專利名稱：醋酸耐性相關基因、利用該基因育種的醋酸菌、以及利用該醋酸菌的食醋的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到來自微生物的編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的基因，擴增該基因拷貝數(shù)的微生物、特別是屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)、或葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸菌，以及利用這些微生物高效制造含有高濃度醋酸的食醋的方法。
背景技術：
醋酸菌是廣泛用于食醋制造中的微生物，特別是屬于醋酸桿菌屬、或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌被用于工業(yè)上的醋酸發(fā)酵中。
在醋酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的乙醇被醋酸菌氧化變成醋酸，結(jié)果醋酸蓄積在培養(yǎng)基中，醋酸即使對醋酸菌也是有抑制作用的，醋酸的蓄積量增大后，隨著培養(yǎng)基中的醋酸濃度增高，醋酸菌的增殖能力和發(fā)酵能力逐漸下降。
因此，在醋酸發(fā)酵中，希望開發(fā)即使在高的醋酸濃度下，增殖能力和發(fā)酵能力也不下降，即醋酸耐性強的醋酸菌，作為其中的一個手段，嘗試了對醋酸耐性相關基因(醋酸耐性基因)進行克隆，使用該醋酸耐性基因?qū)Υ姿峋M行育種、改良。
就到目前為止的有關醋酸菌的醋酸耐性基因的報道來說，作為可以使醋酸桿菌屬的醋酸菌的醋酸耐性變異后成為醋酸易感性株恢復到原來的耐性的互補基因，克隆了形成一簇的3個基因(aarA、aarB、aarC)(例如，參照非專利文獻1)。
推定其中的aarA基因是編碼檸檬酸合成酶的基因，而aarC基因是編碼與醋酸的利用有關的酶的基因，但aarB基因的功能還不清楚(例如，參照非專利文獻2)。
將含有這3個醋酸耐性基因的基因片段克隆到多拷貝的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化Acetobacter aceti subsp.xylihum IF03288株得到的轉(zhuǎn)化株只是醋酸耐性水平上升，而實際的醋酸發(fā)酵的能力有沒有提高還不清楚(例如，參照專利文獻1)。
另外，通過將由醋酸菌克隆的編碼膜結(jié)合型醛脫氫酶(ALDH)的基因?qū)氪姿峋?，證明在醋酸發(fā)酵中最終達到的醋酸濃度提高了的例子已有報道(例如，參照專利文獻2)。然而，由于ALDH是具有氧化醛的功能的酶，但不是與醋酸耐性有直接關系的酶，所以不能判斷編碼ALDH的基因真的是醋酸耐性基因。
專利文獻1特開平3-219878號公報專利文獻2特開平2-2364號公報專利文獻3特開昭60-9489號公報專利文獻4特開昭60-9488號公報非專利文獻1“Journal of Bacteriology、172卷，2096-2104，1990年”非專利文獻2“Journal of Fermentation and Bioengineering、76卷，270-275，1993年”非專利文獻3“Applied of Environment and Microbiology、55卷，171-176，1989年”非專利文獻4“Agricultural and Bio1ogical，Chemistry，52卷，p，3125-3129，1988年”非專利文獻5“Agricultural and Biological，Chemistry，49卷，p，2091-2097，1985年”非專利文獻6“Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，58卷，p，974-975，1994年”發(fā)明內(nèi)容如上所述，到目前為止在基因水平闡明醋酸菌的醋酸耐性，成功開發(fā)基因高醋酸耐性的實用醋酸菌的例子還沒有報道。然而，如果開發(fā)出醋酸耐性優(yōu)越的醋酸菌，由于可以進行比以往更高濃度的醋酸發(fā)酵，有效制造高濃度醋酸、高濃度食醋，本發(fā)明人決定再從基因水平闡明醋酸菌的醋酸耐性的提高。
然后，本發(fā)明人從各方面進行研究，結(jié)果重新設定了如下課題獲得編碼具有在實用水平上使醋酸耐性提高的功能的蛋白質(zhì)的新的醋酸耐性基因，然后用得到的醋酸耐性基因，從重要的是對具有更強醋酸耐性的醋酸菌進行育種的觀點出發(fā)，提供來自屬于醋酸菌的微生物的與醋酸耐性有關的新的基因，以及使用該基因使微生物的醋酸耐性提高的方法、特別是使醋酸菌的醋酸耐性提高的方法、以及利用醋酸耐性提高的醋酸菌，高效制造更高醋酸濃度的食醋的方法。
本發(fā)明人對于即使在醋酸存在下也可以增殖、發(fā)酵的醋酸菌提出了存在著在其他微生物不存在的與特異的醋酸耐性有關的基因的假說，獲得了如果使用這樣的基因，就有可能開發(fā)可以使上述以往微生物的醋酸耐性提高，而且含有高濃度醋酸的以往不能獲得的新的食醋的有效的制造方法的新的立意。
以往獲得醋酸耐性基因的方法一般都是對醋酸菌的醋酸易感性互補的基因進行克隆的方法等。
然而，我們認為用這樣的方法找出產(chǎn)業(yè)上有用的醋酸耐性基因是困難的，經(jīng)過不斷研究，結(jié)果本發(fā)明人開發(fā)了作為由醋酸菌找出醋酸耐性基因的方法，開發(fā)了通過構建醋酸菌的染色體DNA文庫，用該染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化醋酸菌，通過對只在通常1％左右的醋酸存在下生長增殖的菌株篩選，獲得了即使在2％的醋酸存在下也可以生長增殖的基因的方法。
通過該方法由實際食醋制造中使用的葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌首次成功克隆了具有在實用水平上使醋酸耐性提高的功能的新的醋酸耐性基因。
附圖簡單說明

圖1使用Pst I克隆的來自Gluconacetobacter entanii的基因片段(pP1)的限制性內(nèi)切酶譜和醋酸耐性基因的位置、以及向pSPT插入的插入片段的梗概圖。
圖2使用反向聚合酶鏈反應法克隆的來自醋化醋酸桿菌的基因片段(pP2)的限制性內(nèi)切酶譜和醋酸耐性基因的位置、以及向pSPT2插入的插入片段的梗概圖。
圖3表示擴增來自Gluconacetobacter entanii醋酸耐性基因的拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)過程的圖。
圖4表示擴增來自Gluconacetobacter entanii醋酸耐性基因的拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化株的溫度變化和醋酸發(fā)酵過程的圖。
圖5表示來自Gluconacetobacter entanii醋酸耐性基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列編號2)。
圖6表示來自Acetobacter aceti的醋酸耐性基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列編號4)。
圖7表示引物1。
圖8表示引物2。
圖9表示引物3。
圖10表示引物4。
圖11表示引物5。
圖12表示引物6。
得到的醋酸耐性基因在DDBJ/EMBL/Genbank以及SWISS-PROT/PIR中進行同源性檢索，結(jié)果與在鞘氨醇單胞菌屬(geus sphingomonas)等發(fā)現(xiàn)的催化鞘脂合成的第一階段的稱之為絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyltransferase)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出同源性，推定是編碼醋酸菌的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
然而，到目前為止，由原核生物獲得絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的基因僅僅是上述的鞘氨醇單胞菌屬的例子。
另外，獲得的醋酸菌的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因與在鞘氨醇單胞菌屬等發(fā)現(xiàn)的已知的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因在氨基酸序列水平上具有46.3％的同源性，而與鼠的同源性在25％左右，由于其同源性的程度非常低，所以，雖然與其他的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因有一定程度的相似性，但可確認是編碼醋酸菌中特異的新的蛋白質(zhì)(有時稱為蛋白質(zhì)SPT)的新基因。
另外，在將該基因與質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化醋酸菌，使拷貝數(shù)增加的轉(zhuǎn)化株中，醋酸耐性顯著提高，結(jié)果在乙醇存在下，對該轉(zhuǎn)化株進行通氣培養(yǎng)時，在增殖誘導期縮短的基礎上，增殖速度、生酸速度提高的同時，最終的醋酸濃度進一步顯著提高，另外在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列、以及編碼該蛋白質(zhì)的基因的DNA的堿基序列的決定也獲得成功，直至完成本發(fā)明。
即本發(fā)明的實施方式如下所述。
(1)下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT。
(A)具有序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(B)由含有在序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、付加或倒位的1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)。
(2)編碼下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT的基因的DNA。
(A)具有序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(B)由含有在序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、付加或倒位的1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)。
(3)上述(2)所述的基因的DNA，是下述(a)或(b)所示的DNA。
(a)含有由序列表中序列編號1記載的堿基序列中的堿基編號187～1386構成的堿基序列的DNA。
(b)與由序列表中序列編號1記載的堿基序列中的堿基編號187～1386構成的堿基序列或含有其一部分的探針在嚴格條件下進行雜交，而且編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的DNA。
(4)下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT2。
(A)具有序列表中序列編號4記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(B)由含有在序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、付加或倒位的1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)SPT2。
(5)編碼下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT2的基因的DNA。
(A)具有序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(B)由含有在序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入、付加或倒位的1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)SPT2。
(6)(5)所述的基因的DNA是下述(A)或(B)所示的DNA。
(A)含有由序列表中的序列編號3記載的堿基序列中的堿基編號386～1636構成的堿基序列的DNA。
(B)與由序列表中的序列編號3記載的堿基序列中的堿基編號386～1636構成的堿基序列或含有其一部分的探針在嚴格條件下進行雜交，而且編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的DNA。
(7)通過擴增上述(2)、或上述(3)、或上述(5)、或上述(6)記載的DNA的細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，醋酸耐性增強的微生物。
(8)上述(7)所述的微生物，其特征是微生物是醋酸桿菌屬、或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。
(9)一種食醋的制造方法，其特征是將上述(7)、或上述(8)記載的微生物中具有醇氧化能力的微生物于含有乙醇的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使醋酸生成、蓄積在該培養(yǎng)基中。以及由此得到的醋酸含量高(10～17.5％)的新的食醋。
(10)含有上述(2)、或上述(3)記載的DNA的重組質(zhì)粒pUSPT(FERM BP-7932)、或含有上述(5)、或上述(6)記載的DNA的重組質(zhì)粒pUSPT2(FERM BP-8304)。
(11)一種轉(zhuǎn)化體，是至少含有具有序列表中序列編號1或序列編號3所示堿基序列的DNA片段的重組質(zhì)粒，例如，將這些DNA片段插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體(多拷貝載體)pMV24形成的質(zhì)粒pSPT，或pSPT2、和/或?qū)⒃損SPT或pSPT2導入到Acetobacter aceti No.1023(FERM BP-2287)、或Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERMBP-491)后形成的轉(zhuǎn)化體。
利用本發(fā)明可以賦予、增強微生物對醋酸的耐性。而且，在具有醇氧化能力的微生物、特別是醋酸菌中，對醋酸的耐性顯著提高，可以賦予使高濃度醋酸有效地蓄積在培養(yǎng)基中的能力。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明進行詳細說明。
(1)本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA包含可編碼與鞘氨醇單胞菌屬的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶有某種程度的同源性，而且具有使醋酸耐性提高的功能的序列表中序列編號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列，包含該堿基序列的調(diào)控單位、以及該基因的結(jié)構部分。
本發(fā)明的DNA可以通過如下操作由Gluconacetobacter entanii的染色體DNA獲得。
首先，制備Gluconacetobacter entanii、例如Gluconacetobacteraltoacetigenes MH-24株(以FERM BP-491保藏于專利生物保藏中心)的染色體DNA文庫。而染色體DNA是利用專利文獻3公布的方法獲得的。
接下來，為了從得到的染色體DNA分離醋酸耐性基因，制作染色體DNA文庫。首先用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶對染色體進行部分分解，得到各種各樣的DNA片段混合物。如果調(diào)節(jié)切斷反應的時間可以調(diào)節(jié)切斷的程度，可以使用范圍廣泛的限制性內(nèi)切酶。例如，可以使Sau3AI于溫度30℃以上、優(yōu)選是37℃，酶濃度1～10單位/ml，各種時間(1分鐘～2小時)作用于染色體DNA，對DNA進行消化。而在下述實施例中使用了Pst I。
然后，將切斷的染色體DNA片段與可在醋酸菌內(nèi)進行自我復制的載體DNA連接，制作重組DNA。具體來說，使與染色體切斷使用的限制性內(nèi)切酶PstI切斷的片段互補的末端堿基序列產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶，例如PstI于溫度30℃，酶濃度1～100單位/ml的條件下作用于載體DNA1小時以上，完全消化、切斷裂解載體DNA。
然后將上述得到的染色體DNA片段混合物和切斷裂解的載體DNA混合，使T4DNA連接酶于溫度4～16℃，酶濃度1～100單位/ml的條件下作用1小時以上，優(yōu)選是作用6～24小時，獲得重組DNA。
用得到的重組DNA對于通常瓊脂培養(yǎng)基上在1％以上高濃度的醋酸存在下不能增殖的醋酸菌、例如Acetobacter aceti 1023(以FERM BP-2287保藏于專利生物保藏中心)株進行轉(zhuǎn)化，然后涂布在含有2％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。將生成的菌落接種在液體培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)，通過從得到的菌體回收質(zhì)粒，可以得到含有醋酸耐性基因的DNA片段。
作為本發(fā)明的DNA具體來說如含有序列表的序列編號1和序列編號3的堿基序列的DNA，其中，包含序列編號1的堿基187～1386、或序列編號3的堿基110～1312的堿基序列是編碼區(qū)。
序列編號1所示的堿基序列、或序列編號2所示的氨基酸序列(對應于圖3堿基187～1386)、或序列編號3所示的堿基序列、或序列編號4所示的氨基酸序列(對應于圖4堿基110～1321)當在DDBJ/EMBL/Genbank以及SISS-PROT/PIR中進行同源性檢索時，關于序列編號1所示的堿基序列、或序列編號2所示的氨基酸序列在氨基酸水平表現(xiàn)出與少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)的SPT1基因的46.3％同源性，與鼠的LCB1基因、LCB2基因也分別表現(xiàn)出26.3％、24.8％的同源性，推定是編碼絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的基因，很清楚無論與哪一個基因比較其同源性都在50％以下，所以是與這些基因不同的新的基因。
另外關于序列編號2所示的堿基序列、或序列編號4所示的氨基酸序列在氨基酸水平表現(xiàn)出與少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)的SPT1基因的46.7％同源性，與鼠的LCB1基因、LCB2基因也分別表現(xiàn)出22.6％、19.8％的同源性，推定是編碼絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的基因，很清楚無論與哪一個基因比較其同源性都在50％以下，所以是與這些基因不同的新的基因。
而上述的SPT基因等與醋酸耐性的關系完全不清楚。
另外，已鑒定本發(fā)明DNA是與已經(jīng)獲得的醋酸菌的醋酸耐性基因(aarA、aarB、aarC)或具有增強醋酸耐性的功能的ADH基因等都不同的新的具有增強醋酸耐性功能的基因。
本發(fā)明DNA由于其堿基序列已闡明，例如可以通過作為模板使用醋酸菌Gluconnacetobacter entanii的基因組DNA，用根據(jù)該堿基序列合成的寡核苷酸作為以往的聚合酶鏈式反應(PCR反應)，或通過根據(jù)該堿基序列合成的寡核苷酸作為探針的雜交獲得。
寡核苷酸的合成，例如可以根據(jù)使用市售的種種DNA合成儀的常規(guī)方法合成。另外，PCR反應可以使用Applied Biosystems生產(chǎn)的熱循環(huán)儀Gen Amp PCR System2400，使用TaqDNA聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn))和KOD-Plus-(東洋紡織公司生產(chǎn))等，按照常規(guī)方法進行。
本發(fā)明的編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的DNA只要是不喪失編碼的具有增強醋酸耐性功能，即使編碼在1或多個位置缺失、取代、插入或付加1個或數(shù)個氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA也可以。
編碼與這樣的具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)實質(zhì)上同一的蛋白質(zhì)的DNA例如可以通過部位特異的變異法，通過改變堿基使得特定部位的氨基酸缺失、取代、插入或付加也可以獲得。另外，如上述改變的DNA也可以根據(jù)現(xiàn)有已知的突變處理來獲得。
另外，一般來說，蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼他的堿基序列由于在種間、株間、變異體、變種間都稍有不同，實質(zhì)上編碼同一蛋白質(zhì)的DNA可以由整個醋酸菌、也可以是其中的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的種、株、變異體、變種獲得。
具體來說，通過由醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌、或進行了變異處理的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌、這些菌的自然變異株或變種分離與具有包含例如序列表的序列編號1的堿基187～1386構成的堿基序列的DNA、或包含序列表的序列編號3中記載的堿基序列中堿基序列110～1312構成的堿基序列的DNA在嚴格條件下進行雜交、編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的DNA，也可以獲得與該蛋白質(zhì)實質(zhì)上同一的蛋白質(zhì)的DNA。這里所謂的嚴格條件指的是所有特異的雜化體可以形成，而非雜化體不能形成的條件。對該條件明確進行數(shù)值化是困難的，舉一個例子，同源性高的DNA之間、例如具有70％以上同源性的DNA之間進行雜交，而比他們同源性低的DNA之間不進行雜交的條件，或通常的雜交的洗凈條件、例如用1×SSC、用相當于1％SDS的鹽濃度于60℃下進行清洗的條件等。
(2)本發(fā)明的醋酸菌本發(fā)明的醋酸菌指的是醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的細菌，醋酸耐性被增強的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬細菌。
作為醋酸桿菌屬細菌具體的如Acetobacter aceti No.1023株(以FERM BP-2287保藏于專利生物保藏中心)。
作為葡糖酸醋酸桿菌屬細菌，如Gluconacetobacter entanii，現(xiàn)在以FERM BP-491保藏于現(xiàn)在專利生物保藏中心的Acetobacteraltoacetigenes MH-24株。
醋酸耐性的增強例如通過擴增醋酸耐性基因的細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，或使用將含有該基因的結(jié)構基因的DNA片段與在醋酸桿菌屬細菌中有效發(fā)揮功能的啟動子序列連接得到的重組DNA轉(zhuǎn)化醋酸桿菌屬細菌得以增強。
另外通過將在染色體DNA上的該基因的啟動子序列置換為在醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬細菌中有效發(fā)揮功能的其他啟動子序列，例如來自大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322的氨芐青霉素耐性基因、質(zhì)粒pACYC177的卡那霉素耐性基因、質(zhì)粒pACYC184的氯霉素耐性基因、β-半乳糖苷酶基因等的各基因的啟動子等醋酸菌以外的微生物的啟動子序列，也可以增強醋酸耐性。
該基因的細胞內(nèi)的拷貝數(shù)的擴增可以通過將保持該基因的多拷貝載體導入醋酸桿菌屬細菌的細胞進行。即，通過將保持該基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等導入醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬細菌的細胞進行。
作為多拷貝載體如pMV24(例如，參照非專利文獻3)和pTA5001(A)、pTA5001(B)(例如，參照非專利文獻4)。另外作為轉(zhuǎn)座子如Mu和IS1452等。
DNA向醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌的導入可以通過氯化鈣法(例如，參照非專利文獻5)或電穿孔法(例如，參照非專利文獻6)進行。
在具有醇氧化能力的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中，如果向上述那樣增強該醋酸耐性，使醋酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率增大。
(3)食醋制造法象上述那樣，對通過擴增醋酸耐性基因的拷貝數(shù)，有選擇地增強醋酸耐性的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的具有醇氧化能力的細菌在含有醇的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使醋酸生產(chǎn)蓄積在該培養(yǎng)基中，可以高效地制造食醋。
本發(fā)明的制造方法中的醋酸發(fā)酵可以象以往通過醋酸菌發(fā)酵制造食醋的方法進行。作為醋酸發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基，只要是含有碳源、氮源、無機物、乙醇，如有必要還可含有適當量的使用菌株生長增殖需要的營養(yǎng)源，無論是合成培養(yǎng)基，還是天然培養(yǎng)基都可以。
作為碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖以及各種碳水化合物、各種有機物。作為氮源，如胨、發(fā)酵菌體分解物等天然氮源。
另外，培養(yǎng)可以在靜置培養(yǎng)法、振動培養(yǎng)法、通氣攪拌培養(yǎng)法等需氧條件下進行，培養(yǎng)溫度通常為30℃。培養(yǎng)基的pH通常在2.5～7的范圍內(nèi)，優(yōu)選2.7～6.5的范圍，也可以通過各種酸、各種堿、緩沖液等調(diào)配。通常，通過培養(yǎng)1～21天，在培養(yǎng)基中就可蓄積高濃度的醋酸。
(4)本發(fā)明的實施方式將本發(fā)明涉及到的ORF和含有ORF的醋酸耐性基因(序列編號1、或序列編號3)插入到大腸桿菌載體(多拷貝載體)pUC19構成的重組質(zhì)粒pUSPT和pUSPT2由于pUSPT以FERM BP-7932于平成14年(2002年)3月1日保藏于日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，而pUSPT2以FERM BP-8304于平成15年(2003年)2月26日保藏于日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心，所以本發(fā)明涉及到的基因的DNA容易獲得，如果是同行人都容易實施。而且，根據(jù)要求，可以使用該重組質(zhì)粒，將本發(fā)明涉及到ORF或含有ORF的醋酸耐性基因裝載到在醋酸菌中可自我復制的載體中，然后把他導入醋酸菌，通過培養(yǎng)該醋酸菌可以很容易制造醋酸含量高的食醋。
另外，象上述那樣以及下述的實施例所表明的那樣，由于醋酸耐性基因源的保藏、PCR的方式、質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒的制作、宿主菌的保藏等已經(jīng)闡明，都能獲得，操作、處理容易，所以如果按照實施例進行操作、處理，可以獲得目的醋酸耐性轉(zhuǎn)化體，通過使用該轉(zhuǎn)化體可以制造高濃度的醋酸。因此，從這一點出發(fā)，本發(fā)明的實施是容易的。
以下通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。
實施例(實施例1)來自Gluconacetobacter entanii的醋酸耐性基因的克隆和堿基序列以及氨基酸序列的決定(1)染色體DNA文庫的制作將作為Gluconacetobacter entaniil株的Acetobacteraltoacetigenes MH-24株于添加了6％醋酸、4％乙醇的YPG培養(yǎng)基(3％葡萄糖、0.5％酵母提取液、0.2％多胨)中在30℃下進行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)后，對培養(yǎng)液進行離心分離(7,500g、10分鐘)，得到菌體。利用專利文獻3公布的方法從得到的菌體中制備染色體DNA。
將上述那樣獲得的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶PstI(寶酒造公司生產(chǎn))進行部分消化，切斷，而將大腸桿菌-醋酸菌穿梭載體pMV24用限制性內(nèi)切酶PstI完全消化、切斷。各取適量的這些DNA進行混合，用連接試劑盒(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、寶酒造公司生產(chǎn))進行連接，構建Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫。
(2)醋酸耐性基因的克隆用上述那樣得到的Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化于通常瓊脂培養(yǎng)基上只在醋酸濃度1％左右可增殖的Acetobacteraceti No.1023株(FERM BP-2287)。
然后將被轉(zhuǎn)化的醋化醋酸桿菌No.1023株于含有2％醋酸、100μg/ml的氨芐青霉素的YPG瓊脂培養(yǎng)基中在30℃下培養(yǎng)4天。
將培養(yǎng)基中生成的菌落接種于含有100μg/ml的氨芐青霉素的YPG瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，由得到的菌體回收質(zhì)粒，可以回收圖1所示的約4kbp的PstI片段被克隆的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pP1。另外可以確認在含有2％醋酸的YPG瓊脂培養(yǎng)基中可使Acetobacter aceti No.1023株生長增殖的DNA片段是克隆到pP1的約4kbp的PstI片段中的約2kbp的EcoRV-Bal I片段。
這樣一來，可以獲得即使在含有2％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基也可以使通常于瓊脂培養(yǎng)基上只能在醋酸濃度1％左右增殖的醋化醋酸桿菌No.1023株也可以增殖的醋酸耐性基因片段。
(3)克隆的DNA片段的堿基序列的決定將上述克隆的EcoRV-Bal I片段插入到pUC19的SmaI切斷位點，該片段的堿基序列通過Sanger的雙脫氧鏈終止法決定，結(jié)果決定了序列編號1記載的堿基序列。序列決定是對兩方的DNA鏈的全區(qū)域進行的，以切斷點都為重疊方式進行。
在序列編號1記載的堿基序列中，確認存在著從第187位堿基到第1386位堿基編碼序列編號2記載的那樣的400個氨基酸(圖3)的開放讀框(opening reading frame)。
(實施例2)在與來自Gluconacetobacter entanii的醋酸耐性基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株中的醋酸耐性的增強(1)對醋化醋酸桿菌的轉(zhuǎn)化將來自象上述那樣克隆的Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的醋酸耐性基因用KOD-Plus-(東洋紡織公司生產(chǎn))通過PCR法進行擴增，制作將擴增的片段插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pMV24(例如，參照非專利文獻3)的限制性內(nèi)切酶SmaI的切斷位點的質(zhì)粒pSPT。圖1表示插入到了pSPT的擴增片段的簡圖。
PCR法象下述那樣實施。即，作為模板使用來自實施醋酸菌的基因組DNA，作為引物使用引物-1(序列編號5(圖7)所示堿基序列)和引物2(序列編號6(圖8)所示堿基序列)，于下述的條件下實施PCR法。
即，PCR法每一個循環(huán)為94℃15秒、60℃30秒、68℃2分鐘，共進行30次循環(huán)。
通過電穿孔法(例如，參照非專利文獻6)用這個pSPT轉(zhuǎn)化醋化醋酸桿菌No.1023株。于添加了100μg/ml的氨芐青霉素和2％醋酸的YPG瓊脂培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)化株進行選擇。
關于在選擇培養(yǎng)基上生長增殖的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒并進行解析，確認保持了帶有醋酸耐性基因的質(zhì)粒。
(2)轉(zhuǎn)化株的醋酸耐性將上述那樣獲得的含有質(zhì)粒pSPT的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株，于添加了醋酸的YPG培養(yǎng)基中生長增殖與只導入了穿梭載體-pMV24的原株醋化醋酸桿菌No.1023株進行比較。
具體來說，在含有3％乙醇和100μg/m1的氨芐青霉素的100ml的YPG培養(yǎng)基和含有3％乙醇、3％醋酸和100μg/ml的氨芐青霉素的100ml的YPG培養(yǎng)基中分別接種含有pSPT的轉(zhuǎn)化株和含有穿梭載體-pMV24的原株，于30℃下進行振蕩培養(yǎng)(150rpm)，轉(zhuǎn)化株和原株在添加醋酸培養(yǎng)基中的生長增殖通過測定660nm的吸光度進行比較。
結(jié)果就象圖2所示那樣，可以確認在不含有醋酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化株和原株幾乎可以同樣增殖，而在添加了3％醋酸和3％乙醇的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化株可以增殖，但原株醋化醋酸桿菌No.1023株不能增殖，可以確認醋酸耐性基因的醋酸耐性增強功能。
(3)轉(zhuǎn)化株的溫度耐性將上述那樣獲得的含有質(zhì)粒pSPT的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株，于使培養(yǎng)溫度變化的YPG培養(yǎng)基中生長增殖與只導入了穿梭載體-pMV24的原株醋化醋酸桿菌No.1023株進行比較。
具體來說，使用2L的微小罐發(fā)酵罐(mini-jar fermenter)(千代田制作所生產(chǎn)TBR-2-1)，在含有1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml的氨芐青霉素的1L的YPG培養(yǎng)基中于30℃、400rpm、0.20vvm條件下進行通氣攪拌培養(yǎng)，直至達到醋酸濃度3％左右使其發(fā)酵。然后取出培養(yǎng)液，使微小罐發(fā)酵罐中剩下200ml的培養(yǎng)液，新添加800ml的含有醋酸、乙醇、100μg/ml的氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基，用醋酸將乙醇濃度調(diào)整到4％，培養(yǎng)溫度提高到33℃，再開始發(fā)酵。
進一步發(fā)酵，在培養(yǎng)基中的醋酸濃度達到3％左右時，進行再取出培養(yǎng)液、再添加培養(yǎng)基的操作，將溫度提高到36℃同樣進行發(fā)酵，再進行同樣操作，將培養(yǎng)溫度每次升高1℃繼續(xù)實施醋酸發(fā)酵。
然后，通過測定660nm的吸光度，測定培養(yǎng)液中的醋酸濃度，比較醋酸發(fā)酵程度。
結(jié)果就象圖3所示那樣，可以確認轉(zhuǎn)化株在40℃下可以進行醋酸發(fā)酵、菌體增殖，但原株醋化醋酸桿菌No.1023株只在37℃下進行醋酸發(fā)酵、菌體增殖，可以確認SPT基因的溫度耐性增強的功能。
(實施例3)用來自Gluconacetobacter entanii的醋酸耐性基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株中的醋酸發(fā)酵試驗比較實施例2中獲得的含有質(zhì)粒pSPT的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株和只導入了穿梭載體-pMV24的原株醋化醋酸桿菌No.1023株的醋酸發(fā)酵能力。
具體來說，使用5L的微小罐發(fā)酵罐(三ツワ理化學工業(yè)公司生產(chǎn)KMJ-5A)，在含有1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml的氨芐青霉素的2.5L的YPG培養(yǎng)基中于30℃、400rpm、0.20vvm條件下進行通氣攪拌培養(yǎng)，直至達到醋酸濃度3％使其發(fā)酵。然后取出培養(yǎng)液使微小罐發(fā)酵罐中剩下700ml的培養(yǎng)液，對700ml添加1.8L的YPG培養(yǎng)基調(diào)整到含有3％醋酸、4％乙醇的濃度，開始醋酸發(fā)酵，為了將培養(yǎng)過程中的乙醇濃度維持在1％，一邊加乙醇，一邊繼續(xù)進行通氣攪拌培養(yǎng)，比較轉(zhuǎn)化株和原株的醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果歸納在表1中。
表1

由表1的結(jié)果可以確認轉(zhuǎn)化株一方無論最終醋酸濃度、比增殖速度、生酸速度、增殖誘導期哪一點都顯著優(yōu)越。
(實施例4)用來自Gluconacetobacter entanii的醋酸耐性基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株中的醋酸耐性的增強(1)對Acetobacter altoacetigenes的轉(zhuǎn)化用實施例2得到的質(zhì)粒pSPT通過電穿孔法(例如，參照專利文獻6)轉(zhuǎn)化作為Gluconacetobacter entaniil的一株的Acetobacteraltoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)。于添加了100μg/ml的氨芐青霉素和4％醋酸和4％乙醇的含有0.55％瓊脂的YPG瓊脂培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)化株進行選擇。
就在選擇培養(yǎng)基上生長增殖的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒并進行解析，確認了保持了帶有SPT的質(zhì)粒。
具體來說，使用5L的微小罐發(fā)酵罐(三ツワ理化學工業(yè)公司生產(chǎn)KMJ-5A)，在含有4％醋酸、4％乙醇和100μg/ml的氨芐青霉素的2.5L的YPG培養(yǎng)基中于30℃、500rpm、0.20vvm條件下進行通氣攪拌培養(yǎng)，直至達到醋酸濃度6.3％使其發(fā)酵。然后取出培養(yǎng)液使微小罐發(fā)酵罐中剩下700ml的培養(yǎng)液，對剩下的700ml添加6％的含有100μg/ml的氨芐青霉素的1.8L的YPG培養(yǎng)基，調(diào)整到6％、乙醇4％的濃度，開始醋酸發(fā)酵，為了將培養(yǎng)過程中的乙醇濃度維持在1％，一邊加乙醇，一邊繼續(xù)進行通氣攪拌培養(yǎng)，比較轉(zhuǎn)化株和原株的醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果歸納在表2中。
表1

由表2的結(jié)果可以確認轉(zhuǎn)化株一方無論最終醋酸濃度、比增殖速度、生酸速度、增殖誘導期哪一點都顯著優(yōu)越。
(實施例5)來自Acetobacter aceti的醋酸耐性基因的克隆和堿基序列以及氨基酸序列的決定將Acetobacter aceti No.1023株(FERM BP-2287)于YPG培養(yǎng)基(3％葡萄糖、0.5％酵母提取液、0.2％多胨)中在30℃下進行振蕩培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，對培養(yǎng)液進行離心分離(7,500×g、10分鐘)，得到菌體。利用染色體DNA制備法(例如，參照專利文獻3)從得到的菌體中制備染色體DNA。
將上述制備DNA作為模板，利用反向聚合酶鏈反應進行克隆。具體來說，由來自于Acetobacter altoacetigenes MH-24株得到的DNA序列(序列表1)的與其他生物種比較認為保守性高的區(qū)域合成引物3(序列編號7(圖9)所示的堿基序列)、引物4(序列編號8(圖10)所示的堿基序列)。然后以Acetobacter aceti No.1023株的染色體DNA作為模板進行PCR，得到約750bp的擴增片段。然后將Acetobacter acetiNo.1023株的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶PstI完全切斷，按照常規(guī)方法進行連接。以連接產(chǎn)物作為模板，使用引物5(序列編號9(圖11)所示的堿基序列)、引物6(序列編號10(圖12)所示的堿基序列)，得到約3kbp的擴增片段。
這些片段的堿基序列通過Sanger的雙脫氧鏈終止法決定，結(jié)果決定了序列編號3記載的堿基序列。序列決定是對兩方的DNA鏈的所有區(qū)域進行的。
(實施例6)用來自Acetobacter aceti的醋酸耐性基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株中的醋酸耐性的增強(1)Acetobacter altoacetigenes的轉(zhuǎn)化用實施例5得到的質(zhì)粒pSPT2通過電穿孔法(例如，參照專利文獻6)轉(zhuǎn)化作為Gluconacetobacter entaniil I株的Acetobacteraltoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)。于添加了100μg/ml的氨芐青霉素和4％醋酸和4％乙醇的含有0.55％瓊脂的YPG瓊脂培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)化株進行選擇。
就在選擇培養(yǎng)基上生長增殖的氨芐青霉素耐性的轉(zhuǎn)化株通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒并進行解析，確認了保持了帶有SPT的質(zhì)粒。
具體來說，使用5L的微小罐發(fā)酵罐(三ツワ理化學工業(yè)公司生產(chǎn)KMJ-5A)，在含有4％醋酸、4％乙醇和100μg/ml的氨芐青霉素的2.5L的YPG培養(yǎng)基中于30℃、500rpm、0.20vvm條件下進行通氣攪拌培養(yǎng)，使其發(fā)酵直至達到醋酸濃度6.3％。然后取出培養(yǎng)液使微小罐發(fā)酵罐中剩下700ml的培養(yǎng)液，對剩下的700ml添加含有100μg/ml的氨芐青霉素的1.8L的YPG培養(yǎng)基，調(diào)整到6％、乙醇4％的濃度，開始醋酸發(fā)酵，為了將培養(yǎng)過程中的乙醇濃度維持在1％，一邊加乙醇，一邊繼續(xù)進行通氣攪拌培養(yǎng)，比較轉(zhuǎn)化株和原株的醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果歸納在表3中。
表1

由表3的結(jié)果可以確認轉(zhuǎn)化株一方無論最終醋酸濃度、比增殖速度、生酸速度、增殖誘導期哪一點都顯著優(yōu)越。
通過本發(fā)明可以提供與醋酸耐性有關的新的基因，以及利用該基因可以獲得高效制造更高醋酸濃度的食醋的育種株，另外可以提供使用該育種株可高效制造高醋酸濃度的食醋的方法。
序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>醋酸耐性相關基因、利用該基因育種的醋酸菌、以及利用該醋酸菌的食醋的制造方法<130>6676<141>2003-3-12<160>10<210>1<211>2016<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii<400>1gatatcaatg gcagcagcaa gatcgttgag gatctggcct ttgattcact ggccgtcatg 60aattttgtca tggaaatcga ggacacgctc gacgtttccg tgccgcttga ccggctggct 120gatatccgca ccattgatga tctggctgcc tgtatcgtct ctctcaagca ggcatcctga 180tacaccatgt cgattttctc gaaatatgaa ggccttgcgt ccgccctgtc ggcggtaacg 240gccgatggtg ggcgcaaccc gttcaacgtc gtgatcgaaa agcccatttc ctccacggtc 300gggctgatcg aagggcgcga gacgcttctg ttcggcacca acaactatct tgggctgagc 360cagtccccgg ccgcgatcga agcggcggtg gaagccgcca gggcttatgg tgtcggcacg 420accggatcgc gcatcgccaa tggcacgcag ggtctgcacc gccagttgga agagcggctg 480tgcaccttct tccgtcgtcg gcactgcatg gtgttttcca ccggttacca ggccaatctg 540ggcacgattt ccgcactggc gggcaaggac gattatctgc tgcttgatgc ggacagccat 600gccagcatct atgatggcag ccgccttggc catgcgcagg tcatccgctt ccgtcacaac 660gacgccgatg acctgcataa acgcctgcgc cgccttgatg gtacgcccgg agcgaaactg 720gtcgtggtcg aaggcatcta ttccatgatg ggcgacgtcg ttcccatggc ggaattcgcg 780gccgtcaagc gggaaaccgg tgcatggctg ctggcggatg aagcacattc cgttggtgta 840atgggcgaac atggccgtgg cgtggcggaa tccgacggcg tggaagatga tgtcgatttt 900gtcgtcggca ccttttccaa aagccttggc acggttggtg gctactgtgt ttccaaccat 960
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Phe Gly Thr Asn Asn Tyr Leu Gly Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ala Ile50 55 60Glu Ala Ala Val Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Gly Val Gly Thr Thr Gly65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Asn Gly Thr Gln Gly Leu His Arg Gln Leu Glu Glu85 90 95Arg Leu Cys Thr Phe Phe Arg Arg Arg His Cys Met Val Phe Ser Thr100 105 110Gly Tyr Gln Ala Asn Leu Gly Thr Ile Ser Ala Leu Ala Gly Lys Asp115 120 125Asp Tyr Leu Leu Leu Asp Ala Asp Ser His Ala Ser Ile Tyr Asp Gly130 135 140Ser Arg Leu Gly His Ala Gln Val Ile Arg Phe Arg His Asn Asp Ala145 150 155 160Asp Asp Leu His Lys Arg Leu Arg Arg Leu Asp Gly Thr Pro Gly Ala165 170 175Lys Leu Val Val Val Glu Gly Ile Tyr Ser Met Met Gly Asp Val Val180 185 190Pro Met Ala Glu Phe Ala Ala Val Lys Arg Glu Thr Gly Ala Trp Leu195 200 205Leu Ala Asp Glu Ala His Ser Val Gly Val Met Gly Glu His Gly Arg210 215 220Gly Val Ala Glu Ser Asp Gly Val Glu Asp Asp Val Asp Phe Val Val225 230 235 240Gly Thr Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Val Gly Gly Tyr Cys Val Ser245 250 255Asn His Ala Gly Leu Asp Leu Ile Arg Leu Cys Ser Arg Pro Tyr Met260 265 270Phe Thr Ala Ser Leu Pro Pro Glu Val Ile Ala Ala Thr Met Ala Ala
275 280 285Leu Thr Glu Leu Glu Asn Arg Pro Glu Leu Arg Val Arg Leu Met Asp290 295 300Asn Ala Arg Arg Leu His Asp Gly Leu Gln Ala Ala Gly Leu Arg Thr305 310 315 320Gly Pro Gln Ala Ser Pro Val Val Ser Val Ile Leu Asp Asp Val Ala325 330 335Val Ala Val Ala Phe Trp Asn Arg Leu Leu Asp Leu Gly Val Tyr Val340 345 350Asn Leu Ser Leu Pro Pro Ala Thr Pro Asp Gln His Pro Leu Leu Arg355 360 365Thr Ser Val Met Ala Thr His Thr Pro Glu Gln Ile Asp Arg Ala Val370 375 380Glu Ile Phe Ala Val Val Ala Gly Glu Met Gly Ile Asn Arg Ala Ala385 390 395 400<210>3<211>1360<212>DNA<213>Acetobacter aceti<400>3gaagacagct tggatgtatc tatcccgctc gacaaactgg ctgatatccg aacgattaat 60gaccttgccg cttgcattgt tgctctgaaa aacaaagggt gaggcgtgga tgacatcact120attttccaaa tttgaaggta cggcaggcgc gctgggttcc gttgtggccg taggcggtcg180caaccctttt gctgttgtta ttgaaaaacc tgtctcttca actgttggaa ttattgaagg240tcgggaaacg cttctttttg gcaccaataa ctatttgggg cttagtcaat ccaaaaatgc300cattcaagca gcccagcagg ctgccgcggc atgtggcgta ggcacaacgg gctcacgcat360tgcaaatggc acacaatccc tgcaccgaca gcttgaaaaa gatattgccg cgttttttgg420tcggcgtgat gccatggttt tttccacggg gtatcaggca aacctcggca ttatttccac480gctggcaggt aaggatgacc acctgtttct ggatgctgat agccacgcca gtatctatga540
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Gly Ser Arg Ile Ala Asn Gly Thr Gln Ser Leu His Arg Gln Leu Glu85 90 95Lys Asp Ile Ala Ala Phe Phe Gly Arg Arg Asp Ala Met Val Phe Ser100 105 110Thr Gly Tyr Gln Ala Asn Leu Gly Ile Ile Ser Thr Leu Ala Gly Lys115 120 125Asp Asp His Leu Phe Leu Asp Ala Asp Ser His Ala Ser Ile Tyr Asp130 135 140Gly Ser Arg Leu Ser Ala Ala Glu Val Ile Arg Phe Arg His Asn Asp145 150 155 160Pro Asp Asn Leu Tyr Lys Arg Leu Lys Arg Met Asp Gly Thr Pro Gly165 170 175Ala Lys Leu Ile Val Val Glu Gly Ile Tyr Ser Met Thr Gly Asn Val180 185 190Ala Pro Ile Ala Glu Phe Val Ala Val Lys Lys Glu Thr Gly Ala Tyr195 200 205Leu Leu Val Asp Glu Ala His Ser Phe Gly Val Leu Gly Gln Asn Gly210 215 220Arg Gly Ala Ala Glu Ala Asp Gly Val Glu Ala Asp Val Asp Phe Val225 230 235 240Val Gly Thr Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Val Gly Gly Tyr Cys Val245 250 255Ser Asp His Pro Glu Leu Glu Phe Val Arg Leu Asn Cys Arg Pro Tyr260 265 270Met Phe Thr Ala Ser Leu Pro Pro Glu Val Ile Ala Ala Thr Thr Ala275 280 285Ala Leu Lys Asp Met Gln Ala His Pro Glu Leu Arg Lys Gln Leu Met290 295 300Ala Asn Ala Gln Gln Leu His Ala Gly Phe Val Asp Ile Gly Leu Asn
305 310 315 320Ala Ser Lys His Ala Thr Pro Val Ile Ala Val Thr Leu Glu Thr Ala325 330 335Glu Glu Ala Ile Pro Met Trp Asn Arg Leu Leu Glu Leu Gly Val Tyr340 345 350Val Asn Leu Ser Leu Pro Pro Ala Thr Pro Asp Ser Arg Pro Leu Leu355 360 365Arg Cys Ser Val Met Ala Thr His Thr Pro Glu Gln Ile Ala Gln Ala370 375 380Ile Ala Ile Phe Arg Gln Ala Ala Ala Glu Val Gly Val Thr Ile Thr385 390 395 400Pro Ser Ala Ala<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5ctggctgcct gtatcgtctc tctcaagcag 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6acggctgcag ctggtctgcc tgccgtatct 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>7
ggcaaacctc ggcattattt ccacgctggc 30<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8gcgaatctgg tgtagccgga ggaaggctg 29<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>9gccagcgtgg aaataatgcc gaggtttgcc 30<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>10cagccttcct ccggctacac cagattcgc 29
權利要求
1.下述(A)或(B)所示的蛋白質(zhì)SPT。(A)具有序列表中的序列2記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由序列表中的序列2記載的氨基酸序列中含有1個或數(shù)個氨基酸置換、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)。
2.編碼下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT的基因的DNA，(A)具有序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由序列表中的序列編號2記載的氨基酸序列中含有1個或數(shù)個氨基酸置換、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)。
3.權利要求2所述的基因的DNA，是下述(a)或(b)所示的DNA，(a)含有由序列表中的序列編號1記載的堿基序列中的堿基編號187～1386構成的堿基序列的DNA。(b)與具有由序列表中的序列編號1記載的堿基序列中的堿基編號187～1386構成的堿基序列或其一部分的探針在嚴格條件下進行雜交，而且編碼具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)的DNA。
4.下述(A)或(B)所示的蛋白質(zhì)SPT2，(A)具有序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列中含有1個或數(shù)個氨基酸置換、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)SPT2。
5.編碼下述(A)或(B)所示蛋白質(zhì)SPT2的基因的DNA。(A)具有序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)由序列表中的序列編號4記載的氨基酸序列中含有1個或數(shù)個氨基酸置換、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸序列構成、而且具有增強醋酸耐性功能的蛋白質(zhì)SPT2。
6.權利要求5所述的基因的DNA，是下述(A)或(B)所示的DNA，(A)含有由序列表中的序列編號3記載的堿基序列中的堿基編號386～1636構成的堿基序列的DNA。(B)與由序列表中的序列編號3記載的堿基序列中的堿基編號386～1636構成的堿基序列或其一部分制成的探針在嚴格條件下進行雜交，而且編碼具有促進增殖速度功能的蛋白質(zhì)的DNA。
7.微生物，是通過擴增權利要求2、或權利要求3、或權利要求5、或權利要求6所述的DNA的細胞內(nèi)的拷貝數(shù)而增強醋酸耐性的微生物。
8.權利要求7所述的微生物，其特征是微生物是醋桿菌屬、或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。
9.一種食醋的制造方法，其特征是將權利要求7、或權利要求8所述的微生物中具有醇氧化能力的微生物于含有乙醇的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使醋酸生成、蓄積在該培養(yǎng)基中。
10.含有權利要求2、或權利要求3所述的DNA的重組質(zhì)粒pUSPT(FERM BP-7932)、或含有權利要求5、或權利要求6所述的DNA的重組質(zhì)粒pUSPT2(FERM BP-8304)。
全文摘要
本發(fā)明提供與醋酸菌的醋酸耐性有關的新的基因，以及使用該基因使微生物、特別是提高醋酸菌的醋酸耐性的方法，以及使用醋酸耐性提高的醋酸菌高效制造更高醋酸濃度的食醋的方法。在本發(fā)明中，通過從醋酸菌的染色體DNA文庫獲得在通常不能增殖的醋酸濃度的培養(yǎng)基中也可以增殖的基因的方法，由屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的實用醋酸菌克隆了具有在實用水平上可以使醋酸耐性提高功能的新的基因。另外，在將該基因?qū)肓舜姿峋霓D(zhuǎn)化株中，醋酸耐性顯著提高，在乙醇存在下對該轉(zhuǎn)化株進行通氣培養(yǎng)時，也可以使增殖誘導期縮短、增殖速度提高，而且使最終醋酸濃度顯著提高。
文檔編號C12J1/04GK1643151SQ0380608
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月12日 優(yōu)先權日2002年3月15日
發(fā)明者后藤英嗣, 中野繁 申請人:株式會社味滋集團公司