專利名稱：檢測(cè)人乳頭瘤病毒mRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢查人類個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法。
發(fā)明情況宮頸癌是全世界最常見(jiàn)的惡性疾病之一，也是導(dǎo)致婦女生病和死亡的主要原因之一(Parkin DM，Pisani P，F(xiàn)erlay J(1993)Int J Cancer54594-606；Pisani P，Parkin DM，F(xiàn)erlay J(1993)Int J Cancer 55891-903)。據(jù)測(cè)美國(guó)1996年有15,700例侵襲性宮頸癌新病例，而世界衛(wèi)生組織(1990)估計(jì)全世界每年發(fā)病率達(dá)450,000人。世界不同地區(qū)的年發(fā)病率各有不同，西亞為7.6/100,000，而南非為46.8/100,000(Parkin等，1993，同上)。
目前人們對(duì)宮頸癌的理解是，該病是一種多階段疾病，通常發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10-25年。子宮頸侵襲性鱗狀上皮細(xì)胞癌的特征是，癌癥穿透基底膜并向基質(zhì)或上皮中層擴(kuò)散。宮頸癌的臨床過(guò)程變化很大。其預(yù)后與臨床階段、淋巴結(jié)受累、原位腫瘤大小、組織學(xué)類型、侵襲深度和淋巴滲入有關(guān)(Delgado G等，(1990)Gynecol Oncol 38352-357)。其腫瘤特征較少的一些患者結(jié)局相對(duì)較好，而其他患者對(duì)這種起初有限的疾病得到的卻是致命的結(jié)局。這表明的確還需要另外的標(biāo)記物，對(duì)剛診斷出來(lái)的宮頸癌作進(jìn)一步的鑒別，以便根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)程度給予相應(yīng)的治療方案(Ikenberg H等，Int.J.Cancer 59322-6 1994)。
宮頸癌的流行病學(xué)表明其與宗教、婚姻和性行為具有很強(qiáng)的相關(guān)性。對(duì)HPV和宮頸癌形成的關(guān)系已作過(guò)近100例案例對(duì)照研究，結(jié)果幾乎所有的研究例都發(fā)現(xiàn)正相關(guān)性(IARC專論，1995)。此相關(guān)性是強(qiáng)且一致，并對(duì)有限數(shù)量的病毒類型具有特異性(Munoz N，BoschFX(1992)HPV and cervical neoplasiaReview of case-control and cohortstudies(HPV和宮頸癌形成案例對(duì)照和群組研究綜述).IARC Sci Publ251-261)。在最能提供信息的研究當(dāng)中，觀察到侵襲性癌癥和高級(jí)CIN病變與HPV 16 DNA具有強(qiáng)相關(guān)性，且此相關(guān)性的一致性明顯，這就排除了此相關(guān)性可用偶然、偏見(jiàn)或混淆來(lái)解釋的可能性(IARC專論，1995)。間接證據(jù)表明，在癌細(xì)胞中檢測(cè)到的HPV DNA是HPV感染在癌發(fā)生早期的作用的良好標(biāo)記。不斷增加的病毒負(fù)荷與宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)之間的劑量響應(yīng)關(guān)系已有報(bào)道(Munoz和Bosch，1992同上)。在一些較大的系列中，高達(dá)100％的腫瘤為HPV陽(yáng)性，但對(duì)病毒陰性宮頸癌的存在仍有爭(zhēng)論(Meijer CJ等，1992 Detection of humanpapillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction inrelation to cytologypossible implications for cervical cancer screening(相對(duì)于細(xì)胞學(xué)方法，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)子宮頸刮片中人乳頭瘤病毒宮頸癌檢查的可能暗示).IARC Sci Publ 271-281；Das BC等，(1993)Cancer 72147-153)。
在鱗狀上皮細(xì)胞宮頸癌中最常發(fā)現(xiàn)的HPV類型是HPV16(41％-86％)和18(2％-22％)。此外還發(fā)現(xiàn)HPV31、33、35、39、45、51、52、54、56、58、59、61、66和68(IARC專論，1995)。在巴塞羅那舉辦的HPV2000國(guó)際會(huì)議中，認(rèn)定HPV16、18、31和45具有高風(fēng)險(xiǎn)，而HPV33、35、39、51、52、56、58、59、68具有中等風(fēng)險(xiǎn)(Keerti V.Shan.P71)。這13個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)和中等風(fēng)險(xiǎn)HPV一起通常被稱為癌相關(guān)HPV類型。
有許多研究探討了HPV檢測(cè)在宮頸癌檢查中的潛在作用(參看Cuzick等A systematic review of the role of human papillomavirustesting withing a cervical screening programme(關(guān)于宮頸癌檢查計(jì)劃中人乳頭瘤病毒檢測(cè)的作用的系統(tǒng)性綜述).Health Technol Assess314.1999)。
Reid等(Reid R等，(1991)Am J Obstet Gynecol 1641461-1469)最早證明HPV檢測(cè)在宮頸癌檢查中的作用。該研究是在來(lái)自性傳播疾病診所的高風(fēng)險(xiǎn)婦女和婦科?？漆t(yī)生身上進(jìn)行的，使用的是靈敏的(低嚴(yán)格性)Southern印跡雜交法進(jìn)行HPV檢測(cè)。該研究招募了1012名婦女，同時(shí)認(rèn)為子宮頸記錄法是輔助細(xì)胞學(xué)方法的一種可能手段。共發(fā)現(xiàn)23例CIN II/III病變，但只有12例通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)到(靈敏度52％，特異性92％)。HPV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)16例高級(jí)病變。
Bauer等(Bauer HM等，(1991)JAMA 265472-477)報(bào)告了一個(gè)基于PCR的使用MY09/11引物的早期研究(Manos M等，(1990)Lancet335734)，該研究的對(duì)象是參加常規(guī)涂片檢查的年輕婦女(大學(xué)生)。他們發(fā)現(xiàn)在467名婦女中陽(yáng)性率達(dá)46％，這比斑點(diǎn)印跡檢查的陽(yáng)性率(11％)要高得多。
在一個(gè)用GP5/6引物應(yīng)用PCR進(jìn)行的研究中(Van Den Brule AJ，等，(1990)J Clin Microbiol 282739-2743)van der Brule等(Van DenBrule AJ等，(1991)Int J Cancer 48404-408)表明，通過(guò)細(xì)胞學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)HPV陽(yáng)性與宮頸癌發(fā)生之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。在細(xì)胞學(xué)測(cè)試結(jié)果為陰性的年紀(jì)較大(35-55歲)的婦女中，HPV陽(yáng)性率只有3.5％，且如果只考慮HPV類型16、18、31和33時(shí)HPV陽(yáng)性率降低到1.5％，而患有原位組織癌的婦女均為HPV陽(yáng)性，且其中90％攜有上述四種HPV類型之一種。細(xì)胞學(xué)不正?，F(xiàn)象較不嚴(yán)重的婦女以分級(jí)的方式顯示HPV陽(yáng)性率較低，這表明了一種明顯的趨勢(shì)。
Roda Housman等(Roda Housman AM等，(1994)Int J Cancer56802-806)通過(guò)再觀察1373名涂片不正常的婦女?dāng)U大了以上觀察研究范圍。他們的研究也確認(rèn)，HPV陽(yáng)性率隨著涂片結(jié)果的嚴(yán)重性增加而提高。他們還注意到HPV不均勻性水平對(duì)低級(jí)涂片為22種類型，而對(duì)高級(jí)涂片則降到10種“高風(fēng)險(xiǎn)”類型。該文章沒(méi)有包括任何細(xì)胞學(xué)檢測(cè)陰性的婦女，也沒(méi)有對(duì)細(xì)胞學(xué)疾病進(jìn)行組織學(xué)確定。
Cuzick等(Cuzick J等，(1992)Lancet 340112-113；Cuzick J等，(1994)Br J Cancer 69167-171)首先報(bào)告HPV檢測(cè)可為對(duì)隨機(jī)檢查測(cè)出的細(xì)胞學(xué)不正常現(xiàn)象的治療類選提供有用的信息。在一個(gè)對(duì)133名婦女進(jìn)行的研究中，查閱陰道鏡檢查結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性預(yù)報(bào)值為42％，這近似中度核異常的值。結(jié)果在HPV16中表現(xiàn)得最明顯?；顧z組織檢查發(fā)現(xiàn)42名HPV16陽(yáng)性婦女中有39名患有高級(jí)CIN。該研究指出測(cè)試病毒負(fù)荷的重要性，且只認(rèn)定高風(fēng)險(xiǎn)類型的高水平為陽(yáng)性。
CoX等(Cox JT等，(1995)Am J Obstet Gynecol 172946-954)證明采用Hybrid CaptureTM系統(tǒng)進(jìn)行HPV檢測(cè)對(duì)分選涂片疑似的婦女的作用。該試驗(yàn)在217名來(lái)自大學(xué)問(wèn)訊處的上述婦女身上進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)CINII/III的靈敏度為93％，與之相比重復(fù)細(xì)胞學(xué)方法的靈敏度為73％。發(fā)現(xiàn)高病毒負(fù)荷可通過(guò)減低假陽(yáng)性來(lái)進(jìn)一步提高試驗(yàn)的效果。當(dāng)以5RLU為取舍點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)約24％的PPV，同時(shí)不喪失靈敏度。
Cuzick等(Cuzick J等，(1995)Lancet 3451533-1536)在1985名在計(jì)劃生育診所進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)的婦女身上評(píng)估了作為初期檢查的HPV檢驗(yàn)。對(duì)四種普通HPV類型使用類型特異性PCR的靈敏度(75％)超過(guò)使用細(xì)胞學(xué)方法的靈敏度(46％)，陽(yáng)性HPV檢驗(yàn)的PPV(42％)近似于中度核異常的PPV(43％)。
WO 91/08312描述了確定感染HPV的患者個(gè)體的預(yù)后的方法，該方法包括通過(guò)檢測(cè)樣品中全部或部分E6和/或E7 HPV基因的轉(zhuǎn)錄物來(lái)測(cè)定HPV活性水平，并將HPV活性測(cè)定值與預(yù)先確定的活性和發(fā)展為嚴(yán)重子宮頸異常增生或癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系相比較。
WO 99/29890描述了基于基因表達(dá)水平的測(cè)量和分析來(lái)評(píng)價(jià)HPV感染的方法。具體而言，WO 99/29890描述了這樣的方法，該方法基于測(cè)量?jī)煞N或多種HPV基因(如HPV E6、E7、L1和E2)的表達(dá)水平并比較這些基因的組合的表達(dá)比例，以給出對(duì)患者中HPV相關(guān)疾病的發(fā)展階段的標(biāo)志。
本發(fā)明發(fā)明人確認(rèn)，有可能只基于對(duì)HPV L1和E6 mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)進(jìn)行簡(jiǎn)單的陽(yáng)性/陰性確定，而不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)定或不需要確定兩種轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平的差異，就可以對(duì)HPV相關(guān)疾病作出在臨床上有用的評(píng)價(jià)。這種方法在技術(shù)上簡(jiǎn)便，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可進(jìn)行中至高通量型的自動(dòng)化操作。此外，在使用本發(fā)明方法獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明發(fā)明人制定了根據(jù)發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)個(gè)體進(jìn)行分類的新方案，該方案涉及HPV基因表達(dá)型式中與疾病相關(guān)的分子變化，而與CIN分類法無(wú)關(guān)。
因此，本發(fā)明第一方面提供了檢查人類對(duì)象以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，該方法包括檢查人乳頭瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，其中L1和/或全長(zhǎng)E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體認(rèn)定為有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明方法的陽(yáng)性檢查結(jié)果表示子宮頸的細(xì)胞中L1 mRNA和/或E6 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)。這兩種mRNA之一或兩者的陽(yáng)性表達(dá)可認(rèn)為是個(gè)體有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志。表達(dá)E6 mRNA的婦女發(fā)生細(xì)胞變化的風(fēng)險(xiǎn)高，因?yàn)橹掳┬訣6和E7能結(jié)合細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白并作為細(xì)胞增殖的開(kāi)關(guān)。E6 mRNA的明顯表達(dá)為子宮頸的細(xì)胞變化提供了一個(gè)直接的標(biāo)志。無(wú)論在E6 mRNA表達(dá)出現(xiàn)或不出現(xiàn)在情況下，L1 mRNA的表達(dá)也表示活性HPV的存在。
在子宮頸檢查的更廣的情況中，可選出鑒定為L(zhǎng)1和/或E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的婦女作進(jìn)一步的調(diào)查，例如用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行調(diào)查。因此，一方面本發(fā)明方法可提供對(duì)婦女人群進(jìn)行預(yù)篩查的技術(shù)簡(jiǎn)便的方法，以鑒別HPV陽(yáng)性個(gè)體來(lái)作進(jìn)一步的調(diào)查。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可用以基于L1和E6mRNA表達(dá)的陽(yáng)性/陰性評(píng)分將個(gè)體分成四種不同的發(fā)生宮頸癌的類型。
因此，本發(fā)明的又一方面提供了檢查人類個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，該方法包括檢查個(gè)體體內(nèi)HPV L1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物和HPV E6 mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，并根據(jù)L1和/或E6mRNA的表達(dá)按以下分類法將個(gè)體歸類于四類發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)之一風(fēng)險(xiǎn)類型1個(gè)體至少HPV類型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1 mRNA表達(dá)陰性但E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性。至少HPV類型16、18、31或33之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體例如與這些HPV類型表達(dá)陰性但至少HPV類型35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者相比，可認(rèn)定為處于高風(fēng)險(xiǎn)。
風(fēng)險(xiǎn)類型2個(gè)體至少HPV類型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性且E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性。至少HPV類型16、18、31或33之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者例如與這些HPV類型表達(dá)陰性但至少HPV類型35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者相比，可認(rèn)定為處于高風(fēng)險(xiǎn)。
風(fēng)險(xiǎn)類型3個(gè)體的癌相關(guān)HPV類型的L1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性但E6mRNA表達(dá)陰性(如HPV類型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66和68的E6 mRNA表達(dá)陰性)。
風(fēng)險(xiǎn)類型4個(gè)體L1 mRNA表達(dá)陰性且E6 mRNA表達(dá)陰性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，每ml(或樣品總體積)中存在超過(guò)50個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄物表示陽(yáng)性表達(dá)，每ml(或樣品總體積)中存在少于1個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄物表示陰性表達(dá)。
上述分類法基于與發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的分子事件，而與個(gè)體的CIN狀況無(wú)關(guān)。因此，此分類法可提供細(xì)胞學(xué)方法之外的另一方法，以對(duì)婦女進(jìn)行常規(guī)檢查，鑒別處于發(fā)生宮頸癌潛在風(fēng)險(xiǎn)的婦女。該方法也可用作細(xì)胞學(xué)方法的輔助方法，例如作為確證試驗(yàn)以確定基于細(xì)胞學(xué)方法作出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。
HPV類型16、18、31或33之一的高風(fēng)險(xiǎn)E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性但L1表達(dá)陰性的婦女發(fā)生嚴(yán)重細(xì)胞變化和細(xì)胞異常的風(fēng)險(xiǎn)水平很高。這是由于L1 mRNA表達(dá)的陰性結(jié)果直接表明存在整合型HPV，因此也表明E6和E7的高水平和恒定表達(dá)的可能性更高。HPV病毒在人基因組中的整合對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)定性也有直接影響。HPV的整合還降低細(xì)胞變化恢復(fù)的可能性。
HPV類型16、18、31或33之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性且L1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的婦女其HPV表達(dá)的“風(fēng)險(xiǎn)高”，HPV仍有可能被整合。但是，這些婦女的風(fēng)險(xiǎn)不分類得象L1陰性和E6陽(yáng)性的婦女的風(fēng)險(xiǎn)那樣高，因?yàn)橛欣碛勺C明她們可能沒(méi)有整合型HPV。
HPV類型16、18、31或33之一的E6 mRNA表達(dá)陰性但另一HPV類型如類型35、39、45、52、56、58、59、66和68的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的婦女仍可認(rèn)定是“有風(fēng)險(xiǎn)”，因此取決于她們的L1 mRNA表達(dá)是陽(yáng)性還是陰性，可將她們歸入風(fēng)險(xiǎn)類型1或2(如上定義)。
對(duì)L1 mRNA陽(yáng)性但E6 mRNA陰性的婦女評(píng)定為有中等風(fēng)險(xiǎn)。在樣品中可能存在高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型，L1表達(dá)則表明了裂解活性。也可能存在整合型HPV類型，但只有不常見(jiàn)的病毒類型整合。但是，裂解活性檢測(cè)可表明細(xì)胞將很快發(fā)生某些變化。
在子宮頸檢查更為廣泛的情況下，本發(fā)明方法可用以根據(jù)發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)婦女進(jìn)行分類，從而為作出有關(guān)治療和/或進(jìn)一步檢查的決定提供基礎(chǔ)。舉例說(shuō)明風(fēng)險(xiǎn)類型1的婦女、尤其是至少HPV類型16、18、31或33之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的婦女可鑒定為需要接受“立即行動(dòng)”，即進(jìn)行錐形切除術(shù)或陰道鏡檢查，包括活檢組織檢查和組織學(xué)檢查。
如上定義的風(fēng)險(xiǎn)類型2的婦女可評(píng)定為需要立即關(guān)注，即只需要陰道鏡檢查或陰道鏡檢查及包括活檢組織檢查和組織學(xué)檢查。
如上定義的風(fēng)險(xiǎn)類型3的婦女可評(píng)定為需要立即進(jìn)行再檢測(cè)，即立即或在相對(duì)較短的時(shí)間間隔之后(如6個(gè)月)召回進(jìn)行進(jìn)一步的HPV表達(dá)檢測(cè)。
如上定義的風(fēng)險(xiǎn)類型4的婦女可返回檢查計(jì)劃，在較長(zhǎng)的時(shí)間之后再進(jìn)行HPV表達(dá)復(fù)檢。
本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案提供了檢查人類個(gè)體中是否存在整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組的體外方法，該方法包括檢查個(gè)體中人乳頭瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，其中L1mRNA表達(dá)陰性但E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為攜帶整合型HPV。
術(shù)語(yǔ)“整合型HPV”指整合到人基因組的HPV基因組。
術(shù)語(yǔ)“修飾的游離型HPV基因組”意指HPV基因組作為以游離體保留在人個(gè)體細(xì)胞中，也即沒(méi)有整合到人基因組的HPV基因組，且其與相應(yīng)的野生型HPV基因組相比攜有修飾，所述修飾可導(dǎo)致E6和/或E7基因轉(zhuǎn)錄物的組成型表達(dá)或持續(xù)表達(dá)?！靶揎棥蓖ǔ槿笔?、游離體的多聚化或連環(huán)化、游離體的重排等，會(huì)影響E6/E7表達(dá)的調(diào)節(jié)。
如上所述，子宮頸細(xì)胞的L1 mRNA表達(dá)的陰性結(jié)果和E6 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果一起，表明存在整合型HPV基因組和修飾的游離型HPV基因組。因此，用本測(cè)試方法預(yù)測(cè)整合型HPV基因組或修飾的游離型HPV基因組存在的能力嚴(yán)格地取決于評(píng)價(jià)L1 mRNA表達(dá)的陰性結(jié)果的能力。這需要一種靈敏度盡量高，而又能產(chǎn)生盡量少的假陰性結(jié)果的檢測(cè)技術(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這可通過(guò)使用靈敏的擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)檢查L(zhǎng)1 mRNA是否存在來(lái)實(shí)現(xiàn)。最優(yōu)選的技術(shù)是使用分子信標(biāo)探針的實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增技術(shù)，Leone等，NucleicAcids Research.，1998，Vol 26，2150-2155對(duì)此進(jìn)行了描述。得益于此技術(shù)的靈敏度，假陰性結(jié)果的出現(xiàn)率減至最低，“陰性L1表達(dá)”的結(jié)果可以更高的置信度來(lái)評(píng)價(jià)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，檢查人類個(gè)體是否存在整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組的方法可基于只對(duì)E6 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢查。因此，本發(fā)明涉及檢查人類個(gè)體是否存在整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組的體外方法，該方法包括檢查個(gè)體的人乳頭瘤病毒E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，其中E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體認(rèn)定為攜帶整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組。
此外，可只基于對(duì)E6 mRNA的表達(dá)進(jìn)行“開(kāi)/關(guān)”確定，即可將各個(gè)體歸類于發(fā)生宮頸癌的兩類風(fēng)險(xiǎn)之一。因此，本發(fā)明提供了檢查人類個(gè)體以評(píng)價(jià)她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，所述方法包括檢查個(gè)體中HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)并基于E6mRNA的表達(dá)將個(gè)體歸類于發(fā)生宮頸癌的兩類風(fēng)險(xiǎn)之一，其中E6mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體認(rèn)定為攜帶整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組，因此歸類為有發(fā)生宮頸癌的“高風(fēng)險(xiǎn)”，而E6 mRNA表達(dá)陰性的個(gè)體認(rèn)定為不攜帶整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組，因此歸類為發(fā)生宮頸癌“無(wú)可檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)”。
可基于對(duì)子宮頸細(xì)胞中E6 mRNA的表達(dá)進(jìn)行“開(kāi)/關(guān)”確定，將個(gè)體歸類于發(fā)生宮頸癌的兩類風(fēng)險(xiǎn)之一。E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體認(rèn)定為攜帶整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組，因此歸類為有發(fā)生宮頸癌的“高風(fēng)險(xiǎn)”，而E6 mRNA表達(dá)陰性的個(gè)體認(rèn)定為不攜帶整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組，因此歸類為發(fā)生宮頸癌“無(wú)可檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)”。
在子宮頸檢查的情況下，將個(gè)體分為發(fā)生宮頸癌“有高風(fēng)險(xiǎn)”或“無(wú)可檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)”這兩類，可為作出有關(guān)治療和/或進(jìn)一步檢查的決定提供基礎(chǔ)。例如，歸類于高風(fēng)險(xiǎn)類的個(gè)體可認(rèn)定為需要立即進(jìn)行進(jìn)一步分析，如組織學(xué)陰道鏡檢查，而歸類于無(wú)可檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體可在三至五年后再參加檢查計(jì)劃。這些方法特別適用于評(píng)價(jià)已知感染HPV的個(gè)體(如HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性的個(gè)體)或先前通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法或派普斯涂片顯示子宮頸異常的個(gè)體發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)E6 mRNA表達(dá)歸類于“無(wú)可檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)”一類的個(gè)體可能攜有HPV DNA，但E6表達(dá)的陰性結(jié)果表明HPV與檢測(cè)時(shí)癌基因的活性無(wú)關(guān)。
E6 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果所表明的整合型HPV或修飾的游離型HPV基因組的存在本身就表明個(gè)體的子宮頸細(xì)胞發(fā)生異常。因此，本發(fā)明也涉及鑒定子宮頸細(xì)胞發(fā)生異常的人類個(gè)體的體外方法，該方法包括檢查個(gè)體中HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，其中E6mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體可鑒定為子宮頸細(xì)胞發(fā)生異常。
術(shù)語(yǔ)“子宮頸細(xì)胞異常”包括作為比低級(jí)子宮頸病變或低級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變更嚴(yán)重的疾病的特征的細(xì)胞變化，也包括作為與以下病變的嚴(yán)重性相當(dāng)或更重的疾病特征的細(xì)胞變化高級(jí)CIN(定義為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的瘤形成膨脹)、CIN(子宮頸上皮內(nèi)瘤形成)III或高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)瘤形成(HSIL)，包括具有多倍體DNA分布型的病變和平均DNA指數(shù)值提高、DNA-非整倍狀態(tài)百分比及2.5c Exceeding Rates“惡性”CIN病變(Hanselaar等，1992，Anal Cell Pathol.，4315-324；Rihet等，1996，J.Clin Pathol 49892-896；和McDermott等，1997，Br.J.Obstet Gynaecol.104623-625)。
子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(縮寫(xiě)“CIN”)也稱子宮頸異常增生，是一種人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的宮頸癌癥。根據(jù)其嚴(yán)重性，CIN可分為I、II和III類。其可認(rèn)為是癌變前異常，但實(shí)際上不屬于癌癥。CIN I為嚴(yán)重性最輕的類型，通常能自發(fā)消失，但在少數(shù)情況下會(huì)發(fā)展為癌癥。CIN II和CIN III為較為嚴(yán)重的類型，往往難以好轉(zhuǎn)或隨時(shí)間轉(zhuǎn)移而惡化。此兩類CIN可轉(zhuǎn)變成癌癥，但如能進(jìn)行適當(dāng)治療，則基本上不會(huì)轉(zhuǎn)變成癌癥。
HPV已被鑒定為子宮頸細(xì)胞發(fā)生變化的誘因，而子宮頸細(xì)胞變化會(huì)導(dǎo)致發(fā)生宮頸癌。這些細(xì)胞變化與HPV病毒基因組的E6/E7蛋白的組成型表達(dá)或持續(xù)表達(dá)有關(guān)。因此，有可能作出以下結(jié)論，即可檢出E6 mRNA表達(dá)的個(gè)體，尤其是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的評(píng)價(jià)表現(xiàn)出持續(xù)的E6表達(dá)的個(gè)體，其子宮頸已顯示發(fā)生細(xì)胞變化。這些變化可能只在子宮頸的極少數(shù)細(xì)胞中發(fā)生，不能通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)出來(lái)。但采用用以檢測(cè)E6 mRNA的靈敏、特異而準(zhǔn)確的方法，有可能在比采用常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查方法可能得出結(jié)果時(shí)間更早的階段鑒定子宮頸細(xì)胞顯示發(fā)生變化的個(gè)體。這使得可以采用旨在預(yù)防宮頸癌發(fā)展的療法進(jìn)行早期干預(yù)。
由于HPV整合到人基因組或由于修飾的游離型HPV基因組中的“修飾”，病毒E6/E7癌基因轉(zhuǎn)錄的正?？刂茊适?Durst等，1985，JGen Virol，66(Pt7)1515-1522；Pater和Pater，1985 Virology 145313-318；Schwarz等，1985，Nature 314111-114；Park等，1997，同上)。相反，在前惡性(premalignant)病變和HPV感染的正常上皮中乳突淋瘤病毒主要以“非修飾的”游離型形式存在，因此癌基因(E6/E7)轉(zhuǎn)錄可能不存在或被有效向下調(diào)節(jié)(Johnson等，1990，J Gen Virol，71(Pt7)1473-1479；Falcinelli等，1993，J Med Virol，40261-265)。據(jù)觀察，人乳頭瘤病毒類型16DNA整合到人基因組導(dǎo)致細(xì)胞活性/基因組更加不穩(wěn)定，而E6和E7 mRNA穩(wěn)定性卻提高(Jeon和Lambert，1995，ProcNatl Acad Sci USA 921654-1658)。因此，通常見(jiàn)于宮頸癌但只偶見(jiàn)于CIN病變的HPV整合(Carmody等，1996，Mol Cell Probes，10107-116)似乎是宮頸癌發(fā)展中的一個(gè)重要事件。
本發(fā)明方法檢測(cè)子宮頸中的E6/E7病毒mRNA表達(dá)而不是DNA。子宮頸細(xì)胞中E6/E7病毒表達(dá)是對(duì)發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的更為準(zhǔn)確的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，而不是僅僅表明存在HPV病毒，此外，HPV病毒癌基因轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)是癌癥發(fā)生中病毒癌基因的直接參與的一個(gè)更為靈敏的標(biāo)志(Rose等，1994，Gynecol Oncol，52212-217；Rose等，1995，Gynecol Oncol，56239-244)。通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)法檢測(cè)E6/E7轉(zhuǎn)錄物是對(duì)尤其是存在ASCUS和CIN I、感染高風(fēng)險(xiǎn)HPV類型的個(gè)體的CIN發(fā)展及演化為宮頸癌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一個(gè)有用的診斷工具(Sotlar等，1998，Gynecol Oncol，69114-121；Selinka等，1998，Lab Invest，789-18)。
HPV-16/18的E6/E7轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)一律與HPV DNA的物理狀態(tài)有關(guān)(Park等，1997，Gynecol Oncol，Vol65(1)，121-9)。在大多數(shù)宮頸癌細(xì)胞中特定人乳頭瘤病毒的E6和E7基因是從整合到宿主細(xì)胞染色體的病毒序列轉(zhuǎn)錄而來(lái)的(von Kleben Doeberitz等，1991，Proc NatlAcad Sci USA.Vol88(4)，1411-5)。已對(duì)一大系列的CIN病變的病毒負(fù)荷和整合進(jìn)行過(guò)評(píng)估(Pietsaro等，2002，J Clin Microbiol，Vol40(3)，886-91)。只有一個(gè)樣品獨(dú)獨(dú)含有游離型HPV 16 DNA，而此病變能自發(fā)回復(fù)。37個(gè)侵襲性宮頸癌樣品中有17個(gè)先前通過(guò)對(duì)整個(gè)E1/E2進(jìn)行PCR鑒定為含有完全整合型HPV16基因組，這在16個(gè)病例中通過(guò)rliPCR得以確證。但有一個(gè)病例除顯示出占主要地位的整合形式外，還顯示低水平的游離型脫氧核糖核酸。在余下的20個(gè)先前分析顯示游離型形式的癌樣品中，使用rliPCR發(fā)現(xiàn)有14個(gè)樣品含有整合形式，還有4個(gè)樣品含有多聚(修飾的)游離型形式。因此，37個(gè)癌樣品中共有31個(gè)(84％)顯示整合型HPV16基因組，而整合不存在的情況不能被檢出(Kalantari等，2001，Diagn Mol Pathol，Vol10(1)，46-54)。
基本上沒(méi)有觀察到不含整合型HPV或修飾的游離型HPV DNA的宮頸癌細(xì)胞(Kalantari等，2001；Pietsaro等，2002，同上)。另顯示E6和E7可只從整合的或修飾的游離型HPV DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)(von KlebenDoeberitz等，1991，同上)。因此，本發(fā)明發(fā)明人猜測(cè)，對(duì)E6/E7表達(dá)的檢測(cè)能提供有關(guān)整合型HPV或修飾的游離型HPV和高癌基因活性的直接指示，同時(shí)得出以下結(jié)論，即臨床上只對(duì)E6(E6/E7)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)就足以鑒定有發(fā)生宮頸癌的“高風(fēng)險(xiǎn)”的個(gè)體。換句話說(shuō)，如果在子宮頸樣品中能檢出E6/E7 mRNA表達(dá)，這直接表明子宮頸細(xì)胞發(fā)生異常，且由于持續(xù)的HPV癌基因活性，存在很高的發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在人類個(gè)體中檢測(cè)出E6/E7 mRNA表明該個(gè)體有很高的發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，需要立即進(jìn)行進(jìn)一步的檢查，如陰道鏡檢查。
如果個(gè)體未檢出E6/E7 mRNA表達(dá)，她仍可能感染HPV。但是由于不存在整合現(xiàn)象和癌基因活性，HPV感染可自發(fā)緩解(Pietsaro等，2002，同上，他們觀察到此現(xiàn)象)。
臨床上，只依賴于對(duì)E6 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢查的方法的效果嚴(yán)格地取決于以以一定的置信度評(píng)價(jià)E6 mRNA表達(dá)的陰性結(jié)果的能力。而這要求具有最大靈敏度、產(chǎn)生的假陰性結(jié)果又最少的檢測(cè)技術(shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這通過(guò)使用靈敏的擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)檢查E6 mRNA是否存在來(lái)實(shí)現(xiàn)。最優(yōu)選的技術(shù)為使用分子信標(biāo)探針的實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增技術(shù)，這在Leone等，Nucleic Acids Research.，1998，Vol 26，2150-2155中有描述。由于這個(gè)技術(shù)的靈敏度，假陰性結(jié)果的出現(xiàn)率減至最少，且“陰性E6表達(dá)”結(jié)果可以更高的置信度加以評(píng)價(jià)。如果測(cè)試需要用在臨床檢查情況下，這一點(diǎn)尤為重要。
在只基于檢測(cè)E6 mRNA的方法當(dāng)中，優(yōu)選至少檢測(cè)HPV類型16、18、31、33和45，且在優(yōu)選的實(shí)施方案中所進(jìn)行的測(cè)試可只檢測(cè)這些HPV類型。在超過(guò)87％的宮頸癌樣品中已檢出HPV類型16、18、31和33的DNA(Karlsen等，1996，J Clin Microbiol，342095-2100)。其他研究表明E6和E7幾乎總存在于宮頸癌中，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)可能是轉(zhuǎn)化到惡性狀態(tài)并維持該狀態(tài)所必須的(Choo等，1987，J MedVirol 21101-107；Durst等，1995，Cancer Genet Cytogenet，85105-112)。與基于檢測(cè)未受損害的基因組或L1基因序列的HPV檢測(cè)系統(tǒng)相反，對(duì)從E6/E7區(qū)域表達(dá)得到的HPV mRNA進(jìn)行檢測(cè)可檢出高于90％的患者直接有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
臨床上，基于檢測(cè)E6 mRNA的方法優(yōu)選用于后篩選檢查，即對(duì)先前診斷患有ASCUS、CIN I或濕疣的患者進(jìn)行進(jìn)一步的分析。該方法可用來(lái)從先前診斷患有ASCUS、CIN I或濕疣的患者中選出有發(fā)生宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)的患者。ASCUS、濕疣和CIN I的診斷結(jié)果可能或多或少會(huì)相同，因?yàn)椴煌募?xì)胞學(xué)者和不同的細(xì)胞學(xué)部門(mén)之間的再現(xiàn)性很低。str(Int J.Gyn Path.12186-192.1993)發(fā)現(xiàn)只有約1％的CIN I病例會(huì)演化成宮頸癌。因此，真正需要一個(gè)有效的方法來(lái)鑒定患有ASCUS、CIN I或濕疣且有很高的發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體群。Karlsen等，1996進(jìn)行的宮頸癌病例研究中有近87％的病例檢出HPV類型16、18、31或33之一。如加上HPV45，則發(fā)現(xiàn)近90％的宮頸癌樣品與這五種HPV類型有關(guān)。因此，從str(Int J.Gyn Path.12186-192.1993)提供的數(shù)據(jù)可計(jì)算出，超過(guò)99.9％的病例檢測(cè)到ASCUS、CIN I或濕疣病變，為其被我們的HPV-Proofer試劑盒漏檢。
本發(fā)明方法中，mRNA“陽(yáng)性表達(dá)”意指高于情況的表達(dá)。沒(méi)有嚴(yán)格要求對(duì)mRNA表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確的定量確定，也沒(méi)有嚴(yán)格要求對(duì)L1和E6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可包括對(duì)mRNA表達(dá)的定量測(cè)定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為對(duì)“陽(yáng)性表達(dá)”和“陰性表達(dá)”進(jìn)行明確的區(qū)分，需要存在多于50個(gè)拷貝的相關(guān)mRNA(每ml樣品或樣品的每個(gè)總體積)才能確定為“陽(yáng)性表達(dá)”，而“陰性表達(dá)”需要少于1個(gè)拷貝的相關(guān)mRNA(每ml樣品或樣品的每個(gè)總體積)才能確定。
本發(fā)明方法優(yōu)選涉及采用能特異性檢測(cè)癌癥相關(guān)HPV類型，更優(yōu)選“高風(fēng)險(xiǎn)”癌相關(guān)HPV類型的E6 mRNA的技術(shù)對(duì)E6 mRNA進(jìn)行檢查。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法涉及采用能檢測(cè)HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV 45的E6 mRNA的技術(shù)對(duì)E6mRNA進(jìn)行檢查。最優(yōu)選本發(fā)明方法能特異性檢測(cè)至少HPV類型16、18、31和33、優(yōu)選還有HPV 45之一的E6 mRNA的表達(dá)，最優(yōu)選能特異性檢測(cè)這五種類型的E6 mRNA的表達(dá)。但是，除類型16、18、31、33和45之外的類型(如類型35、39、45、52、56、58、59、66和68)的E6表達(dá)陽(yáng)性的婦女可能仍有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明方法最優(yōu)選除檢查HPV類型16、18、31、33和45的E6 mRNA外，還包括對(duì)上述HPV類型之一種或多種的E6 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢查。某些HPV類型表現(xiàn)出明顯的地區(qū)/人口分布規(guī)律。因此，除對(duì)HPV類型16、18、31、33和45進(jìn)行檢查外，還可適當(dāng)包括對(duì)測(cè)試人口/地區(qū)流行的HPV類型特異的引物。
為避免產(chǎn)生疑問(wèn)，除非另有指定，本文所用術(shù)語(yǔ)“E6 mRNA”包括所有天然存在的包含全部或部分E6開(kāi)放閱讀框的mRNA轉(zhuǎn)錄物，包括天然存在的剪接變體，并因此包括另外還含有全部或部分E7開(kāi)放閱讀框(確實(shí)是另外的開(kāi)放閱讀框)的mRNA轉(zhuǎn)錄物。術(shù)語(yǔ)“E6/E7mRNA”、“E6/E7轉(zhuǎn)錄物”等可與術(shù)語(yǔ)“E6 mRNA”、“E6轉(zhuǎn)錄物”互用，同時(shí)還包括含有全部或部分E6開(kāi)放閱讀框(包括天然存在的剪接變體)的天然存在的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及含有全部或部分E7開(kāi)放閱讀框的轉(zhuǎn)錄物。術(shù)語(yǔ)“癌基因表達(dá)”除非另有指定，也指含有全部或部分E6開(kāi)放閱讀框(包括天然存在的剪接變體)的天然存在的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及含有全部或部分E7開(kāi)放閱讀框的轉(zhuǎn)錄物。
至今已證明在感染HPV 16的細(xì)胞中有四種E6/E7 mRNA類型，即一種非剪接的E6轉(zhuǎn)錄物和三種剪接的轉(zhuǎn)錄物E6*I、E6*II和E6*III(Smotkin D等，J Virol.1989 Mar 63(3)1441-7；Smotkin D，Wettstein FO.Proc Natl Acad Sci US A.1986 Jul 83(13)4680-4；DoorbarJ.等，Virology.1990 Sep 178(1)254-62；Cornelissen MT等，J Gen Virol.1990 May 71(Pt 5)1243-6；Johnson MA等，J Gen Viro1.1990 Jul 71(Pt7)1473-9；Schneider-Maunoury S等，J Virol.1987 Oct 61(10)3295-8；Sherman L等，Int J Cancer.1992 Feb 50(3)356-64)。所有四種轉(zhuǎn)錄物都從例如位于E6 ORF的第二個(gè)ATG上游的單一啟動(dòng)子(p97)轉(zhuǎn)錄獲得。
本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案可包括檢查含有全部或部分E7開(kāi)放閱讀框的E6轉(zhuǎn)錄物。這可例如通過(guò)使用對(duì)E7編碼區(qū)特異的引物和探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可包括檢查是否存在“全長(zhǎng)”E6轉(zhuǎn)錄物。在HPV16的情況下術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)E6轉(zhuǎn)錄物”指含有E6 ORF中核苷酸(nt)97至nt880(包括nt97和nt880)區(qū)域全部的轉(zhuǎn)錄物。核苷酸位置按標(biāo)準(zhǔn)HPV命名法進(jìn)行編碼(參看Human PapillomavirusCompendium Online，可通過(guò)因特網(wǎng)獲取，或通過(guò)HV數(shù)據(jù)庫(kù)獲取紙本文件HV Database，Mail Stop K710，Los Almos National Laboratory，Los Almos，NM 87545，USA)。對(duì)全長(zhǎng)E6轉(zhuǎn)錄物的特異性檢測(cè)可例如通過(guò)使用對(duì)只出現(xiàn)于全長(zhǎng)E6轉(zhuǎn)錄物而不出現(xiàn)于剪接變體的區(qū)域特異的引物或探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。不同的HPV類型表現(xiàn)出不同的E6/E7 mRNA表達(dá)型式?？捎靡暂o助設(shè)計(jì)用于檢測(cè)E6/E7轉(zhuǎn)錄物的探針或引物的各種HPV類型(包括HPV類型16和31)的轉(zhuǎn)錄物圖可通過(guò)HumanPapillomavirus Compendium公開(kāi)獲得(見(jiàn)上)。
本文描述的E6寡核苷酸引物適用于通過(guò)NASBA或PCR對(duì)各種HPV類型的E6 mRNA的各區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及檢查L(zhǎng)1 mRNA表達(dá)的方法可包括使用能檢測(cè)幾乎所有已知HPV類型或至少主要的癌相關(guān)HPV類型(如優(yōu)選HPV類型16、18、31和33全部)的L1 mRNA的技術(shù)檢查L(zhǎng)1 mRNA的表達(dá)。本文描述的L1引物和探針能檢測(cè)子宮頸樣品中HPV類型6、11、16、18、31、33、35和51的L1 mRNA。
檢測(cè)L1轉(zhuǎn)錄物可以說(shuō)就是檢測(cè)HPV的“毒力”，即檢測(cè)HPV裂解活性的存在。檢測(cè)E6/E7轉(zhuǎn)錄物可以說(shuō)就是檢測(cè)HPV的“發(fā)病機(jī)理”，因?yàn)檫@些mRNA的表達(dá)能說(shuō)明與發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的分子事件。
在對(duì)4589名婦女的研究中，采用基于檢查E6和L1 mRNA表達(dá)的方法，能檢測(cè)到只有一例例外的CIN III病變或癌癥病例(參看附帶的實(shí)施例)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明上述方法除包括檢查HPV L1和/或E6轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)外，還包括檢查人p16ink4a基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
p16ink4amRNA表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果可作為發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的又一指標(biāo)。
p16ink4a及相關(guān)家族成員起到調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物(RB)的磷酸化和生長(zhǎng)抑制活性的作用。作為支持這一觀點(diǎn)的證據(jù)，已發(fā)現(xiàn)在經(jīng)選擇的癌細(xì)胞系中p16ink4a蛋白的表達(dá)和正常RB之間存在相反的關(guān)系；RB變異、缺失或失活時(shí)可檢出p16ink4a蛋白，而在含正常RB的細(xì)胞系中，p16ink4a明顯減少或不存在。Kheif等(KheifSN等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934350-4354.1996)發(fā)現(xiàn)p16ink4a蛋白在含變異RB或被E7功能性地失活的野生型RB的人宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)。他們還表示，RB的失活與p16ink4a的向上調(diào)節(jié)有關(guān)，證實(shí)了存在涉及p16ink4a和RB的反饋回路。Milde-Langosch等(Milde-Langosch K等，(2001)Virchows Arch 43955-61)發(fā)現(xiàn)p16強(qiáng)表達(dá)和HPV16/18感染之間以及p16強(qiáng)表達(dá)和HPV16/18 E6/E7癌基因表達(dá)之間有明顯的相關(guān)性。Klaes等(Klaes R等，(2001)Int J Cancer 92276-284)觀察到152例高級(jí)子宮頸異常增生病變(從CIN II到侵襲性癌癥)中有150例的p16ink4a基因產(chǎn)物存在強(qiáng)過(guò)量表達(dá)，而正常子宮頸上皮或炎癥或組織轉(zhuǎn)化病變用p16ink4a特異性單克隆抗體E6H4不能染色。所有與LR-HPV類型有關(guān)的認(rèn)定為CIN I的病變都沒(méi)顯示反應(yīng)性或只顯示病灶性的或零星的反應(yīng)性，而LR-HPV類型有關(guān)的認(rèn)定為CIN I的病變中除兩例外其余全部顯示對(duì)p16ink4a的強(qiáng)而擴(kuò)散性染色現(xiàn)象。
本文公開(kāi)的檢查方法可在從臨床樣品中分離得到的核酸制品上進(jìn)行，或在含采自受試對(duì)象的子宮頸細(xì)胞的活檢組織上進(jìn)行?？捎米骱怂醽?lái)源的合適樣品包括(但不限于)子宮頸拭樣、子宮頸活檢組織、子宮頸刮樣、皮膚活檢組織/疣，以及石蠟包埋的組織和福爾馬林或甲醇固定的細(xì)胞。
用本文公開(kāi)的方法進(jìn)行檢查的核酸制品必須包含mRNA，該制品不需要是純化的polyA+mRNA制品和總RNA制品或含RNA和基因組DNA的總核酸粗制品，甚至粗細(xì)胞裂解物也都可適用作NASBA反應(yīng)的原料。基本上本領(lǐng)域公知的任何分離核酸(包括mRNA)制品的技術(shù)都可用于分離測(cè)試樣品中的核酸。優(yōu)選的技術(shù)是US-A-5,234,809和EP-B-0389-063中描述的“Boom”分離方法。該方法可用以分離包含RNA和DNA的核酸制品，其根據(jù)是在離液劑硫氰酸胍(GuSCN)存在下二氧化硅顆粒吸附核酸的性質(zhì)。
本發(fā)明方法基于對(duì)子宮頸細(xì)胞中HPV基因組的活性轉(zhuǎn)錄的評(píng)價(jià)。本發(fā)明方法并不限制使用用以檢測(cè)mRNA表達(dá)的精確技術(shù)。許多檢測(cè)特定mRNA序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，可根據(jù)本發(fā)明加以采用。例如，特定mRNA可通過(guò)雜交、擴(kuò)增或測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
最優(yōu)選通過(guò)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)，所述擴(kuò)增技術(shù)最優(yōu)選等溫?cái)U(kuò)增，如NASBA、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增、RNA技術(shù)中的信號(hào)介導(dǎo)擴(kuò)增、等溫溶液相擴(kuò)增等。所有這些方法均為本領(lǐng)域所公知。更優(yōu)選mRNA表達(dá)能通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增并結(jié)合對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)。最優(yōu)選的結(jié)合方式是通過(guò)NASBA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)用分子信標(biāo)技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，這在Leone等，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155中有描述。
使用NASBA技術(shù)對(duì)測(cè)試樣品中的HPV進(jìn)行檢測(cè)的方法通常包括以下步驟(a)配制反應(yīng)介質(zhì)，所述介質(zhì)包括合適的引物對(duì)、RNA定向性DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜交體的RNA鏈但不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、能識(shí)別所述啟動(dòng)子的RNA聚合酶，以及核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸。
(b)在能進(jìn)行NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件下，將反應(yīng)介質(zhì)與從懷疑含HPV的測(cè)試樣品中分離的核酸制品一起溫育。
(c)檢測(cè)和/或定量測(cè)量NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的任何HPV特異性產(chǎn)物。
對(duì)NASBA反應(yīng)的特異性產(chǎn)物(即目標(biāo)RNA的正義和/或反義拷貝)的檢測(cè)可通過(guò)多種不同方法進(jìn)行。其中一個(gè)方法是，NASBA產(chǎn)物可通過(guò)使用能特異性退火到NASBA產(chǎn)物的HPV特異性雜交探針來(lái)檢測(cè)。雜交探針可以連接到顯示標(biāo)記，如熒光化合物標(biāo)記、發(fā)光化合物標(biāo)記、放射性化合物標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光化合物標(biāo)記或酶標(biāo)記，或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的其它標(biāo)記類型。標(biāo)記本身不需要很精確，但其本身或其與一種或多種另外的物質(zhì)(如酶底物)應(yīng)能產(chǎn)生可通過(guò)外部手段檢出的信號(hào)。
優(yōu)選的檢測(cè)方法是所謂的“實(shí)時(shí)NASBA”，該方法可連續(xù)監(jiān)測(cè)NASBA反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的形成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這可通過(guò)使用“分子信標(biāo)”探針來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述探針包括能退火到NASBA產(chǎn)物的HPV特異性序列、形成莖-雙鏈體的寡核苷酸序列和一對(duì)熒光劑/猝滅劑部分，這對(duì)本領(lǐng)域來(lái)說(shuō)是公知的，且在本文中已作描述。如果在擴(kuò)增前將分子信標(biāo)探針加入反應(yīng)混合物中，則可對(duì)NASBA產(chǎn)物的形成進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(Leone等，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155)。進(jìn)行實(shí)時(shí)NASBA檢測(cè)的試劑盒和儀器可通過(guò)商業(yè)途徑獲得(如Organon Teknika的NucliSensTMEasyQ System)。
另一方法是，分子信標(biāo)技術(shù)可結(jié)合到引物2寡核苷酸，使得不需要獨(dú)立的雜交探針就可對(duì)NASBA反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
又一方法是，NASBA反應(yīng)產(chǎn)物可使用能與引物2寡核苷酸的5′末端的核苷酸序列雜交的通用標(biāo)記檢測(cè)探針來(lái)監(jiān)測(cè)。這相當(dāng)于Organon Teknika提供的“NucliSensTM”檢測(cè)系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，通過(guò)使用包括如本文所述連接到固體載體如磁微珠的探針寡核苷酸的HPV特異性捕捉探針，可獲得對(duì)衍生于目標(biāo)HPV mRNA的NASBA產(chǎn)物的特異性。最優(yōu)選通用標(biāo)記檢測(cè)探針為Organon Teknika提供的ECLTM檢測(cè)探針。NASBA擴(kuò)增子與HPV特異性捕捉探針和通用ECL探針雜交(通過(guò)引物2上的互補(bǔ)序列)。雜交后微珠/擴(kuò)增子/ECL探針復(fù)合物可在自動(dòng)ECL閱讀器(如Organon Teknika提供的NucliSensTM閱讀器)的磁電極上被捕獲。然后電壓脈沖觸發(fā)ECLTM反應(yīng)。
HPV mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌之外的癌癥(包括例如頭頸部癌癥、口腔和舌頭癌癥、皮膚癌、肛門(mén)和陰道癌)也有臨床意義。HPV mRNA檢測(cè)對(duì)身體下部的淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移的診斷也十分有用。因此，本發(fā)明還考慮了根據(jù)對(duì)HPV L1和E6轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的檢查而檢查對(duì)上述癌癥的易感性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測(cè)HPV的L1和E6基因轉(zhuǎn)錄物的試劑盒，該試劑盒包括至少一種適用于擴(kuò)增至少HPV類型16、18、31和33、優(yōu)選還有HPV45的L1轉(zhuǎn)錄物的某個(gè)區(qū)域的引物對(duì)，以及一種或多種促使擴(kuò)增HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45的E6轉(zhuǎn)錄物的某個(gè)區(qū)域的引物對(duì)。
“引物對(duì)”意指通過(guò)使用任何已知的核酸技術(shù)可組合用于擴(kuò)增L1或E6 mRNA的特定區(qū)域的任何一對(duì)引物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒中所包括的引物對(duì)適用于NASBA擴(kuò)增或類似的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
構(gòu)成試劑盒所包括的每個(gè)引物對(duì)的各引物可分開(kāi)提供(如各引物由單獨(dú)的容器提供)，或更優(yōu)選可混合在一個(gè)容器中提供。兩種或多種引物的組合可在試劑盒的單個(gè)容器中現(xiàn)成混合來(lái)提供。如果兩種或多種擴(kuò)增反應(yīng)要“多重”，即在單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行，在單個(gè)容器中提供兩種或多種引物對(duì)較為方便。
適用于擴(kuò)增E6轉(zhuǎn)錄物的某個(gè)區(qū)域的引物對(duì)應(yīng)能擴(kuò)增至少主要的癌相關(guān)HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45的E6 mRNA的某個(gè)區(qū)域。有幾種不同的方法可實(shí)現(xiàn)此目的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可含有單獨(dú)的對(duì)各HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45特異的引物對(duì)。這些引物對(duì)可在試劑盒中的不同容器中提供，或在一個(gè)容器中作為兩種或多種引物對(duì)的混合物來(lái)提供，例如以促使擴(kuò)增反應(yīng)多重化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含能擴(kuò)增HPV16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45的E6基因的某個(gè)區(qū)域的單個(gè)引物對(duì)，因此所述引物對(duì)可在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增四種(優(yōu)選五種)HPV類型。這可例如通過(guò)使用一對(duì)簡(jiǎn)并引物或通過(guò)選擇對(duì)各HPV類型高度保守的E6mRNA的某個(gè)區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)。
E6引物對(duì)可對(duì)應(yīng)于E6 mRNA的任何區(qū)域，且可促使擴(kuò)增全部或部分E6開(kāi)放閱讀框和/或E7開(kāi)放閱讀框。
所述試劑盒可進(jìn)一步包括適用于擴(kuò)增HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45之外的HPV類型的E6 mRNA的引物對(duì)。例如，所述試劑盒可附加有用以檢測(cè)在特定地區(qū)或人口中地方性流行的HPV類型的E6引物。
適用于擴(kuò)增L1轉(zhuǎn)錄物的某個(gè)區(qū)域的引物對(duì)應(yīng)能擴(kuò)增至少主要的癌相關(guān)HPV類型16、18、31和33，優(yōu)選還有HPV45的L1 mRNA的某個(gè)區(qū)域，并優(yōu)選適用于擴(kuò)增基本上所有已知HPV類型的L1mRNA的某個(gè)區(qū)域。使用這樣的引物，則有可能在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)HPV類型的L1 mRNA的活性轉(zhuǎn)錄。
通過(guò)選擇高度保守的L1轉(zhuǎn)錄物區(qū)域，有可能設(shè)計(jì)能檢測(cè)多種HPV類型的L1轉(zhuǎn)錄物的引物。
在另一個(gè)方法中，對(duì)多種HPV類型的特異性可通過(guò)使用具有較小的序列變異、且變異優(yōu)選對(duì)應(yīng)于不同HPV基因型之間序列變異位點(diǎn)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物或多核苷酸復(fù)合混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用這樣的簡(jiǎn)并引物或引物混合物的基本原理在于引物混合物含有至少一個(gè)能檢測(cè)各HPV類型的引物對(duì)。
在又一個(gè)方法中，對(duì)多個(gè)HPV類型的特異性可通過(guò)優(yōu)選在引物的不同HPV基因型之間的序列變異位點(diǎn)加入一個(gè)或多個(gè)肌苷來(lái)實(shí)現(xiàn)。
E6和L1引物對(duì)可在試劑盒中的不同容器中提供，或L1引物對(duì)可在單個(gè)容器中與一種或多種E6引物對(duì)混合提供。
試劑盒可進(jìn)一步包含一種或多種適用于使用試劑盒所包含的引物對(duì)進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的探針。所述探針可作為試劑盒中的單獨(dú)試劑來(lái)提供。另外，所述探針也可作為與一種或多種引物對(duì)的混合物來(lái)提供。
試劑盒所包含的引物和探針優(yōu)選單鏈DNA分子。也可使用保留與互補(bǔ)核酸分子進(jìn)行堿基配對(duì)的能力的非天然的合成多核苷酸，包括添加了修飾堿基的合成寡核苷酸和其中各核苷酸之間的連接鍵包括除磷酸二酯鍵之外的鍵的合成寡核苷酸。引物和探針可按本領(lǐng)域公知的技術(shù)生產(chǎn)，如使用用以合成寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)儀器和方案通過(guò)化學(xué)方法合成。
引物和探針通常為長(zhǎng)度不大于100個(gè)堿基的分離單鏈多核苷酸，更通常為長(zhǎng)度不大于55個(gè)堿基。為避免發(fā)生疑問(wèn)，在此指出術(shù)語(yǔ)“引物”和“探針”不算天然存在的全長(zhǎng)HPV基因組。
在試劑盒中可包括幾種包含HPV特異型序列的普通類型的寡核苷酸引物和探針。通常，這樣的引物和探針可包含另外的非HPV序列，例如擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列或促進(jìn)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的序列。
第一類引物為引物1寡核苷酸(本發(fā)明也稱為NASBA P1引物)，這種寡核苷酸通常長(zhǎng)度約為50個(gè)堿基，在與目標(biāo)mRNA的某個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的3′末端平均含有約20個(gè)堿基。適用作NASBA P1引物的寡核苷酸在表1中表示為“P1/PCR”。P1引物寡核苷酸的一般結(jié)構(gòu)為X1-SEQ，其中SEQ表示HPV特異性序列，X1為包含能被特異性RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子的序列。噬菌體啟動(dòng)子，如T7、T3和SP6啟動(dòng)子優(yōu)選用于本發(fā)明寡核苷酸中，因?yàn)樗鼈冇修D(zhuǎn)錄水平高的好處，且轉(zhuǎn)錄只取決于合適的RNA聚合酶的結(jié)合情況。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列“X1”包括序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG或序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG。這些序列含有T7啟動(dòng)子，包括T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)。在表1中表示為“P1/PCR”的引物中的HPV特異性序列也適合用于標(biāo)準(zhǔn)PCR引物。當(dāng)這些序列用作NASBA P1引物的基礎(chǔ)時(shí)，它們?nèi)缟纤鼍哂蠿1-SEQ的一般結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子序列X1在NASBA P1引物中是必需的。但是，當(dāng)同樣的序列用作標(biāo)準(zhǔn)PCR引物的基礎(chǔ)時(shí)，沒(méi)有必要包括X1。
第二種類型的引物為NASBA引物2寡核苷酸(在本文也稱為NASBA P2引物)，其通常包含長(zhǎng)約20個(gè)堿基、基本上與目標(biāo)mRNA的某個(gè)區(qū)域等同的序列。表1中表示為“P2/PCR”的寡核苷酸序列適用于NASBA P2引物和標(biāo)準(zhǔn)PCR引物。
計(jì)劃用作NASBA P2引物的寡核苷酸在特定的但非限制性的實(shí)施方案中可進(jìn)一步包含與目標(biāo)mRNA無(wú)關(guān)但能與通用檢測(cè)探針雜交的5′末端核苷酸序列。檢測(cè)探針可優(yōu)選例如用熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記或酶標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)探針用容許使用ECLTM技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，但應(yīng)理解本發(fā)明并不限于這個(gè)特定的檢測(cè)方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物2寡核苷酸的5′末端可包含序列GATGCAAGGTCGCATATGAG。這個(gè)序列能夠與OrganonTeknika所售的通用ECLTM探針雜交，所述探針具有以下結(jié)構(gòu)Ru(bpy)32+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3′在另一不同的實(shí)施方案中，引物2寡核苷酸可結(jié)合“分子信標(biāo)”技術(shù)以允許對(duì)NASBA反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，所述技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，且在例如WO 95/13399及Tyagi和Kramer，Nature Biotechnology.14303-308，1996中有描述。
目標(biāo)特異性探針寡核苷酸也可包括在試劑盒中。探針寡核苷酸通常包含長(zhǎng)約20-25個(gè)堿基且與目標(biāo)mRNA或其補(bǔ)體的某個(gè)區(qū)域基本等同的序列。適用作探針的示例性HPV特異性寡核苷酸序列在表1中表示為“PO”。探針寡核苷酸可用作目標(biāo)特異性雜交探針，以檢測(cè)NASBA或PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。就此而言探針寡核苷酸可與固體載體如順磁珠相耦合形成捕捉探針(見(jiàn)下)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針寡核苷酸的5′末端可用生物素標(biāo)記。加入生物素標(biāo)記可促使探針通過(guò)生物素/鏈霉親和素或生物素/抗生物素蛋白連接結(jié)合到固體載體上。
能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)特異性探針可采用“分子信標(biāo)”技術(shù)，所述技術(shù)為本領(lǐng)域所公知且在例如Tyagi和Kramer，NatureBiotechnology.14303-308，1996及WO 95/13399中有描述。適用作分子信標(biāo)探針的示例性HPV特異性寡核苷酸序列在表1中表示為“MB”。
本文所用術(shù)語(yǔ)“分子信標(biāo)探針”意指具有以下結(jié)構(gòu)的分子X(jué)2-arm1-target-arm2-X3其中“target”表示核苷酸的目標(biāo)特異性序列，“X2”和“X3”分別表示熒光部分和猝滅劑部分，其中猝滅劑部分當(dāng)與熒光部分緊靠在一起時(shí)能基本上或完全猝熄熒光部分的熒光，“arm1”和“arm2”表示能形成莖-雙鏈體的互補(bǔ)序列。
優(yōu)選的“arm1”和“arm2”序列的組合如下，但以下意在舉例而不是限制本發(fā)明cgcatg-SEQ-catgcgccagct-SEQ-agctggcacgc-SEQ-gcgtgcgatcg-SEQ-cgatcgccgtcg-SEQ-cgacggcggacc-SEQ-ggtccgccgaagg-SEQ-ccttcggcacgtcg-SEQ-cgacgtgcgcagc-SEQ-gctgcgccaagc-SEQ-gcttggccaagcg-SEQ-cgcttggcccagc-SEQ-gctgggccaaagc-SEQ-gctttggcctgc-SEQ-gcaggccaccc-SEQ-gggtggccaagcc-SEQ-ggcttggccagcg-SEQ-cgctggcgcatg-SEQ-catgcg分子信標(biāo)技術(shù)的應(yīng)用使得可以對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)例如NASBA擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(參看Leone等，Nucleic Acids Reseach.，1998，vol26，第2150-2155頁(yè))。分子信標(biāo)探針通常包括位于HPV特異性序列之側(cè)的互補(bǔ)序列，其在本文中用符號(hào)arm1和arm2表示，它們能相互雜交形成莖-雙鏈體結(jié)構(gòu)。arm1和arm2的精確序列對(duì)本發(fā)明并不重要，但要求當(dāng)探針沒(méi)有結(jié)合到目標(biāo)HPV序列時(shí)這些序列必須能形成莖-雙鏈體。
分子信標(biāo)探針也包括熒光部分和猝滅劑部分，這兩部分在本文用符號(hào)X2和X3表示。有關(guān)技術(shù)人員應(yīng)可理解，要這樣選擇熒光部分和猝滅劑部分，使得當(dāng)這兩部分緊靠在一起時(shí)，如在無(wú)目標(biāo)序列的情況下探針處于發(fā)夾“封閉”構(gòu)象時(shí)，猝滅劑部分應(yīng)能基本上或完全猝熄熒光部分的熒光。當(dāng)結(jié)合到目標(biāo)序列時(shí)，熒光部分和猝滅劑部分分開(kāi)，這樣熒光部分的熒光不再被猝熄。
可根據(jù)本發(fā)明使用的合適的配對(duì)猝滅劑/熒光劑部分的許多實(shí)例為本領(lǐng)域所公知(參看WO 95/13399，Tyaqi和Kramer，同上)?？墒褂糜性S多不同顏色的多種熒光團(tuán)，包括例如5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、熒光素、FAM和得克薩斯紅(參看Tyaqi，Bratu和Kramer，1998，Nature Biotechnology，16，49-53。使用用不同顏色的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針使得可在單個(gè)反應(yīng)器中對(duì)兩個(gè)或多個(gè)不同的探針進(jìn)行“多重”檢測(cè)。優(yōu)選的猝滅劑為4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)，這是一個(gè)非熒光發(fā)色團(tuán)，可用作多種熒光團(tuán)的“通用”猝滅劑。熒光部分和猝滅劑部分可以兩種方向共價(jià)結(jié)合到探針，即熒光部分位于或靠近5′末端而猝滅劑部分位于或靠近3′末端，或與此相反。合成分子信標(biāo)探針的方案為本領(lǐng)域所公知，題為“MolecularBeaconsHybridization Probes for Detection of Nucleic Acids inHomogenous Solutions”(“分子信標(biāo)檢測(cè)均勻溶液中的核酸的雜交探針”)的文章提供了詳細(xì)的合成方案，該文章作者為Sanjay Tyagi等，Department of Molecular Genetics，Public Health Research Institute，455First Avenue，New York，NY 10016，USA，可通過(guò)PHRI網(wǎng)站(www.phri.nyu.edu或www.molecular-beacons.org)從網(wǎng)上獲取。
NASBA P1引物和NASBA P2引物的適當(dāng)組合可用以驅(qū)動(dòng)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)。為驅(qū)動(dòng)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)，引物1寡核苷酸和引物2寡核苷酸必須能從mRNA的目標(biāo)區(qū)域引導(dǎo)雙鏈DNA的合成。為此，引物1寡核苷酸和引物2寡核苷酸必須包含分別與目標(biāo)mRNA的正義鏈和反義鏈的區(qū)域互補(bǔ)的目標(biāo)特異性序列。
在NASBA擴(kuò)增循環(huán)的第一階段，即所謂的“非循環(huán)”階段，引物1寡核苷酸退火到目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)序列，而其3′末端通過(guò)RNA依賴性DNA聚合酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)的作用而延伸，完成第一鏈cDNA的合成。所得RNADNA雜交體的RNA鏈隨后可例如通過(guò)RNA酶H的作用消化，以得到單鏈DNA。引物2寡核苷酸退火到此單鏈DNA近3′末端的互補(bǔ)序列，其3′末端(通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用)被延伸，形成雙鏈DNA。然后RNA聚合酶可從雙鏈DNA中的現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄多個(gè)RNA拷貝。此RNA轉(zhuǎn)錄物與原始目標(biāo)mRNA反義，可作為下一輪NASBA反應(yīng)的模板，其中引物2退火到RNA并引導(dǎo)第一cDNA鏈的合成，引物1引導(dǎo)第二cDNA鏈的合成。NASBA反應(yīng)的一般原理為本領(lǐng)域所公知(參看Compton，J.Nature.35091-92)。
本文所述目標(biāo)特異性探針寡核苷酸也可結(jié)合到固體載體如磁微珠上并用作“捕捉探針”將NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物(單鏈RNA)固定化。本文所述目標(biāo)特異性“分子信標(biāo)”探針可用以對(duì)NASBA反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明的試劑盒也可包括含已知HPV類型的E6和/或L1 mRNA的陽(yáng)性對(duì)照。合適的對(duì)照包括例如從感染已知HPV類型的細(xì)胞系(如HeLa、CaSki)制備的核酸提取物。
試劑盒還可進(jìn)一步含有內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增引物，如對(duì)人U1A RNA特異的引物。
含適用于NASBA擴(kuò)增的引物(任選含有探針)的試劑盒也可進(jìn)一步包含NASBA反應(yīng)所需的酶混合物，如含RNA定向DNA聚合酶(例如逆轉(zhuǎn)錄酶)、水解RNA-DNA雜交體的RNA鏈但不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶(如RNA酶H)和RNA聚合酶的酶混合物。RNA聚合酶應(yīng)能識(shí)別位于試劑盒所提供的NASBA P1引物的5′末端區(qū)域的啟動(dòng)子序列。試劑盒還可提供有含RNA和DNA合成所需的核苷和脫氧核苷的NASBA緩沖劑。標(biāo)準(zhǔn)NASBA反應(yīng)緩沖劑的組成為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參看Leone等，同上)。
表1引入到NASBA/PCR引物和探針中的E6特異性序列
表2引入到NASBA/PCR引物和探針中的L1特異性序列
適用于通過(guò)NASBA檢測(cè)HPV L1和E6 mRNA的優(yōu)選引物在以下各表中列出。但是，這些引物只是用以舉例說(shuō)明，并不代表本發(fā)明的范圍應(yīng)限于這些特定的引物分子。
在以下各表中NASBA P2引物(p2)包括位于5′末端的序列GATGCAAGGTCGCATATGAG；NASBA P1引物(p1)包括位于5′末端的序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG。適用作探針的寡核苷酸用符號(hào)“po”表示。P2引物通常含有來(lái)自正鏈的HPV序列，而P1引物通常含有來(lái)自負(fù)鏈的HPV序列。nt指相應(yīng)HPV基因組序列中核苷酸的位置。
表3-優(yōu)選的E6 NASBA引物和探針
具有相同前綴的P1和P2引物對(duì)(如HAe6701p1和HAe6701p2)要組合使用。但也可使用其它組合，以下概括了HPV類型16、18、31、33和45的組合。
適合用于擴(kuò)增HPV16 E6 mRNA的引物對(duì)如下HAe6701p2或HAe6702p2(兩者nt116)和HAe6701p1或HAe6702p1(兩者nt368)。
HAe6701p2或HAe6702p2(兩者的nt為116)和HPV16p1(nt258)。
H16e6702Ap2(nt142)、H16e6702Bp2(nt182)、H16e6702Cp2(nt185)或H16e6702Dp2(nt188)和HAe6701p1或HAe6702p1(兩者nt368)。
HAe6701p2或HAe6702p2(兩者nt116)和HAe6702Ap1(nt208)、HAe6702Bp1(nt191)、HAe6702Cp1(nt186)或HAe6702Dp1(nt185)。這些組合適用于擴(kuò)增所有E6剪接變體。
HAe6703p2或HAe6704p2(兩者nt656)和HAe6703p1或HAe6704p1(兩者nt741)。這些組合適用于擴(kuò)增所有含E7編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄物(至少至nt741)。
以下引物對(duì)優(yōu)選用于擴(kuò)增HPV18 E6 mRNAH18e6701p2(nt702)或H18e6702p2(nt698)和H18e6701p1或H18e6702p1(兩者nt869)。
H18e6703p2(nt651)和H18e6703p1(nt817)。
H18e6704p2(nt179)和H18e6704p1(nt379)。
以下引物對(duì)優(yōu)選用于擴(kuò)增HPV31 E6 mRNAH31e6701p2或H31e6702p2(兩者nt164)和H31e6701p1或H31e6702p1(兩者nt423)。
H31e6703p2(nt617)、H31e6704p2(nt619)或H31e6705p2(nt617)和H31e6703p1(nt766)、H31e6704p1(nt766)或H31e6705p1(nt809)。
以下引物對(duì)優(yōu)選用于擴(kuò)增HPV33 E6 mRNAH33e6701p2(nt618)或H33e6703p2(nt620)和H33e6701p1(nt763)或H33e6703p1(nt807)。
H33e6702p2(nt431)和H33e6702p1(nt618)。
以下引物對(duì)優(yōu)選用于擴(kuò)增HPV45HPV45p2(nt430)和HPV45p1(nt527)。
表4-E6 PCR引物
HPV類型16、18、31和33的優(yōu)選PCR引物對(duì)與NASBA引物對(duì)類似。
表5-優(yōu)選的L1 NASBA引物和探針
表6-優(yōu)選的L1 PCR引物
SEQ ID NO149和150的HPV特異性序列(引物Onc2A2/Onc2A1-PCR和Onc2A1/Onc2A2-PCR)與HPV類型16基因組序列中位置6596-6615的片斷(SEQ ID NO149；Onc2A2/Onc2A1-PCR)以及位置6729-6747的片斷(SEQ ID NO150；Onc2A1/Onc2A2-PCR)等同。
SEQ ID NO152和153的HPV特異性序列(Onc2B2/Onc2B1-PCR和Onc2B1/Onc2B2-PCR)分別為上述序列的變異體，包括幾個(gè)簡(jiǎn)并堿基。本文提供的簡(jiǎn)并寡核苷酸分子序列的代表符號(hào)使用的是混合堿基位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)IUB編碼N＝G，A，T，C；V＝G，A，C；B＝G，T，C；H＝A，T，C；D＝G，A，T；K＝G，T；S＝G，C；W＝A，T；M＝A，C；Y＝C，T；R＝A，G。
也有可能使用HPV特異性序列SEQ ID NO152(Onc2B2/Onc2B1-PCR)和SEQ ID NO153(Onc2B1/Onc2B2-PCR)的變異體，其中靠近序列的3′末端的任何兩個(gè)核苷酸“SRH”如下所示被肌苷(I)所置換。
5′AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3′5′AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3′5′AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3′HPV特異性序列SEQ ID NO156-163(存在于引物Onc2C2、Onc2D2、Onc2E2、Onc2F2、Onc2G2、Onc2H2、Onc2I2、Onc2J2、Onc2C1-PCR、Onc2D1-PCR、Onc2E1-PCR、Onc2F1-PCR、Onc2G1-PCR、Onc2H1-PCR、Onc2I1-PCR和Onc2J1-PCR)是基于HPV特異性序列SEQ ID NO152(Onc2B2/Onc2B1-PCR)的變異體，而HPV特異性序列SEQ ID NO164-169(存在于引物Onc2K1、Onc2L1、Onc2M1、Onc2N1、Onc2O1、Onc2P1、Onc2K2-PCR、Onc2L2-PCR、Onc2M2-PCR、Onc2N2-PCR、Onc2O2-PCR和Onc2P2-PCR)是基于HPV特異性序列SEQ ID NO153(Onc2B1/Onc2B2-PCR)的變異體。這些變異體包括簡(jiǎn)并堿基以及肌苷(I)殘基。這個(gè)序列變異使得嵌入變異體序列的寡核苷酸，能與多種HPV類型結(jié)合。肌苷堿基不會(huì)對(duì)雜交產(chǎn)生干涉，因此可嵌入不同HPV類型之間的變異位點(diǎn)，從而構(gòu)建能與多種HPV類型結(jié)合的“共有”引物。
引物Onc2A2、Onc2B2、Onc2C2、Onc2D2、Onc2E2、Onc2F2、Onc2G2、Onc2H2、Onc2I2和Onc2J2之一種或多種可與引物Onc2A1、Onc2B1、Onc2K1、Onc2L1、Onc2M1、Onc2N1、Onc2O1和Onc2P1之一種或多種組合使用，以對(duì)HPV L1 mRNA進(jìn)行NASBA擴(kuò)增。
引物Onc2A1-PCR、Onc2B1-PCR、Onc2C1-PCR、Onc2D1-PCR、Onc2E1-PCR、Onc2F1-PCR、Onc2G1-PCR、Onc2H1-PCR、Onc2I1-PCR和Onc2J1-PCR之一種或多種可與引物Onc2A2-PCR、Onc2B2-PCR、Onc2K2-PCR、Onc2L2-PCR、Onc2M2-PCR、Onc2N2-PCR、Onc2O2-PCR和Onc2P2-PCR之一種或多種組合使用，以對(duì)HPV L1mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例和示圖，可進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中

圖1A表示使用針對(duì)HPV16的FAM分子信標(biāo)對(duì)患者樣品進(jìn)行單一反應(yīng)實(shí)時(shí)NASBA測(cè)試的結(jié)果，而圖1B表示使用圖1A的FAM分子信標(biāo)及針對(duì)UOA的得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)進(jìn)行的“多重”實(shí)時(shí)NASBA測(cè)試，圖2A表示對(duì)患者樣品使用針對(duì)HPV18的FAM分子信標(biāo)進(jìn)行的單一反應(yīng)實(shí)時(shí)NASBA，而圖2B表示使用針對(duì)HPV18的得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)和針對(duì)HPV33的FAM標(biāo)記的信標(biāo)進(jìn)行的多重實(shí)時(shí)NASBA，圖3A表示使用針對(duì)HPV31的FAM標(biāo)記分子信標(biāo)進(jìn)行的單一反應(yīng)實(shí)時(shí)NASBA，而圖3B表示使用針對(duì)HPV45的得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)進(jìn)行的多重實(shí)時(shí)NASBA，圖4A表示使用針對(duì)HPV33的FAM標(biāo)記分子信標(biāo)進(jìn)行的單一反應(yīng)實(shí)時(shí)NASBA，而圖4B表示使用針對(duì)HPV18的得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)進(jìn)行的多重實(shí)時(shí)NASBA，圖5A表示使用針對(duì)HPV45的FAM分子信標(biāo)進(jìn)行的單一反應(yīng)實(shí)時(shí)NASBA，而圖5B表示使用針對(duì)HPV45的得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)和針對(duì)HPV31的FAM標(biāo)記的分子信標(biāo)進(jìn)行的多重實(shí)時(shí)NASBA，圖6表示通過(guò)PreTect HPV-Proofer和PCR檢測(cè)HPV(與細(xì)胞學(xué)檢查或組織學(xué)檢查相比)。
實(shí)施例1 通過(guò)基于NASBA的核酸擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)法檢測(cè)HPVmRNA收集和制備臨床樣品從挪威奧斯陸參與子宮頸檢查計(jì)劃的5970名婦女收集派普斯涂片和HPV樣品。如下處理用于提取RNA/DNA的樣品。
用細(xì)胞刷(cytobrush)(Rovers Medical Devices，荷蘭)收集參與子宮頸檢查計(jì)劃的各婦女的子宮頸樣品。然后將細(xì)胞刷浸入9ml裂解緩沖液(5M硫氰酸胍)中。因?yàn)镽NA在-70℃的5M硫氰酸胍中保存得最好，每一輪提取中只用1ml樣品即可。裂解緩沖液中的樣品在-20℃下保存不超過(guò)一個(gè)星期，然后在-70℃下保存，直至進(jìn)行RNA/DNA分離。
在第一輪提取中，使用9ml裂解緩沖液總樣品的1ml，自動(dòng)分離5300名婦女的RNA和DNA。RNA和DNA按照Organon Teknika的“Booms”分離方法(Organon Teknika B.V.，Boselind 15，P.O.Box 84，5280 AB Baxtel，荷蘭；現(xiàn)Biomérieux，69280 Marcyl’Etoile，法國(guó))，使用NuclisensTM提取器按照自動(dòng)提取方案進(jìn)行提取。
細(xì)胞系Hela(HPV18)、SiHa(HPV16)和CaSki(HPV16)細(xì)胞系的DNA和RNA用作PCR和NASBA反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。這些細(xì)胞在敏感性研究(實(shí)例2)中也用作樣品材料。SiHa細(xì)胞每細(xì)胞含有1-2個(gè)拷貝的整合型HPV16，而CaSki細(xì)胞每細(xì)胞含有60-600個(gè)拷貝的整合的和游離型的HPV16。Hela細(xì)胞每細(xì)胞約含10-50個(gè)拷貝的HPV18。
HPV的PCR檢測(cè)和分型用共有Gp5+/6+引物對(duì)從子宮頸刮片分離的DNA進(jìn)行PCR(EP-B-0 517704)。PCR在50ml反應(yīng)體積中進(jìn)行，所述體積中含有75mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、20mM(NH4)2SO4、0.01％Tween 20TM、200mM各dNTP、1.5Mm MgCl2、1U重組Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μl DNA樣品和50pmol各Gp5+和Gp6+引物。在94℃下進(jìn)行2分鐘的變性步驟，然后用PCR處理器(Primus96，HPL block MWG，德國(guó))進(jìn)行40輪擴(kuò)增。每輪擴(kuò)增包括1分鐘的變性步驟，40℃下2分鐘的引物退火步驟和72℃下1.5分鐘的鏈延長(zhǎng)步驟。最后一個(gè)延長(zhǎng)步驟延時(shí)4分鐘，以確保擴(kuò)增的DNA完全延伸。
如下對(duì)Gp5+/6+陽(yáng)性樣品進(jìn)行HPV類型16、31和33PCR方案HPV16、31和33PCR在50ml體積中進(jìn)行，所述體積中含有75mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、200mM各dNTP、1.5mM MgCl2、2.5U重組TaqDNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μlDNA樣品和25pmol各引物。在94℃進(jìn)行2分鐘的變性步驟，然后用PCR處理器(Primus96，HPL block，MWG，德國(guó))進(jìn)行35輪的擴(kuò)增。各輪擴(kuò)增包括30秒的變性步驟，57℃下30秒的引物退火步驟和72℃下1分鐘的鏈延長(zhǎng)步驟。最后一個(gè)步驟延時(shí)10分鐘，以確保擴(kuò)增的DNA完全延伸。HPV33的方案有一個(gè)52℃下的引物退火步驟。HPV18方案設(shè)計(jì)引物以鑒別HPV類型18。PCR在50ml體積中進(jìn)行。所述體積中含有75mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、20mM(NH4)2SO4、0.01％Tween20、200mM各dNTP、2.0mM MgCl2、2.5U重組Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)、3μlDNA樣品和25 pmol各引物。在94℃進(jìn)行2分鐘的變性步驟，然后用PCR處理器(Primus96，HPL block，MWG，德國(guó))進(jìn)行35輪的擴(kuò)增。各輪擴(kuò)增包括30秒的變性步驟，57℃下30秒的引物退火步驟和70℃下1分鐘的鏈延長(zhǎng)步驟。最后一個(gè)延長(zhǎng)步驟延時(shí)10分鐘，以確保擴(kuò)增的DNA完全延伸。
將導(dǎo)向人β-珠蛋白基因的引物組用作DNA質(zhì)量的對(duì)照(Operatingprocedure，University Hospital Vrije Universiteit，荷蘭阿姆斯特丹)。PCR在50ml體積中進(jìn)行，所述體積中含有75mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)、200mM各dNTP、1.5mM MgCl2、1U重組Taq DNA聚合酶(MBIFermentas)、3μl DNA樣品和25pmol各引物。在94℃進(jìn)行2分鐘的變性步驟，然后用PCR處理器(Primus96，HPL block，MWG，德國(guó))進(jìn)行35輪的擴(kuò)增。各輪擴(kuò)增包括94℃下1分鐘的變性步驟，55℃下1.5分鐘的引物退火步驟和72℃下2分鐘的鏈延長(zhǎng)步驟。最后一個(gè)步驟延時(shí)4分鐘，以確保擴(kuò)增的DNA完全延伸。HeLa用作HPV18的陽(yáng)性對(duì)照，而SiHa或Caski用作HPV16的陽(yáng)性對(duì)照。水用作陰性對(duì)照。
用于HPV PCR的引物
在DNA500芯片(Agilent Technologies，美國(guó))上按其操作手冊(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行顯示。所述DNA芯片采用微量凝膠電泳，其最佳檢測(cè)限為0.5-50ng/ml。結(jié)果用Bioanalyzer 2100軟件(Agilent Technologies，美國(guó))解析。
下表確認(rèn)用以對(duì)患者樣品進(jìn)行HPV PCR的引物，并指出另外的適用于HPV35、39、45、51、52、58和HPV6/11的PCR引物。
用于HPV檢測(cè)的PCR引物。
類型 引物 引物序列 位置長(zhǎng)度(bp)HPV6/11 Pr15’TAC ACT GCT GGA CAA CAT 3’ 514-531 123Pr25’TCA TCT TCT GAG CTG TCT 3’ 619-636HPV16 Pr15’TCA AAA GCC ACT GTG TCC TGA 3’ 421-441 120Pr25’CGT GTT CTT GAT GAT CTG CAA 3’ 520-540HPV18 Pr15’TTC CGG TTG ACC TTC TAT GT 3’ 651-670 186Pr25’GGT CGT CTG CTG AGC TTT CT 3’ 817-836HPV31 Pr15’CTA CAG TAA GCA TTG TGC TAT GC 3’ 3835-3857 155Pr25’ACG TAA TGG AGA GGT TGC AAT AAC CC 3’ 3964-3989HPV33 Pr15’AAC GCC ATG AGA GGA CAC AAG 3’ 567-587 212Pr25’ACA CAT AAA CGA ACT GTG GTG 3’ 758-778HPV35 Pr15’CCC GAG GCA ACT GAC CTA TA 3’ 610-629 231Pr25’GGG GCA CAC TAT TCC AAA TG 3’ 821-840HPV39 Pr15’GCA GAC GAC CAC TAC AGC AAA 3’ 210-230 153Pr25’ACA CCG AGT CCG AGT AAT A 3’ 344-362HPV45 Pr15’GAA ACC ATT GAA CCC AGC AGA AAA 3’ 428-451 154Pr25’TTG CTA TAC TTG TGT TTC CCT ACG 3’ 558-581HPV51 Pr15’GGA GGA GGA TGA AGT AGA TA 3’ 658-677 169Pr25’GCC CAT TAA CAT CTG CTG TA 3’ 807-836HPV52 Pr15’GTG CCT ACG CTT TTT ATC TA 3’ 296-315 233Pr25’GGG GTC TCC AAC ACT CTG AAC A 3’ 507-528HPV58 Pr15’TCA GGC GTT GGA GAC ATC 3’ 157-174 162Pr25’AGC AAT CGT AAG CAC ACT 3’ 301-318Gp+ Gp5+ 5’TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3’ 150Gp6+ 5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT CBGPCO3Pr15’ACA CAA CTG TGT TCA CTA GCBGPCO5Pr25’GAA ACC CAA GAG TCT TCT CTNASBA RNA擴(kuò)增避免發(fā)生污染的預(yù)防措施1.在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)所進(jìn)行核酸釋放、分離和擴(kuò)增/檢測(cè)操作。
2.在將進(jìn)行核酸釋放、分離和擴(kuò)增/檢測(cè)操作的實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)所分別保存和制備用以進(jìn)行核酸釋放、分離和擴(kuò)增/檢測(cè)操作的試劑。
3.試管和小瓶不用時(shí)保持密封。
4.在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)所使用的移液管和其它儀器不得在其它場(chǎng)所使用。
5.每次移液操作時(shí)使用干凈的移液管和移液頭。
6.對(duì)可能含有核酸的流體使用帶有防氣溶膠的管頭的移液管。必須用專用、分離的試管進(jìn)行移液操作。所有其它試管和小瓶應(yīng)對(duì)所處理的試管或小瓶保持密封或隔離。
7.當(dāng)處理可能含有目標(biāo)mRNA或擴(kuò)增的材料的臨床材料時(shí)，要戴一次性手套。如有可能，在完成測(cè)試過(guò)程中各移液步驟后，要更換手套，尤其在與可能的污染物接觸后更要更換手套。
8.將用過(guò)的一次性物品收集到一容器中。每次測(cè)試后要密封和移走該容器。
9.每次測(cè)試后，將在核酸分離或擴(kuò)增/檢測(cè)過(guò)程中使用的試管架浸于洗滌劑(如Merck Extran MA01 alkaline)中至少一小時(shí)。
以下程序是使用Organon Teknika提供的NuclisensTMBasic Kit的試劑進(jìn)行的。
n＝10樣品的程序1.制備酶溶液。
往3個(gè)凍干的酶球(NuclisensTMBasic Kit；含AMV-RT、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和BSA)分別加入55μl酶稀釋液(自NuclisensTMBasic Kit；含山梨糖醇水溶液)。將此酶溶液置于室溫下至少20分鐘。將酶溶液收集到一個(gè)試管中，用手指輕彈試管以使完全混合。略加離心沉淀并在1小時(shí)內(nèi)使用。酶混合液的終濃度為375mM山梨糖醇、2.5μgBSA、0.08U RNA酶H、32U T7 RNA聚合酶和6.4U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
2.制備試劑球/KCl溶液。
對(duì)于10個(gè)樣品往凍干的試劑球(自NuclisensTMBasic Kit；含核苷酸、二硫蘇糖醇(dithiotreitol)和MgCl2)加入80μl試劑球稀釋劑(自NuclisensTMBasic Kit；含Tris/HCl(pH8.5)、45％DMSO)，立即旋拌均勻。對(duì)3種試劑球進(jìn)行以上處理并將各溶液混合在一個(gè)試管中。
往上述再生的試劑球溶液加入3μl NASBA水(自NuclisensTMBasic Kit)并混合均勻。
加入56μlKCl儲(chǔ)液(自NuclisensTMBasic Kit)并混合均勻。使用此KCl/水混合液，結(jié)果NASBA反應(yīng)的KCl終濃度為70mM。試劑/KCl溶液的終濃度為1mM各dNTP、2mM ATP、UTP和CTP、1.5mM GTP，以及0.5mM ITP、0.5mM二硫蘇糖醇、70mM KCl、12mM MgCl2、40mM Tris-HCl(pH8.5)。
3.制備含目標(biāo)特異性引物和分子信標(biāo)探針的引物/探針溶液。
對(duì)各目標(biāo)反應(yīng)，將91μl試劑球/KCl溶液(步驟2中制備)轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。加入25μl引物/分子信標(biāo)探針溶液(使每個(gè)反應(yīng)的各正義和反義引物的終濃度為～0.1-0.5μM，各分子信標(biāo)探針的終濃度為～15-20pmol)。旋拌混合均勻。不要離心。
如進(jìn)行不到10個(gè)的目標(biāo)RNA擴(kuò)增，參考下表所示試劑球溶液、KCl/水溶液和引物的合適用量。引物溶液應(yīng)在制備后30分鐘內(nèi)使用。
4.加樣對(duì)各目標(biāo)RNA反應(yīng)往96孔微量滴定板中的10各孔每孔各移加10μl的引物/探針溶液(步驟3中制備)。往每孔中加入5μl核酸提取物。在65±1℃溫育微量滴定板4分鐘。冷至41±0.5℃4分鐘。然后往每孔加入5μl酶溶液。立即將微量滴定板置于熒光檢測(cè)儀器(如NuclisensTMEasyQAnalyzer)中開(kāi)始擴(kuò)增。
臨床研究結(jié)果表7顯示相對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)NASBA HPV陽(yáng)性(L1和/或E6表達(dá))病例和PCR HPV陽(yáng)性病例的分布。PCR擴(kuò)增如Karlsen等，J Clin Microbiol.342095-2100，1996所描述的進(jìn)行。預(yù)期的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果的數(shù)值基于對(duì)CIN III病變所進(jìn)行的類似研究的平均結(jié)果(Clavel等，Br J Cancer，841616-1623，2001)。表8列出幾個(gè)示例性病例的結(jié)果。
表7
表8
實(shí)施例2-實(shí)時(shí)NASBA對(duì)對(duì)照細(xì)胞系的靈敏度在用Organon Teknika/bioMerieux的Boom’s提取法進(jìn)行核酸自動(dòng)提取前(平行試樣1和3)或在核酸提取后(平行試樣2)，將宮頸癌細(xì)胞系CaSki、SiHa和Hela稀釋于裂解緩沖液中。按上述方案使用用得克薩斯紅(16、L1和18)或FAM(U1A、33和31)標(biāo)記的分子信標(biāo)探針進(jìn)行實(shí)時(shí)NASBA。
表9
因此，用實(shí)時(shí)NASBA有可能在少于1個(gè)細(xì)胞中檢出HPV E6mRNA。
實(shí)時(shí)NASBA是作為多重測(cè)試法和作為單一反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行測(cè)試的。以下靈敏度研究的結(jié)果基于對(duì)CaSki、SiHa和Hela細(xì)胞系的平行試驗(yàn)，也基于對(duì)HPV類型16、18、31和33的合成DNA oligos的三個(gè)平行試驗(yàn)。檢測(cè)限的定義是，平行試驗(yàn)中的兩個(gè)樣品均為陽(yáng)性。括號(hào)中的數(shù)字(x)表示在一些試驗(yàn)中也檢出的細(xì)胞的指定數(shù)量。靈敏度定義為在兩個(gè)平行試驗(yàn)中檢出HPV所需的細(xì)胞量。HPV類型從PCR結(jié)果確定，而特異性基于NASBA與PCR的比較結(jié)果。
靈敏度PCR采用Gp5+/6+的HPV共有PCR只能檢測(cè)低至104個(gè)SiHa和Hela細(xì)胞，以及低至103個(gè)CaSki細(xì)胞。但是，類型特異性PCR引物組更加靈敏，HPV16類型特異性PCR引物組可檢測(cè)103(102)個(gè)SiHa細(xì)胞和0.1個(gè)CaSki細(xì)胞，而HPV18類型特異性引物組可檢測(cè)102個(gè)HeLa細(xì)胞。
實(shí)時(shí)NASBA實(shí)時(shí)NASBA采用對(duì)U1A特異的引物，可檢出反應(yīng)混合物中10(1)個(gè)SiHa和Caski細(xì)胞和1個(gè)Hela細(xì)胞。對(duì)于HPV16特異性引物，檢測(cè)下限為(10)(102，1)個(gè)SiHa細(xì)胞和10(1)個(gè)CaSki細(xì)胞，而對(duì)HPV18特異性引物，檢測(cè)下限為1(0.1)個(gè)HeLa細(xì)胞。通用L1引物能檢測(cè)10個(gè)CaSki細(xì)胞。HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞不被通用L1引物檢出。
實(shí)時(shí)多重NASBA采用U1A特異性引物并組合HPV特異性引物(檢測(cè)下限為10(1)個(gè)SiHa細(xì)胞和10(1)個(gè)CaSki細(xì)胞)，檢測(cè)下限為102(10)個(gè)SiHa細(xì)胞和10(1)個(gè)CaSki細(xì)胞。L1特異性引物和HPV33特異性引物組合可檢測(cè)103(102)個(gè)CaSki細(xì)胞。反應(yīng)中沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性HPV33樣品。HPV18特異性引物與HPV31特異性引物組合應(yīng)用時(shí)的檢測(cè)下限為1(0.1)個(gè)HeLa細(xì)胞。反應(yīng)中沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性HPV31樣品。由于沒(méi)有帶HPV31和HPV33的細(xì)胞系，這些HPV類型的特異性引物的靈敏度沒(méi)有進(jìn)行測(cè)試。這些引物只對(duì)含HPV31和HPV33的樣品進(jìn)行測(cè)試，但細(xì)胞數(shù)量和這些細(xì)胞中HPV31和HPV33的拷貝數(shù)未知，在不同樣品中很可能會(huì)不同。
表10與PCR相比實(shí)時(shí)NASBA的靈敏度
對(duì)1999-2001年間進(jìn)入stfold中心醫(yī)院接受CIN治療的婦女的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)NASBA(參看實(shí)施例3)。在上述核酸提取和NASBA方案同時(shí)采用了以FAM和得克薩斯紅標(biāo)記的分子信標(biāo)探針。結(jié)果在圖1A和1B(HPV16-患者樣品205)、圖2A和2B(HPV18-患者樣品146)、圖3A和3B(HPV31-患者樣品236)、圖4A和4B(HPV33-患者樣品218)和圖5A和5B(HPV45-患者樣品343)顯示。在各病例中，“A”圖為單一反應(yīng)，“B”圖為多重測(cè)試。
特異性實(shí)時(shí)NASBA的交叉反應(yīng)性。用實(shí)時(shí)NASBA引物組合對(duì)從奧斯陸研究中經(jīng)PCR檢測(cè)為HPV6/11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、58或HPV X陽(yáng)性的490個(gè)子宮頸樣品進(jìn)行測(cè)試，以檢查使用NASBA時(shí)各HPV類型之間的交叉反應(yīng)性。已通過(guò)共有PCR和除HPV類型39(2)、52(1)和58(2)之外的各HPV類型的類型特異性PCR對(duì)所有樣品進(jìn)行分型。這些樣品通過(guò)PreTect HPV-Proofer加樣測(cè)試。共有Gp5+/6+PCR檢出HPV X陽(yáng)性，但類型特異性PCR檢出HPV6/11、16、18、31、33、35、45和51陰性。沒(méi)發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)性。表14中選定數(shù)目的病例的序列確認(rèn)在表14a中表示。
PCR用PCR和PreTect HPV-Proofer(實(shí)時(shí)多重NASBA)共檢測(cè)了773個(gè)子宮頸樣品，Gp5+/6+共有PCR引物檢出共有24.6％(190/773)的樣品為陽(yáng)性。經(jīng)分型，74.1％(83/112)的樣品為HPV16，13％(15/112)為HPV18，17％(19/112)為HPV31和12％(13/112)為HPV33，包括多重HPV感染。共有103個(gè)樣品有單一或多重HPV感染，而91.3％(94/103)的樣品只有單一HPV感染。8.7％(9/103)的樣品發(fā)生雙HPV感染。所有樣品首先用共有Gp5+/6+PCR引物測(cè)試。然后用β-珠蛋白對(duì)照引物測(cè)試共有Gp5+/6+得到的HPV PCR陰性樣品，以對(duì)完整DNA進(jìn)行確證。HPV PCR陽(yáng)性樣品不進(jìn)行此DNA對(duì)照試驗(yàn)。本研究的HPV陰性樣品對(duì)β-珠蛋白對(duì)照PCR引物均為陽(yáng)性。只有在Gp5+/6+PCR中為陽(yáng)性的DNA樣品才進(jìn)行HPV類型特異性PCR。HPV類型的研究目標(biāo)所在是HPV16、18、31和33。
實(shí)時(shí)多重NASBA對(duì)于實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)，U1A基因產(chǎn)物的引物和探針用作完整DNA的性能對(duì)照。棄去對(duì)U1A陰性的樣品。共有14.2％(110/773)的樣品對(duì)HPV類型特異性NASBA引物中至少一個(gè)為陽(yáng)性，包括顯示多重HPV感染的樣品。這些樣品中有54.5％(60/110)對(duì)HPV16 NASBA引物陽(yáng)性，13.6％(15/110)對(duì)HPV18引物陽(yáng)性，21.8％(24/110)對(duì)HPV31引物陽(yáng)性和13.6％(15/110)對(duì)HPV33引物陽(yáng)性。共有45個(gè)樣品對(duì)L1共有引物陽(yáng)性，通常其中有82.2％(37/45)同時(shí)顯示HPV16 E6/E7癌基因表達(dá)。在2.2％(1/45)的樣品中檢出共有L1，同時(shí)分別檢出HPV18、31或33。另在8.9％(4/45)的樣品中只檢出L1，這些樣品對(duì)Gp5+/6+引物PCR均為陽(yáng)性。共有108個(gè)樣品具有單一或多重HPV感染，而98.1％(106/108)的樣品只有單一HPV感染。在1.9％(2/108)的樣品中出現(xiàn)雙mRNA表達(dá)。
實(shí)時(shí)多重NASBA與PCR比較通過(guò)HPV16 PCR或PreTectHPV-Proofer共有87個(gè)樣品顯示存在HPV16 DNA或RNA。通過(guò)PCR和實(shí)時(shí)NASBA確定有64.4％(56/87)的樣品為HPV16陽(yáng)性。通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)只有39.1％(34/87)的樣品為陽(yáng)性，而通過(guò)實(shí)時(shí)NASBA發(fā)現(xiàn)只有3.4％(3/87)的樣品為陽(yáng)性。對(duì)于HPV18，通過(guò)PCR或?qū)崟r(shí)NASBA發(fā)現(xiàn)共有20個(gè)樣品顯示存在HPV18 DNA或RNA。這20個(gè)樣品當(dāng)中，在PCR和實(shí)時(shí)NASBA這兩個(gè)測(cè)試中發(fā)現(xiàn)有50％(10/20)的樣品為陽(yáng)性，通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)只有35％(7/20)的樣品為陽(yáng)性，而通過(guò)實(shí)時(shí)NASBA發(fā)現(xiàn)只有15％(3/20)的樣品為陽(yáng)性。通過(guò)PCR或?qū)崟r(shí)NASBA發(fā)現(xiàn)共有27個(gè)樣品顯示存在HPV31 DNA或RNA。在這27個(gè)樣品當(dāng)中，在PCR和實(shí)時(shí)NASBA測(cè)試中發(fā)現(xiàn)有59.3％(16/27)的樣品為陽(yáng)性，通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)只有11.1％(3/27)的樣品為陽(yáng)性，通過(guò)實(shí)時(shí)NASBA測(cè)試發(fā)現(xiàn)只有18.5(5/27)的樣品為陽(yáng)性。對(duì)于HPV33，通過(guò)PCR或PreTect HPV-Proofer發(fā)現(xiàn)共有18個(gè)樣品顯示存在HPV DNA或RNA，而通過(guò)PCR和實(shí)時(shí)NASBA這兩個(gè)測(cè)試發(fā)現(xiàn)有55.6％(10/18)的樣品為陽(yáng)性。通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)只有16.7％(3/18)的樣品為陽(yáng)性，而通過(guò)實(shí)時(shí)NASBA發(fā)現(xiàn)只有22.2％(4/18)的樣品為陽(yáng)性。
表11PCR和實(shí)時(shí)NASBA樣品中HPV的統(tǒng)計(jì)分布
表12PCR和實(shí)時(shí)NASBA之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系
表13L1的實(shí)時(shí)NASBA結(jié)果
表14實(shí)時(shí)多重NASBA與PCR比較的遺傳特異性NASBAHPV(PCR) 總數(shù)引物6/11 16183133 35 39 45 51 5258 X162 281 0 110050 02181 1 180 100010 01311 0 1 13150110 00331 2 0 2 12 20120 01452 1 1 1 11017 10 01測(cè)試總計(jì) 4371363225 23 223 31 1 2201490表14a通過(guò)Gp5+/6+PCR引物的DNA測(cè)試序(不包括在本文中)
討論實(shí)時(shí)NASBA的靈敏度通常比PCR的靈敏度要好。實(shí)時(shí)NASBA對(duì)所有標(biāo)記的一般靈敏度為1至102個(gè)細(xì)胞的范圍，這比PCR反應(yīng)102至104個(gè)細(xì)胞的靈敏度范圍要好得多。正如所料到的那樣，特異性引物和探針的靈敏度要比通用引物和探針的靈敏度要好。實(shí)時(shí)NASBA與實(shí)時(shí)多重NASBA相比同樣靈敏或更加靈敏。
導(dǎo)向U1A(人管家基因)的實(shí)時(shí)NASBA引物和分子信標(biāo)探針在實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)中用作樣品材料的性能對(duì)照物，以確保樣品材料中的RNA的完整性。實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)是對(duì)此反應(yīng)進(jìn)行確證所必需的。
通用實(shí)時(shí)NASBA對(duì)L1(HPV的主要衣殼蛋白)的靈敏度比同樣針對(duì)L1的通用Gp5+/6+PCR的靈敏度要好得多，其靈敏度為10個(gè)CaSki細(xì)胞，而通用Gp5+/6+PCR的靈敏度為103(102)個(gè)CaSki細(xì)胞。這兩個(gè)引物組(PCR和NASBA)的靶標(biāo)位于不同HPV類型的保守L1基因的相同區(qū)域。兩者靈敏度的差別可能是由于每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)基因通常有一個(gè)拷貝，而mRNA的拷貝數(shù)可能為幾百。實(shí)時(shí)NASBA L1引物不能象Gp5+/6+PCR引物那樣檢出SiHa和HeLa細(xì)胞，說(shuō)明這些細(xì)胞系中缺少L1表達(dá)。Gp5+/6+PCR引物能檢出104個(gè)SiHa或HeLa細(xì)胞?？紤]到各細(xì)胞中的HPV拷貝數(shù)量，可以理解CaSki細(xì)胞能被檢出的數(shù)量為SiHa和HeLa細(xì)胞的十分之一，因?yàn)槊總€(gè)CaSki細(xì)胞有60-600個(gè)整合的和游離型的HPV拷貝，而每個(gè)SiHa細(xì)胞有1-2個(gè)整合型HPV拷貝，每個(gè)HeLa細(xì)胞有10-50個(gè)整合型HPV拷貝。L1引物組只能檢測(cè)具有整合的和游離型的HPV的CaSki細(xì)胞，而不能檢測(cè)只有整合型HPV的SiHa或HeLa細(xì)胞，這可說(shuō)明L1基因只在HPV感染的游離型狀態(tài)下表達(dá)，因此L1可作為HPV感染的整合和持續(xù)現(xiàn)象的有價(jià)值的標(biāo)志。
HPV類型特異性NASBA引物是針對(duì)全長(zhǎng)E6/E7轉(zhuǎn)錄物的，由于癌細(xì)胞中缺乏E2基因產(chǎn)物，所述轉(zhuǎn)錄物在癌細(xì)胞中大量表達(dá)。實(shí)時(shí)NASBA16類型特異性引物能檢出10(1)個(gè)SiHa細(xì)胞和10(1)個(gè)CaSki細(xì)胞，而HPV16 PCR引物能檢出103(102)個(gè)SiHa細(xì)胞。對(duì)此的解釋是可能由于各細(xì)胞系中HPV拷貝數(shù)量不同。CaSki細(xì)胞具有整合的和游離型的HPV，而SiHa只有整合型HPV。這可能是由于從E6/E7基因表達(dá)的mRNA比較多。對(duì)于CaSki細(xì)胞的檢測(cè)，NASBAHPV16引物的檢測(cè)限為10(1)個(gè)CaSki細(xì)胞，而HPV16 PCR引物的檢測(cè)限為0.1個(gè)CaSki細(xì)胞。這有點(diǎn)奇怪，但可能的解釋是CaSki細(xì)胞含60-600個(gè)HPV16 DNA拷貝，因此對(duì)于6-60個(gè)HPV16 DNA拷貝，可檢出0.1個(gè)CaSki細(xì)胞。與PCR相比，實(shí)時(shí)NASBA的低靈敏度說(shuō)明CaSki細(xì)胞中E6/E7的表達(dá)中等/低下。不穩(wěn)定的mRNA的降解也可作為一種解釋說(shuō)法。CaSki細(xì)胞中的HPV拷貝量約比SiHa細(xì)胞中的大60-600倍，對(duì)CaSki細(xì)胞更靈敏的檢測(cè)顯示了這一點(diǎn)。
類型特異性HPV18 PCR引物能檢出102個(gè)HeLa細(xì)胞。這比HPV共有Gp5+/6+引物大100倍，說(shuō)明特異性引物通常比共有引物更靈敏。類型特異性HPV18 NASBA引物的靈敏度為1(0，1)個(gè)HeLa細(xì)胞，說(shuō)明HeLa細(xì)胞中E6/E7表達(dá)量高。
U1A NASBA引物的靈敏度為10個(gè)SiHa或CaSki。U1A引物組的靶標(biāo)為在每個(gè)人細(xì)胞中都有表達(dá)的人管家基因。
對(duì)于不同的引物組和樣品材料，PCR和NASBA的靈敏度不同，且通常類型特異性引物比共有引物更靈敏，原因在于共有引物組中存在堿基錯(cuò)配。在PCR反應(yīng)中可對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，為引物提供最適的反應(yīng)條件。與PCR的退火溫度相反，NASBA引物的退火溫度必須固定在41℃。這樣缺乏溫度靈活性會(huì)使NASBA引物比PCR引物的靈敏度和特異性差。
PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，而DNA靶標(biāo)通常在每個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)拷貝，這使得PCR對(duì)樣品材料中的細(xì)胞數(shù)目很敏感。NASBA反應(yīng)的靶標(biāo)為DNA，而每個(gè)細(xì)胞中mRNA可以多重拷貝存在，取決于基因的表達(dá)。通過(guò)選擇能高度表達(dá)的基因，每個(gè)細(xì)胞中mRNA的拷貝數(shù)可達(dá)幾百，從而更易檢測(cè)。
dsDNA在細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，可完整保持較長(zhǎng)時(shí)間。與dsDNA相比，mRNA通常不很穩(wěn)定，且取決于細(xì)胞，mRNA的降解會(huì)很快。在裂解緩沖液中無(wú)DNA酶和RNA酶活性檢出，因此dsDNA和ssRNA應(yīng)該穩(wěn)定。自催化活性可降解DNA和RNA。子宮頸樣品中的DNA/RNA在裂解緩沖液中于15-30℃下保存24小時(shí)，在2-8℃下保存7天或在-70℃下長(zhǎng)期保存時(shí)，應(yīng)該能保持完整。
實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)的一個(gè)限制是分子信標(biāo)探針的濃度。產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)超過(guò)分子信標(biāo)探針的濃度，因此不能被檢出，因?yàn)楦邼舛鹊姆肿有艠?biāo)探針會(huì)使反應(yīng)混合物變得更加復(fù)雜并抑制擴(kuò)增反應(yīng)。核苷酸也可能是對(duì)PCR和NASBA反應(yīng)中擴(kuò)增產(chǎn)物最終數(shù)量的一個(gè)限制。由于產(chǎn)物的數(shù)量和反應(yīng)混合物的復(fù)雜性的原因，擴(kuò)增產(chǎn)物的終濃度本身會(huì)抑制擴(kuò)增的進(jìn)一步進(jìn)行。在分子信標(biāo)存在下的NASBA反應(yīng)過(guò)程中，探針可通過(guò)與模板雜交而與擴(kuò)增反應(yīng)相競(jìng)爭(zhēng)，使得其在隨后的RNA合成中不能進(jìn)行。這樣，RNA被用作逆轉(zhuǎn)錄步驟和隨后的通過(guò)T7 RNA聚合酶進(jìn)行的RNA合成的底物。當(dāng)分子信標(biāo)量少時(shí)，此競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系不明顯，而當(dāng)分子信標(biāo)量大時(shí)，此抑制作用可通過(guò)輸入更多的RNA拷貝量來(lái)克服。
對(duì)不同HPV細(xì)胞系的10倍系列稀釋液測(cè)試RNA輸入量與時(shí)間-陽(yáng)性信號(hào)之間的線性關(guān)系。結(jié)果明顯表明，陽(yáng)性信號(hào)取決于RNA的輸入量和時(shí)間。多重反應(yīng)比單一反應(yīng)需要更多的時(shí)間才能顯示陽(yáng)性信號(hào)。這可能是由于多重反應(yīng)器中更復(fù)雜的混合物中的競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，也可能是由于多重反應(yīng)具有不同和較低濃度的引物和探針。目標(biāo)RNA的數(shù)量和時(shí)間-陽(yáng)性信號(hào)之間的關(guān)系揭示了各反應(yīng)器中以RNA為內(nèi)標(biāo)的實(shí)時(shí)多重定量擴(kuò)增反應(yīng)規(guī)律。
實(shí)時(shí)NASBA單一反應(yīng)與多重反應(yīng)。實(shí)時(shí)NASBA通常比實(shí)時(shí)多重NASBA更靈敏。這是可預(yù)料到的，因?yàn)槎嘀胤磻?yīng)中存在引物和探針之間的競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)多重反應(yīng)中引物和分子信標(biāo)探針的終濃度進(jìn)行優(yōu)化，使得對(duì)于至少一個(gè)引物和探針組其濃度能低于在單一反應(yīng)中的濃度。據(jù)此有以下規(guī)律，即引物濃度越低，反應(yīng)靈敏度越低，或至少反應(yīng)越慢。達(dá)到擴(kuò)增反應(yīng)的指數(shù)階段需要更長(zhǎng)的時(shí)間，因此對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)也需要更長(zhǎng)的時(shí)間。NASBA反應(yīng)中引物的濃度不會(huì)成為對(duì)產(chǎn)物終濃度的限制，因?yàn)閺囊镏频玫碾p鏈DNA可不斷循環(huán)作為RNA聚合酶的模板。多重實(shí)時(shí)NASBA與單一實(shí)時(shí)NASBA對(duì)HPV16和HPV18的靈敏度是一樣的，但對(duì)于L1則靈敏度從單一反應(yīng)的10(1)的檢測(cè)限劇烈下降到多重反應(yīng)的103(102)個(gè)CaSki細(xì)胞。對(duì)于U1A NASBA引物，靈敏度從10(1)個(gè)SiHa細(xì)胞降至102(10)個(gè)SiHa細(xì)胞，但對(duì)于CaSki細(xì)胞檢測(cè)限保持不變。檢測(cè)限的降低可能由于多重反應(yīng)中引物和分子信標(biāo)探針之間更加復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。引物和分子信標(biāo)探針的終濃度可能不是最佳的，且多重反應(yīng)中不同的引物和分子信標(biāo)探針會(huì)相互干擾。U1ANASBA引物能檢出1個(gè)HeLa細(xì)胞。有人可能會(huì)猜想在所有的細(xì)胞系中檢測(cè)水平會(huì)一樣，但HeLa細(xì)胞的靈敏度為SiHa和CaSki細(xì)胞的檢測(cè)水平的十分之一。這些細(xì)胞系為癌細(xì)胞，對(duì)上述HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞會(huì)有不同的影響，因此U1A的表達(dá)也不同。表達(dá)的差別也可能由于收獲細(xì)胞時(shí)的計(jì)數(shù)錯(cuò)誤而導(dǎo)致的各反應(yīng)中細(xì)胞數(shù)量的不同。
實(shí)時(shí)NASBA沒(méi)有顯示HPV16、18、31和33之間，或HPV6/11、35、39、45、51、52、58或HPV X的交叉反應(yīng)性。
PCR反應(yīng)的特異性可能優(yōu)于實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)的特異性，因?yàn)镹ASBA反應(yīng)是在41℃下進(jìn)行的等溫反應(yīng)，不可能改變引物的退火溫度。NASBA引物與PCR引物在設(shè)計(jì)上基本相同。與NASBA反應(yīng)相比，在PCR反應(yīng)中，有可能改變退火溫度，因此可為兩引物選擇最適合的退火溫度。這使得引物的退火更具特異性。PCR結(jié)果用凝膠電泳顯示。但與PCR反應(yīng)相比，實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)的分子信標(biāo)探針是另外的一個(gè)參數(shù)，因此可使總NASBA反應(yīng)更具特異性。要發(fā)現(xiàn)DNA序列上不同的引物退火區(qū)域也更容易，因?yàn)镻CR引物的長(zhǎng)度(應(yīng)少于250bp)比NASBA產(chǎn)物的長(zhǎng)度更具靈活性。為了NASBA反應(yīng)的特異性，選擇在不同HPV類型中非保守的獨(dú)特區(qū)域是很重要的。幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配仍可使靶標(biāo)發(fā)生擴(kuò)增或雜交。
用通用L1 NASBA引物能檢出CaSki(整合的和游離型的)細(xì)胞但不能檢出SiHa或HeLa(兩者均為整合的)細(xì)胞，說(shuō)明整合型HPV不顯示任何L1表達(dá)，而游離型的HPV可顯示L1表達(dá)。
總而言之，已開(kāi)發(fā)針對(duì)HPV類型16、18、31和33的鑒定測(cè)試法，用該法能準(zhǔn)確地鑒定這些HPV類型的癌基因的E6/E7表達(dá)。該法還可鑒定主要衣殼蛋白L1的表達(dá)。
實(shí)施例3-在190名患者中進(jìn)行的進(jìn)一步臨床研究患者/臨床樣品采用在1999-2001年間到stfold中心醫(yī)院接受CIN治療的190名婦女的活檢組織。本研究中這190名婦女的平均年齡為37.4歲(年齡范圍在22-74歲)?；顧z組織收集后立即凍存于-80℃。
對(duì)樣品的細(xì)胞學(xué)檢查用常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查報(bào)告記錄細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)果。沒(méi)有對(duì)玻片進(jìn)行再評(píng)價(jià)。各玻片顯示CIN II-III，即高級(jí)異常增生或HSIL，其是入院、陰道鏡檢查和活檢組織檢查的基礎(chǔ)。
對(duì)樣品的組織學(xué)檢查經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查報(bào)告為高級(jí)后，收集活檢組織(本文稱為活檢組織1)。如其確證存在高級(jí)病變(CIN II或III)，患者要再次入院，這次要進(jìn)行陰道鏡指導(dǎo)下的錐形切除術(shù)。在進(jìn)行錐形切除術(shù)前但在進(jìn)行局部麻醉后，從按大體檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)果判斷異常增生最可能集中的部位收集第二份活檢組織(活檢組織2)。在2分鐘內(nèi)將此活檢組織(2×2mm)凍存于-80℃冷凍器中。
活檢組織2在冷凍時(shí)分成兩部分，其中一部分用以進(jìn)行DNA/RNA提取。另一部分固定于10％緩沖甲醛并處理以作組織病理學(xué)檢查。一些病變不能在石蠟塊中正確定向，為顯示相關(guān)的表面上皮細(xì)胞，必須進(jìn)行重新定向或進(jìn)行系列切片。因此，不能保證提取和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)中使用的是剛好一樣的組織。最后，錐形切除樣品由當(dāng)?shù)夭±韺W(xué)者評(píng)價(jià)，病理學(xué)者在任何情況下均能確證存在異常增生。錐樣本與原來(lái)的活檢組織不總是屬同一等級(jí)，且在許多情況下與活檢組織2不是屬同一等級(jí)。
核酸的提取采用前述(Boom等，1990)的自動(dòng)Nuclisens Extractror分離核酸。將各活檢組織分成兩半，一半用以進(jìn)行組織學(xué)檢查，另一半用以進(jìn)行RNA分析。用以進(jìn)行RNA分析的材料在干冰上(-80℃)細(xì)分成碎片，然后加入到1ml的裂解緩沖液(如上所述)中，再用一次性研杵研勻20秒。用裂解緩沖液將100ml的樣品稀釋10倍，再取100ml進(jìn)行DNA/RNA提取。提取的DNA/RNA用～40ml的洗提緩沖液(Organon Teknika)洗提并在-70℃下保存。
本研究中所用的所有分子信標(biāo)探針在其結(jié)構(gòu)的5′末端具有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)。FAM與耦合到3′末端的通用猝滅劑4-(4′二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)的可變莖-環(huán)序列相結(jié)合。上述探針由比利時(shí)Eurogentec提供。反應(yīng)中使用的MB的終濃度為2.5mM。對(duì)于實(shí)時(shí)NASBA我們采用Nuclisens Basic Kit試劑盒(Organon Teknika，Netherland)，該試劑盒可用來(lái)開(kāi)發(fā)用戶定義的RNA擴(kuò)增法。NASBA擴(kuò)增在20μl的體積中進(jìn)行。將引物組和探針導(dǎo)向高風(fēng)險(xiǎn)HPV16、18、31和33的全長(zhǎng)E6/E7 mRNA。為避免核酸降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，作為性能對(duì)照，我們使用了導(dǎo)向人U1核內(nèi)小核糖核蛋白(snRNP)特異性A蛋白(U1 mRNA)(Nelissen等，1991)的引物組和探針。所有樣品都在不同儀器(測(cè)量熒光度和吸光度的微型板閱讀器，自MWG的Bio-tek FL-600FA)上進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。從CaSki/SiHa或HeLa細(xì)胞分離得到的mRNA分別用作HPV16和HPV18轉(zhuǎn)錄物的陽(yáng)性對(duì)照。在每7個(gè)反應(yīng)中有一個(gè)使用除mRNA以外的所有試劑的反應(yīng)作為陰性對(duì)照。
HPV DNA分析；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR使用的提取物及其量與NASBA反應(yīng)中使用的一樣。用L1共有引物Gp5+/6+檢測(cè)含HPV DNA的所有樣品。PCR擴(kuò)增按上述方法進(jìn)行。第一次DNA變性在94℃下進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40輪PCR94℃下變性1分鐘，40℃下退火2分鐘，72℃下延長(zhǎng)1.5分鐘，最后在72℃下延長(zhǎng)4分鐘。如上所述，使用針對(duì)HPV16、18、31和33(6/11、35、45、51、52、58)的PCR類型特異性引物對(duì)HPV進(jìn)行分型。
結(jié)果最初，在通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢查確診CIN I、CIN II或CIN III后，收集了190名患者的活檢組織。通過(guò)組織學(xué)檢查確認(rèn)高級(jí)病變，其中有150個(gè)樣品診斷為CIN III(78.9％)。在進(jìn)行錐形切除術(shù)前收集的活檢組織2用以進(jìn)行RNA分析。但是，對(duì)此活檢組織進(jìn)行的組織學(xué)檢查，結(jié)果在原確診為CIN III的150個(gè)樣品中只診斷出53個(gè)樣品[54個(gè)樣品無(wú)診斷結(jié)果，24個(gè)樣品診斷為CIN II，18個(gè)樣品診斷為CIN I，另4個(gè)樣品診斷為HPV/濕疣]。CIN II樣品的數(shù)量從16個(gè)(8.4％)增加到30個(gè)(15.8％)[通過(guò)組織學(xué)檢查I有24個(gè)樣品診斷為CIN III，4個(gè)樣品為CIN II，1個(gè)樣品為癌，還有1個(gè)樣品為CIN I。組織學(xué)檢查I確診的12個(gè)CIN II病例在組織學(xué)檢查II中的確診率下降]。CIN I的確診數(shù)量從6個(gè)樣品(3.2％)升至32個(gè)樣品(16.8％)。兩個(gè)鱗狀細(xì)胞癌在組織學(xué)檢查II中被診斷為CIN III，腺癌則被診斷為CIN II。在71個(gè)樣品(38.4％)當(dāng)中沒(méi)檢出高級(jí)病變。
在190名患者中有69名(36％)檢出HPV致癌性RNA。在經(jīng)組織學(xué)檢查II確診為CIN III的53個(gè)(28％)樣品中，我們發(fā)現(xiàn)有40個(gè)(76％)樣品顯示HPV16、18、31或33癌基因表達(dá)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在30個(gè)CIN II病例中有9個(gè)(30％)存在癌基因表達(dá)，同樣在32個(gè)CIN I病例中有4個(gè)(13％)、在71個(gè)不顯示細(xì)胞異常的病例中有14個(gè)(20％)、在4個(gè)診斷為HPV/濕疣的病例中有2個(gè)(50％)存在癌基因表達(dá)。
在190名患者中發(fā)現(xiàn)42名有HPV16 RNA，7名(3.7％)有HPV18，15名(7.9％)有HPV31，8名(4.2％)有HPV33。1名患者同時(shí)感染HPV16和HPV18，還有1名患者同時(shí)感染HPV16和HPV31。
使用導(dǎo)向編碼主要衣殼蛋白的L1基因的共有Gp5+/6+引物，通過(guò)PCR在190個(gè)子宮頸活檢組織中有81個(gè)(43％)存在HPV。在第二次組織學(xué)檢查進(jìn)行診斷的119個(gè)病例(115個(gè)病例診斷為CIN，4個(gè)病例診斷為HPV/濕疣)中，發(fā)現(xiàn)有63個(gè)病例含HPV DNA。接受檢測(cè)的另外18個(gè)病例沒(méi)有得出任何組織學(xué)診斷結(jié)果。在81個(gè)病例中有20個(gè)不是通過(guò)NASBA檢測(cè)的，這20個(gè)病例中有7個(gè)診斷為CIN III，2個(gè)診斷為CIN II，4個(gè)診斷為CIN I，7個(gè)沒(méi)有確診結(jié)果。
類型特異性PCR檢出有85個(gè)病例存在HPV；有66個(gè)病例存在HPV16，有10病例存在HPV18，有14個(gè)病例存在HPV31，有7個(gè)病例存在HPV33。有12個(gè)病例存在多重感染3個(gè)感染HPV16+18，4個(gè)感染HPV16+33，5個(gè)感染HPV16+31。有20個(gè)病例無(wú)確診結(jié)果。
實(shí)施例4通過(guò)PrTect HPV-Proofer和PCR檢測(cè)HPV(與細(xì)胞學(xué)檢查和組織學(xué)檢查相比較)正常樣品和ASCUS樣品(包括疑似涂片)用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢查。所有樣品都用共有PCR和PreTect HPV-Proofer測(cè)試，但只有共有陽(yáng)性樣品通過(guò)PCR進(jìn)行分型。CIN3樣品和癌癥樣品通過(guò)組織學(xué)方法進(jìn)行檢查，所有樣品均用三種方法進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果在圖6中顯示。下表15顯示與細(xì)胞學(xué)檢查和組織學(xué)檢查相比實(shí)時(shí)多重NASBA和PCR之間的一致性。
表15與細(xì)胞學(xué)檢查或組織學(xué)檢查相比實(shí)時(shí)多重NASBA和PCR之間的一致性
只對(duì)通過(guò)Gp5+/6+PCR證明陽(yáng)性的樣品進(jìn)行分型。
a包括PCR和實(shí)時(shí)多重NASBA陽(yáng)性和陰性樣品。b只包括PCR和/或?qū)崟r(shí)多重NASBA陽(yáng)性樣品。cASCUS，排除疑似涂片。
實(shí)施例5本發(fā)明提供了用以檢測(cè)HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的試劑盒，所述試劑盒包括一種或多種、兩種或多種并優(yōu)選所有以下引物對(duì)和伴隨的鑒定探針。
HPV16HPV16.txt 7905b.pHPV16P2p2116(20) GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA16p1(no7)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG ATT CCC ATC TCT ATA TAC TA(51baser)HPV16PO2po230(20) TATGACTTTGCTTTTCGGGAH16e6702poHPV18HPV18.txt7857b.pHPV18P2p2698(22) GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAGH18e6702p2HPV18P4p1817(20)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTH18e6703p1(Multiplex)HPV18PO2po752(21) GAACCACAACGTCACACAATGH18e6702poHPV31HpV31.txt7912b.pHPV31P3p2617(20) GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTATGA
H31e6703p2p1766(20)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTGCTCTGTH31e6703p1HPV31PO4po686(26) GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAH31e6704poHPV 33HPV33.txt 7909b.pHPV33P1p2618(22) GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTATH33e6701p2p1763(19)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACGAACTGH33e6701p1HPV33PO3po699(23) GGACAAGCACAACCAGCCACAGCH33e6703po所述試劑盒還可任選包括一種或多種以下分子信標(biāo)探針，作為上述探針的替代物分子信標(biāo)探針H16e6702mb2-FAM ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctggH18e6702mb1-TxR cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcgH31e6704mb2-FAM ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacggH33e6703mb1-FAM ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg
優(yōu)選本發(fā)明試劑盒還包括以下引物對(duì)和探針HPV45HPV45.txt 7858bp(X74479)HPV45P1p2430(21) GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAAH45e6701p2p1527(22)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCAH45e6701p1HPV45PO1po500(20) GTACCGAGGGCAGTGTAATAH45e6701po上述HPV45探針可如下用HPV分子信標(biāo)探針取代H45e6701mb1cgatcgGTACCGAGGGCAGTGTAATAcgatcg此外，取決于使用所述試劑盒的地區(qū)，所述試劑盒可包括一種或多種以下引物對(duì)和伴隨的鑒定探針。
HPV52P1p2144(22) GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGTGTGAGGTGCTGGAAGAATH52e6701p2p1358(18)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCTCTCTTCTAATGTTTH52e6701p1HPV52PO1Po296(20)GTGCCTACGCTTTTTATCTAH52e6701poHPV58 HPV58.txt 7824bp(D90400)
HPV58P2p2173(18)GATGCAAGGTCGCATATGAGTCTGTGCATGAAATCGAAH58e6702p2p1291(18)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCACACTTTACATACTGH58e6702p1HPV58PO2po218(22)TTGCAGCGATCTGAGGTATATGH58e6702poHPV51 HPV51.txt7808 bp(M62877)HPV51PA/Pp2655(23)GATGCAAGGTCGCATATGAG AGA GGA GGA GGA TGA AGT AGA TAH51e6702p2p1807(20)AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCCCATTAACATCTGCTG TA H51e6701p1HPV51POApo771(24)TGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACAH51e67o2po在試劑盒中，上述探針可用以下分子信標(biāo)探針取代H52e6701mb1 cgatcgGTGCCTACGCTTTTATCTAcgatcgH58e6702mb1 ccgtcgTTGCAGCGATCTGAGGTATATGcgacggH51e6702mb1 cgatcgTGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACAcgatcg。
權(quán)利要求
1.一種檢查人類個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，所述方法包括檢查所述個(gè)體的人乳突淋瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)情況，其中L1和/或E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。
2.一種檢查人類個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，所述方法包括檢查個(gè)體的人乳突淋瘤病毒(HPV)L1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物和HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，而且根據(jù)L1和/或E6mRNA的表達(dá)按以下分類法將所述個(gè)體歸類于四類宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之風(fēng)險(xiǎn)類型1至少HPV類型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1 mRNA表達(dá)陰性但E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性；風(fēng)險(xiǎn)類型2至少HPV類型16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66或68之一的L1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性且E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性；風(fēng)險(xiǎn)類型3L1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性但E6 mRNA表達(dá)陰性；風(fēng)險(xiǎn)類型4L1 mRNA表達(dá)陰性且E6 mRNA表達(dá)陰性。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括檢查p16ink4a的表達(dá)，其中L1和/或E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性且p16ink4a表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。
4.一種檢查人類個(gè)體體內(nèi)是否存在整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的體外方法，所述方法包括檢查所述個(gè)體的人乳突淋瘤病毒L1基因和E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)情況，其中L1 mRNA表達(dá)陰性但E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者評(píng)定為攜帶整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的個(gè)體。
5.一種檢查人類個(gè)體體內(nèi)是否存在整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的體外方法，所述方法包括檢查所述個(gè)體的人乳突淋瘤病毒E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)情況，其中E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為攜帶整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的個(gè)體。
6.一種檢查人類個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，所述方法包括檢查個(gè)體HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，并根據(jù)E6 mRNA的表達(dá)情況將所述個(gè)體歸類于兩類宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)之一的個(gè)體，其中E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為攜帶整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的個(gè)體，因此將其歸類為宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，而E6mRNA表達(dá)陰性的個(gè)體評(píng)定為不攜帶整合型HPV或修飾游離型HPV基因組的個(gè)體，因此將其歸類為無(wú)可檢測(cè)的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。
7.一種鑒定具有宮頸細(xì)胞異常變化的人類個(gè)體的體外方法，所述方法包括檢查所述個(gè)體HPV E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)情況，其中E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體鑒定為宮頸細(xì)胞異常變化個(gè)體。
8.權(quán)利要求5至7之任一項(xiàng)的方法，其中所述人類個(gè)體為以前曾被鑒定為宮頸細(xì)胞感染人乳突淋瘤病毒DNA的個(gè)體。
9.權(quán)利要求5至7之任一項(xiàng)的方法，其中所述人類個(gè)體為以前曾被診斷為ASCUS、CIN 1病變或濕疣的個(gè)體。
10.權(quán)利要求4至9之任一項(xiàng)的方法，其中至少HPV類型16、18、31、33或45之一的E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的個(gè)體評(píng)定為攜帶整合型HPV的個(gè)體。
11.權(quán)利要求1至4之任一項(xiàng)的方法，所述方法包括使用能檢測(cè)幾乎所有已知HPV類型的L1 mRNA的技術(shù)檢查L(zhǎng)1 mRNA表達(dá)情況。
12.權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的方法，所述方法包括使用能檢測(cè)至少一種癌相關(guān)HPV類型的E6 mRNA的技術(shù)檢查E6 mRNA表達(dá)情況。
13.權(quán)利要求12的方法，所述方法包括使用能檢測(cè)HPV類型16、18、31、33而且優(yōu)選45的E6 mRNA的技術(shù)檢查E6 mRNA表達(dá)情況。
14.權(quán)利要求1至13之任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)L1和/或E6 mRNA表達(dá)的檢查是通過(guò)使用用以擴(kuò)增mRNA某區(qū)域的擴(kuò)增反應(yīng)并結(jié)合對(duì)所述擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)進(jìn)行的。
15.權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)L1和/或E6 mRNA表達(dá)的檢查是通過(guò)使用實(shí)時(shí)NASBA來(lái)進(jìn)行的。
16.一種用于檢測(cè)HPV L1和E6基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種適用于擴(kuò)增至少HPV類型16、18、31、33而且優(yōu)選45的L1轉(zhuǎn)錄物某區(qū)域的引物對(duì)，以及一種或多種能擴(kuò)增HPV類型16、18、31、33而且優(yōu)選45的E6轉(zhuǎn)錄物某區(qū)域的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供檢查人類女性個(gè)體以評(píng)估她們發(fā)生宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的體外方法，所述方法包括檢查所述個(gè)體的人乳突淋瘤病毒E6基因以及任選L1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)情況，其中L1和/或E6 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者評(píng)定為有發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供了實(shí)施所述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1639357SQ03805380
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月7日
發(fā)明者F·卡爾森 申請(qǐng)人:諾奇普公司