編碼異源多肽的核酸序列。在轉(zhuǎn)座子整合時(shí)，該序列將和轉(zhuǎn)座子一起整合到細(xì)胞的基因組中。另外，當(dāng)后來(lái)切除、再次移動(dòng)時(shí)它和轉(zhuǎn)座子一起切除。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源多肽為選擇性標(biāo)記物。這樣就能夠鑒定整合有轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞，確切地繪制整合位點(diǎn)。
標(biāo)記基因優(yōu)選的標(biāo)記基因包括編碼熒光多肽的基因。例如，本發(fā)明中可以使用刺絲胞動(dòng)物的綠色熒光蛋白(“GFP”)，作為生物發(fā)光中的能量轉(zhuǎn)移受體發(fā)揮作用。這里所用的綠色熒光蛋白是發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)，藍(lán)色熒光蛋白是發(fā)出藍(lán)色熒光的蛋白質(zhì)。已經(jīng)從西北太平洋水母Aequorea victoria中、從海洋三色堇Renilla reniformis中、從Phialidium gregarium中分離到的GFP(Ward et al.，1982，Photochem.Photobiol.，35803-808；Levine et al.，1982，Comp.Biochem.Physiol.，72B77-85)。最近還從珊瑚蟲(chóng)中分離到了熒光蛋白(登記號(hào)AF168419、AF168420、AF168421、AF168422、AF168423和AF168424)。
已經(jīng)通過(guò)對(duì)Aequorea victoria來(lái)源的天然發(fā)生GFP進(jìn)行氨基酸序列修飾，獲得了多種具有有用激發(fā)和發(fā)射光譜的水母相關(guān)GFP(Prasheret al.，1992，Gene，111229-233；Heim et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504；PCT/US95/14692)。舉例來(lái)說(shuō)，水母相關(guān)的熒光蛋白包括野生型Aequorea Victoria GFP，其核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列的Genbank登記號(hào)為L(zhǎng)29345、M62654、M62653，還包括其他人工改造版本的水母相關(guān)綠色熒光蛋白，上文中列出了其中一些這樣的綠色熒光蛋白。這些綠色熒光蛋白中，P4、P4-3、W7和W2的熒光波長(zhǎng)明顯比野生型的短。
可以使用的其他標(biāo)記基因包括選擇標(biāo)記基因，如編碼新霉素、嘌呤霉素或潮霉素的基因，或者是對(duì)應(yīng)的選擇基因，如胞嘧啶脫氨酶基因或硝酸還原酶基因。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員都了解可以使用的大量標(biāo)記基因?？梢允褂萌我獾倪m當(dāng)標(biāo)記基因，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，沒(méi)有必要進(jìn)行特意的選擇。
插入和切除事件的鑒定可以通過(guò)測(cè)序分析鑒定轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子被切除的位點(diǎn)。例如，Minos典型地整合在TA堿基對(duì)部位，切除時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)靶TA序列，位于轉(zhuǎn)座子末端四個(gè)核苷酸的旁側(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)序、PCR和/或雜交等技術(shù)檢測(cè)該序列或相關(guān)序列的存在。
可利用類(lèi)似的技術(shù)，如使用和末端重復(fù)序列相互補(bǔ)的PCR引物鑒定插入的轉(zhuǎn)座子。
轉(zhuǎn)座酶有效的轉(zhuǎn)座子移動(dòng)依賴于轉(zhuǎn)座元件自身向宿主細(xì)胞的有效輸送和有效關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的存在，以催化轉(zhuǎn)座子跳躍。這里所用的“關(guān)聯(lián)性”轉(zhuǎn)座酶是能夠有效活化轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的任意轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座包括轉(zhuǎn)座子從第一整合位點(diǎn)的切除和/或在第二整合位點(diǎn)處的整合。優(yōu)選的關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶是和自然界中體內(nèi)情況下的轉(zhuǎn)座子天然相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。但是，本發(fā)明也包含修飾的轉(zhuǎn)座酶，這些轉(zhuǎn)座酶具有本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)越改進(jìn)活性。例如，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因序列可以加以修飾，優(yōu)化密碼子利用率(usage)，從而增加轉(zhuǎn)座頻率。優(yōu)化密碼子利用率是本領(lǐng)域所熟知的增加給定基因表達(dá)水平的方法?？商鎿Q的方案是，轉(zhuǎn)座酶可以包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、替換或缺失，以增在加宿主生物體中的活性。
編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以存在于第二生物體中，通過(guò)與基因組中包含轉(zhuǎn)座子的第一生物體相雜交，產(chǎn)生用在本發(fā)明方法中的胚胎。在一個(gè)可代替的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因存在于第一生物體中，將該生物體和第二生物體相雜交來(lái)產(chǎn)生胚胎，其中第二生物體包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、允許誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)座酶表達(dá)所需的調(diào)控元件。
將基因?qū)胨拗骷?xì)胞基因組中的許多方法都是本領(lǐng)域中已知的，可以用在本發(fā)明中。例如，可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段將轉(zhuǎn)座酶基因插入宿主細(xì)胞基因組。下面會(huì)進(jìn)一步討論這些方法。
轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的調(diào)控根據(jù)需要，將編碼轉(zhuǎn)座酶的克隆序列可操作性地和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的調(diào)控序列相連接。和編碼轉(zhuǎn)座酶的序列可操作性相連接的控制序列包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)。選擇的這些控制序列和要表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的宿主生物體相容。術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域所熟知的，從大小和復(fù)雜性方面來(lái)說(shuō)所包含的核酸區(qū)域涵蓋了最小啟動(dòng)子和包括上游元件和增強(qiáng)子的啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子典型地選自在一些細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子，這些細(xì)胞類(lèi)型和正被討論的生物體，或生物體所屬的屬、科、目、界或其他分類(lèi)同源，但是異源啟動(dòng)子也發(fā)揮作用，如一些原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中具有功能。啟動(dòng)子可以來(lái)源于病毒或真核基因的啟動(dòng)子序列。例如，它可以是來(lái)源于將發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子。至于真核啟動(dòng)子，它們可以是以普遍(ubiquitous)的方式(如α-肌動(dòng)蛋白、β-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的啟動(dòng)子)，或者，可替換的方案是以組織特異性方式(如丙酮酸激酶基因的啟動(dòng)子)發(fā)揮作用的啟動(dòng)子。在胚系轉(zhuǎn)座事件的產(chǎn)生過(guò)程中，啟動(dòng)子可以來(lái)源于在配子形成，卵子發(fā)生或精子發(fā)生過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)的基因?？商鎿Q的方案是，對(duì)于諸如發(fā)育發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)座作用之類(lèi)的發(fā)育性調(diào)控轉(zhuǎn)座事件來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子可以來(lái)源于其表達(dá)受發(fā)育調(diào)控的基因。對(duì)于早期合子中的表達(dá)，可以使用來(lái)源于母性效應(yīng)基因的啟動(dòng)子。它們還可以是對(duì)特定刺激物產(chǎn)生應(yīng)答的啟動(dòng)子，例如和甾體類(lèi)激素受體相結(jié)合的啟動(dòng)子。還可以使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼鼠白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(MMLV LTR)啟動(dòng)子、肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子或人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下，也就是說(shuō)所獲得的表達(dá)水平可以調(diào)控如使用啟動(dòng)子。例如，調(diào)控序列可以是誘導(dǎo)性的調(diào)控序列?；虮磉_(dá)的誘導(dǎo)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的，包括四環(huán)素、蛻皮素和雌激素誘導(dǎo)系統(tǒng)或lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)。
廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的這類(lèi)系統(tǒng)是與可被四環(huán)素-多西環(huán)素阻遏的轉(zhuǎn)錄活化因子tTA聯(lián)用的tetO啟動(dòng)子-操縱子，也稱為T(mén)et-Off基因表達(dá)系統(tǒng)(Gossen，M.& Bujard，H.(1992)四環(huán)素應(yīng)答啟動(dòng)子對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的嚴(yán)緊控制.Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551)，或多西環(huán)素誘導(dǎo)性rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子，也稱為T(mén)et-On系統(tǒng)(Gossen，M.，F(xiàn)reundlieb，S.，Bender，G.，Muller，G.，Hillen，W.&Bujard，H.(1995)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中四環(huán)素引起的轉(zhuǎn)錄活化。Science2681766-1769)。
在Tet-Off系統(tǒng)中，四環(huán)素(Tc)或多西環(huán)素(doxycycline，Dox；Tc衍生物)從培養(yǎng)基中去除時(shí)，基因開(kāi)始表達(dá)。相比之下，在Tet-On系統(tǒng)中，通過(guò)加入Dox使基因開(kāi)始表達(dá)。以前曾經(jīng)描述了建立帶有轉(zhuǎn)錄活化基因和染色體中穩(wěn)定整合有Tet調(diào)控基因的細(xì)胞系的方法。例如，參見(jiàn)http//www.clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3001-1.pdf。例如，可以采用Tet-On系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中Minos轉(zhuǎn)座酶的四環(huán)素誘導(dǎo)性表達(dá)。
可以通過(guò)常規(guī)的同源重組ES細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。使用了兩個(gè)構(gòu)建體其一是包含位于組成性啟動(dòng)子控制之下的rtTA基因的構(gòu)建體。這種構(gòu)建體的一個(gè)例子是pTet-On質(zhì)粒(Clontech)，它包括編碼rtTA活化因子的基因，該基因位于巨細(xì)胞病毒即早(CMV)啟動(dòng)子控制之下。該構(gòu)建體編碼的rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子僅在多西環(huán)素存在的條件下活化。第二構(gòu)建體包含位于四環(huán)素應(yīng)答元件或TRE控制之下的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。TRE有包含tet操縱子(tetO)的42bp序列的七個(gè)正向重復(fù)組成，位于基礎(chǔ)CMV啟動(dòng)子的即上游，該啟動(dòng)子缺少正常情況下和CMV即早啟動(dòng)子相關(guān)的增強(qiáng)子元件。因?yàn)闆](méi)有這些增強(qiáng)子元件，在沒(méi)有rtTA的結(jié)合時(shí)，沒(méi)有轉(zhuǎn)座酶從TRE的“泄漏(leaky)”表達(dá)。這種構(gòu)建體的一個(gè)例子是pTRE2質(zhì)粒(Clontech)，在其MCS中插入了編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的基因。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有兩個(gè)構(gòu)建體的細(xì)胞中，表達(dá)rtTA，但是如果不向動(dòng)物體內(nèi)施用多西環(huán)素，則不會(huì)活化Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。
因此，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法，將包含pTet-On和pTRE2構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因組中包含一個(gè)轉(zhuǎn)座子的另一個(gè)動(dòng)物相雜交時(shí)，在不存在多西環(huán)素的條件下，所形成的、在基因組中包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的胚胎中不發(fā)生轉(zhuǎn)座移動(dòng)。因此可以使用多西環(huán)素來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座作用。
可以使用任意適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)施用誘導(dǎo)物，如多西環(huán)素。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)給親本生物體喂食或喂水來(lái)施用轉(zhuǎn)座酶表達(dá)誘導(dǎo)物。
可替換的方案是，誘導(dǎo)系統(tǒng)包括他莫昔芬誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶[和轉(zhuǎn)座酶相偶聯(lián)的修飾的雌激素受體結(jié)構(gòu)域(Indra et al.，Nucl Acid Res.27，4324-27，1999)，在他莫昔芬加入培養(yǎng)物之前使轉(zhuǎn)座酶滯留在細(xì)胞質(zhì)中]，RU418誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶(和糖皮質(zhì)激素受體的操縱原理相同；參見(jiàn)Tsujita et al.，J.Neuroscience，19，10318-23，1999)，或雌激素誘導(dǎo)系統(tǒng)。
蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)基于異源二聚化的果蠅蛻皮素受體，它可以為昆蟲(chóng)激素、蛻皮素和其衍生物所誘導(dǎo)。在黑腹果蠅的蛻變過(guò)程中，通常稱作“蛻皮素”的甾體類(lèi)激素20-OH蛻皮素通過(guò)蛻皮素受體引發(fā)級(jí)聯(lián)的形態(tài)變化。通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)調(diào)控優(yōu)化的蛻皮素應(yīng)答啟動(dòng)子的修飾蛻皮素受體，將蛻皮素應(yīng)答性轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)。在施用激素或其衍生物時(shí)，表達(dá)修飾蛻皮素受體的轉(zhuǎn)基因生物體，如小鼠可以活化整合的蛻皮素應(yīng)答性啟動(dòng)子。一旦受體與蛻皮素或蛻皮素類(lèi)似物muristerone結(jié)合，受體就會(huì)活化蛻皮素應(yīng)答性啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的控制。據(jù)報(bào)道，和基于四環(huán)素的系統(tǒng)相比，基于蛻皮素的誘導(dǎo)系統(tǒng)表現(xiàn)出較低的基礎(chǔ)活性和更高的誘導(dǎo)性?；谕懫に氐恼T導(dǎo)系統(tǒng)其進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以參考US6,245,531和No D，Yao TP，Evans RM.哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中蛻皮素誘導(dǎo)性基因的表達(dá)，Proc NatlAcad Sci USA 1996 Apr 933346-51，其內(nèi)容在此引入作為參考。
最近研究表明lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物中，尤其在小鼠中是具有功能的。Cronin et al.，Genes and Development，15，1506-1517(2001)介紹了lac阻遏子轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用，在密碼子利用率和結(jié)構(gòu)上lac阻遏子轉(zhuǎn)基因和典型的哺乳動(dòng)物基因相似，在細(xì)胞書(shū)中普遍地表達(dá)lac阻遏子蛋白，控制位于lac啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因的表達(dá)，其內(nèi)容在此引入作為參考。使用乳糖類(lèi)似物IPTG可以逆轉(zhuǎn)報(bào)道基因的表達(dá)。其中IPTG在小鼠或胚胎母體或喂養(yǎng)幼鼠的飲用水中供應(yīng)。可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因置于lac啟動(dòng)子的控制之下，使將lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)適用于調(diào)控轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)。
此外，可以通過(guò)加入其他的調(diào)控序列，例如增強(qiáng)子序列來(lái)修飾這些啟動(dòng)子。還可以使用來(lái)自上述兩個(gè)或多個(gè)不同啟動(dòng)子的序列元件的嵌合啟動(dòng)子。
也考慮使用基因座控制區(qū)。LCR能夠?qū)D(zhuǎn)基因進(jìn)行嚴(yán)緊調(diào)控的組織特異性控制，從而增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的忠實(shí)性。許多LCR都是本領(lǐng)域中已知的。它們包括β-珠蛋白LCR(Grosveld et al.，(1987)Cell51975-985)；α-珠蛋白(Hatton et al.，(1990)Blood 76221-227)；和CD2(Festenstein et al.，(1996)Science 2711123-1125)；T細(xì)胞特異性CD4(Boyer et al.，J Immunol 1997，1593383-3390)和TCR基因座(Diaz P，et al.，Immunity 1994，1207-217；Ortiz et al.，EMBO J 1997，165037-5045；Hong et al.，Mol Cell Biol 1997，172151-2157)；B細(xì)胞特異性II Eα型MHC(Carson et al.，Nucleic Acids Res 1993，212065-2072)；巨噬細(xì)胞特異性溶菌酶基因(Bonifer et al EMBO J1990，92843-2848)；神經(jīng)元特異性S100基因(Friend et al.，J Neurosci1992，124337-4346)；肝臟特異性LAP基因(Talbot et al.，Nucleic AcidsRes 1994，22756-766)；人生長(zhǎng)激素基因座(Jones et al.，Mol Cell Biol1995，157010-7021)；和免疫球蛋白、肌肉組織等等。Fraser，P.&Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10361-365和Li，Q.，Harju，S.& Peterson，K.R.(1999).Trends Genet.15403-408中介紹了LCR的其他細(xì)節(jié)。
可替換的方案是，體內(nèi)所有細(xì)胞中需要開(kāi)放或打開(kāi)的基因結(jié)構(gòu)域；即蛋白質(zhì)為所有細(xì)胞生存所需、普遍表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)域可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子和/或轉(zhuǎn)座酶在任意組織中的表達(dá)。這種普遍活化的染色質(zhì)開(kāi)放元件(ECOE)的例子包括人基因TBP和hnRNPA2。使用這種UCOE的其他細(xì)節(jié)可以參考Antoniou，M.and Grosveld，F(xiàn).(1999).(血珠蛋白病變治療的遺傳學(xué)方法.在血細(xì)胞生物化學(xué)中，第8卷血細(xì)胞生成和基因治療，F(xiàn)airbairn和Testa版本。KluwerAcademic/Plenum出版社，紐約，219-242頁(yè))和PCT/GB99/02357(WO0005393)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
還可以通過(guò)使用ES細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)座酶和/或轉(zhuǎn)座子表達(dá)的調(diào)節(jié)。使用轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞構(gòu)建嵌合胚胎，有可能產(chǎn)生僅在某些組織中包含轉(zhuǎn)座酶基因或轉(zhuǎn)座子元件的轉(zhuǎn)基因胚胎。這可以提供進(jìn)一步的調(diào)控水平。
使轉(zhuǎn)座效率最大化如上所述，及如WO 01/71019和WO 02/062991中所述，通過(guò)轉(zhuǎn)座酶作用于整合轉(zhuǎn)座子中的末端重復(fù)序列，使轉(zhuǎn)座子從“宿主”基因組的原始位置上切除，重新插入到基因組的另一個(gè)位置上，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座作用。
和大多數(shù)生化方法一樣，僅提高底物的濃度就可使本方法效率更高，得到高水平的末端重復(fù)序列，即拷貝數(shù)增加、轉(zhuǎn)座酶水平升高。
通過(guò)在原始位點(diǎn)上產(chǎn)生多拷貝排列來(lái)增加拷貝數(shù)。例如，通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)基因或使用PAC載體來(lái)產(chǎn)生10至100拷貝?？商鎿Q的方案是，通過(guò)基因組不同位點(diǎn)上多個(gè)插入物的存在來(lái)產(chǎn)生多拷貝。
可以對(duì)轉(zhuǎn)座酶加以修飾，優(yōu)化密碼子利用率，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)座頻率。優(yōu)化密碼子利用率是本領(lǐng)域中用來(lái)增加給定基因表達(dá)水平的熟知方法。
因此，將蠅密碼子利用率替換為哺乳動(dòng)物密碼子利用率，使mRNA更有效地進(jìn)行翻譯，增加轉(zhuǎn)座酶的濃度，進(jìn)而增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)蠅轉(zhuǎn)座酶的效率。
測(cè)定轉(zhuǎn)座酶效率的分析方法包括Klinakis et al.，Insect MolecularBiology，9(3)269-275，2000中所述的常規(guī)轉(zhuǎn)座分析。
還可以將諸如編碼生長(zhǎng)因子、珠蛋白、肌動(dòng)蛋白或白蛋白的大量穩(wěn)定mRNA中發(fā)現(xiàn)的5’和3’序列包含轉(zhuǎn)座酶mRNA序列內(nèi)，來(lái)增加轉(zhuǎn)座酶mRNA的濃度。
轉(zhuǎn)基因生物體本發(fā)明的方法可以使用一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因生物體，這些轉(zhuǎn)基因生物體基因組中整合有轉(zhuǎn)座子、編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因，或二者兼而有之。
可以使用任意可用的技術(shù)導(dǎo)入轉(zhuǎn)座子或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染、病毒載體或非病毒載體的傳遞及微注射。每項(xiàng)技術(shù)都是本領(lǐng)域中已知的?？梢允褂孟嗤虿煌姆椒ú迦朕D(zhuǎn)座酶和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。例如，使用果蠅P元件將Minos轉(zhuǎn)座酶構(gòu)建體導(dǎo)入果蠅體內(nèi)。
例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將轉(zhuǎn)座子或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因插入宿主細(xì)胞基因組中，產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)座子、編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶或二者兼而有之的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物同時(shí)包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的情況下，可以使用相同或不同的方法來(lái)獲得這兩個(gè)構(gòu)建體。構(gòu)建體的傳遞通過(guò)病毒載體介導(dǎo)時(shí)，可以使用包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的復(fù)合載體，其中轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于諸如Tet操縱子之類(lèi)控制序列的控制之下。此外可兩者分開(kāi)的載體。
本發(fā)明中可以使用任意適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些動(dòng)物包括刺胞動(dòng)物門(mén)、櫛水母門(mén)、扁形動(dòng)物門(mén)、線蟲(chóng)綱、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)、軟體動(dòng)物門(mén)、螯肢動(dòng)物門(mén)、單肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱和脊索動(dòng)物門(mén)的動(dòng)物。單肢動(dòng)物門(mén)動(dòng)物包括六足動(dòng)物亞門(mén)的動(dòng)物，這類(lèi)動(dòng)物包括有翅昆蟲(chóng)之類(lèi)的昆蟲(chóng)。脊索動(dòng)物門(mén)的動(dòng)物包括脊椎動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物。具體的哺乳動(dòng)物例子包括非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)、貓、犬、有蹄動(dòng)物，如牛、山羊、豬、綿羊和馬，以及嚙齒類(lèi)動(dòng)物，如小鼠、大鼠、沙土鼠和倉(cāng)鼠。
用于本發(fā)明方法中、用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)是本領(lǐng)域中所熟知的。關(guān)于這一主題，有用的通用教材是Houdebine，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-產(chǎn)生和使用(Harwood Academic，1997)-用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)泛論。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物為昆蟲(chóng)。用在本發(fā)明方法中、用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)的方法是人們所熟知的(例如參見(jiàn)Loukeris et al(1995)，Science 270 2002-2005)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)座元件插入到前胚層胚胎中，例如可使用微注射方法。優(yōu)選的是，新的轉(zhuǎn)基因材料置于極性細(xì)胞質(zhì)部位，卵在這一部位形成新生昆蟲(chóng)自身的卵細(xì)胞或精細(xì)胞。核物質(zhì)分裂許多次之后，大部分被分隔至邊緣，在那里變成昆蟲(chóng)身體的核。少數(shù)核遷移到極性端，成熟時(shí)形成卵細(xì)胞。如果這些細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因，則子代就是轉(zhuǎn)基因的。Loukeris et al.(1995)Science 270 2002-2005和O’Brochta and Atkinson(1998)ScientificAmerican 279 60-65中提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。胚胎微操作技術(shù)的進(jìn)展使得人們能夠?qū)愒碊NA導(dǎo)入諸如受精的哺乳動(dòng)物卵中。例如，可以通過(guò)微注射、磷酸鈣介導(dǎo)的沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或其他手段轉(zhuǎn)化全能的或多能的干細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，胚胎進(jìn)一步發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)非常優(yōu)選的方法中，用包含所需DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育的胚胎，從受感染的胚胎生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。但是，在最優(yōu)選的方法中，優(yōu)選在單細(xì)胞階段將適當(dāng)?shù)腄NA同時(shí)注射到胚胎的原核或胞漿中，胚胎進(jìn)而發(fā)育成成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些技術(shù)是人們所熟知的(參見(jiàn)將異源DNA微注射到哺乳動(dòng)物受精卵中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法的綜述，包括Hogan et al.，小鼠胚胎操作(冷泉港出版社1986)；Krimpenfort et al.，Bio/Technology9844(1991)；Palmiter et al.，Cell，41，41343(1985)；Kraemer et al.，小鼠胚胎的遺傳操作，(冷泉港出版社1985)；Hammer et al.，Nature，315680(1985)；Wagner et al.，U.S.Pat.No.5,175,385；Krimpenfort et al.，U.S.Pat.No.5,175,384，將其各自的內(nèi)容在此引入作為參考)。
另一個(gè)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法涉及包括使用常規(guī)方法將核酸微注射到原核階段的卵中。對(duì)注射的卵進(jìn)行培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到假孕受者的輸卵管中。
還可以用Schnieke，A.E.et al.，1997，Science，2782130和Cibelli，J.B.et al.，1998，Science，2801256中所述的核轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。使用該方法，將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來(lái)自供體動(dòng)物的成纖維細(xì)胞，其中質(zhì)粒包含位于調(diào)控序列控制之下的目的多肽編碼序列。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體與去核的卵母細(xì)胞相融合，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移到雌性受者體內(nèi)。
按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR或Southern印跡分析，對(duì)包含轉(zhuǎn)基因序列的動(dòng)物進(jìn)行分析。
通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如牛的具體實(shí)施例中方法，使用諸如U.S.Pat.No.4,873,191中所述的技術(shù)將包含編碼結(jié)合分子的序列導(dǎo)入來(lái)源于剛從哺乳動(dòng)物體內(nèi)摘除的卵巢的卵母細(xì)胞中。將卵母細(xì)胞從卵泡中吸出，沉降，然后使用凍融的精子進(jìn)行受精，用肝素使精子獲能，使用Percoll梯度進(jìn)行預(yù)分級(jí)，分離能動(dòng)級(jí)分。
將受精的卵母細(xì)胞離心，如15,000g離心8分鐘，使原核顯現(xiàn)出來(lái)以進(jìn)行注射，然后在輸卵管組織條件培養(yǎng)基中從合子培養(yǎng)至桑葚胚或胚囊階段。使用從輸卵管上刮取的腔組織在培養(yǎng)基中加以稀釋來(lái)制備這種輸卵管組織條件培養(yǎng)基。微注射2小時(shí)后必須將合子置于培養(yǎng)基中。
通過(guò)施用糞甾醇使受者動(dòng)物，如牛體內(nèi)的發(fā)情期同步化。2天后產(chǎn)生發(fā)情期，發(fā)情期5～7天后將胚胎轉(zhuǎn)移到受者體內(nèi)。通過(guò)Southern印跡法評(píng)價(jià)后代體內(nèi)的成功轉(zhuǎn)移。
可替換的方案是，將所需的構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，確保轉(zhuǎn)基因的修飾。然后將修飾的細(xì)胞注射到囊胚期的胚胎中，將囊胚置入假孕宿主體內(nèi)。產(chǎn)生的后代對(duì)于ES和宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是嵌合的，可以使用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)獲得只包含ES子代的非嵌合株。WO91/10741中就介紹了這種技術(shù)。
輸送轉(zhuǎn)座子和/或轉(zhuǎn)座酶基因并使之穩(wěn)定整合入宿主動(dòng)物基因組中的可替換方法包括病毒載體，如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、桿狀病毒甾體和皰疹病毒載體。此外，本領(lǐng)域中Zhang等(Nucl.Ac.Res.，1998，263687-3693)也對(duì)這種技術(shù)作了介紹。
適當(dāng)?shù)牟《据d體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，來(lái)源于或可來(lái)源于任意適當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)、馬感染性貧血癥病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、埃布爾森小鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓細(xì)胞瘤病毒-29(MC29)和禽成紅細(xì)胞增多病病毒(AEV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)列單可以參考Coffin et al.，1997，“逆轉(zhuǎn)錄病毒”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，JM Coffin，SM Hughes，HE Vaemus，758-763頁(yè)。
本領(lǐng)域中對(duì)一些逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)作細(xì)節(jié)了描述。例如，HIV和Mo-MLV的詳情可以NCBI GenBank獲知(基因組登記號(hào)分別為AF033819和AF033811)。
可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒廣泛地分為兩類(lèi)，即“簡(jiǎn)單型”和“復(fù)雜型”。還可以進(jìn)一步將逆轉(zhuǎn)錄病毒分為七組。其中的五組為具有致癌潛力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。其余的兩組是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的綜述見(jiàn)Coffin等1997(ibid)。
不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有不同的宿主范圍和組織向性(tropism)。在某些情況下，這種特異性會(huì)限制重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)潛力。由于這一原因，許多基因治療實(shí)驗(yàn)都使用了MLV。具有包膜蛋白的一個(gè)具體MLV是稱作4070A的兩性向性病毒，由于它的包膜蛋白和人類(lèi)與小鼠之間保守的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白“停靠(docks)”在一起，它還能夠感染人細(xì)胞。磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是普遍的，因此這些病毒能夠感染許多細(xì)胞類(lèi)型。
聯(lián)合使用包裝或輔助細(xì)胞系和重組載體使具有復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體典型地增殖，以制備適當(dāng)?shù)味鹊哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體用于隨后的轉(zhuǎn)導(dǎo)。也就是說(shuō)，以反式形式提供三個(gè)包裝蛋白。
“包裝細(xì)胞系”包含一個(gè)或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol和env基因。包裝細(xì)胞系能夠產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的蛋白質(zhì)，但是由于缺少psi區(qū)，不能夠進(jìn)行包裝。輔助蛋白質(zhì)能夠包裝psi陽(yáng)性的重組載體，產(chǎn)生重組病毒原種。該病毒原種可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，將載體導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組?，F(xiàn)有包裝細(xì)胞系的概覽見(jiàn)Coffin等1997年(ibid)。
慢病毒可以分為“靈長(zhǎng)類(lèi)”和“非靈長(zhǎng)類(lèi)”。靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒包括原型“慢病毒”綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/綿羊肺腺瘤病病毒(VMV)，以及相關(guān)的羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬感染性貧血癥病毒(EIAV)和最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。參考Rovira et al.，Blood.2000；964111-4117；Reiseret al.，J Virol.2000 Nov；74(Mulder，M.P et al.(1995).Hum Genet 96(2)133-141)10589；Lai et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2000 Oct 10；97(Southern，E.M.(1975).J.Mol.Biol 98，503-517)11297-302；和Saulnier et al.，J Gene Med 2000Sep-Oct；2(5)317-25。
慢病毒家族與其他類(lèi)型的逆轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別之一在于慢病毒能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞。相比之下，其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，如MLV不能感染非分裂細(xì)胞，如那些組成肌肉、大腦、肺和肝臟組織的細(xì)胞。
已經(jīng)在逆轉(zhuǎn)錄病毒科的多個(gè)慢病毒亞家族成員的基礎(chǔ)上構(gòu)建了許多載體，其中許多都是專利申請(qǐng)的主題(WO-A-98/18815；WO-A-97/12622)。優(yōu)選的慢病毒載體是在HIV、SIV或EIAV的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。從HIV-1構(gòu)建的最簡(jiǎn)單載體具有完整的基因組，只是缺失了env編碼區(qū)部分或置換了nef編碼區(qū)。值得注意的是，這些載體表達(dá)gag/pol和所有的輔助基因，因此僅需要一個(gè)包膜蛋白即可生成具有感染性的病毒顆粒。在輔助基因中，vif、vpr、vpu和nef是非必需的。
基于HIV的慢病毒載體的一個(gè)優(yōu)選通用格式是HIV 5’LTR和先導(dǎo)序列，一些gag編碼區(qū)序列(提供包裝功能)，報(bào)道序列盒、rev應(yīng)答元件(RRE)和3’LTR。這些載體中g(shù)ag/pol輔助基因產(chǎn)物和包膜蛋白功能來(lái)自單一質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或使用HIV共感染包含載體的細(xì)胞。
腺病毒是雙鏈線形DNA病毒，不經(jīng)歷RNA中間體。腺病毒共有50種不同的人血清亞型，根據(jù)基因序列同源性分為6個(gè)亞組，全都表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)幕蚪M構(gòu)。在腺病毒載體系統(tǒng)中，人腺病毒C組血清亞型2和血清亞型5(具有95％序列同源性)是最為常用的，和青年人中的上呼吸道感染正常相關(guān)。
用在本發(fā)明中的腺病毒/腺病毒載體可以是人源的或動(dòng)物來(lái)源的。對(duì)于人源的腺病毒載體來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的腺病毒是C組的腺病毒，尤其是2型腺病毒(Ad2)、5型腺病毒(Ad5)、7型腺病毒(Ad7)或12型腺病毒(Ad12)。在動(dòng)物來(lái)源的各種腺病毒中，可以使用犬腺病毒、小鼠腺病毒或禽腺病毒，如CELO病毒(Cotton et al.，1993，JVirol 673777-3785)。
舉例來(lái)說(shuō)，HSV載體可以來(lái)源于HSV1或HSV2株，或其衍生物?？梢允褂脺p毒株，如1716株(MacLean et al.，1991，J Gen Virol72632-639)、R3616和R4009株(Chou and Roizman，1992，PNAS893266-3270)和R930株(Chou et al.，1994，J.Virol 688304-8311)，這些病毒株都具有ICP34.5和d27-1中的突變(Rice and Knipe，1990，J.Virol 641704-1715)，以及ICP27中有缺失的d27-1。具有VMW65中滅活突變的、缺失了ICP4、ICP0、ICP22、ICP6、ICP47、vhs或gH的其他病毒株，或上述病毒株的任意組合也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的HSV株。
用來(lái)描述各種HSV基因的術(shù)語(yǔ)參見(jiàn)Coffin and Latchman，1996.基于皰疹病毒的載體。Latchman DS(版)，神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳操作，AcadamicPress倫敦，99-114頁(yè)。
本發(fā)明中還可使用桿狀病毒載體。桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是一種DNA病毒，僅在某些鱗翅目昆蟲(chóng)的細(xì)胞中復(fù)制，已廣泛用于昆蟲(chóng)細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)。最近已使用桿狀病毒AcMNPV將異源DNA高效導(dǎo)入各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如肝細(xì)胞系及原代肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(Boyce FM，Bucher NL(1996)桿狀病毒介導(dǎo)的向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移.Proc Natl Acad Sci USA 93，2348-52；Airenne KJ，Hiltunen MO，Turunen MP，Turunen AM，LaitinenOH，Kulomaa MS，YlaHerttuala S(2000)桿狀病毒介導(dǎo)的向兔頸動(dòng)脈中的基因轉(zhuǎn)移.Gene Ther 7，1499-1504)。另外，用于基因轉(zhuǎn)移的桿狀病毒、將異源DNA導(dǎo)入其基因組的方法和昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組病毒的方法都可以從商用途徑獲得；而且，桿狀病毒不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中正常復(fù)制，因此沒(méi)有必要為了該用途將其加以改造。
可以采用常規(guī)的連接技術(shù)來(lái)構(gòu)建用在本發(fā)明方法中的載體。分離的病毒載體、質(zhì)粒或DNA片段可以按所需方式加以切割、加尾，并重新連接，產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。需要的話，用已知的方式進(jìn)行分析，確認(rèn)構(gòu)建的質(zhì)粒中的序列正確。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)常規(guī)的Southern印跡法、點(diǎn)雜交、PCR或原位雜交，使用根據(jù)轉(zhuǎn)座子中存在的序列設(shè)計(jì)的適當(dāng)標(biāo)記探針，直接測(cè)定轉(zhuǎn)座子的存在和/或移動(dòng)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以考慮如何根據(jù)需要來(lái)改進(jìn)這些方法。本發(fā)明中用到的載體最好帶有標(biāo)記基因，以便如上所述的轉(zhuǎn)座子鑒定以及定位。
發(fā)明用途本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎或生物體，它們包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)突變同質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)克隆細(xì)胞群。因此，轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物可以在細(xì)胞簇、一種組織或多種組織、一個(gè)器官或多個(gè)器官中產(chǎn)生，這些組織和器官都具有相同的基因修飾。許多細(xì)胞、組織或器官中相同基因修飾的存在便于分析修飾的表型和基因型，并使得通過(guò)和相應(yīng)的野生型基因或相同生物體的同一類(lèi)型細(xì)胞、組織或器官中的其他基因修飾相比較，了解具體基因修飾的效應(yīng)。
本發(fā)明還可用于監(jiān)測(cè)修飾基因的基因表達(dá)模式，可在胚胎發(fā)育期間以及成年細(xì)胞和組織中監(jiān)測(cè)。
可用序列分析來(lái)鑒定轉(zhuǎn)座子及其從中切除的位點(diǎn)。例如，Minos典型地整合在TA堿基對(duì)處，切除后留下一個(gè)足跡，該足跡由兩個(gè)靶TA序列組成，位于轉(zhuǎn)座子四個(gè)末端核苷酸的旁側(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)序、PCR或雜交之類(lèi)的技術(shù)來(lái)檢測(cè)Minos序列、其足跡或相關(guān)序列的存在。
可用類(lèi)似的技術(shù)，如使用和末端重復(fù)序列互補(bǔ)的PCR引物來(lái)鑒定插入的轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)發(fā)育的預(yù)定階段進(jìn)行精確的基因調(diào)控，并使用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行檢測(cè)，可以繪制基因組的功能譜。因此，本發(fā)明提供了發(fā)育早期階段轉(zhuǎn)基因生物體細(xì)胞中的外顯子捕獲功能性，實(shí)現(xiàn)了有效的轉(zhuǎn)座子移動(dòng)，以及向生物體的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織基因組中的插入。在胚胎發(fā)育的這些階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)座基因?yàn)橥|(zhì)的細(xì)胞群或組織。這樣就能夠進(jìn)一步快速、有效地檢測(cè)表型的變化和/或鑒定修飾的基因。
圖12中給出了一個(gè)適當(dāng)?shù)牟东@構(gòu)建體實(shí)例。
在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以將基因加以標(biāo)記，用于細(xì)胞群或組織中的功能性遺傳分析，或通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入將基因加以敲除，然后通過(guò)轉(zhuǎn)座子“標(biāo)簽”進(jìn)行特異性鑒定，不需要昂貴而耗時(shí)的遺傳分析，且經(jīng)常不需要大量的測(cè)序。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案產(chǎn)生諸如轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)。根據(jù)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞、組織或器官的表型從表型上鑒定靶基因，并通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。上述的誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)可用于調(diào)控基因的部分敲除和反義誘導(dǎo)的完全敲除之間的開(kāi)關(guān)。將帶有轉(zhuǎn)座子插入的體細(xì)胞永生化，如通過(guò)常規(guī)方法產(chǎn)生永生細(xì)胞系，或通過(guò)核植入方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系。
這種文庫(kù)可用于表型分析和基因相關(guān)性的鑒定。本發(fā)明的方法優(yōu)于目前的方法。
在血珠蛋白病變、血友病、囊腫纖維癥和肌肉失養(yǎng)癥之類(lèi)遺傳性疾病中，單一基因或其調(diào)控元件中的明確突變產(chǎn)生異常的基因表達(dá)，導(dǎo)致臨床疾病，極大程度地影響受影響個(gè)體的生活方式和預(yù)期壽命。
但是，在其他疾病中，遺傳因素更為復(fù)雜，對(duì)其知之甚少。尤其是和衰老相關(guān)的疾病，如癡呆和精神??；精神病學(xué)的紊亂，如精神分裂癥和躁狂抑郁癥；與骨和關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥；肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和相關(guān)的血管和心血管病情(參見(jiàn)Lander and Schork，Science(1994)265，2037-2048)。
不同靶點(diǎn)中的多個(gè)突變決定疾病發(fā)生時(shí)間(如絕經(jīng)期后的胰島素抵抗)和疾病狀態(tài)嚴(yán)重程度(如血管疾病和中風(fēng)的事先傾向)之類(lèi)的因素，因此對(duì)飼養(yǎng)的小鼠系進(jìn)行隨機(jī)烷基化，從發(fā)生單一基因缺失的大的ES細(xì)胞文庫(kù)費(fèi)勁地形成轉(zhuǎn)基因小鼠的策略必將會(huì)失敗。
本發(fā)明提供了一個(gè)更具有吸引力的策略，該策略從已知易于發(fā)生某種疾病狀態(tài)的背景出發(fā)，快速產(chǎn)生隨機(jī)“標(biāo)記”的小鼠系，因此有可能具有導(dǎo)致相關(guān)疾病之基因中的現(xiàn)有突變。使用在已知整合位點(diǎn)處帶有多個(gè)“顯性”轉(zhuǎn)座子的建立者細(xì)胞系來(lái)選擇背景。可調(diào)控的轉(zhuǎn)座酶活性能夠快速產(chǎn)生具有不同遺傳背景的小鼠文庫(kù)，反映為不同的疾病模型。
例如，研究表明胰島素受體中的突變導(dǎo)致輕至重度的高胰島素癥，其程度取決于小鼠的遺傳背景(參見(jiàn)Kido(2000)Diabetes49，589-596)，說(shuō)明胰島素抵抗事先有就其他基因的參與。在“輕度表型”小鼠背景下，使用體內(nèi)基因轉(zhuǎn)座技術(shù)產(chǎn)生的這種帶有標(biāo)簽的小鼠文庫(kù)應(yīng)能使一些動(dòng)物具有更嚴(yán)重的表型。對(duì)新的轉(zhuǎn)座事件旁側(cè)DNA進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定導(dǎo)致出現(xiàn)嚴(yán)重表型的新候選致病基因。
因此，候選疾病基因成為進(jìn)一步研究的焦點(diǎn)，以明確它們?cè)趧?dòng)物模型中的確切作用并證明其在人體內(nèi)的疾病相關(guān)作用。
人類(lèi)中靶點(diǎn)的證實(shí)將使用現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)庫(kù)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)，這些數(shù)據(jù)庫(kù)包括DNA和與相關(guān)患者及對(duì)照組相關(guān)的臨床信息。
可以通過(guò)簡(jiǎn)單、快速的指標(biāo)來(lái)分析所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體的表型，測(cè)定指標(biāo)包括尿、血液、脊髓液或組織中存在的代謝物、蛋白質(zhì)(如胰島素)、脂類(lèi)或碳水化合物(當(dāng)測(cè)定葡萄糖耐受時(shí))的變化。可以通過(guò)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的許多技術(shù)中的任意技術(shù)來(lái)實(shí)施體液中的指標(biāo)測(cè)定，這些技術(shù)包括通過(guò)NMR、ELISA、GMS等等。
還可以使用光試驗(yàn)、聲音試驗(yàn)、記憶試驗(yàn)和應(yīng)激試驗(yàn)，測(cè)定行為模式或?qū)ν鈦?lái)刺激的反應(yīng)性，對(duì)其他表型特征進(jìn)行分析。
其他的可檢測(cè)表型特征包括生長(zhǎng)和衰老參數(shù)、腫瘤生長(zhǎng)和肥胖等，這些特征可以通過(guò)諸如稱量體重、脂肪含量和生長(zhǎng)速度的方法來(lái)加以測(cè)定。也可以評(píng)價(jià)其他可檢測(cè)特征的變化，如血壓、心率、肺功能等的變化。
本發(fā)明轉(zhuǎn)座子技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于能夠生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物文庫(kù)而不需要煩瑣的保存。以前產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法包括產(chǎn)生突變的化學(xué)誘變方法。這些方法涉及每個(gè)動(dòng)物(如小鼠)進(jìn)行多處突變。動(dòng)物一旦產(chǎn)生，就分析其表型，并需要?dú)w檔/保存以備后用。本發(fā)明能夠產(chǎn)生基因組中插入不同轉(zhuǎn)座子的起始細(xì)胞系或起始轉(zhuǎn)基因生物體。然后使用這些細(xì)胞系或生物體和帶有轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一起繁殖，產(chǎn)生一個(gè)新的文庫(kù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生ES細(xì)胞文庫(kù)，該文庫(kù)具有分布在整個(gè)基因組上的不同轉(zhuǎn)座子插入?？梢詫?duì)其進(jìn)行測(cè)序和分析。ES細(xì)胞便于保存，以備后用。
在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，可以使用本發(fā)明的方法“標(biāo)記”表達(dá)受外來(lái)刺激物調(diào)節(jié)的基因。因此，表現(xiàn)出具有標(biāo)記轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座移動(dòng)的一個(gè)胚胎、生物體或來(lái)源于二者之一的組織或細(xì)胞用外來(lái)刺激物處理，觀察對(duì)標(biāo)記基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，其中刺激物可以是候選藥物或其他受試試劑。標(biāo)記基因超高表達(dá)或過(guò)低表達(dá)的細(xì)胞可能具有插入的轉(zhuǎn)座子，且轉(zhuǎn)座子插入到了受刺激物上調(diào)或下調(diào)的基因中或基因附近。因此本發(fā)明通過(guò)插入包含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子，可用于提供體內(nèi)增強(qiáng)子捕獲和外顯子捕獲功能，其中標(biāo)記基因表達(dá)水平受增強(qiáng)子或外顯子的接近調(diào)節(jié)。
本方法可用于研究藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)研究中藥物對(duì)基因的調(diào)節(jié)作用。另外，可用于研究天然刺激物，如激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)基因的調(diào)節(jié)；鑒定分子介入的新靶點(diǎn)，包括用語(yǔ)人類(lèi)、植物或動(dòng)物疾病治療的靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)劑、除草劑、抗真菌劑和抗菌劑。
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了進(jìn)一步示例性說(shuō)明。
實(shí)施例A使用多西環(huán)素體內(nèi)活化Minos實(shí)施例1產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子攜帶小鼠和轉(zhuǎn)座酶攜帶小鼠產(chǎn)生了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系。轉(zhuǎn)座子攜帶系(MCG系)包含帶有Minos轉(zhuǎn)座子的片段串聯(lián)體，其中Minos轉(zhuǎn)座子包含位于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制之下的GFP基因。對(duì)轉(zhuǎn)座子加以改造，使內(nèi)部至反向重復(fù)之間的幾乎所有序列都置換為CMV/GFP序列盒。由于不包含編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該轉(zhuǎn)座子是非自主的，只有當(dāng)轉(zhuǎn)座酶存在的條件下才能移動(dòng)。第二轉(zhuǎn)基因小鼠系包含在誘導(dǎo)性啟動(dòng)子控制之下表達(dá)的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。
如下所述構(gòu)建轉(zhuǎn)座子MiCMVGFP用BamHI切割質(zhì)粒pMILRTetR(Klinakis et al.(2000)Ins.Mol.Biol.9，269-275(2000b))，然后重新連接，以去除Minos末端之間的四環(huán)素抗性基因，產(chǎn)生質(zhì)粒PMILRΔBamH I。將來(lái)源于pMILRΔBamH I的、包含D.hydei中Minos反向重復(fù)序列和原始旁側(cè)序列的Asp718/SacI片段克隆到質(zhì)粒pPolyIII-I-lox[將loxP寡核苷酸ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT插入到載體pPolyIII-I中產(chǎn)生(登記號(hào)M18131)中產(chǎn)生]中，產(chǎn)生質(zhì)粒ppolyMILRΔBamHI。通過(guò)將來(lái)源于質(zhì)粒pBluescriptGFP的2.2kb SpeI片段插入到pPolyMILRΔBamHI的SpeI位點(diǎn)上，產(chǎn)生用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的最終構(gòu)建體(pMiCMVGFP，圖5)，其中質(zhì)粒pBluescriptGFP包含由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人源化GFP基因(來(lái)源于Clontech質(zhì)粒pHGFP-S65T)，其后為SV40介入序列和腺苷酸化信號(hào)。
將來(lái)源于pMiCMVGFP質(zhì)粒的3.2kb XhoI片段微注射到FVB XFVB受精卵母細(xì)胞中，構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)座子的MCG系。使用GFP DNA作為探針，對(duì)來(lái)源于尾部活檢樣品的DNA進(jìn)行Southern印跡分析，鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
通過(guò)常規(guī)的同源重組ES細(xì)胞技術(shù)將轉(zhuǎn)座酶基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶表達(dá)系。用常規(guī)方法將ES細(xì)胞注射到囊胚中獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(小鼠胚胎操作，Hogan et al.，冷泉港出版社，1994)。使用了兩個(gè)構(gòu)建體。其中一個(gè)構(gòu)建體包含有靶細(xì)胞中表達(dá)位于組成性啟動(dòng)子控制之下的rtTA基因。所用的構(gòu)建體是pTet-On質(zhì)粒(Clontech)，它包含位于巨細(xì)胞即早(CMV)啟動(dòng)子控制之下、編碼rtTA活化因子的基因。該構(gòu)建體編碼的rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子僅在多西環(huán)素存在的條件下才能活化。第二構(gòu)建體包含位于四環(huán)素應(yīng)答元件或TRE控制之下的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。TRE包含7個(gè)含有tet操縱子(tetO)的42-bp序列的正向重復(fù)，就位于基礎(chǔ)CMV啟動(dòng)子的上游，該啟動(dòng)子缺少正常情況下和CMV即早啟動(dòng)子相關(guān)的增強(qiáng)子元件。因?yàn)闆](méi)有這些增強(qiáng)子元件，在沒(méi)有rtTA的結(jié)合時(shí)，沒(méi)有轉(zhuǎn)座酶從TRE的“泄漏”表達(dá)。使用的第二構(gòu)建體是pTRE2質(zhì)粒(Clontech)，其多克隆位點(diǎn)(MCS)中插入了編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的基因。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有兩個(gè)構(gòu)建體的細(xì)胞中，rtTA得表達(dá)，但是只有往培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素時(shí)才能活化Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。
使用轉(zhuǎn)座酶cDNA片段作為探針對(duì)來(lái)源于尾部活檢樣品的DNA進(jìn)行Southern印跡分析，鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
實(shí)施例2體內(nèi)活化Minos轉(zhuǎn)座子攜帶MCG系的轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)座酶攜帶系的轉(zhuǎn)基因小鼠相雜交?；蚪M中包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的胚胎中，轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)僅在多西環(huán)素存在的條件下發(fā)生。將多西環(huán)素施用在母體生物體水中的胚胎上。為了限制轉(zhuǎn)座事件的可能數(shù)目，多西環(huán)素僅在限定的時(shí)間內(nèi)施用(妊娠1～2天時(shí))。
出生時(shí)，分離從胚胎發(fā)育而來(lái)的轉(zhuǎn)基因后代，各種細(xì)胞和組織用于基因型分析。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)座的檢測(cè)使用能夠與非移動(dòng)性Drosophila hydei序列相雜交的引物對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行PCR分析，檢測(cè)小鼠組織中Minos轉(zhuǎn)座酶所活化的轉(zhuǎn)座，其中Drosophila hydei序列位于構(gòu)建體中Minos轉(zhuǎn)座子的旁側(cè)(Klinakis etal.，(2000)Ins.Mol.Biol.9，269-275)。在果蠅細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的Minos切除后，染色單體進(jìn)行修復(fù)，通常留下特征性的6-堿基對(duì)足跡(Arca et al.(1997)Genetics 145，267-279)。使用特異引物進(jìn)行PCR分析，產(chǎn)生診斷性的167bp的PCR片段(Catteruccia F.et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，2157-2162)。
使用Dneasy組織試劑盒(QIAGEN)，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明從不同組織中分離基因組DNA。使用引物11DML(5’-AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3’)和GOUM67(5’-GCATCAAATTGAGTTTTGCTC-3’)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件如下每25μL反應(yīng)體系中包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001％明膠；1.2單位Taq 2000TMDNA聚合酶(STRATAGENE)，200g模板DNA和10pmol各引物。94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s進(jìn)行43或60個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物克隆到PCRII TA克隆載體(Invitrogen)中，并用T7引物進(jìn)行測(cè)序。
診斷性條帶存在于轉(zhuǎn)基因后代的某些組織中。通過(guò)使用對(duì)擴(kuò)增序列特異的標(biāo)記DNA探針進(jìn)行Southern印跡分析，證實(shí)片段的相同性(數(shù)據(jù)未列出)。細(xì)胞簇對(duì)于相同的轉(zhuǎn)座基因來(lái)說(shuō)是同質(zhì)的。
B使用位于ZP3啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)座酶在體內(nèi)活化Minos實(shí)施例4在該實(shí)施例中，說(shuō)明了將編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達(dá)置于特定發(fā)育階段產(chǎn)生的基因調(diào)控信號(hào)的控制之下，使轉(zhuǎn)座作用在胚胎發(fā)育的這一階段得以誘導(dǎo)。在該實(shí)施例中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于ZP3啟動(dòng)子的控制之下，從而使轉(zhuǎn)座酶僅在2至3周卵發(fā)生階段中生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中表達(dá)。在生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中表達(dá)的Minos轉(zhuǎn)座酶催化修飾的、非自主的Minos轉(zhuǎn)座子的切除，并促進(jìn)其向基因組中新位點(diǎn)上的重新整合。
圖11顯示可替換使用的構(gòu)建體(敲入構(gòu)建體，用于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因)，其中轉(zhuǎn)座酶插入到內(nèi)源精子特異性Hlt基因，以在精子中發(fā)生轉(zhuǎn)座。通過(guò)將Hlt序列置換為ZP3(卵特異性表達(dá))或hnRNP(普遍表達(dá))基因起始位點(diǎn)旁側(cè)的相應(yīng)序列，構(gòu)建卵特異性表達(dá)和普遍表達(dá)的可替換構(gòu)建體。
CMinos序列的哺乳動(dòng)物密碼子利用率實(shí)施例5改進(jìn)轉(zhuǎn)座酶提高蠅轉(zhuǎn)座酶哺乳動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)的效率的一個(gè)方法是將蠅密碼子利用率置換為哺乳動(dòng)物密碼子利用率，使mRNA更有效翻譯，導(dǎo)致轉(zhuǎn)座酶濃度升高。為了這一目的，我們將蠅Minos轉(zhuǎn)座酶的編碼序列置換成了序列-SEQ新1026bp；組成321A；235C；261G；209T；0其他百分比31％A；23％C；25％G；20％T；0％其他分子量(kDa)ssDNA317.79 dsDNA632.5來(lái)源
1 ATGGTGCGCG GTAAGCCTAT CTCTAAGGAG ATCAGAGTAC TGATCAGGGA CTATTTTAAG61 TCTGGGAAGA CACTCACTGA GATAAGCAAG CAGTTAAACT TGCCTAAGAG CTCTGTGCAT121 GGGGTGATAC AGATTTTCAA GAAAAATGGG AACATTGAGA ATAACATCGC GAATAGAGGC181 CGAACATCCG CAATAACCCC CCGCGACAAG AGACAGCTGG CCAAAATTGT GAAGGCTGAC241 CGCCGCCAAT CCCTGAGAAA CTTGGCTTCC AAGTGGTCGC AGACCATTGG CAAGACTGTC301 AAGCGGGAGT GGACCCGGCA GCAATTAAAG AGTATTGGCT ACGGTTTTTA TAAGGCCAAG361 GAAAAACCCC TGCTTACGCT TCGGCAAAAA AAGAAGCGTC TGCAATGGGC TCGGGAAAGG421 ATGTCTTGGA CTCAAAGGCA GTGGGATACC ATCATCTTCA GCGATGAGGC TAAATTTGAT481 GTGAGTGTCG GCGACACGAG AAAGCGCGTC ATCCGTAAGA GGTCCGAGAC ATACCATAAG541 GACTGCCTGA AAAGAACAAC CAAGTTTCCT GCAAGCACTA TGGTATGGGG ATGTATGTCT601 GCCAAAGGAC TCGGAAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATT661 AACATTCTCC AGGATAGTTT GCTGCCCTCA ATACCAAAAC TATCCGATTG TGGTGAATTC721 ACTTTTCAGC AGGACGGAGC ATCATCGCAC ACCGCCAAGC GGACCAAAAA CTGGCTGCAG781 TACAATCAGA TGGAGGTGCT CGATTGGCCC TCAAATAGTC CGGATCTAAG CCCAATCGAA841 AATATCTGGT GGCTAATGAA AAACCAGCTG CGAAACGAGC CACAGAGGAA CATTTCCGAC901 TTGAAAATCA AGCTGCAAGA GATGTGGGAC TCAATCTCTC AGGAGCACTG CAAAAACCTG961 CTCAGCAGCA TGCCTAAACG AGTGAAATGC GTGATGCAGG CCAAGGGCGA CGTTACACAG1021 TTCTGA該序列對(duì)應(yīng)于正常的哺乳動(dòng)物密碼子利用率，翻譯后產(chǎn)生和蠅轉(zhuǎn)座酶蛋白序列相同的蛋白質(zhì)序列。以寡聚核苷酸(上方正義鏈和下方反義鏈)形式合成的基因(cDNA)分為三部分，對(duì)各部分進(jìn)行克隆，然后連接成一條cDNA。
-部分A和起始密碼子前面的Kozak接頭A KozakCCACCATGG
AatII NcoI-15 CCCCGACGTCCCACCATGGTGCGCG GTAAGCCTAT CTCTAAGGAG ATCAGAGTAC TGATCAGGGA CTATTTTAAGTACCACGCGC CATTCGGATA GAGATTCCTC TAGTCTCATG ACTAGTCCCT GATAAAATTC61 TCTGGGAAGA CACTCACTGA GATAAGCAAG CAGTTAAACT TGCCTAAGAG CTCTGTGCATAGACCCTTCT GTGAGTGACT CTATTCGTTC GTCAATTTGA ACGGATTCTC GAGACACGTA121 GGGGTGATAC AGATTTTCAA GAAAAATGGG AACATTGAGA ATAACATCGC GAATAGAGGCCCCCACTATG TCTAAAAGTT CTTTTTACCC TTGTAACTCT TATTGTAGCG CTTATCTCCG181 CGAACATCCG CAATAACCCC CCGCGACAAG AGACAGCTGG CCAAAATTGT GAAGGCTGACGCTTGTAGGC GTTATTGGGG GGCGCTGTTC TCTGTCGACC GGTTTTAACA CTTCCGACTG241 CGCCGCCAAT CCCTGAGAAA CTTGGCTTCC AAGTGGTCGC AGACAATTGG CAAGACTGTCGCGGCGGTTA GGGACTCTTT GAACCGAAGG TTCACCAGCG TCTGTTAACC TGATCAGGGGMfeI SpeI接頭BMfeIGGGGCAATTGG CAAGACTGTCGCGGCGGTTA GGGACTCTTT GAACCGAAGG TTCACCAGCG TCTGTTAACC GTTCTGACAG301AAGCGGGAGT GGACCCGGCA GCAATTAAAG AGTATTGGCT ACGGTTTTTA TAAGGCCAAGTTCGCCCTCA CCTGGGCCGT CGTTAATTTC TCATAACCGA TGCCAAAAAT ATTCCGGTTC361GAAAAACCCC TGCTTACGCT TCGGCAAAAA AAGAAGCGTC TGCAATGGGC TCGGGAAAGGCTTTTTGGGG ACGAATGCGA AGCCGTTTTT TTCTTCGCAG ACGTTACCCG AGCCCTTTCC421ATGTCTTGGA CTCAAAGGCA GTGGGATACC ATCATCTTCA GCGATGAGGC TAAATTTGATTACAGAACCT GAGTTTCCGT CACCCTATGG TAGTAGAAGT CGCTACTCCG ATTTAAACTA481GTGAGTGTCG GCGACACGAG AAAACGCGTC ATCCGTAAGA GGTCCGAGAC ATACCATAAGCACTCACAGC CGCTGTGCTC TTTTGCGCAG TAGGCATTCT CCAGGCTCTG TATGGTATTC541GACTGCCTGA AAAGAACAAC CAAGTTTCCT GCAAGCACTA TGGTATGGGG ATGTATGTCTCTGACGGACT TTTCTTGTTG GTTCAAAGGA CGTTCGTGAT ACCATACCCC TACATACAGA601GCCAAAGGAC TCGGAAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATTCGGTTTCCTG AGCCTTTCGA ACCCCTACGTACCCCHindIII NsiI
接頭CHindIII601CCCCAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATTTTCGA AGTGAAGTAG CTTCCCTGGC AATTACGGCT TTTTATGTAA661AACATTCTCC AGGATAGTTT GCTGCCCTCA ATACCAAAAC TATCCGATTG TGGTGAATTCTTGTAAGAGG TCCTATCAAA CGACGGGAGT TATGGTTTTG ATAGGCTAAC ACCACTTAAG721ACTTTTCAGC AGGACGGAGC ATCATCGCAC ACCGCTAAGC GGACCAAAAA CTGGCTGCAGTGAAAAGTCG TCCTGCCTCG TAGTAGCGTG TGGCGGTTCG CCTGGTTTTT GACCGACGTC781TACAATCAGA TGGAGGTGCT CGATTGGCCC TCAAATAGTC CGGATCTAAG CCCAATCGAAATGTTAGTCT ACCTCCACGA GCTAACCGGG AGTTTATCAG GCCTAGATTC GGGTTAGCTT841AATATCTGGT GGCTAATGAA AAACCAGCTG CGAAACGAGC CACAGAGGAA CATTTCCGACTTATAGACCA CCGATTACTT TTTGGTCGAC GCTTTGCTCG GTGTCTCCTT GTAAAGGCTG901TTGAAAATCA AGCTGCAAGA GATGTGGGAC TCAATCTCTC AGGAGCACTG CAAAAACCTGAACTTTTAGT TCGACGTTCT CTACACCCTG AGTTAGAGAG TCCTCGTGAC GTTTTTGGAC961CTCAGCAGCA TGCCTAAACG AGTGAAATGC GTGATGCAGG CCAAGGGCGA CGTTACACAGGAGTCGTCGT ACGGATTTGC TCACTTTACG CACTACGTCC GGTTCCCGCT GCAATGTGTC1021TTCTGAGGAT CCAAGACTCCTA GGCCCCGGGG AGATCTCCTA CGTAGGGGBamHI XbaI NsiI材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)施例1中描述了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的修飾型Minos轉(zhuǎn)座子pMiCMVGFP(圖5)的構(gòu)建。簡(jiǎn)要地說(shuō)，包含由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人源化GFP基因以及下游介入序列和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)的2.2kb片段置于Minos反向重復(fù)之間。需要的話，左側(cè)反向重復(fù)前面可以包括lox P位點(diǎn)，用于產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
以載體Pev3(Clare Gooding，Biotechnology Dept，Zeneca，Macclesfield，UK；Needham et al.，Nucl.Acids Res.，20，997-1003，1992中進(jìn)一步介紹了Pev3)中1kb ClaI/NotI片段的形式克隆Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA。將獲得質(zhì)粒中的3.8kb的ClaI/Asp718片段(包含Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA，及后面的人β珠蛋白基因內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號(hào))克隆到pBluescript SK+(Stratagene，La Jolla，Ca，USA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pBlue/ILMi/3’β。來(lái)自質(zhì)粒ZP3/6.5Luc(Lira，S.et al(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，7215-7219)的6.5kb平末端Asp718片段包含透明帶3(ZP3)基因的5’旁側(cè)區(qū)和啟動(dòng)子，將該片段克隆到pBlue/ILMi/3’β的EcoRV位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒ZP3/ILMi(圖6)，該智力可用于產(chǎn)生在發(fā)育的卵中表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠為了產(chǎn)生Minos轉(zhuǎn)座酶表達(dá)系，從pZP3/ILMi中切除一個(gè)10.3kb的SmaI/Asp718片段，用凝膠電泳從質(zhì)粒序列中分離出來(lái)(Sambrook，J等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，NY(1989))，使用ELUTIP-d柱進(jìn)行純化和濃縮(Schleicher & Schuell GmbH，Dassel，Germany)，并以4ng/μL的濃度注射到受精的卵母細(xì)胞中。將注射了的卵轉(zhuǎn)移到假孕的小鼠體內(nèi)，通過(guò)對(duì)尾部DNA進(jìn)行Southern印跡分析鑒定轉(zhuǎn)基因后代(Southern，E.M.(1975)，J.Mol.Biol 98，503-517)。
如上所述和(Zagoraiou，L et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，11474-11478)中所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子攜帶(MCG)系。
RT-PCR對(duì)于RT-PCR分析來(lái)說(shuō)，使用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)(BiotechLaboratories，Houston，TX，USA)從ZP3/ILMi轉(zhuǎn)基因的不同器官中分離總RNA。在20μL反應(yīng)體系中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Super RT；HTBiotechnology，Cambridge，UK)和oligo(dT)引物，從1μg總RNA合成cDNA。在體積為50μL的PCR緩沖液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR緩沖液包括1.5mmol/L MgCl2、100ng各引物、0.2mmol/L dNTPs和2.5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia)。94℃ 45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察PCR產(chǎn)物。Minos轉(zhuǎn)座酶特異性引物為Minosl5’-CAGCTTCGAAATGAGCCAC-3’和β-EX5’-TGGACAGCAAGAAAGCGAG-3’。鼠次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)特異引物為5’-CACAGGACTAGAACACCTGC-3’和5’-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3’。
育種(breeding)程序攜帶轉(zhuǎn)座子(MCG)的雌性動(dòng)物和ZP3/ILMi系中15個(gè)雄性動(dòng)物相雜交。通過(guò)這些雜交獲得的雙陽(yáng)性雌性動(dòng)物和野生型(WT)雄性動(dòng)物相雜交，通過(guò)Southern印跡分析，分析后代中的可能轉(zhuǎn)座事件。使用EcoRV或BglII消化基因組DNA，在0.7％或1％的瓊脂糖凝膠(Sigma，Steinhein，Germany)上進(jìn)行分離，印到尼龍膜(Hybond-N+，Amersham Pharmacia，Buckinghamshire England)上，用32P標(biāo)記的、來(lái)源于pMiCMGFP的737bp SacI/NotI GFP片段進(jìn)行探測(cè)。
DNA的熒光原位雜交(FISH)分析根據(jù)常規(guī)方法從腹腔白細(xì)胞(Mulder，M.P et al.(1995).Hum Genet96(2)133-141)制備小鼠細(xì)胞分裂中期的涂片。使用pMiCMVGFP構(gòu)建體的737-bp SacI/NotI GFP片段作為探針。探針可以使用生物素(Boehringer Mannheim)進(jìn)行標(biāo)記并直接用FITC進(jìn)行免疫化學(xué)檢測(cè)，或使用基于Tyramide的步驟改進(jìn)信號(hào)檢測(cè)(Raap，A.K.et al(1995)Human Molecular Genetics 4，529-534)。使用DAPI對(duì)DNA進(jìn)行復(fù)染。
克隆插入位點(diǎn)使用EcoRV或BglII，切割從帶有新的Minos插入位點(diǎn)的動(dòng)物獲得的小鼠DNA，并在0.7％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。將包含轉(zhuǎn)座事件的凝膠區(qū)切下，分離DNA。根據(jù)片段大小，直接在自身連接的片段上進(jìn)行反向PCR，使用Minos引物IMiol(5’-AAGAGAATAAAATTCTCTTTGAGACG-3’)進(jìn)行第一次PCR，使用IMio2(5’-GATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGC-3’)進(jìn)行巢式PCR(Klinakis，A.G.，Zagoraiou，L，Vassilatis，D.K & Savakis，C.(2000)EMBO Report 11，416-421.)；或者使用AluI對(duì)獲得的EcoRV或BglII片段進(jìn)一步進(jìn)行消化，并加以環(huán)化。如前所述使用IMiol和IMiil(5’-CAAAAATATGAGTAATTTATTCAAACGG-3’)進(jìn)行反向PCR，使用引物IMio2和IMii2(5’-GCTTAAGAGATAAGAAAAAAGTGACC-3’)進(jìn)行巢式PCR(Klinakis，A.G.，Zagoraiou，L.，Vassilatis，D.K & Savakis，C.(2000)EMBO Report 11，416-421.)。用這種方式分別擴(kuò)增左側(cè)和右側(cè)序列。直接對(duì)PCR片段進(jìn)行測(cè)序，或者克隆到pGEMT easy載體(Promega)或PCRII(Invitrogen)上進(jìn)行測(cè)序。使用獲得的序列，對(duì)當(dāng)時(shí)Celera(www.celera.com)數(shù)據(jù)庫(kù)中能夠得到的小鼠基因組序列進(jìn)行BLAST檢索。
結(jié)果產(chǎn)生了攜帶轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因小鼠系(MCG)。它包含6個(gè)拷貝的、整合在小鼠第14號(hào)染色體中的Minos轉(zhuǎn)座子MiCMVGFP(圖5)。由于該轉(zhuǎn)座子缺少轉(zhuǎn)座酶基因，因此是非自主的，即它自身不能轉(zhuǎn)座。平行產(chǎn)生了兩個(gè)表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的小鼠系。由于使用ZP3基因的6.5kb 5’旁側(cè)區(qū)和啟動(dòng)子(圖6)，它們?cè)谏L(zhǎng)點(diǎn)卵母細(xì)胞中特異性地表達(dá)Minos轉(zhuǎn)座酶。在兩個(gè)Minos轉(zhuǎn)座酶(ZP3/ILMi)系中，轉(zhuǎn)基因以串聯(lián)體形式整合。在該實(shí)施例中，我們使用了整合有較高拷貝數(shù)的ZP3/ILMi系15(數(shù)據(jù)未列出)。與預(yù)期的一樣，該系中轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)僅限于卵巢(圖7)。對(duì)來(lái)源于轉(zhuǎn)基因ZP3/ILMi系不同組織的RNA樣品進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果僅從卵巢中擴(kuò)增出了～360bp的片段，和正確剪接的轉(zhuǎn)座酶RNA相對(duì)應(yīng)。通過(guò)使用跨越一個(gè)外顯子/內(nèi)含子連接部位的引物，防止擴(kuò)增到相似大小片段的雜質(zhì)DNA(β珠蛋白IVSII-圖6)。
既然Minos轉(zhuǎn)座酶從轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受ZP3啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)座酶應(yīng)該僅在2至3周卵發(fā)生階段生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中表達(dá)。
正常情況下，在原始卵母細(xì)胞(10～15μm)中不能檢測(cè)到透明帶轉(zhuǎn)錄物，在50μm直徑的卵母細(xì)胞中能夠觀察到最高水平。當(dāng)卵母細(xì)胞到達(dá)最大(70～80μm)時(shí)，ZP3轉(zhuǎn)錄物的水平開(kāi)始下降。排出的卵中包含的透明帶轉(zhuǎn)錄物少于總透明帶轉(zhuǎn)錄物峰值水平的5％(Millar，et al(1991)Molecular and Cellular Biology 11，6197-6204；Liu，C et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，5431-5436)。為了排除殘留在成熟卵母細(xì)胞中的一些轉(zhuǎn)座酶活性介導(dǎo)親本轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因的可能性，將Zp3/ILMi雄性動(dòng)物(不表達(dá)轉(zhuǎn)座酶)和多拷貝攜帶MCG系的雌性動(dòng)物相交配。選擇對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的雌性子代，用于進(jìn)一步研究。我們用Southern印跡分析法分析了雙陽(yáng)性雌性動(dòng)物和野生型雄性動(dòng)物產(chǎn)生的307個(gè)子代。將EcoRV和/或BglII消化的尾部DNA印到膜上，并和GFP探針相雜交。由于這些酶都不在轉(zhuǎn)座子內(nèi)部切割，因此在MCG系中存在有和轉(zhuǎn)座子探針相雜交的單一條帶。如果發(fā)生了轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子插入到其最初所在的基因組EcoRV或BglII片段之外，和轉(zhuǎn)座子探針相雜交后會(huì)檢測(cè)到一條新的帶。307只小鼠中，有146只小鼠是轉(zhuǎn)座子(GFP)陽(yáng)性的。在這146只小鼠中，印跡分析觀察到有12個(gè)轉(zhuǎn)座事件產(chǎn)生了新的限制性片段，轉(zhuǎn)座頻率為8.2％。在兩只小鼠中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)座事件(圖8泳道2和5)。觀察到一些后代帶有Minos介導(dǎo)的插入，但是沒(méi)有遺傳轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因，有力地說(shuō)明了轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在母體減數(shù)分裂II期之前的胚系細(xì)胞中。
為了證明觀察到的轉(zhuǎn)座事件確實(shí)發(fā)生在胚系中，進(jìn)一步使發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的動(dòng)物和野生型小鼠相雜交。對(duì)其子代的分析說(shuō)明這些小鼠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移了重新插入的Minos元件(圖8)。轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體的分離以及向F1代兩個(gè)不同系中的重新插入明確地說(shuō)明了轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在另外一個(gè)染色體上(圖8，泳道2對(duì)泳道3和4，泳道8對(duì)泳道9)。所有的轉(zhuǎn)座事件中都移動(dòng)了單拷貝的轉(zhuǎn)座子，只有一個(gè)轉(zhuǎn)座事件除外。
以前曾經(jīng)注意到轉(zhuǎn)座子的大小影響其轉(zhuǎn)座頻率；較長(zhǎng)的元件轉(zhuǎn)座頻率較低(Lampe，D.J.et al.(1998).Genetics 149，179-187；Fischer，S.E.，et al.(1999)Mol.Gen.Genet.262，268-274.)，說(shuō)明當(dāng)轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點(diǎn)(反向重復(fù))彼此靠近時(shí)，可以更有效地識(shí)別。
Minos轉(zhuǎn)座特征為元件的精確整合而不移動(dòng)旁側(cè)DNA。在果蠅和HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座子插入到TA雙核苷酸中，導(dǎo)致插入時(shí)靶位點(diǎn)復(fù)制(17、19)。為了研究小鼠基因組中插入物的結(jié)構(gòu)，我們從5個(gè)不同的轉(zhuǎn)座事件中克隆了旁側(cè)區(qū)(如材料和方法中所述)。和果蠅中觀察到的相同，Minos末端旁側(cè)為T(mén)A雙核苷酸，之后是和建立者小鼠系MCG中元件旁側(cè)序列不相關(guān)的序列(圖9)。用所得序列在Celera小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行BLAST檢索，結(jié)果說(shuō)明所有新的5個(gè)旁側(cè)序列(一種情況下僅獲得了一個(gè)旁側(cè)序列)都對(duì)應(yīng)于廣泛分布的基因組位置(圖9)。所分析的5個(gè)轉(zhuǎn)座事件中，只有一個(gè)位于14號(hào)染色體上。它是整合到中心粒區(qū)域的單拷貝轉(zhuǎn)座子，14號(hào)染色體頂端不存在轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體。因此，這是發(fā)生在不同染色體上的轉(zhuǎn)座事件(參見(jiàn)圖10)。對(duì)來(lái)源于腹腔白細(xì)胞的分裂中期涂片進(jìn)行DNA熒光原位雜交(FISH分析)，驗(yàn)證了旁側(cè)序列的測(cè)序結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。對(duì)于Southern印跡分析可以清楚地加以檢測(cè)但并不靠近同一染色體上原始位置的轉(zhuǎn)座事件來(lái)說(shuō)，F(xiàn)ISH可能檢測(cè)不到。通過(guò)FISH檢測(cè)單拷貝(3kb)轉(zhuǎn)座作用確實(shí)非常困難，這可以部分地解釋了在使用FISH作為僅有的檢測(cè)方法的情況下為什么我們以前獲得的轉(zhuǎn)座作用頻率較低(0.61％)，其中的轉(zhuǎn)座作用使用包含相同轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因系(MCG)和T細(xì)胞中特異性表達(dá)的Minos轉(zhuǎn)座酶獲得(Zagoraiou，L.，et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，11474-11478)。既然靠近元件原始部位的“局部插入物”至少對(duì)于P元件來(lái)說(shuō)是相當(dāng)頻繁的(Zhang，P.& Sprading，A.C.(1993)Genetics 133，361-373)和SleepingBeauty(Luo，G et al(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95，10769-10773；Fisher，S.E.J.，et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，6759-6764.)，對(duì)于Minos元件來(lái)說(shuō)也不是不可能。
為了確定EcoRV/BglII旁側(cè)區(qū)的大小，我們使用loxP/Cre系統(tǒng)從MCG系中產(chǎn)生了單拷貝轉(zhuǎn)座系(數(shù)據(jù)未列出)。在Southern印跡分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，EcoRV和BglII轉(zhuǎn)座子診斷片段中轉(zhuǎn)座子旁側(cè)大約有10kb基因組序列。發(fā)生在該區(qū)域的局部重新插入(但是對(duì)于誘變目的并沒(méi)有意義)會(huì)逃脫檢測(cè)，不包括在我們對(duì)轉(zhuǎn)座頻率的估算之內(nèi)。因此，頻率8.2％是“有用”轉(zhuǎn)座頻率，而非實(shí)際轉(zhuǎn)座頻率。據(jù)報(bào)道，Sleeping Beauty在小鼠雄性胚系中的轉(zhuǎn)座頻率約為20％，但是僅有2％轉(zhuǎn)座到了不同的染色體上(Fisher，S.E.J.，Wienholds，E.& Plsterk，R.H.A.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，6759-6764)。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)Minos大約有6％轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在不同的染色體上(146個(gè)后代中，分析到的11個(gè)轉(zhuǎn)座作用中有8個(gè)，其中1個(gè)未知)，而11個(gè)轉(zhuǎn)座作用中僅有3個(gè)發(fā)生在相同的染色體上(如圖10B)。該結(jié)果說(shuō)明Minos系統(tǒng)具有向不同染色體轉(zhuǎn)座的傾向(前提是靠近原始位點(diǎn)處不發(fā)生未能檢測(cè)到的許多轉(zhuǎn)座作用)。值得注意的是，對(duì)至今發(fā)表的不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行直接比較并不是十分有效的。轉(zhuǎn)座子的大小、拷貝數(shù)和初始染色體位置都會(huì)影響轉(zhuǎn)座效率，這些在不同的系統(tǒng)中無(wú)法比較。
綜上所述，這些結(jié)果表明可以通過(guò)選擇誘導(dǎo)時(shí)間在胚胎發(fā)育的預(yù)定階段誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)在小鼠胚系中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座作用。另外，結(jié)果表明使用Minos的系統(tǒng)是在生物體，如小鼠中實(shí)現(xiàn)插入性基因失活、基因標(biāo)簽、增強(qiáng)子捕獲和外顯子捕獲的有力工具。
上面說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物都在此引用以作參考。對(duì)于本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然可以在不違背本發(fā)明的范圍和精神的條件下對(duì)本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)加以不同的改動(dòng)和變通。雖然本發(fā)明是聯(lián)系具體的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行介紹的，可以理解的是，要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于具體的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)用于實(shí)施本發(fā)明的所述模式所作的各種改動(dòng)對(duì)于分子生物學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，屬于下面權(quán)利要求書(shū)的范圍。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(d)誘導(dǎo)所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致子代的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
2.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中子代是雌性轉(zhuǎn)基因生物體。
3.權(quán)利要求2中要求保護(hù)的方法，其中使轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列是來(lái)源于ZP3調(diào)控序列的序列。
4.權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中子代是雄性轉(zhuǎn)基因生物體。
5.權(quán)利要求4中要求保護(hù)的方法，其中使轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列是來(lái)源于H1t基因調(diào)控序列的序列。
6.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或一個(gè)或多個(gè)能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的序列；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎，所述胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因組中包含(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(d)誘導(dǎo)所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的第二轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中包含編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的第一轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子及編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因，第二轉(zhuǎn)基因生物體包含誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)座酶表達(dá)所必需的一個(gè)或多個(gè)拷貝的調(diào)控序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的轉(zhuǎn)座子和編碼關(guān)聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的所述基因以單一構(gòu)建體的形式提供到第一生物體的基因組中，轉(zhuǎn)座子移動(dòng)時(shí)編碼轉(zhuǎn)座酶的基因遭到破壞。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中的轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于染色質(zhì)開(kāi)放元件中，使得轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的基因位于開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中染色質(zhì)開(kāi)放元件為普遍作用的染色質(zhì)開(kāi)放元件(UCOE)、基因座控制區(qū)(LCR)、CpG島或隔離子。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中的調(diào)控序列是發(fā)育控制序列，可在發(fā)育的預(yù)定階段活化。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)的方法，其中的調(diào)控序列是誘導(dǎo)性調(diào)控序列，選自四環(huán)素誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)、雌激素誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)、蛻皮素誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)和lac操縱子阻遏系統(tǒng)。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)座子移動(dòng)之后或移動(dòng)的結(jié)果是，因基因切除而使編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達(dá)消失。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因插入或靠近表達(dá)的基因。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中轉(zhuǎn)座子是2型轉(zhuǎn)座子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中轉(zhuǎn)座子是Minos、mariner、Hermes、piggyBac或Sleeping Beauty。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中轉(zhuǎn)座子是Minos。
19.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中對(duì)轉(zhuǎn)座子加以修飾使之包括異源核酸序列，旁側(cè)為與轉(zhuǎn)座子同源的反向末端重復(fù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中轉(zhuǎn)座子包含編碼選擇標(biāo)記的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中選擇標(biāo)記是熒光或發(fā)光多肽。
22.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中對(duì)編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的核苷酸序列加以修飾，優(yōu)化了密碼子利用率。
23.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的方法，其中的轉(zhuǎn)基因生物體具有與由轉(zhuǎn)座子移動(dòng)所修飾的基因同質(zhì)的多個(gè)細(xì)胞或組織，該方法包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座。
24.檢測(cè)和表征轉(zhuǎn)基因生物體中基因突變的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或由其發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)出變異表型特征的多個(gè)細(xì)胞的存在；(c)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞的基因組中一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的位置；和(d)將轉(zhuǎn)座事件的位置和觀察到的變異表型相關(guān)聯(lián)，轉(zhuǎn)座事件的位置為與所觀察到的變異表型相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)遺傳性基因座的位置的指標(biāo)。
25.分離和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表型特征相關(guān)的基因的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或由其發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)出所述表型特征的多個(gè)細(xì)胞的存在；(c)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞的基因組中一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的位置；和(d)克隆包含插入物的遺傳性基因座。
26.分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中增強(qiáng)子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因，使得該基因在基礎(chǔ)水平上表達(dá)；(b)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因胚胎或由其形成的后代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織中的報(bào)道基因的表達(dá)水平；(c)鑒定和克隆一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞或組織中的遺傳性基因座，與基礎(chǔ)表達(dá)水平相比，所述基因座中報(bào)道基因的調(diào)節(jié)增加或降低；和(d)表征所述細(xì)胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
27.分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外顯子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含缺失翻譯起始序列但包括剪接受體序列的報(bào)道基因；(b)鑒定胚胎或由其形成的后代中表達(dá)報(bào)道基因的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織；和(c)從所述細(xì)胞或組織中克隆包含表達(dá)的報(bào)道基因的遺傳性基因座。
28.鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中對(duì)刺激物產(chǎn)生應(yīng)答的基因的方法，該方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因，使得該基因在基礎(chǔ)水平上表達(dá)；(b)在無(wú)刺激物的條件下，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因胚胎或由其形成的后代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織中的報(bào)道基因的表達(dá)水平；(c)提供刺激物；(d)鑒定和克隆一個(gè)或多個(gè)所述細(xì)胞或組織中的遺傳性基因座，與基礎(chǔ)表達(dá)水平相比，在刺激物刺激后，所述基因座中報(bào)道基因的調(diào)節(jié)增加或降低。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括額外的步驟(e)表征所述細(xì)胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
30.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)的方法，所述轉(zhuǎn)基因生物體具有在發(fā)育的預(yù)定階段誘導(dǎo)的細(xì)胞群中的基因突變，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至22中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導(dǎo)胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中步驟(d)在胚胎發(fā)育的預(yù)定階段進(jìn)行。
31.調(diào)節(jié)生物體中基因表達(dá)的方法，該方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求30產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)；和(b)從所述文庫(kù)中選擇一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因生物體，其中目的基因的表達(dá)受到一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的調(diào)節(jié)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體文庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明介紹了誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因胚胎中轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子同源的轉(zhuǎn)座酶基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達(dá)的序列；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，導(dǎo)致包含下列結(jié)果在內(nèi)的結(jié)果使該子代的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中產(chǎn)生(i)一個(gè)或多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關(guān)連的轉(zhuǎn)座酶基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個(gè)或多個(gè)誘導(dǎo)性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達(dá)；和(d)誘導(dǎo)所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達(dá)，導(dǎo)致子代的至少一部分組織或細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動(dòng)。利用該方法，可以在胚胎發(fā)育的預(yù)定期內(nèi)方便地誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)，單細(xì)胞中的突變基因可以在隨后的細(xì)胞分裂中復(fù)制，從而產(chǎn)生與被轉(zhuǎn)座基因基本同質(zhì)的細(xì)胞群。
文檔編號(hào)C12N9/22GK1612931SQ03802055
公開(kāi)日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月9日
發(fā)明者R·克雷, C·薩瓦基斯, F·格羅斯維爾德 申請(qǐng)人:米諾斯生物系統(tǒng)有限公司