專利名稱：核酸檢測方法及其系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在利用核酸擴增手段，進行腫瘤或癌的診斷、病毒、細菌等感染、以及各種基因疾病的檢測領(lǐng)域中，含有核酸的生物樣品的處理方法，不用從生物樣品中提取核酸成分，可直接簡便而且迅速地對基因進行檢測的核酸擴增方法。
背景技術(shù)：
隨著近年來基因工程以及分子生物學(xué)等領(lǐng)域的進步，對于傳染病和基因疾病等疾病可以在DNA或RNA水平進行診斷了。特別是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法，Science，2301350-1354，1985)或NASBA法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification法，Nature，350，91-92，1991、日本專利第2648802號公報以及日本專利第2650159號公報記載)以及LAMP法(Loop mediated isothermal amplificationof DNA擴增法、特開2001-242169號公報)等核酸擴增方法，作為檢測非常困難的生物檢體中極微量的核酸的檢測成為可能，基因解析也一下子變得容易了。
PCR法是通過使DNA鏈解離成單鏈，并使夾住DNA鏈中特定區(qū)域的引物結(jié)合單鏈，利用DNA聚合酶反復(fù)進行DNA合成反應(yīng)，將目的DNA片段擴增數(shù)十萬倍的方法。PCR法是Mullis等人的發(fā)明，在特開昭61-274697號公報中報道了。PCR法可用作各種樣品中核酸的高靈敏度分析法，特別是可用作來自動物體液的樣品中核酸的分析法。因此、PCR法可用于傳染病和遺傳病以及癌的診斷等。另外，PCR法也是適用于移植或親子鑒定時的DNA類型的檢查方法。這些場合下，往往選擇末梢血液作為檢查對象。
PCR法一個缺點在于色素、蛋白質(zhì)、糖類或未知雜質(zhì)阻礙反應(yīng)。就是說，人們都知道以代表性的耐熱性DNA聚合酶-來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的TaqDNA聚合酶為首的很多DNA聚合酶，即使是微量的來自體液的雜質(zhì)混在PCR反應(yīng)液中也會強烈地阻礙PCR。
RT-PCR法是提取諸如腫瘤的RNA，以寡(dT)或隨機六聚體作為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成cDNA，通過PCR法擴增其一部分進行檢測的方法。利用該方法對成纖維細胞瘤進行診斷的例子已有報道(北海道醫(yī)學(xué)雜志、p.135-141，Vol.66(2)，1991)。RT-PCR法由于使用易分解的mRNA作為對象，所以需要在檢體采集后進行迅速處理。另外，由于是極其靈敏的檢測方法，特別要注意防止與其它檢體的污染。
LAMP法是當(dāng)進行鏈置換反應(yīng)時，利用含有可在擴增產(chǎn)物的末端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的特殊引物2組以上引物的基因擴增法。擴增產(chǎn)物是由許多反復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，反復(fù)結(jié)構(gòu)的單元是由構(gòu)成夾在引物之間的被擴增領(lǐng)域的2條核酸的堿基序列成反向的同一鏈內(nèi)的互補區(qū)域構(gòu)成。LAMP法的擴增產(chǎn)物可以通過眾所周知的雙鏈DNA檢測法進行檢測，利用其獨特構(gòu)造的檢測方法等也有報道(特開2001-242169號公報、WO00/28082號國際公開公報)。
另外，作為同樣的基因擴增法的TMA法、NASBA法、3SR法，其特征是在兩條引物中一條使用含有T7啟動子序列的引物。這樣一來，使這些引物與靶DNA或RNA雜交，進行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)(以RNA或DNA作為模板，合成DNA)，合成含有T7啟動子的雙鏈DNA。當(dāng)向該反應(yīng)系添加T7聚合酶時，T7啟動子被活化，其下游的基因進行表達，合成大量的擴增產(chǎn)物RNA。在TMA法、NASBA法、3SR法中，以上那樣的擴增循環(huán)在一定溫度下進行。
利用核酸擴增手段的核酸檢測系統(tǒng)一般由對采集的生物樣品進行處理的工序、提取核酸的工序、分注測定試劑的工序、核酸擴增工序以及擴增產(chǎn)物的判定工序構(gòu)成的。在利用PCR法等進行核酸擴增之前，需要提取核酸的前處理工序。作為該提取方法，一直使用通過酶、表面活性劑、離液(chaotropic)劑等分解基因包涵體，然后利用酚法(Biochimica et Biophysica Acta，72619-629，1963)、堿法(NucleicAcid Research，71513-1523，1979)、或酚-氯仿等從基因包涵體的分解物中提取核酸的方法。
最近，在提取核酸的過程中使用離子交換樹脂、玻璃濾器、玻璃珠或具有蛋白質(zhì)凝集作用的試劑等。
另外，作為在核酸的提取中使用的結(jié)合核酸用載體的體系，報道了使用玻璃粒子和碘化鈉的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76-2615-619，1979)、使用羥磷灰石的方法(特開昭63-263093號公報)等。這些方法雖然不使用那么多有害的有機溶劑等，但由于在相關(guān)的工序中包括很多離心分離操作，存在著一次處理許多樣品困難，分離核酸花費時間長等問題。
因此，以往的核酸分離方法要使用有機溶劑或堿等危險試劑，需要離心分離操作，存在著處理多個檢體困難等難點，在要對多個檢體進行再現(xiàn)性好的處理，使人力減少的自動機械化中還存在很大的問題。
作為以提取核酸的自動機械化為目標(biāo)的方法有使用核酸結(jié)合性硅粒子和離液離子的方法(非專利文獻1、專利文獻1)。該方法是將核酸結(jié)合性硅粒子和具有使樣品中核酸游離的能力的離液離子與樣品混合，使樣品中核酸結(jié)合于核酸結(jié)合性硅粒子，將固相與液相分離開，除去樣品中雜質(zhì)后，將結(jié)合于核酸結(jié)合性硅粒子的核酸洗脫下來的方法。
作為核酸擴增阻礙物質(zhì)的除去方法，報道了對含有核酸的生物材料進行酸處理的方法(專利文獻2)。然而，雖然有報道在從生物材料檢體提取核酸的任意階段可以對該檢體進行酸處理，但由于對于樣品中核酸成分不進行分離純化的記載還沒有，所以迅速地實施核酸擴增方法依然困難。
作為減少核酸擴增反應(yīng)的阻礙的方法，報道了為了使核酸擴增阻礙物與陰離子性固相結(jié)合，使樣品與陰離子性固相接觸的方法(專利文獻3)。但也是由于對于樣品中核酸成分不進行分離純化的記載還沒有，所以迅速地實施核酸擴增方法依然困難。
腫瘤或癌的診斷、病毒、細菌等的感染、以及各種基因疾病的檢測領(lǐng)域中，像以上說明的那樣的核酸擴增方法已經(jīng)逐漸實用化(臨床檢查法提要、第31版、金原出版株式會社、1998年9月20日發(fā)行)。
然而，在利用核酸擴增手段的核酸檢測中，測定中花費的時間、靈敏度等方面還遺留許多應(yīng)當(dāng)改進的地方。
(非專利文獻1)J.Clinical Microbiology，28-3p.495-503，1990年(專利文獻1)專利第2680462號公報(專利文獻2)國際公開WO01/00813號公報(專利文獻3)特開平09-173065號公報發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的課題在于在利用核酸擴增方法進行核酸的檢測時，要使測定需要的時間縮短，使基因等的檢查系統(tǒng)綜合的有效率。
本發(fā)明人等為了解決上述課題反復(fù)潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果改善生物樣品的前處理工序，可以縮短檢查系統(tǒng)整體時間，提高測定靈敏度，從而完成本發(fā)明。
即本發(fā)明由以下內(nèi)容組成。
1.以導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段，不從生物樣品分離純化核酸成分而對核酸進行擴增為特征的直接核酸擴增法，2.上述1所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段，3.上述1或2所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的導(dǎo)入是在酸性pH下進行的，4.上述3所述核酸擴增方法，其中酸性pH為pH2.5～pH5，5.上述1～4中任一項所述核酸擴增方法，是在對采集的生物樣品經(jīng)過均一化工序后，不進行核酸成分的分離純化而進行核酸擴增的，6.以使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽，對生物樣品進行處理，不進行核酸成分分離純化而對核酸進行擴增為特征的直接核酸擴增法，7.上述6所述核酸擴增方法，其中反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分與鹽的相互作用是通過離子鍵和/或疏水作用進行的，8.上述6或7所述核酸擴增方法，其中鹽是離液鹽，9.上述6或7所述核酸擴增方法，其中鹽是三鹵醋酸的堿金屬鹽，10.上述8所述核酸擴增方法，其中鹽的種類至少包括NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl(氯化四甲基銨)、TEACl(氯化四乙基銨)、KSCN、CsSCN、CsCl中的一種，11.上述9所述的核酸擴增方法，其中鹽的種類包括CF3COOCs(三氟醋酸銫)，12.上述6～11中任一項所述核酸擴增方法，其中鹽濃度為1mM～2000mM，13.上述6～12中任一項所述核酸擴增方法，是導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段，然后使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物進行相互作用的鹽對生物樣品進行處理的，14.上述13所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段，15.上述12～14中任一項所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的導(dǎo)入是在酸性pH下進行的，16.上述15所述核酸擴增方法，其中酸性pH為pH2.5～pH5，17.上述6～16中任一項所述核酸擴增方法，是在對采集的生物樣品經(jīng)過均一化后工序后，不進行核酸成分的分離純化而進行核酸擴增的，18.上述6～17中任一項所述核酸擴增方法，是將使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽進行處理后的生物樣品再用陰離子性固體進行處理的，19.上述6～18中任一項所述核酸擴增方法，是使使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽進行處理后的生物樣品在有核酸成分的分解酶抑制劑共存下擴增的，
20.上述19所述核酸擴增方法，其中核酸成分的分解酶抑制劑是RNase抑制劑，21.上述1～20中任一項所述核酸擴增方法是LAMP法、RT-LAMP法、PCR法或RT-PCR法中的任一種，22.上述1～20中任一項所述核酸擴增方法中使用的生物樣品的處理方法，23.上述1～20中任一項所述核酸擴增方法中使用的核酸檢測用試劑，24.使用上述1～20中任一項所述核酸擴增方法的核酸檢測系統(tǒng)，25.使用上述24所述核酸檢測系統(tǒng)的核酸檢查裝置，26.使用上述24所述核酸檢測系統(tǒng)的癌轉(zhuǎn)移的檢查方法，27.上述24所述核酸檢測系統(tǒng)中使用的核酸檢查試劑盒，28.具有使核酸成分保持在穩(wěn)定狀態(tài)的pH的生物樣品處理溶液，29.上述28所述生物樣品處理溶液，其中pH為2.5-5，30.上述28或29所述生物樣品處理溶液，還包含與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽。
附圖的簡單說明

圖1是表示提取的RNA的穩(wěn)定性的說明圖(實施例1)。
圖2是表示對于用氯化鉀-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40緩沖液制備的檢體利用RT-LAMP法進行CK19mRNA的基因產(chǎn)物擴增時間過程的說明圖(實施例3)。
圖3是表示對于用甘氨酸-HCl(pH2.2)緩沖液制備的檢體利用RT-LAMP法進行的CK19mRNA的基因產(chǎn)物擴增時間過程的說明圖(實施例3)。
圖4是表示對有無三氟醋酸銫添加引起的CK19mRNA的基因產(chǎn)物擴增開始時間變化進行比較的圖(實施例4)。
圖5和圖6是對有無RNase抑制劑添加引起的β-肌動蛋白mRNA的基因產(chǎn)物擴增進行比較的圖(實施例5)。
圖7是對由于緩沖液pH不同引起的CK19mRNA的基因產(chǎn)物的擴增開始循環(huán)數(shù)變化進行比較的圖(實施例7)。
實施發(fā)明的最佳方式以下就本發(fā)明的核酸擴增方法、生物樣品的處理方法、核酸檢測用試劑等進行說明。
本發(fā)明中所謂的直接核酸擴增方法指的是用勻漿機等將從作為被檢測樣品的由生物體采集的生物樣品均一化后，可使該生物樣品中含有的核酸擴增的核酸擴增方法，不從均一生物樣品提取目的核酸成分，而是可以直接使核酸擴增的核酸擴增方法。
本發(fā)明中所謂的生物樣品指的是用于目的核酸擴增的由生物體得到的樣品，具體來說包括從生物體采集的組織、全血、血清、血漿、尿、唾液、體液、分泌物等來自人或動物的生物材料，以及來自植物、微生物等動物以外的生物材料。
(生物樣品的處理)所謂導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段指的是在對生物樣品進行處理時導(dǎo)入抑制生物樣品中所含的使核酸分解的原因物質(zhì)，例如抑制分解酶活性的物質(zhì)或條件等。這里所說的核酸指的是DNA或RNA，例如用于確認蛋白質(zhì)表達的RNA、特別是mRNA特別適合。RNA容易被生物成分中所含的RNA分解酶分解，特別不穩(wěn)定。本發(fā)明中所謂抑制核酸分解活性的手段具體來說指的是，例如抑制DNA分解酶或RNA分解酶活性的手段。在這種場合下，一般來說可以考慮添加核酸分解酶抑制劑等方法，在本發(fā)明中只要是能夠抑制核酸分解活性的手段，可以使用任意手段。例如、作為抑制核酸分解酶活性的手段可以使用通過酶蛋白質(zhì)變性抑制酶活性的手段。作為可使酶蛋白質(zhì)變性的手段，如添加蛋白質(zhì)變性劑、加熱處理、隨著pH變化的變性處理等。本發(fā)明中，需要使酶蛋白質(zhì)變性，而且要確保目的核酸成分處于穩(wěn)定的狀態(tài)下。
在此，當(dāng)對目的核酸成分保持在穩(wěn)定狀態(tài)下的條件進行研究時，可知由于生物樣品處理液的pH不同，生物樣品中所含的核酸的穩(wěn)定性也不同。所以處理溶液最好不要處于樣品中所含的核酸分解酶等酶活性最高的中性附近，另外酸性過強(pH過低)，核酸成分、特別是RNA由于磷酸二酯鍵因化學(xué)分解等會被切成短的片段，所以也不希望在pH2以下。本發(fā)明的一個特征是發(fā)現(xiàn)在中性或低于中性的pH條件下進行生物樣品的處理，目的核酸穩(wěn)定的條件。具體來說、通過用在pH2.5～5、最好是在pH3～4、最理想是在pH3附近的溶液對生物樣品進行處理，可以確保目的核酸成分處于穩(wěn)定的狀態(tài)下。
所謂酸性pH溶液具體來說如含有甘氨酸-HCl、氯化鉀-HCl的溶液。
上述生物樣品處理也可以通過添加與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物相互作用的鹽來進行。所謂核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙，例如在以mRNA為模板擴增DNA時，由mRNA的逆轉(zhuǎn)錄活性的抑制、DNA復(fù)制的抑制等?？梢哉J為這樣的擴增反應(yīng)抑制是由例如應(yīng)為目的的DNA或RNA等核酸與樣品中含有的蛋白質(zhì)結(jié)合等引起的。
如果在酸性pH下處理生物樣品，由于RNA等核酸成分依然帶(-)電荷，而蛋白質(zhì)傾向帶(+)電荷，核酸成分和蛋白質(zhì)通過離子鍵或疏水作用進行結(jié)合。為了防止這樣的核酸成分和蛋白質(zhì)的結(jié)合，在核酸成分結(jié)合蛋白質(zhì)之前，可以向處理液中添加與蛋白質(zhì)通過離子鍵或疏水作用結(jié)合的物質(zhì)?？梢詫⑦@樣的物質(zhì)稱之為與反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽。
作為與反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽的具體例子，如可以產(chǎn)生離液離子的鹽，所謂離液鹽以及三鹵醋酸的堿金屬鹽等。所謂離液離子是離子半徑大的1價陰離子的總稱，如果將該離子加到水中，具有使疏水性分子的水溶性增加，疏水作用減弱的作用。就是說，通過這些離子使目的核酸成分與反應(yīng)阻礙物的離子鍵或疏水作用減弱，防止目的核酸成分吸附于反應(yīng)阻礙物，由此可以有效地進行核酸擴增反應(yīng)。作為離液離子的具體離子，可舉出SCN-、I-、ClO4-、NO3-、Br-、Cl-、CH3CO2-、F-等。作為可產(chǎn)生這樣離子的鹽，如NaCl、KCl、LiCl、RbCl、NaI、KI、TMACl、TEACl、KSCN、CsSCN、CsCl等，其中NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl、TEACl、KSCN、CsSCN、CsCl最好。上述鹽的添加可以在導(dǎo)入上述的抑制核酸分解活性的手段的前后進行，也可以同時進行，同時添加效率好，最優(yōu)選。
另外，三鹵醋酸的堿金屬鹽也具有與離液鹽同樣的效果，所以也可以有效地進行核酸擴增反應(yīng)。作為三鹵醋酸的堿金屬鹽的具體例子，如三氟醋酸鈉、三氟醋酸鉀、三氟醋酸銫、三氟醋酸鋰、三氯醋酸鈉、三氯醋酸鉀、三氯醋酸銫、三氯醋酸鋰、三氯醋酸銣、三氯醋酸鈁等，三氟醋酸銫最好。上述鹽的添加可以在導(dǎo)入上述的抑制核酸分解活性的手段的前后進行，也可以同時進行，同時添加效率好，最優(yōu)選。
添加的鹽的濃度為1mM～2000mM、優(yōu)選是50mM～500mM，更優(yōu)選的是100mM～300mM。
通過用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物相互作用的鹽處理的上述生物樣品可以用陰離子性固體、即帶負電荷的固體進行處理。作為陰離子性固體可以使用陽離子交換樹脂、例如羧甲基、磷酸或磺丙基衍生化離子交換基質(zhì)或其它的任何含有帶負電荷表面的固體、例如帶負電荷的硅物質(zhì)。用陽離子交換樹脂等陰離子性固體處理生物樣品的方法可以通過眾所周知的方法進行，具體來說、可以使用柱層析法以及批次法。例如將樣品與陰離子性粒子混合、離心、靜置、磁分離或通過同樣手段將陰離子性粒子與上述反應(yīng)阻礙物一起從目的核酸成分中分離。
為了進一步提高穩(wěn)定性效果，可以并用本身是公知的表面活性劑。作為表面活性劑如非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑等，最好使用非離子表面活性劑。作為非離子表面活性劑如高級醇、烷基酚、乙二醇、多價醇的脂肪酸等的部分酯、高級脂肪酸甘油酯、山梨糖醇的脂肪酸酯、以聚丙二醇作為疏水性基團，兩端加成作為親水性基團的乙二醇的聚合產(chǎn)物等。這些表面活性劑可以單獨或2種以上并用。
生物樣品用勻漿器和/或搗碎機等粉碎，使其均一化后、通過上述的抑制核酸分解活性的手段和/或用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物相互作用的鹽進行處理、和/或用陰離子性固體處理、可以制備測定樣品。這樣得到的測定樣品可以直接用于本發(fā)明的測定方法，這一點是表示本發(fā)明直接核酸擴增方法的主要特征點。均一化的生物樣品為了除去細胞破碎物，根據(jù)需要，也可以實施過濾、離心分離等處理。
(核酸的擴增步驟)本發(fā)明的核酸擴增法可以適用眾所周知的的方法，沒有特別限定。例如、可適用PCR法、RT-PCR法、LAMP法、RT-LAMP法、TMA(Transcription Mediated Amplification)法(特表平4-500759號公報)、NASBA法、3SR法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification ofNucleic acids)法等核酸擴增法以及作為RCA(Rolling CircleAmplification)法、INVADER法、CPT(Cycling Probe Technology)法、PALSAR法等核酸擴增法的一種的信號放大法。優(yōu)選PCR法、RT-PCR法、LAMP法、RT-LAMP法、更優(yōu)選是在擴增RNA的RT-PCR法、RT-LAMP法中特別有效。
(擴增產(chǎn)物的檢測)通常，反應(yīng)結(jié)束后的擴增產(chǎn)物可以利用本身公知的方法進行檢測，沒有特別限定。例如、通過瓊脂糖凝膠電泳法、通過使用熒光標(biāo)記的探針進行檢測的實時檢測法、通過DNA合成時副產(chǎn)物的濁度進行檢測等，根據(jù)需要，可通過限制酶的酶切圖形進行確認，以及通過直接測序解析確定堿基序列的方法、也可以選擇其它的很多方法。另外，當(dāng)非特異性的擴增帶多，特異帶的判別困難時，可以通過使用目的擴增域內(nèi)的探針的Southern印跡法等對特異帶進行確認。本發(fā)明也適用于這些眾所周知的方法。
(對象核酸)可適用于上述手段的目的核酸沒有特別限定，可廣泛適用于通過使微量核酸成分擴增，在對疾病有無進行判斷的臨床檢查。例如、可適用于癌或腫瘤相關(guān)標(biāo)志的表達的確認、與基因有關(guān)的疾病、有無病毒或微生物感染的判斷等。
作為癌或腫瘤相關(guān)標(biāo)志、例如在癌患者癌組織以及發(fā)生了癌的臟器的正常部位同等出現(xiàn)，只要在診斷對象組織沒有癌轉(zhuǎn)移，就不能認定其表達的標(biāo)志、或在癌組織中確認強烈表達的標(biāo)志等。作為在癌患者癌組織以及癌發(fā)生的臟器的正常部位同等出現(xiàn)的標(biāo)志的例子，如細胞角蛋白類、具體來說，如細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、細胞角蛋白20等。而作為在癌組織中確認強烈表達的標(biāo)志的例子，如CEA等腫瘤標(biāo)志。通過確認來自診斷對象組織中的各蛋白質(zhì)的mRNA可以確認癌細胞的轉(zhuǎn)移。
為了確認來自上述特定患者的確認癌組織的mRNA，有時將癌組織、癌發(fā)生的臟器的正常部位或診斷對象組織的任一個中都同等表達的蛋白質(zhì)的mRNA量作為指標(biāo)。作為這樣的例子，具體來說可舉出β-肌動蛋白、GAPDH的mRNA等。
通過運用本發(fā)明方法，可以迅速地對癌的淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移或腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移等進行診斷。例如、乳癌等，為了提高QOL(生活質(zhì)量Quality oflife)，希望手術(shù)中的淋巴節(jié)清掃范圍盡可能小。而對于食道癌，由于淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移部位不同，需要選擇開腹、開胸、頸部切開手術(shù)。對于前列腺癌，如果發(fā)生淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移，則應(yīng)決定是否中止切除手術(shù)、進行激素療法等決定手術(shù)繼續(xù)進行或者中止的意向。而對于胃癌，由于有無向淋巴節(jié)癌轉(zhuǎn)移，清掃范圍不同，手術(shù)方式有很大變動，術(shù)后治療方針的指針，例如抗癌劑的給藥或放射線療法成為選擇的指針。這樣場合下，如果可以利用術(shù)中采集的生物體組織對癌轉(zhuǎn)移進行迅速診斷，在短時間手術(shù)中也可以決定淋巴節(jié)清掃范圍、進行手術(shù)方式的變更、輔助療法的選擇等，可以使患者受到最適的治療。本發(fā)明的檢查系統(tǒng)適合用作癌轉(zhuǎn)移的術(shù)中快速診斷方法。
可適用于作為與基因有關(guān)的疾病，遺傳性疾病的檢查、例如年齡老化發(fā)病的遺傳性疾病的發(fā)病危險性的予測，具體來說，可以適用于對青光眼、家族性大腸癌、高血壓、糖尿病等發(fā)病危險性進行判斷的場合。另外，有無病毒或微生物感染的判斷可以對生物體組織、例如血液等有無含有感染原因物質(zhì)的核酸序列進行迅速檢查。
(試劑、檢查試劑盒以及檢查系統(tǒng))本發(fā)明可以提供用于進行直接核酸擴增方法需要的各種試劑類、具體來說可以提供生物樣品處理液、逆轉(zhuǎn)錄酶、互補鏈合成的底物dNTP、進行鏈置換型的互補鏈合成的DNA聚合酶、作為本發(fā)明使用的引物需要的各種寡核苷酸、賦予酶反應(yīng)最適條件的緩沖液、以及根據(jù)需要用于反應(yīng)產(chǎn)物的檢測所必需的試劑類。另外，將這些試劑中的生物樣品處理液以及其它的至少一種試劑組合后可作為試劑盒提供。
本發(fā)明除了涉及到直接核酸擴增方法之外，還涉及到生物樣品處理方法、包括處理方法在內(nèi)的核酸檢測用試劑、試劑盒以及核酸檢測系統(tǒng)整體。另外還涉及到適用于本系統(tǒng)的裝置、癌轉(zhuǎn)移的檢查方法。具體來說、例如在癌患者的手術(shù)中從生物體采集的組織也可運用本系統(tǒng)，在手術(shù)期間可以對向其它組織的癌轉(zhuǎn)移進行確認。
(實施例)以下、通過實施例對本發(fā)明進行更具體說明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。
(實施例1)就穩(wěn)定保存RNA的條件進行研究。
1)材料和方法(1)樣品的制備取出小鼠的淋巴節(jié)，用勻漿器和搗碎機，將組織粉碎，將均一化的組織于4℃下進行離心分離(12000rpm×5分)，取上清。使用市售的抽提用試劑(TRIZOLGibco BRL公司)從上清中提取RNA。
就提取的RNA 513μg/ml水溶液通過注入以下各種緩沖液研究保存穩(wěn)定性。向各種緩沖液7μl中加入上述小鼠RNA溶液2μl，于室溫下靜置10分鐘。然后加電泳用緩沖液1μl，通過瓊脂糖凝膠電泳研究RNA的穩(wěn)定性。
(2)緩沖液①200mM氯化鉀-HCl(pH1.0)+0.1％Nonidet P-40(非離子性表面活性劑Calbiochem公司)②200mM氯化鉀-HCl(pH2.2)+0.1％Nonidet P-40③200mM氯化鉀-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40④200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40⑤醋酸緩沖液(pH5.2)+0.1％Nonidet P-40⑥50mMTris-HCl(pH7.4)+0.1％Nonidet P-40⑦不加緩沖液時(H2O)(3)RNA的檢測(瓊脂糖電泳)瓊脂糖凝膠電泳使用1％瓊脂糖、TEA緩沖液，每一個槽加RNA至1μg、按照通常的手法進行。
2)結(jié)果結(jié)果如圖1所示。在比pH3.0高的中性側(cè)緩沖液中，RNA沒有分解，穩(wěn)定。在比pH2.2高的酸性緩沖液中，RNA分解、但沒有看到RNA的帶。
可知pH3.0緩沖液使RNA穩(wěn)定，作為RNA樣品制備用緩沖液最有效。
(實施例2)采集乳癌患者的淋巴節(jié)，對人的粗提RNA樣品和純化RNA樣品通過RT-PCR法確認細胞角蛋白(CK18和CK19)的mRNA的有無。
1)材料和方法(1)樣品的制備將人淋巴節(jié)懸浮于50mM氯化鉀-HCl(pH3.0)+0.1％NonidetP-40的緩沖液中，用勻漿器和攪拌器將該人淋巴節(jié)的組織粉碎，將勻漿的組織于4℃離心分離(12000rpm×5分)，取上清，作為粗提RNA樣品。另外與實施例1同樣，使用市售抽提用試劑(TRIZOLGibcoBRL公司)從粗提RNA樣品中提取RNA，作為精制RNA樣品。
(2)使用的引物向或探針的序列①CK18 反向引物5′-GATGGTTTGCATGGAGTTGCT-3′(序列1)(源于Genbank訪問碼No.4557887的CK18序列的堿基位置1215-1195位)②CK18 正向引物5′-GCCGCCTGCTGGAAGAT-3′ (序列2)(源于Genbank訪問碼No.4557887的CK18序列的堿基位置1142-1158位)③CK19 反向引物5′-TCCAGGGCGCGCAC-3′(序列3)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置305-292位)④CK19 正向引物5′-AAGCTAACCATGCAGAACCTCAAC-3′(序列4)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置241-264位)⑤CK18的TaqMan探針5′-CAAGGCATCACCAAGATTAAAGTCCTCGC-3′(序列5)(源于Genbank訪問碼No.4557887的CK18序列的堿基位置1188-1160位)⑥CK19的TaqMan探針5′-CGCCTGGCCTCCTACCTGGACA-3′(序列6)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置268-289位)(3)RT-PCR法RT-PCR使用Applied Biosystem公司的RT-PCR Master試劑進行。
測定試劑盒TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystem公司生產(chǎn))cDNA合成使用MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶合成。
①CK18的擴增逆轉(zhuǎn)錄用引物使用序列1記載的引物。
PCR用引物使用終濃度為300nM的序列1和2記載的引物。
DNA聚合酶使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
②CK19的擴增逆轉(zhuǎn)錄用引物使用序列3記載的引物。
PCR用引物使用終濃度為300nM的序列3記載的引物以及終濃度為900nM的序列4記載的引物。
DNA聚合酶使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
③PCR處理于48℃下進行30分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后、于95℃保持10分鐘。
然后、進行95℃15秒、60℃1分鐘的PCR操作40循環(huán)。
(4)核酸的檢測通過與目的雙鏈DNA特異性雜交的TaqMan探針，利用熒光法檢測人CK18和CK19mRNA的擴增產(chǎn)物。TaqMan探針對于CK18是序列5、對于CK19是序列6的寡核苷酸、在各個5′末端使用標(biāo)記了FAM、3′末端標(biāo)記了TAMRA的探針。使用Applied Biosystem公司生產(chǎn)的PRISM7700，對反應(yīng)液中熒光強度的增加進行實時測定。
(表1)表1 RT-PCR的測定(精制RNA樣品和粗提RNA樣品的測定值)
樣品 精制RNA樣品 粗提RNA樣品拷貝數(shù)/ng總RNA 拷貝數(shù)/ng總RNACK18 2000 300CK19 9000 19002)結(jié)果以上結(jié)果表明臨床結(jié)果(HE染色組織診斷)與通過RT-PCR測定的結(jié)果一致，CK18以及CK19的mRNA都擴增了。另外即使對于粗制RNA樣品也確認了來自mRNA的300和1900拷貝的核酸的擴增(表1)。
由此表明如果作為樣品制備用液，使用含有Nonidet P-40的pH3.0緩沖液，不用提取RNA也可通過RT-PCR法進行擴增，結(jié)果可以縮短RNA檢測所需要的時間。
(實施例3)采集乳癌患者的人淋巴節(jié)，就通過HE染色臨床確認癌轉(zhuǎn)移的檢體利用RT-LAMP法對作為乳癌標(biāo)志的CK19mRNA進行了檢測。
1)材料和方法(1)樣品的制備將人淋巴節(jié)懸浮于緩沖液中，用勻漿器和攪拌器將組織可溶化。均一化的組織于4℃下離心分離(12000rpm×5分)，取上清(ライセ一ト)作為粗制RNA樣品。對于組織懸浮液使用50mM氯化鉀-HCl(pH3.0)+0.1％Nonidet P-40的緩沖液或50mM甘氨酸-HCl(pH2.2)緩沖液。另外與實施例1和2同樣，使用市售抽提用試劑(TRIZOLGibco BRL公司)，從粗制RNA樣品提取RNA作為精制RNA樣品。
(2)利用RT-LAMP法進行擴增CK19的擴增是通過向含有以下序列7～12所示6種引物的以下組成中添加粗制RNA溶液或精制RNA溶液2μl，于65℃下加溫1小時進行的。
(3)引物①19-FA-11015′-ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3′(序列7)②19-RA-11015′-aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3′(序列8)③19-F3-11015′-acctggagatgcagatcg-3′(序列9)④19-R3-11015′-caggcttcagcatccttc-3′(序列10)⑤19-LPF-11015′-tgatttcctcctcatggttc-3′(序列11)⑥19-LPR-11015′-tccgggcaccgatctc-3′(序列12)(4)反應(yīng)液組成dNTPs(GIBCO公司) 0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇 5mM甜菜堿(Sigma公司) 640mMThermopol緩沖液(New England BioLabs公司)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司) 1.25UBst DNA聚合酶(New England BioLabs) 16U溴乙錠 0.125mg/mL正向內(nèi)引物(19-FA-1101序列7) 40pmol反向內(nèi)引物(19-RA-1101序列8) 40pmol正向外引物(19-F3-1101序列9) 5pmol反向外引物(19-R3-1101序列10) 5pmol正向回環(huán)引物(loop primer)(19-LPF-1101序列11)20pmol反向回環(huán)引物(19-LPR-1101序列12) 20pmol
(5)核酸的檢測通過與雙鏈DNA特異結(jié)合的溴乙錠，利用熒光法對人CK19mRNA的擴增產(chǎn)物進行檢測。反應(yīng)液中熒光強度變化用AppliedBiosystem公司生產(chǎn)PRISM7700進行實時測定。
2)結(jié)果圖2和圖3給出了作為制備用緩沖液使用氯化鉀-HCl(pH3.0)+Nonidet P-40時以及使用甘氨酸-HCl(pH2.2)緩沖液時通過各RT-LAMP法進行核酸擴增處理的結(jié)果。
使用甘氨酸-HCl(pH2.2)緩沖液時，確認在精制的RNA樣品中有擴增，而對于粗制RNA樣品沒有看到擴增。另外使用氯化鉀-HCl(pH3.0)+Nonidet P-40緩沖液時確認無論精制RNA樣品還是粗制RNA樣品都看到了擴增。
所以作為制備用緩沖液如果使用含有Nonidet P-40的pH3.0緩沖液，不純化RNA通過RT-LAMP法也可確認擴增，結(jié)果可以縮短RNA檢測需要的時間。
(實施例4)將淋巴節(jié)檢體破碎后可溶化時添加鹽類，就減少使用粗制RNA樣品進行擴增反應(yīng)時雜質(zhì)對擴增的阻礙的條件進行研究。
1)材料和方法(1)樣品的制備用搗碎機將小鼠淋巴節(jié)于緩沖液中破碎、均一化。另外將培養(yǎng)細胞(KATOIII)于緩沖液中進行可溶化、均一化。將均一化的這些溶液混合、用作粗制RNA樣品。對于這些樣品的均一化使用含有或不含有100mM的三氟醋酸銫的含有1％Nonidet P-40 200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)緩沖液。
(2)通過RT-LAMP擴增CK19mRNA的擴增利用含有如下序列7～10所示4種引物的以下組成于65℃下加溫1小時進行。對于各反應(yīng)液以適當(dāng)?shù)谋嚷蕦⑸鲜鯧ATOIII細胞培養(yǎng)細胞可溶化樣品和小鼠淋巴節(jié)可溶化樣品進行混合，向一種反應(yīng)液中加入相當(dāng)于20個KATOIII細胞的樣品，另外，作為雜質(zhì)量的參數(shù)，共存蛋白質(zhì)量調(diào)整到設(shè)定的量。
(3)引物①19-FA-1101(序列7)②19-RA-1101(序列8)③19-F3-1101(序列9)④19-R3-1101(序列10)⑤19-LPF-1101(序列11)⑥19-LPR-1101(序列12)(4)反應(yīng)液組成dNTPs(GIBCO公司) 0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇5mM甜菜堿(Sigma公司) 640mMThermopol緩沖液(New England BioLabs公司)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司) 1.25UBst DNA聚合酶(New England BioLabs)16U溴乙錠0.125mg/mL正向內(nèi)引物(19-FA-1101序列7) 40pmol反向內(nèi)引物(19-RA-1101序列8) 40pmol正向外引物(19-F3-1101序列9) 5pmol反向外引物(19-R3-1101序列10)5pmol正向回環(huán)引物(19-LPF-1101序列11) 20pmol反向回環(huán)引物(19-LPR-1101序列12) 20pmol(5)核酸的檢測通過共存于反應(yīng)體系的溴乙錠的熒光進行檢測。用AppliedBiosystem公司生產(chǎn)PRISM7700對反應(yīng)液中的熒光強度變化進行實時測定。
2)結(jié)果圖4給出了作為用于制備粗制RNA樣品的緩沖液使用含有100mM三氟醋酸銫和1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)緩沖液時的結(jié)果以及使用不含三氟醋酸銫的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)緩沖液時的結(jié)果。橫軸表示一種反應(yīng)液中含有的雜質(zhì)蛋白質(zhì)量，縱軸表示DNA擴增開始時間。對于用于制備粗制RNA樣品的緩沖液中存在100mM的三氟醋酸銫時，一種反應(yīng)液中的雜質(zhì)蛋白質(zhì)量即使增加到8μg附近，DNA擴增開始時間也幾乎沒有變化。與此相反，當(dāng)沒有三氟醋酸銫時，隨著雜質(zhì)蛋白質(zhì)量增加，DNA擴增開始時間明顯推遲了。這表明核酸擴增反應(yīng)受到了雜質(zhì)蛋白質(zhì)的阻礙。由此表明通過使粗制RNA樣品制備用緩沖液中含有100mM三氟醋酸銫，可以減少雜質(zhì)蛋白質(zhì)造成的擴增反應(yīng)的阻礙，作為結(jié)果，可以向一種反應(yīng)液增加可添加的粗制RNA樣品溶液，可以提高靈敏度。
(實施例5)使用由淋巴節(jié)檢體制備的粗制RNA樣品進行擴增反應(yīng)時，對通過添加RNase抑制劑防止RNase對目標(biāo)mRNA的分解，意圖提高檢測靈敏度進行研究。
1)材料和方法(1)樣品的制備將乳癌患者淋巴節(jié)于含有或不含有100mM的三氟醋酸銫的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)緩沖液中用搗碎機破碎、均一化。將均一化該溶液直接或用均一化使用的緩沖液稀釋5倍、或50倍后用作粗制RNA樣品。
(2)通過RT-LAMP法進行擴增β-肌動蛋白的擴增通過向含有如下序列13～18所示6種引物的以下組成中添加上述粗制RNA樣品2μl，于65℃下加溫1小時進行。
(3)引物①AFA-45’-tgaaggtagtttcgtggatgcctgaggcactcttccagc-3’(序列13)②ARA-45’-tgaagtgtgacgtggacatccagggtacatggtggtgc-3’(序列14)③AF3-45’-tggcaatgagcggttcc-3’(序列15)④AR3-45’-tccttctgcatcctgtcg-3’(序列16)⑤AD-LPF15’-acaggactccatgccc-3’(序列17)⑥AD-LPR15’-tgtacgccaacacagtgc-3’(序列18)(4)反應(yīng)液組成dNTPs (GIBCO公司)0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇5mM甜菜堿(Sigma公司) 640mMThermopol緩沖液(New England BioLabs公司)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司) 1.25UBst DNA聚合酶(New England BioLabs)16U溴乙錠0.125mg/mL正向內(nèi)引物(AFA-4序列13) 40pmol反向內(nèi)引物(ARA-4序列14) 40pmol正向外引物(AF3-4序列15) 5pmol反向外引物(AR3-4序列16) 5pmol正向回環(huán)引物(AD-LPF1序列17) 20pmol反向回環(huán)引物(AD-LPR1序列18) 20pmolRNase抑制劑
(STRATAGENE公司、RNase Block Ribonuclease Inhibitor)25U(5)核酸的檢測通過共存于反應(yīng)體系的溴乙錠的熒光進行檢測。用AppliedBiosystem公司生產(chǎn)PRISM7700對反應(yīng)液中的熒光強度變化進行實時測定。
2)結(jié)果圖5和6給出了擴增反應(yīng)液中添加和不添加RNase抑制劑時的結(jié)果。橫軸表示反應(yīng)時間，縱軸表示熒光強度。反應(yīng)液中含有RNase抑制劑時，人淋巴節(jié)均一化后制備的粗制RNA樣品、5倍稀釋的樣品、50倍稀釋的樣品都沒有阻礙，發(fā)生了擴增反應(yīng)。與此相反，反應(yīng)液中不含有RNase抑制劑時，擴增反應(yīng)受到阻礙，特別是使用沒有稀釋的粗制RNA樣品時，幾乎沒有擴增。由此表明通過向反應(yīng)液中添加25U的RNase抑制劑，可以減少粗制RNA樣品中含有的雜質(zhì)對擴增反應(yīng)的阻礙，作為結(jié)果，可以向一種反應(yīng)液增加可添加的粗制RNA樣品溶液，能夠提高靈敏度。
(實施例6)在將淋巴節(jié)檢體破碎、均一化的緩沖液中含有100mM三氟醋酸銫，擴增反應(yīng)液中含有25U的RNase抑制劑的條件下，實際上使用乳癌患者淋巴節(jié)，確認添加上述成分的效果。
1)材料和方法(1)樣品的制備將乳癌患者淋巴節(jié)于含有或不含有100mM的三氟醋酸銫的含有1％Nonidet P-40的200mM甘氨酸-HCl(pH3.0)緩沖液中用搗碎機破碎、均一化。用均一化用的緩沖液將均一化的該溶液稀釋5倍，用作粗制RNA樣品，通過RT-LAMP進行擴增反應(yīng)。另外為了測定粗制RNA樣品中含有的CK19mRNA拷貝數(shù)，與實施例1一樣從粗制RNA樣品用市售抽提用試劑(TRIZOLGibco BRL公司)提取RNA，作為精制RNA樣品，進行RT-PCR。RT-PCR在與實施例1同樣的條件下進行。
(2)通過RT-LAMP的擴增CK19mRNA的擴增通過含有如下序列7～12所示的6種引物的以下組成于65℃下加溫1小時進行。在三氟醋酸銫共存下使用均一化的粗制RNA樣品時，向反應(yīng)液中添加RNase抑制劑后進行擴增反應(yīng)。
(3)引物①19-FA-1101(序列7)②19-RA-1101(序列8)③19-F3-1101(序列9)④19-R3-1101(序列10)⑤19-LPF-1101(序列11)⑥19-LPR-1101(序列12)(4)反應(yīng)液組成dNTPs(GIBCO公司) 0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇5mM甜菜堿(Sigma公司) 640mMThermopol緩沖液(New England BioLabs公司)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司) 1.25UBst DNA聚合酶(New England BioLabs)16U溴乙錠0.125mg/mL正向內(nèi)引物(19-FA-1101序列7) 40pmol反向內(nèi)引物(19-RA-1101序列8) 40pmol正向外引物(19-F3-1101序列9) 5pmol反向外引物(19-R3-1101序列10)5pmol正向回環(huán)引物(19-LPF-1101序列11) 20pmol反向回環(huán)引物(19-LPR-1101序列12) 20pmolRNase抑制劑(STRATAGENE公司、RNase Block Ribonuclease Inhibitor)25U
(5)核酸的檢測通過共存于反應(yīng)體系的溴乙錠的熒光進行檢測。用AppliedBiosystem公司生產(chǎn)PRISM7700對反應(yīng)液中的熒光強度變化進行實時測定。
2)結(jié)果表2給出了擴增反應(yīng)液中添加和不添加三氟醋酸銫和RNase抑制劑時的結(jié)果。表的左半邊表示不含有三氟醋酸銫和RNase時的結(jié)果。右半邊表示使用三氟醋酸銫和RNase兩者時的結(jié)果。沒有兩者時，4個檢體不能通過RT-LAMP檢測CK19mRNA，使用兩者時，4個檢體中的3個檢體可以進行CK19mRNA擴增后進行檢測。由此可以確認對于實際的人淋巴節(jié)檢體在破碎可溶化時使三氟醋酸共存，反應(yīng)液中添加RNase抑制劑可以有效提高檢測靈敏度。
(表2)利用RT-PCR和RT-LAMP進行CK19mRNA的測定

(實施例7)直接用血清檢體通過RT-PCR確認三氟醋酸銫的效果。
1)材料及方法
(1)樣品的制備向人血清中加入含有pH8.0的200mM Tris-HCl緩沖液或含100mM三氟醋酸銫的200mM甘氨酸-HCl緩沖液(pH3.0)，再添加來自KATOIII細胞的精制RNA樣品，用作RNA樣品。樣品中的蛋白質(zhì)量調(diào)整到0至33μg/μl。另外、CK19mRNA調(diào)整到為總RNA樣品中5000拷貝/μl。
(2)使用的引物和探針序列①CK19反向引物5′-cttggcccctcagcgtact-3′ (序列19)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置685-667位)②CK19正向引物5′-cagatcgaaggcctgaagga-3′(序列20)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置607-626位)③CK19的TaqMan探針5′-gcctacctgaagaagaaccatgaggaggaa-3′(序列21)(源于Genbank訪問碼No.4504916的CK19序列的堿基位置634-663位)(3)RT-PCR法RT-PCR使用Applied Biosystem公司的RT-PCR Master試劑進行。
測定試劑盒TaqMan One-step RT-PCR Master MixReagents(Applied Biosystem公司生產(chǎn))cDNA合成使用MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶合成。
①CK19的擴增逆轉(zhuǎn)錄用引物使用序列19記載的引物。
PCR用引物使用終濃度為300nM的序列19記載的引物以及終濃度為900nM的配列編號20記載的引物。DNA聚合酶使用Ampli Taq Gold DNA聚合酶。
③PCR處理于48℃下進行30分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，于95℃下保持10分鐘。
然后進行40循環(huán)的95℃15秒、60℃1分鐘的PCR操作。
(4)核酸的檢測通過與目的雙鏈DNA特異性雜交的TaqMan探針，利用熒光法檢測人CK19mRNA的擴增產(chǎn)物。TaqMan探針對于CK19是序列21的寡核苷酸、在各個5′末端使用標(biāo)記了FAM、3′末端標(biāo)記了TAMRA的探針。使用Applied Biosystem公司生產(chǎn)的PRISM7700，對反應(yīng)液中熒光強度的增加進行實時測定。
2)結(jié)果圖7給出了用含有三氟醋酸銫的緩沖液(pH3)制備含有血清成分的RNA樣品時的結(jié)果、以及用中性緩沖液(pH8)制備時的RT-PCR的結(jié)果。圖中四角曲線表示使用含有三氟醋酸銫的酸性緩沖液(pH3)時的結(jié)果，而菱形曲線表示使用中性緩沖液(pH8)時的結(jié)果?？v軸表示RT-PCR反應(yīng)中擴增開始循環(huán)數(shù)，橫軸表示反應(yīng)液中存在的血清蛋白質(zhì)量。含有血清蛋白質(zhì)時，在用中性緩沖液制備的RNA樣品中發(fā)生擴增反應(yīng)的阻礙，擴增開始循環(huán)數(shù)增加，但在用含有三氟醋酸銫的酸性緩沖液制備的RNA樣品中阻礙的程度小，循環(huán)數(shù)沒有怎么增加。由此可以確認用含有三氟醋酸銫的酸性緩沖液(pH3)制備RNA樣品不僅可以有效地防止利用RT-LAMP的擴增中的反應(yīng)阻礙，而且對于RT-PCR反應(yīng)也是有效的。
工業(yè)實用性就象以上說明的那樣，在對核酸進行擴增之后檢測RNA的方法中，利用本發(fā)明的檢體制備條件，確認在RT-PCR法以及RT-LAMP法中，即使是粗制RNA樣品也可進行測定，使用核酸擴增手段能夠縮短測定時間。
序列表序列表<110>希森美康株式會社<120>核酸檢測方法及其系統(tǒng)<130>GP02-1020/PCT<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>1gatggtttgc atggagttgc t 21<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>2gccgcctgct ggaagat 17<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>3tccagggcgc gcac 14<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>4aagctaacca tgcagaacct caac 24<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>5caaggcatca ccaagattaa agtcctcgc 29<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>6cgcctggcct cctacctgga ca 22<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>7ttggcccctc agcgtacaag agctggccta cctg34<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>8aggtcagtgt ggaggtggcg catgtcactc aggatc 36<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>9acctggagat gcagatcg 18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>10caggcttcag catccttc 18
<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>11tgatttcctc ctcatggttc20<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>12tccgggcacc gatctc16<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA<400>13tgaaggtagt ttcgtggatg cctgaggcac tcttccagc 39<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA
<400>14tgaagtgtga cgtggacatc cagggtacat ggtggtgc38<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA<400>15tggcaatgag cggttcc 17<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA<400>16tccttctgca tcctgtcg 18<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA<400>17acaggactcc atgccc16<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)β-肌動蛋白基因設(shè)計的DNA<400>18tgtacgccaa cacagtgc 18<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>19cttggcccct cagcgtact 19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>20cagatcgaag gcctgaagga20<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>21gcctacctga agaagaacca tgaggaggaa 30
權(quán)利要求
1.直接核酸擴增法，其特征是導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段，不從生物樣品分離純化核酸成分而對核酸進行擴增。
2.權(quán)利要求1所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段。
3.權(quán)利要求1或2所述核酸擴增方法，其中抑制分解活性的手段的導(dǎo)入是在酸性pH下進行的。
4.權(quán)利要求3所述核酸擴增方法，其中酸性pH為pH2.5～pH5。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述核酸擴增方法，是在對采集的生物樣品經(jīng)過均一化工序后，不進行核酸成分的分離純化而進行。
6.直接核酸擴增法，其特征在于使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽，對生物樣品進行處理，不進行核酸成分的分離純化而對核酸進行擴增。
7.權(quán)利要求6所述核酸擴增方法，其中反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分與鹽的相互作用是通過離子鍵和/或疏水作用進行的。
8.權(quán)利要求6或7所述核酸擴增方法，其中鹽是離液鹽。
9.權(quán)利要求6或7所述核酸擴增方法，其中鹽是三鹵醋酸的堿金屬鹽。
10.權(quán)利要求8所述核酸擴增方法，其中鹽的種類包括NaCl、KCl、NaI、KI、TMACl(氯化四甲基銨)、TEACl(氯化四乙基銨)、KSCN、CsSCN、CsCl中的至少一種。
11.權(quán)利要求9所述核酸擴增方法，其中鹽的種類包括CF3COOCs(三氟醋酸銫)。
12.權(quán)利要求6～11中任一項所述核酸擴增方法，其中鹽濃度為1mM～2000mM，
13.權(quán)利要求6～12中任一項所述核酸擴增方法，是導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段，而且使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物進行相互作用的鹽對生物樣品進行處理的核酸擴增方法。
14.權(quán)利要求13所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段是抑制RNA分解活性的手段。
15.權(quán)利要求12～14中任一項所述核酸擴增方法，其中抑制核酸分解活性的手段的導(dǎo)入是在酸性pH下進行的。
16.權(quán)利要求15所述核酸擴增方法，其中酸性pH為pH2.5～pH5。
17.權(quán)利要求6～16中任一項所述核酸擴增方法，是在對采集的生物樣品經(jīng)過均一化工序后，不進行核酸成分的分離純化而進行核酸擴增的。
18.權(quán)利要求6～17中任一項所述核酸擴增方法，是將使用與反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽進行處理后的生物樣品再用陰離子性固體進行處理的。
19.權(quán)利要求6～18中任一項所述核酸擴增方法，是使使用與反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽進行處理后的生物樣品在有核酸成分的分解酶抑制劑共存下擴增的。
20.權(quán)利要求19所述核酸擴增方法，其中核酸成分的分解酶抑制劑是RNase抑制劑。
21.權(quán)利要求1～20中任一項所述核酸擴增方法，是LAMP法、RT-LAMP法、PCR法或RT-PCR法中的任一種。
22.權(quán)利要求1～20中任一項所述核酸擴增方法中使用的生物樣品的處理方法，
23.權(quán)利要求1～20中任一項所述核酸擴增方法中使用的核酸檢測用試劑。
24.使用權(quán)利要求1～20中任一項所述核酸擴增方法的核酸檢測系統(tǒng)。
25.使用權(quán)利要求24所述核酸檢測系統(tǒng)的核酸檢查裝置。
26.使用權(quán)利要求24所述核酸檢測系統(tǒng)的癌轉(zhuǎn)移的檢查方法。
27.權(quán)利要求24所述核酸檢測系統(tǒng)中使用的核酸檢查試劑盒。
28.具有使核酸成分保持在穩(wěn)定狀態(tài)的pH的生物樣品處理溶液、
29.權(quán)利要求28所述生物樣品處理溶液，其中pH為2.5～5。
30.權(quán)利要求28或29所述生物樣品處理溶液，還包含與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分相互作用的鹽。
全文摘要
為了在利用核酸擴增方法進行核酸的檢測時，使用直接核酸擴增方法，使測定花費的時間縮短，使基因等的檢查系統(tǒng)綜合有效，在對采集的生物樣品的處理中，經(jīng)過對采集的生物樣品均一化工序或在該工序中導(dǎo)入抑制核酸分解活性的手段，不從生物樣品中進行核酸成分的分離純化。抑制該核酸的分解活性的手段的導(dǎo)入是在酸性pH下、具體來說是在pH2.5～pH5下進行的，通過使用與核酸擴增反應(yīng)的反應(yīng)阻礙物和/或核酸成分進行相互作用的鹽進行處理，不進行核酸成分的分離純化直接進行核酸擴增。
文檔編號C12Q1/68GK1612932SQ0380206
公開日2005年5月4日 申請日期2003年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月9日
發(fā)明者多田幸代, 吉田智一, 正見圭一郎, 西田昌弘, 中林一樹, 山形浩一 申請人:希森美康株式會社