專利名稱：丙二醇烷基(或芳基)醚及醚乙酸酯的酶催化拆分的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物催化領域，本發(fā)明涉及二醇醚及二醇醚乙酸酯的酶催化拆分工藝，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚及丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的酶催化拆分。
背景技術：
對映體是以具有不同空間構型的兩種不同異構體形式存在的非對稱分子，因為它們不具有對稱平面，對映體與它們的鏡像不相同；以兩種對映體形式存在的分子是手性的，這表示它們能夠出現(xiàn)“左”手和“右”手的形式。有機分子中產(chǎn)生手性的最通常的原因是出現(xiàn)了與四個不同取代基或基團相連的四面體碳，這樣的碳被稱為手性中心，或立構中心。一種表示立構中心處原子三維排布(或構型)的方法指當最低優(yōu)先基團指向遠離假定觀察者時，基團優(yōu)先級的排布如果剩余三個基團從較高到較低優(yōu)先級的排布是順時針的，則立構中心具有“R”(或“D”)構型；如果這種排布是逆時針的，則立構中心具有“S”(或“L”)構型。
對映體具有相同的經(jīng)驗化學分子式，并且在反應中化學性質一般相同。然而，對其他非對稱化合物，對映體顯示出不同的化學反應性，并對非對稱物理擾動產(chǎn)生不同的相應，最通常的非對稱擾動是偏振光。
對映體能使平面偏振光旋轉，因此，對映體是光學活性的。相同化合物的兩種不同對映體將使平面偏振光向相反方向旋轉，因此，對一假定觀察者來說，光可以向左或逆時針旋轉(這是左旋或“l(fā)”，或減號或“-”)，或者可以向右或順時針旋轉(這是右旋或“d”或加號或“+”)。光旋轉的符號(+)或(-)與R、S標準無關。等量的兩種手性對映體的混合物稱為外消旋混合物，或外消旋物，并可以用符號(+/-)表示，也可以用前綴“d，l”表示右旋和左旋形式的混合物。外消旋混合物不顯示光旋轉性，因為存在等量的(+)和(-)形式。但是，但是一般來講，出現(xiàn)單一對映體使光僅向一個方向旋轉，因此，單一對映體被稱作光學純物質。
光學純化合物作為手性合成子是有利的，一個原因是活性生物體中的非對稱分子通常僅出現(xiàn)一種它們可能的手性形式。相反，當在實驗室合成一手性有機化合物時，合成反應(無非對稱催化劑)一般產(chǎn)生等量的兩種手性形式，生成等摩爾、或外消旋的異構體產(chǎn)物混合物。將外消旋混合物分離成它的兩組分對映體稱為外消旋混合物的拆分。但是，分離外消旋混合物非常困難(一種方法是通過外消旋物與標準非對稱化合物反應，并將所得具有不同物理性質的產(chǎn)物分離(非對映體)，然后去除標準非對稱化合物)。然而，三維形狀的或立構化學的生物分子對生物功能異常主要。此外，相同結構的對映體可以具有非常不同的生物效用。例如，薩里多米德藥為合成藥物，被認為是一種外消旋物用藥；僅有一種對映體是有效的抗嘔吐藥，而另一種對映體是一種有效的致畸劑，這是給懷孕婦女服用了這種外消旋物之后才悲哀地發(fā)現(xiàn)的事實。
因此，具有生物功能分子的合成優(yōu)選從可形成所需生物活性產(chǎn)品的單一對映體進行，例如，手性的1，2-丙二醇可用于心血管藥、抗病毒藥、以及對映體純冠醚(Hoff et al.(1996)四面體非對稱性(TetrahedronAsymmetry)73181-3186)的制備。這些以及相關的手性化合物也可以用作手性聚合物的合成子、色譜基質、或通過LC或NMR進行手性酸的立體化學分析的衍生試劑。除了醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應用外，光活性的仲醇，特別是那些帶有含氟代烷基(如三氟甲基-)的非對稱碳的仲醇，是鐵電和抗鐵電液晶方面(US專利No.6,239,316B1；EPO申請No.99115154.9)的有用材料。
光學純化合物可以化學合成，但是非對稱化學合成常常需要催化劑，這些催化劑很昂貴和/或者會對環(huán)境有害；此外，這樣的合成一般都要多個步驟，并常常局限于含有給定化學反應中的結構需求的基質。典型化學合成得到的異構體或對映體混合物可以化學或酶催化拆分(或分離成純對映體)。外消旋物的化學拆分如上所述。外消旋物的酶催化拆分依賴于酶對外消旋物基質的一種異構體的優(yōu)選性或選擇性，結果是形成以優(yōu)選基質為主的產(chǎn)物，而將非優(yōu)選的基質主要留在起始異構體中。酶對外消旋物一種異構體的優(yōu)選性稱為對映體選擇性。使用酯酶、脂肪酶以及蛋白酶來進行對映體混合物的動態(tài)拆分已為人熟知。然而，對映體混合物的對映體選擇性拆分不僅嚴重依賴于酶的選擇性，而且依賴于酶基質的化學結構。因此，拆分一給定基質或一系列相關基質的酶的最佳選擇性不易預測，但要求仔細篩選許多酶，同時改變潛在基質的化學結構。
酶催化拆分少量丙二醇醚和相關衍生物的一些實例已在科學和專利文獻中說明。對不易拆分的基質，包括對(±)-1-甲氧基-2-丙醇的乙酸酯和丁酸酯進行對映體選擇性水解的篩選，最近也已有說明(Baumann et al.(2000)四面體不對稱性(TetrahedronAsymmetry)114781-4790)。這些作者報道了來自Candida Antaractica(CAL-B)的部分脂肪酶B催化了乙酸(R)-1-甲氧基-2-丙醇酯的對應體選擇性水解，同時產(chǎn)生了相應(S)-乙酸酯和(R)-醇超過99％ee并且為最大產(chǎn)率(50％)。制備規(guī)模的反應顯然可以50ml規(guī)模進行，使用5.28％(w/v)的乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯(根據(jù)20mmol基質、1.0mg/ml的酶50mg計算)。已報道2.7％(w/v)的(±)-1-甲氧基-2-丙醇在正己烷中用乙酸乙烯酯作?；o體進行酶選擇性?；磻a(chǎn)生乙酸(R)-1-甲氧基-2-丙醇酯，得到98％ee和20％的基質轉化產(chǎn)率(Baumann et al.(2000)四面體不對稱性(TetrahedronAsymmetry)114781-4790)。
使用CAL-B脂肪酶(Novozyme 435)進行光拆分的另一實例是通過4-異丙氧基丁-2-醇與丙酸乙烯酯的對映體選擇性酯化轉移催化產(chǎn)生(R)-(+)-4-異丙氧基丁烷-2-丙酸酯(美國專利No.6,239,316B1；EPO申請No.99115154.9)。酯的化學水解提供了相應的超過95％ee的(R)-醇。
單獨的丙二醇醚(例如，丙二醇苯基醚或1-苯氧基-2-丙醇)和它們相應的乙酸酯(丙二醇苯基醚乙酸酯或乙酸1-苯氧基-2-丙醇酯)已成為大量基團生物催化拆分的中心。三項日本專利已描述了用完整細胞通過對外消旋乙酸酯的處理制備(R)-和(S)-1-芳氧基-2-烷醇，及它們的制備，或來自它們的脂肪酶(日本專利申請Nos.JP 1991-262377，JP1991-262378，和JP1991-262379)；專利中描述的大多數(shù)工作后來都發(fā)表了(Yanase et al.(1993)Biosci.Biotech.Biochem.571334-1337)。此外，已用CAL-B和其他脂肪酶(Hoff et al.(1996)四面體不對稱性(TetrahedronAsymmetry)73181-3186)研究了丁酸1-苯氧基-2-丙醇酯的水解拆分。用丁酸2-氯乙醇酯和其他酰基給體進行的1-苯氧基-2-丙醇的酯化轉移已經(jīng)用于計算機程序開發(fā)計算對映體比例和生物催化拆分中的平衡常數(shù)(Anthonsen等人(1995)四面體非對稱性(TetrahedronAsymmetry)63015-3022；Hoff等人(1996)四面體非對稱性(TetrahedronAsymmetry)73187-3192)。使用乙烯丙酸酯作為?；o體(Gais等人(2001)J.Org.Chem.663384-3396)采用豬肝酯酶(PLE)的聚合物活化形式也說明了1-苯氧基-2-丙醇(約3％w/v)的酯化轉移。
然而，對相關的丙二醇烷基(或芳基)醚以及它們相應乙酸酯的外消旋物通過酶催化水解和?；M行對映體選擇性拆分還沒有報道，這些相關二醇醚的實例包括但不限于丙二醇乙基醚、丙二醇正-丙基醚、丙二醇異丙基醚、丙二醇正-丁基醚、丙二醇叔-丁基醚、以及它們相應的乙酸酯。對丙二醇甲基醚或丙二醇苯基醚或它們相應的乙酸酯在高基質濃度下進行水解或酰基化，得到高旋光純度和高產(chǎn)率的反應條件還沒有描述。
二醇醚以及它們相應的乙酸酯，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚以及它們相應的乙酸酯，以工業(yè)上可行的方式拆分尤其困難。因此，開發(fā)將丙二醇烷基(或芳基)醚以及它們相應乙酸酯的外消旋混合物拆分的工藝將非常有益，其中工藝是酶催化的，可導致高度分離，且產(chǎn)率高、速度快并且經(jīng)濟。
說明和縮略詞為便于理解本發(fā)明，將在此所用的大量縮略詞、術語和詞匯說明如下“Candida Antarctica脂肪酶部分B”縮略為CALB或CAL-B。
“酶活性單元”縮略為U。
“對映體多余”縮略為ee。
“對映體選擇性”縮略為E。
“丙二醇甲醚”(也稱1-甲氧基-2-丙醇)縮略為PM。
“丙二醇甲醚乙酸酯”(也稱乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯)縮略為PMA。
“丙二醇乙醚”(1-乙氧基-2-丙醇)縮略為PE。
“丙二醇乙醚乙酸酯”(乙酸1-乙氧基-2-丙醇酯)縮略為PEA。
“丙二醇正-丙醚”(1-正-丙氧基-2-丙醇)縮略為PnP。
“丙二醇正-丙醚乙酸”(乙酸1-正-丙氧基-2-丙醇酯)縮略為PnPA。
“丙二醇異丙醚”(1-異丙氧基-2-丙醇)縮略為PiP。
“丙二醇異丙醚乙酸酯”(乙酸1-異丙氧基-2-丙醇酯)縮略為PiPA。
“丙二醇正-丁醚”(1-正-丁氧基-2-丙醇)縮略為PnB。
“丙二醇正-丁醚乙酸酯”(乙酸1-正-丁氧基-2-丙醇酯)縮略為PnBA。
“丙二醇叔-丁醚”(1-叔-丁氧基-2-丙醇)縮略為PtB。
“丙二醇叔-丁醚乙酸酯”(乙酸1-叔-丁氧基-2-丙醇酯)縮略為PtBA。
“丙二醇苯基醚”(1-苯氧基-2-丙醇)縮略為PPh。
“丙二醇苯基醚乙酸酯”(乙酸1-苯氧基-2-丙醇酯)縮略為PPhA。
“亞丙基系列二醇醚”或“P-系列二醇醚”或“P-系列基質”指丙二醇烷基(或芳基)醚，并包括但不僅限于上述所列的化合物，PM、PE、PnP、PiP、PnB、PtB和PPh，這類化合物一般包括任何的通過環(huán)氧丙烷在堿性條件下與含醇官能團化合物反應制備的二醇醚。
“亞丙基系列二醇醚乙酸酯”或“P-系列二醇醚乙酸酯”或“P-系列乙酸酯基質”指丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯，并包括但不僅限于上述所列的化合物，PMA、PEA、PnPA、PiPA、PnBA、PtAB和PPhA，這類化合物包括一般的乙酸酯衍生物，主要是在上述說明的化合物“2-丙醇的1-取代醚”的C-2羥基位置的乙酸酯衍生物。
“丙二醇烷基(或芳基)醚”縮略為PGAE。
“丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯”縮略為PGAEA。
“?；纪榛?或芳基)醚”縮略為?；?PGAE，并包括PGAEA。
“乙酸丁酯”縮略為BA。
“乙酸4-乙基苯酚酯”縮略為EPA。
“乙酸乙酯”縮略為EtA。
“三氯乙酸乙酯”縮略為EtCA。
“三氟乙酸乙酯”縮略為EtFA。
“乙酸異丙烯酯”縮略為IPA。
“乙酸乙烯酯”縮略為VA。
“甲氧基乙酸乙酯”縮略為EMA。
“丁酸2，2，2-三氟乙醇酯”縮略為TfEB。
“雙烯酮”縮略為DK。
“丙酸乙烯酯”縮略為VP。
“丙交酯”為3，6-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮。
比率“v/v”指體積/體積。
“異構體”一詞指具有相同分子式但結構不同的化合物，僅在構型和/或構象上有差別的異構體稱為“立構體”，“異構體”一詞也用于指對映體。
“對映體”一詞用于說明彼此成鏡像且不可重疊的一對分子異構體之一，其他用于指定或指代對映體的詞語包括“立構體”，(因為手性中心周圍的排布或立體化學不同；盡管所有的對映體都是立構體，但不是所有的立構體都是對映體)或“光學異構體”(因為純對映體的光學活性，這種光學活性指不同的純對映體使平面偏振光向不同方向旋轉的能力)。對映體一般具有相同的物理性質，如熔點和沸點，并且還具有相同的分光性質。對映體在他們與平面偏振光的相互作用以及生物活性方面可彼此區(qū)分。
符號“R和S”用于表示關于其手性中心分子的絕對構型，符號可以出現(xiàn)作前綴或后綴；它們可以通過一個連字號與異構體分開，也可以不分開；可以用連字號連接，也可以不用；可以用圓括號包圍，也可以不用。
符號或前綴“(+)和(-)”用于指定化合物使平面偏振光旋轉的符號，(-)意指化合物是左旋的(向左旋轉)，前綴有(+)的化合物是右旋的(向右旋轉)。
詞語“外消旋混合物”，“外消旋化合物”，或“外消旋物”指一種化合物的兩種對映體的混合物。理想的外消旋混合物是其中化合物的兩種對映體為50∶50的一種混合物，這樣，(+)對映體的旋光性與(-)對映體的旋光性相抵消。
詞語“分離”，“拆分”，用于指外消旋混合物時，指將外消旋物分成它的兩個對映體形式(如，(+)和(-)；(R)和(S)的形式)。這些詞語也指外消旋物的一種異構體的對映體選擇性轉化生成產(chǎn)物。
詞語“對映體多余”或“ee”指一種對映體產(chǎn)生的量超過另一種而得到的反應產(chǎn)物，并被定義為(+)-和(-)-對映體的混合物，組成以摩爾比或質量比或體積比F(+)和F(-)給出(其中，F(xiàn)(+)和F(-)的總量＝1)。對映體多余量定義為*F(+)-F(-)*且對映體多余量的百分數(shù)為100×*F(+)-F(-)*。對映體的“純度”由它的ee或ee百分值(％ee)來說明。
不論用“純化的對映體”還是“純對映體”或“分離的對映體”或“對映體多余化合物”表示，這些詞語都意指一種對映體的量超過了另一種對映體的量。因此，提及對映體制備時，同時采用(或其中之一)主要對映體的百分含量(如，摩爾或質量或體積)和(或)主要對映體的對映體多余百分含量可以用來確定該制備是否表示了一種純化的對映體制備。
異構體的“對映體的純度”或“對映體純度”一詞指純化對映體的一種定性或定量的度量；典型的，這種度量依據(jù)ee或對映體多余量來表示。
詞語“足夠純化的對映體”，“足以分離的對映體”，“足夠純化的對映體制備”，都意指制備(如，源自非光學活性起始原料、基底、或中間體)中一種對映體多于另一種，對映體或對映體制備中優(yōu)選其中的另一種對映體少于20％，更優(yōu)選少于10％，并更優(yōu)選少于5％，并還要更優(yōu)選少于2％。
詞語“純化的對映體”，“分離的對映體”和“純化對映體制備”都意指制備(如，源自非光學活性起始原料、基質或中間體)中一種對映體(例如，R-對映體)多于另一種，并且制備中的另一種對映體(例如，S-對映體)少于30％，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選少于10％(如，在特殊情形下，R-對映體中實質無S-對映體)，并還要更優(yōu)選少于5％，并還要更優(yōu)選少于2％?？梢院铣杉兓膶τ丑w實際沒有另一種對映體，或以立構優(yōu)選的過程合成的純化對映體，然后進行分離，或純化的對映體可以來自外消旋混合物。
詞語“對映體選擇性”，也稱作對映體比，以符號“E”表示，指在產(chǎn)物外消旋混合物中，從外消旋基質中，將一種對映體相對于另一種對映體的產(chǎn)生出來的酶的選擇能力，換言之，它是對酶區(qū)分對映體的能力的一種度量。一個非選擇性的反應E為1，當E高于20時的拆分一般認為對合成或分離有利。對映體選擇性在于涉及的對映體之間的轉化率不同。所得反應產(chǎn)物富含對映體中的一種；反過來，殘余基質富含另一種對映體。出于實際的目的，一般希望需要得到的一種對映體大大過量，這可通過在一定的轉化度處終止轉化過程來實現(xiàn)。
根據(jù)測定三個變量中的兩個來計算E起始物料的對映體純度(ees)，產(chǎn)物的對映體純度(eep)，以及轉化的程度(c)，然后，采用下列三個等式之一計算(見有機合成中的水解酶(Hydrolases in OrganicSynthesis)，Bonscheuer，UT and Kazlauskas，RJ(1999)Wiley-VCH，NewYork)，section 3.1.1；以及Chen et al.，J.AM.Chen.Soc.1047294-7299(1982))E＝ln[1-c(1+eep)]/ln[1-c(1-eep)]E＝ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)]E＝ln{(1-ees)/[1+(ees/eep)]}/ln{(1+ees)/[1+(ees/eep)]}詞語“?；o體”指在酶催化劑和基質的存在下導致形成酯的適當反應化合物。本發(fā)明中，基質為二醇醚，尤其是丙二醇烷基(或芳基)醚，酶催化劑為水解酶，并優(yōu)選脂肪酶，更優(yōu)選CAL-B。?；o體包括非活性的或活性的?；o體，非活性?；o體的非限制性實例包括丙二醇甲醚乙酸酯(PMA)、丙二醇乙醚乙酸酯(PEA)、丙二醇正-丙醚乙酸酯(PnPA)、乙酸乙酯(EtA)、乙酸丁酯(BA)和乙酸乙基苯酚酯(EPA)?；钚怎；o體的非限制性實例為活性酯(包括但不限于丁酸三氟乙醇酯、S-乙基硫代辛酸酯，以及聯(lián)乙酰單肟乙酸酯)，烯醇酯(包括但不限于乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、及乙酸1-乙氧基乙烯酯、及雙烯酮)，以及酐(乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐)。?；o體的非限制性實例包括乙酸丁酯(BA)、乙酸乙基苯酚酯(EPA)、乙酸乙酯(EtA)、三氯乙酸乙酯(EtCA)、三氟乙酸乙酯(EtFA)、乙酸異丙烯酯(IPA)、乙酸乙烯酯(VA)、甲氧基乙酸乙酯(EMA)、丁酸2，2，2-三氟乙醇酯(TfEB)、雙烯酮(DK)、丙酸乙烯酯(VP)、PMA和PnPA。
詞語“產(chǎn)率”用于說明酶催化反應中產(chǎn)物的產(chǎn)量時，指反應中基質轉化成產(chǎn)物的量。產(chǎn)率依賴于反應混合物中含有的初始基質的量，以及基質轉化成產(chǎn)物的百分量(％)。詞語“產(chǎn)率”也用于說明酶催化反應中殘留未轉化的基質的量。
詞語“轉化率”用于說明酶催化反應中產(chǎn)物的產(chǎn)量時，指反應中基質轉化成產(chǎn)物的比率或百分比例。
詞語“反應混合物”指酶催化劑和基質的混合物，其中，酶可催化將基質轉化成產(chǎn)物的反應；可出現(xiàn)多種基質(如PGAE和酰基給體)或多種產(chǎn)物(如PGAEA和PGAE)，在反應混合物中也可以出現(xiàn)額外的組分。
詞語“反應基質”指不存在酶催化劑的反應混合物，因此，基質是已去除了酶催化劑的反應混合物，或者基質是除了酶催化劑的其他反應混合物組分的混和體。
詞語“反應介質”指其中混和(如溶解或懸浮或混合)了酶催化劑和至少一種基質的溶液。介質可以是水溶液，優(yōu)選經(jīng)過緩沖的水溶液，也可以除水之外含有溶劑或者由溶劑完全替換水。溶劑可以溶于水，也可以不溶于水，溶劑可以是單一的化合物或者是幾種化合物的混和物，反應介質中溶劑的量可以從無到約為介質的100％。
詞語“兩相反應介質”指含有一水相和一溶劑的反應介質，溶劑與水相不混溶，并且是除了基質以外還存在的物質(基質本身是溶劑)，因此，兩相反應介質含有兩種不相混溶的溶劑，并分成兩相。一般，這樣的反應介質含有一水相(一般經(jīng)過緩沖)和一在液相中溶解性有限的有機溶劑，水相可以非常少(含有的量可以僅稍大于約總反應混合物體積的3％)。
詞語“質子惰性”或“非-水溶液”用于指反應介質時，指基本上沒有水相的(這樣，水相約等于或小于總反應混合物體積的3％)、并且含有至少一種溶劑，優(yōu)選非極性溶劑的反應混合物，優(yōu)選這樣的溶劑是有機溶劑。
詞語“共溶劑”用于指反應介質時，指非基質和非產(chǎn)物溶劑，其中基質和產(chǎn)物本身是溶劑。
詞語“酶催化劑”指能夠將基質轉化成產(chǎn)物的酶，優(yōu)選將基質對映體選擇性的轉化成產(chǎn)物。
詞語“有效量”用于指酶時，指出現(xiàn)在反應混合物中、可催化反應在一合理的時間期內以一合理的水平將基質轉化成產(chǎn)物的酶的量。對于一外消旋混合物，合理水平的對映體選擇性基質向產(chǎn)物的轉化依賴于所需的產(chǎn)率和所需的產(chǎn)物或殘余產(chǎn)物的純度；一般，產(chǎn)率在所需產(chǎn)物的約30％到50％的范圍內(即使反應轉化率接近基質的80％時)，純度在約75％ee到大于99％ee的范圍內。合理的時間由工業(yè)上確定，對于外消旋混合物中對映體選擇性基質向產(chǎn)物的轉化，時間一般從約1小時到約80小時，時間或者是間歇工藝的間歇反應時間，或者是連續(xù)工藝中的液體停留時間，由液體加料反應器體積除以液體體積流量而給出。
詞語“循環(huán)再用”用于指酶催化劑時，指酶催化劑在超過一個批次的反應混合物中回收和再使用催化劑，或在連續(xù)反應工藝中通過再使用提高體積生產(chǎn)率。詞語“高生產(chǎn)率”用于指酶催化劑時，指間歇或連續(xù)操作模式下，催化劑可用于處理大量的液體進料(每單位重量催化劑)而不失去活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供的工藝包括在反應混合物中將分子式為I的丙二醇醚乙酸酯外消旋物與一有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此外消旋物的對映體(R或S)被對映體選擇性的水解成相應的丙二醇醚。
其中，R選自烷基或芳基基團。上述分子式I中，R的非限制性實例為CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。用于本發(fā)明的適合的水解酶選自脂肪酶、酯酶、?；D移酶和蛋白酶組成的集合，優(yōu)選的水解酶是脂肪酶和酯酶，最優(yōu)選的水解酶是脂肪酶；并且特別優(yōu)選的脂肪酶選自Candida antarctica脂肪酶部分B、脂肪酶LP‘S’、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶和假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶組成的集合，最優(yōu)選的脂肪酶是Candida antarctica脂肪酶部分B。優(yōu)選的酯酶包括E001、E002和E003(由Thermogen Inc.銷售)以及豬肝酯酶(PLE)。反應混合物中外消旋物的濃度約大于10％v/v，優(yōu)選大于20％v/v。在一些實例中，水解發(fā)生在水相反應介質中；在另一實例中，水解發(fā)生在兩相反應介質中。在另一實例中，約30％到約50％的外消旋物被水解了。在另一實例中，水解外消旋物的對映體純度至少約為70％ee。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括從反應混合物中回收R-丙二醇醚。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括從反應混合物中回收未反應的S-對映體基質，并通過諸如化學水解或酯化轉移的方法將S-對映體基質轉化以獲得相應的S-丙二醇醚。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括酶催化劑的循環(huán)再用。
另一方面，本發(fā)明提供的工藝包括在反應混合物中將分子式為II的丙二醇醚外消旋物與一有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此外消旋物的R-對映體被對映體選擇性的酯化轉移成相應的R-?；济?。
其中，R選自烷基或芳基基團，并且其中外消旋物的濃度至少約為5％v/v，其中反應混合物還包括?；o體。上述分子式II中，R的非限制性實例為CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。?；o體可以是非活性的或活性的?；o體，活性的?；o體選自活性的酯、烯醇酯和酐。適合的活性?；o體的非限制性實例為乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙酸2，2，2-三氯乙醇酯、乙酸2，2，2-三氟乙醇酯、乙酸丁酯、乙酸乙基苯酚酯、乙酸異丙烯酯、甲氧基乙酸乙酯、乙酸1-乙氧基乙烯酯、雙烯酮、丁酸三氟乙醇酯、乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐。優(yōu)選的活性?；o體為乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯。適合的非活性酰基給體的非限制性實例為乙酸乙酯和手性的?；o體化合物如，外消旋的乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯(PMA)、丙二醇乙醚乙酸酯(PEA)、丙二醇正-丙醚乙酸酯(PnPA)、乙酸乙酯(EtA)、乙酸丁酯(BA)以及乙酸乙基苯酚酯(EPA)。用于本發(fā)明的適合水解酶選自脂肪酶、酯酶、酰基轉移酶和蛋白酶組成的集合，優(yōu)選的水解酶為脂肪酶和酯酶，最優(yōu)選的水解酶為脂肪酶；并且特別優(yōu)選的脂肪酶選自Candida antarctica脂肪酶部分B、脂肪酶LP‘S’、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶和假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶組成的集合。最優(yōu)選的脂肪酶為Candida antarctica脂肪酶部分B。優(yōu)選的酯酶是聚合物活化-豬肝酯酶(PLE)。外消旋物和?；o體可以構成100％v/v的反應混合物，在一些實例中，外消旋物和酰基給體的存在比例可導致約50％的外消旋物轉化成?；济选Ｔ谝恍嵗?，約30％到約50％的外消旋物受到酯化轉移作用并且酰基化丙二醇醚的對映體純度至少約為70％ee。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括從反應混合物中回收R-?；纪榛眩-?；纪榛艳D化以獲得相應的R-丙二醇烷基醚。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括從反應混合物中回收未反應的S-對映體基質。在其他的實例中，本發(fā)明的工藝進一步包括酶催化劑的循環(huán)再用。
另一方面，本發(fā)明提供了一種控制基質轉化程度的方法，是關于在通過酯化轉移作用拆分丙二醇醚外消旋混合物的工藝，其中第一種基質，丙二醇醚，通過第二種基質?；o體被酯化轉移，其中該方法包括(a)確定所需的轉化基質的對映體產(chǎn)率(一般，從約30％到約50％)以及所需的轉化和/或未轉化基質的純度(一般，約30％到約70％轉化率，純度＞90％ee)；(b)計算第一種基質和第二種基質的摩爾比以獲得所需的產(chǎn)率和純度；(c)計算第一種基質和第二種基質的量以便根據(jù)摩爾比從理論上獲得所需的產(chǎn)率和純度；以及(d)在反應混合物中，將第一種基質的第一計算量和第二種基質的第二計算量與酶催化劑水解酶的有效量結合，由此，外消旋物的第一種對映體被對映體選擇性地酯化轉移成相應的第一種對映體的?；济?。第一種基質包括分子式為II的丙二醇醚外消旋混合物， 其中，R選自烷基、芳基、芳基取代烷基、烯丙基或縮醛基團；第二種基質包括選自活性酯、非活性酯、烯醇酯和酐組成的集合的?；o體。在一些實例中，第一種基質的第一計算量是第一體積且第二種基質的計算量是第二體積。在一些實例中，第一種基質的第一計算量和第二種基質的第二計算量組成反應混合物約100％的反應基質。適合的?；o體可以是非活性的或活性的?；o體，活性的酰基給體選自活性的酯、烯醇酯和酐組成的集合。優(yōu)選活性?；o體的非限制性實例為乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙酸2，2，2-三氯乙醇酯、乙酸2，2，2-三氟乙醇酯、乙酸丁酯、乙酸乙基苯酚酯、乙酸異丙烯酯、甲氧基乙酸乙酯、乙酸1-乙氧基乙烯醇酯、雙烯酮、丁酸三氟乙醇酯、乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐。優(yōu)選的活性?；o體為乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯。適合的非活性酰基給體的非限制性實例為乙酸乙酯和手性的?；o體化合物如，外消旋的乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯(PMA)、乙酸丁酯(BA)、乙酸乙基苯酚酯(EPA)、乙酸乙酯(EtA)以及PnPA。上述分子式II中，R的非限制性實例為CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3、C6H5、C(CH3)3、C(CH3)2C6H5、C(CH3)(C6H5)2、C(C6H5)3、C(CH3)2CH2CH3、CH2C6H5、CH2CH＝CH2、CH2C≡CH、CH2OCH2CH2OCH3和CH2OCH3。用于本發(fā)明的適合的水解酶選自脂肪酶、酯酶、?；D移酶和蛋白酶組成的集合，優(yōu)選的水解酶是脂肪酶和酯酶，最優(yōu)選的水解酶是脂肪酶；并且特別優(yōu)選的脂肪酶選自Candida antarctica脂肪酶部分B、脂肪酶LP‘S’、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶和假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶組成的集合。最優(yōu)選的脂肪酶是Candida antarctica脂肪酶部分B。優(yōu)選的酯酶是聚合物活化的豬肝酯酶(PLE)。在一些實例中，外消旋物的(R)-對映體被對映體選擇性的酯化轉移成相應的(R)-對映體酰基化丙二醇醚。在其他的實例中，本發(fā)明的方法進一步包括從反應混合物中回收第一種對映體的?；纪榛旬a(chǎn)物，并通過適當?shù)姆椒ㄈ缢饣蝓セD移將產(chǎn)物轉化以獲得相應的第一種對映體的丙二醇烷基醚。在其他的實例中，本發(fā)明的方法進一步包括從反應混合物中回收未反應的第二種對映體的丙二醇烷基醚。在其他的實例中，本發(fā)明的方法進一步包括酶催化劑的循環(huán)再用。在其他的實例中，本發(fā)明的方法進一步包括監(jiān)控酰基化丙二醇醚的產(chǎn)率以及?；蚍酋；济训膶τ丑w純度，并且調節(jié)第一種基質對第二種基質的比例可獲得所需的產(chǎn)率和純度。在其他的實例中，本發(fā)明的方法涉及將外消旋的二醇醚乙酸酯用作?；o體時進一步包括從反應混合物中去除副產(chǎn)物醇以提高試劑的轉化率和促進同一反應中最多四種手性化合物的生成。
另一方面，本發(fā)明提供分子式為III的手性化合物的制備工藝 在R或S構型中，所說的工藝包括以下步驟(a)在從約4℃到約80℃的溫度下，在反應混合物中，接觸分子式為II的丙二醇醚外消旋物與有效量的選自脂肪酶、酯酶、?；D移酶和蛋白酶組成集合的酶催化劑水解酶，由此得到(S)-1-烷氧基-2-丙醇和(R)-1-烷氧基-2-丙醇?；a(chǎn)物； 其中R為烷基、芳基取代烷基、烯丙基或乙縮醛基團，并且其中反應混合物中進一步包括選自活性酯、非活性酯、烯醇酯和酐組成集合的?；o體。
(b)采用適當?shù)姆蛛x方法如，蒸餾或萃取，從步驟(a)形成的(R)-1-烷氧基-2-丙醇?；a(chǎn)物中分離(S)-1-烷氧基-2-丙醇；
(c)在溫和的反應條件下，在酸催化劑如對-甲苯磺酸或磺化離子交換樹脂的存在下，其量約為從5-15％，優(yōu)選5-10％，wt％，將步驟(b)分離出的(S)-1-烷氧基-2-丙醇去烷氧基化以獲得(S)-1，2-丙二醇；以及(d)通過適當?shù)姆蛛x方法如萃取和/或蒸餾，分離步驟(c)中得到的(S)-1，2-丙二醇；并且，可以選擇，(e)在溫和的反應條件下，在酸催化劑如對-甲苯磺酸或磺化離子交換樹脂的存在下，其量約為從5-15％，優(yōu)選5-10％，wt％，將步驟(b)分離出的(R)-1-烷氧基-2-丙醇酰化產(chǎn)物去烷氧基化以獲得(R)-1，2-丙二醇；以及(f)通過適當?shù)姆蛛x方法如萃取和/或蒸餾，分離步驟(e)中得到的(R)-1，2-丙二醇。
上述分子式II中，R的非限制性實例為C(CH3)3、C(CH3)2C6H5、C(CH3)(C6H5)2、C(C6H5)3、C(CH3)2CH2CH3、CH2C6H5、CH2CH＝CH2、CH2C≡CH、CH2OCH2CH2OCH3和CH2OCH3。?；o體可以是非活性的或活性的?；o體，活性的酰基給體選自活性的酯、烯醇酯和酐。適合的活性?；o體的非限制性實例為乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙酸2，2，2-三氯乙醇酯、乙酸2，2，2-三氟乙醇酯、乙酸丁酯、苯基乙酸乙酯、乙酸異丙烯酯、甲氧基乙酸乙酯、乙酸1-乙氧基乙烯酯、雙烯酮、丁酸三氟乙醇酯、乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐。優(yōu)選的活性酰基給體為乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯。適合的非活性?；o體的非限制性實例為乙酸乙酯和手性的?；o體化合物如，外消旋的乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯(PMA)、丙二醇乙醚乙酸酯(PEA)、丙二醇正-丙醚乙酸酯(PnPA)、乙酸乙酯(EtA)、乙酸丁酯(BA)和乙酸乙基苯酚酯(EPA)。用于本發(fā)明的適合的水解酶選自脂肪酶、酯酶、?；D移酶和蛋白酶組成的集合，優(yōu)選的水解酶是脂肪酶和酯酶，最優(yōu)選的水解酶是脂肪酶；并且特別優(yōu)選的脂肪酶選自Candida antarctica脂肪酶部分B、脂肪酶LP‘S’、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶和假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶組成的集合，最優(yōu)選的脂肪酶是Candida antarctica脂肪酶部分B。適合的去烷氧基化催化劑的非限制性實例為對-甲苯磺酸(p-TSA)、DOWEX DR-2030離子交換樹脂、DOWEX MSC-1H+離子交換樹脂、酸性粘土、Nafion H+催化劑，以及無機酸如，硫酸。DOWEX是DowChemical Company的商標，Nafion是DuPont的商標。去烷氧基化步驟在從約40℃到約130℃的溫度下，優(yōu)選從約80℃到約100℃下，便于進行。
上述外消旋混合物的常規(guī)動態(tài)拆分存在的缺點是任一種對映體產(chǎn)物的理論最大產(chǎn)率僅為50％。通過動力學的動態(tài)拆分可以實現(xiàn)外消旋基質中存在的單一對映體的完全轉化。這種方法將脂肪酶催化的?；c釕催化的基質外消旋化相結合以便形成高產(chǎn)率和高光純度的產(chǎn)物。在動力學的動態(tài)拆分中，未反應的基質對映體(對映體未與脂肪酶反應或僅緩慢反應)被連續(xù)的外消旋化，并且產(chǎn)物可以是理論上能得到100％產(chǎn)率的光學純形式的產(chǎn)物。這種方法的實例已經(jīng)對下列化合物進行了說明如仲醇(Larsson，A.L.E.et al.1997.Angew.Chem.，Int EdEngl.361211-1212；Kim，M.-J.et al.2001.J.Org.Chem.，664736-4738)，二醇(Pearson，B.A.et al.1999.J.Org.Chem.，645237-5249)，和α-羥基酸酯(Huerta，F(xiàn).F et al.2000.Org.Lett.21037-1040)。實際上，約6％(w/v)1-苯氧基-2-丙醇經(jīng)釕-和酶-催化的動力學動態(tài)拆分已用乙酸4-氯苯酚酯作為?；o體(Persson et al.1999.J.Am.Chem.Soc.1211645-1650)通過CAL-B進行說明；據(jù)報道R-1-苯氧基-2-丙醇作為產(chǎn)物的產(chǎn)率為88％且％ee純度＞99％。將這種方法應用到基于丙二醇烷基(或芳基)醚拆分的酯化轉移可以提高所需?；中援a(chǎn)物或從中產(chǎn)生的原料的產(chǎn)率。


圖1表示了一批丙二醇烷基(或芳基)醚以及它們相應的乙酸酯。
圖2表示了GC/FID分析的(S)-PMA在反應混合物中的拆分量，反應混合物含有CAL-B(1.0mg/ml Chirazyme L-2 lyo.)以及在水溶液介質(磷酸鈉緩沖液，pH＝7.2)中的25％(v/v)PMA。保留時間為外消旋物PM，2.81分鐘；PMA-S，4.10分鐘；PMA-R，4.24分鐘。
圖3表示(S)-PMA的拆分量與CAL-B酶濃度之間的關系。水相反應混合物含有25％(v/v)的PMA和0.1mg/ml(實心方塊)、0.5mg/ml(實心圓圈)、1.0mg/ml(空心方塊)、及2.0mg/ml(空心圓圈)的Chirazyme L-2 lyo.。
圖4表示所測定的(a)(±)-1-甲氧基-2-丙醇(PM)和(b)(±)-1-苯氧基-2-丙醇(PPh)的酯化轉移量與Chirazyme L-2，c.-f.，C2用量之間的關系。在含有PM/VA(75∶25，％v/v)及PPh/VA(80∶20，％v/v)的比例的反應混合物中，確定了(R)-PM和(R)-PPh的對映體多余量(％ee)及轉化率％，這個比例將理論轉化率分別限制在35％和45％。符號圖例的數(shù)字提供了Chirazyme L-2，c.-f.，C2在反應中的濃度，單位mg/ml。
圖5表示在含有CAL-B(1mg/ml)的反應混合物中，70％(v/v)PPh與30％(v/v)乙酸乙烯酯的對映體選擇性?；?。
圖6表示對PEA水解的酶循環(huán)再使用。顯示了對于三種不同濃度的CAL-B酶，PEA的拆分量(以％ee表示)與酶循環(huán)再用之間的關系；循環(huán)間隔是24小時，除了循環(huán)3(48小時)和循環(huán)8及循環(huán)13(60小時)。
圖7表示放大條件下酶循環(huán)再用于PEA的水解，顯示了PEA的拆分量(以％ee表示)與培養(yǎng)時間之間的關系，其中每一次循環(huán)在反應過程期間都通過取樣和分析樣品進行監(jiān)控；每次循環(huán)的間隔從約2小時變化到約9小時。反應混合物為1.5l，PEA的含量為20％(v/v)，并且酶、固定化CAL-B保留在反應器中，消耗了的反應混合物在一循環(huán)結束時從反應器中取出，加入新的反應混合物開始一個新的循環(huán)。在循環(huán)8，10，16，和25，反應緩慢時，加入新的酶(起始加量的10％)。
圖8表示放大條件下酶循環(huán)再用于PEA的水解，最多循環(huán)32次，顯示了(S)-PEA和(R)-PEA兩者的拆分量(以％ee表示)以及總的轉化率(以％表示)與循環(huán)次數(shù)之間的關系。反應混合物為1.5l，PEA的含量為20％(v/v)，并且酶、固定的CAL-B保留在反應器中，消耗了的或拆分了的反應混合物在一循環(huán)結束時從反應器中取出，加入新的反應混合物開始一個新的循環(huán)。每一次循環(huán)在反應過程期間都進行監(jiān)控(同圖7所示的反應)，并將最后的樣品用于計算拆分量和轉化率。
發(fā)明說明本發(fā)明涉及二醇醚和二醇醚乙酸酯的酶催化拆分工藝，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚及丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的酶催化拆分工藝。
本發(fā)明提供二醇醚和二醇醚乙酸酯的酶催化拆分工藝，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚及丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的酶催化拆分工藝。
示例的二醇醚乙酸酯具有下列化學結構分子式I其中，R選自烷基或芳基基團。上述分子式II中，以R表示的烷基或芳基基團的非限制性實例為CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。
示例的二醇醚具有下列化學結構 分子式II其中，R選自烷基或芳基基團。上述分子式II中，以R表示的烷基或芳基基團的非限制性實例為CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。
上述分子式I表示的丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯以及上述分子式II表示的丙二醇烷基(或芳基)醚的非限制性實例見圖1說明。
用于酶催化拆分外消旋丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的酶催化劑是可水解外消旋混合物中兩個對映體中的一個對映體上的乙酸酯的那些酶催化劑，并具有高度的對映體選擇性(例如，在一些實例中，對映體選擇性大于90％，并且在其他實例中，對映體選擇性大于95％，的剩余基質的對映體多余(ee))且外消旋混合物的轉化比例高，(例如，在一些實例中，轉化比例約為40％，并且在其他實例中，轉化比例約為50％)，這樣，剩余的丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯混合物被高度拆分(例如，在一些實例中，混合物含有大于約97.5％的S-異構體和少于2.5％的R-異構體；在其他實例中，混合物含有大于約97.5％的R-異構體和少于2.5％的S-異構體)。R-異構體的對映體選擇性水解可導致(S)-丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯被拆分，其優(yōu)點是(S)-二醇醚乙酸酯相對易于化學轉化成相應的(S)-二醇醚。
在手性化合物外消旋混合物的酶催化拆分中，相對于轉化率的ee和對映體選擇性(E)的計算已有說明(美國專利No.5,541,080)。
本發(fā)明開發(fā)期間，超過110種商業(yè)用的水解酶(脂肪酶、酯酶、酰基轉移酶和蛋白酶)已對它們催化測試用二醇烷基醚乙酸酯、(±)-PMA[乙酸(±)-1-甲氧基-2-丙醇酯]的外消旋混合物進行對映體選擇性水解的能力經(jīng)過了初始篩選，酶的篩選在水相反應條件、0.5％(v/v)PMA下進行。使用帶β-DEX 325柱子的手性毛細管氣相色譜來監(jiān)測乙酸酯基質的對映體組成和醇產(chǎn)物，1-甲氧基-2-丙醇(PM)的形成。一種在初始篩選期間顯示出高對映體選擇性的酶被選來用于隨后不同參數(shù)(如，高基質濃度，兩相條件，溫度等)下的性能檢測，以便于開發(fā)酶催化生物工藝。相同的酶也可以催化其他相關丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的對映體選擇性水解(見實施例5)。
基于超過110種商業(yè)用水解酶篩選的結果表明Candida antarctica脂肪酶類型B(CAL-B)催化PMA[乙酸(±)-1-甲氧基-2-丙醇酯]的(R)-對映體的對映體選擇性水解，引起這種二醇醚烷基乙酸酯(S)-對映體的拆分(見實施例3)。相同的酶，CAL-B，也可以在質子惰性溶劑或非水相條件下、存在酰基給體時，顯示出可催化PM的外消旋混合物的對映體選擇性酰基化(酯化轉移作用)，產(chǎn)生富余的對映體(R)-PMA和未反應的(S)-PM(見實施例6)。然后確定使用CAL-B或類似脂肪酶的一般條件以便在生物催化工藝中高產(chǎn)率、有效地拆分光活性的PMA或PM。兩種被拆開的光活性物種(二醇醚乙酸酯和二醇醚)可以回收并通過多種技術從反應混合物中分離，這些技術包括但不僅限于液-液萃取、熱活化分離、蒸餾、固相提取方法，液-固吸附、或這些方法的結合；在優(yōu)選的實例中，被拆開的光活性物種進行蒸餾。回收光活性二醇醚乙酸酯的化學水解或酯化轉移等方法很容易得到相應的純凈形式的手性二醇醚。
一組超過110種商業(yè)用的水解酶對其他相關二醇醚乙酸酯進行對映體選擇性的水解也經(jīng)過了篩選，示例的基質包括乙酸(±)1-乙氧基-2-丙醇酯(PEA)、乙酸(±)1-正-丙氧基-2-丙醇酯(PnPA)、乙酸(±)1-異丙氧基-2-丙醇酯(PiPA)、乙酸(±)1-正-丁氧基-2-丙醇酯(PnBA)、以及乙酸(±)1-苯氧基-2-丙醇酯(PPhA)(與PMA一起，這些基質都代表性的被稱作P-系列基質)。對于經(jīng)過篩選的P-系列基質，Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)是最具有對映體選擇性的酶(實例見表1-5)。其他的水解酶，包括假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶(PSL)、Candida antarctica脂肪酶A(CAL-A)和Candida rugosa脂肪酶(CRL)，也可以催化一些基質進行對映體選擇性的水解。
此外，脂肪酶CAL-B也用于以酯化轉移作用為基礎、在有機溶劑中、與各種?；o體(例如，包括但不僅限于乙酸乙酯和乙酸乙烯酯)進行的PE、PnP、PiP、PnB、PtB以及PPh的拆分。根據(jù)基質轉化的程度，相應二醇醚乙酸酯的(R)-對映體作為高光純度的產(chǎn)物生成，這也將引起剩余的未轉化(S)-對映體以高光純度存在。
因此，本發(fā)明提供兩種不同類型的基質，丙二醇烷基(或芳基)醚以及丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的酶催化拆分工藝。酶催化劑是水解酶、以及催化酶，優(yōu)選可逆的酯水解酶。因此，酶催化劑水解酶也可催化酯化轉移反應。在本發(fā)明的不同實例中，依據(jù)哪一種外消旋物是基質，并依據(jù)適當?shù)姆磻獥l件，酶可催化兩不同反應中的一個反應。
在一些實例中，被催化的反應是水解反應，在反應中丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯被水解成丙二醇烷基(或芳基)醚，釋放出乙酸酯基團成為乙酸。在該水解反應中，酶對映體選擇性地水解了其中一種異構體，這就導致該異構體的水解產(chǎn)物富余，以及另一種不能迅速轉化成產(chǎn)物的異構體基質也富余。因此，在特殊實例中，當酶是CAL-B且基質是丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的外消旋物時，本發(fā)明的工藝導致S-丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯形式的基質富余，R的形式主要被轉化成了產(chǎn)物，并且引起了R-丙二醇烷基(或芳基)醚形式的產(chǎn)物富余，因為S的形式不能迅速轉化成產(chǎn)物。因此，在這些實例中，水解反應結束時，兩種主要的對映體是S-丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯和R-丙二醇烷基(或芳基)醚。
在其他實例中，被催化的反應是酯化轉移反應，在反應中丙二醇烷基(或芳基)醚用?；鶊F酯化。在酯化轉移反應中，酶也可對映體選擇性地使一種異構體?；?，這就導致該異構體的酰基化產(chǎn)物富余，以及另一種不能迅速轉化成產(chǎn)物的基質中的異構體也富余。在特殊實例中，當酶是CAL-B且基質是丙二醇烷基(或芳基)醚和酰基給體的外消旋物時，本發(fā)明的工藝導致基質中S-丙二醇烷基(或芳基)醚形式的富余，R的形式主要被轉化成了產(chǎn)物，并且引起R-?；纪榛?或芳基)醚形式的產(chǎn)物富余，因為S的形式不能迅速轉化成產(chǎn)物。因此，酯化轉移反應結束時，兩種主要的對映體是S-丙二醇烷基(或芳基)醚和R-?；纪榛?或芳基)醚。
因此，在一些實例中，本發(fā)明提供丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋混合物的拆分工藝，該工藝包括在丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋物的反應混合物中與一有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此外消旋物的一種異構體被對映體選擇性地水解成相應的丙二醇烷基(或芳基)醚。在一些實例中，酶催化劑是脂肪酶Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)。有關本發(fā)明工藝中丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋混合物通過酶催化水解拆分的特殊和優(yōu)選實例的其他信息在下文提供。
在其他實例中，本發(fā)明提供丙二醇烷基(或芳基)醚外消旋混合物的拆分工藝，包括在丙二醇烷基(或芳基)醚和?；o體的外消旋物反應混合物中與一有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此外消旋物的一種異構體被對映體選擇性地酯化成相應的丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯。一般使用詞語“?；o體”，因為?；o體可以被其他適合的反應化合物替換，導致其他酯的生成。作為非限制性的實例，乙烯丙酸酯存在時的酯化轉移導致丙酰酯的生成。在一些實例中，酶催化劑是脂肪酶Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)。有關本發(fā)明工藝中丙二醇烷基(或芳基)醚外消旋混合物通過酶催化酯化轉移拆分的特殊和優(yōu)選實例的其他信息在下文提供。
如上文所述和下文所述，在通過或是水解或是酯化轉移的方法拆分外消旋物時，反應或基質向產(chǎn)物的轉化可采用多種熟知的方法進行監(jiān)控，優(yōu)選的方法包括采用氣相色譜(GC)分析反應物和產(chǎn)物，其中幾種不同的方法見實施例說明(見實施例1)。產(chǎn)物的產(chǎn)率以基質轉化成產(chǎn)物的百分量表示，這種百分量一般以摩爾表示，盡管也可以以質量或體積表示。在一理想的外消旋混合物中，對于任何一種特殊的對映體，理論上的最大產(chǎn)率是50％(當以摩爾表示時)，這表示一種對映體全部轉化成產(chǎn)物，而另一種沒有轉化。然而，對于一些特殊的反應，理論最大產(chǎn)率是100％，即基質全部轉化成產(chǎn)物。反應中某一特定點處，產(chǎn)物的純度或殘留基質的純度以對映體的多余量或ee表示。ee表示產(chǎn)物或基質的對映體富余，并且理論最大值為100％。對于某一特殊對映體，優(yōu)化反應條件可獲得接近理論最大值的產(chǎn)率和ee，同時在有效和節(jié)省的基礎上影響基質轉化。優(yōu)化反應條件可達到50％轉化率并導致對映體純產(chǎn)物(大于99％ee)的生成，允許反應條件達到40-50％轉化率并且一種或另一種產(chǎn)物以高對映體純度拆分也是可取的。在一種或另一種對映體中富余但不是同手性的回收產(chǎn)物也可作為基質用于隨后的拆分以給出所需的對映體純度。
下列說明提供了本發(fā)明有關特殊和優(yōu)選實例的其他信息。
酶催化劑在本發(fā)明的一些實例中，提供了拆分丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋物的方法，用于拆分丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋物的酶催化劑是水解酶，該水解酶可對映體選擇性地水解外消旋物的一種異構體，優(yōu)選對映體選擇性的水解可產(chǎn)生高對映體純度的產(chǎn)物或起始原料。一般，高對映體純度的產(chǎn)物可以低于50％的基質向產(chǎn)物的轉化(或乙酸酯的水解)獲得，而高對映體純度的基質可以高于50％轉化獲得。優(yōu)選二醇醚產(chǎn)物的對映體純度大于約55％ee，更優(yōu)選大于約70％ee，進一步更優(yōu)選大于約80％ee或85％ee，最優(yōu)選大于約95％ee或98％ee。在優(yōu)選的實例中，酶催化劑可水解R-異構體的乙酸酯。
水解酶或是脂肪酶或是酯酶，脂肪酶和酯酶兩者都可催化酯的水解，特別是羧酸酯酶。示例的水解酶列于表1-5，包括但不僅限于Candida antarctica脂肪酶B、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶和酯酶。在一些優(yōu)選的實例中，水解酶是脂肪酶，它可優(yōu)先催化水溶性酯的水解。
在本發(fā)明的其他實例中，提供了拆分丙二醇烷基(或芳基)醚外消旋物的方法，用于拆分丙二醇烷基(或芳基)醚外消旋物的酶催化劑是水解酶，在?；o體的存在下，該水解酶可對映體選擇性地酯化轉移外消旋物的一種異構體，優(yōu)選對映體選擇性的酯化轉移可產(chǎn)生高對映體純度的產(chǎn)物或起始原料。一般，高對映體純度的產(chǎn)物可以低于50％的基質向產(chǎn)物的轉化(或二醇醚的酯化)獲得，而高對映體純度的基質可以高于50％的轉化時獲得。優(yōu)選二醇醚?；a(chǎn)物的對映體純度大于約55％ee，更優(yōu)選大于約70％ee，進一步更優(yōu)選大于約80％ee或85％ee，最優(yōu)選大于約95％ee或98％ee。在優(yōu)選的實例中，酶催化劑可酯化轉移R-異構體的醚。
水解酶或是脂肪酶或是酯酶，脂肪酶和酯酶兩者都可催化酯的水解，特別是羧酸酯酶。示例的水解酶列于表1-5，包括但不僅限于Candida antarctica脂肪酶B、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas cepacia脂肪酶和酯酶。在一些優(yōu)選的實例中，水解酶是脂肪酶，它可優(yōu)先催化非水溶性酯的水解。
在本發(fā)明的不同實例中并無必要都使用相同的酶，因此，一種酶可通過對映體選擇性水解用于拆分二醇醚乙酸酯的外消旋物，而不同的酶可通過對映體選擇性酯化轉移用于拆分二醇醚的外消旋物。在本發(fā)明的一些實例中，酶催化劑是脂肪酶Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)。在本發(fā)明的不同實例中，這種酶用于水解和酯化轉移兩種反應。
Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)可以按照公開的步驟(Patkarat al.(1993)Ind J.Chem.，Sect.B 32B76-80)從Candida antarctica細胞中分離出或者可從商業(yè)途徑得到(如，NOVO Nordisk的SP 525；RocheMolecular Biochemicals的CHIRAZYME.RTM.L-2)并不經(jīng)任何處理即可用作催化劑。也可將CAL-B固定在聚合物基質上，在一可溶性或非溶性的有機支撐體上(如NOVO Nordisk的NOVOZYM.RTM.435；Roche的Chirazyme L-2，c.-f.，lyo，(載體1)；Roche的Chirazyme L-2，c.f.，C2，(載體2))，或者在一非溶性的無機載體上，這樣的無機支撐體可簡化催化劑的回收再用。這些固定方法已被廣泛報道并為本領域的技術人員所熟知，也可以使用膜分離方法將可溶性酶從反應化合物中分離出。
基質活性和對映體特性與CAL-B相似的脂肪酶也可以在本發(fā)明中使用，一般包括改性的CAL-B。在其他的實例中，酶催化劑從基因工程全細胞轉化株中獲得，該轉化株表達了CAL-B或其他適合的脂肪酶或酯酶，或者采用本領域技術人員熟知的方法從這樣轉化株中獲得的制劑中得到。
水解拆分拆分二醇醚，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯外消旋物的水解反應的不同參數(shù)，可以進行評價并優(yōu)化(見實施例3-5)。水解反應發(fā)生在反應混合物中，反應混合物是酶催化劑和外消旋基質的混和物，其中酶可催化對映體選擇性的水解反應，將基質轉化成產(chǎn)物?？梢猿霈F(xiàn)多種基質或多種產(chǎn)物，其他的組分也可以出現(xiàn)在反應混合物中。依據(jù)不同反應參數(shù)的相對重要性來優(yōu)化反應條件，以及反應期間獲得的不同參數(shù)的期望值。不同參數(shù)的非限制性實例包括哪一種對映體需要拆開，以及需要達到多少產(chǎn)率和多高純度、多少外消旋物需要拆開或需要多少拆開的外消旋物、所需的反應時間、需要加入的酶催化劑的量。因此，在一些實例中，PMA外消旋物對映體選擇性水解的優(yōu)化或接近優(yōu)化的條件用于實現(xiàn)高基質加量，這樣的加量在使用低濃度酶時可產(chǎn)生高純度的拆分對映體，“基質加量”意指反應混合物中包含基質的初始量或濃度。一般，轉化率為約30％到約50％，水解產(chǎn)物的對映體純度至少約為70％ee，優(yōu)選至少約為80％ee，更優(yōu)選至少約為90％ee，進一步更優(yōu)選至少約為95％ee。理想的狀況是，其中CAL-B顯示高選擇性，所需的條件允許拆開的基質和產(chǎn)物達到50％的產(chǎn)率和＞99％ee。通常，基質的對映體純度也很高，但是一般不如產(chǎn)物的對映體純度高；一般在轉化率高于50％時可獲得較高的基質對映體純度。注意在本發(fā)明的反應條件下，水解是一個不可逆的反應，即，在占主導優(yōu)勢的水相反應條件下(即使是在水約大于10％的條件下)，水解產(chǎn)物也不會進行酯化轉移反應，殘留的丙二醇烷基(或芳基)二醇乙酸酯(未轉化的基質)不能夠用作水解二醇醚產(chǎn)物的?；o體。
在一些實例中，通過水解反應拆開的外消旋物是二醇醚乙酸酯，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯，示例的二醇醚已在上述分子式I中說明，丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯的非限制性實例見圖1說明。在其他實例中，拆開的外消旋物是二醇醚丁酸酯，特別是丙二醇烷基(或芳基)丁酸酯，以及二醇醚丙酸酯，特別是丙二醇烷基(或芳基)丙酸酯。
在不同的實例中，基質外消旋物的濃度可從約0.5％變化到約50％v/v，優(yōu)選基質的濃度大于10％v/v。任一特殊?；纪榛?或芳基)醚(如，PGAEA)的最有效濃度都會根據(jù)反應混合物的其他條件、以及根據(jù)反應結束時所需的最終轉化率和產(chǎn)物或剩余基質的純度而變化。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)下列濃度(以％v/v表示)是有效的PMA，為約25％到約40％，在水相反應中優(yōu)選約為25％，在兩相反應中約為10％；PEA，約0.5％到約50％，在水相反應中優(yōu)選約20％到約25％；PPhA，約15％到約50％，在水相反應中優(yōu)選約10％到約25％；PnPA，PiPA，PnBA，約0.5％到約50％，在水相反應中優(yōu)選約10％到約25％。
選擇反應混合物中酶催化劑制劑(或者固定，或者不固定)的量(mg/ml)以獲得所需的反應速率，酶催化劑制劑的量依賴于酶催化劑制劑的特定活性。在一些實例中，本發(fā)明水解反應中，不固定CAL-B(為粗酶制劑，未純化的蛋白質)的量可從約為0.001mg/ml變化到約為5mg/ml，但是一般從每ml總反應體積中含約0.5mg的CAL-B到約2mg的CAL-B，并且最優(yōu)選是從每ml總反應體積中含約1mg的CAL-B到約2mg的CAL-B。
在其他實例中，本發(fā)明水解反應中不固定CAL-B(為粗酶制劑，未純化的蛋白質)的量可從每ml反應混合物中含約0.1mg的CAL-B變化到約1g的CAL-B，一般從每ml反應混合物中含約0.5mg的CAL-B變化到約0.5g的CAL-B，優(yōu)選每ml反應混合物含1mg的CAL-B到200mg的CAL-B。在固定CAL-B的情形中，通過在反應容器內(如擰有蓋子的反應瓶或反應器)向反應混合物中加入酶可實現(xiàn)拆分；也可以通過將含有外消旋基質的反應混合物流過一含有固定酶的柱子來實現(xiàn)拆分；或者使用允許反應混合物擴散的膜反應器，該反應混合物中保留有酶。固定酶可以循環(huán)使用，用于多次反應，如下文進一步的說明。
在一些實例中，反應介質，或其中混和有酶催化劑和至少一種基質的溶液，是水相的；在其他實例中，反應介質是兩相的。水相反應介質，或兩相介質的水相組分，優(yōu)選經(jīng)過緩沖。通過加入pKa在約為所需反應混合物pH的一個pH單元內并且濃度足夠的適當緩沖液可以維持反應混合物的起始pH值。對于pH為5.0，6.0，和7.0的反應，可以分別使用乙酸鹽、檸檬酸鹽-磷酸鹽以及磷酸鹽緩沖液；緩沖液的選擇并不局限于這些示例。反應也可以不加緩沖液進行，反應過程中監(jiān)控反應混合物的pH并且加入酸或堿將反應混合物的pH維持在所需值上。緩沖液的濃度也可以變化，盡管一般緩沖液的濃度值為約25mM到約200mM。反應的pH可以從約為3變化到約為8.5，優(yōu)選pH為7。
兩相反應介質包含一水相(如上所述)和一溶劑，該溶劑在水相中不混溶并且額外地加入到基質中(基質本身是溶劑)。因此，兩相反應介質包含兩不混溶的溶劑，分成兩相。盡管沒有必要去理解反應混合物的潛在機理，且盡管本發(fā)明也無意于受到下列假設的限制，還是認為盡管水相初始就含有溶解的酶，酶在水相和含有機相的不混溶基質之間的界面處仍是活性的。在主要由有機溶劑組成的反應混合物中，反應也可以進行，在有機溶劑中加入水解反應和維持酶活性需要的至少最小量的水。此外，采用單一相的水相混合物，反應也可以進行，該水相混合物含有水以及與水相混溶的極性有機溶劑。
兩相反應可以使用不同的溶劑；實例包括但不僅限于己烷和甲苯。這些溶劑的濃度可以變化，例如，可從25％到65％(v/v)，優(yōu)選含有溶劑約40％到50％(v/v)。極性有機溶劑如甲醇、二氧雜環(huán)乙烷或丙酮也可以較低濃度(如，0.25％到10％v/v)加入以增強對映體選擇性。
優(yōu)選反應混合物是水相，水相混合物的一個優(yōu)點是宜于水解。
在多數(shù)實例中，選擇水解反應的溫度以優(yōu)化反應速率、酶催化劑活性的穩(wěn)定性、酶的對映體選擇性和基質的穩(wěn)定性。例如，在含有25％(v/v)PMA及1.0和0.5mg/ml CAL-B(Chirazyme L-2 lyo)的液體反應混合物中，在30℃和50℃之間(間隔5℃提高)考察培育溫度的影響。在這些條件下，PMA的水解在40℃下最快并且最終的對映體純度不受這一溫度的影響。然而，采用較低濃度的酶，在35℃下培育的反應顯示出長期的持續(xù)催化作用并導致(S)-PMA的對映體純度高于40℃下培育的反應的對映體純度，50℃下培育使酶在5小時內失去活性。假定所測得的速率與溫度誘導的基質溶解性差異無關，結果表明最適宜CAL-B的溫度是接近40℃，但是在水相反應混合物中，35℃時觀察到酶的穩(wěn)定性較高。因此，優(yōu)選溫度為約35℃到40℃，一般使用37℃的溫度。
在大多數(shù)實例中，反應混合物在攪拌下培育，意即完成這樣的攪拌包括旋轉搖動、機械攪拌、或者葉輪驅動攪拌。
在一給定的操作溫度下，反應速率依賴于反應中含有的脂肪酶的量。因此，反應時間依賴于所加脂肪酶的量。因此，例如，采用含有CAL-B(Chirazyme L-2 lyo，大于120U/mg lyo.)濃度為1.0，0.5，0.1，0.05，0.01，0.001mg/ml的反應混合物來確定50％己烷中、兩相條件下、10％(v/v)PMA有效對映體水解所需的最小活性單元。2小時后，含有酶用量為1.0和0.5mg/ml的反應已經(jīng)拆分了大于98％ee的PMA的(S)-對映體，接近理論產(chǎn)率。72h時，含有酶用量至少為0.01mg/ml的反應拆分(S)-PMA大于95％ee。然而，延長培育時間導致殘留(S)-PMA基質的進一步水解，這使(S)-PMA的產(chǎn)率，在反應中酶的含量為0.5和1.0mg/ml時，分別降低到接近25％和10％(根據(jù)最大理論值50％)。
在類似的實例中，水相反應混合物中含有25％(v/v)PMA時，考察對映體選擇性水解與酶的濃度之間的關系，結果表明CAL-B(Chirazyme L-2 lyo)濃度為2.0，1.0，和0.5mg/ml時，分別在4，6和24小時內(見實施例4)，導致(S)-PMA完全拆分至大于99％ee。作為對比，反應混合物中含有0.1mg/ml CAL-B(Chirazyme L-2 lyo)時，在30小時內，(S)-PMA被部分拆分(＜60％ee)。
因此，在大多數(shù)實例中，反應時間從約2小時變化到約72小時，但優(yōu)選從約4小時到約24小時；對于PMA，反應時間更優(yōu)選從約4小時到約6小時，而對于PEA，反應時間更優(yōu)選從約8小時到10小時。
在一些實例中，水解反應以單批間歇反應進行；在其他實例中，水解反應以連續(xù)工藝進行。
酯化轉移拆分拆分二醇醚，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚外消旋物的酯化轉移或?；磻牟煌瑓?shù)，可以進行評價并優(yōu)化(見實施例6-7和11)。酯化轉移反應發(fā)生在反應混合物中，反應混合物是酶催化劑和外消旋基質的混和物，其中酶可催化酯化轉移反應，將基質轉化成一酰基化產(chǎn)物；可以出現(xiàn)多種基質或多種產(chǎn)物，其他的組分也可以出現(xiàn)在反應混合物中。依據(jù)不同反應參數(shù)的相對重要性以及反應期間獲得的不同參數(shù)的期望值來優(yōu)化反應條件。不同參數(shù)的非限制性實例包括哪一種對映體需要拆開，以及需要達到多少產(chǎn)率和多高純度、多少外消旋物需要拆開或需要多少拆開的外消旋物、所需的反應時間、需要加入的酶催化劑的量。一般，產(chǎn)率為約30％到約50％，且一般?；a(chǎn)物的對映體純度約大于80％ee，更優(yōu)選約大于90％ee，進一步更優(yōu)選約大于95％ee。往往基質的對映體純度也很高，但是一般不如產(chǎn)物的對映體純度高；一般轉化率高于50％時可獲得較高的基質對映體純度。然而，產(chǎn)率和純度兩者都依賴于哪一種對映體被拆開，并依賴于反應條件，這應部分是由于生成產(chǎn)物的潛在水解或醇解。換言之，酯化轉移的產(chǎn)物，丙二醇烷基(或芳基)醚乙酸酯，可以通過水解酶酶催化劑被水解或去酯化成相應的丙二醇烷基(或芳基)醚，再次成為酯化轉移反應的基質(然而，可以通過基質的有效性加以限制)。因此，該可逆反應降低了殘留起始物料的對映體純度，由此降低了拆分的效率。產(chǎn)率和純度的相互影響下文中將進一步詳細說明。
選擇反應混合物中酶催化劑制劑(或者是不固定的，或者是固定的)的量(mg/ml)以獲得所需的反應速率，并且根據(jù)所需反應速率選擇酶催化劑制劑的量，酶催化劑制劑的量依賴于酶催化劑制劑的特定活性。在一些實例中，本發(fā)明酯化轉移反應中，不固定CAL-B(為粗酶制劑，未純化的蛋白質)的量可從約為0.001mg/ml到約為5mg/ml的范圍，但是一般從每ml總反應體積中含約0.5mg的CAL-B變化到約2mg的CAL-B，最優(yōu)選從每ml總反應體積中含約1mg到約2mg的CAL-B。實際上，調節(jié)酶的加量顯示出是一種通過反應工程提高產(chǎn)物光純度的有效方法。
在其他實例中，本發(fā)明酯化轉移反應中，固定CAL-B(為粗酶制劑，未純化的蛋白質)的量可從每ml反應混合物中含約0.1mg變化到約1g，并且一般從每ml反應混合物中含約1mg變化到約為0.5g固定CAL-B，優(yōu)選從每ml反應混合物中含約2.5mg到約200g的CAL-B。在固定CAL-B的情形中，通過以間歇方式進行的反應實現(xiàn)拆分，如通過在反應容器內(如擰有蓋子的反應瓶或反應器)向反應混合物中加入酶，或者通過使用膜來保留酶；也可以通過將含有外消旋基質的反應混合物流過一個含有固定酶的柱子，以連續(xù)的方式來實現(xiàn)拆分；采用間歇方式時，酶可以循環(huán)使用，如下文進一步的說明。
酯化轉移的反應介質優(yōu)選質子惰性溶劑，或非水相溶劑；因此，在不同的實例中，介質包括至少一種溶劑或離子液體，并優(yōu)選包括至少一種有機溶劑，有機溶劑優(yōu)選是非極性的，并且進一步更優(yōu)選是一種有機溶劑。這樣溶劑的實例包括但不僅限于甲苯和己烷，以及離子液體。溶劑的其他實例為基質丙二醇烷基(或芳基)醚，因為它們本身是有機溶劑，以及它們生成的產(chǎn)物，即相應的酰基化丙二醇烷基(或芳基)醚，它們也是有機溶劑。非-基質和非-產(chǎn)物的溶劑稱為共溶劑。作為非限制性的實例，離子液體包括1-乙基-3-甲基咪唑鎓(1-ethyl-3-methylimidazolium)(如，[EMIM]-[BF4])和1-丁基-3-甲基咪唑鎓(1-butyl-3-methylimidazolium)(如，[BMIM]-[PF4])，其中，BF4和PF4用作反離子，特別是陰離子組分。(Kim，K.-W.，et al.2001，Biocatalysis inionic liquidsmarkedly enhanced enantioselectivity of lipase(離子液體的生物催化作用脂肪酶對映體選擇性的顯著提高).Organic Letters，31507-1509)以及(Lau，R.M.，et al.2000，Organic Letters，24189)。
在其他實例中(見實施例9-11)，基于酶催化酯化轉移的拆分工藝中，將乙酸(±)-1-甲氧基-2-丙醇酯(PMA)作為?；o體用于對映體選擇性的?；Ｊ褂猛庀中远济炎鳛轷；o體可以將?；噭┮约安痖_的乙酸酯和醇或胺對映體基質同時分開。因此，除了酶催化拆開的基質外，?；o體的副產(chǎn)物也是拆開的手性二醇醚和二醇醚乙酸酯化合物。在基于拆分工藝的酶催化酯化轉移中，將PMA和其他非-活性PGAEA化合物作為?；o體用于對映體選擇性?；淖饔靡呀?jīng)通過以PMA作為非-活性?；o體的反應-提汽實驗得以顯示。
通過酯化轉移反應拆開的基質是二醇醚，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚和?；o體的外消旋混合物。示例的二醇醚乙酸酯見上述分子式I說明，丙二醇烷基(或芳基)醚的非限制性實例見圖1。酰基給體包括活性?；o體，如活性酯(包括但不僅限于丁酸三氟乙醇酯、S-乙基硫代辛酸酯，以及聯(lián)乙酰單肟乙酸酯)，烯醇酯(包括但不限于乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、以及乙酸1-乙氧基乙烯酯、及雙烯酮)，以及酐(乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐)。使用烯醇酯和酸酐作為?；o體可導致實際上?；豢赡?，這對醇的拆分特別有益，因為可逆反應導致殘留起始物料的對映體純度較低。在一些實例中，?；o體包括但不僅限于乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙酸2，2，2-三氯乙醇酯、乙酸2，2，2-三氟乙醇酯、乙酸丁酯、乙酸乙基苯酚酯、乙酸異丙烯酯、甲氧基乙酸乙酯、乙酸1-乙氧基乙烯醇酯、雙烯酮、丁酸三氟乙醇酯、乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐。初步的實驗已經(jīng)證明用所述的前兩種?；o體中，考察全部丙二醇烷基(或芳基)醚的轉化，用乙酸乙烯酯作酰基給體時，轉化是最快的。盡管沒有必要去理解實施本發(fā)明的機理，并且本發(fā)明也不受此潛在機制的限制，還是認為反應迅速是因為這些酯化試劑是烯醇酯，為此，產(chǎn)物醇互變異構成羰基化合物，由此驅動反應并通過醇解消除潛在的產(chǎn)物抑制作用。?；o體還包括非活性酰基給體，如乙酸乙酯和外消旋的手性化合物，例如，外消旋的1-甲氧基-2-丙醇乙酸酯(PMA)。其他非活性酰基給體的非限制性實例包括乙酸丁酯(BA)、乙酸乙基苯酚酯(EPA)、乙酸乙酯(EtA)和PnPA。在這種情形中，從反應混合物中去除副產(chǎn)物醇有利于驅動反應進行并提高試劑的轉化率。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除非副產(chǎn)物醇被去除，否則反應達到平衡使實質上向前和向后的反應速率相同，轉化率達到一有限值。
副產(chǎn)物的實例包括從乙酸乙酯生成的乙醇，以及一般類型的手性仲醇，手性仲醇從它們相應的手性乙酸酯生成。反應器可以在半-間歇操作模式下進行操作，包括定期從反應器中除去蒸汽以去除副產(chǎn)物醇。為補充蒸汽中除去的試劑，操作也可以包括定期加入試劑。本發(fā)明也可以連續(xù)進行，這包括從反應器中連續(xù)除去蒸汽和連續(xù)加入試劑。反應也可以與精餾塔結合進行，這包括向反應器中加進試劑以提高轉化率，然后送往精餾塔以除去副產(chǎn)物醇并將貧醇試劑蒸汽返回反應器。這種反應與蒸汽去除或精餾的結合使副產(chǎn)物醇從反應混合物中汽提出來以驅動反應，使轉化率達到較高的水平，高于沒有去除副產(chǎn)物醇所可能達到的轉化率水平。
可以將非反應性汽提試劑加到反應混合物中以便去除副產(chǎn)物醇，例如，使用汽提試劑如氮氣或正-己烷，通過在反應混合物的沸點以下溫度處、在給定操作壓力下去除蒸汽，對總體工藝有利。使用汽提試劑是否有利以及最適合的汽提試劑的選擇依賴于反應混合物的組成、副產(chǎn)物醇的揮發(fā)性、以及由于催化劑的熱敏感性而在操作溫度和壓力上的任何限制或關于操作的工藝設備在壓力上有多低的實際限制。一般使用的便于輕組分從液體進料中除去的汽提試劑在本領域為人熟知。
在不同的實例中，基質外消旋物的濃度可以從約0.5％變化到約大于85％，v/v；優(yōu)選基質的濃度約大于5％，最優(yōu)選基質的濃度盡可能高，同時還存在有足量的、獲得所需轉化程度所要求的酰基給體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)反應介質可以是約100％(v/v)的基質，包括酰基接受體(例如，丙二醇烷基(或芳基)醚)和?；o體；相信這是因為這些基質本身是有機溶劑，以及因為優(yōu)選反應介質是質子惰性的或非質子的。例如，?；邮荏w(丙二醇醚烷基(或芳基)醚)的濃度可以從約30％(v/v)到約70％(v/v)之間變化，殘留體積約為總反應混合物體積的100％(或約70％(v/v)到約30％(v/v))，總反應混合物包含?；o體(例如，乙酸乙烯酯)。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種進行酯化轉移反應的新方法，這種方法具有幾個優(yōu)點，一是反應可以在非常高的基質濃度下發(fā)生，并且產(chǎn)生的產(chǎn)物的濃度也非常高。另一點是拆開的對映體(產(chǎn)物和基質)無需萃取，因為它們本身是有機溶劑；因此，按照固定生物催化劑從反應混合物中分離的方法，將拆開的對映體從殘留的反應混合物(或反應基質)中直接蒸餾分離，導致拆開的對映體更快速的回收，也因此更有效和廉價。
反應混合物中水的存在(例如，約1％(v/v)到約3％(v/v)加到混合物中)似乎降低了反應速率。然而，水的影響可以是控制反應程度的一種有效途徑。另一方面，反應混合物中水的存在似乎影響相互競爭的酶催化反應、?；a(chǎn)物水解反應的活性。因此，反應混合物中沒有水似乎大大降低了酰基化產(chǎn)物水解的可能性。盡管相信對于脂肪酶發(fā)揮功能需要水，多數(shù)商業(yè)用有機溶劑或多數(shù)商業(yè)用酶的制劑似乎是足量存在的，以至于通常沒有必要向反應混合物中加入水。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過在僅有基質溶劑的反應介質中進行酯化轉移反應，并通過控制反應中的兩種基質，酰基接受體或PGAE和?；o體的比例，就有可能控制產(chǎn)物的產(chǎn)率和拆開的對映體純度。因此，本發(fā)明也提供一種方法，即在僅有基質溶劑的反應介質中，通過控制酶催化的酯化轉移反應，并通過控制反應中的兩種基質，酰基接受體或PGAE和?；o體的比例，來控制產(chǎn)物的產(chǎn)率和拆開的對映體純度。目的是要具有盡可能高的起始?；邮荏w(如，PGAE)濃度，而酰基給體(如，乙酸乙烯酯)的濃度不受限制，滿足這一目的將可導致獲得可能最大量的拆分?；a(chǎn)物或殘留基質。這種控制依據(jù)下列假設，因為基質是一種外消旋混合物，每個對映體轉化成它的相應產(chǎn)物(?；腜GAE)的理論最大轉化率為50％。然而，相信催化水解酶(優(yōu)選脂肪酶或酯酶)可使基質的兩種對映體都酰基化，盡管它可優(yōu)先?；环N對映體(即，它可對映體選擇性地?；环N對映體，例如，CAL-B對映體選擇性地酰基化R-異構體)。因此，在總基質轉化率為50％時，至少產(chǎn)物的一少部分是另一種異構體，這可導致第一種異構體產(chǎn)物的純度降低。因此，在稍低的基質轉化率處(稍低于50％，如，約為45％)，生成的第二種異構體少，導致第一種異構體產(chǎn)物的純度較高，但依然以高產(chǎn)率生成。相反，總基質轉化率為50％時，少量但可能是很大部分的第一種異構體基質沒有轉化。因此，在稍高基質轉化率處(稍高于50％，如，約為55％)，殘留較少的第一種異構體基質，導致第二種基質的純度較高，但依然出現(xiàn)高產(chǎn)率。因此，在本發(fā)明的一些實例中，可以通過兩種基質，酰基接受體(外消旋基質)和?；o體的比例來控制外消旋基質的轉化程度。因此，?；邮荏w(如，PGAE)和?；o體(如，乙酸乙烯酯)的摩爾比為2∶1從理論上可以導致總基質的轉化率約為50％；選擇?；邮荏w和?；o體的摩爾比使一摩爾的?；o體選擇性地與二摩爾的?；邮荏w反應，或僅與約外消旋基質的一半反應。通過改變該比值，控制基質的轉化程度是可能的，因此，可使第一種異構體產(chǎn)物富余或者使第二種異構體基質殘留富余以得到高產(chǎn)率、高純度。例如，基質轉化率為約35％到約65％時，可以獲得所需外消旋物(產(chǎn)物或是殘留基質)的純度大于90％ee。
通過使用基質(二醇醚和?；o體)的分子量和密度，可以計算獲得不同摩爾比所需的體積，計算摩爾比以獲得所需的轉化程度(最優(yōu)產(chǎn)率)和對映體純度，假定完全選擇性的酯化轉移；這些最優(yōu)產(chǎn)率和理論對映體純度是預期值。然后在標準反應條件(如下另述)下，將計算量體積的基質與酶催化劑混和，監(jiān)控基質的轉化程度和第一種異構體產(chǎn)物或殘留第二種異構體基質的相對純度。實驗或實際觀察到的產(chǎn)率和純度有時與預期值不同，例如，存在CAL-B時，PPh與乙酸乙烯酯反應，期望70/30(v/v)的比例可導致基質的轉化率約為75％；然而，一般實際觀察到轉化率接近45％，(S)-PPh和(R)-PPhA的純度分別為約80％ee和大于約98.5％ee。將基質比例改變?yōu)?6/24(v/v)，期望可導致基質的轉化率約為55％；然而，一般實際觀察到轉化率接近40％，(R)-PPhA的純度大于約98％ee，(S)-PPh的純度約為60％ee?？傊景l(fā)明提供一有效的方法，通過限制酰基給體的量來控制基質轉化的程度以產(chǎn)生所需高％ee的產(chǎn)物。
因此，在一些實例中，一種控制基質轉化率的方法是通過手性GC或HPLC分析評定(實例見實施例說明)，首先確定轉化(或?；?基質的最優(yōu)產(chǎn)率和轉化或未轉化基質的對映體純度，然后確定基質的適當摩爾比以得到這些產(chǎn)率(例如，提供酰基給體的量可限制轉化率為45％或55％)，然后根據(jù)基質的分子量和密度計算基質的體積以得到這一摩爾比，然后結合計算的基質體積與酶催化劑，并在標準反應條件下將所得反應混合物培育。監(jiān)控產(chǎn)物的產(chǎn)率和對映體純度，并且如果有必要，根據(jù)觀察到的產(chǎn)率和對映體純度調整基質的比例以獲得所需的轉化程度(產(chǎn)率)和最優(yōu)對映體純度。
因此，在不同實例中，基質的濃度可以從約10％變化到約90％(v/v)，其中?；邮荏w和酰基給體的百分含量加和約為總反應混合物的100％(v/v)。或者，在其他實例中，基質的濃度可以從約20％變化到約80％(v/v)，其中?；邮荏w和?；o體的百分含量加和約少于100％(v/v)；在這種情形中，剩余的體積由有機溶劑補充。
選擇酯化轉移反應的溫度以使反應速率、對映體選擇性、酶催化劑的穩(wěn)定性、以及基質的穩(wěn)定性最優(yōu)化。例如，降低反應溫度導致脂肪酶CAL-B對于PM酯化轉移拆分的對映體選擇性提高。因此，盡管拆分速率降低，降低反應溫度仍然是提高產(chǎn)物光純度的一種有效途徑。在-20℃到30℃的溫度下，這種影響得以證明。因此，在不同實例中，優(yōu)選的溫度將依賴于特定的基質；對于PPh的酯化，優(yōu)選的反應溫度約為20℃到30℃，一般采用的溫度約為25℃。
反應在攪拌下進行；意指完成這樣的攪拌包括旋轉搖動或葉輪驅動攪拌。
反應速率依賴于反應中包含的脂肪酶的量。因此，反應時間依賴于所加脂肪酶的量。對于酯化轉移反應，反應時間從約2小時變化到約96小時，但是優(yōu)選從約4小時到約72小時，并且更優(yōu)選從約4小時到約48小時。
酯化轉移反應可以單批間歇反應進行，或以連續(xù)工藝進行。例如，可以使用帶膜的反應器以有效保留固定酶。
上述酯化轉移反應用于二醇醚拆分具有幾個優(yōu)點，一是用脂肪酶催化?；?，長鏈烷基和芳基取代二醇醚以及它們的乙酸酯限制了水解拆分條件下水相的溶解性。此外，在有機溶劑/基質中基于脂肪酶的?；磻稍诜浅８叩幕|用量下進行，給出高體積生產(chǎn)率并在蒸餾和產(chǎn)物分離之前省去了反應物料萃取的必要。
生物催化劑的回收水解和酯化轉移反應兩者使用的酶催化劑都可以回收；這意味著酶可以從混合物中回收，混合物中催化反應已完全并可以向其中加入新鮮的反應混合物。酶的回收和再用稱為酶的循環(huán)；因此，循環(huán)將進行生物催化劑從反應物、產(chǎn)物、以及反應混合物的其他組分中分離。酶的循環(huán)具有幾個優(yōu)點，包括降低每一循環(huán)的反應成本。
可以通過過濾水相反應混合物實現(xiàn)酶的循環(huán)，由此被過濾器截留?；蛘?，或此外，循環(huán)優(yōu)選使用固定酶。固定酶可以通過多種方法從反應混合物中分離，這些方法包括但不僅限于離心分離、過濾、或通過重力沉積將其保留在反應器中，如沉降、將殘留反應混合物從反應器中排放出，然后加入新的反應基質(它是并不含有任何酶催化劑的反應混合物)。
例如，固定形式的CAL-B，Chirazyme L-2 c.-f.C2 lyo.(Roche)，在基質用量最多為25％時，能夠將每一種丙二醇醚乙酸酯基質拆開。固定的CAL-B也可以用于考察PPhA的對映體選擇性水解。PPhA的對映體選擇性水解很出色，PPhA的加量為25％(v/v)時，可導致(S)-PPhA和(R)-PPh的拆分得到大于99％ee和接近50％的基質轉化率?；|加量最多為50％時，表現(xiàn)出24小時內拆分可得到45％的基質轉化率以及(R)-PPh的純度大于99％ee且(S)-PPhA的純度為77％ee。然而，在基質用量為25％(v/v)PPhA的多次循環(huán)拆分中，固定的CAL-B可催化(S)-PPhA和(R)-PPh兩者的有效拆分。
在另一實例中，對實驗規(guī)模的PEA水解，基質用量為20％(v/v)時，考察Chirazyme L-2 c.-f.C2(酶的用量為30、60和120U/ml)的性能；表明了酶的循環(huán)再用超過15次循環(huán)(見實施例8和圖6)。酶的用量為120U/ml時，經(jīng)過多次循環(huán)的拆分性能最好。使用Roche的固定CAL-B(Chirazyme L-2 c.-f.C2 lyo.)，濃度為26.6mg/ml，也表明了酶可循環(huán)再用于30批次(或循環(huán)次)25％PMA的水解。以20％或25％的基質濃度進行實驗，經(jīng)過30次反應循環(huán)，(S)-PMA的對映體純度大約97％ee。
在放大實驗中，將固定CAL-B(Chirazyme L-2 c.-f.C2；大約240U/ml)用于1.5升規(guī)模、25％PMA的對映體選擇性水解，循環(huán)再用15次，循環(huán)時間從2.5小時變化到6小時。反應參數(shù)包括反應溫度為37℃，攪拌(葉輪速度)200rpm，通過加入20％(w/v)氫氧化鈉維持pH約為7。在其他放大實驗中，將固定CAL-B(Chirazyme L-2 c.-f.C2；接近240U/ml)用于以20％(v/v)PEA為基質的對映體選擇性水解，循環(huán)超過30次(見實施例8和圖7和9)。約8小時的循環(huán)時間使(S)-PEA和(R)-PE以高對映體純度拆分，在循環(huán)8、10、16、和25時加入額外的酶(～10％的初始加量)以保持所需的反應循環(huán)時間。32次反應循環(huán)的平均產(chǎn)物純度為(S)-PEA的純度大于97.9％ee且(R)-PE的純度大于95％ee。反應參數(shù)與PMA的相同。這些實驗的產(chǎn)物回收在下文說明。
拆開對映體的回收兩種拆開的光活性物種(二醇醚乙酸酯和二醇醚)都可以回收并通過液-液萃取、熱-活化分離、蒸餾、液-固吸附方法、或這些方法的結合將其從反應基質中分離。
例如，在上述第一種放大實驗中，用二氯甲烷進行液-液萃取便于含(S)-PMA大于99％ee且(R)-PM約為85％ee的混合物回收。然而，手性的(R)-PM是水溶性的并已證實難于通過液體反應混合物的萃取而回收。
在另外的實例中，上述第二種放大實驗中，用二氯甲烷萃取反應混合物產(chǎn)生(S)-PEA和(R)-PE的混合物，純度分別為98％ee和95％ee。
在其他實例中，15批次PMA水解反應的物料和超過32批次PEA水解反應的物料經(jīng)蒸餾以分離出手性二醇醚和它們的相應對映體乙酸酯。
拆開對映體的效用本發(fā)明的方法提供拆開的對映體，這些對映體在醫(yī)藥(Hoff et al.(1996)四面體非對稱性(TetrahedronAsymmetry)73181-3186)和農(nóng)業(yè)(注釋同上)等行業(yè)具有廣泛應用。例如，拆開的化合物可望用于醫(yī)藥合成、合成化合物(combi-chem)、以及鐵電液晶應用領域中可能的合成纖維。它們也有可望通過與化學-酶催化工藝綜合以形成非對映的酯(而不是外消旋的酯)來提高生物拆分的選擇性。在其他應用中，它們有望提高酶在增強選擇性方面的性能。另一方面，預期這些拆開的化合物可提供價廉的極性手性溶劑，這樣的溶劑有益于作為基于“經(jīng)典拆分”結晶的溶劑或共溶劑，以及生物催化反應的共溶劑或酯化轉移的溶劑。此外，這些溶劑也可能有益于結晶誘導的動力學拆分(CIDR)。此外還預期這些化合物可用于手性物料共蒸餾時選擇性或部分選擇性的共沸蒸餾。在手性色譜中，拆開的化合物可望替代流動相中的簡單醇以提高現(xiàn)有的手性分離，或用作連接手性分離固體相的配合體。其他的用途可以是制備手性堿(醇鹽)，以及通過與TiCl4反應制備手性Lewis酸。后者或許可用于選擇性的氧化，如烯烴的廈普勒斯(Sharpless)環(huán)氧化以及硫化物向亞砜的氧化。
具體實施例方式
實施例為證明并進一步說明某些優(yōu)選的實例以及本發(fā)明的各個方面，提供下列實施例，這些實施例不能理解為限制本發(fā)明的范圍。
在下列實驗公開的內容中，下列縮寫適用于N(標準的)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；mol(摩爾數(shù))；mmol(毫摩爾數(shù))；μmol(微摩爾數(shù))；nmol(納摩爾數(shù))；pmol(皮摩爾數(shù))；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；U(酶活性的單位；一般以轉化基質的摩爾數(shù)表示)；℃(攝氏度)；％(百分比)；(v/v)(體積/體積)；％C(％轉化率)；ee(對映體多余量)；E(對映體選擇性)實施例1原料和分析方法基質使用P-系列的二醇醚和?；a(chǎn)物作為基質，這一系列包括“丙二醇甲醚”(也稱1-甲氧基-2-丙醇，PM)。
“丙二醇甲醚乙酸酯”(也稱乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯，PMA)。
“丙二醇乙醚”(1-乙氧基-2-丙醇，PE)。
“丙二醇乙醚乙酸酯”(乙酸1-乙氧基-2-丙醇酯，PEA)。
“丙二醇正-丙醚”(1-正-丙氧基-2-丙醇，PnP)。
“丙二醇正-丙醚乙酸酯”(乙酸1-正-丙氧基-2-丙醇酯，PnPA)。
“丙二醇異丙醚”(1-異丙氧基-2-丙醇，PiP)。
“丙二醇異丙醚乙酸酯”(乙酸1-異丙氧基-2-丙醇酯，PiPA)。
“丙二醇正-丁醚”(1-正-丁氧基-2-丙醇，PnB)。
“丙二醇正-丁醚乙酸酯”(乙酸1-正-丁氧基-2-丙醇酯，PnBA)。
“丙二醇叔-丁醚”(1-叔-丁氧基-2-丙醇，PtB)。
“丙二醇叔-丁醚乙酸酯”(乙酸1-叔-丁氧基-2-丙醇酯，PtBA)。
“丙二醇苯基醚”(1-苯氧基-2-丙醇，PPh)。
“丙二醇苯基醚乙酸酯”(乙酸1-苯氧基-2-丙醇酯，PPhA)。
酶從供應商處得到不同的脂肪酶、酯酶和蛋白酶，包括ChiroScreenTMEH kit，來自Altus Biologics Inc.(Cambridge，MA)；the ChirazymeLipases & Esterases Screening Set 2，戊二酰基?；D移酶和盤尼西林G酰胺酶，來自Roche Molecular Biochemicals(Mannheim，德國；US經(jīng)BioCatalytics Inc.，Pasadena 分銷，CA)；ThermoCatTMQuickScreemTMEsterase Kit，來自Thermogen Inc.(Lemont，IL)；Lipase Extension Lit和復合Candida antarctica脂肪酶類型B，來自Fluka BioChemika AG(Buchs，Switzerland)；工業(yè)酶樣品，來自Amano Pharmaceutical Co.(Nagoya，日本)，Novo Nordisk，和Genencor International(Rochester，NY)。按照制備廠商的推薦說明將各種酶都貯藏在4℃或-20℃下。
化學試劑和溶液乙腈，己烷(HPLC-級)，乙酸乙烯酯，磷酸鉀一元鹽(KH2PO4，99.0％min.)和磷酸鈉二元鹽(Na2HPO4，≥99.0％min.)，都來自FisherScientific。(S)-環(huán)氧丙烷，來自Chirex(批號T67893，Chirex定購號No.607)。配置Sorensen的磷酸鹽緩沖液，濃度為從29.6mole％KH2PO4和70.4mole％Na2HPO4xH2O，且調節(jié)pH為所需的7.2。
下列丙二醇烷基/芳基醚和它們的乙酸酯都來自Sigma-AldrichPM(99.5％)，PMA(99.5％)，PEA(95％)，PnP(99％)，PnB(99％)，PtB和PPh(93％，最多含有7％的二(丙二醇)苯基醚；DPPh)。PE，PiP，PiPA，PnPA，PnBA，PPhA以及二醇醚的對映體標準物(見下文的非對稱合成)由Dow Chemical Company制備。在5mg/ml ChirazymeL-10(Roche Molecular Biochemicals)的存在下，通過PtB與乙酸乙烯酯(1∶2摩爾比)反應制得PtBA對映體的非外消旋混合物。
非對稱對映體標準物在酶催化的反應中，為了確定外消旋物的哪一種對映體被水解或酯化轉移，有必要得到立體化學結構已知的標準物以便在各種分析方法中使用。使用這些標準物可以關聯(lián)GC保留時間與一種特定的已知化合物。為了這個目的，每個P-系列二醇醚及它們相應乙酸酯的每個成員的純對映體就可化學合成。
首先，合成(S)-PM和(S)-PMA(見實施例2)，并確定它們的GC洗脫時間；這兩種對映體的洗脫時間的相對順序通過比較(S)-PM和(S)-PMA的洗脫時間與相應外消旋物的洗脫時間而確定。在所采用的分析條件下，(S)-PMA先于(R)-PMA(分別為4.1和4.24分鐘)洗脫出，并且對于非-?；膶τ丑w，(S)-PM和(R)-PM，觀察到了相同的洗脫相對順序。這種不同對映體洗脫時間的相對順序類似的延伸到P-系列二醇醚及其相應的乙酸酯的其它成員，并用于該系列的酶催化反應中產(chǎn)品和剩余基質的分析。然后，還化學合成了其它P-系列二醇醚及它們相應乙酸酯的純(S)-對映體(包括(S)-PE和(S)-PEA，(S)-PnP和(S)-PnPA，(S)-PnB和(S)-PnBA，以及(S)-PPh和(S)-PPhA)，確認該相對洗脫順序是正確的(如下文說明)。GC分析的結果表明PE，PEA，PnP，PnPA，PnB，PnBA，PPh和PPhA的(S)-對映體對應于拆分的外消旋標準物中觀察到的相應1-烷氧基-2-丙醇(或乙酸1-烷氧基-2-丙醇酯)對映體的第一洗脫峰。
分析方法氣相色譜法分析使用Hewlett-Packard 6890氣相色譜儀，配有標準毛細管進口、火焰離子探測器(FID)，以及LEAP-CTC自動進樣器(100樣品盤)。采用五種GC方法分析含有不同P-系列基質的樣品，不同的GC方法采用相同的爐溫程序，但是含有針對具體的在篩選期間采用的基質的化合物校準和積分信息。簡言之，使用Supeclo的β-DEX 325手性毛細管柱子(30m×0.25mm ID 0.25μm膜厚)進行分離。程序設定柱子溫度對于PM和PMA為從70℃到120℃，升溫速度10℃/min，對于其它基質和產(chǎn)物，溫度到150℃。載氣為氦氣18.0psi(常壓)，進樣口和探測器的溫度分別為200℃和250℃。在乙腈或水中以200∶1稀釋的樣品(1.0μl)，以分流比25∶1注射進入。該方法使用Dow Chemical或Sigma-Aldrich的外消旋樣品校準，樣品濃度為從0.005到0.5％，并且對于所用化合物都顯示r2＞0.99。
在上述條件下，對于代表二醇醚產(chǎn)物主要組分的仲醇以及它們相應的乙酸酯，列出了化合物的保留時間。根據(jù)標準合成的(S)-對映體相對于拆分外消旋物的洗脫順序，評價了PE、PnP、PiP、PnB、PPh以及它們相應乙酸酯的絕對立構化學。在每一種情形中，仲醇及其乙酸酯的(S)-對映體先于相應的(R)-對映體洗脫出。在(±)-PM的情形中，未見到對映體的基線分離。在所述條件下，化合物的保留時間為(±)-PM(2.811min)，(S)-PMA(4.104min)，(R)-PMA(4.246min)，(S)-PE(3.203min)，(R)-PE(3.248min)，(S)-PEA(4.774min)，(R)-PEA(4.936min)，(S)-PnP(4.157min)，(R)-PnP(4.224min)，(S)-PnPA(6.0min)，(R)-PnPA(6.145min)，(S)-PiP(3.629min)，(R)-PiP(3.718min)，(S)-PiPA(5.316min)，(R)-PiPA(5.448min)，(S)-PnB(5.394min)，(R)-PnB(5.484min)，(S)-PnBA(7.42min)，(R)-PnBA(7.545min)，(S)-PtB(5.559min)，(R)-PtB(5.908min)，(S)-PtBA(7.529min)以及(R)-PtBA(7.679min)。
(±)-PM對映體可以在Supelco的α-DEX 120手性毛細管柱子(30m×0.25mm ID 0.25μm膜厚)上色譜拆分，用氦氣作為載氣20.0psi(常壓)，程序設定爐溫從50℃到150℃，升溫速度10℃/min，進樣口和探測器的溫度分別為200℃和250℃。在乙腈或水中以200∶1稀釋的樣品(1.0μl)，以分流比25∶1注射進入。在這些條件下，拆分(S)-PM和(R)-PM，用時分別為3.316min和3.192min。
液相色譜法使用Perkin-Elmer Series 200液相色譜儀對含有DOWANOLPPh(1-苯氧基-2-丙醇；PPh)及其乙酸酯(PPhA)的樣品進行分析，該液相色譜儀配有四組LC泵、二極管陣列探測器(DAD)，Peltier柱式爐，以及Series 200的自動進樣器。各種化合物在Chiralcel OD-RH柱子(4.6×150mm；Chiral Technologies，Inc.，Exton，PA)上得以分離，使用恒溶劑洗脫以10/40/50混和的乙醇/乙腈/水作為流動相，流速為0.65ml/min，柱子溫度維持在35℃。在這些條件下，(R)-PPh，(S)-PPh，(R)-PPhA和(S)-PPhA的保留時間分別約為6.0min，7.3min，12.6min和13.1min。由于這種方法可使未完全被GC方法拆分的PPh對映體的基線分離，故該方法可用于PPh的ee測定。此外，PPh和PphA足以與少量的雜質分離，這些雜質推定為二(丙二醇)苯基醚(DPPh；商業(yè)制備的PPh中，含量最高為7％)及其乙酸酯DPPhA。
實施例2(S)-PM和(S)-PMA的非對稱合成(S)-1-甲氧基-2-丙醇[(S)-PM]給100ml的三頸圓底燒瓶配備冷卻水冷凝器、一溫度計套管、加熱套/溫度控制器、一磁力攪拌棒以及一橡膠隔膜。然后將此燒瓶轉移至放在一攪拌盤上的加熱套中，將氮氣墊放在反應裝置上通過冷凝器的頂部并在整個反應過程中保持。向燒瓶中加入甲醇(22.99g)，然后攪拌加入氫氧化鉀(0.0322g)并將溫度設定點調節(jié)為45℃。當溶液達到所需的溫度時，使用一注射器將預冷的(S)-環(huán)氧丙烷[(S)-PO；Chirex批號T67893，Chirex定購號No.607]通過橡膠隔膜以約5ml的增量加入到反應燒瓶中。共12.19g PO加入反應燒瓶中。GC分析(見下文分析方法)表明甲醇和PO轉化為所需丙二醇甲醚(PM二醇醚)的轉化率最低。另外加入0.0294gKOH并在50℃加熱反應瓶約15小時。取樣并進行GC分析，結果表明僅有0.007％的(S)-PO未反應。通過將內部溫度提高到150℃將PM二醇醚與催化劑和高沸點副產(chǎn)物閃蒸分離。在過熱溫度91℃到118℃時，PM二醇醚部分開始沸騰并收集到大約15ml的液體。閃蒸分離物料的GC分析表明含有95.4％的1-甲氧基-2-丙醇(PM-2)和3.2％的2-甲氧基-1-丙醇(PM-1)。
由于堿催化的(S)-PO水解反應在進行親核取代的碳上發(fā)生完全的構型反轉(Ege，1989)，生成PM-2的開環(huán)反應保持手性中心的構型并且產(chǎn)生的仲醇為(S)-構型的仲醇。作為對比，通過C2碳的取代生成少量的PM-1產(chǎn)物并且產(chǎn)生的伯醇為(R)-構型。
(S)-1-甲氧基-2-丙醇乙酸酯[(S)-PMA]
向一25ml的燒瓶中加入4.0g(0.044mole)的(S)-PM-2/(R)-PM-1混合物和0.02g無水氯化鋅。裝置上配有帶干燥管的回流冷凝器，快速抬起干燥管，加入4.7g(0.046mole)的乙酸酐，混合物在118℃下回流2小時后冷卻。1％水溶液的GC分析顯示了PMA-2的單峰，保留時間與觀察到的商用PMA-2對映體的第一個峰匹配，這些結果表明PMA-2的第一個峰是(S)對映體的峰。對于PMA-1對映體，也觀察到了單峰，這個峰也與PMA-1(商用混合物中的含量為～3％)的第一個峰匹配，表明該峰是(R)-2-甲氧基-1-丙醇乙酸酯的峰。這些結果表明(R)和(S)PMA-1對映體顯示出與觀察到的相應PMA-2對映體相反的洗脫順序。加入2.44g(0.024mole)無水碳酸鈉中和混合物，并攪拌約1小時，同時CO2析出。加上一短蒸餾頭，使用加熱槍作為熱源蒸餾反應產(chǎn)物，收集95-137℃范圍沸騰的物料約5.0g。GC分析表明樣品的純度約為95％(S-PMA-2的純度為92.6％，R-PMA-1的純度為2.7％)。
實施例3PMA的水解酶的篩選從超過110種的商用水解酶中篩選PMA對映體選擇性水解用的酶。
方法PMA對映體選擇性水解用商業(yè)酶的初步篩選，在0.2ml反應物中進行，該反應物含有0.5％(v/v)的基質(從10％的貯存水溶液中加入)以及濃度為1.0mg/ml的包含在0.065MKNaPO4(pH7.2)的Sorensen(索楞遜)磷酸鹽緩沖液中的酶。加入基質開始反應，并在1.8ml襯聚四氟乙烯帶螺帽的自動樣品器中、水平振蕩速度為300rpm、30℃的條件下培育(除非另行說明)，不含有酶的對比反應用于評價非生物轉化。加入0.8ml的乙腈終止反應，將所得溶液冷凍至少1小時，然后進行GC-FID分析(見下文)。
結果對初始基質分析，PMA，基于超過110種商用水解酶篩選的結果表明Candida antarctica脂肪酶類型B(CAL-B)可催化PMA的(R)-對映體[(R)-1-甲氧基-2丙醇乙酸酯；(R)-PMA]對映體選擇性水解，導致(S)-PMA的拆分，其純度大于99％ee(見表1；該表列出了可催化PMA對映體選擇性水解的酶)。在所提供的酶制劑如ChirazymeL-2，lyo.，(Roche)，Altus 13(Altus Biologics，Inc)，脂肪酶SP-435(NovoNordisk)，以及復合CAL-B(Fluka BioChemika)上觀察到了CAL-B的高對映體選擇性性能。采用Chirazyme L-2，lyo.，(Roche)進行本實施例中說明的關于CAL-B的其他研究。
篩選檢定中，顯示出類似的對映體選擇性，但通?？僧a(chǎn)生低對映體純度的其他酶包括假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶(Chirazyme L-6，lyo；Roche)，假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶(FlukaBioChemika)、脂肪酶PS-C1(Amano)，以及假單胞菌Pseudomonascepacia脂肪酶(Altus Biologics，Inc)(表1)。顯示與CAL-B相反對映體選擇性的酶包括酯酶E001，E002，和E003(Thermogen，Inc.)表1催化PMA(0.5％，v/v)對映體選擇性水解的商用水解酶的篩選結果總結


1結果由GC/FID分析確定并以％體積/體積(％v/v)報告，篩選檢定1∶5稀釋，含0.5％PMA和約1.0mg/ml的酶，如文中所述培育20小時。
實施例4水解優(yōu)化進行實驗以確定在實驗室規(guī)模和反應器規(guī)模(或放大實驗)下各種反應參數(shù)達到最優(yōu)化的反應條件，包括產(chǎn)率或轉化率(以水解基質的比例或量來量化)、異構體純度(以％ee確定)、基質加量(或濃度)、酶的加量、以及反應時間、溫度和介質。
方法一般在1.8ml襯聚四氟乙烯帶螺帽的自動樣品瓶中，用0.5ml的反應混合物評價基質水解的速率和拆分基質的對映體多余量。除非另行說明，反應混合物在水平旋轉振蕩(300rpm)下培育，一般在30℃下，用CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.，Candida antarctica脂肪酶類型B，大于120U/mg lyo)作為生物催化劑。將含有至少10％(v/v)基質的反應物取樣并用乙腈以1∶100稀釋后進行分析。進行一系列的研究以系統(tǒng)評價CAL-B作為酶催化劑用于P-系列二醇醚?；a(chǎn)物水解拆分的性能，并確定有效的酶催化拆分生物工藝條件，在獨立的篩選實驗中考察了下列條件
·不同溶劑的兩相反應混合物(兩相比率0.5)；·不同的兩相反應混合物中，基質濃度的提高；·水相反應混合物中，不同基質濃度下，產(chǎn)物濃度的提高；·水相和兩相反應中，緩沖能力的提高；·完全對映體選擇性水解的最大基質濃度；·兩相反應中，不同的酶濃度；·高的酶濃度和基質濃度下，終點轉化反應·水相反應中，不同的培育溫度。
結果甲苯和己烷的兩相反應在兩相反應條件下，采用較高的基質濃度和不同的共溶劑，考察通過酶催化劑CAL-B(Chirazyme L-2)催化的基質(PMA)的水解。在含10％(v/v)PMA的反應中，加入甲苯和己烷作為共溶劑，相態(tài)比率為0.5(50％v/v)。作為基質和溶劑的PMA為10％和50％(v/v)時，進行類似的反應來考察CAL-B(Chirazyme L-2)的性能。反應物在30℃下培育16小時，產(chǎn)物采用GC進行分析。
結果支持了下列結論作為基質和溶劑的PMA為50％(v/v)時，水解受到輕微抑制。50％(v/v)的甲苯適合作為共溶劑，但是拆分的(S)-PMA的最終產(chǎn)率較低(相信產(chǎn)率降低是由于對映體選擇性較低，或是由于催化較快導致殘留(S)-PMA水解的時間較長)。根據(jù)觀察到的(S)-PMA的高產(chǎn)率，大于99％ee，可知50％(v/v)的己烷是最好的共溶劑。水相反應中，10％(v/v)的PMA可有效水解并導致(S)-PMA以高產(chǎn)率拆分且純度大于99％ee。
己烷和甲苯兩相反應中，PMA濃度的提高在含己烷或甲苯作共溶劑的兩相反應中，考察提高基質濃度的影響。
以50％(v/v)的己烷作為共溶劑，將PMA的用量從10％提高到25％(v/v)，可導致最終(S)-PMA的對映體純度從大于99％ee降低到大于87％ee。含50％PMA的反應，己烷為25％和40％時，可導致最終(S)-PMA的純度分別為大于83％ee和大于66％ee。
以己烷和甲苯作共溶劑(從25％到65％，v/v)且水相濃度固定為25％v/v的反應中，通過測定10％到50％(v/v)PMA的水解，可確定基質的最高濃度，該濃度允許達到完全的對映體選擇而不產(chǎn)生抑制作用。反應終點的分析再次證實己烷是一種較好的共溶劑，并進一步表明以己烷作共溶劑、PMA為10％(v/v)時可導致(S)-PMA的拆分純度大于99％ee。同樣條件下，PMA為20％(v/v)時，(S)-PMA的對映體純度降低到93％ee。
水相反應中，PMA為10％&25％時，提高PM濃度的影響為了確定CAL-B是否可通過PM受到抑制作用，在水相條件下，提高PM的濃度，考察PMA的水解。
在含10％(v/v)PMA的反應中，所加PM最多為15％(v/v)時，水解程度不受影響；2小時內達到最大理論產(chǎn)率時，(S)-PMA的拆分達到大于99.5％ee的純度。然而，在含20％(v/v)PM的反應中，觀察到了輕微的抑制作用，(S)-PMA的對映體純度降至～96％ee。通過提高所加PM的濃度(0到25％)考察25％(v/v)PMA的水解，可進一步分析這一起始界限。在這些條件下，期望基質完全的對映體選擇性水解可釋放出約12.5％的PM，并且最終產(chǎn)物的加入確實會抑制轉化的程度并降低最終(S)-PMA的對映體純度。因此，這些結果表明優(yōu)選的基質濃度約為25％(v/v)。
這些反應的最終pH值從3.5變化到4.5，因此，除了最終產(chǎn)物醇的抑制作用，還考慮到由于乙酸的釋放(見下文)而產(chǎn)生的潛在的pH抑制作用。
根據(jù)上述結果，可以認為用于整體產(chǎn)品回收和去除的可選擇的方法可以使反應向更高基質濃度的方向進行(見，如，Indlekofer，M.et al.(1996)Biotechnology and Bioengineering，52459-471；and Indlekofer，M.et al.(1995)Biotechnology Progress，11436-442)。
緩沖液濃度的提高在含50％(v/v)PMA和1mg/ml CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)的水相和兩相(25％(v/v)己烷)反應中，考察緩沖液濃度提高的影響。
44小時的反應時間里，含0、66和200mM Sorensen磷酸鹽緩沖液(pH7.2)的反應對PMA水解的速率或程度沒有差別。18小時時，水相和兩相反應中達到了最終產(chǎn)物的對映體純度，分別為大于93％ee和大于84％ee。這些結果顯示基質水解過程中釋放出的乙酸不會抑制反應進程。最終反應物在水、66mM緩沖液和200mM緩沖液中的pH值范圍分別為3.0-3.5，4.0-4.5以及4.5。
水相和兩相反應中進行完全對映體選擇性水解的最大PMA濃度測定基質水解程度及其最終純度％ee與基質濃度之間的關系，以確定水相和兩相條件(正己烷的相態(tài)比率為0.2)下可導致完全對映體選擇性水解的最大PMA濃度。酶催化劑為CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)，濃度為1mg/ml。
在含PMA最多為25％(v/v)的水相反應中，64小時時，觀察到(S)-PMA完全拆分，純度大于99.5％ee。含30％(v/v)和40％(v/v)PMA的類似反應產(chǎn)生純度分別大于97.5％ee和大于95.5％ee的(S)-PMA。兩相反應條件下，己烷為20％(v/v)時，觀察到產(chǎn)物對映體純度較低；用量為20％(v/v)、25％(v/v)和40％(v/v)的PMA在64小時內拆分成(S)-PMA，純度分別大于98.5％ee、大于97％ee和92％ee。
這些結果表明在水相條件下，PMA可以最有效的水解，并且在所采用的實驗條件下(如圖2所示)25％(v/v)PMA的最大濃度進行完全的對映體選擇性水解。
水相和50％己烷兩相反應中，酶的濃度對PMA水解的影響在兩相條件下，己烷為50％(v/v)時，將含CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.，大于120U/mg)的濃度為1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.001mg/ml的反應用于確定所需的最小活性單元以實現(xiàn)10％(v/v)PMA的對映體選擇性水解。
2小時后，含酶用量為1.0和0.5mg/ml的反應已拆開了PMA的(S)-對映體，純度大于98％ee，產(chǎn)率接近理論值。72小時時，含酶用量≥0.01mg/ml的反應拆分了(S)-PMA，其純度大于99.5％ee。然而，在含酶為0.5和1.0mg/ml的反應中，延長培育時間可導致進一步的水解，使(S)-PMA的產(chǎn)率分別降低到接近25％和10％(根據(jù)最大理論產(chǎn)率為50％)。
在類似實驗中，含25％(v/v)PMA的水相反應中，考察酶的濃度對水解的影響，結果見圖3。結果表明CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)的濃度為2.0、1.0和0.5mg/ml時，分別在4、6和24小時內(圖3)可實現(xiàn)(S)-PMA的完全拆分，純度大于99％ee。作為對比，含0.1mg/mlCAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)的反應30小時內可部分拆開(S)-PMA(純度＜60％ee)。
高濃度酶和高濃度PMA對對映體選擇性的影響將含CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)濃度為2.0和5.0mg/ml以及PMA濃度為從25％(v/v)到50％(v/v)的反應用于評價酶的選擇性和基質的轉化程度。
含酶加量為2.0和5.0mg/ml的水相反應可在6小時內實現(xiàn)用量最多為40％(v/v)的PMA的拆分，導致(S)-PMA的純度大于95％ee，得到最大產(chǎn)率。培育30小時后，沒有觀察到(S)-PMA的純度％ee或產(chǎn)率有明顯降低，表明在所述條件下，CAL-B制劑可高對映體選擇性的水解(R)-PMA。
水相反應中溫度對PMA水解的影響在含PMA為25％(v/v)且CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)濃度為1.0和0.5mg/ml的水相反應中，在30℃和50℃之間(每5℃遞增)，考察培育溫度的影響。在這些條件下，PMA的水解在40℃最快，并且最終的對映體純度在此溫度下未受影響。然而，在35℃下培育的樣品，采用較少的酶用量在較長時間里顯示出持續(xù)的催化效果并且形成了較高的(S)-PMA的對映體純度，相比于40℃下培育的反應。在50℃下培育，酶在5小時內失去活性。
假設測定的水解速率與溫度引起的基質溶解性差異無關，結果表明CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)的最適宜溫度是接近40℃，但是35℃時觀察到酶的穩(wěn)定性更高。
實施例5其他P-系列二醇醚乙酸酯的對映體選擇性水解水解酶的篩選同樣一組超過110種、選擇用于PMA的對映體選擇性水解的商用水解酶也經(jīng)過篩選用于其他P-系列二醇醚乙酸酯的對映體選擇性水解。如實施例2中的一般說明對這些酶進行初步篩選，其中基質的濃度為0.5％，v/v。對每種基質進行兩種反應并在4h和24h時終止，4h時取樣以確定選擇性的酶，該酶可催化非?？焖俚乃狻ｉ_始，PMA對映體的洗脫順序被用作PEA、PnPA、PiPA和PnBA對映體的絕對構型歸屬的基礎，這些對映體在同樣的GC條件下分離，最早洗脫的對映體經(jīng)驗上歸屬為(S)-構型，這種洗脫方法被化學合成的已知立構化學(如實施例1所述)的對映體純化合物隨后證實。
識別出了可催化每種基質的對映體選擇性水解的幾種酶；這些酶被稱為“選中樣”。大多選中樣可識別二醇醚乙酸酯基質水解了的(R)-對映體，導致乙酸酯(S)-對映體的拆分純度大于85％ee。也存在顯示相反對映體選擇性的酶并可在初步的酶篩選中得以識別；這些酶包括酯酶E001、E002和E003(Thermogen，Inc.)。但是，它們在這些初步篩選反應中被觀察到的對映體選擇性沒有它們的相應酶的對映體選擇性高。
在0.5ml的水相反應中，含酶～2mg/ml且二醇醚乙酸酯基質為0.5％、10％、25％(v/v)時，再次篩選對映體選擇性最高的酶。第二次的這些篩選反應用于考察基質濃度較高時對映體選擇性酶的性能。將PEA、PnPA、PiPA和PnBA水解對映體選擇性最高的酶列于表2-5。它們中間，Candida antarctica脂肪酶類型B(CAL-B)對于每一種二醇醚乙酸酯基質的選擇性都最高。在所提供的酶制劑Chirazyme L-2，lyo.，(Roche)，Altus 13(Altus Biologics，Inc)，脂肪酶SP-435(Novo Nordisk)，以及復合CAL-B(Fluka BioChemika)上可觀察到CAL-B的選擇性能。認為篩選的所有酶中剩余的部分也是有益的，因為多個選中樣識別出來自不同供應商同一種酶。
表2商用水解酶催化PEA對映體選擇性水解的篩選結果1總結

1結果由GC/FID分析確定并以％(v/v)報告，篩選檢定1∶10稀釋，含10％(v/v)PEA和約2.0mg/ml的酶，如文中所述培育24小時。
2 E＝ln((1-ee％PEA)/(1+ee％PEA/ee％PE))/ln((1+ee％PEA)/(1+ee％PEA/ee％PE))，百分比轉化率，％C，根據(jù)體積百分比估算[(S)PE+(R)PE]/[(S)PEA+(R)PEA+[(S)PE+(R)PE]×100表3商用水解酶催化PnPA對映體選擇性水解的篩選結果1總結

1結果由GC/FID分析確定并以％(v/v)報告，篩選反應稀釋1∶100，含PnPA 10％(v/v)和約2.0mg/ml的酶，30℃下、振蕩(300rpm)培育規(guī)定時間，1a的酶濃度為53.2mg/ml。
2對映體選擇性或“對映體的比例”(E)E＝ln((1-ee％PnPA)/(1+ee％PnPA/ee％PnP))/ln(1+ee％PnPA)/(1+ee％PnPA/ee％PnP))百分比轉化率，％C，根據(jù)體積百分比估算[(S)PnP+(R)PnP]/[(S)PnPA+(R)PnPA+(S)PnP+(R)PnP]×100表4商用水解酶催化PiPA對映體選擇性水解的篩選結果1總結


1結果由GC/FID分析確定并以％體積/體積報告，篩選反應稀釋1∶100，含PiPA10％(v/v)和約2.0mg/ml的酶，30℃下、振蕩(300rpm)培育規(guī)定時間。1a酶的濃度為53.2mg/ml。
2對映體選擇性或“對映體的比例”(E)E＝ln((1-ee％PIPA)/(1+ee％PIPA/ee％PnP))/ln((1+ee％PIPA)/(1+ee％PIPA/ee％PIP))百分比轉化率，％C，根據(jù)體積百分比估算[(S)PIP+(R)PIP]/[(S)PIPA+(R)PIPA+(S)PIP+(R)PIP]×100表5商用水解酶催化PnBA對映體選擇性水解的篩選結果1總結


1結果由GC/FID分析確定并以％體積/體積報告，篩選反應稀釋1∶100，含PnBA10％(v/v)和約2.0mg/ml的酶，30℃下、振蕩(300rpm)培育規(guī)定時間。1a酶的濃度為53.2mg/ml。
2對映體選擇性或“對映體的比例”(E)E＝ln((1-ee％PnBA)/(1+ee％PnBA/ee％PnB))/ln((1+ee％PnBA)/(1+ee％PnBA/ee％PnB))百分比轉化率，％C，根據(jù)體積百分比估算[(S)PnB+(R)PnB]/[(S)PnBA+(R)PnBA+(S)PnB+(R)PnB]×100，計算的E值大于500以＞500報告。
根據(jù)PEA、PnPA、PiPA和PnBA通過CAL-B(如上表2-5所示)的選擇性拆分，分別使用Chirazyme L-2，lyo和Chirazyme L-2，c.-f.，C2lyo來考察高基質濃度下PPhA的對映體選擇性水解。使用水相0.2ml的反應來評價酶的選擇性和PPhA的轉化程度，該反應中含ChirazymeL-2，lyo為1.0mg/ml或Chirazyme L-2，c.-f.，C2 lyo為26.6mg/ml且PPhA為10、15、25、35和50％(v/v)。對含Chirazyme L-2，c.-f.，C2 lyo的液體反應的分析表明基質用量最多為25％時，(S)-PPhA和(R)-PPh拆分的純度都可達到99％ee(產(chǎn)率為50％)。基質用量為35％(81％ee)和50％(74％ee)時，觀察到(S)-PPhA被部分拆分?；|用量為10％時，含Chirazyme L-2，lyo.的反應可實現(xiàn)(S)-PPhA的完全拆分(純度大于99％ee)；基質加量為15％、25％、35％和50％(v/v)時，拆分(S)-PPhA的純度約為95％ee、86％ee、79％ee和69％ee。
CAL-B的對映體選擇性在不同條件下的水相反應中考察CAL-B(Chirazyme L-2，lyo.)對不同P-系列二醇醚乙酸酯的對映體選擇性，一些實驗條件和結果概況如下，見表6。
表6.二醇醚乙酸酯使用固定CAL-B(Chirazyme L-2，c.-f.，C2 lyo)的水解


1Candida antarctica脂肪酶類型B，載體固定，可購買得到，名稱為Chirazyme L-2，c.-f.，C2 lyo(～10U/mg，Roche Molecular Biochemicals)n.d未確定結果表明CAL-B可催化PEA、PnPA、PiPA、PnBA和PPhA的對映體選擇性水解，產(chǎn)生高純度的(S)-乙酸酯和(R)-醚。這些結果也表明在所考察的條件下，對所有的基質用量，CAL-B既顯示了寬廣的基質特異性，同時在大多數(shù)情況下仍保留較高的對映體選擇性。
在不同的二醇醚乙酸酯基質的濃度下，最多到高基質濃度(50％到70％)，并且在不同的酶濃度下，CAL-B的對映體選擇性拆分性能概括如表7。表7中顯示的也是二醇醚乙酸酯對映體選擇性水解的一些優(yōu)化參數(shù)的概括。
表7.商用水解酶催化PMA、PEA、PnPA、PiPA、PnBA和PPhA對映體選擇性水解的篩選結果1總結


n.d未確定實施例6酯化轉移初步評價PM通過CAL-B的酯化轉移在幾個不同的反應中，初步考察了CAL-B催化二醇烷基(或芳基)醚酯化轉移的能力，這些0.5ml的反應含有5.0mg/ml CAL-B(ChirazymeL-2，lyo)和10％(v/v)PM，乙酸乙烯酯或乙酸乙酯作為?；o體，可以用也可以不用甲苯或己烷作非極性的共溶劑，結果見表8。
表8不同溶劑和?；o體條件下PM通過CAL-B的?；?

1結果根據(jù)文中所述條件下培育16小時后的反應的GC/FID分析確定。
16小時時進行的終點分析證明用乙酸乙烯酯或者乙酸乙酯作為?；o體(如表8所示)，CAL-B可催化PM對映體選擇性?；?。其他的實驗表明最高的對映體選擇性開始發(fā)生在乙酸乙酯為90％(v/v)的無水條件下。然而，不能排除使用乙酸乙烯酯時的高初始對映體選擇性，假設優(yōu)選醇對映體較快酯化后伴隨有速度較低的不太優(yōu)選的醇對映體?；磻?。這一假設通過反應的實時分析得到證實，表明用乙酸乙烯酯或乙酸乙酯作為酰基給體，5.0mg/ml CAL-B(Chirazyme L-2，lyo)可催化最多50％(v/v)PM對映體選擇性?；?。在PM和乙酸乙酯各含50％(v/v)的反應中，1小時內，可導致生成(R)-PMA的純度大于98％ee。
觀察到乙酸乙酯、非活性酯可作為此反應的?；o體，表明光活性的P-系列二醇醚可以高產(chǎn)率生產(chǎn)。
其他P-系列二醇醚通過CAL-B的酯化轉移使用酶催化劑CAL-B、乙酸乙酯和乙酸乙烯酯為?；o體、有機溶劑為反應介質，考察了P-系列二醇醚PM、PE、PnP、PiP、PnB和PPh基于酯化轉移的拆分，相應二醇醚乙酸酯的(R)-對映體以高光學純度的產(chǎn)物生成。
首先觀察到用乙酸乙烯酯作為?；o體時對考察的所有二醇醚的轉化都是最快的。
實施例7酯化轉移優(yōu)化進行實驗以確定對于實驗室規(guī)模和反應器規(guī)模(放大規(guī)模)，各種反應參數(shù)都能達到最優(yōu)化的反應條件，這些參數(shù)包括包括產(chǎn)率或轉化率(以?；|中的比例或數(shù)量來量化)、異構體純度(以％ee確定)、基質用量(或濃度)、酶的加量、以及反應時間、溫度和介質。
酶的濃度和溫度的影響調節(jié)酶的加量表現(xiàn)為一種通過反應工程提高產(chǎn)物光學純度的有效方法。
載體固定的Candida antarctica脂肪酶類型B(Chirazyme L-2，c.-f.，C2 lyo.)為26.6、13.3和6.7mg/ml時，考察PM和PPh的對映體選擇性酯化轉移，酯化轉移反應為1.0ml，基質/酰基給體的比為75/25％(v/v)PM/VA和80/20％(v/v)PPh/VA。結果表明，PMA和PPhA的(R)-對映體乙酸酯的最高產(chǎn)物純度％ee與含降低濃度的酶的反應相關，這種相關性與轉化的程度無關。對于這三種酶的加量，PM的總轉化率比計算的理論轉化率(根據(jù)?；o體的量計算)高～10％，而PPh的轉化率比計算的理論轉化率低～10％。對(R)-PMA和(R)-PPhA產(chǎn)物選擇性酰基化的結果見圖4。這些結果表明可產(chǎn)生高純度％ee(R)-PMA和(R)-PPhA產(chǎn)物的反應條件與轉化率％無關，而與所考察含酶加量為最低(6.6mg/ml)的反應相關。
不同的酶加量下考察使用乙酸乙烯酯時PM酯化轉移的其他實驗結果如下表表9所示。
對于PM基于酯化轉移的拆分，降低反應溫度導致CAL-B的對映體選擇性提高。盡管拆分的速率降低，但是降低反應溫度是一種提高產(chǎn)物光學純度的有效方法。在溫度為-20℃到30℃的范圍時，這種效果得以表現(xiàn)出來。
載體固定的Candida antarctica脂肪酶類型B(Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo.)為26.6、13.3、6.7、3.3和1.7mg/ml，在30、20、4和-20℃(±2℃)下，無振蕩培育的情況下，考察PM的對映體選擇性酯化轉移，酯化轉移反應為1.0ml，PM/乙酸乙烯酯的比為75/25％或70/30％v/v。反應含有最低加量的酶，在最低溫度(-20℃)下培育，產(chǎn)生(R)-PMA的純度％ee最高，但是速率最慢。然而，這些結果表明，通過優(yōu)化培育溫度和酶的加量可以確定所需拆分效果的適合條件。含不同酶加量、在不同溫度下培育的反應效果見表9。
表9使用乙酸乙烯酯時(±)-1-甲氧基-2-丙醇(PM)的酯化轉移與酶的濃度和溫度之間的關系


1Candida antarctica脂肪酶類型B，載體固定形式，可購買得到，名稱為Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo(～10U/mg，Roche MolecularBiochemicals)水的影響對PM和PPh說明了水的行為和磷酸鹽緩沖液(＜3％vol.)對?；俾屎蛯τ丑w選擇性的影響。一定含量的水(水的行為)可降低反應速率，然而，水含量有望用于控制反應進程。
基質濃度的影響如表10所示，顯示出CAL-B可催化二醇醚PM、PE、PnP、PiP、PnB和PPh的對映體選擇性拆分，基質濃度最高為70％(v/v)且對映體選擇性(E)值為50到大于150。
表10高基質濃度1時(R)-?；锏拿复呋鸱?

1反應體積為0.5ml；酶的濃度為1mg/ml；基質濃度為70％(v/v)，酰基給體為乙酸乙烯酯。
(R)-酯的純度依賴于反應的時間，或分析產(chǎn)物的階段；它也依賴于基質的轉化率是否大于或小于50％(使用乙酸乙烯酯時，由CAL-B催化PPh酯化轉移的結果見圖5)。一般，基質的轉化率小于50％時，(R)-酯出現(xiàn)為高ee值。因此，對于(R)-乙酸酯，PEA的純度大于約96％ee，PPhA的純度大于約95％ee，并且P-系列二醇醚的殘留(R)-乙酸酯純度大于約80％ee(例如，觀察到PnBA的ee值約為87％、89％和82％)。
?；o體在1.0ml、含Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo.為6.6mg/ml的反應中，PE為基質或?；?接受體，并且?；o體的量為1.0摩爾當量時，考察不同潛在?；o體的性能。PE基質的加量范圍為從35％到55％(v/v)，殘留反應體積為酰基給體。在類似的反應中，使用PnP作為基質與?；o體的摩爾比為1∶1和1∶2。PnP基質的加量范圍為從31％到59％(v/v)，殘留反應體積為?；o體。所考察的?；o體包括乙酸丁酯(BA)、乙酸乙基苯酚酯(EPA)、乙酸乙酯(EtA)、三氯乙酸乙酯(EtCA)、三氟乙酸乙酯(EtFA)、乙酸異丙烯酯(IPA)、乙酸乙烯酯(VA)、甲氧基乙酸乙酯(EMA)、丁酸2，2，2-三氟乙醇酯(TfEB)、雙烯酮(DK)和丙酸乙烯酯(VP)。反應在30℃下培育，24小時后取樣。生成的拆分(S)-基質和(R)-酯的純度％ee，以及％轉化率見表11。
表11.二醇醚PE和PnP使用不同酰基給體的酯化轉移


1所考察的?；o體乙酸丁酯(BA)、乙酸乙基苯酚酯(EPA)、乙酸乙酯(EtA)、三氟乙酸乙酯(ETFA)、乙酸異丙烯酯(IPA)、乙酸乙烯酯(VA)、甲氧基乙酸乙酯(EMA)、丁酸2，2，2-三氟乙醇酯(TFEB)、丙酸乙烯酯(VP)2Candida antarctica脂肪酶類型B，載體固定，可購買得到，名稱為Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo(～10U/mg，Roche Molecular Biochemicals)
用三氯乙酸乙酯或雙烯酮作酰基給體時，未檢測到顯著的酯化轉移。這一結果表明乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯是有效的?；o體，可給出高的二醇醚?；x擇性。
其他的考慮可指導選擇適當?shù)孽；o體；這樣的考慮包括反應期間生成的產(chǎn)物類型，以及產(chǎn)物的特性包括它的揮發(fā)性和毒性。例如，用乙酸乙烯酯作酰基給體導致生成乙烯醇，可以理解乙烯醇能互變異構成乙醛；乙醛非常易燃(閃點為-40℃)，是一種可疑的動物致癌物，并且難于通過蒸餾而有效回收。因此，該產(chǎn)物代表了安全危害、健康危害，以及用于分離拆分的對映體的蒸餾設備帶來的類似污染。另一方面，用異丙烯乙酸酯作?；o體導致生成異丙烯醇，相信它可互變異構成丙酮；丙酮的閃點較高(-17℃)，因此不像乙醛那樣易燃，它不是一種可疑的致癌物，并且可證實它更適合于從拆分的對映體中蒸餾出。此外，表12中所示的其他實驗已經(jīng)證明乙酸異丙烯酯是PM、PE、PnP、PnB和PPh的一種有效選和選擇性的?；o體。
表12.二醇醚使用VA和IPA作為?；o體的酯化轉移


1所考察的?；o體異丙烯乙酸酯(IPA)、乙酸乙烯酯(VA)2Candida antarctica脂肪酶類型B，載體固定，可購買得到，名稱為Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo(～10U/mg，Roche Molecular Biochemicals)基質與?；o體的比例控制基質的轉化程度基質加量分別為最多80％和84％時，CAL-B催化PM和PPh的酯化轉移已進行了說明，反應的剩余體積是乙酸乙烯酯(作為?；o體)的體積。限制?；o體的量是一種控制基質轉化程度的有效方法，因此，提供?；o體的量應足以使基質轉化率稍低于或稍高于50％。這一概念也強調使用可達到所需轉化程度的最高基質濃度，由此使體積生產(chǎn)率最大化。
其他的實驗考察了二醇醚基質在不同酰基給體比率下的酯化轉移，其中乙酸乙烯酯是?；o體，結果見下表13。
表13.二醇醚基質在不同乙酸乙烯酯酰基給體比率下的酯化轉移


1Candida antarctica脂肪酶類型B，可購買得到，名稱為Chirazyme L-2，lyo(～120U/mg，Roche Molecular Biochemicals)。固定的形式，名稱為Chirazyme L-2，c.-f.，C2，lyo(～10U/mg，Roche Molecular Biochemicals)，用于含PtB為基質的反應2n.d.，未確定的實施例8催化劑的循環(huán)再用水解或酯化轉移用的酶催化劑都可循環(huán)再用。當CAL-B用于丙二醇醚乙酸酯的對映體選擇性水解時，進行下列實驗以評價和優(yōu)化CAL-B循環(huán)再用的不同參數(shù)。
在0.5ml的液體反應中，考察酶的循環(huán)再用，反應含PMA的濃度為25、35和40％(v/v)，Chirazyme L-2，c.-f.，C2，為13mg/ml(約10U/mg)。反應在40℃下培育，旋轉振蕩300rpm。超過24小時循環(huán)時進行分析，在此時間，將反應溶液取出并向原先的固定酶上加入含基質的新緩沖液以開始下一次反應循環(huán)?；|濃度為35％和45％、循環(huán)3次、采用兩種酶時，拆分不完全，產(chǎn)生的(S)-PMA的純度不超過92％ee。作為對比，含25％PMA的反應經(jīng)過6次循環(huán)后，拆分(S)-PMA的純度一般都＞96-98％ee?；|加量為20和25％時，進行其他的酶循環(huán)再用研究。對于Chirazyme L-2，c.-f.，C2，在基質濃度為20％或25％的試驗中，反應循環(huán)超過30次時，(S)-PMA的對映體純度接近97％ee。
PMA的拆分放大實驗在1.5升反應體積的BioFlo 3500發(fā)酵罐(Fermentor)(New Brunswick Scientific)中進行，基質濃度為25％(v/v)PMA。初始酶用量為26.6mg/ml Chirazyme L-2，c.-f.，C2，(約280U/mg)時，觀察25％PEA的拆分，循環(huán)最多15次，每一反應循環(huán)的時間范圍為2到5小時。每一次循環(huán)結束時，停止攪拌，將沉積的固定CAL-B生物催化劑保留在反應器中而將拆開的反應基質取出。向反應器中加入新鮮含外消旋PMA的緩沖液，開始下一次循環(huán)，在15次的循環(huán)拆分過程中不再額外加入酶。15次的循環(huán)拆分經(jīng)二氯甲烷萃取后，回收(S)-PMA和(R)-PM的平均對映體純度分別為＞99.5％ee和＞85％ee。
將固定CAL-B(Chirazyme L-2，c.-f.，C2；約240U/mg)用于以PEA為基質的一些不同的酶循環(huán)再用實驗，這些實驗都是既有實驗室規(guī)模(＜5ml)也有1.5-L規(guī)模。在一個實驗中，在三個不同的酶用量下，循環(huán)超過15次，循環(huán)時間一般為約24小時時，觀察20％(v/v)PEA在一個1ml反應體積下的拆分。在這一實驗中，每一循環(huán)結束時，將反應基質從固定CAL-B中取出并進行分析，向固定酶中加入新鮮反應基質開始下一次循環(huán)，反應混合物在約40℃下培育。圖6所示的結果表明，在所使用的實驗條件下，可觀察到經(jīng)多次循環(huán)后，(S)-PEA得到了非常好的拆分，并且經(jīng)多次循環(huán)后，較高的酶的濃度導致了較高的拆分。
在另一實驗中，20％(v/v)PEA的拆分在一反應體積為1.5-L的BioFlo 3500發(fā)酵罐(Fermentor)(New Brunswick Scientific)中進行放大。生物催化劑循環(huán)再用允許使用CAL-B的拆分超過30次循環(huán)，每一次循環(huán)的時間從約2小時變化到約9小時。在這一實驗中，每一循環(huán)結束時，將反應基質從反應器中的固定化CAL-B中取出并進行分析，向固定化酶中加入新鮮反應基質開始下一次循環(huán)。反應混合物維持pH為7.2(通過加入20％的NaOH維持)并且在37℃下培育。每一循環(huán)過程中取樣并分析樣品，監(jiān)控產(chǎn)物的對映體純度。前18次循環(huán)的結果見圖7?；|拆分所需的反應循環(huán)時間提高時，向反應器中加入新鮮的酶(10％的起始加量)，在循環(huán)次數(shù)為8、10、16和25時加入了新鮮酶。超過32次循環(huán)的PEA拆分情況見圖8。每次循環(huán)最后一個樣品的分析用于計算(S)-PEA和(R)-PE的拆分純度(以％ee表示)以及總的轉化率(以％表示)。這些結果見圖8，結果證明在放大條件下，可以觀察到經(jīng)過多次循環(huán)(S)-PEA和(R)-PE都得到了非常好的拆分，而且轉化率很高。此外，這些實驗證明了放大條件下Chirazyme L-2，c.-f.，C2的有效循環(huán)再用，這種循環(huán)再用大大降低了每一循環(huán)所用酶的成本；增加酶的循環(huán)再用可提供更高的工藝效率和更低的總生產(chǎn)成本。高濃度PPh的基于酯化轉移的拆分已經(jīng)在下列條件下進行了說明，即1.0-L規(guī)模，使用Chirazyme L-2，c.-f.，C2(6.6mg/ml)，乙酸乙烯酯為?；o體。轉化率＜50％的反應構造為PPh/VA的比為70/30到76/30，并在室溫下產(chǎn)生高純度％ee的(R)-PPhA。對于需要轉化率＞50％的反應，采用PPh/VA的比為70/30，并且在4℃下可獲得較高的對映體選擇性，一般(S)-PPh和(R)-PPhA的產(chǎn)物對映體純度分別為＞90％ee和＞95％ee。采用磁力攪拌棒提供攪拌，并通過過濾將固定化酶從反應器中分離出。在這些條件下，酶可循環(huán)再用5-8次。
規(guī)模為1.0升，用不同PGEA作基質，在酯化轉移條件下進行其他的反應，以高對映體純度拆分相應的(S)-和PGAE(R)-PGAEA。在這些研究中用的酶可重復用于多個間歇拆分循環(huán)，將反應條件和拆分的情況概括于表14。
表14.

實施例9外消旋PMA作為手性酰基給體方法向1.8ml的反應瓶中加入下列量的外消旋1-叔-丁氧基-2-丙醇、所列的?；o體和作為生物催化劑(酶)的Chirazyme L-2 C2。所示PtB接近理論值的轉化率根據(jù)基質和酰基給體的摩爾比計算，大于100％的理論轉化率值指所提供的?；o體的化學計算過量。

總體積為1.0ml的反應混合物在4℃下振蕩培育，65小時的時間內定期取樣并通過手性GC分析以監(jiān)控PtB的轉化率和生成的乙酸酯產(chǎn)物1-叔-丁氧基-2-丙醇乙酸酯以及PMA和PM的對映體純度。
結果表15中所示的結果證明在酶催化的PtB酯化轉移中，DOWANOLPMA可以用作?；o體以產(chǎn)生高對映體純度(＞99％ee)的(R)-PtBA。除了(R)-PtB的高選擇性?；?，在手性?；o體PMA的使用過程中也觀察到了酶的選擇性。反應1和2表明CAL-B優(yōu)選使用(R)-PMA作為?；o體導致生成(R)-PM，并且有PtB的?；磻母碑a(chǎn)物和(S)-PMA的部分拆分同時發(fā)生。二醇醚基質(如，PtB)與手性PMA的比以及揮發(fā)(R)-PM的去除原則上可用來控制反應轉化的程度。例如，含PtB/PMA體積比為50∶50(反應1)和70∶30(反應2)的反應產(chǎn)生R-PtBA的純度＞99％ee，PtB的轉化率分別為31％和20％。還應該注意到酶的濃度、反應時間和培育溫度也可用來控制反應速率和對映體選擇性，這些結果見表15。
表15


1PtB的轉化率按照PtBA的生成報告，并根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PtBA/總的PtBA+總的PtB]×100。
2在含乙酸乙烯酯或乙酸乙酯的反應中，不計酰基給體副產(chǎn)物。
實施例10外消旋PMA作為手性?；o體方法進一步考察改變二醇醚基質和酰基給體比的影響。將含PtB/PMA體積比為30∶70、40∶60、50∶50、60∶40和70∶30的反應混合物用來考察R-PtBA、S-PtB、R-PM和S-PMA的轉化程度和所得到的拆分情況。在1.8ml的反應瓶中，反應含有下列數(shù)量的外消旋PtB、PMA作為酰基給體以及Chirazyme L-2 C2作為生物催化劑(酶)


理論轉化率值大于100％指所提供的?；o體化學計算過量。1.0ml的反應混合物在4℃下振蕩培育，在48小時的時間內定期取樣，并通過手性GC分析以監(jiān)控PtB的轉化率和PtB、PtBA、PMA以及PM的對映體純度。
結果含不同PtB/PMA體積比的反應顯示出不同程度的PtB轉化率，導致R-PtBA的拆分純度＞99％ee且S-PtB對映體純度不同(見表15)。含PtB/PMA比為30∶70的反應顯示出PtB的轉化率最高，并且拆分的對映體純度比含高比例PtB和較低量?；o體反應中的對映體純度高。此外，選擇性使用R-PMA作為手性酰基給體可導致R-PM有效拆分以及S-PMA對映體的富余。這些結果見表16。
表16


1PtB的轉化率按照PtBA的生成報告，并根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PtBA/總的PtBA+總的PtB]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。
2PMA的轉化率根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算進行報告，其定義為[總的PM/總的PM+總的PMA]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。
實施例11外消旋PMA作為手性?；o體實驗A方法根據(jù)前面反應觀察到的轉化程度，在100ml、含PtB/PMA體積比為60∶40的反應中，考察減壓下汽提PM的影響。去除PM后，向反應加入額外的PMA。反應#1中分批去除R-PM并隨后加入新的酰基給體(PMA)以說明反應蒸餾設想的概念。不汽提PM，進行對比反應以評價轉化的程度和產(chǎn)物的對映體純度(i)一次性加入PMA(反應#2)和(ii)分批加入PMA(反應#3)。這些反應含有下列量的外消旋PtB、PMA作為?；o體以及Chirazyme L-2 C2作為生物催化劑(酶)

1反應1加入40ml PMA等分試樣開始反應，然后PM-汽提1.5、3.0和4.5小時。
2對比反應2僅加入40ml PMA作為?；o體開始反應。
3對比反應3不汽提，但是加入40ml PMA等分試樣開始反應，然后在1.75、3.25和4.75小時時取樣。
反應混合物在250ml的玻璃容器內于30℃下攪拌培育。反應1以1.5小時的間隔如下進行汽提將液相從固定酶中傾析到一圓底燒瓶中，并于74℃下減壓旋轉蒸發(fā)除去PM。PM除去后，將反應物冷卻(30℃)，取樣并加入額外的PMA。
結果表17中所示的結果表明反應1和反應3中所得PtB轉化為(R)-PtBA的最終轉化率分別為70％和46％，這種差別是由于反應3中?；o體副產(chǎn)物(PM)富集以及不希望的反應平衡抑制了進一步的轉化，兩個反應中生成的R-PtBA的純度都＞99％ee。然而，反應1中，通過汽提手性副產(chǎn)物(R)-PM獲得的較高轉化率使(S)-PtB拆分的純度＞84％ee，而在反應3中，(S)-PtB拆分的純度僅為65.6％ee。反應1顯示PtB的轉化率為70％，還仍然含有純度＞99％ee的(R)-PtBA，這一事實是由于汽提過程中部分PtB從反應中損失。通過分析反應1中回收的(R)-PM，使用PMA作為?；o體的對映體選擇性的用途就是顯然的了，對于原料在1.5h、3.0h和4.5 h時間點處的濃縮，回收(R)-PM的對映體純度從66％ee變化到74％ee。
盡管這一實驗以間歇方式進行，進行離線的副產(chǎn)物去除，但是這種概念是有效的，并能夠以反應蒸餾的設想方案推廣到連續(xù)生產(chǎn)去除中。使用乙酸乙烯酯作為?；o體，回收的(R)-PM在第二次拆分中能夠升級產(chǎn)生高對映體純度的(R)-PMA。
表17實驗A


1PtB的轉化率按照PtBA的生成報告并根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PtBA/總的PtBA+總的PtB]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。反應1中PtB的轉化率＞50％(同時(R)-PtBA的純度＞99％ee)部分是由于汽提過程中部分PtB從反應中損失。
2PMA的轉化率按照PM的生成報告，并根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PM/總的PM+總的PMA]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。
3汽提過的(R)-PM指通過旋轉蒸發(fā)從反應中去除了的PM部分。
4nd，未確定的實驗B方法在100ml、含PtB/PMA體積比為50∶50的反應中，進行第二種實驗以考察減壓下汽提PM的影響。實驗條件與實驗A中所述的條件相同，除了在說明的情況下使用50ml的PMA作為?；o體。反應含有下列組分

1在1.5、3.0和4.5小時汽提PM之后，向反應1加入50ml PMA等分試樣。
2對比反應2僅加入50ml PMA作為?；o體開始反應。
3對比反應3不汽提，但是加入按照反應1預定的50ml PMA等分試樣。
結果實驗B的結果(表18)證實了實驗A中顯示出的影響。反應1和反應3中所得PtB轉化為(R)-PtBA的最終轉化率分別為77％和43％，即使有50％的?；o體，反應3中?；o體副產(chǎn)物(PM)的富集抑制轉化率超出實驗A中觀察到的水平。再者，兩個反應中生成的(R)-PtBA的純度都＞99％ee。反應1中通過汽提(R)-PM獲得的較高轉化率也使5小時內(S)-PtB拆分的純度＞80％ee，而在反應3中，(S)-PtB拆分的純度僅為60％ee。在使較高對映體純度產(chǎn)物獲得較高基質轉化率方面，酰基給體副產(chǎn)物的去除具有明顯優(yōu)勢。從實驗B的反應1中回收的汽提(R)-PM的對映體純度范圍為69％ee到87％ee。比較反應1和3中PtB的轉化程度以及產(chǎn)物的對映體純度，汽提的效果顯而易見。
表18實驗B



1PtB的轉化率按照PtBA的生成報告并根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PtBA/總的PtBA+總的PtB]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。反應1中PtB的轉化率＞50％(同時(R)-PtBA的純度＞99％ee)部分是由于汽提過程中部分PtB從反應中損失。
2PMA的轉化率根據(jù)GC-FID(峰面積)分析計算，其定義為[總的PM/總的PM+總的PMA]×100，轉化率計算的精確度為約±10％。
3汽提過的(R)-PM指通過旋轉蒸發(fā)從反應中去除了的PM部分。
4nd，未確定的實施例12從(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇制備(S)-1，2-丙二醇步驟(a)(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇的酶催化拆分1.0-L的反應容器中裝有366ml的(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇(PtB)和134ml的乙酸乙烯酯，向該容器加入3.35g、名為Chirazyme L-2 C2的固定化CAL-B。此500ml的反應含有(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇和乙酸乙烯酯的體積比為73∶27(足夠約60％的PtB轉化成PtBA)，將此反應在30℃下攪拌培育。在20-24h的培育過程中間，通過手性GC監(jiān)控產(chǎn)物的產(chǎn)率和對映體純度。產(chǎn)物的產(chǎn)率一般表明20h內轉化率接近50％，20h時通過過濾將反應的溶劑相與固定化酶顆粒分離。固定酶可作為酰基化催化劑循環(huán)再用，通過另外加入500ml體積的體積比為73∶27的(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇和乙酸乙烯酯，采用這種方式重復使用固定化酶的10次拆分循環(huán)。
GC分析的結果表明反應回收的溶劑相含有拆分的產(chǎn)物(R)-1-叔-丁氧基-2-乙酸基丙烷(R-PtBA)，純度＞99％ee，以及(S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇(S-PtB)，純度＞96％ee。乙醛作為酶催化?；磻母碑a(chǎn)物而得到。手性產(chǎn)物隨后通過如步驟(b)所述的蒸餾分離。
步驟(b)蒸餾分離(S)-PtB/(R)-PtBA將步驟(a)中得到的手性產(chǎn)物分兩步純化，第一步，將乙醛從反應混合物中去除。在一般的操作中，將3790g乙醛/(S)-PtB/(R)-PtBA混合物置于一個5-L的圓底燒瓶中，將燒瓶安裝到減壓蒸餾裝置上，減壓蒸餾裝置由一個包裹有1/4”陶瓷鞍狀物的兩英尺玻璃柱和一個用SR-1作冷卻劑(設定到-15℃)的磁力回流冷凝頭組成。在250mmHg的壓力下，回流/前流比為2/2時，將燒瓶加熱到47℃。3.5小時后，大部分的乙醛已去除。然后將沒有乙醛的(S)-PtB/(R)-PtBA混合物在類似的蒸餾裝置上蒸餾，該蒸餾裝置配有1/4”陶瓷鞍狀物包裹的六英尺柱。在這一步中，使用水作為冷卻劑。在一般的操作中，將4,033g(S)-PtB/(R)-PtBA混合物置于一個5-L的燒瓶中，然后將其從74℃加熱到89℃，壓力范圍為6到36mmHg，回流/前流比為2/1。取24個餾分，采用毛細管GC分析這些餾分并將那些類似的組分合并。
合并組分b(餾分7-16)重1,265g，含98.4％的(S)-PtB。合并組分e(餾分20-24)重1,990g并且含99.5％的(R)-PtBA。每一合并組分稀釋樣品(在水中，200∶1的比例)的分析表明(S)-PtB和(R)-PtBA的純度都＞99.5％ee。
步驟(c-1)(S)-PtB脫烷氧基化成(S)-PG將步驟(b)中所得的5.0032g(S)-PtB和0.1888g對甲苯磺酸(p-TSA)催化劑置于一10-ml的兩頸圓錐形底的燒瓶中；將帶無水CaSO4干燥管的冷凝器安裝到燒瓶的一個頸上，隔膜安裝到燒瓶的另一個頸上；將燒瓶放進加熱到100℃的硅油浴中。反應進行13小時，期間隨機取樣并用GC分析。反應結束后，顯示出98.6％的(S)-PtB已反應，(S)-PG的選擇性為81.6％(見表18)。(S)-PG產(chǎn)物在水中稀釋(200∶1的比例)，采用手性GC分析，發(fā)現(xiàn)純度＞99.5％ee。
步驟(c-2)(R)-PtBA水解和脫烷氧基化成(R)-PG將步驟(b)中所得的(R)-PtBA 5.0375g、15.0919g蒸餾水和0.4671gp-TSA催化劑置于一10-ml的兩頸圓錐形底的燒瓶中；將帶無水CaSO4干燥管的冷凝器安裝到燒瓶的一個頸上，隔膜安裝到燒瓶的另一個頸上；將燒瓶放進加熱到100℃的硅油浴中。反應進行33小時，期間隨機取樣并用GC分析。反應結束后，顯示出100％的(R)-PtBA已反應，對(R)-PG的選擇性為86.5％(見表18)。(R)-PG產(chǎn)物在水中稀釋(200∶1的比例)，采用手性GC分析，發(fā)現(xiàn)純度＞99.5％ee。
步驟(d)從脫烷氧基化產(chǎn)物中分離(S)-PG將步驟(c-1)中得到的產(chǎn)物混合物置于一個5-ml的圓底燒瓶中，燒瓶中放有攪拌子；將一配有溫度計、真空連接器和接收器的微型-閃蒸蒸餾裝置安裝到燒瓶上，使用加熱槍在84℃-87℃和10mmHg下將產(chǎn)物閃蒸餾出。分離出的產(chǎn)物用GC分析，發(fā)現(xiàn)含有89％的PG。紅外光譜分析證實分離產(chǎn)物的主要組分是PG，帶有一些羰基雜質，后經(jīng)GC-MS確認為丙二醇的單-和二-乙酸酯。分離出的(S)-PG(水中稀釋，比例為200∶1)采用手性GC分析，發(fā)現(xiàn)純度＞99.5％ee。
步驟(e)通過從(S)-PtB中去除殘余的乙酸提高產(chǎn)率由于(S)-PtB中存在來自步驟(b)中(R)-PtBA部分裂解殘留的乙酸，相信前面步驟中所述的丙二醇乙酸酯已經(jīng)生成?；谶@樣的考慮，少量的(S)-PtB可用少量的10N NaON處理，然后閃蒸蒸餾。然后將處理過的(S)-PtB用于重復步驟(c-1)中的實驗，如表19所示。這一次，(S)-1，2-丙二醇的選擇性＞95％(99.5％ee)。如前所述產(chǎn)物閃蒸蒸餾后的IR分析，表明沒有乙酸酯的峰，這證明了(S)-PtB中自由乙酸的負面影響。本領域的技術人員將會認識到通過在步驟(b)中進行更仔細的蒸餾可以降低或消除乙酸的生成。
表19脫烷氧基化結果


*苯乙烯顆粒，磺酸基團功能化(酸濃度＞2M)，Dow Chemical Company銷售，商品牌號為DOWEX DR-2030離子交換樹脂。
**反應中不用水上述說明中提及的所有公開物和專利在此都供參考。不背離本發(fā)明的范圍和主旨的情況下，對本發(fā)明所述的方法和體系進行不同的修正和變化對于本領域的技術人員而言將是顯而易見的。盡管已結合具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明進行了說明，應理解本發(fā)明的權利要求不應不適當?shù)鼐窒抻谶@樣的具體實例。實際上，實施本發(fā)明所述模式的不同修正對材料科學、化學和分子生物學或相關領域的技術人員而言是顯而易見的，意欲將這些修正包含在下列權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種方法，包括在反應混合物中將分子式為I的丙二醇醚乙酸酯外消旋物與有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此將外消旋物的一種對映體對映體選擇性地水解成相應的丙二醇醚對映體， 其中，R選自烷基或芳基基團。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述外消旋物的濃度大于約10％v/v。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述外消旋物的R-對映體可對映體選擇性地水解成相應的R-丙二醇醚。
4.根據(jù)權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述外消旋物的S-對映體可對映體選擇性地水解成相應的S-丙二醇醚。
5.根據(jù)權利要求1到4的任何一項所述的方法，其中所述的R選自CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。
6.根據(jù)權利要求1到4的任何一項所述的方法，其中所述的水解酶為脂肪酶。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述的脂肪酶為Candida antarctica脂肪酶部分B、脂肪酶LP‘S’、假單胞菌Pseudomonas sp脂蛋白脂肪酶、假單胞菌Pseudomonas sp脂肪酶或假單胞菌Pseudomonascepacia脂肪酶。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述的脂肪酶為Candida antarctica脂肪酶部分B。
9.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述外消旋物的濃度至少約為20％v/v。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中約30％到約50％的外消旋物被水解。
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述水解外消旋物的對映體純度至少約為70％ee。
12.根據(jù)權利要求3所述的方法，進一步包括b)從反應混合物中回收R-丙二醇醚。
13.根據(jù)權利要求3所述的方法，進一步包括a)從反應混合物中回收未反應的S-對映體基質；并且b)將S-對映體基質轉化，以獲得相應的S-丙二醇醚。
14.根據(jù)權利要求4所述的方法，進一步包括b)從反應混合物中回收S-丙二醇醚。
15.根據(jù)權利要求4所述的方法，進一步包括a)從反應混合物中回收未反應的R-對映體基質；并且b)將R-對映體基質轉化，以獲得相應的R-丙二醇醚。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括b)回收酶催化劑。
17.一種方法，包括在反應混合物中將分子式為II的丙二醇醚外消旋物與有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此將外消旋物的一種對映體對映體選擇性地酯化轉移成相應的?；济褜τ丑w， 其中，R選自烷基或芳基基團；其中所述外消旋物的濃度至少約為5％v/v；并且其中所述的反應混合物進一步含有?；o體，該酰基給體是一種活性的?；o體，選自活性的酯、烯醇酯和酐組成的集團。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述的R選自CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述的酰基給體選自乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、丙酸乙烯酯、乙酸2，2，2-三氯乙醇酯、乙酸2，2，2-三氟乙醇酯、乙酸丁酯、乙酸乙基苯酚酯、乙酸異丙烯酯、甲氧基乙酸乙酯、乙酸1-乙氧基乙烯酯、雙烯酮、丁酸三氟乙醇酯、乙酸酐、丙交酯、以及琥珀酸酐。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述的?；o體選自乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯。
21.一種方法，包括在反應混合物中將分子式為II的丙二醇醚外消旋物與有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此將外消旋物的一種對映體對映體選擇性地酯化轉移成相應的?；济褜τ丑w， 其中，R選自烷基或芳基基團；其中所述外消旋物的濃度至少約為5％v/v；并且其中所述的反應混合物進一步含有?；o體，該?；o體是一種非活性的?；o體，選自乙酸乙酯和手性酰基給體組成的集合。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中所述的R選自CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C(CH3)3和C6H5。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的?；o體為外消旋的乙酸1-甲氧基-2-丙醇酯、外消旋的乙酸1-乙氧基-2-丙醇酯或外消旋的乙酸1-丙氧基-2-丙醇酯。
24.根據(jù)權利要求18或權利要求22所述的方法，其中所述的水解酶為脂肪酶。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中所述的脂肪酶為Candidaantarctica脂肪酶部分B。
26.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，其中所述的外消旋物和?；o體組成約100％v/v的反應混合物。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述的外消旋物和?；o體存在的比例可導致約50％的外消旋物轉化成?；谋济选?br> 28.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，其中約30％到約50％的外消旋物被酯化轉移。
29.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，其中所述酰基化丙二醇醚的對映體純度至少約為70％ee。
30.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，進一步包括a)從反應混合物中回收所需的酰基化丙二醇烷基醚對映體；并且b)將回收的酰基化丙二醇烷基醚對映體轉化，以獲得相應的丙二醇烷基醚對映體。
31.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，進一步包括從反應混合物中回收未反應的對映體基質。
32.根據(jù)權利要求17或權利要求21所述的方法，進一步包括回收酶催化劑。
33.在通過酯化轉移拆分丙二醇醚外消旋混合物的方法中控制基質轉化程度的一種方法，其中所述的第一種基質，丙二醇醚，被第二種基質，酰基給體，酯化轉移，包括a)確定轉化的基質所需要的對映體產(chǎn)率以及轉化的和/或未轉化的基質所需要的純度；b)計算第一種基質和第二種基質的摩爾比以獲得所需要的產(chǎn)率和純度；c)根據(jù)摩爾比計算第一種基質和第二種基質的量，以從理論上獲得所需要的產(chǎn)率和純度；以及d)在反應混合物中，將一次計算量的第一種基質和二次計算量的第二種基質與有效量的酶催化劑水解酶混和，由此將外消旋物的第一種對映體對映體選擇性地酯化轉移成相應第一種對映體的?；济?，第一種基質包含分子式為II的丙二醇醚外消旋混合物 其中R選自烷基、芳基、芳基取代烷基、烯丙基或乙縮醛基團；第二種基質包含酰基給體，該?；o體是一種活性的或非活性的酰基給體，選自活性的酯、非活性的酯、烯醇酯和酐。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述第一種基質的一次計算量和第二種基質的二次計算量組成反應混合物約100％的反應基質。
35.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述的R選自CH3、CH3CH2、CH3(CH2)2、CH3(CH2)3、CH(CH3)2、C6H5、C(CH3)3、C(CH3)2C6H5、C(CH3)(C6H5)2、C(C6H5)3、C(CH3)2CH2CH3、CH2C6H5、CH2CH＝CH2、CH2C≡CH、CH2OCH2CH2OCH3和CH2OCH3。
36.根據(jù)權利要求33所述的方法，進一步包括a)從反應混合物中回收第一種對映體的酰基化丙二醇烷基醚產(chǎn)物；并且b)將此產(chǎn)物轉化以獲得相應的第一種對映體丙二醇烷基醚。
37.根據(jù)權利要求33所述的方法，進一步包括從反應混合物中回收未反應的第二種對映體丙二醇烷基醚。
38.根據(jù)權利要求33所述的方法，進一步包括回收酶催化劑。
39.根據(jù)權利要求33所述的方法，進一步包括a)監(jiān)控酰基化丙二醇醚的產(chǎn)率以及?；蚍酋；济训膶τ丑w純度；并且b)調節(jié)第一種基質與第二種基質的比例以獲得所需的產(chǎn)率和純度。
40.一種制備分子式為III的手性化合物的方法， 所說的方法包括下列步驟(a)在反應混合物中將分子式為II的丙二醇醚外消旋物與有效量的酶催化劑水解酶接觸，由此得到(S)-1-烷氧基-2-丙醇和乙酸(R)-1-烷氧基-2-丙醇酯；分子式II中，R為烷基、芳基取代烷基、烯丙基或乙縮醛基團，并且其中所述的反應混合物進一步包含?；o體，該酰基給體選自活性的酯、烯醇酯和酐組成的集合；酶催化劑水解酶選自脂肪酶、酯酶、酰基轉移酶和蛋白酶組成的集合； (b)將步驟(a)中生成的(R)-1-烷氧基-2-丙醇乙酸酯與(S)-1-烷氧基-2-丙醇分離；(c)在溫和的反應條件下，存在酸催化劑時，將步驟(b)中分離的(S)-1-烷氧基-2-丙醇脫烷氧基化以得到(S)-1，2-丙二醇；并且(d)分離步驟(c)中得到的(S)-1，2-丙二醇。
41.根據(jù)權利要求40所述的方法，進一步包括下列步驟(e)在溫和的反應條件下，存在酸催化劑時，將步驟(b)中分離的(R)-1-烷氧基-2-丙醇乙酸酯脫烷氧基化以得到(R)-1，2-丙二醇；并且(f)分離步驟(e)中得到的(R)-1，2-丙二醇。
42.根據(jù)權利要求40或權利要求41所述的方法，其中R選自C(CH3)3、C(CH3)2C6H5、C(CH3)(C6H5)2、C(C6H5)3、C(CH3)2CH2CH3、CH2C6H5、CH2CH＝CH2、CH2C≡CH、CH2OCH2CH2OCH3和CH2OCH3。
43.根據(jù)權利要求42所述的方法，其中R為C(CH3)3。
44.根據(jù)權利要求40到43的任何一項所述的方法，其中所述的水解酶為脂肪酶或酯酶。
45.根據(jù)權利要求44所述的方法，其中所述的水解酶為Candidaantarctica脂肪酶部分B。
46.根據(jù)權利要求40到45的任何一項所述的方法，其中步驟(c)中所說的酸催化劑為對-甲苯磺酸或離子交換樹脂。
47.根據(jù)權利要求40所述的方法，所說的方法包括下列步驟(a)在反應混合物中將(R，S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇，其中所述的反應混合物中進一步含有乙酸乙烯酯，與有效量的Candida antarctica脂肪酶部分B接觸，由此得到(S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇和(R)-1-叔-丁氧基-乙酸基丙烷；(b)通過蒸餾將(S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇與(R)-1-叔-丁氧基-乙酸基丙烷分離；(c)在溫和的反應條件下，存在對-甲苯磺酸酸催化劑時，將步驟(b)中分離的(S)-1-叔-丁氧基-2-丙醇脫烷氧基化以得到(S)-1，2-丙二醇；并且(d)分離步驟(c)中得到的(S)-1，2-丙二醇。
48.根據(jù)權利要求44所述的方法，進一步包括下列步驟(e)在溫和的反應條件下，存在對-甲苯磺酸酸催化劑時，將步驟(b)中分離的(R)-1-叔-丁氧基-乙酸基丙烷脫烷氧基化以得到(R)-1，2-丙二醇；并且(f)分離步驟(e)中得到的(R)-1，2-丙二醇。
49.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中所述的?；o體為外消旋的二醇醚乙酸酯，所說的方法包括將反應和副產(chǎn)物醇通過蒸餾或汽提而去除相結合。
全文摘要
二醇醚乙酸酯，特別是丙二醇烷基(或方劑)醚乙酸酯，可以在高基質濃度下，利用水解酶通過對映體選擇性的水解反應進行酶拆分；在一些實施例中，水解酶為脂肪酶。二醇醚，特別是丙二醇烷基(或芳基)醚，可以在?；o體存在的情況下，高基質濃度下利用水解酶通過對映體選擇性酯化轉移反應進行酶拆分；在一些實施例中，水解酶是一種脂肪酶。
文檔編號C12P41/00GK1656230SQ03806766
公開日2005年8月17日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權日2002年3月22日
發(fā)明者S·M·雷斯尼克, F·A·多納特, T·C·弗蘭克, T·C·塞因, P·福利 申請人:陶氏環(huán)球技術公司