專利名稱：具有可變的發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射頻率的發(fā)光球形非自發(fā)光硅膠顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)光強(qiáng)度可變的發(fā)光、球形微米或納米顆粒，及該顆粒的制備方法和應(yīng)用。
發(fā)光被定義為通過能量吸收而被預(yù)先激發(fā)的物質(zhì)在全部光譜范圍內(nèi)的光發(fā)射。熒光和磷光也在此范圍內(nèi)。
當(dāng)前發(fā)光物質(zhì)以熒光或磷光物質(zhì)的形式在生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)分析與診斷的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)被常規(guī)地用于鑒別如蛋白質(zhì)、肽、毒素或核酸的分析物，并且用作標(biāo)記顯示細(xì)胞、細(xì)胞小室，或檢測生物學(xué)過程。
背景技術(shù)：
一種對(duì)發(fā)光方法十分有趣和創(chuàng)新的使用是用于鑒別生物分子的所謂的芯片技術(shù)。在當(dāng)今的生物分析和診斷領(lǐng)域中，芯片技術(shù)作為以柵格形排列有大量具有已知結(jié)構(gòu)的生物分子傳感器(核酸、蛋白質(zhì)或肽)的平的、玻璃或聚合物載體或者基質(zhì)，也稱作生物芯片，而被熟知。通過與生物芯片一起孵育先前由例如組織或細(xì)胞獲得的發(fā)光標(biāo)記的蛋白質(zhì)或核酸樣品，在其表面上具有與樣品互補(bǔ)的化學(xué)-物理結(jié)構(gòu)的點(diǎn)上形成特異性結(jié)合。由于樣品的發(fā)光標(biāo)記會(huì)引起在形成結(jié)合的點(diǎn)上具有可檢測的發(fā)光，因而對(duì)樣品的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)提供了直接的信息。由于大量的傳感器被固定在芯片上，芯片技術(shù)對(duì)于在醫(yī)藥開發(fā)過程中測試分子庫是一種很有用的工具。
由于芯片技術(shù)的品質(zhì)和適用性直接依賴于發(fā)光標(biāo)記的檢測靈敏度和光譜特異性，已往進(jìn)行了大量開發(fā)以制造新的、改進(jìn)的發(fā)光體系，從而使得生物鑒定的檢測極限被顯著地降低。發(fā)光物質(zhì)的開發(fā)集中于兩類物質(zhì)。一類是發(fā)光分子，這類發(fā)光分子中最普通的是Fluorescein、Rhodamin、Phycoerythrin、Coumarin、Cy3、Cy5、TAMRA、ROX、Oregon Green、Ethidiumbromid、Texas Red和Dabcyl(這些均為商品名稱)。另一類化合物主要為由周期系中IIB和VIA族、IIIA和VA族或IVA族的半導(dǎo)體納米晶體，這類納米晶體中最普通的為CdS、CdSe、CdTe、ZnS和ZnSe。這些半導(dǎo)體納米晶體的一個(gè)獨(dú)特特征是一方面高的量子效率，另一方面又不象常規(guī)發(fā)光染色那樣易于退色。更值得注意的使得在文獻(xiàn)中稱作為“量子點(diǎn)”的該化合物成為常規(guī)熒光染色的有趣替代的一點(diǎn)是量子點(diǎn)的吸收和發(fā)射性能取決于其大小。具體地是指隨著顆粒尺寸的減小，發(fā)射光譜向短波范圍移動(dòng)，反之亦然。
對(duì)于使用發(fā)光效應(yīng)的生物測定的發(fā)展，開啟了不僅基于物質(zhì)的選擇而且基于顆粒大小進(jìn)行不同發(fā)光標(biāo)記的另外的可能性。這也為生物芯片領(lǐng)域中生物分子的光學(xué)編碼提供了理想的基礎(chǔ)。
在生物分析中熒光標(biāo)記的應(yīng)用在許多相關(guān)文獻(xiàn)中已有敘述。
美國專利4,777,123描述了一種免疫測定原理，該原理揭示了兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記的受體的應(yīng)用，從而在檢測的配體的存在下由第一個(gè)被激發(fā)的熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)熒光團(tuán)的能量減少。
美國專利5,324,633的主題為使用光子計(jì)數(shù)器或共焦顯微鏡檢測與生物高聚物結(jié)合的熒光標(biāo)記受體的生物芯片法。
美國專利5,066,580中描述了在被標(biāo)記的抗體的協(xié)助下用于細(xì)胞檢測的具有450～650nm的激發(fā)頻率的氧雜蒽(xanthene)熒光染料。在美國專利3,998,943、3,996,345、4,174,384、4,199,559和4,261,968中公開了配體受體測定，該測定的基本原理為用發(fā)射性能依靠于配體-受體結(jié)合的熒光染色標(biāo)記受體和/或配體。
美國專利5,319,209公開了其中適于測量細(xì)胞中離子濃度的苯并呋喃-異酞酸酯形式的熒光傳感器。
具有相應(yīng)的光學(xué)特性的半導(dǎo)體納米晶體和/或量子點(diǎn)的制備是現(xiàn)有技術(shù)并在相關(guān)的文獻(xiàn)中以不同方式被報(bào)道Kortan等，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol 112，1327，1990；Colvin等，自然(Nature)，Vol.370，354，1994；Murray等，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol.115，8706，1993；Hirai等，物理化學(xué)B雜志(J.Phys.Chem.B)，Vol.103，4228，1999；Dabbousi等，物理化學(xué)B雜志(J.Phys.Chem.B)，Vol.101，9463，1997；Hines等，物理化學(xué)雜志(J.Phys.Chem.)Vol.100，468，1996；Danek等，化學(xué)材料(Chem.Mater.)Vol.8，173，1996；Steigerwald等，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)(1988)1103046-3050和Lianos等，化學(xué)物理快報(bào)(Chem.Phys.Lett.)Vol.125，299，1986。
但是，對(duì)于在生物分析中發(fā)光物質(zhì)的使用而言，僅實(shí)際的合成并不是決定性的，重要的是在發(fā)光標(biāo)記和相應(yīng)生物物質(zhì)之間的共價(jià)鍵的可能性。使用發(fā)光染料，首先以N-羥基琥珀酰亞胺基酯或異硫氰酸酯的形式被引入的功能基團(tuán)起到與生物分子的氨基結(jié)合的作用。另一方面，量子點(diǎn)總是按照兩種方法被功能化一方面，表面用如巰基丙酸、二氫硫辛酸、巰基乙酸、巰基硅烷的功能巰基化合物轉(zhuǎn)化，該化合物隨后優(yōu)選通過羧基功能與相應(yīng)的生物分子連接(Gerion等，物理化學(xué)雜志(J.Phys.Chem.)Vol.105，8861，2001)；Mattoussi等，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol.122，12142，2000)；Chan等，科學(xué)(Science)Vol 281，2016，1998)；Mitchell等，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol.121，8122，1999))，或者量子點(diǎn)被包封在聚合物基質(zhì)或枝形聚合物(dendrimer)中(“覆蓋”)。Lemon等，(美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol.122，12886，2000)，Sooklal等，(先進(jìn)材料(Adv.Mater.)Vol.10，1083，1998)和Lakowicz等，(物理化學(xué)雜志(J.Phys.Chem.)Vol.103，7613，1999)描述了在聚酰胺胺枝形聚合物的協(xié)助下半導(dǎo)體納米晶體的包封。使用共聚苯乙烯乙烯(polystyrene-co-vinyl)吡啶、聚苯乙烯、硅膠或聚月桂酰甲基丙烯酸酯的包封由以下文獻(xiàn)公開Zhao等，(化學(xué)材料(Chem.Mater.)Vol.14，1418，2002)；Han等，(自然生物技術(shù)(Nature Biotech.)，Vol.19，631，2001)；Correa-Duarte等，(化學(xué)物理快報(bào)(Chem.Phys.Letters，)Vol.286，497，1998)；Chang等，(美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)Vol.116，6739，1994)和Lee等，(先進(jìn)材料(Adv.Mater.)，Vol.12，1102，2000)。美國專利6,114,038和5,906,670的主要內(nèi)容為被包封在含巰基的組分和二氨基羧酸中的量子點(diǎn)以及用噴射系統(tǒng)在氣相中制備的半導(dǎo)體納米晶體。
美國專利6,207,397、5,251,018、5,751,018、5,262,357和5,505,928涉及了能夠與親和性配體結(jié)合的III-V族和II-VI族半導(dǎo)體納米晶體的制備。
美國專利6,326,144和6,207,229的主要內(nèi)容為具有與生物成分的親和鍵的被包覆的半導(dǎo)體納米晶體以及用ZnS、ZnSe、CdS或CdSe包覆的單分散的光發(fā)射納米晶體。
美國專利5,293,050和5,354,707涉及用于電路的硅的光發(fā)射半導(dǎo)體層，其中第二硅層含有至少一個(gè)量子點(diǎn)。
美國專利5,525,377描述了用于陰極射線管或電致發(fā)光顯示器的被聚甲基丙烯酸甲酯涂敷的摻雜半導(dǎo)體化合物的20～100納米顆粒。
美國專利5,537,000中涉及了使用ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、GaS、InAs、InP和InSb形式的半導(dǎo)體納米晶體作為電子傳輸介質(zhì)制備電致發(fā)光設(shè)備，當(dāng)被施加電壓后，該電致發(fā)光設(shè)備可以發(fā)射出不同波長的可見光。美國專利5,541,948的主要內(nèi)容為包含II和VI族元素的摻雜了過渡金屬的激光強(qiáng)化晶體。
美國專利5,585,640公開了摻雜了發(fā)光納米晶體的玻璃基質(zhì)。制備摻雜的預(yù)制玻璃形式需要超過1000℃的溫度。
美國專利5,770,299公開了用作繪畫的顏料的包含CdS和/或III-V族組分的半導(dǎo)體納米晶體或II-VI族半導(dǎo)體納米晶體。
美國專利5,789,162公開了在商業(yè)硅膠小球上的熒光標(biāo)記的肽庫的固相合成。
美國專利5,990,479涉及涂敷硅烷衍生物并能夠與親和性分子鍵合的生物應(yīng)用發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體傳感器。
美國專利5,043,265公開了作為免疫球蛋白和聚核苷酸的標(biāo)記的ZnS-Ag和Y2O2S-Eu形式的發(fā)光顆粒。
美國專利5,985,353的主要內(nèi)容為在分散于核酸或蛋白質(zhì)形式的惰性凝膠聚合物中的陽離子交換劑存在下由過渡金屬、鑭系元素或錒系元素制備納米顆粒。與交換劑鍵合的陽離子通過加入相應(yīng)的陰離子被沉淀為納米顆粒。
美國專利4,666,862和Oi等(J.Cell.Biol.Vol.93，891 1982)公開了能夠降低激發(fā)和發(fā)射頻率之間的光譜重疊程度，相當(dāng)于顯著的斯托克司頻移(Stokes shift)，的藻膽蛋白標(biāo)記物。
另外一組光發(fā)射物質(zhì)是所謂的上轉(zhuǎn)換磷光顆粒(up-convertingphosphor)，其獨(dú)特特征為發(fā)射與激發(fā)輻射相反的短波輻射。這種類型的物質(zhì)主要地包含氧和/或硫和/或氟與鑭系元素或釔的化合物。
如果被用于生物測定中，則這些物質(zhì)具有吸收和發(fā)射頻率不受如載體顆粒或微量滴定載玻片的載體系統(tǒng)的自身熒光干擾的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)使用任何類型的載體系統(tǒng)時(shí)，在當(dāng)今的生物分析中該自身熒光現(xiàn)象仍會(huì)引起問題。
美國專利5,674,698和5,698,397公開了通過激光激發(fā)被用于生物學(xué)和其他測定中的一系列摻雜上轉(zhuǎn)換磷光顆粒形式如氟化鈉釔、氟化鑭、氟化釓和氧硫化釔的分子傳感器。
美國專利5,132,242中公開了密封在聚丙烯酸酯微載體中的上轉(zhuǎn)換磷光顆粒，該微載體對(duì)于激發(fā)和發(fā)射頻率是透明的并且能夠通過功能基團(tuán)而加入與蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵。
Corstjens等，(Clin.Chem.Vol.47，1885，2001)和Niedbala等，(分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)Vol.293，22，2001)公開了用于測定核酸序列和免疫測定的上轉(zhuǎn)換磷光顆粒。Hampl等，(分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)Vol.288，176，2001)公開了硅烷涂敷的上轉(zhuǎn)換磷光顆粒。
美國專利6,004,530的主要內(nèi)容為可被用作檢測生物物質(zhì)的發(fā)光金屬卟啉。
在現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的單一分子或納米晶體形式的發(fā)光標(biāo)記具有缺陷，即該發(fā)光標(biāo)記的使用，尤其是在生物測定中，在所需的時(shí)間和步驟方面需要復(fù)雜的制備。因而與復(fù)雜步驟相關(guān)的合成或制備時(shí)間為幾小時(shí)到幾天(參見美國專利5,132,242)在氮?dú)舛栊詺夥罩胁僮鳎麴s，在有機(jī)介質(zhì)中操作。因而，這些在任何情況下均存在有機(jī)聚合物的產(chǎn)物具有顯著的自身熒光，參見上面列出的Han等的參考文獻(xiàn)。
已知的發(fā)光體系的最嚴(yán)重的局限是對(duì)每個(gè)要被標(biāo)記的生物分子，一般地只有一個(gè)或很少的幾個(gè)發(fā)光顆粒(半導(dǎo)體納米晶體或上轉(zhuǎn)換磷光顆粒晶體)可以被鍵合。結(jié)果，這種限制顯著地降低了生物測定的檢測靈敏度。對(duì)于發(fā)光分子情況也相似，同樣僅有少數(shù)發(fā)光顆?？膳c每個(gè)生物分子鍵合，所以很難檢測到從被標(biāo)記的生物分子發(fā)射出的信號(hào)。此外，連接發(fā)光物質(zhì)到生物分子(如，抗體)上可能會(huì)引起后者失活。然而，已經(jīng)被開發(fā)為替代物的發(fā)光標(biāo)記的微?；蚣{米顆粒均具有與難以生產(chǎn)、使用和檢測的顆粒的表面相連接的發(fā)光標(biāo)記，參見Fornusek和Vetvicka，在CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，2，pp.137-174，1986中的“用于細(xì)胞表面標(biāo)記示蹤的作為診斷工具的聚合小球(Polymeric Microspheres as Diagnostic Tools for Cell SurfaceMarker Tracing)”。該文獻(xiàn)對(duì)這種技術(shù)做了綜合性的評(píng)述，其他引用文獻(xiàn)為Kaplan等(Biochimica et Biophysica Acta，Vol.728，112，1983)以及美國專利3,853,987、4,035,316、4,105,598、4,108,972、4,224,198和4,326,008。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是避免已知現(xiàn)有技術(shù)水平的發(fā)光載體體系的缺點(diǎn)并提供包含復(fù)合發(fā)光物質(zhì)的具有適當(dāng)多孔性的透明、非自發(fā)熒光的微粒和亞微顆粒。由于可以在分子和納米顆?；蚰z體兩種形式中包封大量的發(fā)光劑，在生物分析和診斷中生物分子的檢測靈敏度已經(jīng)被極大地提高，甚至達(dá)到可以檢測單個(gè)分子的水平。然而，幾種具有可變發(fā)射性能的發(fā)光物質(zhì)的包封使得生物分子的光學(xué)編碼有多種變化。
該目標(biāo)按照本發(fā)明通過在不會(huì)影響基本物質(zhì)的實(shí)質(zhì)發(fā)光性能的硅膠透明基質(zhì)中包封發(fā)光物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。
更進(jìn)一步，該目標(biāo)按照本發(fā)明通過反向懸浮法(inverse suspensionmethod)完成，因而含有硅膠溶膠和發(fā)光物質(zhì)的混合物被分散在不與水混溶的有機(jī)相中，然后被縮聚。通過該方法可以制備出包含包封的發(fā)光物質(zhì)的立體交聯(lián)的、珠狀聚合物載體。
具體實(shí)施例方式
硅溶膠根據(jù)普遍已知的現(xiàn)有技術(shù)的方法，即在稀釋的無機(jī)酸的幫助下通過烷氧基硅烷的水解而被制備出來(Dave等ImmobilizedBiomolecules in Analysis，編輯Cass和Ligler，Oxford University出版社，1998；WO 02/09125 A1)。脂肪醇的硅原酸酯可被用作烷氧基硅烷，優(yōu)選為甲基、乙基或丙基酯，單獨(dú)或以混合物的形式。相應(yīng)的發(fā)光物質(zhì)在第二個(gè)步驟中被加入到硅溶膠中。為了能夠更均勻地混合異質(zhì)的溶膠-發(fā)光物質(zhì)混合物，反應(yīng)在超聲浴中進(jìn)行或使用超聲極(ultrasonicsonotrode)，處理通常持續(xù)半分鐘。由這種方法獲得的膠體分散混合物然后一般通過攪拌被分散在與水不混溶的有機(jī)溶劑中。形成的珠狀溶膠滴然后通過隨后加入稀釋的堿縮聚成為立體交聯(lián)硅膠。
溶膠和有機(jī)分散相的極性特征被選擇一方面能夠制備穩(wěn)定的懸浮液，另一方面使得添加的發(fā)光物質(zhì)對(duì)溶膠具有高親合力，以至于在溶膠和有機(jī)相之間有清晰的分界，結(jié)果使加入的發(fā)光化合物只被均勻的分散在溶膠相中。
根據(jù)配方，包括硅膠溶膠制備的整個(gè)制備方法需要約20～50分鐘。
發(fā)光顆粒的合成開始于按照已知方法通過在酸性水溶性的環(huán)境中水解適當(dāng)?shù)耐檠趸柰橹苽涞墓枞苣z。具有C1到C3酯基的原硅酸被優(yōu)選地用于該方法及產(chǎn)物。令人驚異的是，這與具有確定濃度的硅烷一起使得完全透明顆粒得以制備。在最初的配方中烷氧基硅烷的濃度為40～90％體積，優(yōu)選的為65～80％體積。在酸性水溶液的存在下使硅烷受到超聲的作用從而制備澄清的溶膠，該酸性水溶液在硅烷配方中的體積百分比一般在10～40％并且其濃度一般在0.01到0.5摩爾/升之間。超聲處理的時(shí)間依賴酸濃度確定為5～20分鐘。通過該方法獲得的硅溶膠可以在深冷溫度下(大約-18℃)中儲(chǔ)存多天，或者也可以被立即處理。
本發(fā)明的硅膠技術(shù)的另一個(gè)特點(diǎn)是所獲得顆粒的多孔性可以在寬的范圍內(nèi)變動(dòng)，這是一個(gè)任何其它已知現(xiàn)有技術(shù)不具備的特點(diǎn)。
顆粒載體介質(zhì)的多孔性對(duì)于所有的生物檢測或分離過程中起到?jīng)Q定性作用，這是因?yàn)榉治鑫锏奶禺愋缘臋z測能力依賴于其與固定在載體上的配體和/或受體的結(jié)合。這種結(jié)合過程的程度和質(zhì)量直接受載體的可接近表面的影響。后者直接由載體的多孔性決定。令人驚異的是，這可以借助于按照本發(fā)明的產(chǎn)物和方法通過向溶膠加入特定物質(zhì)加以調(diào)節(jié)。這些一般被稱為生孔劑(porogen)的物質(zhì)在分散前被加入到溶膠中。被作為添加物使用的物質(zhì)優(yōu)選是不影響載體的吸收-發(fā)射性能的物質(zhì)。這些物質(zhì)的例子包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚氨基酸、多糖，蛋白質(zhì)或聚乙烯吡咯烷酮，本發(fā)明不局限于這些物質(zhì)。它們在分散和交聯(lián)過程中被包封在球形顆粒中。相對(duì)于溶膠相而言，以1～10％水溶液存在的有機(jī)聚合物溶液的體積百分比為1～20％。
另外用于調(diào)節(jié)多孔性的參數(shù)源于對(duì)各種二、三或四取代的硅烷組分的組合的選擇。從而，純粹四取代酯的凝膠通常具有比通過添加二或三取代酯化合物而制備的溶膠或凝膠更低的多孔性。二或三功能酯基化合物的選擇性混合物使孔徑在50～200nm之間。相對(duì)于整個(gè)硅烷濃度，二和三功能硅烷的濃度一般在1～10％，優(yōu)選為1～5％體積。
本發(fā)明的產(chǎn)物和方法的另一個(gè)重要方面是可以同時(shí)通過機(jī)械攪拌的類型和方式以及硅溶膠的粘度來控制顆粒的大小。眾所周知，顆粒的大小是在懸浮聚合期間通過攪拌速度加以調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)方式為顆粒尺寸問題隨攪拌速度的增加而下降。這些因素的相互關(guān)系也適用于本發(fā)明，即＞1000rpm的攪拌速度一般會(huì)使得顆粒尺寸＜50μm，攪拌速度＞5000rpm則顆粒尺寸＜10μm。為了獲得更細(xì)的亞微米級(jí)顆粒，就需要例如根據(jù)轉(zhuǎn)子-定子原理(rotor-stator principle)工作并且轉(zhuǎn)子速度＞10000rpm(例如，Ultra-Turrax)的分散工具。超聲處理也使顆粒尺寸在0.5～10μm的范圍內(nèi)。
除了純粹的機(jī)械因素，溶膠的粘度對(duì)顆粒的大小也有決定性的影響。降低溶膠粘度一般會(huì)導(dǎo)致顆粒大小類似的降低，反之亦然升高粘度導(dǎo)致顆粒尺寸的增加。獲得按照本發(fā)明的具有0.5～50μm的理想顆粒尺寸的產(chǎn)物所需的粘度在5～300cp之間。
在制備了具有理想特性的溶膠后，相應(yīng)的發(fā)光標(biāo)記物在下一步驟中被加入并與溶膠均勻地混合，優(yōu)選應(yīng)用超聲波處理。這些可以在吸收了一定波長的輻射后以不同于吸收頻率的頻率發(fā)射出光子并且能夠達(dá)到與硅膠溶膠的均勻混合的化合物可以被用作發(fā)光物質(zhì)。
多種這類物質(zhì)已經(jīng)在所列的參考文獻(xiàn)中被描述。發(fā)光分子和標(biāo)記的例子有熒光黃(Fluorescein)、若丹明(Rhodamin)、香豆素(Coumarin)、丹磺酰氯(Dansylchlorid)、溴乙菲啶(Ethidiumbromid)、Texas Red、藻紅蛋白、Oregon Green或Cascade Blue以及具有下列商品名的化合物BODIPY、SYBR Green、TOTO-1或YOYO-1以及這些產(chǎn)品的衍生物，本發(fā)明的產(chǎn)物并不局限于此。例如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe，CdTe，HgS，HgSe或HgTe的II-VI族系列化合物以及例如GaAs、InGaAs、InP或InAs的III-V族納米晶體均可被用作半導(dǎo)體納米晶體。例如鍺的IVA族半導(dǎo)體也是適合的。
上轉(zhuǎn)換磷光顆粒的適當(dāng)例子為稀土或IIIB族元素的化合物，例如氟化鈉釔、氟化鑭、硫氧化鑭、硫氧化釔、氟化釔、鎵酸釔、氟化釓、氟化鋇釔、硫氧化釓以及摻雜了活化劑對(duì)(activator pair)如鐿/鉺、鐿/銩或鐿/鈥的上述類型的化合物。其它適合的上轉(zhuǎn)換磷光顆粒包括鉺、釹、銩、鈥和鐠的螯合化合物。發(fā)光蛋白質(zhì)如視紫紅蛋白質(zhì)、綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)和金屬卟啉也可以相似的方式被用作發(fā)光物質(zhì)。
被加入的發(fā)光物質(zhì)的濃度可以依據(jù)相應(yīng)生物分析或診斷的要求在寬范圍內(nèi)變化。為了實(shí)現(xiàn)清楚地發(fā)光，為標(biāo)記物質(zhì)的1～10％重量的濃度通常就足夠了。這些濃度超過了常規(guī)測定中每個(gè)分析物可使用的發(fā)光標(biāo)記濃度的幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
硅溶膠與多種物質(zhì)極佳的可混溶性意外地使得磁性膠體和/或納米顆粒形式的磁性化合物可以與發(fā)光物質(zhì)一起同時(shí)被包封。這產(chǎn)生了可同時(shí)起到發(fā)光效果和磁性分離的作用的全新的特性組合。這就為高效生物測定的發(fā)展開辟了全新的前景，通過該高效生物測定使得以前只在聚合物或玻璃基質(zhì)上進(jìn)行的先前的陣列無法測定的極大量的生物分子(“分子庫”)得以被測定?？梢员皇褂玫拇判晕镔|(zhì)為已知的含亞鐵、含鐵或超順磁性物質(zhì)以及鐵磁流體，其中許多已經(jīng)在相關(guān)的文獻(xiàn)中被描述巴西專利1439031，Shinkai等，生物催化(Biocatalysis)Vol 5，61，1991；Kondo等，微生物生物技術(shù)應(yīng)用(Appl.Microbiol.Biotechn.)Vol.41，99，1994。磁性膠體的濃度全部經(jīng)過挑選以使得涉及到發(fā)光標(biāo)記的吸收和發(fā)射性能的顆粒的透明性不會(huì)受到影響。其一般在相對(duì)于硅膠顆粒重量的10～30％。
在該方法的第三個(gè)步驟中，硅膠-發(fā)光標(biāo)記混合物通過攪拌被分散在有機(jī)相中。這些不與水互溶且可以使硅溶膠穩(wěn)定分散的溶劑是合適的分散劑。這類分散劑從現(xiàn)有技術(shù)可知并在以下文獻(xiàn)中被描述WO02/09125以及Laane等(“有機(jī)介質(zhì)中的生物催化(Biocatalysis inOrganic Media)”，Laane等，編輯，Elsevier，Amsterdam，pp 65，1987)。符合這些要求的溶劑包括己烷、三氯乙烯、石油醚、甲苯、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、四氯化碳、庚烷。密度大約為1g/cm3的上述溶液的混合物也很適于分散。有機(jī)相與水溶膠的體積比例一般在8∶1～30∶1。
考慮到更窄的顆粒大小分布和更好的分散性能，一種或多種表面活性劑、分散穩(wěn)定劑或乳化劑型的表面活性物質(zhì)可以被加入到有機(jī)相中。這些物質(zhì)的例子包括丙烯氧化物-乙烯氧化物的嵌段共聚物、聚羥基脂肪酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇-醚衍生物、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、蓖麻油衍生物的嵌段共聚物、聚乙二醇-蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、烷基苯基聚乙二醇衍生物、聚丙三醇酯、改性聚酯、聚氧丙烯乙二胺嵌段共聚物、聚乙二醇、聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯醇衍生物。這種類型的物質(zhì)在市場上的商品名為Renex、Estol、Prisorine、Hypermer、Pluronic、Tween、Eumulgin、Pripol、Tetronic、Brij、Lameform、Arlacel、Span、Dehymuls、Synperonic或Triton。有關(guān)顆粒的產(chǎn)生的表面活性劑的濃度在體積和/或重量的0.1～15％之間，優(yōu)選地為0.5～6％。
在該方法的最后一個(gè)步驟中，在分散過程中溶膠與稀釋的堿混合，所以前者濃縮聚合為固體凝膠。溶膠一般在數(shù)秒鐘(3～20秒)內(nèi)被固定成預(yù)期的凝膠顆粒。因此，機(jī)械分散處理只進(jìn)行幾秒鐘。所選的堿濃度越高，凝膠化和同時(shí)的機(jī)械分散處理就越短。1～12％水溶液形式的氨被優(yōu)選地用作堿，其它的堿如NaOH、二乙胺或KOH也可以使用。堿與溶膠的體積比一般在1∶2～1∶4之間。
非常快速的凝膠化反應(yīng)的結(jié)果是，包括發(fā)光標(biāo)記包封的整個(gè)顆粒制備過程可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。這相對(duì)于全部制備發(fā)光顆粒的常規(guī)方法節(jié)省了高達(dá)90％的時(shí)間。
制備過程后用乙醇和水洗滌數(shù)次。所獲得的磁性載體一般被儲(chǔ)存在水中。所獲得的硅膠顆?？梢员恢苯佑糜谶M(jìn)一步的功能化。
為了使發(fā)光顆粒與所有作為目標(biāo)物質(zhì)的相應(yīng)的生物分子，如蛋白質(zhì)、抗體、肽、酶、核酸、低聚糖，受體、生物配體或分析物傳感器相結(jié)合，使用了普通已知的硅膠和/或硅烷化載體的活化和連接方法。這些方法包括與具有例如氨基、環(huán)氧基、含巰基的、異硫氰酸酯、丙烯酸或鹵素基團(tuán)的功能烷氧基硅烷反應(yīng)。這種活化和連接劑的例子包括3-氨基丙基-三乙氧基硅烷、3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-縮水甘油基-丙氧基三甲氧基硅烷、3-縮水甘油基丙氧基甲基二乙氧基硅烷、3-巰基丙基三甲氧基硅烷、3-異氰硫基丙基三乙氧基硅烷、甲基丙烯基丙氧基三乙氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷。通過使用氨基羧酸、戊二醛對(duì)前面所述的烷氧基硅烷的衍化或者以酸或堿水解環(huán)氧基團(tuán)向羥基衍生物引入羧基、羥基或醛基的方法已被現(xiàn)有技術(shù)所公開。相似地，按照已知方法環(huán)氧活化的載體與羧酸、亞硫酸、硫代硫酸、氨基取代的羧酸如次氮基三乙酸或亞胺基乙酰乙酸之間的反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生金屬螯合物載體。通過光活化劑，如含有芳基疊氮(arylazine)或偶氮甲烷(diazirin)功能團(tuán)的，活化硅膠顆粒是較容易做到的，該光活化劑首先通過紫外光照射被連接到載體上，然后可與生物配體和/或生物分子反應(yīng)。該類型的物質(zhì)包括N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮苯甲酸、[2-硝基-4-[3-(三氟甲基)-3H-偶氮甲烷-3-基]苯氧基]乙?；?N-羥基琥珀酰亞胺酸、N-羥基琥珀酰亞胺基-(4-疊氮苯基)-1，3`-二硫代丙酸、N-[m-[3-(三氟甲基)偶氮甲烷-3-基]苯基]-4-順丁烯二酰亞胺丁酰胺(maleimidobutyramide)。
在這里不需要對(duì)各種活化、功能化和連接進(jìn)行詳細(xì)描述，因?yàn)樘囟ǖ姆磻?yīng)方法是普遍已知的并可以在任何時(shí)候被本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用(參見，Vansant等，“二氧化硅表面的特性和化學(xué)修飾(Characterizationand Chemical Modification of the Silica Surface)”，由Delmon和Yates編輯，Elsevier，Amsterdam，1997；“磁性載體的科學(xué)與臨床應(yīng)用(Scientificand Clinical Applications of Magnetic Carriers)”，Hfeli等(編者)，PlenumPress，New York，1997；Shriver-Lake，“分析中的固定生物分子(Immobilized Biomolecules in Analysis)”，Cass和Ligler，編輯，OxfordUniversity Press，1998；WO 99/01766；Lottspeich和Zorbas編輯，“Bioanalytik”，Spektrum Verlag，Heidelberg，1998)。基本實(shí)施例不應(yīng)被看作是公開范圍的限制。
按照本發(fā)明的發(fā)光顆粒的應(yīng)用覆蓋所有使用顯色反應(yīng)、發(fā)光或放射性以檢測或定量特定物質(zhì)或分析物的生物分析和診斷的領(lǐng)域。其例子包括放射或酶免疫形式的免疫分析、核酸檢測、蛋白質(zhì)組分析、DNA測序、噬菌體顯示(phage display)、細(xì)胞標(biāo)記、核酸陣列或細(xì)胞標(biāo)記。此外，顆粒發(fā)光標(biāo)記物可被用于流式細(xì)胞儀或被熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)或用于測試DNA或蛋白質(zhì)庫。
隨后的實(shí)施例更詳細(xì)地?cái)⑹隽吮景l(fā)明的產(chǎn)物和方法，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1室溫下5ml四甲氧基硅烷和2ml的0.05M HCl一同在超聲浴中置于超聲波下10分鐘，所獲得的2ml澄清的溶膠與1ml的0.05％若丹明B溶液混合，混合物然后被加入到含有0.4ml的Korantin(BASF)的25ml己烷中。該配比用分散裝置(Ultra-Turrax)以20000rpm分散3秒鐘。在加入1ml的1％的氨水溶液后再分散5秒鐘。5分鐘后顆粒通過兩分鐘的離心被沉淀。過量的部分被傾析掉并用乙醇，丙酮和水漂洗三次，每次大約10ml。得到了顆粒大小為1～3μm的發(fā)光顆粒。
獲得的顆粒隨后用無水甲苯洗滌數(shù)次，然后在氬氣氣氛中與5ml無水甲苯和2ml的3-縮水甘油基丙氧基三甲氧基硅烷在90℃攪拌下反應(yīng)3小時(shí)。然后用甲苯和丙酮漂洗5次。100mg所獲得的產(chǎn)物再用0.5摩爾pH為8.5的磷酸緩沖液洗滌三次，并且隨后在溶解有10mg鏈霉抗生物素蛋白的2ml相同的緩沖液中40℃下孵育5小時(shí)。然后產(chǎn)物經(jīng)離心步驟每次用0.05M pH為7.2的磷酸緩沖液洗滌5次。為了阻斷任何剩余的環(huán)氧基團(tuán)，被結(jié)合的產(chǎn)物在包含0.1％血清白蛋白的1％乙醇胺溶液中室溫下儲(chǔ)存24小時(shí)。然后用pH為8.0的0.05 Tris/HCl緩沖液洗滌數(shù)次。
從而制備出能夠用于結(jié)合或標(biāo)記生物素化的生物分子的產(chǎn)物。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似地制備的2ml硅溶膠與根據(jù)Sooklal等(Adv.Mater.，Vol.10，1083，1998)的說明合成的平均顆粒大小為138nm的10mgCdS半導(dǎo)體納米晶體混合，然后在室溫下置于超聲波中2分鐘?；旌衔镌谌芙庥?.5％體積的Span 60和溶解有0.5％體積的Tween 80的25ml甲苯中用Ultra-Turrax在20000rpm下被分散5秒鐘。加入1ml 6％氨水溶液后，被繼續(xù)分散5秒鐘。然后類似于實(shí)施例1，顆粒被分離并制備。獲得了發(fā)射最大值為510nm的平均顆粒大小為3.6μm的發(fā)光顆粒。
為了活化顆粒，在[2-硝基-4-[3-(三氟甲基)-3H-偶氮甲烷-3-基]苯氧基]乙?；?N-羥基琥珀酰亞胺酸(配比5mg溶解于0.5ml乙醇-水(1∶1)中)的存在下用stratalinker UV 2400(Stratagene)照射75mg發(fā)光顆粒20分鐘。包含氨基的生物分子、配體或受體例如核酸、蛋白質(zhì)或抗體都可根據(jù)已知方法(Matson和Little，J.Chromatogr.，Vol.458，67，1988)在用乙醇和水洗滌之后與活化的產(chǎn)物結(jié)合。
實(shí)施例3
0.5ml四乙氧基硅烷與0.1ml的水和0.08ml的0.1M HCl混合，在室溫下超聲浴中置于超聲波下10分鐘。所獲得的0.2ml的溶膠與根據(jù)Hampl的描述(Anal.Biochem.，Vol.288，176，2001)制備的5mg(YYbEr)2O2S混合，并在超聲浴中處理5分鐘。然后加入30mg磁性粉末(Bayferrox 318M，Bayer，F(xiàn)RG)到混合物中。混合物再被置于超聲波下2分鐘。混合物然后通過在12000rpm的攪拌(Ultra-Turrax)被分散于溶解有2％體積的Dehymuls HRE7和0.5％體積的Prisorine 3700的3ml三氯乙烯中。0.08ml的6％氨水溶液在分散中被加入。化合物再攪拌5秒鐘。獲得的發(fā)光顆粒的分離和制備與實(shí)施例1類似。
得到了平均顆粒大小為6.7μm的發(fā)光顆粒。
在各次磁性分離之后，產(chǎn)物在被用干燥甲苯洗滌5次之前被真空干燥3小時(shí)，隨后在加入3ml甲苯和0.25ml的3-丙氨基三乙氧基硅烷后沸騰回流12小時(shí)。磁性顆粒被再次磁性分離并用大約5ml的甲苯和氯仿洗滌3次。然后該磁性顆粒在真空中干燥數(shù)小時(shí)。然后35℃下在4ml的pH為9.0的0.1M碳酸鈉緩沖液中，氨基修飾的產(chǎn)物用6％戊二醛溶液轉(zhuǎn)化。然后該產(chǎn)物用pH為7.2的0.1M磷酸緩沖液徹底地漂洗。
根據(jù)已知方法，具有氨基基團(tuán)的生物分子例如蛋白質(zhì)、肽、核酸或在5′端有取代氨基的低聚核苷酸，能夠與所獲得的醛基功能化的發(fā)光顆粒結(jié)合。以這種方式被功能化的發(fā)光顆?？梢栽诘鞍踪|(zhì)或核酸陣列中被用作傳感器。
權(quán)利要求
1.發(fā)光硅膠顆粒，在透明硅膠基質(zhì)中包含一種或多種發(fā)光物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征在于該顆粒不是自發(fā)光的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的顆粒，其特征在于所述的發(fā)光物質(zhì)被包封在該顆粒中。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)選自顯示熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、電致發(fā)光或能量轉(zhuǎn)換發(fā)光的物質(zhì)的組。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)的濃度為1～10wt％。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)顯示不同的發(fā)射頻率。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)是激發(fā)頻率高于發(fā)射頻率的分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)包括IIIA和VA族，IIB和VIA族或IVA族的元素形成的半導(dǎo)體納米晶體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的顆粒，其特征在于發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體被加入銅和/或銀添加劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)具有比發(fā)射頻率低的激發(fā)頻率。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)是稀土和/或釔與第VIA和/或VIIA族元素的微晶化合物。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)是金屬螯合化合物，其中心原子選自VIII，IB，IIB族或稀土族。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)為吡咯染料。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到6的顆粒，其特征在于發(fā)光物質(zhì)為發(fā)光蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任意一項(xiàng)的顆粒，其中額外包含或包封了磁性膠體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的顆粒，其特征在于磁性膠體選自包含亞鐵、鐵和超順磁性化合物以及鐵磁流體的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的顆粒，其特征在于磁性膠體以相對(duì)顆粒重量10～50％的濃度存在。
18.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的顆粒，其特征在于硅膠具有可以與選自包含蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞受體、核酸、核酸片斷、多聚糖、低聚糖、抗體、抗體片斷、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素和酶的組的生物分子結(jié)合的功能基團(tuán)，或者能夠與一種或多種這些生物分子聯(lián)合的功能基團(tuán)。
19.制備根據(jù)權(quán)利要求1到18中任意一項(xiàng)的發(fā)光硅膠顆粒的方法，其特征在于a)由稀釋的酸和烷氧基硅烷構(gòu)成的混合物被濃縮為澄清的硅溶膠；b)澄清硅溶膠被均勻地與一種或多種發(fā)光物質(zhì)混合；c)溶膠-發(fā)光物質(zhì)混合物被分散在不與水混溶的有機(jī)相中；和d)溶膠-發(fā)光物質(zhì)混合物通過在分散過程中或分散之后加入堿被交聯(lián)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的發(fā)光透明硅膠顆粒的制備方法，其特征在于10～50％重量的含亞鐵、含鐵或超順磁性的物質(zhì)被加入到溶膠-發(fā)光物質(zhì)混合物中。
21.根據(jù)權(quán)利要求19和20的發(fā)光硅膠顆粒的制備方法，其特征在于不與水混溶的有機(jī)相包含0.1～15％體積濃度的一種或多種表面活性物質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求19到21中任意一項(xiàng)的發(fā)光硅膠顆粒的制備方法，其特征在于溶膠與有機(jī)相的體積比為1∶5到1∶30。
23.根據(jù)權(quán)利要求19到22中任意一項(xiàng)的發(fā)光硅膠顆粒的制備方法，其特征在于分散交聯(lián)過程需要2～30秒。
24.根據(jù)權(quán)利要求19到23中任意一項(xiàng)的發(fā)光硅膠顆粒的制備方法，其特征在于1～20％體積比的有機(jī)聚合物、多聚糖或蛋白質(zhì)的水溶液在分散前與溶膠混合。
25.根據(jù)權(quán)利要求1到18中的任意一項(xiàng)的發(fā)光硅膠顆粒在核酸、核酸片斷、蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗體片斷、細(xì)胞、細(xì)胞受體、生物素化的生物分子的分析和/或診斷，以及在芯片技術(shù)中作為傳感器測試蛋白質(zhì)或核酸庫，或者在核酸測序中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過在硅膠基體中包封一種或多種不同發(fā)光物質(zhì)制備的，具有高發(fā)光性的球形透明硅膠顆粒。通過改變發(fā)光物質(zhì)的濃度和通過包封具有不同發(fā)射頻率的物質(zhì)，該顆?？梢栽谏锓治龊驮\斷中作為復(fù)合編碼和生物標(biāo)記體系被使用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1643379SQ03807087
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月30日
發(fā)明者德特勒夫·P·米勒－舒爾特 申請(qǐng)人:德特勒夫·P·米勒－舒爾特