專利名稱：具有改良的存活性質(zhì)的宿主細(xì)胞及該細(xì)胞的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)包括增加量的活性抗-細(xì)胞凋亡基因的遺傳工程處理的哺乳動物宿主細(xì)胞與產(chǎn)生此類細(xì)胞的方法。更特別地，本發(fā)明是關(guān)于調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)抗-細(xì)胞凋亡活性基因的量的方法；以及關(guān)于利用延遲/抑制此類細(xì)胞的自然發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡而顯示增加的細(xì)胞存活力的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
因為功能上與藥物動力學(xué)上相關(guān)的后翻譯修飾是與人類高度相容，故哺乳類細(xì)胞是生產(chǎn)大部分的復(fù)雜的蛋白質(zhì)治療藥物的優(yōu)選宿主。商業(yè)上相關(guān)的細(xì)胞型態(tài)包括雜交瘤、骨髓瘤、中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞與幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞。因為CHO的生長直接地適應(yīng)無血清/無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液，且考慮其為重要管制機(jī)構(gòu)的安全的生產(chǎn)宿主，故產(chǎn)業(yè)上使用愈來愈多的CHO衍生物。
在標(biāo)準(zhǔn)的生物醫(yī)藥生產(chǎn)方法-生物反應(yīng)器操作中，有相當(dāng)百分比的生產(chǎn)細(xì)胞群會在稱為細(xì)胞凋亡的遺傳決定的程序中死亡(Al-Rubeai等人，1998；Goswami等人，1999；Laken等人，2001)。已知細(xì)胞凋亡是因諸如血清缺乏、營養(yǎng)限制、氧氣限制與機(jī)械應(yīng)激的外源或內(nèi)生性信號的結(jié)果而活化的主動細(xì)胞自殺程序。細(xì)胞凋亡的特征為漿膜起泡、細(xì)胞體積喪失、細(xì)胞核回縮與在核體間隔的核酸內(nèi)切酶降解DNA(Wyllie等人，1980)。
經(jīng)辨識血清成分是主要有效的細(xì)胞凋亡保護(hù)劑。然而，不僅在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)內(nèi)，甚至，亦因藥物注冊的重要的管制機(jī)構(gòu)的推動，一直有強(qiáng)烈驅(qū)力來發(fā)展無血清與無蛋白質(zhì)的制造過程。主要原因在節(jié)省成本、蛋白純化時較少的干擾、并減少導(dǎo)入諸如感染性蛋白質(zhì)或病毒等病原的潛在性。然而，省略血清通常造成生產(chǎn)的細(xì)胞株對程序性細(xì)胞死亡敏感度增加，使細(xì)胞更易受培養(yǎng)的侵犯的傷害(Franek等人，1991；Goswami等人，1999；Moore等人，1995；Zanghi等人，1999)。因為蛋白產(chǎn)量主要為活的生產(chǎn)細(xì)胞群的函數(shù)，故成熟前的細(xì)胞死亡，例如藉細(xì)胞凋亡所致的細(xì)胞死亡，即表示有價值的來源的大量損失。愈能長久維持培養(yǎng)物中高密度的活的生產(chǎn)性細(xì)胞，因為每個生產(chǎn)過程的產(chǎn)率亦較高，其生產(chǎn)過程愈有效亦愈能獲利。在無血清時，細(xì)胞在到達(dá)最高細(xì)胞密度的固定生長期時會更快死，因此縮短生產(chǎn)期。因產(chǎn)物受凋亡細(xì)胞釋出的蛋白酶降解與收取時受多量的細(xì)胞碎片干擾，產(chǎn)率會進(jìn)一步減低。
為解決生產(chǎn)細(xì)胞株增加的細(xì)胞凋亡敏感度的困境，目前已開始多種生理的工程處理策略，特別是那些經(jīng)改變并完全培養(yǎng)于無血清條件的細(xì)胞株。其中的某些策略的焦點為，在模擬生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，減少/消減誘發(fā)內(nèi)生性的細(xì)胞凋亡-反應(yīng)程序。有一種方法是通過給食減輕營養(yǎng)物的損失(deZengotita等人，2000；Franek等人，1996；Mercille等人，1994；Sanfeliu等人，1999)。另一種方法的焦點為，使用細(xì)胞凋亡的抑制化合物添加劑以阻斷細(xì)胞凋亡反應(yīng)機(jī)制的主要效應(yīng)物(Mastrangelo等人，1999；Sanfeliu等人，2000；Simpson等人，1998；Zangli等人，2000)。一種替代策略代表遺傳方法。包括利用抗-細(xì)胞凋亡存活基因或遺傳工程處理的抗細(xì)胞凋亡決定物來處理細(xì)胞本身，所述決定物衍生自存活維持調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或病毒(Cotter等人，1995；Chung等人，1998；Fussenegger等人，2000；Mastrangelo等人，1998，2000a與2000b；Mercille等人，1999a與1999b；Pan等人，1998；Simpson等人，1999；Terada等人，1997；Tey等人，2000a與2000b)。
關(guān)于后者的策略，經(jīng)假設(shè)bcl-2與bcl-xL這兩種細(xì)胞凋亡抑制物，且是高度保守的促(pro-)-細(xì)胞凋亡(例如bad、bak、bax、bok、bcl-xS、bik、bid、hrk、bim、blk、bcl-y)與抗-細(xì)胞凋亡(例如bcl-2、bcl-xL、blc-w、bfl-1、al、mcl-1、boo、brag-1、nr-13、bhrf-1、ced 9、cdn-1、cdn-2、cdn-3)應(yīng)答調(diào)控基因的主要成員，是生物技術(shù)機(jī)構(gòu)中抗-細(xì)胞凋亡的工程操作的強(qiáng)力候選者。
經(jīng)顯示，Bcl-2可在回應(yīng)由同源-與異源-二聚化的促-與抗-細(xì)胞凋亡BCL-2型蛋白質(zhì)所組成的位于線粒體外膜的分子變阻器情形下，調(diào)節(jié)位于線粒體外膜的胱冬酶(caspase)-9-依賴型的細(xì)胞凋亡路徑的誘發(fā)。利用培養(yǎng)限制的對促-調(diào)亡(pro-apoptotic)亞家庭成員的偏向表達(dá)與內(nèi)生信號，造成Apaf-1-胱冬酶-9復(fù)合物的釋出與此含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶自動活化的情形，與細(xì)胞色素c由線粒體劇烈流至細(xì)胞質(zhì)相關(guān)。細(xì)胞凋亡控制機(jī)制在線粒體外膜組合其主要的部分，在抗細(xì)胞凋亡的工程操作的焦點上，可使這些細(xì)胞發(fā)電廠成為壓力感應(yīng)器，并且作為維持細(xì)胞凋亡過程的執(zhí)行者(Follstad等人，2000；Green等人，1998；Tsujimoto，1998)。
有些報告指出導(dǎo)源抗-細(xì)胞凋亡bcl-2基因的表達(dá)對適應(yīng)并培養(yǎng)于含胎牛血清的遺傳工程細(xì)胞株的存活/存活力與強(qiáng)健具正向效果。那些細(xì)胞包括骨髓瘤、雜交瘤、幼倉鼠腎臟細(xì)胞(BHK)與中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。有人說明BCL-2表達(dá)的正效果與諸如血清與葡萄糖缺乏、生長因子抽離或病毒感染的不同環(huán)境應(yīng)激相關(guān)(Fassnacht等人，1998；Figueroa等人，2001；Fussenegger等人，2000；Itoh等人，1995；Mastrangelo等人，2000a與2000b；Reynolds等人，1996；Simpson等人，1997，1998與1999；Tey等人，2000a與2000b)。
分別已有人說明以BCL-xL為基礎(chǔ)的代謝遺傳工程處理人T細(xì)胞與CD34+血球生成細(xì)胞(美國專利號碼6,143,291，WO 00/75291)。Fussenegger等人，1998還有Mastrangelo等人，2000a與2000b皆說明BCL-xL表達(dá)對倉鼠細(xì)胞存活的正效果。
然而，全部這些報告若非使用諸如人類T細(xì)胞與CD34+造血細(xì)胞的非生產(chǎn)性細(xì)胞株，即是使用已調(diào)適過并例行地培養(yǎng)在含血清條件的例如，倉鼠或小鼠細(xì)胞株的生產(chǎn)性細(xì)胞株；而且，甚至多數(shù)是附著細(xì)胞。研究血清抽離效果對表達(dá)異源BCL-2或BCL-xL的重組細(xì)胞的存活，并不包括數(shù)次傳代培養(yǎng)于無血清的培養(yǎng)液。反而，血清培養(yǎng)的細(xì)胞若非接種于完全無血清的培養(yǎng)液，即是血清含量減低的培養(yǎng)液；而且，還追蹤數(shù)天有關(guān)這些培養(yǎng)侵犯對批式培養(yǎng)的細(xì)胞存活效果。因為由血清內(nèi)的細(xì)胞凋亡保護(hù)劑制約的胞內(nèi)反應(yīng)仍持續(xù)，這種因血清抽離造成的培養(yǎng)侵犯的真正開始亦可能延遲。
只有少量實驗進(jìn)行相關(guān)的已適應(yīng)并恒定生長于無血清培養(yǎng)液的懸浮液的重組細(xì)胞株的生產(chǎn)。目前，這些條件是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)最喜愛者，但是同時細(xì)胞株更脆弱且更不強(qiáng)健。在Goswami等人1999的報告中，說明了表達(dá)γ-干擾素的CHO細(xì)胞培養(yǎng)在那些條件下的實驗。表達(dá)額外的異源BCL-2的培養(yǎng)物的存活有改善，但局限于批式培養(yǎng)7天后僅約40％的活細(xì)胞而已。沒有人知道BCL-xL表達(dá)對適應(yīng)并永久生長于無血清條件下的縮主細(xì)胞存活力/存活的效果。
由上述討論，很清楚地在生物技術(shù)機(jī)構(gòu)需要進(jìn)一步增加細(xì)胞存活力，尤其是已適應(yīng)無血清生長并夠格于無血清生產(chǎn)治療與診斷用的生物藥物的細(xì)胞株。于批式培養(yǎng)中，若能以高存活力延長細(xì)胞于固定期的存活，會明顯影響產(chǎn)率與成本效益，藉此生產(chǎn)期每額外增加一天都會帶來大貢獻(xiàn)。
在本發(fā)明中，我們提供策略以進(jìn)一步改善在無血清的培養(yǎng)液的懸浮液中恒定成長的生產(chǎn)細(xì)胞株的存活。該策略是根據(jù)遺傳工程處理的宿主細(xì)胞，以改善抗-細(xì)胞凋亡的作用性多肽的細(xì)胞內(nèi)含量。很驚訝地發(fā)現(xiàn)，抗-細(xì)胞凋亡的作用性基因的細(xì)胞內(nèi)含量可實質(zhì)改善細(xì)胞存活力，且對細(xì)胞生產(chǎn)力亦無任何負(fù)面效果。
發(fā)明概述經(jīng)顯示，非擴(kuò)增的異源導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因，例如BCL-2或BCL-xL，對適應(yīng)且通常生長于無血清和/或無蛋白質(zhì)條件的細(xì)胞的存活力/存活，僅有很小效果(參照圖5)。此發(fā)現(xiàn)已由Goswami等人1999的報告所支持?，F(xiàn)在，本發(fā)明說明/提供一個顯著改善宿主細(xì)胞存活力/存活的新方法，特別是對建立與培養(yǎng)于無血清條件下的宿主細(xì)胞。利用擴(kuò)增促成的過度表達(dá)來改善抗細(xì)胞凋亡作用性蛋白，例如BCL-xL或BCL-2的胞內(nèi)含量，可延遲/抑制細(xì)胞凋亡。本發(fā)明很驚訝發(fā)現(xiàn)，藉大量的過度表達(dá)諸如BCL-xL的抗細(xì)胞凋亡蛋白，不僅僅是未負(fù)面影響所需蛋白表達(dá)量的能進(jìn)一步改善存活力/存活的適當(dāng)工具而已。相反地，在BCL-xL過度表達(dá)的細(xì)胞，細(xì)胞生產(chǎn)力還增加(例如參照圖2與圖3)。因而，本發(fā)明提供新的遺傳修飾宿主細(xì)胞，特別是倉鼠或小鼠生產(chǎn)細(xì)胞株，而且還有生成這種創(chuàng)造性的生產(chǎn)細(xì)胞株的方法。只要能以非常充分方式改善目前的生產(chǎn)方法的經(jīng)濟(jì)活力，此發(fā)現(xiàn)對生產(chǎn)生物醫(yī)藥肽/蛋白將非常有利。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的大優(yōu)點在于其提供了將細(xì)胞存活力改善，蛋白生產(chǎn)過程的限制因子和蛋白的高產(chǎn)量相互聯(lián)系起來的方法。
因而，本發(fā)明提供具改善的存活性質(zhì)且非常適于生產(chǎn)生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)的遺傳工程處理的宿主細(xì)胞。該改善的存活性質(zhì)是基于細(xì)胞內(nèi)增加的抗細(xì)胞凋亡基因的量。優(yōu)選者為哺乳動物來源的宿主細(xì)胞、更優(yōu)選為小鼠雜交瘤/骨髓瘤或倉鼠細(xì)胞，尤其是已適應(yīng)且恒定培養(yǎng)于無血清和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明亦提供顯示增加的抗-細(xì)胞凋亡基因表達(dá)量的哺乳動物宿主細(xì)胞的產(chǎn)生方法，包括(i)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞群，其中該基因是可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的凋控序列，(ii)將該細(xì)胞群于至少可表達(dá)該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因和該細(xì)胞凋亡基因，且是有利于取得至少該抗-細(xì)胞凋亡基因的多拷貝數(shù)的條件下培養(yǎng)，以及(iii)由該細(xì)胞群選取至少摻入多拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因的細(xì)胞。
因而，本發(fā)明亦提供在宿主細(xì)胞表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的方法，包括(i)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞群，其中該基因是可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的調(diào)控序列，和(ii)將該細(xì)胞群于可表達(dá)該基因的條件下培養(yǎng)。
利用任何這些方法之一處理宿主細(xì)胞，可提供包括至少一種高拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明亦提供在任何根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白的方法，包括(i)在有利于抗-細(xì)胞凋亡基因與目的基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，和(ii)從細(xì)胞和/或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離目的蛋白。
最后，本發(fā)明還為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員提供了最早從倉鼠(黝倉鼠(Cricetulus griseus))分離的新的抗凋亡基因，以及該基因的幾種突變體。野生型和修飾后基因均可用于本文的任何創(chuàng)造性方法中，用來改善細(xì)胞生存力和細(xì)胞繁殖力。此外，本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)，該蛋白由這些新的抗凋亡基因中的任何一種編碼。
附圖簡述

圖1圖示供轉(zhuǎn)染CHO-DG44細(xì)胞的表達(dá)載體設(shè)計。P/E意指含增強(qiáng)子與啟動子元件的組合單位，P為啟動子元件而T為被轉(zhuǎn)錄的信使RNA聚腺苷酸化所需的轉(zhuǎn)錄終止位置。sICAM意指目的基因，而bcl-2與bcl-xl指抗細(xì)胞凋亡基因。dhfr意指可擴(kuò)增的選擇用標(biāo)記二氫葉酸還原酶。箭頭指示轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始位置。
圖2比較短暫轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后48小時的表達(dá)情形。圖2A的pBID-sICAM、圖2B的pSEAP2-對照組(Clontech，Palo Alto，CA)與圖2C的pGL2-對照組(Promega，Madison，WI)是經(jīng)pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL或?qū)φ战MpBID轉(zhuǎn)染。
圖3顯示經(jīng)pBID-sICAM與pBID、pBID-bcl-2或pBID-blc-xL共轉(zhuǎn)染、選取與培養(yǎng)于無黃嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的CHO-DG44的穩(wěn)定混合群sICAM的表達(dá)情形。每個值都是經(jīng)過3天培養(yǎng)期間的5次傳代的6個混合群的平均sICAM產(chǎn)量。
圖4評估克隆的細(xì)胞株HMNI-1/2(經(jīng)pBID-sICAM與pBID共轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞)、HMNIBC-1/2(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-2共轉(zhuǎn)染)與HMNIBX-1/2(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-xL共轉(zhuǎn)染)于7天批式培養(yǎng)期使用臺盼藍(lán)染料排除的存活力。選取重組的CHO-DG44細(xì)胞并培養(yǎng)于無黃嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
圖5顯示使用臺盼藍(lán)染料排除的存活力百分比情形，氨甲喋呤擴(kuò)增的細(xì)胞克隆HMNI-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID共轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞株)、HMNIBC-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-2共轉(zhuǎn)染)與HMNIBX-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-xL共轉(zhuǎn)染)于9天批式培養(yǎng)于無黃嘌呤/胸苷，但含20毫微摩爾濃度的MTX的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
圖6顯示表達(dá)BCL-2或BCL-xL的氨甲喋呤擴(kuò)增的CHO-DG44細(xì)胞克隆的細(xì)胞凋亡特征。使用熒光為基礎(chǔ)的TUNEL分析(BD BiosciencesPharMingen，San Diego，CA)，于第2、4與6天時評估HMNI-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID共轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞株)、HMNIBC-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-2共轉(zhuǎn)染)與HMNIBX-3/4(經(jīng)pBID-sICAM與pBID-bcl-xL共轉(zhuǎn)染)的批式培養(yǎng)于無黃嘌呤/胸苷，但含20毫微摩爾濃度的MTX的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的凋零細(xì)胞百分比。
圖7顯示BCL-2與BCL-xL在不同重組的CHO-DG44細(xì)胞克隆的Western印跡分析結(jié)果。其比較BCL-2(圖7A)與BCL-xL(圖7B)在未擴(kuò)增(BCL-2HMNIBC-1/2；BCL-xLHMNIBX-1/2)或擴(kuò)增(BCL-2HMNIBC-3/4；BCL-xLHMNIBX-3/4)的表達(dá)單順反子構(gòu)型的抗-細(xì)胞凋亡基因的細(xì)胞品系的表達(dá)?？?細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)是與親代(CHO-DG44)且僅生產(chǎn)-sICAM(HMNI-1)的對照組的細(xì)胞株做比較。蛋白質(zhì)是利用購自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的具BCL-2或BCL-xL特異性的小鼠單株抗體與抗-小鼠過氧化酶偶合的第二抗體(Dianova GmbH，Hamburg，Germany)來檢測。
圖8顯示以Mito Tracker為基礎(chǔ)的培養(yǎng)于有或無血清的CHO-DG44的線粒體含量的定量(Molecular Probes，Eugene，OR)。FACS介導(dǎo)的線粒體計數(shù)是對培養(yǎng)于含10％血清(灰線)與不含血清(黑線)的CHO-DG44細(xì)胞進(jìn)行的。
圖9顯示了新倉鼠bcl-Xl基因(SEQ ID NOS3和4)的核苷酸序列以及預(yù)期的開放閱讀框架。所述核苷酸序列代表一種合成序列，其中5’和3’未翻譯區(qū)自基因組克隆和cDNA克隆的編碼區(qū)獲得。
圖10圖示了真核表達(dá)載體設(shè)計。P/E表示含有增強(qiáng)子和啟動子元件的合成單位，P是啟動子元件，T是轉(zhuǎn)錄的信使RNA多核苷酸化所需的轉(zhuǎn)錄終止位點。bcl-xL指倉鼠抗凋亡bcl-xL cDNA，而dhfr指可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記二氫葉酸還原酶。箭頭表明了轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始位點。
圖11圖示了產(chǎn)生倉鼠Bcl-xL缺失突變體的總體克隆策略。表達(dá)載體pBID/Bcl-xL編碼倉鼠Bcl-xL野生型cDNA，在PCRs中作為模板。使用載體特異的引物1(VSP1)和基因特異性引物del26，del46或del66的組合物產(chǎn)生缺失突變體的各種5’末端。為進(jìn)行亞克隆，使用Not I和位于啟動子/增強(qiáng)子(P/E)區(qū)內(nèi)的SnaB I消化PCR產(chǎn)物(黑色箭頭)，Not I中通過基因特異的引物新引入了限制性酶切位點。使用載體特異的引物2(VSP2)和基因特異性引物del63或del83的組合物產(chǎn)生缺失突變體的各種3’末端。使用位于基因特異引物序列內(nèi)的Not I和終止子區(qū)(T)上游的EcoR I消化得到的PCR產(chǎn)物(黑色箭頭)。為構(gòu)建含有倉鼠bcl-xL cDNA缺失突變體(pBID/bcl-xL del)的表達(dá)載體，將5’和3’cDNA片段直接克隆到SnaB I/EcoR I消化的載體pBID中。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供經(jīng)導(dǎo)入編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇性的擴(kuò)增用的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列而遺傳修飾的宿主細(xì)胞。在一優(yōu)選具體實施方案中，該抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇性的擴(kuò)增用的標(biāo)記基因與目的基因，可操作地連接于至少一個允許這些基因表達(dá)的調(diào)控序列。在一個更優(yōu)選的實施方式中，所述抗凋亡基因，選擇性標(biāo)記基因和目的基因可操作地連接于僅一個啟動子序列，使得所述基因共表達(dá)。在本發(fā)明的另一實施方案中，該抗凋亡基因，選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因可操作地連接于僅一個啟動子序列，使得所述基因共表達(dá)。在另一具體實施方案中，該宿主細(xì)胞的遺傳修飾包括導(dǎo)入一種以上的抗-細(xì)胞凋亡基因。
以此方式修飾的宿主細(xì)胞，允許抗-細(xì)胞凋亡基因與選擇性擴(kuò)增用的標(biāo)記以及視情形的目的基因共表達(dá)。選擇性擴(kuò)增用的標(biāo)記，不僅使我們可穩(wěn)定選取轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞克隆，亦可擴(kuò)增抗-細(xì)胞凋亡基因。本發(fā)明顯示，擴(kuò)增抗-細(xì)胞凋亡基因，提供達(dá)成抗-細(xì)胞凋亡作用性蛋白的細(xì)胞內(nèi)含量更有效的方法；與未擴(kuò)增任何抗-細(xì)胞凋亡蛋白編碼序列者比較，可有效改善宿主細(xì)胞的存活。因為延遲或抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的程序性的細(xì)胞死亡，例如細(xì)胞凋亡所強(qiáng)化的細(xì)胞存活，為根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的宿主細(xì)胞的特征。很驚訝地發(fā)現(xiàn)，經(jīng)任何的本發(fā)明方法修飾的宿主細(xì)胞群，是經(jīng)培養(yǎng)至少9天，其中細(xì)胞的總存活率至少為約50％(亦參照圖5)。8天批式培養(yǎng)后，根據(jù)本發(fā)明生成的宿主細(xì)胞的存活力至少可達(dá)60％。在本發(fā)明的進(jìn)一步具體實施方案中，7天的批式培養(yǎng)后細(xì)胞的存活力至少可達(dá)約75％。在另一個具體實施方案中，6天的批式培養(yǎng)后細(xì)胞的存活力至少可達(dá)約85％。本領(lǐng)域無法得知存活力的相等水平，至少對無血清的培養(yǎng)，尤其是一直培養(yǎng)在無血清條件下的細(xì)胞，和/或與生物醫(yī)藥的無血清生產(chǎn)相關(guān)聯(lián)者是如此。本領(lǐng)域所述的存活力經(jīng)7天批式培養(yǎng)后，限制于40％(Goswami等人，1999)。因而，據(jù)此所確定特征的宿主細(xì)胞是本發(fā)明范圍所涵蓋。
“細(xì)胞存活力”或“細(xì)胞存活”是目標(biāo)細(xì)胞持續(xù)活著并表達(dá)功能的能力，且包括因抑制或延遲細(xì)胞凋亡或自然細(xì)胞死亡而保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞死亡。細(xì)胞存活力或細(xì)胞存活的測定方法是本領(lǐng)域所熟知。例如，細(xì)胞存活力可利用相差顯微鏡、熒光顯微鏡或使用諸如臺盼藍(lán)、碘化丙錠或碘化丙錠/吖啶橙的組合等非細(xì)胞滲透性染料的流式細(xì)胞計數(shù)儀來測定。這些方法在Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.，更新版，都以實例說明，其全文納入此文供參考。
術(shù)語“一直培養(yǎng)在無血清條件下”不僅指在無血清條件下進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)，還包括細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過增加細(xì)胞數(shù)目的細(xì)胞擴(kuò)增以及細(xì)胞儲存，例如儲存于液氮中。
因而，本發(fā)明亦是有關(guān)抑制或延遲宿主細(xì)胞死亡的方法，包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如上述的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于至少有一種抗-細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的條件，并可抑制或延遲該宿主細(xì)胞的死亡。在一優(yōu)選具體實施方案中，該細(xì)胞的細(xì)胞死亡是由程序化的細(xì)胞死亡，更優(yōu)選是因細(xì)胞凋亡所造成。
本發(fā)明亦提供顯示增加的表達(dá)量的抗細(xì)胞凋亡基因的哺乳動物宿主細(xì)胞的產(chǎn)生方法，包括(i)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞群，其中該基因是可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的調(diào)控序列，(ii)將該細(xì)胞群于至少可表達(dá)該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因和該抗-細(xì)胞凋亡基因，且是有利于取得至少該抗-細(xì)胞凋亡基因的多拷貝數(shù)的條件下培養(yǎng)，以及(iii)由該細(xì)胞群選取至少摻入多拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因的細(xì)胞。優(yōu)選將至少抗凋亡和選擇性可擴(kuò)增的標(biāo)記基因置于空間緊鄰位置，使得抗凋亡基因的擴(kuò)增更有效。因此在上述優(yōu)選的實施方案的方法中，至少抗凋亡和選擇性可擴(kuò)增基因由相同的DNA分子編碼，例如如果兩個基因均位于相同的表達(dá)載體上，并因此共同引入宿主細(xì)胞中。在該方法更優(yōu)選的實施方案中，該抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因的表達(dá)例如通過使用共同的啟動子可操作地相互連接，使得所述基因共表達(dá)。
在更有選地實施方案中，該抗凋亡基因，選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因和目的基因由僅一個DNA分子編碼，例如如果所有這些基因被置于相同的表達(dá)載體上，并將共同被引入所述的宿主細(xì)胞中。在更有選地實施方案中，該抗凋亡基因，選擇性可擴(kuò)增基因和目的基因不僅只由一種DNA分子編碼，還可操作地連接于僅一個啟動子序列以使所述基因共表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的任何方法基因修飾的宿主細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染以及非擴(kuò)增的親代細(xì)胞比較，顯示增加的抗-細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。“親代細(xì)胞”意指未顯示增加的抗-細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的細(xì)胞；而且，通常與根據(jù)本發(fā)明的例如，導(dǎo)入與擴(kuò)增編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列的基因修飾細(xì)胞，生長在相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的條件?！翱?細(xì)胞凋亡蛋白的增加的表達(dá)”意指例如，過度表達(dá)，亦即，與未根據(jù)本發(fā)明的任何修飾的方法比較，例如，藉由導(dǎo)入和擴(kuò)增編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列加以修飾的宿主細(xì)胞，該蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量至少增加30倍，以至少增加50倍優(yōu)選，以增加至少100倍更佳。
因而，本發(fā)明亦提供經(jīng)本文所述的任何方法基因修飾，并顯示過度表達(dá)的抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞；亦即，與未根據(jù)本發(fā)明的任何修飾的方法比較，該基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)量至少增加約30倍。在進(jìn)一步的具體實施方案中，本發(fā)明亦關(guān)于與未經(jīng)本發(fā)明修飾的細(xì)胞比較，其過度表達(dá)量至少顯示增加50倍的宿主細(xì)胞。在另一具體實施方案中，本發(fā)明提供與未經(jīng)本發(fā)明揭示方式所修飾的細(xì)胞比較，其過度表達(dá)量至少顯示增加約100倍的宿主細(xì)胞。圖7以實例說明由本發(fā)明方法產(chǎn)生的宿主細(xì)胞可達(dá)到的表達(dá)量。將本發(fā)明方法應(yīng)用于宿主細(xì)胞的修飾過程，例如，進(jìn)一步增加抗-細(xì)胞凋亡基因的拷貝數(shù)，可進(jìn)一步增加抗-細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)量。將一或多種抗-細(xì)胞凋亡基因的多拷貝導(dǎo)入宿主細(xì)胞亦是可了解的。
在本發(fā)明意義的“宿主細(xì)胞”或“目標(biāo)細(xì)胞”為倉鼠細(xì)胞，優(yōu)選者為BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1與CHO-DG44細(xì)胞或任何此類細(xì)胞株的衍生物/子代。尤其優(yōu)選者為CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1與BHK21，甚至更優(yōu)選者為CHO-DG44與CHO-DUKX細(xì)胞。在進(jìn)一步的具體實施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞亦指小鼠骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選者為NS0與Sp2/0細(xì)胞或任何此類細(xì)胞株的衍生物/子代。在本發(fā)明意義可使用的小鼠與倉鼠細(xì)胞的實例總結(jié)于表1中。然而，這些細(xì)胞，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、猴子與嚙齒類細(xì)胞株的其它哺乳類細(xì)胞，或包括但不限于酵母菌、昆蟲與植物細(xì)胞的真核細(xì)胞的衍生物/子代，亦可做為本發(fā)明的意義上的宿主細(xì)胞使用，特別是用于生產(chǎn)生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)。
表1倉鼠與小鼠生產(chǎn)細(xì)胞株

建立、適應(yīng)后，宿主細(xì)胞最好能完全培養(yǎng)于無血清條件，且視情形是在無任何動物來源的蛋白質(zhì)/肽的培養(yǎng)液中。市售培養(yǎng)液諸如Ham′sF12(Sigma，Deisenhofen，Germany、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium(DMEM；Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM；Sigma)、Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-Invtirogen、無血清的CHO Medium(Sigma)與無蛋白的CHO Medium(Sigma)俱為適當(dāng)營養(yǎng)溶液的范例。任何的這些培養(yǎng)液，必要時皆需補(bǔ)充一些化合物，例如激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂、磷酸鹽)、緩沖液(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它相當(dāng)?shù)哪芰縼碓?、抗生素、微量元素等。亦得包括任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它適當(dāng)濃度的必要補(bǔ)充物。在本發(fā)明使用無血清的培養(yǎng)液優(yōu)選，但補(bǔ)充適當(dāng)量血清的培養(yǎng)液亦可做為培養(yǎng)宿主細(xì)胞之用。為培養(yǎng)與選取表達(dá)選擇用的基因的遺傳修飾細(xì)胞，我們在培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)倪x擇藥劑。
為改善宿主細(xì)胞存活力，最好是如上述的生產(chǎn)細(xì)胞的存活力，本發(fā)明亦涉及高水平表達(dá)的bcl-2超家族抗-細(xì)胞凋亡基因。因而，編碼bcl-2超家族的基因適于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。因此，利用導(dǎo)入編碼bcl-2超家庭基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，亦為本發(fā)明意義所涵蓋。表2中列出抑制或延遲程序性的細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡的屬于bcl-2超家庭成員的實例。哺乳動物、線蟲(C.elegans)或病毒來源的此家族的多數(shù)蛋白，具有與細(xì)胞凋亡抑制劑，BCL-2(BCL-2類似物區(qū)域BH1-BH4)相似的2-4個區(qū)域的延長的氨基酸序列。這些均為進(jìn)行本發(fā)明的抗細(xì)胞凋亡基因/蛋白質(zhì)的適當(dāng)候選物。
本發(fā)明的進(jìn)一步具體實施方案以細(xì)胞為優(yōu)選，其存活是藉導(dǎo)入編碼BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9的核酸序列而延長。在一更佳的具體實施方案中，該編碼本發(fā)明的抗-細(xì)胞凋亡基因的核酸序列為脊椎動物的DNA分子。優(yōu)選的脊椎動物為哺乳動物。更優(yōu)選，本發(fā)明的核酸序列編碼名為BCL-xL或BCL-2的多肽。以BCL-xL編碼基因最佳。在更優(yōu)選的實施方案中，編碼BCL-Xl的核酸序列從倉鼠，優(yōu)選黝倉鼠中分離。亦佳者為具有SEQ ID NO1(與GenBank AccessionNumber Z23115一致)或SEQ ID NO2(與GenBank Accession Number M13995一致)，SEQ IDNO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，或SEQ ID NO11序列的核酸，其中SEQ ID NO3最早從倉鼠分離，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9，和SEQ ID NO11是SEQ ID NO3的核酸序列的修飾變體。最佳者為SEQ ID NO1。由其它脊椎動物編碼的任何這些基因的同系物，亦適于進(jìn)行本發(fā)明。而且，亦佳者為編碼任何表2的抗-細(xì)胞凋亡基因的核苷酸序列，特別是具有表2所引的任何GenBank Accession Number的序列?？?細(xì)胞凋亡作用基因的實例亦可參照美國專利6,303,331、5,834,309和6,646,008以及WO 95/006342，其并列入本文供參考。亦可參考Boise等人，Cell 74，597-608，1993。WO 95/006342以實例說明如何分離BCL-xL編碼序列。
編碼抗-細(xì)胞凋亡蛋白的核酸序列意欲包括任何不論在體外或?qū)⒕幋a序列導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞后會轉(zhuǎn)錄與翻譯成-細(xì)胞凋亡蛋白的核酸序列。該抗-細(xì)胞凋亡蛋白編碼序列可為天然(野生型)基因和自然產(chǎn)生(經(jīng)自發(fā)突變)的基因，或重組的遺傳工程的突變體與變體、截短物與片段、功能性等效物、衍生物、同系物與自然產(chǎn)生或野生型蛋白的融合物；只要編碼的多肽的生物功能活性，即抗細(xì)胞凋亡功能維持，且未實質(zhì)改變即可。優(yōu)選的編碼多肽與相應(yīng)的野生型抗-細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)比較，至少具有50％，更優(yōu)選為至少具有80％，益佳者為至少具有100％或更多的功能性生物活性?！耙吧偷鞍住币庵竿暾?、未切短、未修飾、自然產(chǎn)生的編碼多肽的等位基因。
抗-細(xì)胞凋亡多肽的“功能性生物活性”可經(jīng)由對表達(dá)該特定多肽的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的定量細(xì)胞凋亡分析來確定，其例諸如TUNEL分析、Annexin V分析、利用熒光顯微鏡的吖啶橙/溴化乙錠染色或碘化丙錠/吖啶橙染色、或流式細(xì)胞計數(shù)分析或其它分析。這些分析為本領(lǐng)域所熟知且其說明可參照例如Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.，更新版。
術(shù)語“功能性生物活性”或“功能性生物活性片段”指具有抗凋亡肽的功能性生物活性的多肽或片段。意思是與相應(yīng)的野生型抗凋亡蛋白相比，功能性生物活性多肽或功能性生物活性片段具有至少50％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少100％或者更多功能性生物活性。
利用本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點突變或聚合酶鏈反應(yīng)介導(dǎo)的突變，可制備該修飾的核酸序列。在本發(fā)明中，特佳的bcl-xL核酸序列為分離的SEQ ID NO1(與GenBank Accession Number Z23115一致)，SEQ IDNO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的多聚核苷酸。本發(fā)明還包括與那些序列以及任何其它BCL-xL編碼序列功能上相當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?，包括那些核酸的重組改造的突變體和變體，截短的序列和片段，功能對等物，衍生物，同源物和融合物。。在一優(yōu)選具體實施方案中，該編碼BCL-xL的蛋白質(zhì)為人類來源的；在一更佳的具體實施方案其是起源于倉鼠。
在本文中，編碼倉鼠Bcl-xL同源基因的核酸第一次被鑒定并也由本發(fā)明提供。分離的倉鼠bcl-xl基因是一種核酸物質(zhì)，具有SEQ ID NO3，該基因從黝倉鼠中分離并從中克隆。將使用該序列或其任何功能片段，變體或突變體(簡并性或非簡并性)編碼的抗凋亡蛋白，通過抑制或延緩凋亡來延長細(xì)胞生存的方法是本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案。然而，編碼其它物種的BCL-xL的核酸序列亦為本發(fā)明的意義所涵蓋。
BCL-xL蛋白質(zhì)是bcl-x基因所編碼。已知人bcl-xl基因產(chǎn)生兩種不同的RNA分子，其一編碼BCL-xL(長型)另一個編碼BCL-xS(短型)。BCL-xS缺少BCL-xL的一段63個氨基酸。經(jīng)顯示BCL-xS有助于細(xì)胞凋亡。因而使用cDNA，而非基因組片段表達(dá)BCL-xL優(yōu)選。在另一優(yōu)選具體實施方案中，其涵蓋改善的抗-細(xì)胞凋亡性質(zhì)的BCL-xL突變體或BCL-2突變體，例如刪除BH3與BH4保守區(qū)間的非保守區(qū)域，因此增加突變的蛋白質(zhì)變體的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(Chang等人，1997；Figueroa等人，2001)。
本發(fā)明提供的另一優(yōu)選實施方案中，修飾的倉鼠bcl-xL基因的變體，尤其是上述SEQ ID NO3編碼的倉鼠bcl-xL基因。這種修飾的變體包括但不限于具有以下序列的核酸分子SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或其任何功能性變體或突變體(簡并性或非簡并性)。
“功能突變體”包括但不限于具有與上述任何一種核酸序列至少95％，優(yōu)選96％，更優(yōu)選97％，更加優(yōu)選98％和最優(yōu)選99％的同源性的DNA分子。突變可由插入，替代和/或缺失原始核酸序列的一個或多個核苷酸造成。術(shù)語“功能突變體”也包括上述核酸分子的任何功能性生物活性片段，缺失或插入突變體，其與這些分子的任一種或者至少與這些分子的功能片段具有至少95％，優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少97％，更優(yōu)選至少98％，最優(yōu)選至少99％的同源性。術(shù)語“功能突變體”還包括上述核酸分子的任何功能性生物活性片段，缺失或插入突變體，其中這些片段的生物活性部分顯示與倉鼠bcl-xL基因的生物活性部分至少95％，優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少97％，更優(yōu)選至少98％，最優(yōu)選至少99％的同源性。
“功能片段”也指DNA分子，其編碼倉鼠bcl-xL基因的功能活性部分，尤其是具有SEQ ID NO3的序列的核酸的片段。優(yōu)選倉鼠bcl-xL基因的功能片段的實例是具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ IDNO11的序列的核酸分子。
“功能變體”包括在嚴(yán)格的條件下與具有上述任何序列的核酸雜交的核酸分子，例如具有SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的序列，并編碼功能性生物活性的倉鼠bcl-xL基因的核酸。術(shù)語“變體”通常指多核苷酸的另一種形式，它具有一個或多個核苷酸取代，缺失或插入，而基本不改變編碼的多肽的功能。
“簡并突變體”通常指具有不同的核酸序列但編碼具有相同氨基酸序列的多肽的DNA分子。意思是，任何編碼特定多肽的核酸是其簡并突變體，該多肽具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的任一序列編碼的氨基酸序列。
根據(jù)上文所述，本發(fā)明還提供了包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，其中的核酸選自(a)具有SEQ ID NO3的序列的核酸或其互補(bǔ)序列；(b)(a)中定義的核酸序列的功能片段，變體或突變體(簡并或非簡并性)；(c)與(a)中定義的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸和；(d)與(a)，(b)或(c)中定義的任一核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。本發(fā)明還提供了包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，其中的核酸選自(a)具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的序列的核酸或其互補(bǔ)序列；(b)(a)中定義的核酸序列的功能片段，變體或突變體(簡并或非簡并性)；(c)與(a)中定義的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸和；(d)與(a)，(b)或(c)中定義的任一核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還涉及包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，所述核酸具有SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的序列。
上述那些DNA序列中的任一種編碼的蛋白導(dǎo)致倉鼠BCl-xL蛋白的穩(wěn)定形式增強(qiáng)或降低。本文所述在任何創(chuàng)造方法中使用一種或多種這些倉鼠BCl-xL突變體，通過抑制或延緩凋亡來延長細(xì)胞生存是本發(fā)明一個高度優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明因此還涉及一種多肽，所述多肽由上述編碼功能性生物活性bcl-xL基因的核酸序列的任何一種編碼。
表2bcl-2超家族的抗-細(xì)胞凋亡基因

本文所用的“核酸序列”意指寡核苷酸、核苷酸或多聚核苷酸或其片段或部分，且涵蓋基因組來源或合成的DNA或RNA，其可為單鏈或雙鏈并可代表有意義鏈與反義鏈。本發(fā)明的多聚核苷酸包括其中一個或多個密碼子已經(jīng)由其同義物所取代的核酸區(qū)域。另外包括具有編碼序列的多聚核苷酸，其為編碼序列的自然發(fā)生的等位基因變體，例如SEQ ID NO1，SEQID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQID NO11的編碼序列變體。如本領(lǐng)域所知，等位基因變體為多聚核苷酸的替代型，其可能有實質(zhì)上不改變編碼的多肽的功能的一個或多個核苷酸的取代、刪除或插入。多肽的功能通常由該編碼多肽的功能性生物活性所決定。因而，實質(zhì)上不改變編碼的多肽的功能，意指與對應(yīng)的野生型編碼的多肽比較，該編碼的多肽的功能性生物活性水平至少是50％，更優(yōu)選為至少是80％，益佳者為至少是100％或更多。
“編碼”的用語意指核酸中核苷酸的特定序列，諸如在染色體中的基因或mRNA的固有性質(zhì)，其是做為合成在生物過程中的其它聚合物與巨分子的模版。所述聚合物或巨分子具有確定的核苷酸(亦即rRNA、tRNA、其它RNA分子)或氨基酸序列及所述基因或mRNA所帶來的生物特性。因此，若一個基因生成的mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯生成細(xì)胞中或其它系統(tǒng)的蛋白，則該基因即編碼該蛋白質(zhì)。無論是其核苷酸序列與mRNA序列一致，且通常在序列表中提供的編碼鏈，還是做為基因或cDNA翻譯的模版的非編碼鏈，皆可認(rèn)為能編碼該基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。因為遺傳密碼的簡并性，編碼蛋白質(zhì)的核酸包括任何具有不同核苷酸序列，但是編碼該蛋白質(zhì)的相同氨基酸序列的核酸。編碼蛋白質(zhì)的核酸與核苷酸序列可包括內(nèi)含子。
在本文中“cDNA”的用語意指由逆轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的脫氧核糖核苷酸，而且通常是mRNA或基因生成的其它RNA的第二鏈所合成。若為雙鏈，則cDNA分子具有編碼或意義鏈或非編碼或反義鏈。
通常如本文所用者，大寫字母(例如BCL-xL)意指多肽(例如基因表達(dá)的產(chǎn)物)；而小寫字母(例如bcl-xL)意指聚核苷酸(例如基因)。此外，在此專利說明書通篇中，除非有其它說明，單數(shù)型“一個”與“該”皆包括復(fù)數(shù)型。
“多肽”的用語與氨基酸殘基序列或蛋白質(zhì)交互使用，并意指任何長度的氨基酸聚合物。這些用語亦包括經(jīng)由反應(yīng)的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，這些反應(yīng)包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化或蛋白質(zhì)加工?？稍诙嚯慕Y(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾與改變，例如與其它蛋白質(zhì)融合、氨基酸序列取代、刪除或插入，同時維持分子的生物性功能活性。例如，可在多肽或其對應(yīng)的核酸編碼序列，做某些氨基酸序列的取代，而且可得具類似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。如上述，優(yōu)選的蛋白質(zhì)為由SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何功能片段，變體或突變體(簡并和非簡并性)的核酸序列編碼的BCL-xL蛋白質(zhì)序列。藉由對其對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行定點突變或聚合酶鏈反應(yīng)介導(dǎo)的突變而生成，可制備利用氨基酸的親水/疏水(hydropathic)指數(shù)(Kyte等人，J.Mol.Biol.157105-132，1982)提供功能性相當(dāng)?shù)腂CL-xL多肽的氨基酸取代。
如上述，本發(fā)明涉及有關(guān)遺傳修飾的宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生此種宿主細(xì)胞的方法。在一個具體實施方案中，該宿主細(xì)胞包括異源引入的編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的聚核苷酸序列。“選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因”具有選擇用標(biāo)記基因的性質(zhì)，但當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于適當(dāng)條件時，另外允許擴(kuò)增(亦即，生成該基因的另外拷貝，該基因可以以染色體內(nèi)(intra-chromosomal)或染色體外(extra-chromosomal)的型式存活)基因本身與鄰近該選擇用的可擴(kuò)增的基因的基因。本發(fā)明特別提供宿主細(xì)胞，不僅包括一個拷貝數(shù)的導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因，亦包括多拷貝數(shù)的該抗-細(xì)胞凋亡基因，例如超過5，10，20，50或100個拷貝數(shù)的導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因。
這種宿主細(xì)胞，例如可經(jīng)由包括下列的方法取得(i)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞群，其中該基因是可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的凋控序列，(ii)將該細(xì)胞群培養(yǎng)于至少可表達(dá)該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與該抗-細(xì)胞凋亡基因，且是有利于取得至少該抗-細(xì)胞凋亡基因的多拷貝數(shù)的條件，以及(iii)由該細(xì)胞群選取至少摻入多拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因的細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選至少將抗凋亡和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因放置在空間鄰近的位置上使得該抗凋亡基因的擴(kuò)增更有效。因此，本文方法優(yōu)選的實施方案中，至少抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因是相同的DNA分子編碼的，例如兩個基因均位于相同的表達(dá)載體上，并因此被共同引入宿主細(xì)胞。在該方法更優(yōu)選的實施方案中，例如通過使用共同的啟動子將該抗凋亡基因和選擇性擴(kuò)增標(biāo)記基因的表達(dá)可操作地相互連接，使得所述基因共表達(dá)。
以此方式生成的宿主細(xì)胞包括，例如至少5個拷貝數(shù)的摻入的異源性抗-細(xì)胞凋亡基因。在進(jìn)一步的具體實施方案中，該宿主細(xì)胞包括，例如至少10個拷貝數(shù)的摻入的異源性抗-細(xì)胞凋亡基因。在另一個具體實施方案中，可得包括至少50個導(dǎo)入的拷貝數(shù)的異源性抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的具體實施方案中，該宿主細(xì)胞包括，例如至少100個拷貝數(shù)的摻入的異源性抗-細(xì)胞凋亡基因。適當(dāng)?shù)目?細(xì)胞凋亡基因是那些以上所述的凋亡基因，特別是那些表2所列者，例如編碼本文所述BCL-xL多肽的任何基因。
通常本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選者是包括，其拷貝數(shù)允許其表達(dá)量足夠高至能經(jīng)由抑制或延遲程序性的細(xì)胞死亡，而增強(qiáng)細(xì)胞群存活的抗-細(xì)胞凋亡基因。更優(yōu)選為，宿主細(xì)胞不僅包括允許改善細(xì)胞存活的拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因，亦顯示同樣由遺傳修飾的宿主細(xì)胞編碼的高量表達(dá)的目的基因。對熟諳本領(lǐng)域者而言，發(fā)現(xiàn)具有減少細(xì)胞凋亡率的最高效果，而不劇烈造成細(xì)胞生長率減少或遺傳不穩(wěn)定性，并且對目的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率亦無負(fù)面影響的抗-細(xì)胞凋亡基因的最高可容許表達(dá)量的方法，是已知的。其包括但不限于，例如產(chǎn)生生長曲線、利用測定非滲透性染料的排除而經(jīng)顯微鏡或流式細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞存活力、藉TUNEL或Annexin V分析定量細(xì)胞凋亡、由ELISA決定產(chǎn)品滴定度并經(jīng)數(shù)次傳代由Southern雜交或斑點印跡雜交或定量PCR評估轉(zhuǎn)染基因的遺傳穩(wěn)定性。
在本發(fā)明中，若抗-細(xì)胞凋亡基因，例如bcl-xL基因的表達(dá)量與親代、非擴(kuò)增細(xì)胞比較，達(dá)到編碼多肽的胞內(nèi)存活的有效濃度，例如即達(dá)到充分增加的細(xì)胞存活。充分增加的細(xì)胞存活的提供是例如，當(dāng)該bcl-xL基因或任何其它抗-細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)量與親代細(xì)胞群比較，致使細(xì)胞群于培養(yǎng)6、7、8或9天后至少增加約20％的存活。更優(yōu)選為與親代細(xì)胞群比較，于培養(yǎng)6、7、8或9天后細(xì)胞存活至少增加約30％，益佳者為至少增加約50％。培養(yǎng)期9天后，當(dāng)至少約50％的培養(yǎng)細(xì)胞存活時，亦達(dá)到了足夠的細(xì)胞存活。若抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL，于培養(yǎng)9天后，當(dāng)至少約60％的細(xì)胞存活時，亦達(dá)到了足夠的細(xì)胞存活。在一個具體實施方案中，當(dāng)培養(yǎng)9天后至少約60％的細(xì)胞群存活時，其亦達(dá)到了充分增加的細(xì)胞存活。在進(jìn)一步的具體實施方案中，當(dāng)培養(yǎng)7天后至少約75％的細(xì)胞群存活；甚至，若培養(yǎng)6天后至少約85％的細(xì)胞存活時，其即達(dá)到了充分增加的細(xì)胞存活。
“選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因”通常是編碼真核細(xì)胞在那些條件下生長所需的酶。例如，該選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因可編碼DHFR，該基因是在轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞生長于選擇性藥劑，氨甲喋呤(MTX)條件下所擴(kuò)增。表3的非限制性實例選擇用基因亦為可擴(kuò)增的標(biāo)記基因，其可用以實現(xiàn)本發(fā)明。為回顧表3所列的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因，請參照Kaufman，Methods inEnzymology，185537-566(1990)，其納入本文供參考。據(jù)此，根據(jù)本文所述任何方法的遺傳修飾宿主細(xì)胞皆為本發(fā)明所涵蓋，其中該選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼具有二氫葉酸還原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脫氨酶、腺苷酸脫氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脫氫酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸還原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鳥氨酸脫羧酶、HMG CoA還原酶、乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶的功能的多肽。
優(yōu)選的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因為編碼嘌呤合成所必須的二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因。缺少DHFR基因的細(xì)胞在無嘌呤的培養(yǎng)基無法生長。因而，DHFR具有選取并擴(kuò)增在缺少嘌呤的培養(yǎng)基中生長的基因的顯性選擇用標(biāo)記的用途。與DHFR基因聯(lián)合所用的藥劑為氨甲喋呤(MTX)。因而，本發(fā)明包括生成哺乳動物宿主細(xì)胞的方法，包括(i)將抗-細(xì)胞凋亡基因、編碼DHFR的基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞群，與(ii)在含氨甲喋呤條件下擴(kuò)增該抗-細(xì)胞凋亡基因。在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，該抗凋亡基因和DHFR編碼基因引入宿主細(xì)胞中時位于相同的DNA分子上。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，兩個基因可操作地相互連接，并通過僅一個共同的啟動子轉(zhuǎn)錄。據(jù)此，將轉(zhuǎn)染基因培養(yǎng)于不含血清、無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基并逐漸增加MTX的量，由培養(yǎng)基中無MTX開始，至MTX濃度介于2毫微摩爾濃度至2000毫微摩爾濃度，更典型地介于2毫微摩爾濃度至1000毫微摩爾濃度。逐漸增加MTX濃度，其倍數(shù)因子為2-10。在一優(yōu)選方法，該抗-細(xì)胞凋亡基因另外編碼表2所列的任何一個基因。在一更佳方法中，該抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-2或BCL-xL；而且在一益佳方法中，其編碼BCL-xL。
表3選擇用可擴(kuò)增標(biāo)記基因


利用DHFR編碼基因做為選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記的適當(dāng)宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選者為小鼠骨髓瘤或倉鼠細(xì)胞。更優(yōu)選為缺少DHFR活性的CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)及CHO-DG44(Urlaub等人，Cell 33[2]，405-412，1983)細(xì)胞。為延展DHFR擴(kuò)增方法至其它細(xì)胞類型，可能使用編碼對氨甲喋呤敏感性降低的蛋白質(zhì)的突變體DHFR基因，聯(lián)合含正常數(shù)目的內(nèi)源性野生型DHFR基因的宿主細(xì)胞(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。
本發(fā)明的另一個具體實施方案亦提供經(jīng)導(dǎo)入的編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、DHFR基因與至少一種目的基因的核酸序列而遺傳修飾的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的具體實施方案中，該宿主細(xì)胞的抗-細(xì)胞凋亡基因，編碼任何表2所列的抗-細(xì)胞凋亡基因，優(yōu)選者是bcl-xL基因，更優(yōu)選是人或倉鼠源的bcl-xL基因，更優(yōu)選具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何功能片段，變體或突變體(簡并和非簡并性)的序列的bcl-xL基因。
經(jīng)由導(dǎo)入編碼bcl-xL、DHFR基因與至少一種目的基因的核酸序列而遺傳修飾的宿主細(xì)胞是本發(fā)明最優(yōu)選的，因而，亦是本發(fā)明的主題。然而，通常宿主細(xì)胞是在本發(fā)明意義之內(nèi)，至少包括異源的抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用可擴(kuò)增標(biāo)記基因與一種目的基因，其中該抗-細(xì)胞凋亡基因是表2的任何基因，或本文所述的其它任何基因，而該選擇用可擴(kuò)增標(biāo)記基因是表3所列的任何基因。
“選擇用藥劑”的用語意指干擾缺少特定選擇用的基因的宿主細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，為選取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的例如APH(氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶)的抗生素抗性基因的存在，使用抗生素，遺傳霉素(G418)。選擇用藥劑亦可包括“擴(kuò)增藥劑”，若該選擇用標(biāo)記基因依賴其可擴(kuò)增的選擇用標(biāo)記，其定義為供本文的目的做為擴(kuò)增該可擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)的藥劑。例如，MTX為選擇用藥劑對DHFR基因的擴(kuò)增有用途。擴(kuò)增選擇用藥劑的實例為，但不限于表3所述藥劑。
本發(fā)明適于產(chǎn)生生產(chǎn)生物醫(yī)藥多肽/蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明特別適于顯示增強(qiáng)的細(xì)胞存活力與生產(chǎn)力的細(xì)胞來表達(dá)高產(chǎn)率的大量不同的目的基因。“目的基因”、“選取序列”或“產(chǎn)物基因”在本文具有相同意義，并意指任何長度的編碼目的產(chǎn)物的多聚核苷酸序列，亦可指稱為“所需產(chǎn)物”的用語。選取序列可為全長度或切短的基因、融合或標(biāo)記的基因，而且可為cDNA、基因組NDA或DNA片段，又以cDNA優(yōu)選。其可為天然序列，亦即自然產(chǎn)生型式或可為突變型，或者還可以是視需要加以修飾者。這些修飾包括將密碼子最佳化，可使密碼子在選取的細(xì)胞中使用最優(yōu)化、人源化(humanization)或貼上標(biāo)簽。選取的序列可編碼分泌的、細(xì)胞質(zhì)的、細(xì)胞核、膜結(jié)合或細(xì)胞表面的多肽?！八璁a(chǎn)物”包括蛋白質(zhì)、多肽、其片段、肽、反義RNA等的全部能在選取的宿主細(xì)胞表達(dá)者。所需的蛋白質(zhì)可為例如抗體、酶、細(xì)胞因子、淋巴因子、粘附分子、受體、衍生物或其片段，及任何其它做為激動劑或拮抗劑的多肽，和/或具有治療或診斷用途的多肽。所需蛋白質(zhì)多肽的實例亦可見下文。
就定義而言，任何導(dǎo)入宿主細(xì)胞的序列或基因，相對于宿主細(xì)胞皆稱為“異源序列”或“異源基因”，即使該導(dǎo)入序列或基因與宿主的內(nèi)生序列或基因一致。例如，導(dǎo)入倉鼠宿主細(xì)胞的倉鼠bcl-xL基因在定義上即是異源基因。
利用“表達(dá)載體”，可將例如編碼BCL-xL的核酸序列的異源基因序列導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，以真核細(xì)胞優(yōu)選，又以哺乳動物表達(dá)載體更佳。建構(gòu)載體的方法是熟諳本領(lǐng)域者所熟知，且大不同的發(fā)表文章中皆有說明。特別的建構(gòu)適當(dāng)載體的技術(shù)，包括諸如啟動子、增強(qiáng)子、終止與聚腺苷酸化信號、選擇標(biāo)記、復(fù)制起點與剪切信號等功能成分的說明，在Sambrook等人，1989，及其所引的參考資料皆有相當(dāng)詳細(xì)的回顧。載體可能包括，但不限于質(zhì)粒載體、噬菌粒、粘粒、人工/微小-染色體，或諸如桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、噬菌體的病毒載體。真核表達(dá)載體典型地亦包含促成載體在細(xì)菌增殖的原核序列，諸如復(fù)制起點與在細(xì)菌中選取用的抗生素基因。多種真核表達(dá)載體是本領(lǐng)域所熟知的，該載體包含克隆位點，其內(nèi)可操作地連接多聚核苷酸，某些表達(dá)載體可購自諸如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA。
在一優(yōu)選具體實施方案中，該表達(dá)載體至少包括編碼肽/多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄與翻譯所需的調(diào)控序列的核酸序列。在一更特定具體實施方案中，該表達(dá)載體至少包括允許編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄與翻譯(表達(dá))的調(diào)控序列。
“調(diào)控序列”包括啟動子、增強(qiáng)子、終止與聚腺苷酸化信號及其它表達(dá)控制元件?？捎诓煌?xì)胞型態(tài)表達(dá)功能的不論誘導(dǎo)性或構(gòu)造性調(diào)控序列，皆為本領(lǐng)域所知。轉(zhuǎn)錄調(diào)控單位通常包括欲表達(dá)的基因序列的上游啟動子、轉(zhuǎn)錄起始與終止位置與聚腺苷化信號序列。轉(zhuǎn)錄起始位點的用語，意指構(gòu)建體中的核酸，該核酸相當(dāng)于摻入初級轉(zhuǎn)錄本亦即mRNA前體的第一個核酸；轉(zhuǎn)錄起始位點可與啟動子序列重疊。轉(zhuǎn)錄終止位點的用語意指通常出現(xiàn)在目的基因的3′端或欲轉(zhuǎn)錄序列的延伸的核苷酸序列，其會造成RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄。聚腺苷化信號或聚-A添加信號提供在真核RNA 3′端的特定位置的切斷與至3′端約100-200腺嘌呤核苷酸(聚A尾)序列核心的轉(zhuǎn)錄后添加的信號。聚腺苷化信號序列包括位于切斷位置上游約10-30核苷酸的AATAAA序列，加上下游序列。已知有不同的聚腺苷酸元件，例如SV40晚期與早期polyA或BGH polyA。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括每個欲表達(dá)的個別多肽的轉(zhuǎn)錄起始位置(AUG)、終止密碼子與聚A信號。在某些構(gòu)建體中還包括內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位置(IRES)。IRES定義如下。為將表達(dá)最佳化，不論在轉(zhuǎn)錄或翻譯層面，對欲表達(dá)的核酸序列可能需去除、添加或改變5′和/或3′未翻譯部分，以消減潛在的額外的不適當(dāng)替代翻譯起始密碼子或其它可能干擾或減少表達(dá)的序列。另外的共有核糖體結(jié)合位置可即插入開始密碼子的5′端以增強(qiáng)表達(dá)。為產(chǎn)生分泌性多肽，該選取序列通常會包括編碼前導(dǎo)肽的信號序列，所述肽可指引新合成多肽到達(dá)并穿過多肽的分泌性路徑的ER膜。前導(dǎo)肽通常，但非無一例外地位于分泌蛋白質(zhì)的氨基端，且在蛋白質(zhì)通過ER膜后即會被信號肽酶切斷。分泌用的序列通常，但非必需包括其自己的信號序列。在無原生信號序列時，可將異源信號序列融合于選取的序列。無數(shù)的信號序列是本領(lǐng)域已知，且可得自諸如GenBank與EMBL的序列資料庫。
表達(dá)載體可包含表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的目的基因的單一轉(zhuǎn)錄單位，例如利用IRES元件或某些基因的插入序列指引，以在操作上將全部元件連接于相同啟動子或啟動子/增強(qiáng)子。替代性地，表達(dá)載體可具有一或多種轉(zhuǎn)錄單位，而前述元件可由分開的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)，而每個轉(zhuǎn)錄單位含相同或不同調(diào)控序列。在另一替代方式，超過一種表達(dá)載體包括一或多種轉(zhuǎn)錄單位，每個轉(zhuǎn)錄單元皆可用以表達(dá)一個或多個前述元件，可經(jīng)共轉(zhuǎn)染使用并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或可依次序的不同回合或任何次序的導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄單位使用并導(dǎo)入宿主細(xì)胞。只要轉(zhuǎn)錄單位能充分表達(dá)，可選用每個載體的任何組合。進(jìn)一步的經(jīng)認(rèn)定為必要的元件，可能位于表達(dá)載體上，所述元件諸如另外的抗-細(xì)胞凋亡基因、目的基因或選擇用標(biāo)記。本發(fā)明的先決條件為，若非在一或兩個載體的分開的轉(zhuǎn)錄單位即是在單一載體的同一轉(zhuǎn)錄單位，將抗-細(xì)胞凋亡基因與選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因共導(dǎo)入，以允許抗-細(xì)胞凋亡基因與選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因共擴(kuò)增。在進(jìn)一步的具體實施方案中，該抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因還有目的基因是同時導(dǎo)入，若非在一或兩個載體的分開的轉(zhuǎn)錄單位即是在單一載體之一或多個轉(zhuǎn)錄單位，以允許抗-細(xì)胞凋亡基因與選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因的共擴(kuò)增。優(yōu)選至少將抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因置于空間上緊鄰的位置，使得該抗凋亡基因的擴(kuò)增更有效。因此優(yōu)選至少抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因是相同的DNA分子編碼的，例如兩個基因均位于相同的表達(dá)載體上，并因此被共同引入宿主細(xì)胞。更優(yōu)選例如通過使用共同的啟動子將該抗凋亡基因和選擇性擴(kuò)增標(biāo)記基因可操作地相互連接，使得所述基因共表達(dá)和擴(kuò)增。
“啟動子”意指控制其可操作地連接的基因或序列轉(zhuǎn)錄的聚核苷酸序列。啟動子包括RNA聚合酶結(jié)合與轉(zhuǎn)錄起始的信號。所用啟動子會在表達(dá)涵蓋所選序列的宿主細(xì)胞的細(xì)胞型態(tài)表達(dá)功能。不同來源的包括構(gòu)成性、誘導(dǎo)性與阻遏性啟動子的大量啟動子是本領(lǐng)域所熟知(并在諸如GenBank的資料庫中已經(jīng)辨識)，而且可作為克隆的多聚核苷酸獲得或可從克隆的多聚核苷酸中獲得(例如來自諸如ATCC以及其它市售或個別來源的貯存庫)。就誘導(dǎo)性啟動子而言，啟動子是對應(yīng)信號而增加或減少活性。例如，含四環(huán)素操縱子序列(tetO)的四環(huán)素(tet)啟動子可利用四環(huán)素-調(diào)控轉(zhuǎn)化蛋白(tTA)來誘導(dǎo)。在有tet時，tTA與tetO的結(jié)合受抑制。其它誘導(dǎo)性啟動子包括jun、fox、金屬硫蛋白與熱休克啟動子，請參照例如Sambrook等人，1989與Gossen等人，1994。經(jīng)辨識為高表達(dá)的強(qiáng)啟動子的真核啟動子為WO97/15664描述的Ubiquitin S27a基因的倉鼠啟動子及其功能片段，SV40早期啟動子、腺病毒的主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)序列與人類巨細(xì)胞病毒即早期啟動子(CMV)。其它異源哺乳動物啟動子包括，例如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子。前述啟動子是本領(lǐng)域所熟知者。任何上述的啟動子都高度適合控制和啟動本文所述的所有創(chuàng)造性宿主細(xì)胞中的至少抗凋亡基因的表達(dá)。例如，引入哺乳動物細(xì)胞的抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因的適宜表達(dá)載體包含一個抗凋亡基因，一個選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因，和WO97/15664描述的UbiquitinS27a基因的倉鼠啟動子或其功能片段。優(yōu)選至少該抗凋亡基因在所述Ubiquitin S27a基因的倉鼠啟動子的控制之下。本文所用“增強(qiáng)子”意指作用于啟動子以增強(qiáng)與其操作連接的基因或編碼序列的轉(zhuǎn)錄的多聚核苷酸序列。不像啟動子，增強(qiáng)子相對不依賴于方向與位置，且發(fā)現(xiàn)是在轉(zhuǎn)錄單位的5′或3′，位于內(nèi)含子內(nèi)以及就在編碼序列內(nèi)。因而，盡管實例上增強(qiáng)子得與啟動子在物理與功能上重疊，然而，增強(qiáng)子可放在轉(zhuǎn)錄起始位置的上游或下游或與啟動子有相當(dāng)距離。大量的不同來源的啟動子是本領(lǐng)域所熟知的(并在諸如GenBank的資料庫中已辨識，例如SV40增強(qiáng)子、CMV增強(qiáng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子、腺病毒增強(qiáng)子)，而且可作為克隆的多聚核苷酸序列獲得或從克隆的聚核苷酸中獲得(例如來自諸如ATCC以及其它市售或個別來源的貯存庫)。有些包括啟動子的多聚核苷酸(諸如一般用的CMV啟動子)亦包括增強(qiáng)子。例如上述所有的強(qiáng)啟動子亦包括強(qiáng)的增強(qiáng)子。
“轉(zhuǎn)錄單位”是定義構(gòu)建體內(nèi)的含一或多個待轉(zhuǎn)錄基因的區(qū)域，其中，該基因內(nèi)含的片段操作上彼此連接，并由單一啟動子轉(zhuǎn)錄；其結(jié)果，使不同的基因至少在轉(zhuǎn)錄上相連接。每個轉(zhuǎn)錄單位可轉(zhuǎn)錄并表達(dá)超過一個蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。每個轉(zhuǎn)錄單位將包含該單位所含的任何選取序列轉(zhuǎn)錄與翻譯所需的調(diào)控單位。
“可操作地連接”意指其所處位置允許其以目的方式表達(dá)功能的兩個或更多的核酸序列或序列元件。例如，若其作用為順式控制或調(diào)節(jié)連接序列的轉(zhuǎn)錄，啟動子和/或增強(qiáng)子即可操作地連接于編碼序列。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的，但亦不盡然；然而，在需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，或為分泌性前導(dǎo)序列情形時，將為連續(xù)且在讀框中。然而，盡管操作連接的啟動子通常位于編碼序列上游，卻未必與其連續(xù)。增強(qiáng)子只要能增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄，不需要是連續(xù)者。為此，其可位于編碼序列的上游或下游，甚至是有一段距離。聚腺苷酸化位置若位于編碼序列3′端，且能使轉(zhuǎn)錄繼續(xù)由編碼序列至聚腺苷酸化信號時，其即操作上與編碼序列連接。經(jīng)本領(lǐng)域已知的重組方法即可完成連接，例如使用PCR方法、接合于適當(dāng)?shù)南拗莆恢没蚪?jīng)由粘接過程。若無適當(dāng)?shù)南拗莆恢?，亦得使用根?jù)傳統(tǒng)方式的合成寡核苷酸連接子或銜接子來進(jìn)行。
本文所用“表達(dá)”的用語意指宿主細(xì)胞內(nèi)的異源核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。宿主細(xì)胞中所需產(chǎn)物的表達(dá)量，得根據(jù)細(xì)胞中對應(yīng)的mRNA的量或選取序列編碼所需多肽的量來決定。例如，由選取序列轉(zhuǎn)錄的mRNA得經(jīng)Northern雜交、核糖核酸酶RNA保護(hù)、與細(xì)胞RNA的原位雜合或經(jīng)PCR定量(參照Sambrook等人，1989，Ausubel等人，1987更新版)?？衫枚喾N方法定量選取序列編碼的蛋白，例如藉ELISA、藉Western印跡、藉放射免疫分析、藉免疫沉淀、藉分析蛋白的生物活性或藉蛋白的免疫染色并隨后FACS分析(參照Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1987更新版)。
本文所用“增強(qiáng)表達(dá)”、“過度表達(dá)”或“高量表達(dá)”的用語意指持續(xù)與充分高量的異源選取序列的表達(dá)，在本發(fā)明中以導(dǎo)入宿主細(xì)胞的抗-細(xì)胞凋亡基因，例如bcl-xL或bcl-2和/或目的基因優(yōu)選。增強(qiáng)表達(dá)可利用多種方式達(dá)成。在本發(fā)明中，諸如bcl-xL的抗-細(xì)胞凋亡基因，或任何其它表2所列基因加上選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因的表達(dá)，提供更有效的選取與辨識高量表達(dá)異源基因的宿主細(xì)胞。選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因不僅允許我們選取穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，也允許目的異源基因的基因擴(kuò)增。該核酸序列的另外的拷貝得整合入細(xì)胞的基因組或額外的人工染色體/微小染色體，或以附加體形式被放入。此方法得結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選(FACS)-使用例如熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)或細(xì)胞表面標(biāo)示物等另外的選擇標(biāo)記，以支持選取共擴(kuò)增抗-細(xì)胞凋亡基因的重組宿主細(xì)胞?？蛇_(dá)到增強(qiáng)表達(dá)(不論就其本身或組合上述可能的情形時)的其它方法包括但不限于，使用(人工)轉(zhuǎn)錄因子或以天然或合成藥劑處理細(xì)胞，以向上調(diào)控內(nèi)生或異源基因表達(dá)、改善編碼BCL-xL的mRNA或蛋白質(zhì)本身的穩(wěn)定性(例如刪除與蛋白質(zhì)生物功能無關(guān)的蛋白酶易感性區(qū)域)、增加mRNA翻譯或使用附加體質(zhì)粒(根據(jù)做為復(fù)制起點的病毒序列，諸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)來增加基因量、擴(kuò)增啟動序列(Hemann等人，1994)或根據(jù)DNA連環(huán)的體內(nèi)擴(kuò)增系統(tǒng)(Monaco等人，1996)。熟諳本領(lǐng)域者以本領(lǐng)域的方法，可辨識與定量已增加的拷貝數(shù)，例如，擴(kuò)增的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的拷貝數(shù)，所利用的方法例如Southern印跡分析或定量PCR。如何選取最適控制并進(jìn)行此分析，是熟諳本領(lǐng)域者的知識范圍。這種方法的實例之一是本文所述的實例。
藉上述方法可依此產(chǎn)生宿主細(xì)胞，故其包括至少多拷貝數(shù)的導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因，例如至少5、10、20、50或100拷貝數(shù)的導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因。
“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位置”或“IRES”說明功能上促進(jìn)獨(dú)立于IRES的5′的基因翻譯起始的序列，并允許動物細(xì)胞中的兩個順反子(開放讀框)翻譯自單一轉(zhuǎn)錄本。IRES提供獨(dú)立的核糖體進(jìn)入位置以供正在其下游的開放讀框的翻譯。不像細(xì)菌mRNA的多順反子一樣，即編碼由該mRNA依序翻譯的多種不同多肽，動物的多數(shù)mRNA為單順反子，并僅編碼一個蛋白質(zhì)的合成。在真核細(xì)胞的多順反子轉(zhuǎn)錄本，翻譯會由最5′端的翻譯起始位置起始，于第一個停止密碼子終止，且該翻譯本會由核糖體釋出，造成僅mRNA的第一個編碼多肽的翻譯。在真核細(xì)胞，具IRES可操作地連接于第二個或后續(xù)的開放讀框的多順反子的轉(zhuǎn)錄本，其允許下游的開放讀框的依序翻譯，以產(chǎn)生由該相同轉(zhuǎn)錄本編碼的兩種或多種多肽。該IRES可為不同長度且得自不同來源，例如腦心肌炎病毒(EMCV)或細(xì)小核糖核酸病毒。先前已有人說明不同的IRES序列及其在載體建構(gòu)中的用途(Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997)。同樣可操作地(isoperatively)連接于IRES 3′端的下游編碼序列，不論以任何距離，都不會負(fù)面影響下游基因的表達(dá)。藉改變距離并測量做為距離函數(shù)的表達(dá)情形，可很方便決定IRES與下游基因開始處之間的最佳或許可的距離。
本文所用“內(nèi)含子”的用語意指通常出現(xiàn)在很多真核基因中的不同長度的非編碼核酸序列，其是經(jīng)由必須依賴插入序列兩端的高度保存或靠近的序列的剪切方法，由新轉(zhuǎn)錄的mRNA前體去除。通常，剪切過程需要內(nèi)含子的5′端與3′端正確切除，而且生成的mRNA的端正確接合，使得產(chǎn)生成熟的具蛋白質(zhì)合成的適當(dāng)讀框的mRNA。很多剪切提供者與剪切接受者的位置，亦即在外顯子-內(nèi)含子與內(nèi)含子-外顯子邊界緊密圍繞的序列的特征已被確定，對此可參見Ohshima等人，1987的綜述。
得利用任何本領(lǐng)域熟諳的技術(shù)進(jìn)行真核宿主細(xì)胞經(jīng)聚核苷酸或表達(dá)載體的“轉(zhuǎn)染”，以生成遺傳修飾細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其說明請見Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1987(更新版)。轉(zhuǎn)染方法包括，但不限于脂粒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、聚陽離子(諸如DEAE-葡聚糖)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)融合、病毒感染與微注射。該轉(zhuǎn)染以穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染優(yōu)選。這樣的轉(zhuǎn)染方法是有利的，其能在特定的宿主細(xì)胞株與類型中，提供最佳的轉(zhuǎn)染頻率與異源基因的表達(dá)。適當(dāng)方法得由例行過程確定。對于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子而言，構(gòu)建體或者整合入宿主細(xì)胞基因組或人工染色體/微小染色體，或者以附加體形式存在，以便于其在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地維持。
“選擇用標(biāo)記基因”是僅允許帶該基因的細(xì)胞在相應(yīng)的選取藥劑下，受具體的順或反向選取的基因。藉由說明，抗生素抗性基因可做為正的選擇用標(biāo)記基因，其允許以相應(yīng)的抗生素條件，做為正向選擇經(jīng)該基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的標(biāo)記；至于，非轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在選擇的培養(yǎng)條件則無法生長或存活。選擇用標(biāo)記可為正、負(fù)或雙功能的。正向選擇用標(biāo)記，藉賦予藥物抗性或補(bǔ)償宿主細(xì)胞的代謝或合成缺陷而允許選取帶標(biāo)記的基因。相形之下，負(fù)向選取標(biāo)記允許帶標(biāo)記細(xì)胞受選擇性消減。例如，利用HSV-tk基因做為標(biāo)記，可使細(xì)胞對諸如無環(huán)鳥苷與丙氧鳥苷(gancyclovir)的藥劑敏感。只要其編碼產(chǎn)物維持選擇用性質(zhì)，本文所用的選擇用標(biāo)記基因，可包括擴(kuò)增的選擇用基因，包括重組的遺傳工程處理的突變體與變體、片段、功能性等效物、衍生物、同系物與原生的選擇用標(biāo)記基因的融合物。有用的衍生物，通常在與選擇用性質(zhì)相關(guān)的選擇用標(biāo)記的區(qū)域或功能部位具有實質(zhì)的序列相似性(在氨基酸水平)。目前已有多種包括雙功能(亦即正/負(fù))標(biāo)記的標(biāo)記基因的說明，(參照例如WO 92/08796與WO 94/28143)其列入本文供參考。例如，通常用于真核細(xì)胞的選擇用基因包括，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH)，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HYG)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，與編碼新霉素(G418)、嘌呤霉素、組胺醇D、博菜霉素與腐草霉素的抗性基因。
選擇亦可利用例如細(xì)胞表面標(biāo)示物、細(xì)菌β-半乳糖苷酶或熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP)及其來自水母(Aequorea victoria)與另一種水母(Renilla reniformis)或其它物種的變體、紅色熒光蛋白、熒光蛋白及其來自Discosoma或其它物種的變體)藉熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)選取細(xì)胞。
根據(jù)本文的教誨，本發(fā)明亦提供在宿主細(xì)胞表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的方法。該方法包括下列步驟(i)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞群，優(yōu)選者為倉鼠宿主細(xì)胞群，其中該基因是可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的調(diào)控序列，(ii)將該細(xì)胞群培養(yǎng)于可表達(dá)該基因的條件。對熟諳本領(lǐng)域者而言，如何將一或多種聚核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法、教誨是如上述所例示者。甚至，本發(fā)明亦給予實例，說明一或多種基因如何與至少一種調(diào)控序列連接，以表達(dá)該基因。此外，還描述了優(yōu)選將至少該抗凋亡基因和選擇性可擴(kuò)增標(biāo)記基因置于空間上緊鄰的位置上使得該抗凋亡基因的擴(kuò)增更為有效。適于表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞是本發(fā)明所提及者?？?細(xì)胞凋亡基因的適當(dāng)中選物列于表2。優(yōu)選者是編碼BCL-xL或BCL-2的任何序列，更優(yōu)選是編碼BCL-xL的任何序列，更優(yōu)選人或倉鼠源的編碼的任何BCL-xL序列。在該方法的進(jìn)一步更佳具體實施方案中，共表達(dá)的宿主細(xì)胞包括任何編碼表3所列的任何一種選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記的序列。益佳的方法為，其中該宿主細(xì)胞包括編碼異源BCL-xL的序列且包括編碼表3所列的任何一種選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記的序列。最佳的方法為，其中該宿主細(xì)胞包括編碼異源BCL-xL與DHFR的序列，尤其是當(dāng)BCL-xL編碼序列是人或倉鼠源的時候。
本發(fā)明提供的方法，允許熟諳本領(lǐng)域者產(chǎn)生歸因于延遲或抑制程序性的細(xì)胞死亡，而顯示增強(qiáng)的細(xì)胞存活的特別是為生產(chǎn)目的的新宿主細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞長期培養(yǎng)于懸浮液，尤其是無血清培養(yǎng)液的劇烈增加細(xì)胞存活力與產(chǎn)量的有利策略。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞非常適于生產(chǎn)多種所需的多肽。本發(fā)明所述的遺傳修飾宿主細(xì)胞，不僅編碼負(fù)責(zé)增強(qiáng)細(xì)胞存活的基因，例如抗-凋亡基因和可擴(kuò)增的標(biāo)記基因，而且還視情形編碼所需肽的任何目的基因。據(jù)此，本發(fā)明亦提供熟諳本領(lǐng)域者在宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，包括i)將本發(fā)明的任何宿主細(xì)胞在有利于表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因與目的基因的條件下培養(yǎng)，與ii)由細(xì)胞和/或細(xì)胞培養(yǎng)上清液分離目的蛋白。本發(fā)明亦提供以該細(xì)胞生產(chǎn)由目的基因所編碼的至少一種所需蛋白的用途。
所需蛋白質(zhì)是那些上述者。尤其是，所需蛋白質(zhì)/多肽是例如，但不限于胰島素、類胰島素生長因子、hGH、tPA；諸如白細(xì)胞介素(IL)的細(xì)胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干擾素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ，腫瘤壞死因子(IFN)(諸如)IFNα與IFNβ、IFNγ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1與VEGF。亦包括促紅細(xì)胞生成素或任何其它激素生長因子的生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可很有利地用來生產(chǎn)抗體及其片段。這種片段包括，例如Fab片段(抗原結(jié)合片段＝Fab)。Fab片段是由鄰近恒定區(qū)聚在一起的兩種鏈的可變區(qū)組成。這些可利用蛋白酶例如，以木瓜酵素由傳統(tǒng)抗體消化形成；但是類似的Fab片段亦可同時經(jīng)由遺傳工程生產(chǎn)。進(jìn)一步的抗體片段包括F(ab′)2片段，可利用胃蛋白酶的蛋白質(zhì)剪切制備。
利用遺傳工程方法可能生產(chǎn)僅由重鍵(VH)與輕鏈(VL)可變區(qū)組成的縮短的抗體片段。其命名為Fv片段(可變區(qū)片段＝可變區(qū)部分的片段)。因為這些Fv片段缺少經(jīng)由恒定鏈的半胱氨酸的兩個鏈的共架結(jié)合，F(xiàn)v片段通常已經(jīng)過穩(wěn)定化。利用短的肽片段連接重鏈與輕鏈的可變區(qū)是有利的，例如10-30個氨基酸，以15個氨基酸優(yōu)選。以此方式取得由肽連接子連接的包括VH與VL的單一肽鏈。這種抗體蛋白質(zhì)命名為單鏈-Fv(scFv)。由現(xiàn)有技術(shù)所知的此類Fv-抗體蛋白的實例說明詳見Huston等人，(1988，PNAS 165879-5883)。
近年來，已發(fā)展出制備scFv做為多聚衍生物的不同策略。此是欲造成特別是具改善的藥物動力學(xué)與生物分布性質(zhì)以及增強(qiáng)的結(jié)合親合性的重組抗體。為實現(xiàn)scFv的多聚化，故將scFv制成具有多聚化功能區(qū)的融合蛋白。該多聚化功能區(qū)可為例如IgG的CH3區(qū)域或諸如亮氨酸-拉鏈功能部位的卷繞的卷繞結(jié)構(gòu)(螺旋結(jié)構(gòu))。然而，亦有使用scFv的VH/VL區(qū)域間的作用來多聚化的策略(例如雙、三與五體(pentabodies))。所謂雙體(biabody)，熟諳本領(lǐng)域者亦指二價同源二聚體scFv衍生物。scFv分子中縮短的連接子至5-10個氨基酸會形成其中有一鏈內(nèi)VH/VL-重疊(superimposition)的同源二聚體。藉摻入雙硫鍵橋可將雙體另外穩(wěn)定化。來自現(xiàn)有技術(shù)的雙體抗體蛋白的實例可見Perisic等人(1994，Structure21217-1226)。
所謂微抗體，熟諳本領(lǐng)域者亦指雙價、同源二聚體scFv衍生物。其由包含免疫球蛋白，優(yōu)選者為IgG的CH3區(qū)域融合蛋白組成；最佳者做為二聚化區(qū)域的IgG1是經(jīng)由絞鏈區(qū)(例如，亦源于IgG1)與連接子區(qū)域連接于scFv。來自現(xiàn)有技術(shù)的微抗體蛋白的實例可見Hu等人(1996，Cancer Res.563055-61)。
所謂三體(tribody)，熟諳本領(lǐng)域者亦指三價同源三聚體scFv衍生物(Kortt等人，1997 Protein Enginnering 10423-433)。不用連接子序列而經(jīng)VH-VL直接融合的scFv衍生物會形成三聚體。
熟諳本領(lǐng)域者亦熟悉具雙-、三-或四價結(jié)構(gòu)并衍生自scFv的所謂的微抗體。該多聚化是由雙-、三-或四聚體的卷繞的卷繞結(jié)構(gòu)實現(xiàn)(Pack等人，1993 Biotechnology 111271-1277；Lovejoy等人，1993 Science 2591288-1293；Pack等人，1995 J.Mol.Biol.24628-34)。
本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞是本文所說明且以增強(qiáng)的細(xì)胞存活為其特征者。特別是優(yōu)選者為根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，包括編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列。更優(yōu)選為包括多拷貝數(shù)的這些基因的宿主細(xì)胞，至少有抗-細(xì)胞凋亡基因與選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因。多拷貝數(shù)的這些基因亦是利用本文所述方法取得，例如藉基因擴(kuò)增方法和/或以熟諳本領(lǐng)域者已知的任何其它方式(例如，導(dǎo)入基因的多聯(lián)體)提供宿主細(xì)胞多基因拷貝數(shù)。
適當(dāng)?shù)目?細(xì)胞凋亡基因為，但不限于表2所列者。優(yōu)選者是包括多拷貝數(shù)的BCL-xL編碼基因與多拷貝數(shù)的任何表3所列的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因的宿主細(xì)胞。最佳的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因為DHFR編碼基因。
適于生產(chǎn)蛋白的宿主細(xì)胞是顯示過度表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因者，與未根據(jù)本發(fā)明方法修飾的宿主細(xì)胞的該蛋白的表達(dá)量比較，其至少增加約30倍，以至少約50倍優(yōu)選，又以至少約100倍更佳。
甚至，適當(dāng)?shù)氖怯谂囵B(yǎng)9天后，顯示至少約50％存活力的宿主細(xì)胞群。甚至，本發(fā)明的適當(dāng)?shù)呐c優(yōu)選的宿主細(xì)胞是培養(yǎng)8天后，顯示至少約60％存活力者。甚至，適于本發(fā)明意義的宿主細(xì)胞為，于至少7天后，顯示至少約75％的細(xì)胞存活力者。在另一具體實施方案中，宿主細(xì)胞群于培養(yǎng)6天后，以顯示至少約85％存活力為適當(dāng)?shù)那覂?yōu)選的。在抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL的情形下，可取得于培養(yǎng)9天后，至少約60％；培養(yǎng)8天后，至少75％；培養(yǎng)7天后，至少約85％的存活力的細(xì)胞(例如參照圖5)。而且，與未經(jīng)基因擴(kuò)增方法修飾的親代細(xì)胞群比較，以經(jīng)過6、7、8或9天培養(yǎng)后，其存活至少增加約20％的宿主細(xì)胞特別適當(dāng)。更優(yōu)選是，與親代細(xì)胞群比較，經(jīng)6、7、8或9天培養(yǎng)后，其存活至少增加約30％的宿主細(xì)胞群，益佳者為其存活至少增加約50％的宿主細(xì)胞群。
在本發(fā)明意義的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或宿主細(xì)胞群，包括倉鼠細(xì)胞，以BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1與CHO-DG44細(xì)胞優(yōu)選，或可為任何此類細(xì)胞株的衍生物/子代。特佳者為CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1與BHK21；更特別者為CHO-DG44與CHO-DUKX細(xì)胞。在本發(fā)明進(jìn)一步的具體實施方案中，宿主細(xì)胞亦意指小鼠骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選者為NS0與Sp2/0或任何此類細(xì)胞株的衍生物/子代。然而，那些細(xì)胞、其它哺乳類細(xì)胞的衍生物/子代，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、猴子與嚙齒類細(xì)胞株；或真核細(xì)胞，包括但不限于酵母菌、昆蟲與植物細(xì)胞，亦可做為生產(chǎn)目的的本發(fā)明意義的用途。
通常是經(jīng)多步驟方法，才能選取已顯示增加的存活力并表達(dá)高水平所需蛋白的重組宿主細(xì)胞。選取策略有賴細(xì)胞是否由至少三個相關(guān)基因(抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因、目的基因、與視情形的額外的選擇用標(biāo)記基因)平行共轉(zhuǎn)染、是否將該目的基因?qū)胍呀?jīng)顯示如本文所述的增加的細(xì)胞存活力的細(xì)胞，或是否將該抗-細(xì)胞凋亡基因加上選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因?qū)胍驯磉_(dá)目的基因的宿主細(xì)胞。
在第一種情形，其篩選或選取與目的基因共轉(zhuǎn)染的任何表達(dá)選擇用標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以辨識摻入目的基因的細(xì)胞。通常，將轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞培養(yǎng)于選擇用培養(yǎng)液，例如約2周，以選擇表達(dá)有選擇用標(biāo)記的宿主細(xì)胞。其后，逐步將細(xì)胞暴露于連續(xù)增量的擴(kuò)增選取藥劑，共擴(kuò)增編碼至少抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因的核酸序列，直到取得充分表達(dá)的異源的所需產(chǎn)物以及抗-細(xì)胞凋亡基因產(chǎn)物。每個選取步驟皆可以細(xì)胞集中物(cell pools)，或結(jié)合克隆選擇方法，例如通過有限稀釋來進(jìn)行。若使用諸如GFP的適當(dāng)標(biāo)記，可利用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)進(jìn)行選取。
在第二種情形，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是至少經(jīng)目的基因與選擇用標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染；并視情形加上與先前所用的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因不同的選取用可擴(kuò)增的基因，以產(chǎn)生具增強(qiáng)的存活力的宿主細(xì)胞。之后，篩選或選取至少表達(dá)有與目的基因共轉(zhuǎn)染的選取用標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以辨識摻入目的基因的細(xì)胞。典型地，將轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞培養(yǎng)于選擇用培養(yǎng)液，以選擇被表達(dá)選擇用標(biāo)示物者。視情形，為產(chǎn)生具增強(qiáng)的存活力的宿主細(xì)胞，選取用培養(yǎng)液亦可包含對先前所用的選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因具有特異性的選取用藥劑。選取步驟可以細(xì)胞集中物(cell pools)或可與克隆選擇方法組合進(jìn)行，所述克隆選擇可通過例如，有限稀釋來實現(xiàn)。若使用諸如GFP的適當(dāng)標(biāo)記，可利用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來進(jìn)行選取。若使用另一種選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，視情形，亦可進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞擴(kuò)增步驟，以至少增加目的基因的拷貝數(shù)。
在第三種情形，以抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的另外一種選擇用標(biāo)記基因和/或目的基因，將重組的宿主細(xì)胞或已表達(dá)目的基因的生產(chǎn)細(xì)胞株共轉(zhuǎn)染；藉此，其使用與建立重組的生產(chǎn)細(xì)胞株不同的標(biāo)記以進(jìn)行選取。將轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞株培養(yǎng)于選取用培養(yǎng)基約2周，進(jìn)行選取，以表達(dá)新導(dǎo)入的標(biāo)記基因。視情形，該選取用培養(yǎng)基亦含具有先前使用的選取用標(biāo)記特異性的選取用藥劑，以生成重組的生產(chǎn)細(xì)胞株。其后，逐步將細(xì)胞暴露于連續(xù)增加量的擴(kuò)增的選取藥劑，至少共擴(kuò)增抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形共轉(zhuǎn)染的目的基因，直到至少取得充分表達(dá)的抗-細(xì)胞凋亡基因產(chǎn)物為止。每個選取步驟皆可以細(xì)胞集中物或可結(jié)合，例如有限稀釋的克隆選擇來進(jìn)行。若使用諸如GFP的適當(dāng)標(biāo)記，得利用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來進(jìn)行選取。
目的蛋白以培養(yǎng)液中的分泌性多肽的形式回收優(yōu)選，或若其表達(dá)時無分泌性信號，可由宿主細(xì)胞裂解物回收。需要從其它重組蛋白和宿主細(xì)胞蛋白中純化目的蛋白，以取得目的蛋白的實質(zhì)上均質(zhì)的制備物。第一步，細(xì)胞和/或顆粒性細(xì)胞碎片從培養(yǎng)液或裂解物中去除。其后，將目的產(chǎn)物從污染的可溶蛋白、多肽與核酸中純化，例如藉免疫親合力或離子交換層析柱分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色譜層析、硅膠或諸如DEAE的陽離子交換樹脂的色譜層析法。通常，教導(dǎo)熟諳本領(lǐng)域者如何純化宿主細(xì)胞表達(dá)的異源蛋白的方法是本領(lǐng)域所熟知的。這種方法的說明請見例如Harris與Angal，Protein Purification Methods，Rickwood與Hames編輯，ThePractical Approach Series，IRL Press(1995)或Robert Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag(1998)，二者皆列入本文供參考。
本發(fā)明的通常主題之一，是提供熟諳本領(lǐng)域者顯示已增加細(xì)胞存活的宿主細(xì)胞。藉任何本文所述方法，抑制或延遲程序性的細(xì)胞死亡，例如細(xì)胞凋亡，皆可增加細(xì)胞存活。增強(qiáng)本文意義的細(xì)胞存活的最充分方式為，提供宿主細(xì)胞多拷貝數(shù)的至少一種異源導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因，并培養(yǎng)該宿主細(xì)胞于允許抗-細(xì)胞凋亡基因拷貝數(shù)高度表達(dá)的條件。本發(fā)明亦提供至少包括5個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。本發(fā)明亦提供至少包括10個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。甚且，本發(fā)明亦提供宿主細(xì)胞，至少包括20個拷貝數(shù)；在另一個具體實施方案中，至少50個拷貝數(shù)；在進(jìn)一步的具體實施方案中，至少100個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因。本發(fā)明，提供熟諳本領(lǐng)域者數(shù)種如何生成此類包括多拷貝數(shù)的異源抗細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞的方法。那些方法包括但不限于上述者例如(i)于選擇性藥劑驅(qū)使下，逐步擴(kuò)增至少一種異源導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因，(ii)利用并導(dǎo)入上述的附加體質(zhì)粒，增加至少一種異源導(dǎo)入的抗-細(xì)胞凋亡基因的基因量，(iii)或使用根據(jù)例如Monaco等人，1996所述的DNA多聯(lián)體體外擴(kuò)增系統(tǒng)，其列入本文供參考。
適當(dāng)?shù)目?細(xì)胞凋亡基因是任何表2所列者或者本發(fā)明通常描述的那些，特別是由任何指向表2的核酸序列所編碼者或者任何由SEQ ID1，SEQID3，SEQ ID5，SEQ ID7，SEQ ID9或SEQ ID11或其任何功能變體或突變體(簡并和非簡并性)編碼的基因。優(yōu)選者為包括多拷貝數(shù)的編碼BCL-xL或BCL-2的基因的宿主細(xì)胞，更優(yōu)選為編碼BCL-xL，更優(yōu)選為編碼人或倉鼠源的BCL-xL。而益佳者為包含多拷貝的具SEQ ID NO1，SEQ ID3，SEQID5，SEQ ID7，SEQ ID9或SEQ ID11或其任何功能變體或突變體(簡并和非簡并的)的序列的核酸的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的具體實施方案中，以編碼BCL-2或具SEQ ID NO2的序列的抗-細(xì)胞凋亡基因優(yōu)選。亦佳者為包括不同的抗-細(xì)胞凋亡基因，例如選自表2所列者或本發(fā)明所述的其它任何基因的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明一更佳具體實施方案中，混合物至少有一個拷貝數(shù)編碼異源的BCL-xL。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是任何本發(fā)明所述者，例如表1所提及者。更優(yōu)選為倉鼠或小鼠類來源，例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞的宿主細(xì)胞。益佳者為CHO或BHK細(xì)胞，特別是CHO-DG44、BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1與CHO-DG44細(xì)胞，或可為任何此類細(xì)胞株的衍生物/子代。最佳者為CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1與BHK21；特別是CHO-DG44與CHO-DUKX細(xì)胞。
上述的宿主細(xì)胞可另外藉導(dǎo)入至少一種目的異源基因加以修飾；因此，本發(fā)明亦關(guān)于包括如上述的多拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因，并進(jìn)一步包括至少一種目的基因的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的實施除非另有說明，將使用傳統(tǒng)細(xì)胞生物、分子生物、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)等常規(guī)技術(shù)，而這些皆屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。這些技術(shù)在目前的文獻(xiàn)皆完全揭示。例如參照Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1987更新版)；Brown編輯，Essential Molecular Biology，IRL Press(1991)；Goeddel編輯，Gene Expression Technology，Academic Press(1991)；Bothwell等人編輯，Methods fo Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Bartlett Publ.(1990)；Wu等人，編輯，Recombinant DNA Methodology，AcademicPress(1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，Stockton Press(1990)；McPherson等人，PCRA Practical Approach，IRL Press at Oxford UniversityPress(1991)；Gait編輯，Oligonucleotide Synthesis(1984)；Miller&Calos編輯，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(1987)；Butler編輯，MammalianCell Biotechnology(1991)；Pollard等人，編輯，Animal Cell Culture，HumanaPress(1990)；Freshney等人，編輯，Culture of Animal Cells，Alan R.Liss(1987)；Studzinski，編輯，Cell Growth and Apoptosis，A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press(1995)；Melamed等人，編輯，F(xiàn)low Cytometry andSorting，Wiley-Liss(1990)；Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.(更新版)；Wirth&Hauser，Genetic Engineering of Animals Cells，inBiotechnology第2冊，Puhler編輯，VCH，Weinheim 663-744；Methods ofEnzymology(Academic Press，Inc.)系列叢書與Harlow等人，編輯，AntibodiesA Laboratory Manusal(1987)。
本專利說明書所提及的全部出版品與專利申請，是本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員技術(shù)水平的指示。本文所引用的全部出版品與專利申請，藉此全文引入本文供參考，以更完整說明有關(guān)本發(fā)明的技術(shù)狀態(tài)。參考下列實施例，將更易了解上文的本發(fā)明的一般描述，然而其僅用以說明本發(fā)明的某些具體實施方案，無論如何皆非用以限制本發(fā)明。
實施例縮寫CHO中華倉鼠卵巢DHFR二氫葉酸還原酶ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗FACS熒光激活細(xì)胞分選儀FITC異硫氰酸熒光素HRPO辣根過氧化酶HT次黃嘌呤與胸苷IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位置MIX氨甲喋呤PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS磷酸鹽緩沖的鹽溶液PCR聚合酶鏈反應(yīng)PI碘化丙錠RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)SEAP分泌性的堿性磷酸酶SDS十二烷基硫酸鈉
sICAM可溶性細(xì)胞間粘附分子方法1.細(xì)胞培養(yǎng)將永久培養(yǎng)于補(bǔ)充以次黃嘌呤與胸苷(Invitrogen，Carlsbad，CA)的無血清培養(yǎng)液的懸浮液CHO-S-SFMII(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub等人，1983)，保溫于37℃、含5％CO2的濕度調(diào)整的恒溫箱的細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中。每2-3天，接種濃度為2×105細(xì)胞/毫升的細(xì)胞，并利用CASY1細(xì)胞計數(shù)器(Schaerfe System；Germany)分析細(xì)胞懸浮液(500微升)的細(xì)胞數(shù)及存活力。存活力亦可利用臺盼藍(lán)染色排除來確認(rèn)。單細(xì)胞克隆是利用標(biāo)準(zhǔn)稀釋技術(shù)，以96孔板進(jìn)行。為了以DHFR為基礎(chǔ)的選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞之用，我們使用無次黃嘌呤與胸苷的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液。將20毫摩爾濃度MTX(Sigma，Germany)加入培養(yǎng)液，做為擴(kuò)增選取用藥劑來完成以DHFR為基礎(chǔ)的基因擴(kuò)增。做為批式培養(yǎng)用，將純種系以二重復(fù)接種入含12毫升適當(dāng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶(T25)，并保溫于恒溫箱中7-9天而不加任何新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)將CHO-DG44細(xì)胞培養(yǎng)于CHO-S-SFMII培養(yǎng)液時，補(bǔ)充以10％胎牛血清(Sigma，Germany)。為了傳代，每2-3天將細(xì)胞以胰蛋白酶處理(在含血清時CHO-DG44便會附著)并以2×105細(xì)胞/毫升的濃度接種于新鮮培養(yǎng)液中。
2.表達(dá)載體根據(jù)pAD-CMV載體(Werner等人，1998)的基礎(chǔ)載體pBID，會介導(dǎo)由CMV啟動子/增強(qiáng)子驅(qū)使的異源基因的構(gòu)成性表達(dá)。此外，pBID編碼dhfr的微小基因做為可擴(kuò)增的選擇用標(biāo)記(例如參照EP 0 393 438)。由pAD-sICAM(Werner等人，1998)分離出含sIACM的HindIII/SalI片段，并克隆入pBID的相當(dāng)位置(HindIII與SalI)，以生成pBID-sICAM。以如下方式將人類bcl-xL(SEQ ID NO1，GenBank Accession Number Z23115)與bcl-2(SEQ ID NO3，GenBank登錄號為M13995)同系物克隆入表達(dá)載體。為建構(gòu)pBID-bcl-2，首先將bcl-2以PCR由人類總RNA擴(kuò)增，并再克隆入pCR2.1-TOPO克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。利用EcoRI，將其從那里切出并接合入pBID的相當(dāng)?shù)腅coRI位置。利用Klenow-DNA聚合酶，將填滿的PmeI-切出的pDD6(Fussenegger等人，1998)的IRES-bcl-xL片段，克隆入pBID-sICAM的Xbal位置生成雙順反子的pBID-sICASM-bcl-xL表達(dá)載體。利用SalI/XhoI消化與再接合，將sICAM-IRES成分從pBID-sICAM-bcl-xL中消除，此載體為建構(gòu)pBID-bcl-xL的基礎(chǔ)。PSEAP2-對照包含受SV40啟動子控制的人類的分泌性堿性磷酸酶(Clontech，PaloAlto，CA)。pGL2-對照包含受SV40啟動子驅(qū)使的螢火蟲的蟲熒光素酶(Promega，Madison，USA)。
3.瞬時與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染利用Fugene6試劑(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每次轉(zhuǎn)染，將2毫升的含0.6×106指數(shù)生長的CHO-DG44細(xì)胞的補(bǔ)充以HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液接種入6孔板的孔中。每次轉(zhuǎn)染，依照制造商的方法，使用總共4微克的質(zhì)粒-DNA與10微升的Fugene6試劑。瞬時的轉(zhuǎn)染平行三份重復(fù)進(jìn)行，并于轉(zhuǎn)染48小時后收集上清液與細(xì)胞。為了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后72小時以無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液取代培養(yǎng)液，并于分析或克隆前選取混合的細(xì)胞群2周，而且每3-4天換培養(yǎng)液。單細(xì)胞的克隆是利用標(biāo)準(zhǔn)稀釋技術(shù)。為擴(kuò)增整合入宿主細(xì)胞染色體的異源基因，將衍生自混合的遺傳修飾的宿主細(xì)胞群接種入含200微升的補(bǔ)充以20毫微摩爾濃度MTX的無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液至96孔板。以3周選取擴(kuò)增的單細(xì)胞克隆，并擴(kuò)展入細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶。
4.sICAM ELISA以標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel等人，1994更新版)，利用兩個自行生產(chǎn)的sICAM特異性單克隆抗體(例如美國專利號碼5,284,931與5,475,091所述)，其中之一抗體為HRPO-偶聯(lián)抗體，經(jīng)ELISA定量上清液的sICAM滴度。以純化的sICAM蛋白用做標(biāo)準(zhǔn)物。由Spectra Fluor Plus讀數(shù)機(jī)(TECAN，Crailsheim，Germany)分析樣本。
5.報導(dǎo)酶分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，以Promega的Luciferase Assay System(Madison，WI)決定螢火蟲的蟲熒光素酶報導(dǎo)酶活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，以Clontech的GreatEscAPe SEAP試劑盒(Palo Alto，CA)測定SEAP活性。利用Spectra Fluor Plus讀數(shù)儀(TECAN，Crailsheim，Germany)分析樣本。
6.Western印跡分析利用Western印跡分析確認(rèn)親代宿主細(xì)胞CHO-DG44與遺傳修飾的宿主細(xì)胞的BCL-2與BCL-xL的表達(dá)。以500微升裂解緩沖液(1％TritonX-100、15毫摩爾濃度NaCl、10毫摩爾濃度Tris-HCl pH 7.5加上50微克/毫升苯基甲烷磺酰氟化物與200微升的來自Roche Diagnostics的蛋白酶抑制劑混合物)抽提約1×106的細(xì)胞。裂解物以13000xg離心10分鐘，使之澄清。根據(jù)制造商的方法(Bio-Rad Laboratories GmbH，Munich，Germany)，以Bradford分析確定蛋白質(zhì)濃度。然后，將抽提物貯存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ〉攘康鞍?20微克)進(jìn)行10％SDS-PAGE(Novex；Invitrogen，Carlsbad，CA)并于其后電印跡于硝酸纖維素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)。以5％脫脂奶粉封閉后，利用來自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的BCL-2或BCL-xL特異性的小鼠單克隆抗體檢測蛋白。觀測蛋白是以抗-小鼠過氧化酶-偶合的第二抗體(Dianova GmbH，Hamburg，Germany)利用ECL檢測系統(tǒng)(AmershamBiosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)進(jìn)行。
7.細(xì)胞凋亡的定量利用以熒光為基礎(chǔ)的TUNEL-分析(BD Biosciences PharMingen，SanDiego，CA)定量片段化的DNA量。收取1×106細(xì)胞，以PBS洗過，并以1％聚甲醛的PBS溶液于4℃處理15分鐘。經(jīng)另外的PBS清洗步驟后，將細(xì)胞混以70％乙醇并根據(jù)制造商方法進(jìn)行分析。以FACSCalibur(Becton-Dickinson)進(jìn)行每個樣本的10000個細(xì)胞的FITC與PI發(fā)射情形分析。
8.標(biāo)記的線粒體的流式細(xì)胞計數(shù)法每個樣本收取500000個細(xì)胞，以PBS洗，并以1％聚甲醛的PBS溶液于4℃處理15分鐘。于第二次PBS清洗后，已可進(jìn)行以熒光為基礎(chǔ)的細(xì)胞線粒體的染色。由1毫摩爾濃度貯存液制備含500pM濃度的線粒體選取用的Mito Tracker Green FM染料(Molecular Probes，Eugene，OR)的PBS溶液。將細(xì)胞保溫于200微升，37℃的染色溶液15分鐘。其后，以PBS洗細(xì)胞兩次，懸浮于400微升PBS，并進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。測定每個樣本10000個細(xì)胞的綠色熒光發(fā)射。
9.雜交試驗根據(jù)Ausubel等，1994，更新版所述的標(biāo)準(zhǔn)方案使用DNA或RNA探針＞100bp)進(jìn)行DNA或RNA蛋白印跡的雜交分析。在后雜交洗滌中實現(xiàn)雜交的特異性，其中關(guān)鍵的參數(shù)是終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和洗滌進(jìn)行時的溫度。通過在65℃下0.2XSSC/0.1％SDS中進(jìn)行洗滌實現(xiàn)嚴(yán)格條件。對于高度嚴(yán)格的條件洗滌在65℃下0.1XSSC/0.1％SDS中進(jìn)行。
實例1瞬時與穩(wěn)定模式的存活與產(chǎn)物基因的過度表達(dá)一般傷風(fēng)治療藥sICAM(可溶性的細(xì)胞間粘附分子1)會與ICAM受體競爭鼻病毒的結(jié)合并防止此一般傷風(fēng)的病原與進(jìn)入細(xì)胞及后續(xù)感染所需的ICAM受體作用(Bella等人，1999；Marlin等人，1990)。為詳細(xì)評估抗-細(xì)胞凋亡基因bcl-2與bcl-xL的暫時表達(dá)對sICAM產(chǎn)生的影響，將等量的sICAM編碼質(zhì)粒pBID-sICAM以平行三份與pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL或同基因型對照pBID其轉(zhuǎn)染(圖1)入缺乏dhfr的CHO-DG44。讓細(xì)胞永久生長于無血清的補(bǔ)充以次黃嘌呤與胸苷的CHO-S-SFMII(Invitrogen，Carlsbad，CA)的懸浮液。轉(zhuǎn)染后48小時，利用自行生產(chǎn)的sICAM特異抗體、經(jīng)ELISA定量懸浮液的sICAM滴定度。在BCL-2的表達(dá)劇烈減低對照組pBID的sICAM生產(chǎn)至10％的情形時，異位的BCL-xL的表達(dá)卻增加sICAM產(chǎn)率達(dá)60％(圖2A)。這些資料經(jīng)SEAP表達(dá)情形(以pSEAP2-對照交換pBID-sICAM)證實，其顯示所觀察的BCL-2與BCL-xL的生產(chǎn)特征是一般性的，而非sICAM/BCL-2或sICAM/BCL-xL表達(dá)的組合效果(圖2B)，而且，為評估BCL-2與BCL-xL的表達(dá)對細(xì)胞生產(chǎn)參數(shù)的影響是否與分泌性產(chǎn)物蛋白相聯(lián)系、甚或受其限制，還利用胞內(nèi)熒光素酶報導(dǎo)分子進(jìn)行一致性的產(chǎn)物分析(以pGL2-對照取代pBID-sICAM)。熒光素酶生產(chǎn)特征與前述SEAP及sICAM表達(dá)情形相關(guān)，證實這些細(xì)胞凋亡-抑制基因?qū)HO-DG44細(xì)胞的總體產(chǎn)量的正面(bcl-xL)與負(fù)面(bcl-2)影響(圖2C)。所需蛋白在BCL-2表達(dá)后的減量生產(chǎn)情形，在適應(yīng)懸浮液生長的COS-7細(xì)胞(ATCC CRL-1651)、附著依賴性的CHO-K1(ATCC CCL-61)與CHO-DUKX細(xì)胞(ATCC CRL-9096)亦發(fā)現(xiàn)。
盡管瞬時轉(zhuǎn)染實驗對異源基因在廣范圍的細(xì)胞型態(tài)與拷貝數(shù)的代謝的工程改造能力給我們高度可依賴的資料，卻僅有穩(wěn)定的混合群體得無疑地證實所觀察的表達(dá)型。因而，生成每個pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL、pBID-sICAM/pBID-構(gòu)型的6個混合群的sICAM滴定度情形。于無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液利用以DHFR為基礎(chǔ)的篩選來選取表達(dá)異源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。圖3顯示在3天培養(yǎng)期中由那些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的混合群所生產(chǎn)的sICAM的絕對產(chǎn)量。每個值表示經(jīng)5次傳代后所有群的平均sICAM產(chǎn)量，而每次傳代皆取一些樣本。如瞬時轉(zhuǎn)染可見到的，BCL-2的表達(dá)對sICAM產(chǎn)量有負(fù)面影響，滴定度減低達(dá)50％；至于與工程處理僅sICAM表達(dá)的對照組群比較，BCL-xL的表達(dá)增加此一般傷風(fēng)治療劑的總體產(chǎn)率達(dá)30％。這些在瞬時與穩(wěn)定表達(dá)構(gòu)型中所得的相關(guān)性結(jié)果提示，抗-細(xì)胞凋亡的工程策略的設(shè)計應(yīng)在仔細(xì)考慮了可利用的存活決定因素后再予以考慮。
實施例2bcl-2與bcl-xL的dhfr-擴(kuò)增的基因表達(dá)對穩(wěn)定的生產(chǎn)sICAM的細(xì)胞純種系的存活力與抗-細(xì)胞凋亡的效果。
為評估抗-細(xì)胞凋亡工程處理對無血清的批式培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因CHO-DG44細(xì)胞株的效果，選取由CHO-DG44與pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL或pBID-sICAM/pBID載體組合穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染、且來自6種混合的細(xì)胞群的個別最高生產(chǎn)sICAM的細(xì)胞群做進(jìn)一步分析。利用于96孔板的限制性細(xì)胞稀釋，進(jìn)行兩個單細(xì)胞的克隆步驟，一個是在無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(非擴(kuò)增的細(xì)胞純種系)；另一個包括單回合的MTX-誘發(fā)的DHFR-為基礎(chǔ)的擴(kuò)增，且以20毫微摩爾濃度的MTX補(bǔ)充無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液(擴(kuò)增的細(xì)胞純種系)。利用ELISA篩選最高的sICAM生產(chǎn)者的細(xì)胞純種系，每個基因組態(tài)選取兩個最好的純種系做進(jìn)一步分析。除了pBID-sICAM外，這些細(xì)胞純種系亦含下列之一的構(gòu)建體(i)位于HMNI-1、HMNI-2(未擴(kuò)增)及HMNI-3、HMNI-4(已擴(kuò)增)中的pBID(僅有載體的對照組)，(ii)位于HMNIBC-1、HMNIBC-2(未擴(kuò)增)及HMNIBC-3、HMNIBC-4(已擴(kuò)增)中的pBID-bcl-2，(iii)位于HMNIBX-1、HMNIBX-2(未擴(kuò)增)及HMNIBX-3、HMNIBX-4(已擴(kuò)增)中的pBID-bcl-xL。
每天檢測批式培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中全部的細(xì)胞純種系，持續(xù)一周。如圖4可見，所有非擴(kuò)增的細(xì)胞純種系，包括僅有載體的對照組，展現(xiàn)類似的存活力情形，此清楚顯示BCL-2與BCL-xL對存活力的效果可忽視。于第7天，存活力在所有情形皆降至約30-40％。然而，在含擴(kuò)增的異源基因的純種系的下降期，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活力明顯較高。在有關(guān)細(xì)胞死亡的保護(hù)方面，BCL-xL明顯比BCL-2表達(dá)好(圖5)。在表達(dá)BCL-xL的細(xì)胞株(HMNIBX-3/4)，于第9天仍有70％的活細(xì)胞，這與表達(dá)BCL-2的細(xì)胞株(HMNIBC-3/4)的約60％的活細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?xì)胞株(HMNI-3/4)的無活細(xì)胞形成對照。與存活力增加相關(guān)，使用熒光為基礎(chǔ)的TUNEL分析，于2、4及6天時評估擴(kuò)增的細(xì)胞純種系，亦顯示起始細(xì)胞死亡程序的細(xì)胞百分比劇烈減少(圖6)。然而，在第2天時全部的轉(zhuǎn)基因組態(tài)幾乎皆未發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞，而第4天時則可見凋亡的細(xì)胞明顯增加。增加最少達(dá)5％者，為表達(dá)BCL-xL的細(xì)胞；隨之為表達(dá)BCL-2的細(xì)胞為10％；至于轉(zhuǎn)基因的對照組細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞幾乎達(dá)30％。于第6天時，不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株間的差異更明顯。BCL-xL的細(xì)胞凋亡抑制潛力與BCL-2比較至少高3倍；因為在此階段后者BCL-xL的凋亡細(xì)胞達(dá)30％，而前者僅10％。在未表達(dá)任何異源抗-細(xì)胞凋亡基因的轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的數(shù)目則已達(dá)60％。
為證實抗-細(xì)胞凋亡基因的擴(kuò)增狀態(tài)，遂進(jìn)行BCL-2與BCL-xL指向的Western印跡分析。圖7顯示僅轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M細(xì)胞株HMNI-1的基礎(chǔ)BCL-2(圖7A)與BCL-xL(圖7B)表達(dá)量接近檢測極限，并與親代CHO-DG44細(xì)胞的表達(dá)量相當(dāng)。此顯示存活的基因表達(dá)并未受以DHFR為基礎(chǔ)的選取向上調(diào)控，這與較早的G418介導(dǎo)的選取報告偏向增強(qiáng)的存活結(jié)果有所不同(Tey等人，2000a)。與基因轉(zhuǎn)基因?qū)φ战MHMNI-1和親代CHO-DG44(圖12A與12B，HMNIBC-3/4與HMNIBX-3/4)比較，利用以DHFR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增，BCL-2與BCL-xL的表達(dá)情形可分別增加至少80-100倍與30-40倍。在非擴(kuò)增的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，BCL-2與BCL-xL的表達(dá)量增加不到10倍。此蛋白量明顯低是因為充分的抗-細(xì)胞凋亡保護(hù)效果(圖5)。以具雙順反子組態(tài)的表達(dá)載體-pBID-sICAM-bcl-xL轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可得相當(dāng)結(jié)果。在此轉(zhuǎn)錄單位的第一個順反子的sICAM的開始(set up)翻譯中，其起始是傳統(tǒng)的cap-依賴模式；而第二個順反子的bcl-xL的cap-依賴模式，是由衍生自腦心肌炎病毒的IRES元件所驅(qū)使。選擇用可擴(kuò)增的標(biāo)記dhfr是包含在相同載體的分開的轉(zhuǎn)錄單位。
BCL-2與BCL-xL介導(dǎo)的抗-細(xì)胞凋亡工程的詳細(xì)分析例示這些存活決定因子的高水平表達(dá)是必須的，以便在永久培養(yǎng)于無血清條件的CHO-DG44細(xì)胞中展現(xiàn)任何明顯的保護(hù)效果。
實施例3利用斑點印跡分析確定基因的拷貝數(shù)整合入轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞CHO-DG44的異源抗-細(xì)胞凋亡基因bcl-2與bcl-xL的拷貝數(shù)是利用斑點印跡分析來決定。為此目的，利用市售Qiagen的Genomic Blood&Tissue Kit(Hilden，Germany)，根據(jù)制造商所述方法，由轉(zhuǎn)基因與親代CHO-DG44細(xì)胞株分離基因組DNA。將通常介于0.5-15微克的不同量基因組DNA的溶于堿性緩沖液者，使用附著于抽氣裝置(suctiondevice)的歧管(其細(xì)節(jié)請見Ausubel等人，1994，更新版)二重復(fù)施用于帶正電的Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)。被印跡的基因組DNA的量，視其后將由雜合的探針?biāo)褜さ哪繕?biāo)序列的相對量而定。然后進(jìn)行雜合分析以決定印跡的DNA制備物的bcl-2與bcl-xL序列的量。遵照基因圖像隨機(jī)引物標(biāo)識模式(Gene Images random prime labelling module)(Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)的方法，產(chǎn)生隨機(jī)引物引導(dǎo)(random-primed)的FITC-dUTP標(biāo)記的bcl-2與bcl-xL特異性探針；若非利用由EcoRI消化pBID-bcl-2所得bcl-2特異性的640堿基對片段，即是利用PvuII/BcII消化pBID-bcl-xL的bcl-xL特異性730堿基對片段做為標(biāo)識反應(yīng)的模板。根據(jù)基因圖像隨機(jī)引物標(biāo)識模式的方法，雜交是于雜交箱中以65℃雜交過夜。雜交后濾膜以0.2xSSC/0.1％SDS，65℃洗兩次、各20分鐘，然后根據(jù)Gene Images CDP-Star檢測模式(Amersham Biosciences)，繼續(xù)抗體顯色與檢測。信號定量是利用VDS-CL Imager System(Amersham Biosciences)進(jìn)行的。分離自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基因組DNA的bcl-2或bcl-xL特異性信號的信號強(qiáng)度是與固定分子數(shù)的pBID-bcl-2或pBID-bcl-xL表達(dá)質(zhì)粒(根據(jù)質(zhì)粒分子量為基礎(chǔ)計算的數(shù)目)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，且用來估計基因組DNA樣本內(nèi)的目標(biāo)DNA的絕對量。因為內(nèi)源性bcl-2與bcl-xL基因，親代細(xì)胞株CHO-DG44的基因組DNA的雜交信號將從轉(zhuǎn)基因信號減去。然后將轉(zhuǎn)基因樣本的拷貝數(shù)除以每個樣本的DNA量，以取得每個細(xì)胞的基因拷貝數(shù)并根據(jù)每個細(xì)胞5pg的DNA量，乘以5pg。為校正所比較的樣本間DNA的量，于脫去濾膜(filter)上的第一種探針后，在相同濾膜的第二次雜合反應(yīng)中以倉鼠的mbh-1基因的一部分(myc-為基礎(chǔ)的基序的同系物1)用做內(nèi)部控制基因探針。
藉此方法，可確定經(jīng)由導(dǎo)入與擴(kuò)增bcl-2或bcl-xL基因(例如，如本文所述者)的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，其包含至少5、10、20、50或100拷貝數(shù)的異源bcl-2與bcl-xL基因。
實施例4藉添加血清調(diào)節(jié)線粒體數(shù)目為明顯影響生長于無血清條件的CHO-DG44的存活，很清楚的需要高BCL-2或BCL-xL劑量，起始我們思考是否線粒體的量與因而對程序性細(xì)胞死亡的敏感性是視血清而定。因為發(fā)現(xiàn)血清是細(xì)胞凋亡的重要保護(hù)因素，而且線粒體是細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)者(類似BCL-2與BCL-xL)的主要平臺，此假設(shè)更令人信服。
以決定血清依賴型的特定線粒體量為焦點，CHO-DG44細(xì)胞，若非培養(yǎng)于無血清的CHO-S-SFMII培養(yǎng)液的懸浮液，即是培養(yǎng)于補(bǔ)充以10％FCS的CHO-S-SFMII中成附著細(xì)胞。于所述條件培養(yǎng)2周后，兩種培養(yǎng)的細(xì)胞皆利用MitoTracker Green FM-線粒體特異性的熒光染料描述其特定線粒體含量。因MitoTracker Green FM會以膜電位依賴方式在線粒體累積，故其是定量這些細(xì)胞器的良好工具(Metivier等人，1998)。與培養(yǎng)在含血清的細(xì)胞比較，線粒體特異性染色在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)中明顯增加。FACS-介導(dǎo)的分析定量特定線粒體含量增高達(dá)3倍(圖8)。因無血清條件下線粒體清楚擴(kuò)增，故直接提示血清依賴型細(xì)胞株的成功抗-細(xì)胞凋亡工程處理需增加BCL-2或BCL-xL表達(dá)量以補(bǔ)足與這些細(xì)胞器相關(guān)的細(xì)胞凋亡機(jī)制的特定增加。
實施例5克隆倉鼠bcl-xL cDNA設(shè)計了以下5’末端引物(Bcl for15’-GCCACCATGTCTCAGAGCAAACCGGGAG-3’；SEQ ID NO13)和3’末端引物(Bcl rev15’-TCAYTTCCGACTGAAGAGYGARCC-3’；SEQ ID NO14)。這些引物根據(jù)方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于一步RT-PCR，對從倉鼠細(xì)胞系CHO-DG44(Urlaub et al.，1983)中分離的1μg總RNA進(jìn)行所述RT-PCR以獲得bcl-xL cDNA的倉鼠同源物。產(chǎn)生的700bp cDNA產(chǎn)物亞克隆入TA-型克隆載體(Invitrogen)中，并在ABI 373A自動測序儀(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)上測定兩條cDNA鏈的核苷酸序列，其中使用載體特異的(M13反向，T7)和基因特異的引物(Bcl for1和Bcl rev1)根據(jù)產(chǎn)品說明(Applied Biosystems)啟動Big Dye Terminator Cycle Sequencing reaction試劑盒中的延伸反應(yīng)。對GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索已確定分離的cDNA以及其包含倉鼠bcl-xL基因的整個編碼區(qū)。
為測定倉鼠bcl-xL基因編碼區(qū)的真實5’和3’末端序列，使用了基因組步移法(genomic walking approach)。為分別分離含有編碼區(qū)5’末端和3’末端的基因組區(qū)，根據(jù)倉鼠bcl-xL序列設(shè)計了以下引物(i)重疊引物Bcl rev5(5’-CATCACTAAACTGACTCCAGCTG-3’；SEQID NO15)和Bcl rev6(5’-TGACTCCAGCTGTATCCTTTCTG-3’；SEQ ID NO16)，位于編碼區(qū)的5’末端的下游，并與分離5’末端的編碼鏈互補(bǔ)，(ii)重疊引物Bcl for2(5’-GACGGGCATGACTGTGGCTG-3’；SEQ IDNO17)和Bcl for3(5’-TGACTGTGGCTGGTGTGGTTCT-3’；SEQ ID NO18)，位于編碼區(qū)的3’末端的上游，并與分離3’末端的非編碼鏈互補(bǔ)，銜接子接連的基因組CHO-DG44 DNA作為嵌套式PCR中的模板。初級PCR用與銜接子互補(bǔ)的引物以及bcl-xL特異的引物(分別為Bcl rev5或Bcl for2)的組合物進(jìn)行。次級PCR利用初級PCR產(chǎn)物以及內(nèi)部銜接子引物和嵌套式bcl-xL特異引物(分別為Bcl rev6或Bcl for3)的組合物。產(chǎn)生的DNA片段的大小在0.5kb和1.8kb之間，其起點是bcl-xl引物末端已知序列，并延伸到各種長度的未知鄰近基因組DNA，將該片段克隆到TA-型克隆載體(Invitrogen)中，并進(jìn)一步利用序列分析進(jìn)行分析。所有重疊DNA片段含有倉鼠bcl-xL編碼區(qū)的5’或3’末端，以及未翻譯區(qū)的5’或3’末端的序列。根據(jù)該序列信息，在反應(yīng)中使用以下引物重復(fù)一步式RT-PCR倉鼠特異的5’末端引物(5’-TCCGGAATTCGCCACCATGTCTCAGAGCAACC GGGAG-3’；SEQ ID NO19)和3末端引物Xho-Bcl rev(5’-TCCGCTCGAGTCACTTCCGACTGAA GAGAGAGCC-3’；SEQ ID NO20)。通過這種方法獲得完整的倉鼠源bcl-xL編碼區(qū)(圖9)。引物Eco-Bcl for和Xho-Bcl rev包括bcl-xL序列和EcoRI或XhoI的限制性酶切位點，用于亞克隆到真核表達(dá)載體pBID中，產(chǎn)生pBID/bcl-xL(圖10)。該載體基于pAD-CMV載體(Werner等，1998)，介導(dǎo)CMV啟動子/增強(qiáng)子驅(qū)動的異源基因的構(gòu)成性表達(dá)。此外，pBID編碼dhfr微小基因，該基因是可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記(見例如EP 0 393 438)。
實施例6倉鼠bcl-xL缺失突變體的產(chǎn)生多種具有不同的非保守非結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)缺失的倉鼠bcl-xL突變體如下克隆。簡言之，每種缺失突變體的5’和3’末段分別通過PCR產(chǎn)生，通過新引入的Not I限制性位點連接，直接克隆到真核表達(dá)載體pBID中并通過序列分析確定。缺失的氨基酸殘基被4個丙氨酸的序列一致地取代，該序列作為橋接相鄰結(jié)構(gòu)域的接頭。表達(dá)載體pBID/bcl-xL含有倉鼠bcl-xL野生型cDNA，并在PCR中用作模板，與各種引物組合產(chǎn)生編碼區(qū)5’或3’部分的所需部分，所述編碼區(qū)位于缺失的DNA序列的上游或下游(圖11)(i)5’部分a)載體特異的上游引物與del26組合(5’-ATAGTTATGCTGCG GCCGCACTCCAGCTGTATCCTTTCTGG-3’)(SEQ ID NO19)b)載體特異的上游引物與del46組合(5’-ATAGTTATGCTGCGGCCGCCCTCTCTGATTCAGTTCCTTCTG-3’)(SEQ ID NO20)c)載體特異的上游引物與del66組合(5’-ATAGTTATGCTGCGGCCGCTACCGCGGGGCTGTCCGCC-3’)(SEQ ID NO21)(ii)3’部分a)載體特異的下游引物與del63組合(5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCAGCGGTAAATGGAGCCACTGGC-3’)(SEQ ID NO22)載體特異的下游引物與del83結(jié)合(5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCAGCAGCCGTAAAGCAAGCGCTG-3`)(SEQ ID NO23)為使產(chǎn)生缺失突變體pBID/bcl-xLdel26-83分別具有SEQ ID NOs5和6的nt和aa序列，pBID/bcl-xLdel46-83分別具有SEQ ID NOs7和8的nt和aa序列，pBID/bcl-xLdel66-83分別具有SEQ ID Nos9和10的nt和aa序列，以及pBID/bcl-xLdel46-63分別具有SEQ ID NOs11和12的nt和aa序列，PCR片段del26和del83，del46和del83，del66和del83或del46和del63分別通過引入的NotI限制性位點連接并作為EcoRI/SnaBI限制性片段克隆入表達(dá)載體pBID中。數(shù)字表明缺失的氨基酸，例如del26-83表示，在突變體中倉鼠野生型BCL-xL序列的氨基酸26-83缺失。
參考資料Adam，M.A.et al.，J Virol 1991，65，4985-4990Al-Rubeai，M.et al.，Curr Opin Biotechnol 1998，9，152-156Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current protocols in molecular biology.New YorkGreene Publishing Associates and Wiley-Interscience.1994(updated)Bella，J.et al.，J Struct Biol 1999，128，69-74Boise，L.H.et al.，Cell 1993，74，597-608
Bothwell et al.eds.，Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Bartlett Publ.，1990Brown ed.，Essential Molecular Biology，IRL Press，1991Butler ed.，Mammalian Cell Biotechnology，1991Chang，B.S.et al.，Embo J1997，16(5)，968-977Chung，J.D.et al.，Biotechnol Bioeng 1998，57，164-171Cotter，T.G.et al.，F(xiàn)rends Biotechnol 1995，13，150-155Davies，M.V.et al.，J Virol 1992，66，1924-1932deZengotita，V.M.et al.，Biotechnol Bioeng 2000，69，566-576Fassnacht，D.et al.，Cytotechnology 1998，26，219-225Figueroa，B.Jr.et al.，Biotechnol Bioeng 2001，73，716-723Follstad，B.D.et al.，Eur J Biochem 2000，267，6534-6540Franek，K.et al.，J FEBS Lett 1991，284，285-287Franek，F(xiàn).et al.，Immunol Lett 1996，52，139-144.
Freshney et al.，eds.，Culture of Animal Cells，Alan R.Liss，1987Fussenegger，M.et al.，Nat Biotechnol 1998，16，468-472Fussenegger，M.et al.，Cytotechnology 2000，32，45-61Gait ed.，Oligonucleotide Synthesis，1984Goeddel ed.，Gene Expression Technology，Academic Press，1991Gossen，M.et al.，Curr Opi Biotech 1994，5，516-520Goswami，J.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，62，632-640Green，D.R.et al.，Science 1998，281，1309-1312Haber，D.A.et al.，Somatic Cell Genetics 1982，8，499-508Harlow et al.，eds.，AntibodiesA Laboratory Manual，1987Harris and Angal，Protein PurificationA Practical Approach，Pichwood andHames，eds.，IRL Press，1995Hemann，C.et al.，DNA Cell Biol 1994，13(4)，437-445Hu et al.，Cancer Res.1996，56，3055-3061Huston C.et al.，PNAS 1988，85(16)5879-5883Itoh，Y.et al.，Biotechnol Bioeng 1995，48，118-112Jang，S.K.et al.，J Virol 1989，63，1651-1660
Kaufman，R.J.，Methods in Enzymology 1990，185，537-566Kortt et al.，Protein Engineering 1997，10，423-433Kriegler，Gene Transfer and Expression，Stockton Press，1990Kyte，J.et al.，J Mol Biol 1982，157，105-132Laken，H.A.et al.，Curr Opin Biotechnol 2001，12，175-179Loyvejoy et al.，Science 1993，259，1288-1293Marlin，S.D.et al.，Nature 1990，344，70-77Mastrangelo，A.J.et al.，Trends Biotechnol 1998，16，88-95Mastrangelo，A.J.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，65，298-305Mastrangelo，A.J.et al.，Biotechnol Bioeng 2000a，67，555-564Mastrangelo，A.J.et al.，Biotechnol Bioeng 2000b，67，644-554McPherson et al.，PCRA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，1991Melamed et al.，eds.，F(xiàn)low Cytometry and Sorting，Wiley-Liss，1990Mercille，S.et al.，Biotechnol Bioeng 1994，44，1140-1154Mercille，S.et al.，Biotechnol Bioeng 1999a，63，529-543Mercille，S.et al.，Biotechnol Bioeng 1999b，63，516-528Metivier，D.et al.，Immunol Lett 1998，61，157-163Miller&Calos eds.，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，1987Monaco，L.et al.，Gene 1996，180，145-150Moore，A.et al.，Cytotechnology 1995，17，1-11Morgan，R.A.et al.，Nucl Acids Res 1992，20，1293-1299Mosser，D.D.et al.，BioTechmiques 1997，22(1)，150-156Ohshima，Y.et al.，J Mol Biol 1987，195，247-259Pack et al.，Biotechnology 1993，11，1271-1277Pack et al.，J.Mol.Biol.1995，246，28-34Pan，G.et al.，J Biol Chem 1998，273，5841-5845Pelletier，J.et al.，Nature 1988，334，320-325Perisic O，et al.，Structure 1994，2，1217-1226Plollard et al.，eds.，Animal Cell Culture，Humana Press，1990Ramesh，N.et al.，Nucl Acids Res 1996，24，2697-2700
Reynolds，J.E.et al.，Exp Cell Res 1996，225，430-436Sambrollk et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989Sanfeliu，A.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，64，46-53Sanfeliu，A.et al.，Biotechnol Bioeng 2000，70，421-427Scopes，R.，Protein Purfication，Springer Verlag，1988Simonson，C.C.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1983，80，2495-2499Simpson，N.H.et al.，Biotechnol Bioeng 1997，54，1-16Simpson，N.H.et al.，Biotechnol Bioeng 1998，59，90-98Simpson，N.H.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，64，174-186Studzinski，ed.，Cell Growth and Apoptosis，A Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press 1995Sugimoto et al.，Biotechnology 1994，12，694-698Terada，S.et al.，Cytotechnology 1997，25，17-23Tey，B.T.et al.，Biotechnol Bioeng 2000a，68，31-43Tey，B.T.et al.，J Biotechnol 2000b，79，147-159Tusjimoto，Y.，Genes to Cell 1998，3，697-707Urlaub，G.et al.，Cell 1983，33，405-412Werner，R.G.et al.，Arzneim.-Forsch./Drug.Res.1998，48，870-880Wigler，M.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1980，77，3567-3570Wirth and Hauser，Genetic Engineering of Animals Cells，inBiotechnologyVol.2，Puhler ed.，VCH，Weinheim 663-744Wu et al.，eds.，Recombinant DNA Methodology，Academic Press(1989)Wyllie，A.H.et al.，Int Rev Cytol 1980，68，251-306Zanghi，J.A.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，64，108-199Zanghi，J.A.et al.，Biotechnol Prog 2000，16，319-325
序列表<110>貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co.KG)<120>具有改良的存活性質(zhì)的宿主細(xì)胞及該細(xì)胞的生產(chǎn)方法<130>Case 1-1314<160>25<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>926<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gaatctcttt ctctcccttc agaatcttat cttggctttg gatcttagaa gagaatcact 60aaccagagac gagactcagt gagtgagcag gtgttttgga caatggactg gttgagccca120tccctattat aaaaatgtct cagagcaacc gggagctggt ggttgacttt ctctcctaca180agctttccca gaaaggatac agctggagtc agtttagtga tgtggaagag aacaggactg240aggccccaga agggactgaa tcggagatgg agacccccag tgccatcaat ggcaacccat300cctggcacct ggcagacagc cccgcggtga atggagccac tgcgcacagc agcagtttgg360atgcccggga ggtgatcccc atggcagcag taaagcaagc gctgagggag gcaggcgacg420agtttgaact gcggtaccgg cgggcattca gtgacctgac atcccagctc cacatcaccc480cagggacagc atatcagagc tttgaacagg tagtgaatga actcttccgg gatggggtaa540actggggtcg cattgtggcc tttttctcct tcggcggggc actgtgcgtg gaaagcgtag600acaaggagat gcaggtattg gtgagtcgga tcgcagcttg gatggccact tacctgaatg660accacctaga gccttggatc caggagaacg gcggctggga tacttttgtg gaactctatg720ggaacaatgc agcagccgag agccgaaagg gccaggaacg cttcaaccgc tggttcctga780cgggcatgac tgtggccggc gtggttctgc tgggctcact cttcagtcgg aaatgaccag840acactgacca tccactctac cctcccaccc ccttctctgc tccaccacat cctccgtcca900gccgccattg ccaccaggag aacccg 926<210>2<211>911<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<400>2tgattgaaga caccccctcg tccaagaatg caaagcacat ccaataaaat agctggatta 60taactcctct tctttctctg ggggccgtgg ggtgggagct ggggcgagag gtgccgttgg120cccccgttgc ttttcctctg ggaaggatgg cgcacgctgg gagaacgggg tacgacaacc180gggagatagt gatgaagtac atccattata agctgtcgca gaggggctac gagtgggatg240cgggagatgt gggcgccgcg cccccggggg ccgcccccgc accgggcatc ttctcctccc300agcccgggca cacgccccat ccagccgcat cccgcgaccc ggtcgccagg acctcgccgc360tgcagacccc ggctgccccc ggcgccgccg cggggcctgc gctcagcccg gtgccacctg420tggtccacct ggccctccgc caagccggcg acgacttctc ccgccgctac cgcggcgact480tcgccgagat gtccagccag ctgcacctga cgcccttcac cgcgcgggga cgctttgcca540cggtggtgga ggagctcttc agggacgggg tgaactgggg gaggattgtg gccttctttg600agttcggtgg ggtcatgtgt gtggagagcg tcaaccggga gatgtcgccc ctggtggaca660acatcgccct gtggatgact gagtacctga accggcacct gcacacctgg atccaggata720acggaggctg ggtaggtgca tctggtgatg tgagtctggg ctgaggccac aggtccgaga780tcgggggttg gagtgcgggt gggctcctgg gcaatgggag gctgtggagc cggcgaaata840aaatcagagt tgttgcttcc cggcgtgtcc ctacctcctc ctctggacaa agcgttcact900cccaacctga c 911<210>3<211>863<212>DNA<213>黝倉鼠(Cricetulus griseus)<400>3cagagcagac ccagtgagtg agcaggtgtt ttggacaatg gactggttga gcccatctgt 60attataaaaa tgtctcagag caaccgggag ctagtggttg actttctctc ctacaagctc120tcccagaaag gatacagctg gagtcagttt agtgatgtcg aagagaacag gactgaggcc180ccagaaggaa ctgaatcaga gagggagacc cccagtgcca tcaatggcaa cccatcctgg240cacctggcgg acagccccgc ggtaaatgga gccactggcc acagcagcag tttggatgca300cgggaggtga tccccatggc agccgtaaag caagcgctga gagaggccgg cgatgagttt360gagctgcggt accggcgggc gttcagtgat ctaacatccc agcttcatat aaccccaggg420actgcatatc aaagctttga acaggtagtg aatgaactct tccgggatgg ggtaaactgg480ggtcgcattg tggccttttt ctccttcggt ggagccctct gtgtggaaag cgtagacaag540gagatgcagg tattggtgag tcggatcgca agttggatgg ccacctacct gaatgaccac600ctagagcctt ggatccagga caacggcggc tgggacactt tcgtggaact ctacggaaac660aatgcagcag ctgagagccg gaaaggccag gagcgcttca accgctggtt cctgacgggc720atgactgtgg ctggtgtggt tctgctgggc tctctcttca gtcggaagtg acaagacagt780gaccacctac tcacatctcg cctcccaccc tatccccacc acaactctct cttcagccac840cattgctacc aggagaacca cta863
<210>4<211>233<212>PRT<213>黝倉鼠(Cricetulus griseus)<400>4Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu20 25 30Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Glu Thr Pro35 40 45Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala50 55 60Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val65 70 75 80Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu85 90 95Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu100 105 110His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn115 120 125Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe130 135 140Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln145 150 155 160Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp165 170 175His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val180 185 190Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu195 200 205Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val210 215 220Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys225 230<210>5<211>540
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO3的缺失突變體(de126-83)<400>5atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa 60ggatacagct ggagtgcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc120gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata180accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg240gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc300gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg360aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc420tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc480ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga540<210>6<211>179<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO4的缺失突變體(de126-83)<400>6Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val20 25 30Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg35 40 45Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr50 55 60Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly65 70 75 80Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu85 90 95Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile100 105 110Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile115 120 125
Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn130 135 140Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe145 150 155 160Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe165 170 175Ser Arg Lys<210>7<211>600<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO3的缺失突變體(de146-83)<400>7atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa 60ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga120actgaatcag agagggcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc180gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata240accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg300gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc360gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg420aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc480tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc540ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga600<210>8<211>199<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO4的缺失突變體(de146-83)<400>8Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu20 25 30
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Ala Ala Ala35 40 45Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu50 55 60Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu His Ile65 70 75 80Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn Glu Leu85 90 95Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe100 105 110Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln Val Leu115 120 125Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu130 135 140Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu145 150 155 160Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu Arg Phe165 170 175Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val Leu Leu180 185 190Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys195<210>9<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO3的缺失突變體(de166-83)<400>9atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa 60ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga120actgaatcag agagggagac ccccagtgcc atcaatggca acccatcctg gcacctggcg180gacagccccg cggtagcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc240gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata300accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg360gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc420gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg480aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc540
tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc600ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga660<210>10<211>219<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO4的缺失突變體(de166-83)<400>10Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu20 25 30Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Glu Thr Pro35 40 45Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala50 55 60Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly65 70 75 80Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser85 90 95Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val100 105 110Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala115 120 125Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu130 135140Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu145 150 155 160Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr165 170 175Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly180 185 190Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly195 200 205Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys210 215
<210>11<211>660<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO3的缺失突變體(de146-63)<400>11atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa 60ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga120actgaatcag agagggcggc cgcagcagcg gtaaatggag ccactggcca cagcagcagt180ttggatgcac gggaggtgat ccccatggca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc240gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata300accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg360gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc420gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg480aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc540tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc600ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga660<210>12<211>219<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO4的缺失突變體(de126-83)<400>12Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1 5 10 15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu20 25 30Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Ala Ala Ala35 40 45Ala Ala Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg50 55 60Glu Val Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly65 70 75 80Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser85 90 95
Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val100 105 110Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala115 120 125Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu130 135 140Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu145 150 155 160Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr165 170 175Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly180 185 190Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly195 200 205Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys210 215<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev1)<400>13gccaccatgt ctcagagcaa accgggag 28<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev1)<220>
<221>Y<222>(4)..(4)<223>Y指T或C<220>
<221>Y<222>(19)..(19)<223>Y指T或C<220>
<221>R<222>(22)..(22)<223>R指G或A<400>14tcayttccga ctgaagagyg arcc 24<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev5)<400>15catcactaaa ctgactccag ctg 23<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev6)<400>16tgactccagc tgtatccttt ctg 23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl for2)<400>17gacgggcatg actgtggctg 20
<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Bcl for3)<400>18tgactgtggc tggtgtggtt ct 22<210>19<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Eco-Bcl for)<400>19tccggaattc gccaccatgt ctcagagcaa ccgggag 37<210>20<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(Xho-Bcl rev)<400>20tccgctcgag tcacttccga ctgaagagag agcc 34<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(de126)<400>21atagttatgc tgcggccgca ctccagctgt atcctttctg g 41<210>22<211>42<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(de146)<400>22atagttatgc tgcggccgcc ctctctgatt cagttccttc tg 42<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(de166)<400>23atagttatgc tgcggccgct accgcggggc tgtccgcc 38<210>24<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(de163)<400>24aagtaagaag cggccgcagc agcggtaaat ggagccactg gc 42<210>25<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(de183)<400>25aagtaagaag cggccgcagc agcagccgta aagcaagcgc tg 4權(quán)利要求
1.一種藉導(dǎo)入編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列以遺傳修飾的倉鼠宿主細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK或BHK-21(2254-62.2)細(xì)胞，或任何此類細(xì)胞株的子代。
4.一種藉導(dǎo)入編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的核酸序列以遺傳修飾的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為NS0或SP2/0-Ag14細(xì)胞，或任何此類細(xì)胞株的子代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼可起細(xì)胞死亡抑制物作用的Bcl-2超家庭的成員。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL或BCL-2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ IDNO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何生物活性片段，變體或衍生物的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的宿主細(xì)胞，其編碼BCL-xL。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9或SEQ ID NO11，或其任何生物活性片段，變體或衍生物的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脫氨酶、腺苷酸脫氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脫氫酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸還原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鳥氨酸脫羧酶、HMG CoA還原酶、乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL，而該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼DHFR、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脫氨酶、腺苷酸脫氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脫氫酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸還原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鳥氨酸脫羧酶、HMG CoA還原酶、乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATPP酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL而該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼DHFR。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因、該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因在可操作地連接于至少一種允許所述基因表達(dá)的調(diào)控序列。
16.一種在哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與至少一種目的基因的方法，其包括(a)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與目的基因的核酸序列導(dǎo)入倉鼠宿主細(xì)胞群，其中所述基因可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的調(diào)控序列，(b)將該宿主細(xì)胞群于可表達(dá)該基因的條件下培養(yǎng)。
17.一種產(chǎn)生顯示增強(qiáng)表達(dá)量的抗-細(xì)胞凋亡基因的哺乳動物宿主細(xì)胞的方法，其包括(a)將編碼抗-細(xì)胞凋亡基因、選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因與視情形的至少一種目的基因的核酸序列導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞群，其中所述基因可操作地連接于至少一種允許該基因表達(dá)的調(diào)控序列，(b)將該細(xì)胞群于至少可表達(dá)該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因和該抗-細(xì)胞凋亡基因，且是有利于獲得至少該抗-細(xì)胞凋亡基因的多拷貝數(shù)的條件下培養(yǎng)，(c)從所述細(xì)胞群中選取至少摻入了多拷貝數(shù)的抗-細(xì)胞凋亡基因的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述目的基因被導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞群中。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項的方法，其中所述哺乳動物宿主細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞或倉鼠細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述倉鼠細(xì)胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項的方法，其中所述哺乳動物宿主細(xì)胞為NS0或SP2/0-Ag14細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求15至19中任一項的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL或BCL-2。
24.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ IDNO7.SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何生物活性片段，變體或突變體(簡并和非簡并性)的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL。
26.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的方法，其中該抗-細(xì)胞凋亡基因具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何生物活性片斷，變體或突變體(簡并和非簡并性)的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求16至26中任一項的方法，其中所述選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脫氨酶、腺苷酸脫氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脫氫酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸還原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鳥氨酸脫羧酶、HMGCoA還原酶、乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶、蘇氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求16至21中任一項的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL而該選擇用的可擴(kuò)增的標(biāo)記基因編碼DHFR。
29.一種產(chǎn)生哺乳動物宿主細(xì)胞的方法，其包括(a)將抗-細(xì)胞凋亡基因與DHFR基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞群，(b)在氨甲喋呤存在的條件下擴(kuò)增該抗-細(xì)胞凋亡基因。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-2或BCL-xL。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31的方法，其中所述宿主細(xì)胞為小鼠骨髓瘤細(xì)胞或倉鼠細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求29-31的方法，其中所述倉鼠細(xì)胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求16-33中任一項的方法獲得的宿主細(xì)胞。
35.一種抑制或延遲宿主細(xì)胞的細(xì)胞死亡的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞于至少表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因，因而抑制或延遲該宿主細(xì)胞的細(xì)胞死亡的條件下培養(yǎng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述細(xì)胞死亡是由程序性細(xì)胞死亡所造成的。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡所造成的。
38.根據(jù)權(quán)利要求16-33或35-37中任一項的方法，其中所述細(xì)胞被培養(yǎng)在無血清和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液中。
39.一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的細(xì)胞在有利表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡基因與目的基因的條件下培養(yǎng)，(b)從細(xì)胞和/或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離目的蛋白。
40.一種根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的細(xì)胞生產(chǎn)至少一種由目的基因所編碼的蛋白質(zhì)的用途。
41.一種至少包含5個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
42.一種至少包含10個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
43.一種至少包含20個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
44.一種至少包含50個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
45.一種至少包含100個拷貝數(shù)的異源抗-細(xì)胞凋亡基因的宿主細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求37-41中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因編碼BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
47.根據(jù)權(quán)利要求41-45中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因為BCL-xL或BCL-2。
48.根據(jù)權(quán)利要求41-45中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ IDNO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11，或其任何生物活性片段，變體或突變體(簡并和非簡并性)的序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求41-45中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述抗-細(xì)胞凋亡基因為BCL-xL。
50.根據(jù)權(quán)利要求41-49中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為小鼠骨髓瘤細(xì)胞或倉鼠細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求41-49中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的宿主細(xì)胞，其中所述小鼠骨髓瘤細(xì)胞為NS0或SP2/0-Ag14細(xì)胞，或任何此類細(xì)胞株的子代。
53.根據(jù)權(quán)利要求41-49中任一項的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞為CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK、BHK-21(2254-62.2)，或任何此類細(xì)胞株的子代。
54.根據(jù)權(quán)利要求41-53中任一項的宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步包含至少一種異源的目的基因。
55.根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞，其至少包含5個拷貝數(shù)的異源的抗-細(xì)胞凋亡基因。
56.根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞，其至少包含10個拷貝數(shù)的異源的抗-細(xì)胞凋亡基因。
57.根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞，其至少包含20個拷貝數(shù)的異源的抗-細(xì)胞凋亡基因。
58.根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞，其至少包含50個拷貝數(shù)的異源的抗-細(xì)胞凋亡基因。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-15或34中任一項的宿主細(xì)胞，其至少包含100個拷貝數(shù)的異源的抗-細(xì)胞凋亡基因。
60.一種DNA，包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列，其中該核酸是(a)具有SEQ ID NO3或其互補(bǔ)鏈的序列的核酸；(b)(a)中定義的核酸序列的功能片段，(簡并和非簡并性的)變體或突變體；(c)與(a)中定義的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸；或(d)與(a)，(b)，或(c)中定義的任何核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。
61.一種DNA，包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列，其中所述核酸是(a)具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或其中任一互補(bǔ)鏈的序列的核酸；(b)(a)中定義的任何核酸序列的(簡并和非簡并性)功能變體或突變體；(c)與(a)中定義的任何核酸序列具有至少95％的同源性的核酸；或(d)與(a)，(b)，或(c)中定義的任何核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸。
62.一種DNA，包含編碼生物活性bcl-xL基因的核酸序列，所述bcl-xL基因具有SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ IDNO11的序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求60-62中任一項的DNA編碼的多肽。
64.包含根據(jù)權(quán)利要求60-62中任一項的DNA的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)包括增加量的活性抗－細(xì)胞凋亡基因的遺傳工程處理的哺乳動物宿主細(xì)胞與產(chǎn)生此類細(xì)胞的方法。更特別地，本發(fā)明是關(guān)于調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)抗－細(xì)胞凋亡活性基因的量的方法；以及關(guān)于利用延遲/抑制此類細(xì)胞的自然發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡而顯示增加的細(xì)胞存活力的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了新的抗凋亡基因，該基因適合制備利用延遲/抑制此類細(xì)胞的自然發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡而顯示增加的細(xì)胞存活力的宿主細(xì)胞。
文檔編號C12N15/09GK1646683SQ03806881
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月28日
發(fā)明者巴巴拉·埃尼克爾, 海科·門茨, 馬丁·富塞尼格 申請人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司