專利名稱：指導(dǎo)b2∶b1除蟲菌素比例的除蟲鏈霉菌基因的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及主要應(yīng)用于動物健康領(lǐng)域的除蟲菌素(avermectin)，例如doramectin，的組合物及有效產(chǎn)生除蟲菌素的方法。更具體地，本發(fā)明涉及含有編碼AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于調(diào)節(jié)除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)培養(yǎng)物發(fā)酵所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例。本發(fā)明還涉及除蟲鏈霉菌的載體，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和新型突變株，它們的aveC基因已突變從而調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例。
2.發(fā)明背景2.1.除蟲菌素鏈霉菌可產(chǎn)生各種各樣的次級代謝產(chǎn)物，其中包括除蟲菌素，其含有一系列八種相關(guān)的能產(chǎn)生有效的抗蠕蟲和殺昆蟲活性的大環(huán)內(nèi)脂類化合物，有16個成員。這八種截然不同但又密切相關(guān)的化合物主要指A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b?！癮”系列化合物指的是天然除蟲菌素，其在C25位的取代基為(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基為異丙基的那些化合物。代號“A”及“B”指的是C5位取代基分別為甲氧基和羥基的除蟲菌素。數(shù)字“1”指的是在C22位及C23位為雙鍵的除蟲菌素；而數(shù)字“2”為C22位有一個氫原子及在C23位有一個羥基的除蟲菌素。在這些相關(guān)的除蟲菌素中，B1型的除蟲菌素(如doramectin)被公認(rèn)為具有最有效的抗寄生蟲活性和殺蟲活性，因而也是最具商業(yè)前景的除蟲菌素。
除蟲菌素及其由除蟲鏈霉菌菌株需氧發(fā)酵而生產(chǎn)的方法在美國專利4,310,519及4,429,042中都已有描述。一般認(rèn)為天然除蟲菌素的生物合成可以通過異丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的輔酶A硫酯類似物來內(nèi)源啟動。
經(jīng)過隨機(jī)誘變進(jìn)行菌株改進(jìn)并聯(lián)合使用外源提供的脂肪酸可以有效生產(chǎn)除蟲菌素類似物。支鏈2-氧酸脫氫酶缺陷的除蟲鏈霉菌突變體(bkd缺陷突變體)只有在發(fā)酵中補(bǔ)充有脂肪酸時才能產(chǎn)生除蟲菌素。篩選和分離支鏈脫氫酶活性缺陷的突變體(如除蟲鏈霉菌，ATCC 53567)在歐洲專利(EP)276103中已有描述。在有外源提供脂肪酸的情況下發(fā)酵這些突變體，導(dǎo)致僅產(chǎn)生四種對應(yīng)于所用的脂肪酸的除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補(bǔ)充除蟲鏈霉菌(ATCC 53567)發(fā)酵，結(jié)果產(chǎn)生天然除蟲菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用異丁酸補(bǔ)充發(fā)酵，結(jié)果產(chǎn)生天然除蟲菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用環(huán)戊烷羧酸補(bǔ)充發(fā)酵，結(jié)果產(chǎn)生四種新型的環(huán)戊基除蟲菌素A1，A2，B1及B2。
用其它脂肪酸補(bǔ)充發(fā)酵可以產(chǎn)生新的除蟲菌素。通過篩選800多種潛在的前體，已經(jīng)鑒定出60多種其它新的除蟲菌素(例見Dutton等，1991，J.Antibiot.，44357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性缺陷的除蟲鏈霉菌突變體基本上只產(chǎn)生B類除蟲菌素，因而，同時缺少支鏈2-氧酸脫氫酶及5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的除蟲鏈霉菌突變體對應(yīng)于補(bǔ)充發(fā)酵所用的脂肪酸僅生產(chǎn)出B類除蟲菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸補(bǔ)充這類雙重突變體發(fā)酵，結(jié)果僅產(chǎn)生天然除蟲菌素B1a及B2a，而用異丁酸或環(huán)戊烷羧酸補(bǔ)充發(fā)酵則可以分別產(chǎn)生天然除蟲菌素B1b及B2b或新型環(huán)戊基B1及B2除蟲菌素。用環(huán)己烷羧酸補(bǔ)充該雙重突變體菌株是產(chǎn)生商業(yè)上重要的新型除蟲菌素環(huán)己基除蟲菌素B1(doramectin)的優(yōu)選方法。這類雙重突變體如除蟲鏈霉菌(ATCC 53692)的分離及特性描述在EP 276103中。
2.2.參與除蟲菌素生物合成的基因在很多情況下，涉及次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的基因及編碼一種具體抗菌素的基因在染色體上的位置常常是簇集在一起的。例如，鏈霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(見Hopwood和Sherman，1990，Ann.Rev.Genet.，2437-66)。因此，對生物合成途徑中的基因進(jìn)行克隆的一個策略是，分離抗藥性基因及然后檢測染色體上相鄰區(qū)域中其它與該具體抗生素的生物合成相關(guān)的基因。另外一種克隆重要代謝產(chǎn)物生物合成之相關(guān)基因的策略是突變體互補(bǔ)。例如，將來自能產(chǎn)生具體代謝產(chǎn)物的生物的DNA文庫部分引入不產(chǎn)生該代謝產(chǎn)物的突變體，并篩選產(chǎn)生該代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化株。另外，利用來自其它鏈霉菌的探針進(jìn)行文庫雜交的方法已被用于鑒別及克隆生物合成途徑中的基因。
涉及除蟲菌素生物合成的基因(ave基因)，象鏈霉菌其它次級代謝物(例如，PKS)的生物合成所必需的基因一樣，是簇集于染色體上的。目前已使用載體成功克隆了許多ave基因來彌補(bǔ)除蟲菌素生物合成受阻的除蟲鏈霉菌突變體。這些基因的克隆在美國專利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，J. Antibiot. 48532-534描述了涉及C22，C23脫水步驟的染色體區(qū)域(aveC)定位在除蟲鏈霉菌的4.82Kb BamHI片段上，并描述了產(chǎn)生單一組份B2a生產(chǎn)者的aveC基因突變。由于雙氫除蟲菌素(ivermectin，一種潛在的抗蠕蟲化合物)能由除蟲菌素B2a化學(xué)合成，故認(rèn)為該除蟲菌素B2a的單一組分生產(chǎn)者對于雙氫除蟲菌素的商業(yè)生產(chǎn)特別有用。
2001年6月19日授予Stutzman-Engwall等的美國專利6,248,579，描述了除蟲鏈霉菌aveC基因的一些突變，它們導(dǎo)致環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1的比例減少到約0.75∶1。
2001年2月22日公開的輝瑞產(chǎn)品公司(Pfizer Products Inc.)的PCT申請WO 01/12821，描述了除蟲鏈霉菌aveC基因的另一些突變，它們導(dǎo)致環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1的比例減少到約0.40∶1。
鑒定出aveC基因中導(dǎo)致進(jìn)一步減小除蟲菌素生產(chǎn)的復(fù)雜度的突變或突變組合，例如，進(jìn)一步降低除蟲菌素B2∶B1比率的突變，可以簡化商業(yè)上重要的除蟲菌素的生產(chǎn)及純化。
3.發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的序列相同的核苷酸序列，或與圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但所述核苷酸序列還包含編碼氨基酸取代組合的突變，所述取代發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸位置的氨基酸殘基上，使除蟲鏈霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表達(dá)含有突變核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞，相對于僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌ATCC 53692細(xì)胞而言，產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例下降，其中當(dāng)除蟲菌素2類∶1類為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，除蟲菌素2類∶1類的比例為0.35∶1或更低。在一優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。
在一個具體實施方案中，氨基酸取代組合包含選自下組的組合
(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；(f)D48E，L136P，G179S，E238D；(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；(h)D48E，A61T，L136P，G179S；(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；(q)D48E，L136P，G179S，R250W；(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；(t)D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S；(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L；(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ad)D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D；
(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S；(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(an)D48E，A89T，S138T，G179S；(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；(au)D48E，A89T，L136P，G179S；(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的序列相同的核苷酸序列，或與圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但所述核苷酸序列還包含編碼氨基酸取代組合的突變，所述取代發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸位置的氨基酸殘基上，導(dǎo)致除蟲鏈霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表達(dá)含有突變核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞，相對于僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌ATCC 53692細(xì)胞而言，產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例下降，其中當(dāng)除蟲菌素2類∶1類為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.40∶1或更低，且其中氨基酸取代組合包含選自下組的組合(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明多核苷酸分子的重組載體。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的多核苷酸分子或重組載體的宿主細(xì)胞。在一優(yōu)選實施方案中，所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌細(xì)胞。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞的aveC等位基因發(fā)生突變，該突變導(dǎo)致AveC基因產(chǎn)物中出現(xiàn)氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，其中所述氨基酸取代組合選自上文中列出的(a)-(be)。
本發(fā)明還提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞的aveC等位基因發(fā)生突變，該突變導(dǎo)致在AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，其中含有突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞能產(chǎn)生0.35∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了一種制備除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞的aveC等位基因發(fā)生突變，該突變導(dǎo)致在AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，其中所述氨基酸取代組合選自上文(bf)和(bg)所列的組。在一個優(yōu)選實施方案中，含有這樣的突變aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌細(xì)胞能產(chǎn)生約0.40∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。
本發(fā)明還提供了鏈霉菌的細(xì)胞，它包含突變的除蟲鏈霉菌aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。在一優(yōu)選實施方案中，所述鏈霉菌是除蟲鏈霉菌。
本發(fā)明還提供了能產(chǎn)生0.35∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了鏈霉菌的細(xì)胞，它包含突變的除蟲鏈霉菌aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。在一優(yōu)選實施方案中，所述鏈霉菌是除蟲鏈霉菌。在一個更優(yōu)選實施方案中，所述細(xì)胞是能產(chǎn)生約0.40∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的除蟲鏈霉菌細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生除蟲菌素的方法，包括在允許或誘導(dǎo)產(chǎn)生除蟲菌素的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞，并從培養(yǎng)中回收所述除蟲菌素。
本發(fā)明還提供了由除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，包括已經(jīng)培養(yǎng)了細(xì)胞的培養(yǎng)基中的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，其中所述培養(yǎng)基中環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例為0.35∶1或更低，優(yōu)選約0.30∶1或更低，更優(yōu)選約0.25∶1或更低，更優(yōu)選約0.20∶1或更低。在一個具體實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物由表達(dá)突變的aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的基因產(chǎn)物導(dǎo)致由所述細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的2類∶1類比例，相對于不表達(dá)突變的aveC等位基因、僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細(xì)胞而言，比例減少。
在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物為0.35∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(a)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物為約0.30∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(f)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物為約0.25∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(w)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
在一個更優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物為約0.20∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了由除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，其包括已經(jīng)培養(yǎng)了細(xì)胞的培養(yǎng)基中的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，其中所述培養(yǎng)基中環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.40∶1或更低，本發(fā)明還提供了由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自上文(bf)和(bg)所列的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物。
4.


圖1.含有除蟲鏈霉菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO1)及其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2.含有除蟲鏈霉菌aveC基因完整的ORF的質(zhì)粒載體pSE186(ATCC209604)。
圖3.含有插入除蟲鏈霉菌aveC ORF中的紅色糖多孢菌(Sacc.Erythraea)ermE基因的基因取代載體pSE180(ATCC 209605)。
圖4.除蟲鏈霉菌的除蟲菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切圖譜，以及鑒定的五種重疊的粘?？寺?即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)。還指示了pSE118與pSE119的關(guān)系。
圖5.除蟲鏈霉菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析。通過與環(huán)己基B1的標(biāo)準(zhǔn)量比較來進(jìn)行峰定量。環(huán)己基B2的滯留時間是7.4-7.7分鐘，環(huán)己基B1的滯留時間是11.9-12.3分鐘。圖5A.攜帶失活的aveC ORF的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株。圖5B.用pSEI86(ATCC 209604)轉(zhuǎn)化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株。圖5C.用pSE187轉(zhuǎn)化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株。圖5D.用pSE188轉(zhuǎn)化的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株。
圖6A-M.匯編列表，顯示由第二輪“基因改組”鑒定的aveC等位基因突變所編碼的氨基酸取代組合，以及它們對環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1生產(chǎn)比例的影響。對于每一種質(zhì)粒而言，在題為“突變”的欄中，上面一格列出了氨基酸取代，下面一格列出了導(dǎo)致這些氨基酸取代的核苷酸堿基改變。括號中的核苷酸堿基改變?yōu)槌聊淖?，即它們不改變氨基酸序列?br> 5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及鑒定及表征具有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸分子，構(gòu)建可用于篩選突變的AveC基因產(chǎn)物對除蟲菌素生產(chǎn)的影響的除蟲鏈霉菌新菌株，并發(fā)現(xiàn)一些突變的AveC基因產(chǎn)物可以降低除蟲鏈霉菌產(chǎn)生的除蟲菌素B2∶B1的比例。例如，本發(fā)明下文中描述了一種多核苷酸分子，它具有與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列相同的核苷酸序列，或圖1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列，下文中還描述了具有由上述序列衍生的突變核苷酸序列的多核苷酸分子及其簡并變體。但本發(fā)明所述原理可以類似地應(yīng)用于其它多核苷酸分子，包括來自其它鏈霉菌例如吸水鏈霉菌(S.hygroscopeicus)及灰產(chǎn)色鏈霉菌(S.griseochromogenes)等的aveC同源基因。
5.1.編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的多核苷酸分子本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸分子，其含有除蟲鏈霉菌的完整aveC ORF或其實質(zhì)性部分，該分離的多核苷酸分子缺少處于除蟲鏈霉菌染色體中aveC ORF所處位置下游的下一個完整ORF。
本發(fā)明所述分離的多核苷酸分子優(yōu)選包括與質(zhì)粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列相同，或與圖1(SEQ IDNO1)的ORF的核苷酸序列或其實質(zhì)性部分相同的核苷酸序列。本文中，含有編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子的“實質(zhì)性部分”指的是一種分離的多核苷酸分子，其至少包括圖1(SEQ ID NO1)所示完整aveC ORF序列的約70％，并且編碼功能等效AveC基因產(chǎn)物。這里，“功能等效”的AveC基因產(chǎn)物被定義為一種基因產(chǎn)物，當(dāng)其在失活了天然aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692中表達(dá)時，導(dǎo)致與僅表達(dá)除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692的天然野生型功能性aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株ATCC 53692相比，產(chǎn)生基本上相同的比例和量的除蟲菌素。
除了aveC ORF的核苷酸序列外，本發(fā)明所述分離的多核苷酸分子可以進(jìn)一步包括天然側(cè)翼于除蟲鏈霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如圖1(SEQ ID NO1)所示的側(cè)翼核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸分子，其基于已知的遺傳密碼簡并性包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其簡并變體。
本文中，術(shù)語“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“編碼序列”，“開放閱讀框”及“ORF”都是指DNA分子和RNA分子，其可以是單鏈或雙鏈，當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)控元件的控制之下時，在適當(dāng)宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯(DNA)或被翻譯(RNA)成AveC基因產(chǎn)物，或者，被翻譯成與AveC基因產(chǎn)物同源的多肽。編碼序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因組DNA序列，及化學(xué)合成的DNA和RNA序列。
圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四個不同的GTG密碼子。如美國專利6,248,579所示，可構(gòu)建aveCORF(圖1；SEQ ID NO1)5′區(qū)域的多重缺失，以便幫助確定這些密碼子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白質(zhì)表達(dá)的起始位點。使bp 42位的第一個GTG位點缺失并不能消除AveC活性。進(jìn)一步使bp位置174，177及180的所有GTG密碼子都缺失消除了AveC活性，這表明該區(qū)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)表達(dá)是必須的。本發(fā)明因此包括具有不同長度的aveC ORF。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸分子，其包含與質(zhì)粒pSE186(ATCC209604)的除蟲鏈霉菌aveC基因產(chǎn)物編碼序列同源，或與圖1(SEQ IDNO1)所示aveC ORF的核苷酸序列或其實質(zhì)性部分同源的核苷酸序列。術(shù)語“同源”當(dāng)用于指與除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列同源的多核苷酸分子時，指具有以下核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列編碼相同的AveC基因產(chǎn)物，或與圖1(SEQ ID NO1)所示aveC ORF的核苷酸序列編碼相同的AveC基因產(chǎn)物，但在所述核苷酸序列中含有一或多個基于遺傳密碼簡并性的沉默改變(即簡并變體)；或(b)在中度嚴(yán)緊條件下與下述多核苷酸分子的互補(bǔ)序列雜交，并編碼上述功能等效AveC基因產(chǎn)物，其中所述多核苷酸分子含有編碼由質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因產(chǎn)物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或編碼圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述中度嚴(yán)緊條件也即在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結(jié)合于濾膜上的DNA雜交，及在42℃，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(例見Ausubel等(編)，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley& Sons，Inc.，New York，p.2.10.3)。在優(yōu)選的實施方案中，同源多核苷酸分子在高度嚴(yán)緊條件下與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)中編碼AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，或與圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列或其實質(zhì)性部分的互補(bǔ)序列雜交，并編碼上述功能等效AveC基因產(chǎn)物，其中所述高度嚴(yán)緊條件是指，在65℃，0.5M NaHPO4，7％SDS，1mMEDTA中與結(jié)合于濾膜上的DNA雜交，及在68℃，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，見上文)。
AveC基因產(chǎn)物及其潛在的功能等效物的活性，可以通過對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析來測定，見下文實施例。含有編碼除蟲鏈霉菌aveC基因產(chǎn)物之功能等效物的核苷酸序列的多核苷酸分子，包括天然存在于除蟲鏈霉菌其它菌株的aveC基因，存在于鏈霉菌其它種的aveC同源基因，及突變的aveC等位基因，不管是天然的還是人工合成的。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸分子，其包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產(chǎn)物編碼序列編碼的氨基酸序列同源，或與圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列或其實質(zhì)性部分同源的氨基酸序列。本文中，圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的“實質(zhì)性部分”是指一種多肽，它包括圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的至少約70％，并且組成了上述功能等效AveC基因產(chǎn)物。
本文用來描述與除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物之氨基酸序列同源的氨基酸序列時，術(shù)語“同源”指一種多肽，它含有圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列、但其中一或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守取代，其中所述氨基酸序列與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上AveC基因產(chǎn)物編碼序列編碼的多肽、或與圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列相比，具有按照任何標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列同一性算法如BLASTP算法(GENBANK，NCBI)所確定的至少約70％，更優(yōu)選至少約80％，最優(yōu)選至少約90％的氨基酸序列同一性，其中所述保守氨基酸取代產(chǎn)生了功能等效的基因產(chǎn)物，如上述定義。保守氨基酸取代是本領(lǐng)域眾所周知的。進(jìn)行這類取代的規(guī)則參見Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3等。更具體地，保守氨基酸取代是通常在一族具有相關(guān)酸性或極性的氨基酸家族中發(fā)生的那些?；蚓幋a的氨基酸一般分為四組(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以歸類為芳香氨基酸。在任何具體組中的一或多個取代通常對于該多肽的功能沒有顯著影響，例如，亮氨酸被異亮氨酸或纈氨酸取代，或天冬氨酸被谷氨酸取代，或蘇氨酸被絲氨酸取代，或任何其它氨基酸殘基被結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸殘基(例如，具有相似的酸性或極性，或具有相似性的一些結(jié)合的氨基酸殘基)取代。
本文公開的多核苷酸分子的生產(chǎn)和操作是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的，可以按照下述重組技術(shù)進(jìn)行操作，例如，Maniatis等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel等，1989，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing Associates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Innis等(編)，1995，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，San Diego；Erlich(編)，1992，PCR Technology，Oxford University Press，New York(列入本文作為參考)。編碼AveC基因產(chǎn)物或AveC同源基因產(chǎn)物的多核苷酸克隆可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行鑒別，包括但不限于下文第7節(jié)所列舉的方法。通過使用如Benton和Davis，1977，Science，196180中所述的篩選噬菌體文庫的方法和Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965所述的篩選質(zhì)粒文庫的方法，可以從基因組DNA文庫中篩選aveC及aveC同系物編碼序列。具有已知包括aveC ORF核苷酸序列的多核苷酸分子，例如存在于質(zhì)粒pSE186(ATCC209604)，或質(zhì)粒pSE119中的那些(見下文第7節(jié))，可以用作這些篩選實驗的探針?；蛘撸梢愿鶕?jù)純化的AveC同源基因產(chǎn)物的部分或全部氨基酸序列所推出的核苷酸序列，來合成對應(yīng)的寡核苷酸探針。
5.2.重組系統(tǒng)
5.2.1.克隆與表達(dá)載體本發(fā)明還提供了重組克隆載體與表達(dá)載體，其可用于克隆或表達(dá)本發(fā)明含有，例如除蟲鏈霉菌aveC ORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了質(zhì)粒pSE186(ATCC209604)，其含有除蟲鏈霉菌aveC基因的完整ORF。
所有下面有關(guān)除蟲鏈霉菌aveC ORF，或含有除蟲鏈霉菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的描述，也是指如下所述的突變的aveC等位基因，除非明確指明或根據(jù)上下文可以看出。
已研制出具體用于鏈霉菌的多種不同載體，包括噬菌體，高拷貝數(shù)質(zhì)粒，低拷貝數(shù)質(zhì)粒，及大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒等，其中任一個都可以用來實踐本發(fā)明。另外還從鏈霉菌中克隆了大量藥物抗性基因，其中一些基因被摻入載體作為選擇性標(biāo)記。在鏈霉菌中使用這些載體的例子可參見，如Hutchinson，1980，Applied Biochem.Biotech，16169～190。
本發(fā)明的重組載體，尤其是表達(dá)載體，優(yōu)選被構(gòu)建為，使得本發(fā)明多核苷酸分子的編碼序列與轉(zhuǎn)錄或翻譯編碼序列所必需的一或多個調(diào)控元件可操作相連，以便產(chǎn)生多肽。本文所用術(shù)語“調(diào)控元件”包括但不限于這樣的核苷酸序列，其編碼誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動子，增強(qiáng)子，操縱子，及本領(lǐng)域已知用于驅(qū)動和/或調(diào)控多核苷酸編碼序列的表達(dá)的其它元件。此外，如本文所用，編碼序列與一或多個調(diào)控元件“可操作相連”，其中這些調(diào)控元件有效調(diào)節(jié)并允許轉(zhuǎn)錄編碼序列和/或翻譯其mRNA。
典型的質(zhì)粒載體經(jīng)過改造可以包含本發(fā)明的多核苷酸分子，這些載體包括pCR-Blunt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(Promega)，和穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，J.Bact.，1715872-5881)等。
構(gòu)建含有具體編碼序列并使其與適當(dāng)調(diào)控元件可操作相連的重組載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可使用這些方法實踐本發(fā)明。這些方法包括體外重組技術(shù)，合成技術(shù)，和體內(nèi)基因重組。例見Maniatis等，1989，文獻(xiàn)同上；Ausubel等，1989，文獻(xiàn)同上；Sambrook等，1989，文獻(xiàn)同上；Innis等，1995，文獻(xiàn)同上；及Erlich，1992，文獻(xiàn)同上中描述的技術(shù)。
這些載體的調(diào)控元件在強(qiáng)度和特異性方面可以不同。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可使用多種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄及翻譯元件中的任一種。對于細(xì)菌來說，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)或啟動子的非限制性例子包括，β-gal啟動子，T7啟動子，TAC啟動子，λ左及右啟動子，trp及l(fā)ac啟動子，trp-lac融合啟動子，具體對于鏈霉菌來說，啟動子有ermE，melC，及tipA等。在一個具體實施方案中，制備了一種表達(dá)載體，其含有已被克隆在與強(qiáng)組成型啟動子相鄰的位置上的aveC ORF或其突變的ORF，所述啟動子如紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的ermE。按照美國專利6,248,579所述，將含有ermE啟動子的載體轉(zhuǎn)化到除蟲鏈霉菌中，隨后對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行的HPLC分析顯示，所產(chǎn)生的除蟲菌素的滴度相對于僅表達(dá)野生型aveC等位基因的相同菌株的產(chǎn)量有所增加。
融合蛋白表達(dá)載體可用于表達(dá)AveC基因產(chǎn)物-融合蛋白。純化的融合蛋白可用于產(chǎn)生抗AveC基因產(chǎn)物的抗血清，研究AveC基因產(chǎn)物的生化特性，改造具有不同生化活性的AveC融合蛋白，或輔助鑒定或純化所表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物。可能的融合蛋白表達(dá)載體包括但不局限于這樣的載體，其中摻入了編碼β-半乳糖苷酶的序列及trpE融合子，麥芽糖結(jié)合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合子和多組氨酸融合子(運載區(qū)域)。在另一實施方案中，AveC基因產(chǎn)物或其部分可與來源于鏈霉菌其它種或菌株(例如吸水鏈霉菌或灰產(chǎn)色鏈霉菌)的AveC同源基因產(chǎn)物或其部分融合。將這種雜合載體轉(zhuǎn)化至除蟲鏈霉菌細(xì)胞中，并檢測其效應(yīng)，例如對所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類之比例的影響。
AveC融合蛋白經(jīng)過改造可以含有對純化有用的區(qū)域。例如，AveC-麥芽糖結(jié)合蛋白融合可以用直鏈淀粉樹脂純化；AveC-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白可以用谷胱甘肽-瓊脂糖珠純化；AveC-多組氨酸融合可以用二價鎳樹脂純化?；蛘?，可以用抗載體蛋白或肽的抗體進(jìn)行融合蛋白的親和純化。例如，可以將編碼單克隆抗體靶表位的核苷酸序列插入表達(dá)載體的適當(dāng)位置處，使其與調(diào)控元件可操作相連并使所表達(dá)的表位與AveC多肽融合。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼FLAGTM表位標(biāo)記(InternationalBiotechnologies Inc.)(其為親水性標(biāo)記肽)的核苷酸序列插入表達(dá)載體中，使其插入位置對應(yīng)于，例如，AveC多肽羧基末端。所表達(dá)的AveC多肽-FLAGTM表位融合產(chǎn)物然后可以利用商購的抗-FLAGTM抗體來進(jìn)行檢測及親和純化。
編碼AveC融合蛋白的表達(dá)載體也可以經(jīng)過改造而含有編碼特異性蛋白酶裂解位點的多接頭序列，以使表達(dá)的AveC多肽在用特異性蛋白酶處理后可以與運載區(qū)域或融合配對物脫離。例如，所述融合蛋白載體可以包括編碼凝血酶或Xa因子酶切位點等的DNA序列。
位于aveC ORF上游且與其在同一框內(nèi)的信號序列，可以利用已知方法插入表達(dá)載體中，以便指導(dǎo)所表達(dá)的基因產(chǎn)物的運輸和分泌。信號序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T細(xì)胞受體等的信號序列。
為了幫助選擇經(jīng)過本發(fā)明克隆載體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，可以對所述載體進(jìn)行改造，以使其進(jìn)一步包括編碼報道基因產(chǎn)物或其它選擇標(biāo)記的序列。優(yōu)選所述編碼序列與上述調(diào)控元件編碼序列可操作相連。對本發(fā)明有用的報道基因是本領(lǐng)域已知的，包括那些編碼綠色熒光蛋白，螢光素酶，xylE以及酪氨酸酶等的報道基因。編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，包括編碼賦予抗生素抗性或抗代謝物抗性的基因產(chǎn)物的那些，或提供營養(yǎng)缺陷型需求的那些。這類序列的實例包括編碼抗紅霉素，硫鏈絲菌肽(thiostrepton)或卡那霉素等的抗性的那些。
5.2.2宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化本發(fā)明進(jìn)一步提供含有本發(fā)明多核苷酸分子或重組載體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或由其衍生的新菌株或細(xì)胞系?？捎糜诒景l(fā)明實踐中的宿主細(xì)胞優(yōu)選為鏈霉菌細(xì)胞，但也可以用其它原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。這類經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞一般包括但不局限于微生物，例如經(jīng)重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，或經(jīng)重組載體轉(zhuǎn)化的酵母，等等。
本發(fā)明的多核苷酸分子欲在鏈霉菌細(xì)胞中發(fā)揮作用，但也可以被轉(zhuǎn)化至其它細(xì)菌或真核細(xì)胞中以便實現(xiàn)例如克隆或表達(dá)目的。一般使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，它可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA(保藏號31343)，或可商購(Stratagene)。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，也可以有效利用哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體優(yōu)選被引入(例如，經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)基本上均一培養(yǎng)的一或多個宿主細(xì)胞中。表達(dá)載體通常利用已知技術(shù)引入宿主細(xì)胞，所述技術(shù)如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，磷酸鈣沉淀，氯化鈣處理，顯微注射，電穿孔，通過與重組病毒接觸來進(jìn)行轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合，或微粒轟擊(microprojectile bombardment)。轉(zhuǎn)化子可以用標(biāo)準(zhǔn)方法來選擇，例如，選擇那些表達(dá)了與重組載體相關(guān)的選擇標(biāo)記(如抗生素抗性)的細(xì)胞，如上述。
一旦將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，aveC編碼序列已整合并維持在宿主染色體上或為游離體形式的事實，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Southern雜交分析、限制酶分析、PCR(包括逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(rt-PCR))分析來證實，或通過用免疫學(xué)試驗檢測預(yù)期基因產(chǎn)物來證實。含有和/或表達(dá)重組aveC編碼序列的宿主細(xì)胞，可以通過本領(lǐng)域公知的至少四種常規(guī)方法中的任一種來證實，所述方法包括(i)DNA-DNA，DNA-RNA，或RNA-反義RNA雜交；(ii)檢測標(biāo)記基因功能的存在；(iii)通過測定宿主細(xì)胞中aveC特異性mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)來評估轉(zhuǎn)錄水平，及(iv)通過免疫分析或AveC生物活性的存在(例如，具體比例和量的除蟲菌素的產(chǎn)生表示在，例如，除蟲鏈霉菌宿主細(xì)胞中存在AveC活性)來測定成熟多肽產(chǎn)物的存在。
5.2.3.重組AveC基因產(chǎn)物的表達(dá)及鑒定一旦將天然的或突變的aveC編碼序列穩(wěn)定引入合適的宿主細(xì)胞，可以使經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞無性繁殖，所得的細(xì)胞可以在有助于天然的或突變的AveC基因產(chǎn)物最大量生產(chǎn)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述條件通常包括培養(yǎng)細(xì)胞直至高密度。當(dāng)表達(dá)載體含有誘導(dǎo)型啟動子時，可以根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)的需要采用合適的誘導(dǎo)條件，例如，溫度變化，使?fàn)I養(yǎng)耗盡，添加義務(wù)誘導(dǎo)物(例如，碳水化合物的類似物，如異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG))，積累過量的代謝副產(chǎn)物等。
當(dāng)表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物保留在宿主細(xì)胞內(nèi)部時，收集細(xì)胞并裂解，在本領(lǐng)域已知使蛋白質(zhì)降解最小化的提取條件下，例如，在4℃和/或有蛋白酶抑制劑存在的條件下，從裂解物中分離并純化產(chǎn)物。當(dāng)表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物從宿主細(xì)胞中分泌時，只需收集耗盡的營養(yǎng)培養(yǎng)基并從中分離產(chǎn)物。
表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物，可利用標(biāo)準(zhǔn)方法從相應(yīng)的細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基中分離或基本上純化，所述方法包括但不局限于下列方法的任何組合硫酸銨沉淀，大小分級分離，離子交換層析，HPLC，密度離心及親和層析。當(dāng)表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物表現(xiàn)出生物活性時，可使用適當(dāng)試驗在純化步驟的每一步監(jiān)控所述制劑不斷提高的純度。不管表達(dá)的AveC基因產(chǎn)物是否表現(xiàn)出生物活性，都可以依據(jù)其大小或與AveC特異性抗體的反應(yīng)性來檢測，或在融合標(biāo)記的存在下檢測。如本文所用，AveC基因產(chǎn)物當(dāng)在具體制劑中占蛋白重量比的約20％以上時為“基本上純化”。同樣，如本文所用，AveC基因產(chǎn)物當(dāng)在具體制劑中占蛋白重量比的至少約80％時是“分離的”。
本發(fā)明因此提供分離的或基本上純化的重組表達(dá)型除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物，其含有可以被質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因產(chǎn)物編碼序列所編碼的氨基酸序列，或圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其實質(zhì)性部分，本發(fā)明還提供所述基因產(chǎn)物的突變體和簡并變體。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)AveC基因產(chǎn)物的方法，包括在有助于產(chǎn)生重組AveC基因產(chǎn)物的條件下，培養(yǎng)經(jīng)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收AveC基因產(chǎn)物，其中所述載體含有一種多核苷酸分子，該多核苷酸分子具有編碼AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列并與一或多個控制該多核苷酸分子在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)控元件可操作相連。
重組表達(dá)的除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物可用于多種目的，包括篩選可以改變AveC基因產(chǎn)物功能并因此調(diào)節(jié)除蟲菌素生物合成的化合物，以及產(chǎn)生抗AveC基因產(chǎn)物的抗體。
一旦獲得純度足夠高的AveC基因產(chǎn)物，就可以用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒定，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻層析，氨基酸序列分析，在除蟲菌素生物合成途徑中產(chǎn)生合適產(chǎn)物的生物活性等等。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的肽測序技術(shù)測定AveC基因產(chǎn)物的氨基酸序列?？梢杂糜H水性分析(例見Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 783824)或類似的軟件運算法來鑒定AveC基因產(chǎn)物的親水區(qū)及疏水區(qū)，籍此進(jìn)一步鑒定AveC基因產(chǎn)物?？蛇M(jìn)行結(jié)構(gòu)分析以鑒定AveC基因產(chǎn)物中具有特殊二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，例如可使用諸如X-射線結(jié)晶學(xué)等生物物理法(Engstrom，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)，計算機(jī)建模(Fletterick及Zoller(編)，1986，Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)，和核磁共振(NMR)來作圖并研究AveC基因產(chǎn)物與其底物之間相互作用的位點。從這些研究所取得的信息可用于選擇aveC ORF中的新突變位點，以幫助開發(fā)具有更合適的除蟲菌素生產(chǎn)特性的除蟲鏈霉菌新菌株。
5.3.aveC突變體的構(gòu)建及應(yīng)用本發(fā)明的一個主要目的是鑒定除蟲鏈霉菌aveC等位基因中導(dǎo)致B2∶B1除蟲菌素的比例改變(最優(yōu)選減少)的新突變。本發(fā)明因此提供了可用于產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株的細(xì)胞的一種多核苷酸分子，所述細(xì)胞與僅表達(dá)野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，除蟲菌素生產(chǎn)出現(xiàn)可以檢測到的改變。在一個優(yōu)選實施方案中，所述多核苷酸分子可以用于產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株的細(xì)胞，這種細(xì)胞與僅表達(dá)野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，產(chǎn)生具有較低的2類∶1類比例的除蟲菌素。所述菌株的細(xì)胞還可以包含其它突變，以便與僅表達(dá)單個野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，產(chǎn)生更多量的除蟲菌素。
aveC等位基因或編碼序列的突變包括下述的任何突變，其在AveC基因產(chǎn)物中引入一或多個氨基酸取代、缺失和/或添加，或?qū)е翧veC基因產(chǎn)物截短，或它們的任何組合，且產(chǎn)生所需結(jié)果。所述突變的aveC等位基因序列還包括它們的任何簡并變體。例如，本發(fā)明提供以下多核苷酸分子，其包含aveC等位基因的核苷酸序列或其簡并變體，或包含質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上的AveC基因產(chǎn)物編碼序列或其簡并變體，或圖1(SEQID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列或其簡并變體，但其進(jìn)一步含有突變，所述突變編碼AveC基因產(chǎn)物選定位點的氨基酸取代的組合。在一個非限制性實施方案中，這類取代發(fā)生在AveC基因產(chǎn)物中對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸位置25，28，35，36，38，40，41，48，55，61，78，84，89，90，99，107，108，111，120，123，136，138，139，141，154，159，163，179，192，196，198，200，202，220，228，229，230，231，234，238，239，250，252，266，275，278，289或298的一或多個氨基酸位置上。優(yōu)選將要取代的氨基酸位置的組合包含D48，A61，A89，L136，S138，A139，R163，G179，V196，A198，E238和P289中的一或多個。特別優(yōu)選的氨基酸取代組合包含在D48和G179的取代，更優(yōu)選D48E和G179S。導(dǎo)致環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1比例下降的氨基酸取代組合的具體實例列在圖6A-J中。
本發(fā)明因此提供了一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的序列相同的核苷酸序列，或與圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但所述核苷酸序列還包含編碼氨基酸取代組合的突變，所述取代發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸位置的氨基酸殘基上，使除蟲鏈霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表達(dá)含有上述突變核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞，相對于僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌ATCC 53692細(xì)胞而言，產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例下降，其中當(dāng)除蟲菌素2類∶1類為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，除蟲菌素2類∶1類的比例為0.35∶1或更低。在一優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。
在一個具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(a)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE538(見圖6)。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(b)組的組合G40S，D48E，L136P，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE559。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(c)組的組合D48E，L136P，R163Q，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE567。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(d)組的組合D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE572。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(e)組的組合D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE571。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(f)組的組合D48E，L136P，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE501和pSE546。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(g)組的組合D48E，A61T，L136P，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE510。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(h)組的組合D48E，A61T，L136P，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE512。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(i)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE519。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(j)組的組合D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE526。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(k)組的組合D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE528。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(l)組的組合D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE530。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(m)組的組合D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE531。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(n)組的組合D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE534。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(o)組的組合Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE535。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(p)組的組合D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE542。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(q)組的組合D48E，L136P，G179S，R250W。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE545。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(r)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE548。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(s)組的組合D48E，L136P，G179S，A198G，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE552。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(t)組的組合D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE557。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(u)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE564和pSE565。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(v)組的組合D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE568。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(w)組的組合D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE543。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(x)組的組合D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE504。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(y)組的組合D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE508。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(z)組的組合D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE511。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(aa)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE520。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ab)組的組合D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE523。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ac)組的組合D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE527。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ad)組的組合D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE539。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ae)組的組合G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE540。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(af)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE547。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ag)組的組合D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE550。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ah)組的組合S41G，D48E，A89T，L136P，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE558。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ai)組的組合D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE563。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(aj)組的組合D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE566。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ak)組的組合D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE573和pSE578。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(al)組的組合Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE574。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(am)組的組合D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE575和pSE576。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(an)組的組合D48E，A89T，S138T，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE577。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ao)組的組合D48E，A89T，L136P，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE502和pSE524。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ap)組的組合D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE503。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(aq)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE505。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ar)組的組合D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE506。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(as)組的組合D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE507。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(at)組的組合D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE509。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(au)組的組合D48E，A89T，L136P，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE514和pSE525。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(av)組的組合D48E，A89T，V120A，L136P，G179S。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE515。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(aw)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE517。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ax)組的組合D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE518。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ay)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE529和pSE554。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(az)組的組合D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE532。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(ba)組的組合D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE536。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(bb)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE537。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(bc)組的組合D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE541。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(bd)組的組合D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE549和pSE553。
在另一具體實施方案中，所述氨基酸取代組合包含(be)組的組合D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。編碼這些氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE551。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因相同的核苷酸序列，與質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上編碼除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的序列相同的核苷酸序列，或與圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但所述核苷酸序列還包含編碼氨基酸取代組合的突變，所述取代發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸位置的氨基酸殘基上，導(dǎo)致除蟲鏈霉菌ATCC 53692中失活了野生型aveC等位基因、且表達(dá)含有上述突變核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞，相對于僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌ATCC 53692細(xì)胞而言，產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例下降，其中當(dāng)除蟲菌素2類∶1類為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，除蟲菌素2類∶1類的比例約為0.40∶1或更低，且其中氨基酸取代組合包含選自下組的組合(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
編碼(bf)組氨基酸取代的質(zhì)粒的非限制性實例是pSE556和pSE569。編碼(bg)組氨基酸取代的質(zhì)粒的一個非限制性實例是pSE561。
本發(fā)明涉及，上述任一種氨基酸取代可以通過對aveC等位基因的核苷酸序列或其簡并變體進(jìn)行任何能導(dǎo)致所述取代的修飾來實現(xiàn)。例如，通過將天然密碼子序列或其簡并變體改換為編碼相同氨基酸取代的數(shù)個可選密碼子中任一種，有可能實現(xiàn)本文所述的大多數(shù)氨基酸取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文所述以及已知的遺傳密碼子簡并性，可以輕易而明顯地確定編碼上述氨基酸取代的各種可能序列。在上文所列的每一種具體組合的一個非限制性實施方案中，氨基酸取代通過圖6所示非沉默核苷酸改變來實現(xiàn)。
本文中，“氨基酸取代組合包含以下組合...”等等是指，本發(fā)明AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代至少包括具體列出的那些取代，而且可以包括其它氨基酸取代，或氨基酸缺失，或氨基酸添加，或它們的一些組合，其中所得AveC基因產(chǎn)物在除蟲鏈霉菌細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致B2∶B1除蟲菌素的比例按照預(yù)期的下降。
aveC等位基因或其簡并變體的突變可通過多種已知方法的任一種來實施，包括使用易錯PCR，或通過盒式誘變。例如，可以使用寡核苷酸定向誘變以一種限定的方式改變aveC等位基因或ORF的序列，如在aveC等位基因或ORF中的具體區(qū)域引入一或多個限制性位點或一個終止密碼子。正如美國專利5,605,793、5,830,721、5,837,458所述，也可使用涉及隨機(jī)片斷化、誘變的反復(fù)循環(huán)、以及核苷酸改組的方法，來產(chǎn)生具有編碼aveC突變的核苷酸序列的多核苷酸大文庫。
靶向突變是有效的，尤其當(dāng)它們改變AveC基因產(chǎn)物中的一或多個保守氨基酸殘基時更是如此。例如，將除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物的公認(rèn)氨基酸序列(SEQ ID NO2)與來自灰產(chǎn)色鏈霉菌(SEQ ID NO5)及吸水鏈霉菌(SEQ ID NO4)的AveC同源基因產(chǎn)物的公認(rèn)氨基酸序列(美國專利6,248,579)相比較，顯示了這些物種之間顯著保守的氨基酸殘基位點。導(dǎo)致一或多個所述保守氨基酸殘基改變的靶向誘變對于產(chǎn)生可以顯示所需的除蟲菌素產(chǎn)量改變的新突變株是非常有效的。
隨機(jī)誘變也是有效的，可以通過將除蟲鏈霉菌細(xì)胞暴露于紫外線或X-射線照射，或暴露于化學(xué)誘變劑如N-甲基-N′-亞硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亞硝酸或氮芥等，來進(jìn)行誘變。有關(guān)誘變技術(shù)的綜述可參見Ausubel，1989，文獻(xiàn)同上。
一旦產(chǎn)生突變的多核苷酸分子，可通過篩選確定它們是否可調(diào)節(jié)除蟲鏈霉菌中的除蟲菌素生物合成。在優(yōu)選的實施方案中，具有突變的核苷酸序列的多核苷酸分子，可以通過彌補(bǔ)(complementing)除蟲鏈霉菌菌株來檢測，所述菌株是aveC基因已失活從而給出aveC陰性(aveC-)背景的菌株。在一個非限制性方法中，突變的多核苷酸分子被剪接到表達(dá)質(zhì)粒中，與一或多個調(diào)控元件可操作相連，該質(zhì)粒優(yōu)選還包括一或多個藥物抗性基因，以便允許對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行選擇。使用已知技術(shù)將該載體轉(zhuǎn)化至aveC-宿主細(xì)胞，選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并在允許或誘導(dǎo)除蟲菌素產(chǎn)生的條件下在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述條件例如，在培養(yǎng)基中包括合適的起始亞基，以及在本領(lǐng)域已知的最適合除蟲菌素生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)。然后通過HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物，以測定突變的多核苷酸分子彌補(bǔ)宿主細(xì)胞的能力。數(shù)種攜有能降低除蟲菌素B2∶B1比例的突變多核苷酸分子的載體，包括pSE188，pSE199，pSE231，pSE239，以及pSE290至pSE297都在下面8.3章節(jié)舉例說明。這類質(zhì)粒載體的其它實例見圖6。
本發(fā)明上述任一種方法可以用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添加環(huán)己烷羧酸，但也可以使用其它合適的脂肪酸前體，例如，表1所列的任一種脂肪酸前體，或甲硫乳酸(methylthiolactic acid)。
一旦鑒定出按所需方向調(diào)節(jié)除蟲菌素生產(chǎn)的突變的多核苷酸分子，就可以確定核苷酸序列上發(fā)生突變的位置。例如，具有編碼突變AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸分子可以通過PCR分離，并用已知方法對其進(jìn)行DNA序列分析。通過比較突變型和野生型aveC等位基因的DNA序列，可以確定負(fù)責(zé)改變除蟲菌素生產(chǎn)的突變。例如，除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物在第55位(S55F)，第138位(S138T)，第139位(A139T)或第230位(G230D)中任一處含有單個氨基酸取代，或在第138位(S138T)和第139位(A139T或A139F)含有雙重取代時，導(dǎo)致AveC基因產(chǎn)物的功能發(fā)生改變，使所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例改變(參見下文第8章節(jié))，其中所述氨基酸位置對應(yīng)于圖1(SEQ ID NO2)中所示。此外，以下7種突變組合分別顯示能有效降低除蟲菌素的2類∶1類之比(1)D48E/A89T；(2)S138T/A139T/G179S；(3)Q38P/L136P/E238D；(4)F99S/S138T/A139T/G179S；(5)A139T/M228T；(6)G111V/P289L；(7)A139T/K154E/Q298H。本發(fā)明包括顯示能降低除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1之比例的另外59種突變組合，它們表示在圖6中并引述在權(quán)利要求中。
本文中，上述表達(dá)方式(如A139T)是指，用單字母表示的起始氨基酸殘基(本例中為丙氨酸A)，在指定位置(本例中為SEQ ID NO2所示多肽的第139位)，被替換起始氨基酸殘基的氨基酸殘基(本例中為蘇氨酸T)取代。
本文中，當(dāng)由除蟲鏈霉菌染色體中，或者本發(fā)明載體或分離的多核苷酸分子中的aveC等位基因所編碼的氨基酸殘基被描述為“對應(yīng)于”SEQ IDNO2的具體氨基酸殘基，或者當(dāng)氨基酸取代被描述為發(fā)生在“對應(yīng)于”SEQ ID NO2中具體編號的氨基酸殘基的具體位置上，這時是表示處在AveC基因產(chǎn)物相同位置上的氨基酸殘基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參看本文SEQ ID NO2所示氨基酸序列很快確定該殘基。
本文中，當(dāng)編碼具體突變的aveC等位基因中的具體突變被描述為aveC等位基因中“對應(yīng)于”SEQ ID NO1所示具體核苷酸位置的具體核苷酸位置上發(fā)生的堿基改變，或者當(dāng)aveC等位基因中的核苷酸位置被描述為“對應(yīng)于”SEQ ID NO1中的具體核苷酸位置，這時是指aveC核苷酸序列或其簡并變體中同樣相關(guān)位置上的核苷酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照本文SEQ IDNO1所示核苷酸序列能快速確定該核苷酸。
本文中描述除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1的比例時所用的術(shù)語“約”是指，具體指明的數(shù)值加或減該數(shù)值的10％。
本發(fā)明的多核苷酸分子可以是“分離的”，這意味著(i)它已經(jīng)經(jīng)過純化，因此基本上不含具有不同核苷酸序列的其它多核苷酸分子；或(ii)它處在并非天然的環(huán)境中，例如來自除蟲鏈霉菌的aveC等位基因或其突變形式處在并非除蟲鏈霉菌細(xì)胞的另一種細(xì)胞中；或(iii)它表現(xiàn)為并非天然的一種形式，例如更短的DNA片段，如消化細(xì)菌染色體所得的限制性片段，它們主要含有aveC編碼區(qū)或其突變形式，可以含或不含其任何輔助調(diào)控序列，或者是隨后被整合到異源DNA片段中，如(除了除蟲鏈霉菌細(xì)胞以外的)細(xì)菌細(xì)胞的染色體中，或者諸如質(zhì)?；蚴删w等載體的DNA中，或者被整合到除蟲鏈霉菌染色體上并非天然aveC等位基因所處的位置。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明多核苷酸分子的重組載體。所述重組載體可用于將任何含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除蟲鏈霉菌染色體上的aveC等位基因位點，以通過例如同源重組來插入或取代aveCORF或其部分。然而，按照本發(fā)明，此處提供的含有本發(fā)明的突變核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC等位基因以外的其它位點時，或在作為除蟲鏈霉菌細(xì)胞中的游離體形式維持時，發(fā)揮調(diào)節(jié)除蟲菌素生物合成的功能。因此，本發(fā)明還提供了包含多核苷酸分子的載體，所述多核苷酸含有本發(fā)明所述突變的核苷酸序列，所述載體可用于將所述多核苷酸分子插入到除蟲鏈霉菌染色體上除aveC基因位點以外的位置，或以游離體的形式維持。
在非限制性實施方案中，所述載體是下述基因取代載體，其可以用于將本發(fā)明所述突變的aveC等位基因或其簡并變體插入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，籍此產(chǎn)生新的除蟲鏈霉菌菌株，所述菌株的細(xì)胞與僅表達(dá)野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例下降。這類基因取代載體可以用本文提供的表達(dá)載體(例如以下第8章節(jié)中所例舉的那些表達(dá)載體)中的突變多核苷酸分子來構(gòu)建。
本發(fā)明還提供了一種載體，其可用于將突變的aveC等位基因或其簡并變體插入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，以便產(chǎn)生新菌株的細(xì)胞，所述新細(xì)胞與僅表達(dá)野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，除蟲菌素的產(chǎn)量有所改變。在優(yōu)選的實施方案中，所述新細(xì)胞產(chǎn)生的除蟲菌素的量增加。在具體的非限制性實施方案中，該載體包含本領(lǐng)域已知的強(qiáng)啟動子，例如，來自紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的強(qiáng)組成型ermE啟動子，使其位于ave ORF上游并與該aveC ORF可操作相連。所述載體可以使用質(zhì)粒pSE189中的突變的aveC等位基因，按照美國專利6,248,579中所述的方法來構(gòu)建。
本發(fā)明提供了基因取代載體，其可用于滅活野生型除蟲鏈霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性實施方案中，所述基因取代載體可以用質(zhì)粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突變的多核苷酸分子來構(gòu)建，該質(zhì)粒在下文第8.1章節(jié)描述(圖3)。本發(fā)明還提供了含有多核苷酸分子的基因取代載體，所述多核苷酸分子包含天然側(cè)翼于除蟲鏈霉菌染色體上原位aveC基因的核苷酸序列或由該序列組成，包括，例如那些如圖1(SEQ ID NO1)所示的側(cè)翼核苷酸序列，所述載體可用于使除蟲鏈霉菌aveC ORF缺失。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的多核苷酸分子或重組載體。所述宿主細(xì)胞可以是任何能作為所述多核苷酸分子或重組載體的宿主的原核或真核細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在一個更優(yōu)選實施方案中，所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬的細(xì)胞。在一個更優(yōu)選實施方案中，所述宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，導(dǎo)致在AveC基因產(chǎn)物中出現(xiàn)氨基酸取代組合，或(ii)將突變的aveC等位基因或其簡并變體引入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，所述基因或變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，導(dǎo)致在AveC基因產(chǎn)物中出現(xiàn)氨基酸取代組合，或(ii)將突變的aveC等位基因或其簡并變體引入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，所述基因或變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含氨基酸取代組合，所述含有突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞能以0.35∶1或更低的比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，導(dǎo)致在AveC基因產(chǎn)物中出現(xiàn)氨基酸取代組合，或(ii)將突變的aveC等位基因或其簡并變體引入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，所述基因或變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自(bf)和(bg)的氨基酸取代組合。在一優(yōu)選實施方案中，含有所述突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞能以約0.40∶1或更低的比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。
按照上述步驟使aveC等位基因突變，或引入突變的aveC等位基因或其簡并變體之后，可以產(chǎn)生新的除蟲鏈霉菌菌株。
本發(fā)明還提供了包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的鏈霉菌屬細(xì)胞，所述基因或變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。在一個優(yōu)選實施方案中，鏈霉菌屬的物種是除蟲鏈霉菌。
本發(fā)明還提供了能以0.35∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.30∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.25∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在一個更優(yōu)選實施方案中，環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約為0.20∶1或更低。在一個非限制性實施方案中，所述細(xì)胞包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合。
本發(fā)明還提供了鏈霉菌屬物種的細(xì)胞，其包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文所列(bf)和(bg)的氨基酸取代組合。在一優(yōu)選實施方案中，所述鏈霉菌屬物種是除蟲鏈霉菌。在一個更優(yōu)選實施方案中，所述細(xì)胞是能以約0.40∶1或更低的比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的除蟲鏈霉菌細(xì)胞。
上述任一種突變都可以出現(xiàn)在本發(fā)明細(xì)胞中的染色體外元件(如質(zhì)粒)上，但優(yōu)選所述突變出現(xiàn)在整合到除蟲鏈霉菌染色體中的aveC編碼序列中，優(yōu)選，但并非必需，位于天然aveC等位基因的位置。
所述新菌株的細(xì)胞可以用于大量產(chǎn)生具有商業(yè)價值的除蟲菌素如doramectin。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生除蟲菌素的方法，包括在培養(yǎng)基中，用允許或誘導(dǎo)本發(fā)明的除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生除蟲菌素的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述除蟲菌素。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法中所用的細(xì)胞以0.35∶1或更低的比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，更優(yōu)選所述比例為約0.30∶1或更低，更優(yōu)選所述比例為約0.25∶1或更低，更優(yōu)選所述比例為約0.20∶1或更低。
在一個優(yōu)選實施方案中，以0.35∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的細(xì)胞，包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，以約0.30∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的細(xì)胞，包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，以約0.25∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的細(xì)胞，包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，以約0.20∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的細(xì)胞，包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述細(xì)胞以約0.40∶1或更低比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，且包含突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代組合。
本發(fā)明的方法使具有商業(yè)價值的除蟲菌素如doramectin的生產(chǎn)效力提高。
本發(fā)明還提供了由除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，其在培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中包含環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，該培養(yǎng)基中環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例為0.35∶1或更低，優(yōu)選約0.30∶1或更低，更優(yōu)選約0.25∶1或更低，優(yōu)選約0.20∶1或更低。在一個具體實施方案中，所述的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素組合物由表達(dá)突變的aveC等位基因或其簡并變體的除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的基因產(chǎn)物，導(dǎo)致所述細(xì)胞與不表達(dá)突變的aveC等位基因而是僅表達(dá)野生型aveC等位基因的除蟲鏈霉菌相同菌株的細(xì)胞相比，產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例下降。
在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物是0.35∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(a)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物是約0.30∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(f)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物是約0.25∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(w)-(be)所列的氨基酸取代組合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述組合物是約0.20∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述組合物由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(ao)-(be)所列的氨基酸取代組合。
本發(fā)明還提供了由除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，其在培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中包含環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，該培養(yǎng)基中環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例約0.40∶1或更低，且是由包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞產(chǎn)生，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼的AveC基因產(chǎn)物包含選自上文中(bf)和(bg)所列的氨基酸取代組合。
優(yōu)選所述除蟲菌素新組合物出現(xiàn)在培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基中，例如，在部分或完全耗盡的發(fā)酵培養(yǎng)液中，另外也可以用已知的生物化學(xué)純化技術(shù)，如硫酸銨沉淀，透析，大小分級分離，離子交換層析，HPLC等，將除蟲菌素組合物從培養(yǎng)液中部分純化或?qū)嵸|(zhì)上純化出來。
除了如上所述產(chǎn)生除蟲鏈霉菌新菌株，使其包含能產(chǎn)生比例降低的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1的細(xì)胞，本發(fā)明還涉及將其它突變引入除蟲鏈霉菌細(xì)胞中，以便進(jìn)一步改進(jìn)除蟲菌素生產(chǎn)的特性。在一個非限制性實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞還包含一些修飾，以便提高除蟲菌素的生產(chǎn)水平。在一個實施方案中，所述細(xì)胞可以如下制備(i)使除蟲鏈霉菌細(xì)胞中的aveC等位基因突變，或(ii)將突變的aveC等位基因或其簡并變體引入除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中，其中所述突變的等位基因的表達(dá)導(dǎo)致，表達(dá)該突變的aveC等位基因的除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞，與僅表達(dá)單個野生型aveC等位基因的相同菌株的細(xì)胞相比，除蟲菌素的產(chǎn)量增加，然后選出經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其與僅表達(dá)單個野生型aveC等位基因的菌株的細(xì)胞相比，除蟲菌素的產(chǎn)量增加。例如，可以對aveC等位基因進(jìn)行修飾，使其包含強(qiáng)啟動子，如紅色糖多孢菌的強(qiáng)組成型ermE啟動子，使其位于ave ORF上游并與該aveC ORF可操作相連。在另一實施方案中，可以將一或多個突變引入除蟲鏈霉菌的aveR1和/或aveR2基因中，從而增加除蟲菌素的生產(chǎn)水平，如2001年3月6日授予Stutzman-Engwall的美國專利6,197,5591所述。
5.4.除蟲菌素的用途除蟲菌素是可具體作為治蠕蟲劑、殺體外寄生蟲劑、殺蟲劑及殺螨劑來使用的高效抗寄生蟲藥劑。按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物均可用于這些用途。例如，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物可用于治療人類的各種疾病或癥狀，尤其是本領(lǐng)域已知由寄生蟲感染造成的那些疾病。參見Ikeda and Omura，1997，Chem.Rev.97(7)2591-2609。更具體地，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物可有效治療由內(nèi)寄生蟲所致的各種疾病，所述內(nèi)寄生蟲如能感染人，家養(yǎng)動物，豬，綿羊，家禽，馬或牛的寄生性線蟲。
更具體地，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物可有效抵抗感染人體的線蟲以及感染各種動物的線蟲。這類線蟲包括胃腸道寄生蟲如鉤蟲(Ancylostoma)，線蟲(Necator)，蛔蟲(Ascaris)，類圓線蟲(Strongyloides)，旋毛蟲(Trichinella)，毛細(xì)線蟲(Capillaria)，鞭蟲(Trichuris)，蟯蟲(Enterobius)，惡絲蟲(Dirofilaria)，及在血管或其它組織或器官中發(fā)現(xiàn)的寄生蟲如絲蟲性蠕蟲以及類園線蟲和旋毛蟲的腸道提取物。
按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物也可用于治療體外寄生蟲感染，包括節(jié)肢動物對哺乳動物或鳥類的感染，如能感染馬和牛的蜱(tick)、螨、虱、蚤、綠頭蒼蠅、咬蟲(biting insect)、或移棲雙翅目幼蟲等引起的感染。
按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物也可作為殺蟲劑用于對抗室內(nèi)害蟲(household pest)如蟑螂、衣蛾、地毯甲蟲、及家蠅等，以及侵害儲存的谷物和農(nóng)作物的有害昆蟲，包括紅蜘蛛(spider mite)、蚜蟲、毛蟲、和直翅目幼蟲如蝗蟲(locust)等。
用按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物能治療的動物包括綿羊、牛、馬、鹿、山羊、豬、鳥類包括家禽、狗和貓。
按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物可根據(jù)具體用途、接受治療的宿主動物的具體種類、所涉及的寄生蟲或昆蟲等情況以相應(yīng)劑型給藥。當(dāng)作為殺寄生蟲劑使用時，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物可以以膠囊、丸劑、片劑、或灌服液的劑型口服，或以傾注(pour-on)、注射或植入的形式給藥。這類制劑可以按標(biāo)準(zhǔn)獸醫(yī)學(xué)實踐以傳統(tǒng)方式制備。因此，可將活性成分與精確分配的適當(dāng)稀釋劑或載體混合來制備膠囊、丸劑或片劑，所述稀釋劑或載體另外含有崩解劑和/或粘合劑如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸鎂等。灌服劑是將活性成分與分散劑或潤濕劑等一起分散在水溶液中來制備。注射劑可配制成無菌溶液，其中可含其它物質(zhì)如足夠的鹽和/或葡萄糖以便使該溶液相對于血液為等滲狀態(tài)。
這些配制劑中活性化合物的重量可根據(jù)患者、或所治療的宿主動物種類、感染的嚴(yán)重性及類型、宿主的體重等而變化。通常，口服給藥的一劑為約0.001-10mg活性化合物/kg患者或動物的體重，單次給藥或在1-5天內(nèi)分次給藥。但有時可由醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)臨床癥狀確定較高或較低的劑量。
或者，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物也可以與動物飼料一起給藥，為此，可制備濃縮的食物添加劑或預(yù)混劑以便與常規(guī)動物飼料混合。
當(dāng)作為殺蟲劑使用，及用于處理農(nóng)業(yè)害蟲時，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的除蟲菌素化合物也可以按標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)實踐以噴霧劑，粉劑，乳劑和類似形式來使用。
6.實施例除蟲鏈霉菌的發(fā)酵及除蟲菌素B2∶B1的分析如果發(fā)酵培養(yǎng)基中不補(bǔ)充脂肪酸，則既缺失支鏈2-氧酸脫氫酶又缺失5-0-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的菌株將不產(chǎn)生除蟲菌素。該實施例證實這類突變株在有不同脂肪酸的條件下啟動生物合成時，可獲得很寬范圍的除蟲菌素B2∶B1比例。
6.1.材料及方法除蟲鏈霉菌ATCC 53692儲存在-70℃的全肉湯接種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成為淀粉(Nadex，Laing National)-20g；Pharmamedia(Trader′sProtein，Memphis，TN)-15g；Ardamine pH(Yeast Products Inc.)-5g；碳酸鈣-1g。終體積用自來水調(diào)整為1升，pH調(diào)整至7.2，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌25分鐘。
取2ml上述制劑的解凍后懸浮液接種到一個含有50ml同樣培養(yǎng)基的燒瓶中。以180rpm在旋轉(zhuǎn)振蕩器上28℃培養(yǎng)48小時后，取2ml肉湯接種到一個含有50ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的燒瓶中，該培養(yǎng)基含有淀粉-80g；碳酸鈣-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氫二鉀-1g；硫酸鎂-1g；谷氨酸-0.6g；七水合硫酸亞鐵-0.01g；硫酸鋅-0.001g；硫酸亞鎂-0.001g。終體積用自來水調(diào)整為1升，pH調(diào)整至7.2，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌25分鐘。
將不同的羧酸底物(見表1)溶于甲醇中并在接種24小時后添加到發(fā)酵液中使終濃度為0.2g/l。將該發(fā)酵液于28℃培養(yǎng)14天，然后離心(2,500rpm，2分鐘)，去除上清。菌絲沉淀用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)提取，分離有機(jī)相，過濾，然后蒸發(fā)使之干燥。殘余物用1ml甲醇吸收，并用配有掃描二極管陣列檢測器的Hewlett-Packard 1090A液相色譜在240nm進(jìn)行HPLC分析，所用柱子是保持在40℃的Beckman Ultrasphere C-18，5μm，4.6mm×25cm柱。將25μl上述甲醇溶液注入該柱子中。以0.85/ml min的流速，用甲醇-水從80∶20到95∶5的線性梯度洗脫40分鐘。用環(huán)己基B1的兩種標(biāo)準(zhǔn)濃度校準(zhǔn)檢測器的反應(yīng)，測量除蟲菌素B2及B1的曲線以下面積。
6.2.結(jié)果除蟲菌素B2和B1的HPLC滯留時間，及2∶1比例如表1所示。
表1
表1所列數(shù)據(jù)證實B2∶B1除蟲菌素的產(chǎn)生比有相當(dāng)寬的范圍，其表明根據(jù)所提供的脂肪酸側(cè)鏈起始物單元的性質(zhì)，2類化合物相對于1類化合物的脫水轉(zhuǎn)化結(jié)果有很大的差異。這指示由AveC蛋白的改變所致B2∶B1比例的改變只特異性針對具體底物。因此，對用具體底物獲得的B2∶B1比例發(fā)生變化的突變體進(jìn)行篩選時需要該底物的存在。下面這些例子描述了使用環(huán)己烷羧酸作為篩選底物。然而，該底物僅用于舉例說明本發(fā)明潛在的實用性，而不是有意要限制本發(fā)明。
7.實施例分離aveC基因本實施例描述了除蟲鏈霉菌染色體中編碼AveC基因產(chǎn)物的區(qū)域的分離及鑒定，如下文所證實，aveC基因經(jīng)鑒定能改變所產(chǎn)生的環(huán)己基B2對環(huán)己基B1除蟲菌素的比例(B2∶B1)。
7.1.材料與方法7.1.1.使鏈霉菌生長以便分離DNA下面的方法用于培養(yǎng)鏈霉菌。除蟲鏈霉菌ATCC 31272株單菌落(單菌落分離物#2)在1/2強(qiáng)度的YPD-6中分離，YPD-6含有Difco酵母提取物-5g；Difco細(xì)菌用胨-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；Difco細(xì)菌用瓊脂-15g，終體積用dH2O調(diào)整至1升，pH調(diào)整至7.0，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌25分鐘。
將上述培養(yǎng)基中生長的菌絲體接種到25mm×150mm試管中的10mlTSB培養(yǎng)基(Difco Tryptic Soy Broth-30g，在1升dH2O中，在121℃高壓滅菌25分鐘)中，在28℃以300rpm振蕩培養(yǎng)48-72小時。
7.1.2.從鏈霉菌中分離染色體DNA將如上所述生長的菌絲體取等份試樣(0.25ml或0.5ml)置于一個1.5ml的微量離心試管中，將細(xì)胞在12,000×g離心60秒而濃縮。去除上清液，使細(xì)胞重新懸浮于0.25ml TSE緩沖液(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1M Tris-HCl，pH8.0，2.5ml 1M EDTA，pH8.0，和75ml dH2O)中，該緩沖液含有2mg/ml溶菌酶。樣品在37℃振蕩培養(yǎng)20分鐘，上樣至AutoGen 540TM自動核酸分離儀(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，用Cycle 159(儀器軟件)按照操作手冊分離基因組DNA。
或者，將5ml菌絲體置于一個17mm×100mm的試管中，3,000rpm離心5分鐘使細(xì)胞濃縮，去除上清液。將細(xì)胞重新懸浮在1ml TSE緩沖液中，3,000rpm離心5分鐘使細(xì)胞濃縮，去除上清液。將細(xì)胞重新懸浮在含有2mg/ml溶菌酶的1ml TSE緩沖液中，37℃振蕩培養(yǎng)30-60分鐘。培養(yǎng)后，加入0.5ml 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，將細(xì)胞在37℃保溫，直到裂解完成。裂解產(chǎn)物在60℃保溫10分鐘，冷卻至室溫，分到兩個1.5mlEppendorf試管中，并用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，預(yù)先用0.5M Tris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取2到5次。通過加入1/10體積3M醋酸鈉，pH4.8沉降DNA，在冰中保溫混合物10分鐘，在15,000rpm，5℃將混合物離心10分鐘，將上清液移至干凈試管中，并在其中加入1倍體積的異丙醇。然后將上清液與異丙醇一起在冰中保溫20分鐘，在15,000rpm 5℃將混合物離心20分鐘，將上清液移除，用70％乙醇洗滌DNA粒狀沉淀物1次。在粒狀沉淀物干燥后，將DNA再懸浮于TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。
7.1.3.從鏈霉菌中分離質(zhì)粒DNA將一份菌絲體(1.0ml)置于一個1.5ml的微量離心試管中，12,000xg離心60秒濃縮細(xì)胞。去除上清液，細(xì)胞再懸浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg離心濃縮60秒，去除上清液。然后將細(xì)胞重新懸浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.25ml TSE緩沖液中，37℃振蕩保溫20分鐘，然后上樣至AutoGen 540TM自動核酸分離儀中。按照操作手冊，使用Cycle 106(儀器軟件)分離質(zhì)粒DNA。
或者，將1.5ml的菌絲體置于1.5ml微型離心試管中，12,000xg離心60秒濃縮細(xì)胞。去除上清液，細(xì)胞再懸浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000xg離心濃縮60秒，去除上清液。細(xì)胞重新懸浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.5ml TSE緩沖液中，37℃保溫15-30分鐘。保溫后，加入0.25ml堿性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)，55℃保溫15-30分鐘或直到溶液變清。將醋酸鈉(0.1ml，3M，pH4.8)加入到DNA溶液中，將其在冰中保溫10分鐘。DNA樣品在5℃14,000rpm離心10分鐘。將上清液移至干凈試管中，并在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚∶50％氯仿)并輕輕混和。DNA溶液在5℃以14,000rpm離心10分鐘，上清液移至干凈的Eppendorf試管中。加入異丙醇0.75ml，將溶液輕輕混和，然后在室溫下保溫20分鐘。將該DNA溶液在5℃以14,000rpm離心15分鐘，移除上清液，用70％乙醇洗滌DNA沉淀顆粒，干燥，再在TE緩沖液中重新懸浮。
7.1.4.從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA將單個大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌落在5ml Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(細(xì)菌用胨-10g，細(xì)菌用酵母提取物-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0，121℃高壓滅菌25分鐘，并添加100μg/ml氨芐青霉素)中保溫。將培養(yǎng)物過夜培養(yǎng)，將1μm等分試樣置于1.5ml微型離心試管中，將培養(yǎng)樣品載至AutoGen 540TM自動核酸分離器中，按照操作手冊，使用Cycle 3(儀器軟件)分離質(zhì)粒DNA。
7.1.5除蟲鏈霉菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化將除蟲鏈霉菌單菌落在1/2強(qiáng)度的YPD-6中分離。將菌絲體接種到25mm×150mm試管中的10ml TSB培養(yǎng)基中，在28℃以300rpm振蕩培養(yǎng)48小時。將1ml菌絲體接種至50ml YEME培養(yǎng)基。每升YEME培養(yǎng)基含有Difco酵母提取物-3g；Difco細(xì)菌用胨-5g；Difco Malt Extract-3g；蔗糖-300g。121℃高壓滅菌25分鐘后，加入下列物質(zhì)2.5M MgCl2·6H2O(單獨在121℃高壓滅菌25分鐘)-2ml；及甘氨酸(20％)(過濾除菌)-25ml。
將菌絲體30℃培養(yǎng)48-72小時，然后在50ml離心管(Falcon)中在3,000rpm下離心20分鐘收獲。去除上清液，菌絲體在P緩沖液中重新懸浮，P緩沖液含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl26H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl22H2O(3.68％)-100ml；及MES緩沖液(1.0M，pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH調(diào)至6.5，終體積調(diào)至1升，培養(yǎng)基用0.45微米濾膜熱過濾。
菌絲體以3,000rpm離心20分鐘得到粒狀沉淀，去除上清液，將菌絲體在含有2mg/ml溶菌酶的20ml P緩沖液中重新懸浮。菌絲體在35℃振蕩保溫15分鐘，經(jīng)顯微鏡鏡檢確定原生質(zhì)體的形成程度。當(dāng)原生質(zhì)體的形成結(jié)束時，將其在8,000rpm離心10分鐘。去除上清液，將原生質(zhì)體在10ml P緩沖液中重新懸浮。將原生質(zhì)體在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，將其在2ml P緩沖液中重新懸浮，將約1×109個原生質(zhì)體分配至2.0ml低溫小瓶(Nalgene)中。
含1×109個原生質(zhì)體的小瓶在8,000rpm離心10分鐘，去除上清液，原生質(zhì)體在0.1ml P緩沖液中重新懸浮。將2～5μg轉(zhuǎn)化的DNA加入到原生質(zhì)體中，接著加入0.5ml T工作液。T緩沖基質(zhì)含有PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml。用1N NaOH(已濾膜除菌)將pH調(diào)節(jié)至8.8，將T緩沖基質(zhì)經(jīng)濾膜過濾除菌，于4℃保存。T工作液(于使用當(dāng)天制備)是T緩沖基質(zhì)-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2·2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M，pH8)-0.5ml。 T工作液的每一組分均分別過濾除菌。
在20秒鐘內(nèi)將T緩沖液加入到原生質(zhì)體中，還加入1.0ml P緩沖液，然后將原生質(zhì)體在8,000rpm離心10分鐘。去除上清液后將原生質(zhì)體在0.1mlP緩沖液中重新懸浮。然后將原生質(zhì)體鋪板至RM14培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2.6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；Difco酪蛋白氨基酸-0.1g；Difco酵母提取物-5g；Difco燕麥瓊脂-3g；Difco細(xì)菌用瓊脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃高壓滅菌25分鐘。然后加入下列的無菌原液K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2.2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES緩沖液(1.0M，pH6.5)-10ml；痕量元素(同上)-2ml；環(huán)己酰亞胺原液(25mg/ml)-40ml；及1N NaOH-2ml。將25ml RM14培養(yǎng)基等分在每個平板上，這些平板在使用前都要干燥24小時。
原生質(zhì)體在濕度95％、溫度30℃保溫20-24小時。為了選擇硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化子，將含有125μg/ml硫鏈絲菌肽的1ml上層緩沖基質(zhì)均勻覆蓋在RM14再生平板上。每100ml上層緩沖基質(zhì)含有蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(與上相同)-0.2ml；及MES(1M，pH6.5)-1ml。原生質(zhì)體在濕度95％、溫度30℃保溫7-14天直到能觀察到硫鏈絲菌肽抗性(Thior)菌落。
7.1.6.變青鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化有些例子中用變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK64(由John Innes研究所，Norwich，U.K提供)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于變青鏈霉菌生長、原生質(zhì)化及轉(zhuǎn)化的方法和組合物如Hopwood等，1985，Genetic Manipulation ofStreptomyces，A Laboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，U.K.所述并遵照執(zhí)行。如上文7.1.3中所述從變青鏈霉菌轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA。
7.1.7.除蟲鏈霉菌菌株的發(fā)酵分析除蟲鏈霉菌的菌絲體在1/2強(qiáng)度的YPD-6上培養(yǎng)4-7天后，接種到含有8ml預(yù)制培養(yǎng)基及兩個5mm玻璃珠的1×6英寸試管中，預(yù)制培養(yǎng)基含有可溶性淀粉(為可溶性淀粉或KOSO，Japan Com Starch Co.，Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；Ardamine pH-5g/L(Champlain Ind.，Clifton，NJ)；CaCO3-2g/L；2x bcfa(″bcfa″指支鏈脂肪酸)，其在培養(yǎng)基中含有終濃度為50ppm的2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm的異丁酸，及20ppm的異戊酸。將pH調(diào)至7.2，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌25分鐘。
試管以17°角在29℃以215rpm振蕩培養(yǎng)3天。將種子培養(yǎng)物的2ml等分試樣接種到含有25ml生長培養(yǎng)基的300ml Erlenmeyer燒瓶中，該培養(yǎng)基含有淀粉(為可溶性淀粉或KOSO)-160g/L；Nutrisoy(Archer DanielsMidland，Decatur，IL)10g/L；Ardamine pH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4.4H2O-2g/L；FeSO4.7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4.7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L 2x bcfa(同上)；及環(huán)己烷羧酸(CHC)(在pH7.0制成20％的溶液)-800ppm。pH調(diào)至6.9，培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌25分鐘。
接種后，將燒瓶在29℃以200rpm振蕩培養(yǎng)12天。培養(yǎng)后，從燒瓶中取2ml樣品，用8ml甲醇稀釋，混合，混合物在1,250xg離心10分鐘以沉淀碎片。用Beckman Ultrasphere ODS柱(25cm×4.6mm ID)以0.75ml/min的流速進(jìn)行HPLC來分析上清液，檢測240nm的吸光度。流動相為86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。
7.1.8.除蟲鏈霉菌PKS基因的分離制備除蟲鏈霉菌(ATCC 31272，SC-2)染色體DNA的粘粒文庫并使其與由紅色糖多孢菌聚酮化合物合成酶(PKS)基因的片段制成的酮合成酶(KS)探針雜交。粘粒文庫的制備詳見Sambrook等，1989，同上。鏈霉菌染色體DNA文庫的制備詳見Hopwood等，1985，同上。帶有酮合成酶-雜交區(qū)域的粘粒菌落可通過與pEX26(由Dr.P.Leadlay，Cambridge，UK提供)的2.7KbNdeI/Eco47III片段雜交來識別。將約5ng pEX26用Ndel及Eco47III消化。將反應(yīng)混合物上樣至0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts，Rockland，ME)。電泳后從凝膠中切出2.7Kb的Nde1/Eco47III片段，用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。2.7Kb的Nde1/Eco47III片段使用BRL Nick翻譯系統(tǒng)(BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)按說明書進(jìn)行[α-32P]dCTP(脫氧胞苷5′-三磷酸鹽，四(三乙胺)鹽，[α-32P]-)(NEN-Dupont，Boston，MA)標(biāo)記。一個典型反應(yīng)在0.05ml體積中進(jìn)行。加入5μl終止緩沖液后，用G-25 Sephadex Quick SpinTMColumn(Boehringer Mannheim)按說明書將標(biāo)記的DNA分子與未發(fā)生摻入的核酸分子分離。
約1,800個粘粒菌落通過菌落雜交進(jìn)行篩選。鑒定出10個與紅色糖多孢菌KS探針強(qiáng)力雜交的菌落。將含有粘粒DNA的大腸桿菌菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用Cycle 3(儀器軟件)在AutoGen 540TM自動核酸分離器中按照操作說明分離每一培養(yǎng)物中的粘粒DNA。限制性核酸內(nèi)切酶作圖及Southern印跡雜交分析揭示五個菌落中含有重疊的染色體區(qū)域。五種粘粒(也即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)的除蟲鏈霉菌基因組BamH1酶切圖譜通過對重疊粘粒的分析及雜交進(jìn)行構(gòu)建(圖4)。
7.1.9.鑒定能調(diào)控除蟲菌素B2∶B1比例的DNA及鑒定aveC ORF以下方法用于測試來自pSE66粘粒克隆的亞克隆片段調(diào)控AveC突變株中除蟲菌素B2∶B1比例的能力。用Sac1及BamH1消化pSE66(5μg)。將反應(yīng)混合物上樣至0.8％SeaplaqueTMGTG瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)，電泳后從凝膠中切出2.9Kb的Sac1/BamH1片段，使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。約5μg穿梭載體pWHM3(Vara等，1989，J.Bacteriol.1715872-5881)用Sac1及BamHI消化。將約0.5μg所述2.9Kb插入子與0.5μg已消化的pWHM3混合，并按照廠商說明與1個單位的連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在15℃、總體積20μl中保溫過夜。保溫后，將5μl連接混合物在70℃保溫10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細(xì)胞(BRL)。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析可以證實2.9Kb Sac1/BamHI插入子的存在。該質(zhì)粒被命名為pSE119。
如上7.1.5部分所述，制備除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株(Pfizer內(nèi)部(in-house)菌株)的原生質(zhì)體并用pSE119轉(zhuǎn)化。1100-SC38株是一種突變體，當(dāng)補(bǔ)充環(huán)己烷羧酸時，相對于除蟲菌素環(huán)己基-B1形式，其產(chǎn)生明顯多的除蟲菌素環(huán)己基-B2形式(B2∶B1的比例大約是30∶1)。用于轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌原生質(zhì)體的pSE119從大腸桿菌GM2163株(得自Dr.B.J.Bachmann，Curator，E. coli Genetic Stock Center，Yale University)、大腸桿菌DM1株(BRL)、或變青鏈霉菌TK64株中分離。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化子并通過對發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析來進(jìn)行分析。除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的含有pSE119的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了比例已改變的除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基-B1，該比例大約是3.7∶1(表2)。
確定了pSE119能調(diào)控AveC突變體中的除蟲菌素B2∶B1的比例后，測出插入的DNA序列。按照操作手冊，使用質(zhì)粒DNA分離試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)，大約有10μg的pSE119被分離，然后用ABI 373A自動DNA測序儀(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行測序。用遺傳學(xué)計算機(jī)組程序(GCG，Madison，WI)組合和編輯測序數(shù)據(jù)。DNA序列及aveC ORF在圖1(SEQ ID NO1)中已經(jīng)列出。
如下構(gòu)建一種新的質(zhì)粒，命名為pSE118。用SphI及BamHI消化大約5μg的pSE66。將反應(yīng)混合物上樣至0.8％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上，電泳后從凝膠中切出2.8Kb的SphI/BamHI片段，使用FastProtocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)從凝膠中回收DNA。約5μg穿梭載體pWHM3用SphI及BamHI消化。將0.5μg 2.8Kb插入子與0.5μg已消化的pWHM3混合，在15℃、總體積20μl中按照廠商說明與1個單位的連接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)一起保溫過夜。保溫后，將5μl連接混合物在70℃保溫10分鐘，冷卻至室溫，按照操作手冊用于轉(zhuǎn)化受感態(tài)的大腸桿菌DH5α細(xì)胞。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析可以證實2.8Kb SphI/BamHI插入子的存在。該質(zhì)粒被命名為pSE118。pSE118及pSE119中的DNA插入子約有838個核苷酸重疊(圖4)。
除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的原生質(zhì)體用pSE118如上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化子并通過對發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析來進(jìn)行分析。除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的含pSE118的轉(zhuǎn)化株相對于1100-SC38株而言，除蟲菌素環(huán)己基B2∶環(huán)己基-B1的比例并未改變(表2)。
7.1.10.對除蟲鏈霉菌染色體DNA上aveC基因的PCR擴(kuò)增通過PCR擴(kuò)增法從除蟲鏈霉菌染色體DNA中分離含aveC ORF的～1.2Kb片段，所用引物根據(jù)從上所獲的aveC核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計。PCR引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。右向引物是5′-TCACGAAACCGGACACAC-3(SEQ ID NO6)；左向引物是5′-CATGATCGCTGAACCGAG-3′(SEQ ID NO7)。在由生產(chǎn)商所提供的緩沖液中，在有300μM dNTP，10％甘油，每種引物各200pmol，0.1μg模板及2.5單位酶，終體積100μl的條件下，用Deep VentTM聚合酶(New England-Biolabs)在Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。第一循環(huán)為95℃5分鐘(變性步驟)，60℃2分鐘(退火步驟)，72℃2分鐘(延伸步驟)。隨后24循環(huán)的溫度變化與此相似，但變性步驟的時間縮短至45秒且退火時間縮短至1分鐘。
PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳后，檢測到約1.2Kb的單一DNA帶。從凝膠中純化該DNA，并以1∶10摩爾的載體插入子比例與25ng線性化鈍端PCR-Blunt載體(Invitrogen)按照操作手冊進(jìn)行連接。按照操作手冊用該連接混合物轉(zhuǎn)化One ShotTM大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，該～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。該質(zhì)粒被命名為pSE179。
將pSE179中的DNA插入子通過BamHI/XbaI消化而分離，電泳分離，從凝膠中純化，并與已被BamHI/XbaI消化的穿梭載體pWHM3連接，該反應(yīng)中DNA總濃度為1μg，載體與插入子的摩爾比為1∶5。按照操作手冊用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，所述～1.2Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。該質(zhì)粒(被命名為pSE186(圖2，ATCC 209604))被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DM1中，并從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA。
7.2.結(jié)果鑒定出來自pSE119的2.9Kb SacI/BamHI酶切片段，當(dāng)其轉(zhuǎn)化至除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株中時，顯著地改變了B2∶B1除蟲菌素的產(chǎn)量比。一般情況下，除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的B2∶B1比約為30∶1，但當(dāng)用含有2.9Kb SacI/BamHI酶切片段的載體轉(zhuǎn)化時，除蟲菌素B2∶B1的比例減少至大約3.7∶1。對轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵后分析證實了轉(zhuǎn)化DNA的存在。
對2.9Kb pSE119片段進(jìn)行測序，鑒定了約0.9Kb的ORF(圖1)(SEQ IDNO1)，其包含一個已于他處發(fā)生突變而僅產(chǎn)生B2產(chǎn)物的PstI/SphI片段(Ikeda等，1995，同上)。該ORF或其相應(yīng)的推導(dǎo)多肽，與已知數(shù)據(jù)庫(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，并不表明其與已知DNA或蛋白序列有任何的同源性。
表2表示用不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的除蟲鏈霉菌1100-SC38株的發(fā)酵分析表2
8.實施例除蟲鏈霉菌aveC突變株的構(gòu)建本實施例描述用上述組合物及方法對幾種不同除蟲鏈霉菌aveC突變株的構(gòu)建。在鏈霉菌基因中引入突變的技術(shù)見Kieser及Hopwood，1991，Meth.Enzym.204430-458。詳見Anzai等，1988，J.Antibiot XLI(2)226-233和Stutzman-Engwall等，1992，J.Bacteriol.174(1)144-154。這些參考資料在此都被全文引用。
8.1.除蟲鏈霉菌AveC基因的失活含有失活的AveC基因的AveC突變株可通過下述的幾種方法構(gòu)建。在第一種方法中，將pSE119(上文第7.1.9所述質(zhì)粒)上aveC基因內(nèi)部的640bp SphI/PstI片段用紅色糖多孢菌的ermE基因(賦予紅霉素抗性)取代。ermE基因通過用BglII和EcoRI消化而從pIJ4026(來自John Innes Institute，Norwich，U.K.；還參見Bibb等，1985，Gene 41357-368)中分離，然后電泳，從凝膠中純化。將此約1.7Kb的片段連接到用BamHI和EcoRI消化的pGEM7Zf(Promega)中，將該連接混合物依照操作手冊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，所述約1.7Kb插入子的存在可以通過限制性分析證實。將該質(zhì)粒命名為pSE27。
pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphI及BamHI消化，將消化物電泳，從凝膠中純化約2.8Kb的SphI/BamHI插入子。pSE119用PstI和EcoRI消化，然后電泳，從凝膠中純化約1.5Kb的PstI/EcoRI插入子。將穿梭載體pWHM3用BamHI及EcoRI消化。pSE27用PstI和SphI消化。然后電泳，從凝膠中純化約1.7Kb的PstI/SphI插入子。將全部四種片段(即約2.8Kb，約1.5Kb，約7.2Kb，約1.7Kb)通過一個4步驟(4-way)連接反應(yīng)連接在一起。將該連接混合物依照操作手冊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析證實正確插入子的存在。該質(zhì)粒被命名為pSE180(圖3；ATCC209605)。
將pSE180轉(zhuǎn)化入變青鏈霉菌TK64細(xì)胞，用針對硫鏈絲菌肽和紅霉素的抗性鑒定轉(zhuǎn)化的菌落。從變青鏈霉菌中分離pSE180，用其轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌的原生質(zhì)體。鑒定出四種硫鏈絲菌肽抗性除蟲鏈霉菌轉(zhuǎn)化體，制備原生質(zhì)體并在非選擇性條件下將其鋪板至RM14培養(yǎng)基中。使原生質(zhì)體再生，然后篩選有紅霉素抗性而無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，其表明失活型aveC基因已整合在染色體上但游離復(fù)制子已丟失。鑒定出一個ErmrThios轉(zhuǎn)化體，將其命名為SE180-11菌株。從SE180-11株中分離總?cè)旧wDNA，用限制性酶BamHI，HindIII，PstI或SphI消化，在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與ermE探針進(jìn)行雜交。這些分析顯示，通過一個雙交換事件使得ermE抗性基因整合至染色體上并同時使640bpPstI/SphI片段缺失。對SE180-11株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析顯示不再產(chǎn)生正常的除蟲菌素(圖5A)。
在使aveC基因失活的第二種方法中，從除蟲鏈霉菌SE180-11株的染色體上取出1.7Kb的ermE基因，使得aveC基因中出現(xiàn)640bp PstI/SphI的缺失。如下構(gòu)建基因取代質(zhì)粒pSE180用XbaI進(jìn)行部分消化，從凝膠中純化約11.4Kb的片段。該約11.4Kb的帶缺少所述1.7Kb ermE抗性基因。將此DNA連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α細(xì)胞。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，正確插入子的存在可以通過限制性分析證實。將該質(zhì)粒(被命名為pSE184)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質(zhì)體。從SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體制備原生質(zhì)體，并在RM14上鋪板為單菌落。使原生質(zhì)體再生，然后篩選出無紅霉素抗性和硫鏈絲菌肽抗性的單菌落，其表明失活型aveC基因已整合在染色體上但含有ermE基因的游離復(fù)制子已缺失。鑒定出一個ErmsThios轉(zhuǎn)化子并命名為SE184-1-13。對SE184-1-13的發(fā)酵分析顯示正常除蟲菌素不再產(chǎn)生，且SE184-1-13具有與SE180-11相同的發(fā)酵特征。
在第三種使aveC基因失活的方法中，用PCR在第471位核苷酸C之后添加兩個G，導(dǎo)致在染色體aveC基因中引入移碼突變，從而創(chuàng)建一個BspE1位點。工程化EspE1位點的存在可用于檢測基因取代事件。PCR引物被設(shè)計為能在aveC基因中引進(jìn)移碼突變，所述引物由Genosys Biotechnologies公司提供。右向引物為5′-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3′(SEQ ID NO8)，左向引物為5′-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3′(SEQ ID NO9)。PCR條件如上第7.1.10節(jié)所述。666bp的PCR產(chǎn)物用Sph1消化，分別得到278bp及388bp的兩種片段。從凝膠中純化所述388bp的片段。
基因取代質(zhì)粒如下構(gòu)建穿梭載體pWHM3用EcoRI及BamHI消化。pSE119用BamHI及SphI消化，然后電泳，從凝膠中分離出約840bp的片段。pSE119用EcoRI及XmmI消化，電泳分離，從凝膠中純化約1.7Kb的片段。四種片段(也即～7.2Kb，～840bp，～1.7Kb及388bp)通過一個4步驟連接反應(yīng)連接在一起。將該連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析證實正確插入子的存在。將該質(zhì)粒(命名為pSE185)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DM1細(xì)胞，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株的原生質(zhì)體。分離1100-SC38菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，并通過對發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析來分析。當(dāng)pSE185轉(zhuǎn)化入除蟲鏈霉菌1100-SC38菌株中時，并未明顯改變除蟲菌素B2∶B1的比例(表2)。
用pSE185轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌原生質(zhì)體以在染色體aveC基因中產(chǎn)生一個移碼突變。從硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化株制備原生質(zhì)體，并在RM14培養(yǎng)基上鋪板為單菌落。使原生質(zhì)體再生，然后篩選無硫鏈絲菌肽抗性的單菌落。分離硫鏈絲菌肽敏感菌落的染色體DNA并通過PCR篩選整合至染色體中的移碼突變的存在。PCR引物根據(jù)aveC核苷酸序列設(shè)計，由GenosysBiotechnologies(Texas)公司提供。右向PCR引物為5′-GCAAGGATACGGGGACTAC-3′(SEQ ID NO10)，左向PCR引物為5′-GAACCGACCGCCTGATAC-3′(SEQ ID NO11)，PCR條件如上第7.1.10節(jié)所述。所獲PCR產(chǎn)物為543bp，當(dāng)用BspE1消化時，可檢測到三種片段368bp，96bp，及79bp，其表明失活型aveC基因的染色體整合及游離復(fù)制子的缺失。
對aveC基因上含有移碼突變的除蟲鏈霉菌突變株的發(fā)酵分析顯示，正常除蟲菌素不再產(chǎn)生，且這些突變株具有與SE180-11株及SE184-1-13株相同的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC特征。鑒定出一個Thios轉(zhuǎn)化株并命名為SE185-5a。
此外，在aveC基因上產(chǎn)生一個突變，其使第520位核苷酸由G變?yōu)锳，從而導(dǎo)致第116位上編碼色氨酸(W)的密碼子變?yōu)榻K止密碼子。攜帶此突變的除蟲鏈霉菌菌株不產(chǎn)生正常除蟲菌素且具有與SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的發(fā)酵特征。
此外，在aveC基因中產(chǎn)生突變，其導(dǎo)致(i)第970位核苷酸由G變?yōu)锳，使第256位氨基酸從甘氨酸(G)變?yōu)樘於彼?D)，(ii)第996位核苷酸由T變?yōu)镃，使第275位氨基酸從酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)。具有這些突變(G256D/Y275H)的除蟲鏈霉菌菌株并不產(chǎn)生正常除蟲菌素但具有與SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a菌株相同的發(fā)酵特征。
除蟲鏈霉菌aveC失活突變株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此處所提的其它菌株，為評估aveC基因中其它突變的影響提供了篩選工具。將含有野生型aveC基因的pSE186轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DM1細(xì)胞中，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA。用該pSE186 DNA轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11株。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，測定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物來分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化體。功能性aveC基因的反位(in trans)存在能將除蟲菌素的正常產(chǎn)量恢復(fù)到SE180-11株的水平(圖5B)。
8.2對改變B2∶B1比例的AveC基因中突變的分析如上所述，含有失活的aveC基因的除蟲鏈霉菌SE180-11菌株通過用含有功能性aveC基因的質(zhì)粒(pSE186)轉(zhuǎn)化而補(bǔ)充。SE180-11株也可用作宿主菌株來鑒定aveC基因的其它突變，如下所述。
從1100-SC38菌株中分離染色體DNA，并用作aveC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的模板。通過PCR擴(kuò)增分離1.2Kb ORF，擴(kuò)增所用引物根據(jù)aveC核苷酸序列來設(shè)計。右向引物為SEQ ID NO6，左向引物為SEQ ID NO7(見第7.1.10節(jié)所述)。PCR及亞克隆條件如第7.1.10節(jié)所述。1.2Kb ORF的DNA序列分析顯示了第337位核苷酸由C變?yōu)門的aveC基因突變，第55位的氨基酸由絲氨酸(S)變?yōu)楸奖彼?F)。將含有S55F突變的aveC基因亞克隆入pWHM3以產(chǎn)生一個質(zhì)粒，其被命名為pSE187，并用于轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質(zhì)體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，以確定紅霉素抗性的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物來分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化體。編碼第55位氨基酸之改變(S55F)的aveC基因的存在，能將正常的除蟲菌素產(chǎn)量恢復(fù)到SE180-11株的水平(圖5C)；但環(huán)己基B2∶環(huán)己基B2的比例約為26∶1，而用pSE186轉(zhuǎn)化的SE180-11株的B2∶B1比約為1.6∶1(表3)，表明該單突變(S55F)調(diào)節(jié)了環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的量。
鑒定出在aveC基因中的另一個突變，其使第862位核苷酸由G變?yōu)锳，從而第230位的氨基酸由甘氨酸(G)變?yōu)樘於彼?D)。含有該突變(G230D)的除蟲鏈霉菌菌株產(chǎn)生的除蟲菌素B2∶B1比例約為30∶1。
8.3.使B2∶B1比例下降的突變可以如下構(gòu)建減少環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基-B1的量的幾種突變。
鑒定出aveC基因中一個突變，其使第588位核苷酸由G變?yōu)锳，從而第139位的氨基酸由丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T)。將含有A139T突變的aveC基因亞克隆入pWHM3中，產(chǎn)生一個質(zhì)粒(命名為pSE188)，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11株的原生質(zhì)體。分離SE180-11株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，測定紅霉素抗性株的存在，通過HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物來分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化體。編碼氨基酸殘基139改變(A139T)的突變型aveC基因的存在能將除蟲菌素產(chǎn)量恢復(fù)至SE180-11株的水平(圖5D)；但B2∶B1的比例約是0.94∶1，這表明該突變減少了環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的量。該結(jié)果很意外，因為已公布的結(jié)果以及上述突變結(jié)果僅證明了aveC基因的失活或除蟲菌素B2型相對于B1型的產(chǎn)量增加(見表3)。
由于A139T突變以更利于B1的方式改變了B2∶B1的比例，因此構(gòu)建一個突變，其使第138位的氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘K氨酸。為此，pSE186用EcoRI消化并克隆入已用EcoRI消化的pGEM3Zf(Promega)中。該被命名為psE186a的質(zhì)粒用ApaI及KpnI消化，在瓊脂糖凝膠中分離DNA片段，從凝膠中純化兩種片段～3.8Kb及～0.4Kb。用pSE186的～1.2Kb DNA插入片段作PCR模板，誘導(dǎo)第585位核苷酸的單堿基改變。將PCR引物設(shè)計成在核苷酸585位能引進(jìn)一個突變，該引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物為5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3′(SEQ ID NO12)；左向PCR引物為5′-GGAACCGACCGCCTGATACA-3′(SEQ ID NO13)。使用Advantage GC基因組PCR試劑盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)，在由廠商提供的緩沖液中，在有200μM dNTPs，每種引物各200pmol，50ng模板DNA，1.0MGC-Melt及1個單位的KlenTaq聚合酶混合物的條件下，在終體積50μl中進(jìn)行PCR反應(yīng)。第一循環(huán)為94℃1分鐘；接下來以94℃30秒鐘及68℃2分鐘進(jìn)行25個循環(huán)；然后以68℃3分鐘進(jìn)行一個循環(huán)。將295bp的PCR產(chǎn)物用ApaI及KpnI消化以釋放一個254bp的片段，其通過電泳進(jìn)行分辨并從凝膠中純化。所有三種片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)用一個3步驟連接反應(yīng)連接在一起。將該連接混合物轉(zhuǎn)化入完整的大腸桿菌DH5c細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA，正確插入子的存在可以通過限制性分析確認(rèn)。該質(zhì)粒被命名為pSE198。
pSE198用EcoRI進(jìn)行消化，克隆進(jìn)已用EcoRI消化的pWHM3中，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認(rèn)正確插入子的存在。將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DM1，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析確認(rèn)正確插入子的存在。將這一命名為pSE199的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株原生質(zhì)體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化株，確定紅霉素抗性的存在，通過用HPLC法分析發(fā)酵產(chǎn)物而分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化株。編碼138位上氨基酸改變(S138T)的突變aveC基因的存在能將正常除蟲菌素產(chǎn)量恢復(fù)至SE180-11株的水平；然而，B2∶B1的比例為0.88∶1，表明了該突變減少了環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基-B1的量(見表-3)。該B2∶B1的比例甚至低于0.94∶1(這是用pSE188轉(zhuǎn)化SE180-11菌株而產(chǎn)生的A139T突變所觀察到的比例，如上所述)。
構(gòu)建另一個突變以同時在氨基酸位置138及139處引進(jìn)一個蘇氨酸。用pSE186的約1.2Kb DNA插入片段做PCR的模板。將PCR引物設(shè)計成能在核苷酸位置585及588處誘發(fā)突變，該引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。右向PCR引物為5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3′(SEQ ID NO14)；左向PCR引物為5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3′(SEQ ID NO15)。使用本節(jié)上述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。449bp的PCR產(chǎn)物用Apa1及Kpn1消化以釋放254bp的片段，其通過電泳進(jìn)行分辨并從凝膠中純化。將pSE186a用ApaI及KpnI消化，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，從凝膠中純化3.8Kb與0.4Kb的兩種片段。所有這三種片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)以3步驟連接反應(yīng)進(jìn)行連接，將該連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析確認(rèn)正確插入子的存在。該質(zhì)粒被命名為pSE230。
pSE230用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認(rèn)正確插入子的存在。將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析確認(rèn)正確插入子的存在。用這一命名為pSE231的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質(zhì)體。分離SE180-11的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，確定紅霉素抗性的存在，然后通過發(fā)酵分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化體。雙突變aveC基因(編碼S138T/A139T)的存在能使正常的除蟲菌素生產(chǎn)恢復(fù)到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例為0.84∶1，顯示該突變相對于pSE188或pSE199所轉(zhuǎn)化的SE180-11株所提供的降低作用而言，進(jìn)一步降低了環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基B1的產(chǎn)量(見表3)。
構(gòu)建另一突變，以便進(jìn)一步降低環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的產(chǎn)量。由于S138T/A139T突變能使B2∶B1之比向更利于B1的方向改變，因此構(gòu)建一種突變，使得能在第138位氨基酸處引入一個蘇氨酸并在第139位氨基酸處引入一個苯丙氨酸。用來自pSE186的約1.2kb DNA插入片段作為PCR的模板。將PCR引物設(shè)計為能在第585位核苷酸處引入突變(使T變?yōu)锳)，第588位核苷酸處引入突變(使G變?yōu)門)，第589位核苷酸處引入突變(使C變?yōu)門)，這些引物可由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。正向PCR引物為5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3’(SEQ ID NO16)；反向PCR引物為5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’(SEQ ID NO15)。PCR反應(yīng)用Advantage GC基因組PCR試劑盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)在廠家提供的緩沖液中進(jìn)行，所述緩沖液中有200μM dNTPs，每種引物各200pmol，50ng模板DNA，101mM乙酸鎂，1.0M GC-Melt和1個單位的Tth DNA聚合酶，終體積50μl。熱循環(huán)過程為，94℃1分鐘進(jìn)行第一個循環(huán)；然后94℃30秒和68℃2分鐘共25個循環(huán)；68℃3分鐘進(jìn)行一個循環(huán)。449bp的PCR產(chǎn)物用ApaI和KpnI消化，釋放出一個254bp的片段，將其通過電泳分離并在凝膠上純化。將所有三種片段(約3.8Kb，約0.4Kb和254bp)通過一個三步驟連接反應(yīng)連接在一起。將該連接混合無轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析證實正確插入子的存在。將該質(zhì)粒命名為pSE238。
pSE238用EcoRI消化，克隆至已被EcoRI消化的pWHM3質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析及DNA序列分析確認(rèn)正確插入子的存在。將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DM1中，從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性分析確認(rèn)正確插入子的存在。用這一命名為pSE239的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質(zhì)體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，確定紅霉素抗性的存在，然后通過對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析來分析ThiorErmr轉(zhuǎn)化體。雙突變aveC基因(編碼S138T/A139F)的存在能使正常的除蟲菌素生產(chǎn)恢復(fù)到SE180-11株的水平；但B2∶B1的比例為0.75∶1，表明該突變相對于如上述用pSE188，pSE199或pSE231轉(zhuǎn)化的SE180-11株所提供的降低作用而言，進(jìn)一步降低了環(huán)己基-B2相對于環(huán)己基B1的產(chǎn)量(見表3)。
表3
可利用DNA改組(shuffling)技術(shù)構(gòu)建另外的突變，以進(jìn)一步降低環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的產(chǎn)量，所述技術(shù)如Stemmer，1994，Nature 370389-391；Stemmer，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751所述；還可詳見美國專利5605793，5811238，5830721和5837458。
將含有突變型aveC基因的DNA改組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的dam dcm大腸桿菌細(xì)胞中。從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，用于轉(zhuǎn)化除蟲鏈霉菌SE180-11菌株的原生質(zhì)體。分離SE180-11菌株的硫鏈絲菌肽抗性轉(zhuǎn)化體，從中篩選能產(chǎn)生除蟲菌素但其環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1之比為1∶1或更低的那些轉(zhuǎn)化體。測定能產(chǎn)生除蟲菌素但其B2∶B1之比為1∶1或更低的那些轉(zhuǎn)化體中質(zhì)粒DNA的DNA序列。
鑒定出8株轉(zhuǎn)化體，其產(chǎn)生的環(huán)己基B2相對于環(huán)己基B1的量減少。這些轉(zhuǎn)化體中最低B2∶B1之比為0.40∶1(表4)。分離這8種轉(zhuǎn)化體每一種的質(zhì)粒DNA，測定其DNA序列以便鑒定aveC基因中的突變。所述突變?nèi)缦隆?br> pSE290包含4個核苷酸突變，即第317位的核苷酸從T變?yōu)锳，第353位的核苷酸從C變?yōu)锳，第438位的核苷酸從G變?yōu)锳，第1155位的核苷酸從T變?yōu)锳。第317位核苷酸的改變使得第48位的氨基酸由D變?yōu)镋，第438位核苷酸的改變使得第89位的氨基酸由A變?yōu)門。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.42∶1(表4)。
pSE291包含4個核苷酸突變，即第272位的核苷酸從G變?yōu)锳，第585位的核苷酸從T變?yōu)锳，第588位的核苷酸從G變?yōu)锳，第708位的核苷酸從G變?yōu)锳。第585位核苷酸的改變使得第138位的氨基酸由S變?yōu)門，第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變?yōu)門，第708位核苷酸的改變使得第179位的氨基酸由G變?yōu)镾。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.57∶1(表4)。
pSE292包含與pSE290相同的4個核苷酸突變。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.40∶1(表4)。
pSE293包含6個核苷酸突變，即第24位的核苷酸從A變?yōu)镚，第286位的核苷酸從A變?yōu)镃，第497位的核苷酸從T變?yōu)镃，第554位的核苷酸從C變?yōu)門，第580位的核苷酸從T變?yōu)镃，第886位的核苷酸從A變?yōu)門。第286位核苷酸的改變使得第38位的氨基酸由Q變?yōu)镻，第580位核苷酸的改變使得第136位的氨基酸由L變?yōu)镻，第886位核苷酸的改變使得第238位的氨基酸由E變?yōu)镈。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.68∶1(表4)。
pSE294包含6個核苷酸突變，即第469位的核苷酸從T變?yōu)镃，第585位的核苷酸從T變?yōu)锳，第588位的核苷酸從G變?yōu)锳，第708位的核苷酸從G變?yōu)锳，第833位的核苷酸從C變?yōu)門，第1184位的核苷酸從G變?yōu)锳。此外，第173、174和175位的核苷酸已缺失。第469位核苷酸的改變使得第99位的氨基酸由F變?yōu)镾，第585位核苷酸的改變使得第138位的氨基酸由S變?yōu)門，第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變?yōu)門，第708位核苷酸的改變使得第179位的氨基酸由G變?yōu)镾。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.53∶1(表4)。
pSE295包含2個核苷酸突變，即第588位的核苷酸從G變?yōu)锳，第856位的核苷酸從T變?yōu)镃。第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變?yōu)門，第856位核苷酸的改變使得第228位的氨基酸由M變?yōu)門。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.80∶1(表4)。
pSE296包含5個核苷酸突變，即第155位的核苷酸從T變?yōu)镃，第505位的核苷酸從G變?yōu)門，第1039位的核苷酸從C變?yōu)門，第1202位的核苷酸從C變?yōu)門，第1210位的核苷酸從T變?yōu)镃。第505位核苷酸的改變使得第111位的氨基酸由G變?yōu)閂，第1039位核苷酸的改變使得第289位的氨基酸由P變?yōu)長。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.73∶1(表4)。
pSE297包含4個核苷酸突變，即第377位的核苷酸從G變?yōu)門，第588位的核苷酸從G變?yōu)锳，第633位的核苷酸從A變?yōu)镚，第1067位的核苷酸從A變?yōu)門。第588位核苷酸的改變使得第139位的氨基酸由A變?yōu)門，第633位核苷酸的改變使得第154位的氨基酸由K變?yōu)镋，第1067位核苷酸的改變使得第298位的氨基酸由Q變?yōu)镠。攜有該質(zhì)粒的細(xì)胞所產(chǎn)生的B2∶B1之比為0.67∶1(表4)。
表4
如下進(jìn)行另一輪DNA改組，以便使環(huán)己基-B2除蟲菌素的產(chǎn)量相對于環(huán)己基-B1除蟲菌素減少。
半合成改組用Maxygen Inc.的WO97/20078中所述的方法對最佳克隆進(jìn)行改組。在改組反應(yīng)中添加多個單獨的寡核苷酸，它們編碼與降低的B2∶B1比例最佳對應(yīng)的有益取代，它們的添加量是相對于aveC模板鏈為5摩爾過量。使所述寡核苷酸的每一核苷酸錯配的側(cè)翼為20個具有完美同一性(perfect identity)的核苷酸，以便確保在改組反應(yīng)期間的正確插入。寡核苷酸購自O(shè)peronTechnologies(Alameda，CA)。
除蟲鏈霉菌的HTP生長從轉(zhuǎn)化平板上挑取獨立的菌落，將其接種到96孔深孔接種板的200μlR5培養(yǎng)基(Kieser，T等，“Practical Streptomyces Genetics”，2000，Norwich，U.K.，John Innes Foundation)中，30℃振蕩培養(yǎng)。在每一孔中分配玻璃珠，以便分散菌絲體并給培養(yǎng)物通氣。在此期間，使培養(yǎng)物實現(xiàn)平穩(wěn)的密集生長。4-5天后，取20μl接種培養(yǎng)物分散到生產(chǎn)平板中，剩余的體積在加入甘油至終濃度為20％以后，作為主平板凍在-80℃。將生產(chǎn)平板在30℃潮濕環(huán)境中保溫12-14天。保溫5-8天后，這些菌株開始形成孢子。生產(chǎn)平板基本如輝瑞產(chǎn)品公司(Pfizer Inc.)的WO 99/41389所述來制備，不同僅在于添加1％瓊脂糖以確保固體表面。
提取以及ESI-MS/MS篩選將總量為1ml的乙酸乙酯加入每一孔中，室溫振蕩保溫20分鐘。回收約750μl乙酸乙酯相，轉(zhuǎn)移到96孔板中，蒸發(fā)過夜。將沉淀重懸于100μl甲醇1mM NaCl中，用96孔板模式的自動取樣器取5μl溶液注入質(zhì)譜儀中，不進(jìn)行液相層析或其它分離就直接分析流動注射相。通過電噴離子化作用(electrospray ionization)使化合物離子化，監(jiān)控兩個不同通道的兩輪MS/MS躍遷(transition)。B1鈉化離子(sodiated ion)的MS/MS躍遷是從m/z 921到m/z777，B2鈉化離子的MS/MS躍遷是從m/z 939到m/z 795。用Finnigan TSQ-7000，Micromass Quattro-LC質(zhì)譜儀和Leap Technology Twin-Pal自動取樣器進(jìn)行該高通量篩選。將每一孔位置上B1和B2各自的圖譜整合可以鑒定出熱點(hit)。
最后鑒定出57種新的氨基酸取代組合，它們可以產(chǎn)生0.35∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素(圖6)。其中一些新突變可以產(chǎn)生約0.30∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素；一些可以產(chǎn)生約0.25∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，還有一些可以產(chǎn)生約0.20∶1或更低比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。鑒定出2種新突變可以產(chǎn)生0.37或0.38的比例的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。
生物材料的保藏1998年1月29日，下列生物材料保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，保藏號為質(zhì)粒保藏號質(zhì)粒pSE180 209605質(zhì)粒pSE186 209604以上所引用的全部的專利，專利申請，及公開文獻(xiàn)在此全面引作參考。
本發(fā)明并不局限于本文所述具體實施方案的范圍，這些僅為本發(fā)明各個方面的個別舉例，功能上相當(dāng)?shù)姆椒敖M合物都屬于本發(fā)明的范圍。實際上，除了上述說明及示例外，從上述說明和附圖，本發(fā)明的各種變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是很明顯的。這些變化都將落入所附權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表<110>輝瑞產(chǎn)品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)<120>指導(dǎo)B2∶B1除蟲菌素比例的除蟲鏈霉菌基因<130>PC23034A<140>PC23034A<141>2002-02-12<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1229<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<220>
<221>CDS<222>(174)..(1085)<400>1tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg176Val1gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac 224Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr5 10 15gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg 272Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr20 25 30gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg 320Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val35 40 45
gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg 368Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp50 55 60 65ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu70 75 80ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg agc tgg cag agc ccg ctc atg aac 464Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn85 90 95tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val100 105 110ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt 560Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly115 120 125gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg gct 608Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala130 135 140 145ctg atc gtc acc gtg ctg tgc agc aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc 656Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys Ala150 155 160cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe165 170 175atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg 752Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly180 185 190atc agc gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly195 200 205gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu Val210 215 220 225tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu
230 235 240tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac 944Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn245 250 255tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc 992Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe260 265 270ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro275 280 285ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga 1085Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr290 295 300gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205acactcctcg gttcagcgat catg1229<210>2<211>303<212>PRT<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>2Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala1 5 10 15Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu20 25 30Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp35 40 45Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala50 55 60Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala65 70 75 80Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met85 90 95Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala100 105 110Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro
115 120 125Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser130 135 140Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys145 150 155 160Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe165 170 175Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser180 185 190Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser195 200 205Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu210 215 220Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp225230 235 240Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala245 250 255Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met260 265 270Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln275 280 285Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr290 295 300<210>3<211>1150<212>DNA<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220>
<221>CDS<222>(58)..(990)<400>3gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val1 5 10 15ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc 153Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly20 25 30
tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu35 40 45cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val50 55 60gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu65 70 75 80acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln85 90 95agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat 393Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn100 105 110gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln115 120 125ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc 489Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser130 135 140atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met145 150 155 160ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile165 170 175gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu180 185 190gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg 681Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu195 200 205acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val
210 215 220gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg225 230 235 240aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro245 250 255gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala260 265 270aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu275 280 285ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe290 295 300cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020Arg Pro Ala Ala Gly Tyr305 310gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140gcggccgggg1150<210>4<211>310<212>PRT<213>吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<400>4Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val1 5 10 15Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly20 25 30Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu35 40 45Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val
50 55 60Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu65 70 75 80Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln85 90 95Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn100 105 110Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln115 120 125Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser130 135 140Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met145 150 155 160Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile165 170 175Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu180 185 190Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu195 200 205Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val210 215 220Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg225 230 235 240Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro245 250 255Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala260 265 270Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu275 280 285Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe290 295 300Arg Pro Ala Ala Gly Tyr305 310<210>5<211>215<212>PRT<213>灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)<400>5Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val1 5 10 15Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp
20 25 30Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp35 40 45Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe50 55 60Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala65 70 75 80Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met85 90 95Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala100 105 110Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro115 120 125Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr130 135 140Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg145 150 155 160Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe165 170 175Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala180 185 190Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg195 200 205Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg210 215<210>6<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>6tcacgaaacc ggacacac 18
<210>7<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>7catgatcgct gaaccgag 18<210>8<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>8ggttccggat gccgttctcg 20<210>9<211>21<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>9aactccggtc gactcccctt c 21<210>10<211>19<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>10gcaaggatac ggggactac 19<210>11<211>18<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>11gaaccgaccg cctgatac 18
<210>12<211>43<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>12gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43<210>13<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>13ggaaccgacc gcctgataca 20<210>14<211>46<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>14gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc46<210>15<211>20<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>15ggaacatcac ggcattcacc 20<210>16<211>46<212>DNA<213>除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)<400>16gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc4權(quán)利要求
1.一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因，或質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上的除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列，或圖1(SEQ ID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但該核苷酸序列還包含突變，所述突變編碼相應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸位置上的氨基酸殘基的取代組合，所述突變使得除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中，野生型aveC等位基因已失活但能表達(dá)含所述突變型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞能產(chǎn)生除蟲菌素，且所產(chǎn)生的除蟲菌素中2類∶1類的比例相對于除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中僅表達(dá)野生型aveC等位基因的那些細(xì)胞所產(chǎn)生的比例而言降低，其中當(dāng)所述2類∶1類除蟲菌素為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述2類∶1類除蟲菌素的比例為0.35∶1或更低。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例為0.20∶1或更低。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述氨基酸取代組合包括選自下組的組合(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；(f)D48E，L136P，G179S，E238D；(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；(h)D48E，A61T，L136P，G179S；(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；(q)D48E，L136P，G179S，R250W；(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；(t)D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S；(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L；(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R1 63Q，G1 79S，E238D；(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ad)D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D；(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S；(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(an)D48E，A89T，S138T，G179S；(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；(au)D48E，A89T，L136P，G179S；(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
4.一種多核苷酸分子，其含有與除蟲鏈霉菌aveC等位基因，質(zhì)粒pSE186(ATCC 209604)上除蟲鏈霉菌AveC基因產(chǎn)物編碼序列，或圖1(SEQID NO1)所示除蟲鏈霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或其簡并變體，但該核苷酸序列還包含突變，所述突變編碼相應(yīng)于SEQ IDNO2氨基酸位置上的氨基酸殘基的取代組合，所述突變使得除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中野生型aveC等位基因已失活但能表達(dá)含所述突變型核苷酸序列的多核苷酸分子的那些細(xì)胞能產(chǎn)生除蟲菌素，且所產(chǎn)生的除蟲菌素中2類1類的比例相對于由除蟲鏈霉菌ATCC 53692株中僅表達(dá)野生型aveC等位基因的那些細(xì)胞所產(chǎn)生的比例降低，其中當(dāng)所述2類∶1類除蟲菌素為環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素時，所述2類∶1類除蟲菌素的比例降低到約0.40∶1或更低，且其中所述氨基酸取代的組合包含選自下組的組合(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
5.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1或4的多核苷酸分子。
6.一種產(chǎn)生除蟲鏈霉菌菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，所述突變導(dǎo)致AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼包含氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，所述AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合包含選自下組的組合(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；(f)D48E，L136P，G179S，E238D；(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；(h)D48E，A61T，L136P，G179S；(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；(q)D48E，L136P，G179S，R250W；(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；(t)D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S；(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L；(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ad)D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D；(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S；(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(an)D48E，A89T，S138T，G179S；(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；(au)D48E，A89T，L136P，G179S；(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
7.一種產(chǎn)生除蟲鏈霉菌菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，所述突變導(dǎo)致AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼包含氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，所述包含突變的aveC等位基因或其簡并變體的細(xì)胞能以0.35∶1或更低的比例產(chǎn)生環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述氨基酸取代組合包括選自下組的組合(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；(f)D48E，L136P，G179S，E238D；(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；(h)D48E，A61T，L136P，G179S；(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；(q)D48E，L136P，G179S，R250W；(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；(t)D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S；(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L；(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ad)D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D；(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S；(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(an)D48E，A89T，S138T，G179S；(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；(au)D48E，A89T，L136P，G179S；(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D 。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例為約0.20∶1或更低。
10.一種產(chǎn)生除蟲鏈霉菌菌株的方法，包括(i)使除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中的aveC等位基因突變，所述突變導(dǎo)致AveC基因產(chǎn)物中的氨基酸取代組合，或(ii)向除蟲鏈霉菌菌株的細(xì)胞中引入突變的aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼包含氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物，且其中所述氨基酸取代組合包含選自下組的組合(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
11.一種含有突變的除蟲鏈霉菌aveC等位基因或其簡并變體的鏈霉菌細(xì)胞，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自下組的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物(a)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(b)G40S，D48E，L136P，G179S，E238D；(c)D48E，L136P，R163Q，G179S；(d)D48E，L136P，R163Q，G179S，E238D；(e)D48E，L136P，R163Q，G179S，A200G，E238D；(f)D48E，L136P，G179S，E238D；(g)D48E，A61T，L136P，G179S，E238D；(h)D48E，A61T，L136P，G179S；(i)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(j)D48E，A61T，L136P，G179S，A198G，P202S，E238D，P289L；(k)D48E，A61T，L136P，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(l)D48E，L136P，G179S，A198G，E238D，P289L；(m)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，A198G，P289L；(n)D48E，L84P，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，P289L；(o)Y28C，D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D；(p)D48E，A61T，A107T，S108G，L136P，G179S，S192A，E238D，P289L；(q)D48E，L136P，G179S，R250W；(r)D48E，A89T，S138T，A139T，R163Q，G179S；(s)D48E，L136P，G179S，A198G，P289L；(t)D48E，F(xiàn)78L，A89T，L136P，G179S；(u)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，E238D，F(xiàn)278L；(v)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(w)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，E238D，P289L；(x)D25G，D48E，A89T，L136P，S138T，A139T，V141A，I159T，R163Q，G179S；(y)D48E，A89T，S90G，L136P，R163Q，G179S，E238D；(z)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，E238D，P289L；(aa)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S；(ab)D48E，L136P，R163Q，G179S，S231L；(ac)D48E，L136P，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ad)D48E，A61T，A89T，F(xiàn)99S，S138T，A139T，G179S，E238D；(ae)G35S，D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，P289L；(af)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D；(ag)D48E，A89T，G111V，S138T，A139T，G179S，A198G，E238D；(ah)S41G，D48E，A89T，L136P，G179S；(ai)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，P252S；(aj)D48E，A89T，L136P，G179S，F(xiàn)234S；(ak)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S，E238D；(al)Q36R，D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(am)D48E，A89T，L136P，R163Q，G179S；(an)D48E，A89T，S138T，G179S；(ao)D48E，A89T，L136P，G179S，E238D；(ap)D48E，A89T，L136P，K154E，G179S，E238D；(aq)D48E，A89T，S138T，A139T，K154R，G179S，V196A，P289L；(ar)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(as)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，V196A，A198G，P289L；(at)D48E，A61T，S138T，A139F，G179S，G196A，E238D，P289L；(au)D48E，A89T，L136P，G179S；(av)D48E，A89T，V120A，L136P，G179S；(aw)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，A198G，E238D；(ax)D48E，A61T，A89T，G111V，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D；(ay)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；(az)D48E，A61T，A89T，L136P，S138T，A139F，G179S，A198G，E238D；(ba)D48E，A89T，S138T，A139F，G179S，A198G，V220A；(bb)D48E，A61T，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，R239H，P289L；(bc)D48E，A61T，A89T，L136P，G179S，P289L；(bd)D48E，A89T，S138T，A139T，G179S，V196A，E238D，P289L；和(be)D48E，A61T，A89T，S138T，A139F，G179S，V196A，E238D。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其為除蟲鏈霉菌細(xì)胞。
13.一種鏈霉菌細(xì)胞，其含有突變的除蟲鏈霉菌aveC等位基因或其簡并變體，所述突變的aveC等位基因或其簡并變體編碼含有選自下組的氨基酸取代組合的AveC基因產(chǎn)物(bf)D48E，S138T，A139T，G179S，E238D；和(bg)Y28C，Q38R，D48E，L136P，G179S，E238D。
14.一種由除蟲鏈霉菌細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的組合物，所述組合物在培養(yǎng)了細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素，且該培養(yǎng)基中的環(huán)己基B2∶環(huán)己基B1除蟲菌素的比例為0.35∶1或更低。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有編碼AveC基因產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子可被用于改變除蟲鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及除蟲鏈霉菌的載體、宿主細(xì)胞和突變菌株，其中AveC基因已失活或突變以改變所產(chǎn)生的除蟲菌素2類∶1類的比例或量。
文檔編號C12N1/21GK1630712SQ03803741
公開日2005年6月22日 申請日期2003年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月12日
發(fā)明者金·J·施圖茨曼-恩格沃爾, 克萊斯·E·D·古斯塔夫森, 安克·克雷伯, 森·A·雷拉德, 杰里米·S·明舒爾, 塞蘭·金, 陳燕 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司