專利名稱：生產(chǎn)左旋二酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文指NADPH)脫氫酶從2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮(下文指酮異佛爾酮(ketoisophorone))生產(chǎn)(6R)-2，2，6-三甲基-環(huán)己烯-1，4-二酮(下文指左旋二酮(levodione))的方法。左旋二酮是類胡蘿卜素(例如玉米黃素)合成中重要的中間體。
背景技術(shù)：
從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的微生物方法是已知的，見例如美國專利4,156,100。
我們卻意外發(fā)現(xiàn)用NADPH脫氫酶作為催化劑可從酮異佛爾酮形成左旋二酮。本發(fā)明方法中用作催化劑的NADPH脫氫酶一般都被稱為老黃酶(old yellow enzyme，OYE)，根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)所提供的酶命名法(Academic Press，1992)，它是酶E.C.1.6.99。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其包含在存在NADH或NADPH的含水(aqueous)培養(yǎng)基中令酮異佛爾酮接觸NADPH脫氫酶，并從所述反應(yīng)混合物分離所得左旋二酮。
本文所用術(shù)語“NADPH脫氫酶”包括能在NADH或NADPH存在時催化從酮異佛爾酮到左旋二酮的酶促反應(yīng)的蛋白，如根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會所提供的酶命名法分類為EC 1.6.99的老黃酶(OYE)。
本發(fā)明特別涉及從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其中催化所述反應(yīng)的NADPH脫氫酶是被限定為酶E.C.1.6.99的OYE。
本發(fā)明方法中用作催化劑的OYE可從適合生產(chǎn)所述酶的任何適宜微生物獲得或分離，所述微生物包括但不限于糖酵母菌屬(Saccharomyces)，接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，念珠菌屬(Candida)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，貝內(nèi)克菌屬(Beneckea)，或弧菌屬(Vibrio)。上述微生物也包括它們按照國際原核生物命名代碼(the Internatinal Code of Nomenclatureof Prokaryotes)所限定的具有相同物化性質(zhì)的同物異名體(synonym)或基原異名體(basonym)。
表達(dá)NADPH脫氫酶的轉(zhuǎn)化的微生物，如大腸桿菌(Escherichia coli)也可用作起始微生物。
本發(fā)明實(shí)施方案中，適合生產(chǎn)NADPH脫氫酶如OYE的微生物是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，10801 University Boulevard Manassas，VA20100-2209，U.S.A面向公眾發(fā)放的釀酒酵母S288C(ATCC 204508)?？捎帽娝苤募兓椒ㄖ苽渌雒?見Abramovitz，A.S.，& Massey.V.，J.Biol.Chem.251，5321-5326，1976)。本發(fā)明也可用所述微生物的功能等效物(Functional equivalent)，傳代培養(yǎng)物(subculture)，突變體(mutant)和變種(variant)。
本發(fā)明實(shí)施方案中，商品化的OYE(如，NADPH-FMN Oxidoreductase(Sigma，U.S.A.))可用于將酮異佛爾酮催化裂解為左旋二酮。
本發(fā)明優(yōu)選使用的OYE由分子量分別為45.0kDa和44.9kDa的OYE2和OYE3這兩個亞基組成。已驚訝發(fā)現(xiàn)OYE2和OYE3不僅能用NADPH，而且能用NADH作為輔因子來催化本發(fā)明的反應(yīng)。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種方法，其中用于催化酮異佛爾酮成為左旋二酮的反應(yīng)的OYE由來自釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因編碼。
本發(fā)明OYE在輔因子存在時根據(jù)下列公式催化酮異佛爾酮還原成為左旋二酮酮異佛爾酮+NADH(NADPH)左旋二酮+NAD(NADP)例如，標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)如下進(jìn)行向基礎(chǔ)(basal)反應(yīng)混合物(100μl的1MTris-HCl緩沖液，pH 8.0，100μl的80mM NADH，100μl的0.13M酮異佛爾酮，并用水補(bǔ)足到總體積1ml)中添加5μl所述酶溶液，并在20-40℃保溫5-300分鐘，優(yōu)選在25℃保溫30分鐘。用1ml有機(jī)溶劑如乙酸乙酯，正己烷，甲苯，或正丁基乙酸酯抽提所述反應(yīng)混合物，以使左旋二酮回收到(recover)所述有機(jī)溶劑層。用已知方法如氣相色譜，高效液相色譜，薄層色譜或紙色譜等分析所述抽提物。
在氣相色譜的情況下，可應(yīng)用如下條件作為一個實(shí)施方案柱ULBON HR-20M(Shinwa，Japan)0.25mmΦ×30m柱溫度160℃(恒定)注射器溫度250℃載氣(carrier gas)He(ca.1ml/min)所述反應(yīng)可在pH值約4.5-約8.5并有NADH或NADPH存在的溶劑中進(jìn)行，所述溶劑如Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液等。優(yōu)選，所述pH為5.0-8.0。
本發(fā)明涉及借助OYE從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其中所述反應(yīng)在pH值4.5-8.5及溫度20-40℃進(jìn)行。優(yōu)選，所述反應(yīng)在pH值5.0-8.0及溫度25-35℃進(jìn)行。
可根據(jù)所來源的微生物(例如釀酒酵母)的基因組序列信息，克隆編碼本發(fā)明OYE2和OYE3蛋白的基因，并在適宜的宿主生物如大腸桿菌中過表達(dá)所述基因。可用眾所周知的重組技術(shù)(見Molecular cloninga LaboratoryManual，2nd Edition/Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)制備所述表達(dá)NADPH脫氫酶的重組微生物，如大腸桿菌。
因此，本發(fā)明涉及從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其包括在存在NADH或NADPH的情況下，在含水培養(yǎng)基中將酮異佛爾酮接觸表達(dá)NADPH脫氫酶的重組微生物或其無細(xì)胞提取物，并從所述反應(yīng)混合物中分離所得左旋二酮。優(yōu)選，所述重組微生物是大腸桿菌。
本發(fā)明另一方面中，由重組微生物表達(dá)的NADPH脫氫酶是被限定為酶EC 1.6.99的OYE。
用于在重組微生物中進(jìn)行表達(dá)的OYE具體可以來自選自如下的微生物糖酵母菌屬，接合酵母屬，念珠菌屬，葡糖桿菌屬，貝內(nèi)克菌屬和弧菌屬或其功能等效物，傳代培養(yǎng)物，突變體和變種。所述OYE優(yōu)選來自釀酒酵母，更優(yōu)選釀酒酵母S288C(ATCC 204508)。最優(yōu)選的是由來自釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因編碼的OYE。
所述表達(dá)NADPH脫氫酶的重組微生物(例如大腸桿菌)可在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含糖類如葡萄糖或蔗糖，醇類如乙醇或甘油，脂肪酸如油酸，硬脂酸或其酯，或油類如菜籽油(rapeseed oil)或豆油(soybean oil)作為碳源；硫酸銨，硝酸鈉，蛋白胨，氨基酸，玉米漿(corn steep liquor)，麥麩，酵母提取物等等作為氮源；硫酸鎂，氯化鈉，碳酸鈣，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀等等作為無機(jī)鹽來源；以及麥芽提取物，肉提取物等等作為其他營養(yǎng)來源。可在有氧條件下進(jìn)行所述培養(yǎng)，一般是，在pH 3.0-9.0的培養(yǎng)基中于10-40℃培養(yǎng)1-7天。優(yōu)選在pH 5.0-8.0的培養(yǎng)基中于25-35℃培養(yǎng)2-4天。
OYE可用作從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的催化劑。在一個實(shí)施方案中，用重組微生物從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的反應(yīng)可在pH值約4.5-約8.5，在NADH或NADPH存在時，在溶劑(如Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液等等)中進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述反應(yīng)在pH 5.0-8.0進(jìn)行。
進(jìn)行所述反應(yīng)的一個優(yōu)選溫度范圍是20-40℃。當(dāng)分別設(shè)定所述pH和溫度在5.0-8.0及25-35℃時，所述反應(yīng)通常會產(chǎn)生最好的結(jié)果。
另一實(shí)施方案中，用重組微生物生產(chǎn)左旋二酮的反應(yīng)在pH值4.5-8.5和溫度20-40℃進(jìn)行。優(yōu)選在pH值為5.0-8.0并且溫度為25-35℃進(jìn)行所述反應(yīng)。
酮異佛爾酮在溶劑中的濃度可根據(jù)其他反應(yīng)條件變化，但通常在1mM-2M，優(yōu)選在10mM-100mM。
在所述反應(yīng)中，OYE也可以是用適宜載體固定的狀態(tài)。本領(lǐng)域通常已知的任何固定化酶方法痘可以使用。例如，所述酶可直接結(jié)合到膜，顆?；蝾愃频木哂幸换蚨鄠€功能基團(tuán)的樹脂上，或者可以通過具有一或多個功能基團(tuán)的橋連化合物(例如戊二醛)結(jié)合到樹脂上。
反應(yīng)后，可通過用有機(jī)溶劑抽提從所述反應(yīng)混合物回收左旋二酮，所述有機(jī)溶劑與水不互溶并很容易使左旋二酮溶解，如乙酸乙酯，正己烷，甲苯或正丁基乙酸酯。左旋二酮的進(jìn)一步純化可以是，通過濃縮所述抽提物來直接結(jié)晶左旋二酮，或通過組合多種色譜，例如，薄層色譜，吸附色譜，離子交換層析，凝膠過濾色譜或高效液相色譜來進(jìn)行純化。
下述實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1從釀酒酵母基因組DNA克隆oye2和oye3基因用乙酸鉀方法制備釀酒酵母S288C(ATCC 204508)基因組DNA。用所述制得的基因組DNA作為模板，用熱循環(huán)儀(Perkin Elmer 2400，U.S.A.)通過兩步(two-step)PCR方法獲得oye2和oye3的基因片段。所述PCR混合物(0.02m1)含每種引物5pmol，每種dNTP 0.312mM，和2.5U的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.LTD/Kyoto，Japan)。用100ng的釀酒酵母S288C(ATCC204508)的基因組DNA作為第一個PCR反應(yīng)的模板。在所述反應(yīng)后所述混合物用水稀釋為1∶20，并用它作為第二個PCR反應(yīng)的模板。對于第一個PCR，將98℃10秒，55℃30秒和72℃90秒的循環(huán)重復(fù)25次。對于第二個PCR，將98℃10秒，51℃30秒和72℃90秒的循環(huán)重復(fù)25次。
為克隆所述oye2基因，用如下引物進(jìn)行第一個PCR反應(yīng)OYE2-1(5′-CGGTCCAGATATAGAATAAATCATCATATTAAG-3′)(SEQ ID NO1)，和OYE2-2(5′-GAAATGGTGCTACAAAGTACGGTTAACAC-3′)(SEQ ID NO2)。此反應(yīng)擴(kuò)增了包含所述oye2基因的DNA片段(1250bp)。用下述引物進(jìn)行第二個PCROYE2-3(5′-TTAGAAGAATTCATGCCATTTGTTA-3′)(SEQ IDNO3)，和OYE2-4(5′-AGATTTCTGCAGTTAATTTTTGTCC-3′)(SEQ ID NO4)。
此反應(yīng)擴(kuò)增了僅包含所述oye2基因ORF的DNA片段(1200bp)。用EcoRI和PstI處理該擴(kuò)增的oye2基因，并與已用EcoRI和PstI消化的載體pKK223-3(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)連接來構(gòu)建質(zhì)粒pKK223-3/OYE2。用所述連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并選擇數(shù)個克隆來進(jìn)行序列分析。用“Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit”(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)和自動序列分析儀(ABIprism 377)測定每個待選克隆的克隆化oye2基因的序列。用于所述序列分析的引物如下PKK223-3(+)(5′-GACATCATAACGGTTCTGGCA-3′)(SEQ ID NO5)PKK223-3(-)(5′-TTATCAGACCGCTTCTGCGTT-3′)(SEQ ID NO6)OYE2-5(5′-GGTATCTGGTCCGAAGAACA-3′)(SEQ ID NO7)YE2-6(5′-GACACGAGGTTCAAGTAGATG-3′)(SEQ ID NO8)
選擇顯示與釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的已知oye2序列具有完全相同序列的克隆之一，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。為克隆所述oye3基因，用如下引物進(jìn)行第一個PCR反應(yīng)OYE3-1(5′-GTACGTACTTGATATATACAACAACTGTAG-3′)(SEQ ID NO9)和OYE3-2(5′-GCTGCCCTATATAAACAAAGATCGAGTC-3′)(SEQ ID NO10)。
此反應(yīng)擴(kuò)增了包含oye3基因的DNA片段(1250bp)。用下述引物進(jìn)行第二個PCROYE3-5(5′-TTAGAACAATTGATGCCATTTGTAA-3′)(SEQ ID NO11)OYE3-4(5′-AGATTTCTGCAGTCAGTTCTTGTT-3′)(SEQ ID NO12)。
此反應(yīng)擴(kuò)增了僅包含oye3基因ORF的DNA片段(1200bp)。用MfeI和PstI處理該擴(kuò)增的oye3基因，并與已用EcoRI和PstI消化的載體pKK223-3(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)連接來構(gòu)建質(zhì)粒pKK223-3/OYE3。用所述連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并選擇數(shù)個克隆來進(jìn)行序列分析。用“Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit”(Amersham Bioscience/Buckinghamshire，England)和自動序列分析儀(ABIprism 377)測定每個待選克隆的克隆化oye3基因的序列。用于所述序列分析的引物如下PKK223-3(+)(5′-GACATCATAACGGTTCTGGCA-3′)(SEQ ID NO13)PKK223-3(-)(5′-TTATCAGACCGCTTCTGCGTT-3′)(SEQ ID NO14)OYE3-6(5′-GACTGTGCATCTGACAGAGT-3′)(SEQ ID NO15)。
選擇顯示與釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的已知oye3序列具有完全相同序列的克隆之一，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2用含有釀酒酵母oye2或oye3基因的大腸桿菌菌株的無細(xì)胞提取物生產(chǎn)左旋二酮將在實(shí)施例1構(gòu)建的并分別包含oye2和oye3的完整DNA序列的質(zhì)粒pKK223-3/OYE2和pKK223-3/OYE3引入大腸桿菌JM109，獲得重組菌株JM109[pKK223-3/OYE2]和JM109[pKK223-3/OYE3]。
制備菌株JM109[pKK223-3]作為對照。將這些菌株中的每株接種到M9基本培養(yǎng)基(2×500ml，在2L-坂口瓶(Sakaguchi flask)中)中并在37℃培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含0.05mg/ml的氨芐青霉素和2％(w/v)的水解酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories，U.S.A.)。當(dāng)610nm的光密度達(dá)到0.4，將IPTG(異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside))加入所述培養(yǎng)基使其濃度為0.01mM，繼續(xù)培養(yǎng)另外的8-10小時。然后通過離心收集細(xì)菌細(xì)胞。從1升所述液體培養(yǎng)基獲得約10g濕細(xì)胞。取細(xì)胞組分(fraction)(0.7g)在1.4ml含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，200mM KCI和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的緩沖液中重懸，所述細(xì)胞用超聲震蕩器破裂15分鐘。離心后用所得上清作為無細(xì)胞提取物來如下生產(chǎn)左旋二酮。在1ml由25mM Tris-HCl(pH 8.0)，66mMNADH或55mM NADPH，和13mM酮異佛爾酮組成的反應(yīng)混合物中使用每份從JM109[pKK223-3/OYE2]，JM109[pKK223-3/OYE3]或JM109[pKK223-3]細(xì)胞獲得的含2mg蛋白的無細(xì)胞提取物。在25℃進(jìn)行所述反應(yīng)30分鐘。用1ml乙酸乙酯抽提所述反應(yīng)混合物來將左旋二酮回收到乙酸乙酯層。用氣相色譜[柱ULBON HR-20M(Shinwa，Japan)0.25mmΦ×30m，柱溫度160℃(恒定(constant))，注射器溫度250℃，載氣He(ca.1ml/min)]分析所述抽提物。所述結(jié)果見表1。
表1

在另一實(shí)驗(yàn)中結(jié)合使用JM109[pKK223-3/OYE2]的無細(xì)胞提取物和NADH-再循環(huán)系統(tǒng)，所述左旋二酮的產(chǎn)量達(dá)到95％。這種情況下，在由250mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.31mM NAD+，220mM D-葡萄糖，12.5單位/ml葡萄糖脫氫酶和65mM酮異佛爾酮組成的25ml反應(yīng)混合物中使用含30mg蛋白的JM109[pKK223-3/OYE2]的無細(xì)胞提取物。所述反應(yīng)在室溫進(jìn)行90分鐘。用7％氨水控制所述反應(yīng)混合物的pH高于7.0。結(jié)果產(chǎn)出了9.5g/l的左旋二酮(所用的酮異佛爾酮的95％被轉(zhuǎn)化)。用手性(chiral)毛細(xì)柱BGB-176(BGB AnalytikAG，Switzerland)通過氣相色譜分析所述產(chǎn)物的光純度，結(jié)果為94.6％(對映異構(gòu)體過量(enantiomeric excess)；e.e.)。
實(shí)施例3用具有釀酒酵母oye基因的大腸桿菌菌株細(xì)胞生產(chǎn)左旋二酮將實(shí)施例2所得菌株JM109[pKK223-3/OYE2]和JM109[pKK223-3]分別接種到含0.05mg/ml氨芐青霉素和2％(w/v)的水解酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories，U.S.A.)的M9基本培養(yǎng)基(5ml，在試管中)中并在37℃培養(yǎng)。當(dāng)610nm的光密度達(dá)到0.4，將IPTG加入所述培養(yǎng)基使其濃度為0.01mM并繼續(xù)培養(yǎng)另外8-10小時。然后通過離心收集所述細(xì)菌細(xì)胞，并在2ml 100mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中重懸。將此懸液分為兩份(每份1ml)，在有/無0.37mM(f.c.)NAD+，15單位/ml(f.c.)葡萄糖脫氫酶的情況下，通過加入33mM(終濃度，下文簡稱f.c.)酮異佛爾酮和280mM(f.c.)D-葡萄糖來啟動所述反應(yīng)。使所述反應(yīng)在30℃過夜進(jìn)行。通過乙酸乙酯抽提所述反應(yīng)混合物來將左旋二酮回收到乙酸乙酯層。如實(shí)施例1所述用氣相色譜來分析所述抽提物。結(jié)果見表2。
表2

序列表<110>羅氏維生素公司(Roche Vitamins AG)<120>生產(chǎn)左旋二酮的方法<130>21147<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-1<400>1cggtccagat atagaataaa tcatcatatt aag 33<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-2<400>2gaaatggtgc tacaaagtac ggttaacac 29<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-3<400>3ttagaagaat tcatgccatt tgtta 25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-4<400>4agatttctgc agttaatttt tgtcc 25<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(+)<400>5gacatcataa cggttctggc a 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(-)<400>6ttatcagacc gcttctgcgt t 21<210>7<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-5<400>7ggtatctggt ccgaagaaca20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE2-6<400>8gacacgaggt tcaactagat g 21<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-1<400>9gtacgtactt gatatataca acaactgtag 30<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-2<400>10gctgccctat ataaacaaag atcgagtc28
<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-5<400>11ttagaacaat tgatgccatt tgtaa 25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-4<400>12agatttctgc agtcagttct tgtt 24<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(+)<400>13gacatcataa cggttctggc a 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PKK223-3(-)<400>14ttatcagacc gcttctgcgt t 21<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OYE3-6<400>15gactgtgcat ctgacagagt20
權(quán)利要求
1.從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其包括在存在NADH或NADPH的情況下，使酮異佛爾酮在含水培養(yǎng)基中與NADPH脫氫酶接觸，并從所述反應(yīng)混合物分離所得到的左旋二酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述NADPH脫氫酶是被限定為酶EC 1.6.99的老黃酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酶可從適宜生產(chǎn)所述NADPH脫氫酶的微生物獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述微生物選自糖酵母菌屬，接合酵母屬，念珠菌屬，葡糖桿菌屬，貝內(nèi)克菌屬，或弧菌屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述微生物是釀酒酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述微生物是釀酒酵母S288C(ATCC 204508)，其功能等效物，傳代培養(yǎng)物，突變體或變種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述NADPH脫氫酶是由來自釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因所編碼的老黃酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其中所述反應(yīng)在pH值4.5-8.5和溫度20-40℃進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其中所述反應(yīng)在pH值5.0-8.0和溫度25-35℃進(jìn)行。
10.從酮異佛爾酮生產(chǎn)左旋二酮的方法，其包括在NADH或NADPH存在的情況下，使酮異佛爾酮在含水培養(yǎng)基中與表達(dá)NADPH脫氫酶的轉(zhuǎn)化的微生物或其無細(xì)胞提取物接觸，并從所述反應(yīng)混合物分離所得到的左旋二酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組微生物是大腸桿菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述NADPH脫氫酶是被限定為酶EC 1.6.99的老黃酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中由所述轉(zhuǎn)化的微生物表達(dá)的酶來自選自如下的微生物糖酵母菌屬，接合酵母屬，念珠菌屬，葡糖桿菌屬，貝內(nèi)克菌屬，或弧菌屬。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一所述的方法，其中由所述轉(zhuǎn)化的微生物表達(dá)的酶來自釀酒酵母，優(yōu)選釀酒酵母S288C(ATCC 204508)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14任一所述的方法，其中由所述轉(zhuǎn)化的微生物表達(dá)的NADPH脫氫酶為由來自釀酒酵母S288C(ATCC 204508)的oye2或oye3基因所編碼的老黃酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15任一所述的方法，其中所述反應(yīng)在pH值4.5-8.5和溫度20-40℃進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-15任一所述的方法，其中所述反應(yīng)在pH值5.0-8.0和溫度25-35℃進(jìn)行。
18.基本如本文上述的本發(fā)明，具體參照所述實(shí)施例。
全文摘要
本發(fā)明提供了烯酮還原酶，特別是來自酵母的烯酮還原酶，以及一種從酮異戊酯制備左旋二酮的方法，所述烯酮還原酶的特征在于，分子量為61,300±5,000Da；以NADPH和NADH為輔因子；在pH7.4時的最適溫度為55－60℃；最適pH為4.5－8.5，并且對α，β－不飽和酮有底物特異性。
文檔編號C12N15/09GK1639347SQ03804423
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者清水昌, 和田大 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)公司