專利名稱：4,5－二羥基－2－環(huán)戊烯－1－酮(dhcp)處理對細菌基因表達和群體感應(yīng)的影響的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域細菌中基因表達和群體感應(yīng)的調(diào)控相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域許多抗生素能有效抵抗各種細菌；然而，近年來，多重耐藥細菌的出現(xiàn)已經(jīng)成為一種主要問題。這促使人們尋找更新的和更有效的抗細菌化合物。早先，本發(fā)明人實驗室報道其中一種化合物，4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(DHCP)，對各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，諸如大腸桿菌，沙門氏菌，芽孢桿菌屬，葡萄球菌等具有抗細菌活性。DHCP可以通過加熱處理糖醛酸或其衍生物而制備(Koyama等，1999)。它也可由烘焙或烤干的蔬菜，果實，谷物，蘑菇，海藻，樹皮或軟骨產(chǎn)生(Koyama等，1999)。它顯示出作為治療或預(yù)防藥劑用于抗癌的應(yīng)用潛力，以及作為抗細菌劑用于防腐劑，牙膏，化妝品和洗浴藥劑的應(yīng)用潛力(Koyama等，1999)。DHCP也可以通過微生物合成。當S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被用作DNA，RMA或蛋白生物合成的甲基供體時，一些SAM-依賴的轉(zhuǎn)甲基酶將甲基從SAM轉(zhuǎn)移給其底物產(chǎn)生S-腺苷高半胱氨酸(SAH)，然后S-腺苷高半胱氨酸(SAH)通過酶Pfs降解產(chǎn)生S-核糖基高半胱氨酸(SRH)。SRH最終轉(zhuǎn)換成高半胱氨酸和4，5-二羥基-2，3-戊二酮(Miller等，1968和Schauder等，2001)?；谄浣Y(jié)構(gòu)，DHCP可能是由后者形成。
自大腸桿菌基因組文庫分離出一種DHCP毒性多拷貝抑制因子。該抑制因子編碼基因命名為dep，將推斷地所述基因的編碼蛋白命名為Dep.Dep蛋白顯示出與已知的排出蛋白具有高度同源性，這些排出蛋白賦予對氯霉素，雙環(huán)霉素和四環(huán)素等許多抗生素的抗性。然而Dep蛋白并未賦予對任何檢測抗生素的交叉抗性(Phadtare等，2001)。DHCP確切的作用機理是未知的。
最近，在有關(guān)大腸桿菌群體感應(yīng)的研究中DHCP引起了注意(Schauder等，2001)。許多細菌能夠通過分泌生長階段相關(guān)的低分子量信號傳導(dǎo)信息素(phermone)來控制特異基因的表達。該過程被命名為群體感應(yīng)。群體感應(yīng)調(diào)控的生理學(xué)過程存在于各種細菌中，包括生物發(fā)光，抗生素合成，致病性，蛋白分泌，莢膜的外多糖合成，生物薄膜形成，運動性(綜述見Miller等，2001；Schauder等，2001和Whitehead等，2001)。群體感應(yīng)的研究特別重要，因為調(diào)控細胞密度是其一種顯著特征，而許多產(chǎn)生這種應(yīng)答的化合物具有抗細菌活性。哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)，一種革蘭氏陰性生物發(fā)光海洋細菌，可對兩種不同的自誘導(dǎo)物AI-1和AI-2產(chǎn)生應(yīng)答而調(diào)節(jié)光產(chǎn)生。AI-1是高絲氨酸內(nèi)酯，用于種內(nèi)通訊。AI-2用于種間通訊，其結(jié)構(gòu)是未知的。AI-2由SAM產(chǎn)生，在大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，哈維氏弧菌(V.harveyi)，霍亂弧菌(V.cholerae)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)中其生物合成途徑和生物合成生化中間體是相同的。一些化合物被篩選作為AI-2候選物，DHCP是其中之一。然而，DHCP在篩選試驗中沒有顯示任何活性，因此被排除作為AI-2候選物(Schauder等，2001)的可能。
此處任何文獻的引用并非打算承認這些文獻為本申請任何權(quán)利要求專利性的相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)，或必需材料。對于所有文獻內(nèi)容或日期的任何陳述，乃基于申請人遞交申請時所能獲得的信息，并不等同于認可這些陳述的正確性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)微生物基因的方法，該方法通過將要調(diào)節(jié)其基因的微生物與4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(DHCP)接觸從而調(diào)節(jié)微生物中的基因。要調(diào)節(jié)的基因包括脅迫應(yīng)答基因，膜合成和膜功能相關(guān)基因，具各種功能的蛋白的編碼基因，和編碼未知功能的蛋白的基因。這些要調(diào)節(jié)基因的非限制實施例包括下文列于表1到7的基因及其類似物。優(yōu)選地，所述基因參與諸如群體感應(yīng)回路的打開/關(guān)閉或種間自誘導(dǎo)物AI-2活性產(chǎn)生的群體感應(yīng)過程。
本發(fā)明也提供了一種用于篩選其基因表達水平受DHCP影響的生理活性物質(zhì)的方法，以及提供了通過該方法獲得的一種生理活性物質(zhì)。該方法包括在候選物質(zhì)存在或者缺少的情況下培養(yǎng)微生物，然后測定在候選物質(zhì)存在或者缺少的情況下該微生物的基因表達水平，其中所述基因是表達水平受DHCP影響的那些。如果在候選物質(zhì)存在的情況下基因表達水平相對于候選物質(zhì)缺乏的情況下顯著地增高或者降低，則鑒定這種候選物質(zhì)為能顯著地影響至少一種基因表達水平的生理活性物質(zhì)。用于此方法基因的非限制性實施例包括下文列于表1到7的基因及其類似物。作為優(yōu)選的實施方案，基于基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量或通過DNA微陣列雜交測定基因的表達水平。
本發(fā)明的另一方面涉及一種增加微生物中重組多肽產(chǎn)量的方法，包括在有DHCP存在時培養(yǎng)微生物以增加重組多肽的表達和產(chǎn)量，然后回收培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組多肽。
本發(fā)明的另一方面涉及一種利用DHCP作為活性成分抑制種間群體感應(yīng)誘導(dǎo)物，例如誘導(dǎo)物AI-2活性的方法。
本發(fā)明的再一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用DHCP生產(chǎn)一種用于調(diào)節(jié)微生物基因的組合物，以及包含DHCP作為活性成分的組合物用于調(diào)節(jié)微生物基因；用于調(diào)節(jié)群體感應(yīng)，例如cysk表達；用于打開/關(guān)閉群體感應(yīng)回路；用于抑制種間群體感應(yīng)誘導(dǎo)物，例如AI-2的活性；用于調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答基因表達；用于調(diào)節(jié)群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因的表達；用于促進重組蛋白分泌；用于調(diào)節(jié)列于表1到7的基因的表達，或用于維持內(nèi)環(huán)境平衡。


圖1是顯示DHCP對mRNAs水平影響的凝膠。如實施例1材料和方法部分所述使用熱酚法提取RNA，用osmY，dps，rpoS，katG，cysK，tehA，zipA和ompF相應(yīng)的寡核苷酸進行引物延伸分析。對每個基因泳道1和2分別表示由對照(未處理的)和DHCP處理細胞分離的mRNAs。
圖2A和2B是顯示DHCP抑制AI-2活性的圖表。如實施例1材料和方法部分所述進行AI-2活性試驗。哈維氏弧菌BB152中所見的發(fā)光度假定為100％，其它活性表示為相對的百分率(％)。在附圖2A中，泳道如下無菌的AB培養(yǎng)基，泳道1；哈維氏弧菌BB152培養(yǎng)液，泳道2；DHCP(250μM)泳道3；DHCP(250μM)加哈維氏弧菌BB152培養(yǎng)液，泳道4。在附圖2B中，用AI-2產(chǎn)生最大量發(fā)光后，以250μM(實心圓)和100μM(空心正方形)將DHCP添加給反應(yīng)混合物。不添加DHCP的相應(yīng)AI-2對照活性也顯示出來(空心三角形)。用液體閃爍計數(shù)器監(jiān)控不同時間點的發(fā)光量。
發(fā)明詳述通過參考下列實施例可更容易理解本發(fā)明，下列實施例是作為示例提供而不是要用來限定本發(fā)明的。
實施例1本發(fā)明人用DNA微陣列來分析大腸桿菌(E.coli)應(yīng)答DHCP的普遍轉(zhuǎn)錄模式以(i)研究DHCP抗細菌活性的表現(xiàn)(ii)研究DHCP參與大腸桿菌群體感應(yīng)途徑的可能性。本發(fā)明人獲得的結(jié)果表明(i)DHCP在大腸桿菌中具有廣泛的影響，影響參與常規(guī)新陳代謝和膜合成和功能的蛋白的編碼基因，以及(ii)包括群體調(diào)節(jié)過程，例如毒性，運動性和外膜功能在內(nèi)的基因受DHCP處理的影響。在DHCP處理的細胞中諸如sapF(Lopez-Solanilla等，1998)，potA，和potB(DeLisa等，2001)等毒性相關(guān)基因的表達水平下降。來自大腸桿菌的sapF基因和來自費希氏弧菌的sapF同源，后者被證明可被LuxR-AI復(fù)合體增強，有人建議sapF在費希氏弧菌生物發(fā)光中起作用(Chen等，2000)。此外，一種已知在大腸桿菌替代的途徑中起作用的群體感應(yīng)基因cysK(Baca-DeLancey等，1999)響應(yīng)DHCP顯著地增強。本實施例展現(xiàn)的結(jié)果顯示，DHCP調(diào)節(jié)大腸桿菌中不同群體感應(yīng)回路的打開/關(guān)閉。
材料和方法細菌菌株大腸桿菌野生型菌株 JM83[F-araΔ(lac-proAB)rpsL(strr)](Yanisch-Perron等，1985)生長在Luria肉湯(LB)中。哈維氏弧菌BB152和BB170菌株由Bonnie Bassler博士惠贈(普林斯頓大學(xué))。這些菌株如前所述生長在AB培養(yǎng)基中(Yanisch-Perron等，1985)。
RNA分離將在LB培養(yǎng)基中生長過夜的大腸桿菌細胞稀釋到新鮮的LB培養(yǎng)基中。生長達到50Klett單位后，加入DHCP(250μM)并進一步監(jiān)控生長。生長達到90-100Klett單位后，將其稀釋10倍到含有如前所述相同濃度DHCP的培養(yǎng)基中(Phadtare等，2001)。DHCP溫育8小時后收獲細胞。不加入DHCP以同樣方式培養(yǎng)對照細胞，并在OD600相當于DHCP處理細胞的最終OD600時收獲細胞。如前所述使用熱酚法抽提總RNA(Sarmientos等，1983)。用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)作進一步純化，然后用DNase I處理，繼之以酚-氯仿處理和乙醇沉淀。通過測定260nm吸光率進行定量。用瓊脂糖凝膠電泳確認RNA純度。
DNA微陣列分析用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia公司)標記mRNAs。用隨機六聚物pd(N)6作為引物，使用IntelliGene大腸桿菌芯片1版本(Takara Shuzo有限公司，日本)進行DNA微陣列分析。它代表大腸桿菌K-12 W3110的全部ORF。
引物延伸用于檢測相應(yīng)的mRNA的引物為引物750077，5′-TACAGCCAGCAGAGTTTTCGAAAT-3′(SEQ ID NO1)，相應(yīng)于osmY第15到第8密碼子序列(Yim等，1992)；引物750078，5′-ATAAAGCAGATTGGTCGCTTTTGA-3′(SEQ ID NO2)，相應(yīng)于dps第16到第9密碼子序列(Altuvia等，1994)；引物979747，5′-CAGCGTATTCTGACTCATAAGGTG-3′(SEQ ID NO3)，相應(yīng)于rpoS自第6密碼子的區(qū)域(Takayanagi等，1994)；引物956660，5′-AGTGGCTGTGGTGTTATGGATATC-3′(SEQ ID NO4)，相應(yīng)于katG第13到第16密碼子區(qū)域(Triggs-Raine等，1998)；引物3969805，5′-CAGGCGAACCAGCGGCGTGTGACC-3′(SEQ ID NO5)，相應(yīng)于cysK第20到第13密碼子區(qū)域(Byrne等，1988)；引物3969806，5′-GTAGCCTGCCGGCAAATTGAGCAC-3′(SEQ ID NO6)，相應(yīng)于tehA第13到第6密碼子區(qū)域(Walter等，1991)；引物3969807，5′-GATTAATATCAGACGCAAATCCTG-3′(SEQ ID NO7)，相應(yīng)于zipA第10到第3密碼子區(qū)域(Hale等，1997)；和引物7018，5′-ACGGGATCCTTCATCATTATTTATTA-3′(SEQ ID NO8)，包括含有自ompF第1密碼子的區(qū)域(登錄號，J01655，M10311和M10312)。使用T4多核苷酸激酶(Gibco BRL公司)用[γ-32P]腺苷三磷酸(Du-Pont-New Bngland Nuclear公司)標記引物。使用5微克RNA在42℃進行引物延伸，反應(yīng)進行1小時，最終反應(yīng)體積為10微升，含有50μMTris-HCl(pH 8.5)，8μM MgCl2，30μM KCl，1μM二硫蘇糖醇，0.4pmol32P標記的引物，0.5μM的各種dNTP，10單位RNase抑制劑(Boehringer Mannheim公司)和6.25單位逆轉(zhuǎn)錄酶(BoehringerMannheim公司)。在變性條件下用6％聚丙烯酰胺凝膠分析產(chǎn)物。通過直接放射性測量定量引物延伸產(chǎn)物。
AI-2分析如Surette和Bassler所述使用哈維氏弧菌報道分子菌株(BB170)進行AI-2分析(Surette等，1999)。使用哈維氏弧菌BB152菌株無細胞的培養(yǎng)液作為陽性對照。使用無菌的AB培養(yǎng)基作為陰性對照。簡要地，在AB培養(yǎng)基中30℃過夜培養(yǎng)哈維氏弧菌BB170菌株，然后將細胞以1∶5000倍稀釋到新鮮培養(yǎng)基中。將稀釋的培養(yǎng)物(90微升)加入到分析混合物中，其中包含10微升AB培養(yǎng)基或者哈維氏弧菌Bb152/DHCP(100-250μm)無細胞培養(yǎng)液。為檢查DHCP對AI-2產(chǎn)生的發(fā)光量的影響，在反應(yīng)混合物達到最大發(fā)光后將其加入。用液體閃爍計數(shù)器監(jiān)控發(fā)光量。
結(jié)果本發(fā)明人實驗室先前已經(jīng)表明，在DHCP(250μM)存在經(jīng)3小時培養(yǎng)后嚴重損害大腸桿菌JM83的生長，而在5小時后細胞停止生長(Phadtare等，2001)。本研究主要目的是鑒定DHCP處理可引起mRNA豐度顯著增減的所有大腸桿菌讀碼框。對照(未處理的)和DHCP處理細胞的細胞密度是相同的；因此，微陣列所見的改變基本上不受細胞差異的影響。使用從相應(yīng)細胞分離的RNA作為DNA陣列雜交的探針，如本實施例材料和方法部分所述測定數(shù)據(jù)。計算相應(yīng)點的對數(shù)表達比值可以對在兩種生長條件下各個大腸桿菌基因的相對轉(zhuǎn)錄水平進行配對比較。只考慮表達水平的對數(shù)比值至少是4的基因。一些情況下考慮屬于相同操縱子或者相同種類的基因，即使對數(shù)比值倍數(shù)相差僅僅是3或者稍微小于3。對數(shù)比值高于零值表明DHCP處理誘導(dǎo)表達而低于零表明抑制表達。使用相應(yīng)于那些被顯著影響基因的寡核苷酸進行引物延伸來確證DNA微陣列分析所見結(jié)果。結(jié)果如附圖1所示并被概括在表1，兩種方法的結(jié)果彼此相符合。
表1 DNA微陣列和引物延伸的結(jié)果比較基因微陣列引物延伸osmY12.00 15.00dps 13.00 12.00rpoS4.00 4.00katG9.00 9.00cysK20.00 18.00tehA5.00 5.00zlpA4.50 6.00ompF0.06 0.06顯示DHCP處理相對對照(未處理)細胞各種基因相應(yīng)mRNA水平的比值。
本發(fā)明人實驗室觀察到許多包括廣泛功能的應(yīng)答基因(i)編碼核醣體蛋白的基因，(ii)編碼脅迫應(yīng)答普遍調(diào)節(jié)因子-RpoS和RpoS調(diào)節(jié)蛋白的基因，(iii)參與膜合成與諸如轉(zhuǎn)運等膜功能的基因，(iv)編碼參與常規(guī)新陳代謝蛋白的基因，(v)編碼具各種功能的蛋白的基因，和(vi)編碼推測的蛋白和未知功能或者種類的蛋白的基因。
核醣體蛋白的編碼基因受DHCP處理的影響因為本實驗選擇的DHCP濃度嚴重危害生長，顯著的次級效應(yīng)可能是由于生長抑制本身引起，并不一定反映DHCP的作用靶點。生長率減慢的一種現(xiàn)象是細胞的翻譯機制受到影響，證據(jù)是核醣體蛋白水平下降。見表2，大多數(shù)編碼核醣體L蛋白的基因顯示出水平下降，盡管大多數(shù)情況下影響不嚴重(2-3倍)。
表2.DHCP對核醣體蛋白編碼基因的影響基因基因產(chǎn)物和/或功能比值(DHCP-處理/對照)rplA核糖體蛋白L1 0.23rplB核糖體蛋白L2 0.25rplC核糖體蛋白L3 0.28rplD核糖體蛋白L4 0.27rplE核糖體蛋白L5 0.34rplF核糖體蛋白L6 0.30rplI核糖體蛋白L9 0.25rplJ核糖體蛋白L10 0.28rplK核糖體蛋白L11 0.39rplM核糖體蛋白L13 0.49rplN核糖體蛋白L14 0.44rplO核糖體蛋白L15 0.36rplP核糖體蛋白L16 0.36rplQ核糖體蛋白L17 0.47rplR核糖體蛋白L18 0.38rplS核糖體蛋白L19 0.35rplV核糖體蛋白L22 0.28rplW核糖體蛋白L23 0.27rplX核糖體蛋白L24 0.31rplY核糖體蛋白L25 0.28rpmB核糖體蛋白L28 0.45rpmE核糖體蛋白L31 0.39DHCP對膜相關(guān)功能的影響接著，檢測了DHCP對不同種類基因的影響。如表3所示，40種細胞膜相關(guān)蛋白的編碼基因受到顯著影響。突出地，特別是參與鐵轉(zhuǎn)運(fecA，fecB，fecC，fecD，fepA和fepC)和亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運(potA，potB，potC和potD)的細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)受到影響。外膜蛋白編碼基因(Omp)水平也降低(5-15倍)。參與運動功能的蛋白的編碼基因諸如motA，motB和cheA降低4-6倍。有趣地，鋅-轉(zhuǎn)運ATPase編碼基因atzN增高11倍。CreD編碼基因creD表現(xiàn)出最顯著的差異(47倍增加)。因為CreD的確切功能是未知的(Avison等，2001)，所以難以判斷這一觀察結(jié)果的生理意義。creD一個重要特點是受CreBC調(diào)節(jié)，CreBC是cre調(diào)節(jié)子的第一個成員和一種假定的普遍調(diào)節(jié)因子(Avision等，2001)。另一個受CreBC調(diào)節(jié)的基因是talA(Avision等，2001)，它在本研究中也增加7.6倍(表6)。talA編碼參與甘油醛-3-磷酸動員到戊糖磷酸途徑的酶。其它CreBC調(diào)節(jié)的基因諸如yidS，和yieI，雖然其產(chǎn)物沒有確定任何功能，也增加4倍(表7)。然而其它CreBC調(diào)節(jié)的基因諸如ackA，pta，radC，malE和trgB不受DHCP誘導(dǎo)。事實上，ackA降低3.6倍(表5)。其它一些因子可能也參與這些基因的表達調(diào)控。
編碼賦予對亞碲酸鹽抗性的蛋白的tehA基因的水平有5倍的顯著增加。亞碲酸鹽在許多革蘭氏陰性細菌中產(chǎn)生毒性，這些毒性的確切的機制是來知的，然而已經(jīng)表明它產(chǎn)生氧化脅迫和可能在不同蛋白中替代硫，致使它們變成無功能的(Garberg等，1999和Summers等，1977)。tehA超表達也賦予對諸如四苯基氯化砷，溴化乙錠，結(jié)晶紫和原黃素等化合物的抗性，類似于推斷的多重藥物抗性泵的功能(Turner等，1997)。
表3 DHCP對參與膜合成和膜相關(guān)功能基因的影響比率基因基因產(chǎn)物和/或功能 (DHCP-處理/對照)ansPL-天冬酰胺透性酶 0.29atoE短鏈脂肪酸 0.17atzN鋅-轉(zhuǎn)運ATPase 11.30cheA趨化蛋白CheA 0.25cpxP周質(zhì)蛋白前體 4.95creD內(nèi)膜蛋白CreD 47.00czcD陽離子排出蛋白CzcD 3.60fadL長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白 0.10fecA二檸檬酸鐵(III)轉(zhuǎn)運蛋白FecA0.16fecB二檸檬酸鐵(III)結(jié)合蛋白0.15fecCFecC蛋白 0.21fecD二檸檬酸鐵(III)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蛋白0.15fecE二檸檬酸鐵(III)轉(zhuǎn)運蛋白0.11fepA鐵螫合素受體前體 0.25fepC鐵腸桿菌素轉(zhuǎn)運蛋白FepC 0.40glf UDP-吡喃半乳糖變位酶 0.20lysP細胞溶素特異性透性酶 0.16motA趨化蛋白MotA 0.18motB趨化蛋白MotB 0.40msyB膜蛋白 4.25nmpC外膜孔道蛋白前體 0.01ompA外膜蛋白a前體 0.23ompC外膜蛋白c前體 0.20ompF外膜蛋白f前體 0.06ompT蛋白酶VII 0.11pheP苯丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白pheP 0.13plsXPlsX蛋白 0.28potA亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運蛋白A 0.13potB亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)0.13
potC亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng) 0.20potD亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運蛋白D 0.19rfc 可能的O-抗原聚合酶0.23sdaC可能的絲氨酸轉(zhuǎn)運蛋白 0.25secF分泌蛋白SecF 0.26secGP12細胞質(zhì)膜蛋白 0.30secYSecY蛋白 0.40tehA亞碲酸鹽抗性蛋白TehA 5.00tsr 甲基接受性趨化蛋白(mcp-1) 0.22tsx 核苷特異性通道形成蛋白0.22znu 高親合性鋅攝取系統(tǒng)蛋白0.13DHCP誘導(dǎo)RpoS和RpoS調(diào)節(jié)的蛋白RpoS是一種普遍的脅迫應(yīng)答調(diào)節(jié)因子，已知它也參與大腸桿菌中的群體感應(yīng)(Hengge-Aronis，2000和Sitnikov等，1996)。接下來，檢驗了DHCP對rpoS水平的影響，發(fā)現(xiàn)在DHCP處理之后誘導(dǎo)rpoS4倍增加。Dps，一種受氧化和滲透壓力誘導(dǎo)的蛋白(Altuvia等，1994和Martinez等，1997)，其編碼基因dps被誘導(dǎo)13倍(表4)。其它基因諸如RpoS調(diào)節(jié)的脅迫蛋白OsmY和KatG的編碼基因osmY和katG，各自也顯著受到誘導(dǎo)(Hengge-Aronis，2000和Yim等，1994)。有趣地是，其它一些不參與脅迫應(yīng)答的RpoS調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因也受到誘導(dǎo)，這可能和RpoS本身的較高水平有關(guān)。這些例子包括hdeB，otsA，poxB和wrbA(表4)。
表4 DHCP對參與膜合成和膜相關(guān)功能基因的影響比率基因基因產(chǎn)物和/或功能(DHCP-處理/對照)dps DNA結(jié)合蛋白Dps13.00hdeB10k-1蛋白前體 6.00katG過氧化氫酶HPI 9.00osmY高滲誘導(dǎo)蛋白 12.00otsA海藻糖-6-磷酸合酶 11.00poxB丙酮酸脫氫酶 15.00rpoS核糖核蛋白聚合酶sigma因子RpoS 4.00wrbA色氨酸阻遇物結(jié)合蛋白 14.00DHCP對參與常規(guī)新陳代謝基因的影響接下來檢測DHCP處理如何影響細胞常規(guī)新陳代謝。類似于對膜的影響，DHCP處理影響許多參與細胞常規(guī)新陳代謝的過程，其中一些可能是DHCP處理的次級效應(yīng)。44種基因在DHCP處理之后顯示顯著不同的表達水平(表5)。最突出的基因是參與半胱氨酸合成的蛋白的編碼基因。觀察到諸如cysA，cysD，cysH，cysI，cysJ，cysK，cysM，cysN，cysP，cysQ，cysU，和cysW等屬于參與半胱氨酸合成的調(diào)節(jié)子的基因表達水平顯著增加(3-20倍)。其中，cysK顯示20倍的最大增加。有趣地是，不屬于這些調(diào)節(jié)子的cysG和cysS不受DHCP處理的影響。屬于其它操縱子的受DHCP處理誘導(dǎo)的基因分別屬于涉及半乳糖和鉬代謝的半乳糖操縱子和moa操縱子。另一方面，屬于Ent操縱子的基因減少。fru(fruB和fruK)系統(tǒng)也被嚴重地抑制(分別為8和33倍)。
表5.對DHCP產(chǎn)生應(yīng)答的參與常規(guī)新陳代謝的基因比率基因 基因產(chǎn)物和/或功能 (DHCP-處理/對照)ackA 乙酰激酶 0.28AldH 醛脫氫酶同系物 6.50CtsA 硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白 3.00CysD 硫酸鹽腺苷酰(基)轉(zhuǎn)移酶 5.88CysH 硫酸腺苷酸還原酶 6.50CysI 亞硫酸鹽還原酶(NADPH)α亞基7.30CysJ 硫酸鹽還原酶(NADPH)β亞基 4.70CysK 半胱氨酸合成酶 20.00CysM O-乙酰絲氨酸(硫醇)-裂解酶B 3.00CysN 硫酸鹽腺苷酸轉(zhuǎn)移酶 5.00CysP 硫代硫酸鹽-結(jié)合蛋白CysP前體3.55CysQ 銨基轉(zhuǎn)運蛋白CysQ 3.28cysU 硫酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)透性酶 4.99CysW 硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白CysW 15.00EntA 2，3-二氫-2，3-二羥基安息香酸 0.44EntB 異分支酸酶 0.23EntC 異分支酸合成酶 0.45EntE 腸螯合素合成酶 0.32Fbp 果糖-1，6-二磷酸酶 4.00FruB PTS系統(tǒng)0.12FruK I-磷酸果糖激酶 0.03Gale UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶4.60GalM 醛糖-1-差向異構(gòu)酶 4.00GalP 半乳糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)移蛋白 5.21GalT 半乳糖-1-磷酸鹽尿苷酰轉(zhuǎn)移酶6.50GlnH 谷氨酰胺-結(jié)合蛋白前體 4.90GltB 谷氨酸合酶(NADPH)大鏈 3.50Gsp 谷胱甘酰亞精胺合酶/酰胺酶 3.80
HmpA 黃素血紅蛋白3.80HyfG 氫化酶-4組分G 10.00IlvB 乙酰乳酸合酶4.00LysU 賴氨酸-tRNA連接酶 4.00MoaA 鉬輔因子生物合成蛋白3.55MoaB MoaB蛋白4.00MoaC MoaC蛋白2.86MoaD 蝶呤鉬蛋白(mpt)轉(zhuǎn)換因子 4.30Ndk 二磷酸核苷激酶 0.20PfkB 6-磷酸果糖激酶同工酶4.91PheS 苯丙氨酸-tRNA連接酶 0.25PheT 苯丙氨酸-tRNA合成酶 0.25PtfB 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶II 0.08PyrD 二氫乳清酸氧化酶0.22rfnC DTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3，5-差向異構(gòu)酶0.21RfbD DTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶 0.27DHCP影響許多具各種功能的蛋白表6列舉了在DHCP處理之后表現(xiàn)出顯著的表達水平誘導(dǎo)或者抑制的35種基因。有趣地是，參與亞碲酸鹽抗性的TehB蛋白的編碼基因tehB，受誘導(dǎo)后增加5倍(表3)，類似于tehA。分別編碼應(yīng)答氧脅迫的烷基氫過氧化物還原酶，細菌鐵蛋白和SoxS蛋白的AhpF，bfr和soxS基因受誘導(dǎo)時也增加4倍(Agnez-Lima等，2001；Cha等，1995和Chen等，1999)。編碼MdaB的基因(mdaB)誘導(dǎo)后增加10倍。MdaB超量產(chǎn)生可能通過調(diào)節(jié)拓撲異構(gòu)酶IV活性而賦予對兩種拓撲異構(gòu)酶抑制劑，阿霉素和鬼臼亞乙苷的抗性(Chatterjee等，1995)。然而，在本研究中，DHCP處理時編碼拓撲異構(gòu)酶IV兩個亞基的基因parC和parE的水平不改變。編碼多重抗生素抗性蛋白的marA基因誘導(dǎo)后增加5倍。谷氧還蛋白編碼基因nrdH和nrdI顯著地受DHCP誘導(dǎo)增加。有趣地是，參與毒性的基因諸如sap(對抗微生物肽的靈敏度)操縱子基因在DHCP處理后受到抑制。
表7列舉了對DHCP產(chǎn)生應(yīng)答的編碼功能不明確蛋白的基因。
表6 DHCP對具各種功能的蛋白的編碼基因的影響比率基因基因產(chǎn)物和/或功能 (DHCP-處理/對照)ahpF烷基氫過氧化物還原酶 3.50Bfr 細菌鐵蛋白 4.60CirA大腸桿菌素I受體前體 0.16CspA冷激蛋白 0.38CspB冷激蛋白 0.38CspF冷激蛋白 0.14CspI冷激蛋白 0.19DnaJDnaJ蛋白 0.28FlhC鞭毛轉(zhuǎn)錄激活因子FlhC 0.29FlhD鞭毛轉(zhuǎn)錄激活因子FlhD 0.11FliC鞭毛蛋白 0.30FliYFliY蛋白前體 9.00Hns DNA-結(jié)合蛋白H-NS 0.30HsdS類型I限制性內(nèi)切酶0.21MarA多重抗生素抗性蛋白MarA 5.00McrB5-甲基胞嘧啶特異性限制性內(nèi)切酶B 0.10McrCMcrC蛋白 0.11MdaB藥物活性調(diào)節(jié)劑 10.00MrdA青霉素結(jié)合蛋白 0.25MrdB桿狀決定蛋白MrdB 0.24NemAN-乙基馬來酰亞胺還原酶 8.00NrdH谷氧還蛋白類蛋白 21.00NrdINrdI蛋白 9.50SapA肽轉(zhuǎn)運周質(zhì)蛋白SapA 0.28SapC肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)透性酶蛋白 0.28SapD肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)ATP-結(jié)合蛋白 0.17SapF肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)ATP-結(jié)合蛋白 0.24Sfa Sfa蛋白 0.24
SoxSSoxS蛋白 4.34Sped腺苷甲硫氨酸脫羧酶 0.23SpotSpoT蛋白 0.22SuhB基因外抑制因子蛋白SuhB 0.23TalAPatatire轉(zhuǎn)醛酶 7.60TehB亞碲酸鹽抗性蛋白TehB 5.00ZipA細胞分裂蛋白 4.50表7 DHCP對未知功能或者種類蛋白編碼基因的影響比率基因 (DHCP-處理/對照)yafB 6.5YbgS 24YdiC 11YedU 5YeeD 9YggG 4YhbW 4.5YhcN 5.5YhhQ 6.5YhjX 9YidS 4yieI 4yjbJ 8YmdD 0.2YmgA 13YnhA 3.8YnhC 7.5YnhD 8.2YnhE 10DHCP抑制AI-2活性在本研究中，使用Suretter和Basslerr設(shè)計的AI-2試驗(Surette等，1999)。哈維氏弧菌BB170菌株報道分子菌株具有群體感應(yīng)表現(xiàn)型，傳感器1-，傳感器2+。它通過信號系統(tǒng)2檢測器誘導(dǎo)lux表達。添加由哈維氏弧菌BB170菌株(含有系統(tǒng)2自誘導(dǎo)物)制備的10％無細胞培養(yǎng)液刺激報道分子菌株發(fā)光表達。DHCP被考慮作為參與種間群體感應(yīng)自誘導(dǎo)物AI-2的候選物，而據(jù)報道DHCP不具有這種活性(Schauder等，2001)。本發(fā)明人實驗室檢驗了DHCP是否抑制AI-2活性。如附圖2A所示，與先前的報道一致(Schauder等，2001)，分離自哈維氏弧菌BB152菌株的AI-2顯示出發(fā)光性(泳道2)，而DHCP不顯示AI-2活性(泳道3)。使用無菌的AB培養(yǎng)基作為陰性對照(泳道1)。在添加包含無細胞提取物的AI-2前將DHCP(250μM-與用作DNA微陣列分析的濃度相同)加到試驗中，AI-2活性被完全地抑制(泳道4)。據(jù)報道在大約10μM濃度時，AI-2產(chǎn)生最大量發(fā)光(Schauder等，2001)。應(yīng)注意本試驗使用的DMCP濃度超過AI-2濃度。同時試驗了在AI-2產(chǎn)生最大量發(fā)光后加入DHCP是否可抑制AI-2活性。如附圖2B所示，當以250μM濃度(實心圓)加入DHCP時，AI-2活性在8分鐘內(nèi)減小為零。當以100μM濃度(空心正方形)加入DHCP時，AI-2活性在40分鐘后減小為零。不添加DHCP(空心三角形)的相應(yīng)對照活性是完全穩(wěn)定的。本發(fā)明人推斷DHCP可有效地抑制AI-2活性。
討論DHCP處理的大腸桿菌細胞DNA陣列分析結(jié)果有兩個重要方面數(shù)據(jù)表明DHCP引起廣泛效應(yīng)以及參與復(fù)雜的大腸桿菌群體感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。
DHCP的抗細菌活性本研究結(jié)果表明DHCP在大腸桿菌中有普遍的影響，影響許多參與常規(guī)新陳代謝以及膜合成與功能的蛋白編碼基因。有趣地是，許多應(yīng)答氧和滲透脅迫的基因被上調(diào)。此外，賦予亞碲酸鹽抗性的tehA，tehB和cysK被顯著地上調(diào)。對亞碲酸鹽產(chǎn)生抗性的方式和其毒性機制對研究人員來說具有重大意義，且未被完全了解。已經(jīng)表明(i)cysK介導(dǎo)大腸桿菌亞碲酸鹽抗性，(ii)TehA和TehB賦予對亞碲酸鹽的抗性；這些蛋白中的半胱氨酸殘基參與與亞碲酸鹽的結(jié)合并且TehB需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以結(jié)合亞碲酸鹽。在介導(dǎo)對亞碲酸鹽的抗性時，它是一種可結(jié)合這兩種化合物的二聚體，以及(iii)亞碲酸鹽產(chǎn)生氧脅迫并在不同的蛋白中替換硫，致使它們成為無功能的(Syllick-Brenzinger等，2000；Garberg等，1999；Summers等，1977和Vasquez等，2001)。在本研究中，除cysK，tehA和tehB之外，應(yīng)答氧脅迫的蛋白諸如AhpF，Dps，KatG，SoxS，和Bfr的編碼基因被上調(diào)。這暗示DHCP可能在細胞中產(chǎn)生脅迫而其體現(xiàn)為本研究中觀察到的許多次級效應(yīng)。
DHCP參與群體感應(yīng)在革蘭氏陰性細菌中，群體感應(yīng)一般地參與酰化的高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)自誘導(dǎo)物，其合成依賴于一種‘LuxI’自誘導(dǎo)物合酶和一種同源的‘LuxR’自誘導(dǎo)物結(jié)合/轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白。HSL誘導(dǎo)物與一種LuxR蛋白結(jié)合導(dǎo)致特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。首先在費希氏弧菌中鑒定出參與生物發(fā)光的LuxI-LuxR信號級聯(lián)放大(Hastings等，1977和Nealson等，1979)。這種海洋革蘭氏陰性細菌調(diào)節(jié)群體感應(yīng)回路的蟲螢光素酶的表達。另一方面，在哈維氏弧菌中，用于種內(nèi)和種間通訊的兩個自誘導(dǎo)物AI-1和AI-2分別被鑒定出來(綜述見Schauder等，2001)。AI-2是高絲氨酸內(nèi)酯而AI-2確切結(jié)構(gòu)是未知的。最近認為AI-2可能是一種呋喃糖酰硼酸鹽二酯(Chen等，2002)。Shauder等檢查了DHCP的群體感應(yīng)活性并發(fā)現(xiàn)它并不具有AI-2功能(schauder等，2001)。有趣地是，本研究結(jié)果表明DHCP事實上抑制AI-2活性。此外，DHCP可能通過參與AI-2合成的生物合成途徑產(chǎn)生。這引起一種推測的可能性，即，DHCP參與大腸桿菌中AI-2功能的調(diào)控并隨后調(diào)節(jié)基于AI-2的群體感應(yīng)。
最近，對大腸桿菌響應(yīng)AI-2的普遍轉(zhuǎn)錄模式進行了DNA微陣列分析(DeLisa等，2001)。一些實驗包括(i)參與運動性的蛋白諸如MotA和MotB的編碼基因增加3倍，(ii)參與亞精胺/腐胺轉(zhuǎn)運的蛋白的編碼基因potABCD增加3-5倍。這些蛋白顯示出與植物中由att操縱子編碼的參與毒性的蛋白具有同源性(matthysse等，1996)，(iii)OmpA和OmpF的編碼基因分別增加3.2和5.1倍，以及(iv)cysK和rpoS分別增加3和1.2倍。有趣地是，除了cysK和rpoS外(表4和5)，用DHCP處理看到相反的結(jié)果。這和報道分子試驗中DHCP抑制AI-2活性相一致。在大腸桿菌另一群體感應(yīng)途徑中顯示cysK是由不類似于AI-2的信號誘導(dǎo)的。與AI-2不同，這些信號是由大腸桿菌DH5α菌株產(chǎn)生，與葡萄糖無關(guān)并出現(xiàn)在靜止期(Baca-DeLancey等，1999)。然而按照推測由這些信號誘導(dǎo)的基因諸如astD，tnaB和gabT不被DHCP誘導(dǎo)。還表明，吲哚作為信號誘導(dǎo)cysK，然而并不誘導(dǎo)gabT，顯示參與不同的群體感應(yīng)途徑(Wang等，2001)。本結(jié)果可能與此相似。同樣重要的是注意到用DHCP處理時一些受AI-2影響的基因的水平不改變。諸如rfa，wzb或者hha等基因用DHCP處理沒有顯著改變，而用AI-2處理顯示改變。這些影響的確切原因是未知的，但是可能這些基因還由除了AI-2之外的其它因子調(diào)節(jié)，因此僅僅抑制AI-2活性并不導(dǎo)致它們的下調(diào)。最近，據(jù)報道鼠傷寒沙門氏菌AI-2控制在其吸收中起作用的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達。這些操縱子功能未知但是預(yù)測編碼與核糖體轉(zhuǎn)運操縱子(Rbs)顯著相似的ABC轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合體。它們被命名為lsr操縱子(Taga等，2001)。但是，AI-2普遍性影響的DNA陣列分析并未顯示這一操縱子(DeLisa等，2001)。而同樣在本研究中，有趣地是，AI-2誘導(dǎo)另一個編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的操縱子即pot操縱子(DeLisa等，2001)。與此一致，在我們的研究中，DHCP處理導(dǎo)致這些操縱子的顯著抑制(表3)。這暗示AI-2可能也參與其它ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的調(diào)控，而其被DHCP抑制反映在至少其中一些操縱子的隨后抑制中。
sap操縱于(sapA到sapF)顯示參與菊歐文氏菌的毒性(Lopez-Solanilla等，1998)。報道說在費希氏弧菌中sap操縱子被LuxR-AI復(fù)合體調(diào)節(jié)，因此推斷sap操縱子在生物發(fā)光中起作用(Chen等，2000)。費希氏弧菌的Sap蛋白和大腸桿菌Sap蛋白同源。DHCP抑制sap基因(表6)，這和報道分子試驗中生物發(fā)光的抑制一致。一種特異性調(diào)節(jié)區(qū)類似的序列R&R*存在于費希氏弧菌的sap和lux調(diào)節(jié)子中。LuxR-AI結(jié)合到這個區(qū)域來調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達(Chen等，2000)?？赡蹹HPC干擾LuxR-AI復(fù)合體結(jié)合到R&R*序列并反過來抑制諸如報道分子試驗中的蟲螢光素酶操縱子或者大腸桿菌sap操縱子等基因的轉(zhuǎn)錄。由此可推測DHCP可能關(guān)閉一個涉及AI-2的群體感應(yīng)途徑而打開涉及cysK誘導(dǎo)的另一途徑。最近，在大腸桿菌低和高細胞密度培養(yǎng)物中，一些質(zhì)粒編碼的基因誘導(dǎo)后AI-2活性顯示出顯著降低。AI-2水平與每一蛋白產(chǎn)量線性相關(guān)(DeLisa等，2001)。這使得群體感應(yīng)途徑作為潛在的靶可用于設(shè)計優(yōu)化策略來提高重組蛋白產(chǎn)量。DHCP對AI-2活性的抑制在這一方面可能非常重要。
總之，DHCP在大腸桿菌中具有廣泛的影響。它抑制一些參與群體感應(yīng)過程諸如毒性和運動性的基因，并抑制一種群體感應(yīng)自誘導(dǎo)物本身活性。另一方面，已知參與替代群體感應(yīng)途徑的特定基因諸如cysK被極大地誘導(dǎo)，暗示DHCP可能調(diào)節(jié)大腸桿菌不同群體感應(yīng)回路的打開/關(guān)閉。
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序列表<110>S.普拉德塔雷(PHADTARE，Sangita)加藤郁之進(KATO，Ikunoshin)井上正順(INOUYE，Masayori)<120>4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(DHCP)處理對細菌基因表達和群體感應(yīng)的影響(EFFECTOF TREATMENT WITH 4，5-DIHYDROXY-2-CYCLOPENTEN-1-ONE(DHCP)ON GENE EXPRESSION ANDQUORUM-SENSING IN BACTERIA)<130>PHADTARE＝1.1PCT<150>60/363,548<151>2002-03-13<150>60/402,041<151>2002-08-09<160>8<170>PatentIn 3.2版<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>1tacagccagc agagtt ttcg aaat 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>2tacagccagc agagttttcg aaat24
<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>3cagcgtattc tgactcataa ggtg24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>4agtggctgtg gtgttatgga tatc24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>5caggcgaacc agcggcgtgt gacc24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>6caggcgaacc agcggcgtgt gacc24<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>7gattaatatc agacgcaaat cct 23<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>8acgggatcct tcatcat tat ttatta 2權(quán)利要求
1.一種調(diào)控微生物基因的方法，包括將其中基因需要進行調(diào)控的微生物與4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(DHCP)接觸；以及調(diào)控微生物中的基因，其中所述基因選自編碼核醣體蛋白的基因、應(yīng)答脅迫的基因、參與膜合成以及膜功能的基因、參與常規(guī)新陳代謝的基因、編碼具各種功能的蛋白的基因以及編碼未知功能的蛋白的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基因選自列于表1-7的基因及其同系物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基因參與群體感應(yīng)過程。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述基因由于種間自誘導(dǎo)物AI-2活性的抑制而受到調(diào)控。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述基因由于群體感應(yīng)回路的打開/關(guān)閉而受到調(diào)控。
6.一種用于通過權(quán)利要求1所述方法來調(diào)控微生物基因的組合物，其中含有作為活性成分的DHCP。
7.DHCP在制備用于通過權(quán)利要求1所述方法調(diào)控微生物基因的組合物中的應(yīng)用。
8.一種篩選生理活性物質(zhì)的方法，包括(a).在候選物質(zhì)存在以及缺少的情況下培養(yǎng)微生物；(b).在候選物質(zhì)存在以及缺少的情況下測定微生物中的基因表達水平，其中所述基因是其表達水平受DHCP影響的那些基因；(c).將影響至少一種基因表達水平的候選物質(zhì)鑒定為生理活性物質(zhì)，其中所述基因在候選物質(zhì)存在下的表達水平與缺少候選物質(zhì)時的表達水平相比有顯著地增強或減弱。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述基因選自列于表1-7的基因及其同系物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述基因的表述水平基于基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量進行測定。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中通過利用DNA微陣列雜交測定基因的表達水平。
12.一種可以通過權(quán)利要求8的方法獲得的生理活性物質(zhì)。
13.一種用于增加微生物中重組多肽產(chǎn)量的方法，包括(i)在DHCP存在的情況下培養(yǎng)微生物以增加重組多肽的表達和產(chǎn)量；以及(ii)回收從培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組多肽。
14.一種抑制種間群體感應(yīng)誘導(dǎo)物活性的方法，其中DHCP用作活性成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該誘導(dǎo)物是AI-2。
16.一種用于調(diào)控群體感應(yīng)的組合物，其中含有DHCP。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其調(diào)控cysK的表達。
18.一種用于打開/關(guān)閉群體感應(yīng)回路的組合物，其中含有DHCP。
19.一種用于抑制種間群體感應(yīng)誘導(dǎo)物活性的組合物，其中含有DHCP。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述誘導(dǎo)物是自誘導(dǎo)物AI-2。
21.一種用于調(diào)控脅迫應(yīng)答基因表達的組合物，其中含有DHCP。
22.一種用于調(diào)控群體感應(yīng)調(diào)控基因表達的組合物，其中含有DHCP。
23.一種用于調(diào)控選自表1-7所列基因的基因的表達的組合物，其中含有DHCP。
24.一種用于促進重組蛋白分泌的組合物，其中含有DHCP。
25.一種用于保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的組合物，其中含有DHCP。
全文摘要
DHCP(4，5－二羥基－2－環(huán)戊烯－1－酮)已顯示出具有對大腸桿菌的抗細菌活性。通過DNA微陣列分析了響應(yīng)DHCP的大腸桿菌普遍轉(zhuǎn)錄模式?，F(xiàn)在表明DHCP在大腸桿菌中具有廣泛的影響，影響參與常規(guī)新陳代謝和細胞膜合成和功能的蛋白編碼基因。此外，rpoS和RpoS調(diào)節(jié)的、應(yīng)答不同脅迫的基因被上調(diào)。DHCP也顯示抑制AI－2，一種參與群體感應(yīng)的自誘導(dǎo)物，而參與諸如毒性，運動性和外膜功能等群體調(diào)控過程的基因經(jīng)DHCP處理下調(diào)。此外，cysK－一種已知的在大腸桿菌另一途徑中起作用的群體感應(yīng)基因響應(yīng)DHCP顯著地增加。這些結(jié)果顯示DHCP調(diào)控大腸桿菌不同群體感應(yīng)回路的打開/關(guān)閉。
文檔編號C12P21/02GK1642418SQ03805910
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者S·普拉德塔雷, 加藤郁之進, 井上正順 申請人:寶生物工程株式會社