專利名稱：確定致病性病毒對蛋白酶抑制劑敏感性的組合物和方法
本申請要求2002年2月15日提交的美國臨時申請?zhí)?0/357,171；2002年2月22日提交的美國臨時申請?zhí)?0/359,342；2002年6月26日提交的美國臨時申請?zhí)?0/392,377的優(yōu)先權(quán)，上述申請全文引于此處作為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及確定致病性病毒對抗病毒化合物敏感性的組合物和方法。所述組合物和方法可用于鑒別治療病毒感染的有效藥物治療方案，以及鑒別和確定潛在治療化合物的生物學(xué)有效性。
2.發(fā)明背景自二十世紀(jì)八十年代早期以來，感染人免疫缺陷病毒(“HIV”)(獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)的致病因素)的人數(shù)已超過6千萬。參見Lucas，2002，Lepr Rev.73(1)64-71。HIV/AIDS如今在亞撒哈拉非洲是導(dǎo)致死亡的最主要原因，而且其在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的原因中位列第四。在2001年末，全球大約有4千萬HIV攜帶者。參見Norris，2002，Radiol Technol.73(4)339-363。
現(xiàn)代抗-HIV藥的靶點是HIV生命周期的不同階段和HIV復(fù)制和/或生存必需的多種酶。已批準(zhǔn)用于AIDS治療的藥物包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韋、核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如替諾福韋，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如奈韋拉平、依法韋侖、地拉韋啶和蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
抗病毒藥作用的一個結(jié)果是其能夠?qū)Σ《緩?fù)制施加足以使其選擇抗藥性突變株的選擇壓力(Herrmann等，1977，Ann NY Acad Sci 284632-637)。當(dāng)藥物量增加時，復(fù)制病毒種群所受的選擇壓力增加從而促進(jìn)抗藥性突變株更快速生成。
由于抗藥性的出現(xiàn)不可避免，因此必須設(shè)計在面對抗性病毒種群時能夠最優(yōu)化治療的策略。確定抗藥性對藥物治療失敗(drugfailure)的影響是困難的，因為可能產(chǎn)生抗藥性的患者也有可能具有其它能夠使患者易于發(fā)生預(yù)后不良的其它因素(Richman，1994，AIDSRes Hum Retroviruses 10901-905)。另外，每個患者通常都含有病毒突變株的不同混合物，所述混合物具有對抗病毒藥不同敏感性的不同突變株。
用于評估抗病毒藥抗性的傳統(tǒng)方法是不足夠的；確定HIV對抗病毒劑的抗性的經(jīng)典檢測法復(fù)雜、費時、昂貴、具有潛在危險，且不能針對特定患者的治療進(jìn)行定制。參見Barre-Sinoussi等，1983，Science220868-871；Popovic等，1984，Science 224497-500)和其變化形式(例如參見，Goedert等，1987，JAMA 257331-334；Allain等，1987，N.Engl.J.Med.3171114-1121；Piatak等，1993，Science2591749-1754；Urdea，1993，Clin.Chem.39725-726；Kellam和Larder，1994，Antimicrobial Agents and Chemo.3823-30)。
目前通常使用兩種方法檢測對抗病毒藥的抗性。第一種方法，稱為表型分析，直接檢測獲自感染者病毒的病毒對特定抗病毒藥的敏感性。Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44920-928和Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother 42(2)269-76描述了目前廣泛使用的表型分析。Gunthard等，1998，AIDS Res HumRetroviruses 14869-76和Schuurman等，1999，J Clin Microbiol.372291-96描述了目前流行的基因型測定法。Hirsch等，2000，JAMA2832417-26對目前分析藥物敏感性的可用檢測法作了一般性分析。
第二種方法，稱為基因型分析，檢測病毒中能夠影響藥物敏感性的突變并可將特定基因突變和抗藥性及藥物失敗聯(lián)系起來。基因型分析檢測取自患者的病毒，尋找與對特定藥物抗性相關(guān)的特定基因突變的存在?；蛐头治鲇幸恍﹥?yōu)于表型分析的優(yōu)勢，最顯著的是檢測試驗可以相對簡易和快速地實施。檢測可在短至數(shù)日的時間內(nèi)完成，并且由于其復(fù)雜性較低，因此其在實施上會稍便宜。然而，基因型數(shù)據(jù)的解讀要依賴于先前關(guān)于特定突變和藥物敏感性改變間的相關(guān)性的認(rèn)識。
Carrilio等(1998，J.Virol.727532-41)描述了對洛匹那韋敏感性降低的HIV-1變體的體外選擇和鑒定。在8個氨基酸位置的9個不同突變與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)。后來的研究在預(yù)先用至少一種蛋白酶抑制劑治療的HIV-感染患者的血漿樣品中發(fā)現(xiàn)在HIV蛋白酶中11個位置的23個不同突變與對洛匹那韋的體外敏感性降低相關(guān)(Kempf等，2001，J.Virol.757462-69)。已有人假定了一種粗略的算法，該算法試圖將對洛匹那韋的表型抗性與在11個經(jīng)鑒定的位點觀察到的突變數(shù)目相關(guān)聯(lián)，并因此預(yù)測了洛匹那韋治療的有效性(Kempf等，2000，Antiviral Therapy 5(suppl.3)70，摘要89)。按照該算法，如果其蛋白酶中11個經(jīng)鑒定的位點的突變?yōu)槲鍌€或低于五個突變，則病毒是對洛匹那韋治療敏感的。如果在這11個位點的突變數(shù)目為6或更多，則預(yù)示該病毒具有對洛匹那韋治療的抗性。
迄今為止關(guān)于使用降低的敏感性的基因型相關(guān)性來預(yù)測抗病毒藥，特別是靶向針對不斷進(jìn)化的HIV的藥物的有效性的努力充其量也是有缺陷的。能夠更精確的預(yù)測給定抗病毒藥或藥物組合是否在對特定患者的治療中有效的算法通過將不大可能成功的藥物在其施用給該患者前鑒別出來從而節(jié)省時間和費用。更重要地是，其可通過減少在用不會改善他或她的HIV感染的強效毒素治療時給他或她帶來的損害從而提高患者的生活質(zhì)量。因此，迫切需要一種預(yù)測特定藥物是否在對特定患者的治療中有效的更為精確的算法。此外，基于基因型的分析法比表型分析更快速并具有更高的成本效率。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于研發(fā)和使用確定抗病毒療法或聯(lián)合療法有效性的算法的方法和組合物。該算法基于由表型臨床臨界值(對治療的抗性開始而敏感性終止的點)指導(dǎo)的配對的表型和基因型數(shù)據(jù)的分析。該算法顯著地改善了患者的生活質(zhì)量，這是因為該算法通過精確預(yù)測給定的抗病毒藥在治療患者時是否有效，從而減少用不會改善他或她的HIV感染的強效毒素治療時產(chǎn)生的對他或她產(chǎn)生的傷害。
一方面，本發(fā)明提供了能夠向患者提供有效治療方案的算法，該算法通過預(yù)測感染個體能否對抗病毒劑或聯(lián)合劑治療發(fā)生應(yīng)答，從而設(shè)計出不會給患者帶來不需要的副作用的有效治療方案。而且，由于避免了無效藥物的使用，故可以節(jié)省大量的時間和費用。
另一方面，本發(fā)明提供了確定病毒對抗病毒療法敏感性的方法，包括在病毒基因組或病毒酶中檢測是否存在與對抗病毒療法敏感性降低相關(guān)的突變。
另一方面，本發(fā)明提供了確定抗病毒療法對感染病毒個體的有效性的方法，該方法包括在來自所述個體的樣品中檢測是否存在與抗病毒療法敏感性降低相關(guān)的突變。
本發(fā)明還提供了通過如上所述測定相同或不同的抗病毒療法的有效性而監(jiān)測接受抗病毒療法的個體中病毒感染的臨床進(jìn)展的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑敏感性降低相關(guān)的突變的核酸和多肽。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
一方面，本發(fā)明提供了一種確定人免疫缺陷病毒是否可能具有對蛋白酶抑制劑治療的抗性或敏感性的方法，該方法包括在所述HIV中檢測是否存在一個或多個表7中所列的HIV蛋白酶突變，給表7中所列出的每個突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)，然后將所述加權(quán)系數(shù)相加從而獲得所述個體的總分，其中如果所述總分等于或高于臨界值則所述個體可能對所述蛋白酶抑制劑治療具抗性，而如果所述總分低于所述臨界值則所述個體可能對所述蛋白酶抑制劑治療敏感。在一個實施方案中，臨界值是6。在另一個實施方案中，臨界值是7。在另一個實施方案中，臨界值是8。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定人免疫缺陷病毒對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性是否增加的方法，該方法包括在所述HIV中檢測是否存在一個或多個表7中所列的HIV蛋白酶突變；給表7中所列出每個突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)，然后將所述加權(quán)系數(shù)相加從而獲得所述HIV的總分，其中如果所述總分等于或高于臨界值則所述HIV可能具有對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的增高的可能性。在一個實施方案中，臨界值是6。在另一個實施方案中，臨界值是7。在另一個實施方案中，臨界值是8。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定人免疫缺陷病毒感染個體是否可能具有對蛋白酶抑制劑治療的抗性或敏感性的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測是否存在一個或多個表7中所列的HIV蛋白酶突變，給表7中所列出的每個突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)，然后將所述加權(quán)系數(shù)相加從而獲得所述個體的總分，其中如果所述總分等于或高于臨界值則所述個體可能對所述蛋白酶抑制劑治療具抗性，而如果所述總分低于所述臨界值則所述個體可能對所述蛋白酶抑制劑治療具敏感性。在一個實施方案中，臨界值是6。在另一個實施方案中，臨界值是7。在另一個實施方案中，臨界值是8。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在編碼所述蛋白酶的HIV的核酸中檢測在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明所述HIV對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但前提是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。在一個實施方案中，在所述HIV的蛋白酶中檢測到所述突變。在另一個實施方案中，在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測到所述突變。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述蛋白酶氨基酸序列的20，33，34，46，50，54，63，66，73，74，76，79，82，84或89位氨基酸，但前提是所述突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53，71或95位氨基酸，但前提是所述突變不是V32I或147V。在一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自L10F、F53L和A71L。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性是否增高的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測，所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示所述個體對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但須所述突變不是K20M，K20R，M46I，M46L，I54L，I54T，I54V，L63P，V82A，V82F，V82T或I84V。在一個實施方案中，在所述HIV的蛋白酶中檢測所述突變。在另一個實施方案中，在編碼蛋白酶的HIV核苷酸中檢測所述突變。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是V32I或I47V。在一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自L10F、F53L和A71L。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
在另一個實施方案中，所述人免疫缺陷病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼HIV中蛋白酶的分離的寡核苷酸，所述蛋白酶包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的突變，其中所述突變與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。在一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約100個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約90個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約80個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約70個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約60個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約50個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約40個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約30個核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸的長度為約10～約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，所述分離的寡核苷酸包括位于所述HIV中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的與對蛋白酶抑制劑敏感性降低相關(guān)的突變，但須所述突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。寡核苷酸的長度可以是約10～約100個核苷酸、約10～約90個核苷酸、約10～約80個核苷酸、約10～約70個核苷酸、約10～約60個核苷酸、約10～約50個核苷酸、約10～約40個核苷酸、約10～約30個核苷酸、約10～約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，所述分離的寡核苷酸編碼HIV中包括在密碼子位點20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89的突變的蛋白酶，其中所述突變與對蛋白酶抑制劑敏感性降低相關(guān)，但須所述密碼子不編碼20位的M或R、46位的I或L、54位的L、T或V，63位的P、82位的A、F或T或84位的V。寡核苷酸的長度可以是約10～約100個核苷酸、約10～約90個核苷酸、約10～約80個核苷酸、約10～約70個核苷酸、約10～約60個核苷酸、約10～約50個核苷酸、約10～約40個核苷酸、約10～約30個核苷酸、約10～約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼HIV中包括在密碼子位點20、33、34、50、54、63、66、73、74、76、79、82或89的突變的蛋白酶的分離的寡核苷酸，其中所述突變與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)，但須所述密碼子不編碼20位的M或R、33位的F或M、46位的I或L、54位的A、L、S、T或V，63位的P、73位的S或T、74位的S、82位的A、F或T或84位的V。寡核苷酸的長度可以是約10～約100個核苷酸、約10～約90個核苷酸、約10～約80個核苷酸、約10～約70個核苷酸、約10～約60個核苷酸、約10～約50個核苷酸、約10～約40個核苷酸、約10～約30個核苷酸、約10～約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的1～10殘基的多肽。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ IDNO1的氨基酸序列的11～20殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的21～30殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的31～40殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的41～50殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的51～60殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的61～70殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的71～80殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的81～90殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ IDNO1的氨基酸序列的91～99殘基。
在另一個實施方案中，所述多肽與含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性。在另一個實施方案中，所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過序列特異性寡核苷酸探針和編碼所述突變的人免疫缺陷病毒的核苷酸序列雜交檢測蛋白酶中是否存在突變的方法，其中雜交的發(fā)生指示所述突變是否存在。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過核酸測序檢測蛋白酶中是否存在突變的方法。
在一個實施方案中，個體正在接受或已經(jīng)接受用所述或不同蛋白酶抑制劑的在先治療。
在一個實施方案中，所述蛋白酶的20位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的20位氨基酸是I。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是I、F或V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是I或V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是含有堿性、極性或親水性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是K。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的46位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的46位氨基酸是V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的50位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的50位氨基酸是L或V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是A或M。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是M。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是S。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的63位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的63位氨基酸是T。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的66位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的66位氨基酸是F或V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是C或T。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是C。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是A或P。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是S。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是氨基酸含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是A。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是氨基酸含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是D或E。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是S。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是L。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的89位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的89位氨基酸是I或M。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是T。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的55位氨基酸是含有堿性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的55位氨基酸是R。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是E。
另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在2個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在3個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在4個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在5個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在6個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在7個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在8個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測在9個或多個氨基酸位點是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV對第一個蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在與第二個蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該HIV對所述第一個蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但須所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或184V。在一個實施方案中，第一個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。在另一個實施方案中，第二個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對第一個蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在與第二個蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該個體對所述第一個蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但須所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或184V。在一個實施方案中，第一個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。在另一個實施方案中，第二個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。
4.附圖簡述圖.1圖解說明HIV-1的基因組結(jié)構(gòu)。
圖.2是顯示獲自2038名患者的測試數(shù)據(jù)集的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖?；蛐汀芭R界值”為6，即如果其總分是6或更高，則該HIV被確定為具有對洛匹那韋的基因型抗性，而如果其總分低于6，則為基因型敏感性。
圖.3是顯示在除去了含有在與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的任何位置的氨基酸的混合的樣品后，HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。從該分析中排除那些同時包含野生型和突變體的樣品。
圖.4是顯示蛋白酶中含有突變I50V的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為這些樣品中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。
圖.5是顯示蛋白酶中含有突變V82A、F、S、T或I的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為這些樣品中抗性相關(guān)突變?nèi)繑?shù)量的函數(shù)的散點圖。
圖.6是顯示蛋白酶中包含突變I54A、L、M、S、T或V的HIV樣品對洛匹那韋(洛匹那韋倍數(shù)變化的對數(shù))的敏感性作為這些樣品中所述抗性相關(guān)突變總數(shù)的函數(shù)的散點圖。
圖.7是顯示在除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后，HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。
圖.8是顯示在除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后和除去了含有在與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的任何位置的氨基酸的混合的樣品后，HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。僅將那些同時包含野生型或參照株和突變體的樣品除去。
圖.9是顯示在除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后，含有蛋白酶中突變I50V的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變總量的函數(shù)的散點圖。
圖.10是顯示在除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后，含有蛋白酶中突變V82A，F(xiàn)，S，T或I的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為那些樣品中抗性相關(guān)突變總量的函數(shù)的散點圖。
圖.11是顯示在除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后，含有蛋白酶中突變I54A、L、M、S、T或V的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為那些樣品中抗性相關(guān)突變總量的函數(shù)的散點圖。
圖.12A顯示了NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)蛋白酶的氨基酸序列(SEQ.ID.NO1)。
圖.12B顯示了NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)蛋白酶基因的核酸序列(SEQ.ID.NO2)。
圖.13顯示了第82位氨基酸對洛匹那韋倍數(shù)變化的影響。
顯示了中位數(shù)(水平線)，25th和75th百分位數(shù)(方框)，10th和90th百分位數(shù)(觸須線)和極端值(點)。
圖.14顯示了54位氨基酸對洛匹那韋倍數(shù)變化的作用。顯示了中位數(shù)(水平線)，25th和75th百分位數(shù)(方框)，10th和90th百分位數(shù)(觸須線)和極端值(點)。
圖.15是顯示獲自2195名患者的測試數(shù)據(jù)集的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。基因型“臨界值”是8，即，如果其總分是8或更高，則該HIV具有對洛匹那韋的基因型抗性，如果其總分低于8，則其具有基因型敏感性。
圖.16是顯示獲自1099名患者的測試數(shù)據(jù)集的HIV樣品對洛匹那韋的敏感性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為蛋白酶中抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)的散點圖。基因型“臨界值”是7，即，如果其總分是7或更高，則該HIV具有對洛匹那韋的基因型抗性，如果其總分低于7，則其具有基因型敏感性。
圖.17顯示了HIV中與對安潑那韋(“APV)抗性相關(guān)的突變對針對洛匹那韋抗性的作用。顯示了中位數(shù)(水平線)，25th和75th百分位數(shù)(方框)，10th和90th百分位數(shù)(觸須線)和極端值(點)。
圖.18顯示了洛匹那韋倍數(shù)變化(“l(fā)og LPV”)對安潑那韋倍數(shù)變化(“l(fā)og APV”)的雙變量散點圖。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于研發(fā)確定抗病毒藥的有效性的算法的方法和組合物，所述算法基于由表型臨床臨界值指導(dǎo)的配對的表型和基因型數(shù)據(jù)綜合分析。
本發(fā)明還提供了確定病毒對抗病毒療法敏感性的方法，確定抗病毒療法對感染病毒個體有效性的方法，和監(jiān)測接受抗病毒療法的個體中病毒感染的臨床進(jìn)展的方法。另一方面，本發(fā)明還提供了核酸和多肽，它們包含人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑，例如，洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變。
5.1 縮略語“LPV”是蛋白酶抑制劑洛匹那韋的縮寫。
“APV”是蛋白酶抑制劑安潑那韋的縮寫。
“PI”是蛋白酶抑制劑的縮寫。
“PT-R”和“PT-S”分別是“表型抗性”和“表型敏感性”的縮寫。
“GT-R”和“GT-S”分別是“基因型抗性”和“基因型敏感性”的縮寫。
“PCR”是“聚合酶鏈反應(yīng)”的縮寫。
“FC”是“倍數(shù)變化”的縮寫。
本文中使用的20種遺傳編碼的L-氨基酸的氨基酸表示法是常規(guī)的，如下所述氨基酸 單字母縮寫 三字母縮寫丙氨酸 A Ala精氨酸 R Arg天冬酰胺N Asn天冬氨酸D Asp半胱氨酸C Cys谷氨酰胺Q Gln谷氨酸 E Glu甘氨酸 G Gly組氨酸 H His異亮氨酸I Ile亮氨酸 L Leu賴氨酸 K Lys甲硫氨酸M Met苯丙氨酸F Phe脯氨酸 P Pro絲氨酸 S Ser蘇氨酸 T Thr色氨酸 W Trp酪氨酸 Y Tyr纈氨酸 V Val除非另有描述，當(dāng)多肽序列用一串單字母和/或三字母縮寫表示時，該序列是以N→C方向的，這與習(xí)慣作法一致。
在本文中將序列中的各氨基酸表示為AN，其中A是序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，而N是序列中的位置。在本文中將氨基酸序列中的突變表示為A1，NA2，其中A1，是參照蛋白質(zhì)序列中的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，A2是突變的蛋白質(zhì)序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，而N是氨基酸序列中的位置。例如，G25M突變表示在第25位氨基酸上甘氨酸改變?yōu)榧琢虬彼帷１疚闹校€可以將突變表示為NA2，其中N是氨基酸序列中的位置而A2是突變的蛋白質(zhì)序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記(例如，25M，是指在第25位氨基酸上野生型氨基酸改變?yōu)榧琢虬彼?。此外，本文中突變還可以表示為A1N，其中A1是參照蛋白質(zhì)序列中的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記和N是氨基酸序列中的位置(例如，G25表示在第25位氨基酸上甘氨酸改變?yōu)槿魏伟被?。該表示法通常在當(dāng)突變的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸或者是未知的或者(如果突變的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸可以是任何氨基酸)是除參照蛋白質(zhì)序列所發(fā)現(xiàn)氨基酸之外的那些時使用。氨基酸位置根據(jù)包含突變的區(qū)域來源的蛋白質(zhì)的全長序列進(jìn)行計數(shù)。DNA序列中的核苷酸和點突變的表示法是類似的。
本說明書全文所使用的涉及包括特定核酸堿基序列的核酸的縮寫是一般的單字母縮寫。因此，當(dāng)包括于核酸中時，天然存在的編碼核酸堿基縮寫如下腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有所指，將表示為一串單字母縮寫的單鏈核苷酸序列和雙鏈序列的上鏈以5’-3′的方向表示。
5.2 定義如本文所使用的，下述術(shù)語具有如下含義除非另有所指，“原發(fā)突變”是指影響酶活性位點，即在酶底物復(fù)合物相關(guān)的、或當(dāng)將病毒置于抗病毒劑的選擇壓力下時在復(fù)制早期重復(fù)出現(xiàn)的，或?qū)︶槍共《緞┑耐蛔兊谋硇兔舾行跃哂袕娮饔玫哪切┌被嵛恢玫耐蛔儭?br> “繼發(fā)突變”是指不是原發(fā)突變的且促成敏感性降低或補償由原發(fā)突變所加的總體缺陷的突變。
“基因型分析”是確定生物體、生物體的部分、基因或基因部分的基因序列的檢測法。所述檢測法經(jīng)常在HIV中使用以確定是否存在與抗藥性相關(guān)的特定突變。
如本文所使用的，“基因型數(shù)據(jù)”是關(guān)于例如病毒基因型的數(shù)據(jù)。基因型數(shù)據(jù)的實例包括，但不限于，病毒、病毒部分、病毒基因、病毒基因部分、或與病毒核酸或蛋白質(zhì)中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基具有同一性的核苷酸或氨基酸序列。
“表型分析”是檢測病毒(例如HIV)對特定抗病毒劑的敏感性的檢測法。
“敏感性”是指病毒對特定藥物的反應(yīng)。對藥物敏感性減少或降低的病毒對藥物的抗性增高或敏感性降低。對藥物敏感性增高或增強或更高的病毒對藥物的敏感性增高或抗性降低。
病毒對特定藥物的表型敏感性是連續(xù)統(tǒng)一體。然而，其事實上可用于劃定一個閾值或多個閾值用于簡化對特定倍數(shù)變化結(jié)果的解讀。對于已經(jīng)收集了充分臨床結(jié)果數(shù)據(jù)的藥物，能夠確定“臨床臨界值”，如下文所述。
“臨床臨界值”是指一個具體的點，在這個點抗性開始而敏感性消失。其可通過用特定藥物治療失敗可能性顯著增加的藥物敏感性水平進(jìn)行確定。如臨床研究中所確定的，對于不同的抗病毒劑來說臨界值不同。通過評估抗性和結(jié)果數(shù)據(jù)可在臨床試驗中確定臨床臨界值。治療開始時檢測藥物敏感性(表型)。可在治療過程的每個預(yù)定的時間點監(jiān)測治療應(yīng)答，例如病毒負(fù)荷的改變。藥物敏感性與治療應(yīng)答相關(guān)聯(lián)并通過與治療失敗相關(guān)的抗性水平可確定臨床臨界值(全部實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析)。
“ICn”是指抑制濃度。其是在患者的血液或體外抑制致病性微生物(例如HIV)n％復(fù)制所需的藥物濃度。因此，“IC50”是指將病毒復(fù)制抑制了不存在藥物時觀測的水平的50％的抗病毒劑濃度?！盎颊逫C50”是指抑制來自患者的病毒的復(fù)制50％所需的藥物濃度，“參照IC50”是指抑制參照或野生型病毒復(fù)制50％所需的藥物濃度。類似地，“IC90”是指抑制病毒復(fù)制90％的抗病毒劑濃度。
“倍數(shù)變化”是患者病毒的藥物敏感性和藥物敏感的參照病毒的藥物敏感性的數(shù)值對比。其是患者IC50與藥物敏感的參照IC50的比值，即，患者IC50/參照IC50＝倍數(shù)變化(“FC”)。倍數(shù)變化為1.0提示患者病毒表現(xiàn)出與藥物敏感的參照病毒一樣的藥物敏感性程度。倍數(shù)變化低于1提示患者病毒的藥物敏感性高于參照病毒的藥物敏感性。倍數(shù)變化高于1提示患者病毒的藥物敏感度低于參照病毒的藥物敏感性。倍數(shù)變化等于或高于臨床臨界值是指患者病毒具有對藥物應(yīng)答的較低的可能性。倍數(shù)變化低于臨床臨界值是指患者病毒具有對藥物的敏感性。
“洛匹那韋倍數(shù)變化”是指洛匹那韋抗來自患者血漿樣品的IC50與洛匹那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50的比值。
如果病毒的洛匹那韋倍數(shù)變化低于10，則該病毒對洛匹那韋“敏感”。
如果病毒的洛匹那韋倍數(shù)變化為10或高于10，則該病毒對洛匹那韋有“抗性”。
如果病毒具有一種特性，例如與針對抗病毒療法敏感性降低相關(guān)的突變，則該病毒具有“針對抗病毒療法敏感性降低的增高的可能性”。如果具有某種特性的病毒種群，平均來說，與其它不具有所述特性的相似病毒種群相比對抗病毒療法更不敏感，則該病毒特性與敏感性降低相關(guān)。因此，特性存在和敏感性降低間的相關(guān)性既不必絕對化，也不需要特性對于參照的敏感性降低是必須的(即，該特性在敏感性降低上發(fā)揮誘發(fā)性的作用)或充分的(即，特性單獨存在即為充分的)。
本文中術(shù)語“％序列同源性”與術(shù)語“％同源性”、“％序列同一性”和“％同一性”互換使用并是指當(dāng)用序列對比程序進(jìn)行比對時，2個或多個肽序列間氨基酸序列同一性的水平。例如，如本文所用的，80％同源性是指由確定的算法所確定的80％序列同一性的相同事物，并相應(yīng)地與具有超過給定序列的長度的高于80％序列同一性的給定序列同源。序列同一性的示例性水平包括，但不限于，具有與特定序列60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列同一性。
可用于確定兩個序列間同一性的示例性計算機程序包括，但不限于，BLAST程序包，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其已經(jīng)公開于互聯(lián)網(wǎng)上，其網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。還可參見Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(特別參考公開的缺省設(shè)定，即，參數(shù)w＝4，t＝17)和Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402。當(dāng)評估給定氨基酸序列相對于GenBank蛋白質(zhì)序列和其它公開數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列時，通常采用BLASTP程序?qū)嵤┬蛄袡z索。優(yōu)選使用BLASTX程序在GenBank蛋白質(zhì)序列庫及其他公共數(shù)據(jù)庫中檢索在全部閱讀框中翻譯為氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX均使用開放缺口罰分為11.0和擴展缺口罰分為1.0的缺省參數(shù)以及用BLOSUM-62矩陣運行。參見Altschul等，1997。
為了確定2個或多個序列間的“％同一性”，使用例如，MacVector6.5版中的CLUSTAL-W程序?qū)嵤﹥?yōu)選的所選序列的比對，所述程序以缺省參數(shù)，開放缺口罰分為10.0，擴展缺口罰分為0.1，和BLOSUM 30相似性矩陣運行。
“極性氨基酸”是指含有在生理pH下不帶電荷的側(cè)鏈，但含有至少一個其中由雙原子共享的電子對且靠一個原子保持的更近的鍵的親水性氨基酸。遺傳編碼的極性氨基酸包括Asn(N)、GLN(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“非極性氨基酸”是指含有在生理pH下不帶電荷的側(cè)鏈并含有其中由雙原子共享的電子對且由雙原子的每個原子同等保持的鍵(即，側(cè)鏈?zhǔn)欠菢O性的)的疏水性氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(1)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。
“親水性氨基酸”是指表現(xiàn)為根據(jù)Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化一致疏水性尺度低于0的疏水性的氨基酸。遺傳編碼的親水性氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”是指表現(xiàn)為根據(jù)Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化一致疏水性尺度高于0的疏水性的氨基酸。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)，Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
“酸性氨基酸”是指含有pK值低于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有由于缺失氫離子而在生理pH下帶負(fù)電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。
“堿性氨基酸”是指含有pK值高于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。堿性氨基酸通常具有由于水合氫離子的聯(lián)合而在生理pH下帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Arg(R)，His(H)和Lys(K)。
“突變”是與參照核酸或蛋白質(zhì)相比，氨基酸序列或相應(yīng)核苷酸序列中存在的變化。對于本發(fā)明包括HIV蛋白酶的實施方案，參照蛋白酶是存在于NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)中的蛋白酶。雖然肽的氨基酸序列可直接用，例如，埃德曼(Edman)降解或質(zhì)譜分析法進(jìn)行確定，更典型地，肽的氨基酸序列可由編碼該肽的核酸的核苷酸序列推導(dǎo)得出。任何本領(lǐng)域已知的用于確定核苷酸序列的方法都是可用的，例如，Maxam-Gilbert測序(Maxam等，1980，Method inEnzymology 65499)，雙脫氧法測序(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad Sci.USA 745463)或基于雜交的方法(例如參見，Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY)。
病毒中的“抗性相關(guān)突變”(“RAM”)是與病毒針對抗病毒劑敏感性的降低相關(guān)的突變。RAM可在一些病毒，包括，但不限于人免疫缺陷病毒(“HIV”)中發(fā)現(xiàn)。所述突變可在一個或多個病毒蛋白質(zhì)，例如，HIV的蛋白酶、整合酶、包膜蛋白或逆轉(zhuǎn)錄酶中發(fā)現(xiàn)。RAM可相對于參照株進(jìn)行確定。對于本發(fā)明包括HIV蛋白酶的實施方案，所述參照蛋白酶是存在于NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)中的蛋白酶。
“突變體”是含有相對于參照病毒、基因或蛋白質(zhì)的一個或多個改變的序列的病毒、基因或蛋白質(zhì)。
本文通篇所使用的術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可彼此互換。
術(shù)語“參照”和“野生型”在本文全文中可互換使用。
本文通篇所使用的術(shù)語“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可彼此互換。
術(shù)語“約”是指數(shù)字10％高于或10％低于其修飾數(shù)字。在數(shù)字必需是整數(shù)的情況下，例如，核苷酸長度或氨基酸長度，若得到的數(shù)字不是整數(shù)，則將其向上舍入或向下舍入離其最近的高于0的整數(shù)。
5.3抗性相關(guān)突變本發(fā)明提供了包括HIV蛋白酶中突變的核酸和多肽。優(yōu)選地，HIV是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。HIV還可以是，例如，II型人免疫缺陷病毒(“HIV-2”)。在一個實施方案中，所述突變與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)。在另一個實施方案中，所述突變與對蛋白酶抑制劑敏感性的增加相關(guān)。蛋白酶抑制劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
一方面，本發(fā)明提供了包括HIV的蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑，例如洛匹那韋敏感性增高或降低相關(guān)的突變的肽、多肽或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了源自HIV蛋白酶的并包括與對蛋白酶抑制劑敏感性降低相關(guān)的突變的多肽。在另一個實施方案中，所述多肽包括超過一個與對蛋白酶抑制劑敏感性降低相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，所述多肽包括與對蛋白酶抑制劑敏感性增加相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，所述多肽包括超過一個與對蛋白酶抑制劑敏感性增加相關(guān)的突變。本發(fā)明的多肽包括由這些多肽修飾或來源自這些多肽的肽、多肽和蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述多肽包括翻譯后修飾。在另一個實施方案中，所述多肽包括一個或多個氨基酸類似物。
在一個實施方案中，所述多肽包括一個或多個與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變。表1提供了與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變的列表。本申請文件全文所涉及的氨基酸或核苷酸位置，分別指SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中蛋白酶氨基酸或核苷酸的位置，或指其它病毒中的相應(yīng)位置，所述病毒例如是在蛋白酶中以及編碼相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的序列的蛋白酶的基因中有添加或缺失的病毒。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了源自HIV蛋白酶的多肽，該多肽包括選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M的突變。在另一個實施方案中，所述突變選自L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
在一個實施方案中，除了不同于SEQ ID NO1之處在于其中包含至少一個與對蛋白酶抑制劑例如，洛匹那韋敏感性降低或增加相關(guān)的突變的序列，所述多肽含有SEQ ID NO1的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述多肽包括SEQ ID NO1的至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、85、90或95個連續(xù)的氨基酸。
在另一個實施方案中，所述多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的1～10殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的11～20殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ IDNO1的氨基酸序列的21～30殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的31～40殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的41～50殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的51～60殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的61～70殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的71～80殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的81～90殘基。在另一個實施方案中，多肽包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的91～99殘基。
在另一個實施方案中，所述多肽與含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性。在另一個實施方案中，所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有高于80％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有高于90％同一性的氨基酸序列。
為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分?jǐn)?shù)，將序列對齊以便實現(xiàn)最佳比較目的(例如，可將缺口引入第一個氨基酸或核苷酸序列中以便與第二個氨基酸或核苷酸序列進(jìn)行最佳對比)。然后比較位于相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位置被第二個序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，則該分子在這一位置是同一的。兩個序列間的同一性百分比是序列間共有相同位置數(shù)的函數(shù)(％同一性＝#同一性位置/總#位置(例如，重疊位置)×100)。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。
兩個序列間同一性百分?jǐn)?shù)的測定可采用數(shù)學(xué)算法完成。用于兩個序列對比的數(shù)學(xué)算法的一個優(yōu)選的，非限制性的實例是按Karlin和Altschul修改的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，(1993))Karlin和Altschul算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，(1990))。所述算法已引入Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215403-410)的NBLAST和XBLAST程序中?？刹捎肗BLAST程序，得分＝100，字長＝12實施BLAST核苷酸檢索以獲得與本發(fā)明的核苷酸分子同源的核苷酸序列?？刹捎肵BLAST程序，得分＝50，字長＝3實施BLAST蛋白質(zhì)檢索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為獲得為了對比目的的缺口比對，可使用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所描述的缺口BLAST?；蛘?，可使用PSI-Blast來實施迭代檢索來檢測分子間的親緣關(guān)系。同前，當(dāng)使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列對比的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的，非限制性的實例是Myers和Miller的算法(CABIOS(1989))。所述算法已引入ALIGN程序(2.0版)中，該程序是CGC序列對比軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序來對比氨基酸序列時，可使用PAM120加權(quán)余數(shù)表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。用于序列分析的其它算法是本領(lǐng)域已知的，并包括如描述于Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，103-5中的ADVANCE和ADAM和描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定檢索靈敏度和速度的控制性選擇。如果ktup＝2，可通過尋找對齊的殘基對發(fā)現(xiàn)對比的兩個序列中的相似區(qū)；如果ktup＝1，可檢測單個對齊氨基酸。對于蛋白質(zhì)序列可將ktup設(shè)為2或1，或?qū)τ贒NA序列設(shè)為1～6。如果ktup不是特別指定的，則其缺省值對于蛋白質(zhì)是2而對于DNA是6。
兩個序列間的同一性百分?jǐn)?shù)可使用與上述方法相似的技術(shù)進(jìn)行確定，在含有或不含有允許的缺口時。在計算同一性百分?jǐn)?shù)時，通常計算精確匹配。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的天然存在的或合成設(shè)計的等位基因變體。在另一個實施方案中，除了不同于由SEQ ID NO2編碼的、其中包括至少一種與對蛋白酶抑制劑例如，洛匹那韋的敏感性降低或增加相關(guān)的突變的多肽，本發(fā)明提供了由核苷酸分子編碼的多肽，所述核苷酸分子是含有SEQ ID NO2的核苷酸序列或其互補序列的核苷酸分子的天然存在的或合成設(shè)計的等位基因變體。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼或涉及本發(fā)明的多肽或其生物活性部分的多聚核苷酸、寡核苷酸或核酸，包括，例如，足以用作鑒別、分析、突變或擴增本發(fā)明的核酸的雜交探針、PCR引物或測序引物的核酸分子。
在一個實施方案中，所述核酸編碼包括對HIV蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑例如，洛匹那韋的敏感性降低或增加相關(guān)的突變的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸，所述多肽源自HIV蛋白酶并包括一個或多個與對蛋白酶抑制劑的敏感性降低相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，所述核酸編碼包括一個或多個與對蛋白酶抑制劑的敏感性增高相關(guān)的突變的多肽。本發(fā)明的核酸包括由這些核酸序列修飾和衍生的核酸、多聚核苷酸和寡核苷酸。在一個實施方案中，核酸包括核酸類似物。
在一個實施方案中，核酸可以具有HIV基因組的長度，即，約9200個核苷酸。在另一個實施方案中，核苷酸可以具有大約是HIV蛋白酶編碼序列的長度，例如，約300核苷酸。在其它實施方案中，核酸可對應(yīng)于HIV基因組的片段或HIV蛋白酶編碼序列的片段。例如，核酸的長度可以是約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250或300個核苷酸。或者，核酸的長度可以是，例如，約350、375、400、425、450，475或500個核苷酸。核酸的長度可以是，例如，小于3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500或9000個核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸具有適于檢測本文所描述的突變，例如作為探針或引物的長度和序列。
在一個實施方案中，所述核酸編碼包括一個或多個與洛匹那韋敏感性的降低相關(guān)的突變的多肽。表1提供了對洛匹那韋敏感性的降低相關(guān)的突變的列表。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼源自HIV蛋白酶并包括選自K20I、M46V、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M的突變的多肽的核酸。在另一個實施方案中，所述突變選自L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中、所述突變選自K20I，E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
在另一個實施方案中，除了與SEQ ID NO2不同之處在于其編碼至少一個與對蛋白酶抑制劑例如，洛匹那韋敏感性降低或增加相關(guān)的突變的序列，寡核苷酸含有SEQ ID NO2的核酸序列。在其它實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、180、210、240、255、270或285個連續(xù)核酸。
在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的1～30殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ IDNO2的核苷酸序列的31～60殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的61～90殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的91～120殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的121～150殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的151～180殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的181～210殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的211～240殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ IDNO2的核苷酸序列的241～270殘基。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸序列的271～297殘基。
在另一個實施方案中，所述寡核苷酸與含有SEQ ID NO2的核酸序列的寡核苷酸具有至少60％，但低于100％的同一性。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于70％的同一性的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于80％的同一性的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于90％的同一性的核苷酸序列。兩個核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)可按前面所述進(jìn)行確定。
除SEQ ID NO2的核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到導(dǎo)致氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性可存在于種群中(例如，人類種群)。由于天然等位基因變異所述遺傳多態(tài)性可存在于種群中的個體中。天然等位基因變異通常能導(dǎo)致特定基因的核苷酸序列中1-5％的變異。作為天然等位基因變異結(jié)果的并且未改變功能活性的任何和全部所述核苷酸變異和結(jié)果得到的氨基酸變異或多態(tài)性均包含在本發(fā)明的范圍中。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了適于用作檢測本發(fā)明的核苷酸序列的引物或雜交探針的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可僅包括編碼全長本發(fā)明的多肽的核酸序列的部分例如，可用作探針或引物的片段或編碼本發(fā)明的多肽的生物活性部分的片段。該探針可包括與其連接的標(biāo)記基團(tuán)，例如，放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。在各實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈上進(jìn)行修飾。
5.4 發(fā)現(xiàn)藥物抗性相關(guān)的病毒突變另一方面，本發(fā)明提供了在病毒或病毒衍生物中發(fā)現(xiàn)抗性相關(guān)的突變的方法。
5.4.1 病毒和病毒樣品根據(jù)本發(fā)明的抗性相關(guān)的突變(“RAM”)可存在于任何類型的病毒，例如在動物中發(fā)現(xiàn)的任何病毒中。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述病毒包括已知感染哺乳動物的病毒，所述哺乳動物包括狗、貓、馬、羊、牛等。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是已知感染靈長類動物的病毒。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是已知感染人類的病毒。感染人類病毒的實例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(“HIV”)、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、其它人皰疹病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲、乙和丙型肝炎病毒、鼻病毒和人乳頭狀瘤病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。HIV還可以是，例如，II型人免疫缺陷病毒(“HIV-2”)。上述是目前存在對其有效抗病毒化療的特定病毒的代表并表示逆轉(zhuǎn)錄病毒家族、皰疹病毒、正粘病毒、副粘病毒、微小RNA病毒、黃病毒、肺病毒和肝DNA病毒。本發(fā)明可用于由這些家族內(nèi)的其它病毒所產(chǎn)生的其它病毒感染以及從其它病毒家族中的目前是否存在有效治療的病毒引起的病毒感染。
根據(jù)本發(fā)明的RAM可在用本領(lǐng)域任何已知的獲取病毒樣品的方法獲得的病毒樣品中發(fā)現(xiàn)。所述方法包括，但不限于，從病毒感染的人或動物獲取病毒樣品或從病毒培養(yǎng)物中獲取病毒樣品。在一個實施方案中，所述病毒樣品獲自病毒感染的人類個體。所述病毒樣品可獲自感染個體的身體的任何部分或任何預(yù)期含有病毒的分泌物。所述部分的實例包括，但不限于血液、血清、血漿、唾液、淋巴液、精液、陰道粘液和其它體液的樣品。在一個實施方案中，所述樣品是血液、血清或血漿樣品。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于獲自培養(yǎng)物的病毒中。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)物可獲自實驗室。在其它實施方案中，所述培養(yǎng)物可獲自保藏中心，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
在某些的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于病毒衍生物中。在一個實施方案中，病毒衍生物自身不具有病原性。在另一個實施方案中，病毒的衍生物是基于質(zhì)粒的系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的復(fù)制或用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的復(fù)制受選擇壓力的是否存在的影響，從而選擇增加對選擇壓力抗性的突變。在某些實施方案中，病毒衍生物包括所述的核酸或蛋白質(zhì)，例如作為抗病毒療法靶位的那些核酸或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，可將所述的基因摻入載體中。例如參見，美國專利號5,837,464和6,242,187和PCT公開WO99/67427，上述各專利引入本文作為參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因可以是編碼蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的基因。
在另一個實施方案中，無須使用完整病毒。代替地，可使用摻入載體的病毒部分。優(yōu)選地，抗病毒藥靶向所使用的該病毒部分。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于遺傳修飾的病毒中?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知任何用于遺傳修飾病毒的方法對病毒進(jìn)行遺傳修飾。例如，可將病毒在實驗室培養(yǎng)基中按需要的次數(shù)培養(yǎng)傳代。在一個實施方案中，不施加選擇壓力(即，不對病毒施加適于具有特定特征的病毒的復(fù)制的處理)，經(jīng)過隨機遺傳漂變(random geneticdrift)而累積新的突變。在另一個實施方案中，在病毒在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(即，該病毒在適于具有一個或多個特性的病毒的復(fù)制的條件下培養(yǎng))，將選擇壓力施加于該病毒。在一個實施方案中，選擇壓力是抗病毒療法。任何已知的抗病毒療法均可用作選擇壓力。在一個實施方案中，所述病毒是HIV而所述選擇壓力是蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，所述病毒是HIV-1而所述選擇壓力是蛋白酶抑制劑。任何蛋白酶抑制劑均可用于施加選擇壓力。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。通過用蛋白酶抑制劑，例如，洛匹那韋處理體外培養(yǎng)的HIV，技術(shù)人員可選擇具有對安潑那韋抗性增加的HIV的突變株?？烧{(diào)整所述選擇壓力的嚴(yán)緊性以便增加或降低不具有所選特性的病毒的存活。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的RAM可通過誘變處理病毒、病毒基因組或病毒基因組的部分進(jìn)行制備。本領(lǐng)域中已知的任何誘變方法均可用于該目的。在一個實施方案中，所述誘變基本上是隨機的。在另一個實施方案中，基本上隨機的誘變通過對病毒、病毒基因組或病毒基因組的部分進(jìn)行誘變處理進(jìn)行實施。在另一個實施方案中，對編碼作為抗病毒療法的靶位的病毒蛋白的基因進(jìn)行誘變處理。基本隨機的誘變處理的實例包括，例如，暴露于誘變劑(例如，溴乙錠、乙基甲烷磺酯、乙基亞硝基脲(ENU)等)、放射(例如，紫外線)、插入和/或除去可轉(zhuǎn)座元件(例如，Tn5、Tn10)或在細(xì)胞、細(xì)胞提取物或在具有增高的誘變率的體外復(fù)制系統(tǒng)中的復(fù)制。例如參見，Russell等，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 765918-5922；Russell，W.，1982，Environmental Mutagens and CarcinogensProceedings of the ThirdInternational Conference on Environmental Mutagens。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能認(rèn)識到雖然每一個這些誘變方法基本上在分子水平是隨機的，每個都具有其自身優(yōu)選的靶位。
另一方面，可能影響病毒對抗病毒治療的敏感性的突變采用定點誘變進(jìn)行制備。可使用本領(lǐng)域已知的任何定點誘變方法(例如參見，Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY)?？蓪⑺龆c誘變實施于，例如，特定的基因或基因組區(qū)、基因或基因組區(qū)的特定部分、或基因或基因組區(qū)中的一個或幾個特定核苷酸。在一個實施方案中，將所述定點誘變實施于病毒基因組區(qū)、基因、基因片段或基于一個或多個標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸。在一個實施方案中，對基因或基因的部分實施定點誘變，因為其編碼已知為或疑為抗病毒療法靶位的蛋白質(zhì)，例如，編碼HIV蛋白酶的基因。在另一個實施方案中，選擇基因的部分或基因中的一個或少數(shù)幾個核苷酸進(jìn)行定點誘變。在一個實施方案中，將要進(jìn)行誘變處理的核苷酸編碼已知或疑為與抗病毒化合物相互作用的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，將要誘變處理的核苷酸編碼已知或疑為在具有針對抗病毒治療敏感性降低的病毒株中突變的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，所述誘變處理的核苷酸編碼的氨基酸殘基毗鄰或靠近已知或疑為與抗病毒化合物相互作用的或已知或疑為在具有針對抗病毒療法敏感性降低的病毒株中突變的蛋白質(zhì)殘基初級序列。在另一個實施方案中，誘變處理的核苷酸編碼毗鄰或靠近已知為或疑為與抗病毒化合物發(fā)生相互作用或已知為或疑為在具有對抗病毒療法增高的敏感性的病毒株中突變的蛋白質(zhì)殘基的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)氨基酸殘基。在另一個實施方案中，所述誘變處理的核苷酸編碼氨基酸殘基位于或靠近已知為或疑為與抗病毒化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)的活性位點。例如參見，Sarkar和Sommer，1990，Biotechniques，8404-407。
5.4.2 檢測病毒中是否存在突變可通過本領(lǐng)域中已知的任何用于檢測突變的方法檢測病毒中是否存在根據(jù)本發(fā)明的RAM。可在編碼特定蛋白質(zhì)的病毒基因中或在該蛋白質(zhì)自身，即在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中檢測突變。
在一個實施方案中，所述突變位于病毒基因組中。所述突變可位于，例如，編碼病毒蛋白質(zhì)的基因中，在編碼病毒蛋白的基因的順式或反式作用調(diào)控序列、基因間隔序列或內(nèi)含子序列內(nèi)。突變能夠影響改變病毒針對抗病毒療法的敏感性的病毒結(jié)構(gòu)、功能、復(fù)制或環(huán)境的任何方面。在一個實施方案中，突變位于是抗病毒療法靶位的編碼病毒蛋白質(zhì)的基因內(nèi)。
可使用多種技術(shù)檢測病毒基因中的突變。病毒DNA或RNA可用作所述試驗技術(shù)的起點，并可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離。
病毒DNA或RNA可用于雜交或擴增試驗中，從而檢測涉及基因結(jié)構(gòu)異常情況，包括點突變、插入、缺失和基因組重排。所述試驗可包括，但不限于，Southern分析(Southern，1975，J.Mol.Biol.98503-517)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)(Orita等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766-2770)，和PCR分析(美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，Academic Press，Inc.)。
用于檢測基因特異性突變的所述診斷方法可包括例如，將所述病毒核酸與一個或多個標(biāo)記的核酸試劑包括重組DNA分子克隆的基因或其簡并變異體，在適于這些試劑與其互補序列特異性退火的條件下進(jìn)行接觸和孵育。優(yōu)選地，這些核酸試劑的長度是至少15～30個核苷酸。在孵育后，從所述核苷酸分子雜交體中除去所有非退火的核酸。如果存在任何所述分子，則可檢測到發(fā)生雜交的核酸的存在。使用所述檢測方案，可將來自所述病毒的核酸固定于，例如，固體載體例如膜，或塑料表面例如微量滴定板或聚苯乙烯珠上。在該情況下，在孵育后，非退火的，標(biāo)記的上述類型的核酸試劑可被很容易的去除。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施對剩下的，退火的，標(biāo)記的核酸試劑的檢測?？蓪⒑塑账嵩噭┩嘶鹚鶎Φ幕蛐蛄信c從正?；蛐蛄兄型茰y的退火模式相比較從而確定基因突變是否存在。
檢測基因特異性核酸分子的選擇性診斷方法可包括核酸分子的擴增，例如通過PCR(美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，AcademicPress，Inc.)，隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的技術(shù)檢測擴增的分子?？蓪⒌玫降臄U增的序列與如果擴增的核酸僅含有各基因的正常拷貝時所期望的那些序列相比較以便測定基因突變是否存在。
此外，可采用本領(lǐng)域中任何已知測序方法對所述核苷酸測序。例如，所述病毒DNA可通過描述于Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463，進(jìn)一步描述于Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9309的雙脫氧法，或通過描述于Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65499的方法進(jìn)行測序。還可參見Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY所描述的技術(shù)。
針對所述病毒基因產(chǎn)物，即，病毒蛋白質(zhì)或病毒肽片段的抗體也可用于在病毒蛋白質(zhì)中檢測突變?；蛘?，所述病毒蛋白質(zhì)或肽片段可采用本領(lǐng)域中任何已知的為了產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的測序方法測序。所述方法的一個實例是可用于小蛋白質(zhì)或多肽測序的埃德曼降解法。較大蛋白質(zhì)可最初用本領(lǐng)域中已知的化學(xué)或酶試劑，例如，溴化氰、羥胺、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶剪切，然后通過埃德曼降解法進(jìn)行測序。
5.5 檢測突變體病毒的表型敏感性本領(lǐng)域中任何已知方法均可用于測定突變體病毒或病毒種群對抗病毒療法的表型敏感性。例如參見美國專利號5,837,464和6,242,187，將其全文引入此處作為參考。在某些實施方案中，實施表型分析，即病毒對給定抗病毒劑的敏感性可通過無所述突變的參照病毒的敏感性進(jìn)行檢測。該檢測是藥物敏感性的直接、定量的檢測并可通過本領(lǐng)域中確定病毒針對抗病毒劑的敏感性的任何已知方法進(jìn)行實施。所述方法的實例包括，但不限于，通過參照病毒確定IC50值的倍數(shù)變化。表型分析檢測了特定病毒株在存在藥物抑制劑時在體外的生長能力。當(dāng)與抑制所述參照病毒所需藥物量相比，抑制病毒活性需要更多藥物時，該病毒具有對特定藥物較低的敏感性。
在一個實施方案中，對病毒株實施表型分析并用于計算藥物的IC50或IC90。也可將分析的結(jié)果表示為每個病毒株的與藥物敏感性對照株或來自同一患者的先前的病毒株相比的IC50或IC90中的倍數(shù)變化。因為將所述病毒直接實施每個有效抗病毒藥物治療，故可將結(jié)果直接與治療應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。例如，如果該患者病毒顯示了對特定藥物的抗性，則將該藥物從該患者的治療方案中除去或省略，這可使得醫(yī)師可以設(shè)計在較長期更可能有效的的治療方案。
在另一個實施方案中，采用重組病毒試驗(“RVAs”)實施所述表型分析。RVAs使用通過病毒載體和擴增自患者病毒的病毒基因序列間的同源重組產(chǎn)生的病毒原種。在某些實施方案中，所述病毒載體是HIV載體而所述病毒基因序列可以是蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶序列。
在一個實施方案中，使用PHENOSENSETM(ViroLogic Inc.，SouthSan Francisco，CA)實施所述表型分析。參見Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44920-928；美國專利號5,837,464和6,242,187。PHENOSENSETM是實現(xiàn)表型分析優(yōu)勢并克服先前分析法的缺陷的表型分析法。因為該分析法已經(jīng)實現(xiàn)自動化，PHENOSENSETM在受控的條件下能夠提供較高通量。結(jié)果是能夠準(zhǔn)確確定患者的HIV分離群對目前所有有效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥的敏感性圖譜的檢測，并將結(jié)果在收到樣品后約10～約15日內(nèi)直接傳送給醫(yī)師。PHENOSENSETM是準(zhǔn)確的并能在僅一個病毒復(fù)制周期內(nèi)即可獲得結(jié)果，從而避免選擇病毒亞群。該結(jié)果是定量的，用于衡量藥物敏感性的不同程度，同時也是靈敏的，該檢測可實施于病毒負(fù)荷約500拷貝/ml的樣品并能檢測檢測濃度為總病毒種群的濃度的10％或更低的某些藥物抗性病毒的少數(shù)種群。而且，所述結(jié)果為可重復(fù)的且在所實施的約95％的試驗中的變化(依賴于藥物)低于約1.4-2.5倍。
PHENOSENSETM可使用來自擴增的病毒基因序列的核酸。如5.4.1節(jié)中所述，包含病毒的樣品可以是來自所述病毒感染的人或動物的樣品或來自病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品。在一個實施方案中，所述病毒樣品包括遺傳修飾的實驗室株。
然后抗性測試載體(“RTV”)可通過采用本領(lǐng)域中任何已知的將基因序列摻入至載體的方法將擴增的病毒基因序列摻入復(fù)制缺陷型病毒載體的方式進(jìn)行構(gòu)建。在一個實施方案中，使用限制性內(nèi)切酶和常規(guī)克隆方法。參見Maniatis等，1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and Wiley InterScience，NY。在某些實施方案中，使用限制性內(nèi)切酶ApaI和PinAI。優(yōu)選地，復(fù)制缺陷型病毒載體是指示基因病毒載體(“IGVV”)。在某些實施方案中，所述病毒載體包含檢測RTV復(fù)制的元件。優(yōu)選地，病毒載體包含熒光素酶表達(dá)盒。
所述測定可通過首先用RTV DNA和表達(dá)另一逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，雙嗜性鼠白血病病毒(MLV)的包膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)行實施。轉(zhuǎn)染后，收集病毒顆粒并用于感染新鮮靶細(xì)胞。單個病毒復(fù)制周期的完成可通過用于檢測載體中復(fù)制的方法進(jìn)行檢測。在一個實施方案中，單個病毒復(fù)制周期的完成導(dǎo)致熒光素酶的生成?？稍谵D(zhuǎn)染步驟或感染步驟以一系列濃度加入抗病毒劑。
針對抗病毒劑的敏感性可通過比較載體在存在和不存在抗病毒劑時的復(fù)制進(jìn)行檢測。例如，針對抗病毒劑的敏感性可通過比較在存在和不存在抗病毒劑時熒光素酶活性進(jìn)行檢測。敏感性病毒在存在抗病毒劑時將產(chǎn)生低水平的熒光素酶活性，而具有降低的敏感性的病毒將產(chǎn)生較高水平的熒光素酶活性。
在一個實施方案中，將PHENOSENSETM用于評價HIV-1對抗病毒藥的表型敏感性。優(yōu)選地，所述抗病毒藥是蛋白酶抑制劑。更優(yōu)選地，其為洛匹那韋。在某些實施方案中，所述參照病毒株是HIV株NL4-3或HXB-2.
在一個實施方案中，病毒核酸，例如，HIV-1 RNA可提取自血漿樣品，完整病毒基因或其片段可采用例如(但不限于)PCR的方法進(jìn)行擴增。參見例如，Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother42(2)269-76。在一個實施例中，包含全部HIV-1 PR-和RT-編碼序列的2.2-kb片段可采用巢式逆轉(zhuǎn)錄-PCR進(jìn)行擴增。然后可將擴增的核酸庫，例如，PR-RT-編碼序列，與pGEMT3deltaPRT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞例如CD4+T淋巴細(xì)胞(MT4)中，所述質(zhì)粒中刪除了大部分PR(密碼子10～99)和RT(密碼子1～482)序列。同源重組導(dǎo)致含有病毒編碼序列，例如源自血漿中HIV-1 RNA的PR-和RT-編碼序列的嵌合病毒產(chǎn)生。嵌合病毒針對目前所有靶向轉(zhuǎn)染基因的產(chǎn)物的有效抗病毒劑(例如proRT和/或PR抑制劑)的敏感性，可通過本領(lǐng)域已知的任何細(xì)胞存活試驗進(jìn)行測定。例如，可以在能夠?qū)崿F(xiàn)高樣品通量的自動化系統(tǒng)中使用基于MT4細(xì)胞-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑的細(xì)胞存活試驗。對所有抗病毒劑例如RT和PR抑制劑的抗性圖譜可用單PR-RT-抗病毒圖(Antivirogram)進(jìn)行圖解顯示。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它用于評價病毒對抗病毒藥的表型敏感性的實驗也可使用。例如參見，Shi和Mellors，1997，AntimicrobAgents Chemother.41(12)2781-85；Gervaix等，1997，Proc NatlAcad Sci U.S.A.94(9)4653-8，這些文件全文引入此處作為參考。
在另一個實施方案中，病毒對用抗病毒療法治療的敏感性通過檢測在存在所述抗病毒療法時，該抗病毒療法的靶位的活性進(jìn)行測定。在一個實施方案中，所述病毒是HIV，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑，而抗病毒療法的靶點是HIV蛋白酶。例如參見，美國專利號5,436,131；6,103,462，這些文件全文引入此處作為參考。
5.6 將表型敏感性和基因型敏感性相關(guān)聯(lián)可將本領(lǐng)域中任何已知方法用于確定突變是否與病毒針對抗病毒療法的敏感性的增加相關(guān)聯(lián)并因此是根據(jù)本發(fā)明的RAM。在一個實施方案中，P值用于確定相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)顯著性，這樣P值越小，檢測的顯著性越高。優(yōu)選地，P值須低于0.05。更優(yōu)選地，P值須低于0.01。P值可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行計算。在一個實施方案中，采用Fisher′s精確概率檢驗計算P值。例如參見，David Freedman，Robert Pisani & Roger Purves，1980，STATISTICS，W.W.Norton，New York。
在一個實施方案中，將某些含有被分析突變的具有低于或高于10倍的IC50倍數(shù)變化的樣品與不含所述突變的某些樣品比較?？蓸?gòu)建2×2表并且可使用Fisher′s精確概率檢驗計算P值(參見實施例5)。將小于0.05或0.01的P值歸為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
5.7 確定對抗病毒療法的敏感性另一方面，本發(fā)明提供了一種確定病毒對抗病毒療法的敏感性的方法?？剐韵嚓P(guān)突變(RAM)可被鑒定并將其與病毒對抗病毒療法的降低的敏感性相關(guān)聯(lián)，如上述5.3-5.6節(jié)中所述?？刹捎帽绢I(lǐng)域的任何已知方法例如上述5.4.2節(jié)中所述檢測病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示該病毒具有對所述抗病毒療法敏感性降低的增高的可能性。在一個實施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。在另一個實施方案中，所述病毒是I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的編碼所述蛋白酶的核酸中檢測在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明與無所述突變的HIV相比例如，野生型或?qū)φ誋IV，所述HIV對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V在一個實施方案中，在所述HIV的蛋白酶中檢測所述突變。在另一個實施方案中，在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測所述突變。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或I84V。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是V32I或I47V。在一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自L10F、F53L和A71L。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV對第一個蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測是否存在與第二個蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該HIV對第一個蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加。在一個實施方案中，所述第一個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。在另一個實施方案中，所述第二個蛋白酶抑制劑是安潑那韋。在另一個實施方案中，所述蛋白酶中的突變位于蛋白酶的氨基酸序列的11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A、或I84V。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對第一個蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測所述蛋白酶的氨基酸序列的11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在與第二個蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該個體對第一個蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定病毒感染個體對抗病毒療法的敏感性的方法?？设b定抗性相關(guān)突變(RAM)并將其與病毒對抗病毒療法的降低的敏感性相關(guān)聯(lián)，如上述5.3-5.6節(jié)所述。可采用本領(lǐng)域的任何已知方法例如上述5.4.2節(jié)中所述檢測存在于來自所述個體的樣品中的病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示該個體具有對所述抗病毒療法敏感性降低的增高的可能性。在一個實施方案中，所述病毒是HIV。在另一個實施方案中，病毒是HIV-1。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染的個體對蛋白酶抑制劑治療的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示與用不含有所述突變的HIV例如，野生型或?qū)φ誋IV感染的個體相比，該個體對蛋白酶抑制劑治療敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或184V。在一個實施方案中，在所述HIV的蛋白酶中檢測所述突變。在另一個實施方案中，在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測所述突變。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定蛋白酶抑制劑治療對HIV感染個體有效性的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測，在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示所述個體對所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或I84V。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變位于HIV蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提條件是所述突變不是V32I或147V。在一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自L10F、F53L和A71L。
在另一個實施方案中，與所述蛋白酶抑制劑治療敏感性降低相關(guān)的突變選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一個實施方案中，所述突變選自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
5.8 構(gòu)建算法一方面，本發(fā)明提供了一種將病毒的基因型數(shù)據(jù)與所述病毒的表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的算法的構(gòu)建方法。在一個實施方案中，該表型數(shù)據(jù)涉及病毒對抗病毒療法的敏感性。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是抗病毒化合物。在另一個實施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
在一個實施方案中，構(gòu)建所述算法的方法包括建立將關(guān)于病毒組的基因型數(shù)據(jù)與關(guān)于病毒組的表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的一個規(guī)則或多個規(guī)則。
在一個實施方案中，建立包括病毒組中每一病毒的基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)的測試數(shù)據(jù)集。可使用本領(lǐng)域中任何已知方法來收集關(guān)于病毒的基因型數(shù)據(jù)。上面已經(jīng)提供了收集所述數(shù)據(jù)的方法的實例?？墒褂帽绢I(lǐng)域中任何已知方法收集關(guān)于病毒的表型數(shù)據(jù)。所述方法的實例如上文所述。在某些實施方案中，測試數(shù)據(jù)集包括一個或多個上述RAMs。在一個實施方案中，每一基因型數(shù)據(jù)均為病毒組中病毒的病毒蛋白質(zhì)的全部或部分序列。在另一個實施方案中，測試數(shù)據(jù)集中的每一基因型數(shù)據(jù)均為由病毒編碼的蛋白質(zhì)中相對參照病毒中的參照蛋白質(zhì)的單氨基酸變化。在其它實施方案中，所述基因型包括所述病毒蛋白質(zhì)中2、3、4、5、6或更多個氨基酸改變。在另一個實施方案中，病毒是HIV，而蛋白質(zhì)是HIV蛋白酶。在一個實施方案中，病毒是HIV-1。在另一個實施方案中，所述參照蛋白質(zhì)是來自NL4-3 HIV的蛋白酶。
在一個實施方案中，測試數(shù)據(jù)集中的每一表型數(shù)據(jù)均為病毒組中病毒針對抗病毒療法的敏感性。在一個實施方案中，抗病毒療法是抗病毒化合物。在另一個實施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。在一個實施方案中，所述敏感性按病毒相對參照病毒的敏感性的改變進(jìn)行檢測。在另一個實施方案中，所述敏感性按病毒IC50相對參照病毒的改變進(jìn)行檢測。在另一個實施方案中，將IC50的變化表示為IC50的倍數(shù)變化。在一個實施方案中，所述病毒是HIV。在另一個實施方案中，所述病毒是HIV-1.在另一個實施方案中，所述參照HIV是NL4-3 HIV。
測試數(shù)據(jù)集中的基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)可用本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行表示或組織。在一個實施方案中，用圖表的方式顯示所述數(shù)據(jù)，例如，如圖2和7中所示。在這類表示方法中，Y軸表示該數(shù)據(jù)集中病毒的IC50相對參照病毒的倍數(shù)變化。圖表中的每個點均與該數(shù)據(jù)集中的一個病毒相對應(yīng)。X軸表示該數(shù)據(jù)集中病毒所含有的突變數(shù)量。點的位置同時表示突變的數(shù)量和抗病毒治療中病毒所具有的倍數(shù)變化，上述二者均相對參照株進(jìn)行檢測。在另一個實施方案中，用圖解的形式顯示測試數(shù)據(jù)集中的基因型和表型數(shù)據(jù)，例如，如圖2中所示。
一方面，按將測試數(shù)據(jù)集中的基因型數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的方式建立算法。在一個實施方案中，確定表型臨界點。在另一個實施方案中，該表型是針對抗病毒療法的敏感性。在另一個實施方案中，所述表型是針對抗病毒療法的敏感性相對參照病毒的改變，而臨界點是如下的值，即在高于該值的病毒或病毒種群被確定為具有針對抗病毒療法的表型抗性(“PT-R”)而低于該值的病毒或病毒種群被確定為具有針對抗病毒療法的表型敏感性(“PT-S”)。在其它實施方案中，所述臨界點高于參照病毒的IC50的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍。在另一個實施方案中，所述表型臨界點是如上述的臨床臨界值。在另一個實施方案中，病毒是HIV而抗病毒療法是用蛋白酶抑制劑的治療。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑洛匹那韋。
在另一個實施方案中，將所述表型臨界點用于確定基因型臨界點。在一個實施方案中，其通過將測試數(shù)據(jù)集的病毒中突變的數(shù)量與病毒的表型敏感性相關(guān)聯(lián)來實施。其可通過，例如，使用與上述圖2中相似的圖來完成。選擇基因型臨界點以便使得具有超過所述數(shù)據(jù)集中的突變數(shù)量的最多的病毒具有表型抗性(“PT-R”)，而且使得具有少于所述數(shù)據(jù)集中的突變數(shù)量的最多的病毒具有表型敏感性(“PT-S”)。經(jīng)過確定，測試數(shù)據(jù)集中具有等于或高于所述基因型臨界值的突變數(shù)量的病毒具有對抗病毒療法的基因型抗性(“GT-R”)，而測試數(shù)據(jù)集中具有低于所述基因型臨界值的突變數(shù)量的病毒具有對抗病毒療法的基因型敏感性(“GT-S”)。因此，在一個實施方案中，選擇能使測試數(shù)據(jù)集中最大百分比的病毒或者具有表型抗性和基因型抗性(“PT-R，GT-R”)或者具有表型敏感性和基因型敏感性(“PT-S，GT-S”)的基因型臨界點。
雖然該簡單算法能夠提供測試數(shù)據(jù)集中基因型和表型數(shù)據(jù)間相關(guān)性的有用近似值，但在大多數(shù)情況下存在顯著數(shù)量的具有基因型敏感性但也具有表型抗性(“GT-S，PT-R”)或具有基因型抗性但也具有表型敏感性(“GT-R，PT-S”)的菌株，如圖2和7中所示。這些不一致結(jié)果是算法不準(zhǔn)確性的量度。因此，在某些實施方案中，還要修改所述算法以便降低測試數(shù)據(jù)集中不一致結(jié)果的百分比。在一個實施方案中，其通過從數(shù)據(jù)集中除去對應(yīng)于包括含有包括野生型，在由測試算法所考慮的單個位置的突變混合的病毒種群的每個數(shù)據(jù)點來實施。如圖3和實施例3中所示，其具有降低PT-S，GT-R結(jié)果的數(shù)量的作用，由此降低了不一致的結(jié)果的總百分?jǐn)?shù)并因此改善了算法對測試數(shù)據(jù)集的適合度。
在另一個實施方案中，通過給在測試數(shù)據(jù)集中觀測到的一個或多個突變分配不同的加權(quán)值從而降低不一致結(jié)果的百分比。不包括該步驟的算法假定測試數(shù)據(jù)集中的每個突變對病毒或病毒種群針對抗病毒治療總抗性的貢獻(xiàn)相等。在很多情況下這不正確。圖4顯示了測試數(shù)據(jù)集中幾乎總與針對抗病毒療法的表型抗性相關(guān)的突變的實例。即，幾乎每一含有該突變的病毒，即使是那些僅含有全部突變的一個或兩個的病毒也均具有對抗病毒療法的表型抗性。在一個實施方案中，所述突變是“被加權(quán)的”即，被設(shè)定了增高的突變評分。突變可被設(shè)定如下加權(quán)，例如，2、3、4、5、6、7、8或更高。例如，被設(shè)定為加權(quán)2的突變將作為病毒中的2個突變進(jìn)行計算。還可設(shè)定分?jǐn)?shù)加權(quán)值。在另一個實施方案中，可設(shè)定低于1和低于0的值，其中突變與病毒對抗病毒療法敏感性增高相關(guān)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到存在給特定突變設(shè)定增高的加權(quán)時有關(guān)的平衡。隨著突變的加權(quán)增高，GT-R，PT-S不一致結(jié)果的數(shù)量可增加。因此，如果給予某突變的加權(quán)值過高，可使算法總體不一致性升高。
因此，在一個實施方案中，為能平衡GT-S，PT-R結(jié)果的降低和GT-R，PT-S結(jié)果的增加的突變設(shè)定加權(quán)。
在另一個實施方案中，測試數(shù)據(jù)集中不同突變間的相互作用也作為因子納入算法中。例如，可發(fā)現(xiàn)2個或多個突變以協(xié)同方式發(fā)揮作用，即，病毒中的突變同時發(fā)揮作用時對病毒抗性的促成作用要顯著高于根據(jù)各病毒彼此不依賴時的作用所預(yù)測的促成作用。或者，可能會發(fā)現(xiàn)病毒中2個或多個突變同時發(fā)揮作用時所促成的病毒抗性要顯著低于根據(jù)各病毒獨立存在時的促成作用所預(yù)期的病毒抗性。而且，可發(fā)現(xiàn)2個或多個突變一起存在要比突變獨立存在頻繁得多。因此，在一個實施方案中，給一起存在的突變一起加權(quán)。例如，為了避免GT-R，PT-S不一致結(jié)果數(shù)量的增加，僅給一個突變設(shè)定加權(quán)1或更大，而給其它一個突變或多個突變設(shè)定加權(quán)0。
另一方面，通過將數(shù)據(jù)集的病毒中的突變的數(shù)量和類型與病毒的表型敏感性相關(guān)聯(lián)可將表型臨界點用于確定基因型臨界點。突變類型的實例包括，但不限于，原發(fā)氨基酸突變、繼發(fā)氨基酸突變、多肽上為保留凈電荷的突變和不會改變特定位置氨基酸的極性、疏水性或親水性的突變。根據(jù)本說明的技術(shù)，本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括其它類型的突變是本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的。
在一個實施方案中，構(gòu)建將一個或多類突變所需條件因子化的算法。在另一個實施方案中，算法將一個或多個突變類型的最小數(shù)量所需條件因子化。在另一個實施方案中，算法將原發(fā)或繼發(fā)突變的最低數(shù)量所需條件因子化。在另一個實施方案中，原發(fā)或繼發(fā)突變聯(lián)合其它突變的所需條件也作為因子而納入算法中。例如，可發(fā)現(xiàn)具有特定突變組合的病毒具有針對抗病毒療法的抗性，而當(dāng)該組合中任一突變，單獨或與其不是該組合部分的其它突變聯(lián)合而存在于病毒中時，該病毒不具有針對抗病毒療法的抗性。
通過使用，例如，上述方法，可設(shè)計所述算法以便獲得任何需要的結(jié)果。在一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將總一致性(PT-R、GT-R和PT-S、GT-S組的百分?jǐn)?shù)之和或100-(PT-S、GT-R+PT-R、GT-S組的百分?jǐn)?shù))最大化。在某些實施方案中，總一致性高于75％、80％、85％、90％或95％。在一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-R、GT-S結(jié)果的百分?jǐn)?shù)最小化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-S、GT-R結(jié)果的百分?jǐn)?shù)最小化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-S、GT-S結(jié)果的百分?jǐn)?shù)最大化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-R、GT-R結(jié)果的百分?jǐn)?shù)最大化。
在算法構(gòu)建期間或其構(gòu)建后的任何時間點，其還可以在第二數(shù)據(jù)集上進(jìn)行測試。在一個實施方案中，所述第二數(shù)據(jù)集包括不包含于測試數(shù)據(jù)集中的病毒，即，第二數(shù)據(jù)集是原始(naive)數(shù)據(jù)集。在另一個實施方案中，所述第二數(shù)據(jù)集包括存在于測試數(shù)據(jù)集中的一個或多個病毒和不存在于測試數(shù)據(jù)集中的一個或多個病毒。將所述算法用于第二數(shù)據(jù)集，特別是原始數(shù)據(jù)集，能夠評估所述算法的預(yù)測能力。因此，在一個實施方案中，使用第二數(shù)據(jù)集評估算法的精確度，然后如上述修改所述算法的規(guī)則以便提供其精確度。在另一個實施方案中，將迭代法用于建立所述算法，由此檢測算法并隨后對其重復(fù)修改直至達(dá)到需要的精確度水平。
5.9 采用算法預(yù)測病毒的敏感性另一方面，本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明的算法預(yù)測病毒或病毒衍生物對基于病毒的基因型的抗病毒療法的表型敏感性的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測，是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒治療的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中得分等于或大于基因型臨界值則提示該病毒具有針對抗病毒療法的基因型抗性，而得分低于基因型臨界值，則提示該病毒具有針對抗病毒療法的基因型敏感性。
本發(fā)明的算法可用于任何抗病毒藥敏感性是關(guān)注因素的病毒病，如5.4.1節(jié)中所述。在特定的實施方案中本發(fā)明的測定法可用于測定逆轉(zhuǎn)錄病毒對抗病毒藥的敏感性。在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是HIV-1.
本發(fā)明的抗病毒劑可以是對抗病毒的任何有效治療。本發(fā)明的實施可用于，例如，理解可在本發(fā)明的藥物敏感性實驗中進(jìn)行檢測的病毒的結(jié)構(gòu)、生命周期和遺傳成分。這些將被本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉并提供，例如關(guān)鍵酶和抗病毒劑可靶向的其它分子。本發(fā)明的抗病毒劑的實例包括，但不限于，核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韋(abacavir)，核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如替諾福韋(tenofovir)，非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如奈韋拉平、依非韋侖、地拉韋定，融合抑制劑例如T-20和T-1249和蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
在本發(fā)明的某些實施方案中，將抗病毒劑施用于逆轉(zhuǎn)錄病毒。在特定的實施方案中，抗病毒劑是蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，抗病毒劑是洛匹那韋。
某些與抗病毒劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。例如參見，Kempf等，2001，J.Virol.757462-69。其它突變可采用上述5.3-5.8節(jié)所描述的方法測定。例如，表1提供了與洛匹那韋敏感性的降低相關(guān)的突變列表。
5.10 使用算法預(yù)測個體抗病毒療法的有效性另一方面，本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的算法基于病毒對抗病毒療法的基因型從而預(yù)測抗病毒療法對感染了病毒的個體的有效性的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒療法的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中得分等于或大于基因型臨界值提示該病毒具有針對抗病毒療法的基因型抗性，而得分低于基因型臨界值則提示該病毒具有針對抗病毒療法的基因型敏感性。
如上面5.4.1節(jié)中所述，本發(fā)明的算法可用于任何抗病毒藥敏感性是關(guān)注因素的病毒病，而本發(fā)明的抗病毒劑可以是任何對病毒有效的治療法。在特定的實施方案中本發(fā)明的測定法用于測定逆轉(zhuǎn)錄病毒對抗病毒藥的敏感性。在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是HIV-1。在本發(fā)明的某些實施方案中，將所述抗病毒劑導(dǎo)向逆轉(zhuǎn)錄病毒。在特定的實施方案中，抗病毒劑是蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，抗病毒劑是洛匹那韋。
如上面5.9節(jié)中所述，與抗病毒劑治療敏感性的降低相關(guān)的突變可獲自現(xiàn)有技術(shù)或采用如上面5.4-5.8節(jié)中所述方法測定。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種在感染了病毒并在之前正在進(jìn)行或已經(jīng)進(jìn)行了相同或不同抗病毒療法治療的患者中監(jiān)測抗病毒療法有效性的方法，包括在所述個體的樣品中檢測，是否存在與抗病毒療法治療敏感性的降低相關(guān)的氨基酸殘基，其中所述殘基的存在與所述抗病毒療法治療敏感性的降低相關(guān)。
5.11 將對一種抗病毒療法的敏感性與對另一種抗病毒療法的敏感性相關(guān)聯(lián)另一方面，本發(fā)明提供了一種采用本發(fā)明的算法預(yù)測基于所述病毒對不同抗病毒療法的基因型敏感性的抗病毒療法對病毒的有效性。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測，是否存在一個或多個與針對抗病毒療法抗性相關(guān)的突變并將本發(fā)明的算法規(guī)則用于檢測到的突變，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒治療的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在所述病毒或所述病毒衍生物中檢測，是否存在一個或多個與針對抗病毒療法抗性相關(guān)的突變并將所述算法規(guī)則用于檢測到的突變，其中得分等于或高于基因型臨界值則表明該病毒具有對不同抗病毒療法的基因型抗性，而當(dāng)?shù)梅值陀诨蛐团R界值時則表明該病毒具有對不同抗病毒療法的的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述兩種抗病毒療法影響相同的病毒蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述兩種抗病毒療法均為蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。而在另一實施方案中，兩種抗病毒療法中之一是洛匹那韋。而在另一實施方案中，與對一種蛋白酶抑制劑的抗性相關(guān)的突變還與對另一蛋白酶抑制劑的抗性相關(guān)。下述實施例8中提供了所述突變的實例。
6.實施例下述實施例用于舉例說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明主題的限制。
6.1 實施例1鑒定抗性相關(guān)突變的病例樣品分析本實施例說明了分析病例樣品從而鑒定與對蛋白酶抑制劑例如洛匹那韋的敏感性增加或降低相關(guān)的突變的方法。
為了測定HIV-1病毒株的蛋白酶序列和其對洛匹那韋治療的敏感性之間的關(guān)系，將2038名患者血漿樣品的測試數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因型和表型分析。采用PHENOSENSETM(Virologic，South San Francisco，CA)HIV分析法(Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44920-928；美國專利號5,837,464和6,242,187)實施表型分析。血漿樣品取自HIV-1感染患者。除去來自相同患者的重復(fù)樣品以便避免因突變的獨特組合引起的可能偏倚，從患者樣品獲得HIV-1對洛匹那韋的IC50值。將其與洛匹那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50進(jìn)行比較。將表型數(shù)據(jù)表示為洛匹那韋的50％抑制濃度(IC50)時的“倍數(shù)變化”(或log倍數(shù)變化)。通過用洛匹那韋抗來自患者血漿樣品的HIV-1的IC50除以洛匹那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50計算倍數(shù)IC50值。
為確定與對洛匹那韋的敏感性的降低相關(guān)的基因型改變，分析每一患者的樣品中HIV-1蛋白酶的完整氨基酸序列。將突變與NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照株的蛋白酶序列進(jìn)行比較。99個氨基酸位置中的88個含有至少一種突變(表2和3)。在測試數(shù)據(jù)的2038個樣品中，樣品的1％或更多(即，多于20個樣品)中存在61個位置的突變，在20個或低于20個樣品中(低于樣品的1％)在剩下的38個位置存在突變。這些數(shù)據(jù)列于表2和3中。表1提供了與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變的列表。在除去不含與蛋白酶抑制劑相關(guān)的任何原發(fā)突變并且對任何蛋白酶抑制劑的IC50倍數(shù)變化(“FC”)均不高于2(實施例5)的樣品后，從2038個樣品的完整測試數(shù)據(jù)集或1418個樣品的數(shù)據(jù)集(用*表示)中獲得表1中的數(shù)據(jù)。實施例5中描述了用于計算P值的方法。
6.2 實施例2洛匹那韋敏感性與HIV-1蛋白酶中突變數(shù)的相關(guān)性本實施例說明了將HIV-1的蛋白酶基因中等權(quán)的突變數(shù)量與其對洛匹那韋的敏感性相關(guān)聯(lián)的簡單算法是不準(zhǔn)確的。
分析2038名患者血漿樣品的數(shù)據(jù)集并鑒定與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變，如實施例1中所述。將對洛匹那韋的表型敏感性(洛匹那韋倍數(shù)變化)作為存在于患者的血漿樣品中的HIV-1的蛋白酶中的突變數(shù)量的函數(shù)進(jìn)行分析。通過用洛匹那韋抗來自患者血漿樣品的HIV-1的IC50除以洛匹那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50計算每一樣品的倍數(shù)變化。通過對存在于每一患者的樣品中的HIV-1的蛋白酶進(jìn)行測序獲得基因型數(shù)據(jù)并確定相對于NL4-3(GenBank登錄號AP324493)HIV序列的序列改變。SEQ.ID.No.1中給出NL4-3蛋白酶的氨基酸序列(

圖12A)而SEQ.ID.No.2給出NL4-3蛋白酶基因的核酸序列(圖12B)。
圖2顯示了對洛匹那韋的抗性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為抗性相關(guān)突變數(shù)量的函數(shù)。將含有氨基酸混合物的樣品作為突變體。用于該分析的突變是在Kempf研究(Kempf等，2001，J.Virol.757462-69)中所鑒定的突變。為了清楚地說明由Kempf提出的算法的缺陷，所述算法試圖基于在HIV蛋白酶中11個已鑒定的位置觀測到的突變數(shù)量來預(yù)測對洛匹那韋的表型敏感性，將該分析的圖表分成四個象限。Kempf研究假定，如果HIV在這11個位點含有5個或少于5個突變，則該HIV具有對洛匹那韋治療的敏感性，然而，如果這些突變的數(shù)量是6個或多于6個，則預(yù)測該病毒具有對洛匹那韋治療的抗性。左下象限對應(yīng)于其蛋白酶中含有5或少于5個突變且具有對洛匹那韋表型敏感性和基因型敏感性(PT-S，GT-S)的那些病毒。在該象限中發(fā)現(xiàn)2038個樣品中的1109個或54％。上右象限對應(yīng)于含有6個或多于6個突變且具有對洛匹那韋(Log洛匹那韋倍數(shù)變化≥1)的表型抗性和基因型抗性(PT-R，GT-R)的那些病毒，該象限包含樣品中的637個或31％。然而，其它兩個象限對應(yīng)于“例外情況”，所述例外情況是指病毒根據(jù)基因型(突變數(shù)量)被預(yù)測為具有敏感性，但卻表現(xiàn)為表型(基于Log洛匹那韋倍數(shù)變化)抗性(左上，PT-R，GT-S)的情況或病毒根據(jù)基因型被預(yù)測為具有抗性，但卻表現(xiàn)為表型(基于Log洛匹那韋倍數(shù)變化)敏感性(右下，PT-S，GT-R)的情況。
圖2顯示出在182個樣品(對應(yīng)于初始數(shù)據(jù)集的9％，其含有2～5個突變，與期望相反)存在于上，左(PT-R，GT-S)象限中且其IC50值比參照株(log倍數(shù)變化是1-2)的IC50高10～100倍。相反地，某些含有6、7或8個突變的病毒并未表現(xiàn)出任何高于WT病毒株的對洛匹那韋的抗性，因此存在于下，右(PT-S，GT-R)象限中(110個樣品(5％))。
因此從圖2中可以明顯的看出對洛匹那韋的敏感性和所述HIV-1蛋白酶中突變的數(shù)量之間的簡單相關(guān)是非常不精確的。
6.3 實施例3減少PT-S、GT-R不一致組的大小本實施例說明了圖2中所示的PT-S，GT-R數(shù)據(jù)可用存在含有至少一個洛匹那韋抗性相關(guān)位置上的氨基酸混合物的樣品來解釋。
采用實施例2的簡單算法得出上，左(“PT-R，GT-S”)象限中大約9％的結(jié)果和下，右(“PT-S，GT-R”)象限(圖2)中5％的結(jié)果。這些不一致的結(jié)果可能是由于(至少部分上)患者的樣品包含病毒株混合物，所述病毒株含有在一個或多個與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的位置上具有氨基酸殘基混合的蛋白酶。當(dāng)將這些樣品(即含有野生型和突變型二者混合物的那些樣品)從所述分析中排除時，PT-S，GT-R結(jié)果降至2％而PT-R，GT-S結(jié)果數(shù)量約保持與10％一致(圖3)。在該修改的分析中使用1402個樣品。
不受任何特定理論的束縛，其可用下述假說進(jìn)行解釋。所述研究將含有病毒株混合的樣品按突變體進(jìn)行處理。因此，這可以實現(xiàn)將包含10％突變體病毒(包含抗性相關(guān)突變)和90％未突變的或參照病毒的樣品按突變體進(jìn)行處理。因為突變體病毒的群體小，因此總體樣品可不表現(xiàn)出與假設(shè)含有100％突變的樣品預(yù)期一致的表型抗性。然而，為了基因型的目的，將所述樣品按含有突變進(jìn)行處理。因此所述樣品可導(dǎo)致觀察到低于含有100％突變體的樣品所預(yù)期的表型抗性。這導(dǎo)致數(shù)據(jù)落在下，右象限中，該象限中所述種群具有基因型抗性(GT-R)，而具有表型敏感性(PT-S)。
將在一個或多個與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的位置上含有氨基酸混合物的樣品除去明顯地降低了PT-S，GT-R結(jié)果，從而證實了這兩者之間的關(guān)聯(lián)。
6.4 實施例4PT-R，GT-S不一致組的分析本實施例說明了特定突變比其它對洛匹那韋抗性貢獻(xiàn)更大。
圖2中PT-R，GT-S象限中的樣品對應(yīng)于含有五個或少于五個與對洛匹那韋敏感性的降低相關(guān)的HIV蛋白酶中的突變的病毒。這些病毒是表型抗性的(具有高于10的倍數(shù)變化)但被預(yù)測為具有基因型敏感性(因為它們含有5個或小于5個突變)。不受任何特定理論的束縛，其可通過某些突變比其它突變更顯著地促成對洛匹那韋的抗性來進(jìn)行解釋。這些突變的某些甚至可看作與四個或五個其它洛匹那韋相關(guān)性突變對洛匹那韋的抗性的作用相同。當(dāng)這些，更顯著的突變連同1、2、3或4個其它與洛匹那韋相關(guān)的突變一起存在時，給予的總抗性可足夠大從而產(chǎn)生病毒表型抗性。
在50、54和82位上發(fā)現(xiàn)與PT-R，GT-S組顯著相關(guān)的突變。表1提供了與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的突變的列表。圖4，5和6說明了當(dāng)更顯著的突變(在50、54和82位的那些)存在時，洛匹那韋倍數(shù)變化高而所述樣品主要存在于圖的上半部，該半部與增高的表型抗性相關(guān)。圖2或3和圖4、5和6的比較也說明了PT-R，GT-S象限中的大多數(shù)樣品是包含更具顯著的突變的那些樣品。
因此，很明顯PT-R，GT-S組可與不呈比例地比其它突變更能促成對洛匹那韋抗性的突變的存在相關(guān)聯(lián)。
6.5 實施例5鑒定抗性相關(guān)突變的病例的替換性分析本實施例說明了(1)一種分析病例樣品以便鑒定與對蛋白酶抑制劑例如洛匹那韋敏感性增高或降低相關(guān)的突變的替換性方法；(2)將HIV的蛋白酶基因中的等權(quán)突變的數(shù)量與其對洛匹那韋敏感性相關(guān)聯(lián)的簡單算法是不精確的(3)PT-S，GT-R象限中所示數(shù)據(jù)可根據(jù)存在含有至少一個洛匹那韋抗性相關(guān)位置上的氨基酸混合物的樣品來解釋；和(4)特定突變比其它的更能促成洛匹那韋抗性。
為測定HIV-1病毒株的蛋白酶序列和其對洛匹那韋治療的敏感性間的相關(guān)性，將2038名患者血漿樣品的測試數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因型和表型分析。在2038個樣品的初始點，除去那些在表型和基因型上不具有任何蛋白酶抑制劑敏感性降低表現(xiàn)的樣品。該排除的表型標(biāo)準(zhǔn)是全部樣品的LPV FC＜2而基因型標(biāo)準(zhǔn)是不存在下列任何位置(原發(fā))的突變30、32、46、48、50、54、82(除了V82I)、84、88或90。這導(dǎo)致除去了620個樣品，留下1418個樣品的數(shù)據(jù)集，將其按實施例1中所述進(jìn)行分析。
與圖2相似，將對洛匹那韋的抗性(Log洛匹那韋倍數(shù)變化)作為所述抗性相關(guān)突變的數(shù)量的函數(shù)進(jìn)行作圖。圖7顯示了在該分析(1418個樣品)中所獲數(shù)據(jù)的圖。圖7，恰如圖2，也包含全部四個象限中的數(shù)據(jù)。在所分析的1418個樣品中，45％(637個樣品)為PT-R，GT-R，34％(489個樣品)為PT-S，GT-S，13％(182個樣品)為PT-R，GT-S和8％(110個樣品)為PT-S，GT-R。
當(dāng)(如實施例3中所述)將含有在一個或多個與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的位置上具有氨基酸殘基混合的蛋白酶的病毒株混合物的樣品從分析中排除時，PT-S，GT-R象限中的樣品數(shù)量降至4％(31個樣品)。該分析導(dǎo)致排除555個樣品，留下總共863個樣品(圖8)。
如實施例4中所述，在50、54和82位上發(fā)現(xiàn)與PT-R，GT-S組顯著相關(guān)的突變。圖9，10和11說明了當(dāng)更顯著的突變(在50、54和82位的那些)存在時，洛匹那韋倍數(shù)變化高而所述樣品主要存在于圖的上半部，該半部與增高的表型抗性相關(guān)。圖7或8和圖9、10和11的比較也說明了PT-R，GT-S象限中的大多數(shù)樣品是包含更顯著的突變的那些樣品。
用于確定相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)意義的P值按如下方法計算對每一突變，將低于或高于LPV10倍的數(shù)據(jù)集(這里，基因型敏感性樣品來自N＝863的數(shù)據(jù)集)中樣品的數(shù)量在含有或不含有所研究突變的樣品中進(jìn)行比較。構(gòu)建2×2表并采用Fisher′s精確概率檢驗計算P值。對于G48V的一個實例如下
6.6 實施例6首先改進(jìn)的算法和其改善的精度的說明本實施例說明了可通過區(qū)別地加權(quán)更顯著性促成洛匹那韋抗性的突變的作用而構(gòu)建降低PT-R，GT-S結(jié)果的發(fā)生率的算法。
如實施例5中所述，在2038個樣品測試數(shù)據(jù)集的初始點，除去不含有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變的那些樣品和對任何蛋白酶抑制劑的IC50倍數(shù)變化(“FC”)均不高于2的那些樣品，結(jié)果得到1418個樣品數(shù)據(jù)集。進(jìn)一步除去含有在一個或多個與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的位置上具有氨基酸殘基混合的蛋白酶的病毒株混合物的樣品，結(jié)果得到863個樣品的最終數(shù)據(jù)集，將其用于設(shè)計能通過降低PT-R，GT-S結(jié)果的發(fā)生率而精確預(yù)測HIV對洛匹那韋敏感性的算法。
根據(jù)僅在所述測試數(shù)據(jù)集(863個樣品)中觀測到的數(shù)據(jù)設(shè)定最終規(guī)則。然后將該從測試數(shù)據(jù)集設(shè)計的規(guī)則在測試數(shù)據(jù)集和樣品的第二組(“驗證數(shù)據(jù)集”)中測試。驗證數(shù)據(jù)集含有1022個樣品并排除了來自包含于測試數(shù)據(jù)集中的患者的任何樣品。對于測試數(shù)據(jù)集，除去不具有任何對蛋白酶抑制劑敏感性降低的表現(xiàn)的樣品，留下了523個樣品。該設(shè)計的規(guī)則或算法的精度決定于可單獨根據(jù)該算法確定患者的敏感性的精度。當(dāng)偏差出現(xiàn)時，修改算法以便使其與在測試組中觀測到的結(jié)果保持一致。
然后對驗證組再次測試修改的算法。第二版中所示的結(jié)果要好于最初版本的那些結(jié)果。多次重復(fù)該步驟而該結(jié)果的每個版本即使不好于也至少與其前面的版本相同。
表4，5和6總結(jié)了用于每次重復(fù)步驟或版本的規(guī)則和獲自測試數(shù)據(jù)集(表4)和兩個不同的驗證組(表5和6)的結(jié)果。第一欄提供了重復(fù)步驟或版本數(shù)。接下來的四欄提供了，按順序，根據(jù)所述算法，在PT-S，GT-R、PT-R，GT-R、PT-S，GT-S，PT-R，GT-S組中預(yù)期的數(shù)量。接下來的兩欄提供了PT-S，GT-R和PT-R，GT-S組的百分?jǐn)?shù)。接下來的一欄提供了總一致性(PT-R，GT-R和PT-S，GT-S組百分?jǐn)?shù)的和，或100-(PT-S、GT-R+PT-R、GT-S組的百分?jǐn)?shù))。
最后一欄含有用于測試重復(fù)步驟的規(guī)則。將每組規(guī)則加至其前面的規(guī)則上。某些突變的加權(quán)要高于其它突變(例如，V82和I54突變的大多數(shù))，某些一同從分析中除去(例如，I54L)而某些的加權(quán)系數(shù)在算法的進(jìn)展性版本中發(fā)生變化。在版本6中，將全部V82突變體的加權(quán)系數(shù)從1增至3。然而，對于版本7，V82T的加權(quán)系數(shù)回降至1，這是因為其對洛匹那韋抗性的貢獻(xiàn)不如其它V82突變體那樣顯著。圖13顯示了82位不同氨基酸(野生型和突變)的效應(yīng)。可以看出V82T對洛匹那韋倍數(shù)變化的作用與其它V82突變體不一樣大。I54突變體的預(yù)分析導(dǎo)致了從算法中除去I54L。然而，隨后的分析顯示出I54L顯著地促成洛匹那韋抗性(圖14)。因此，在表7中，給I54L設(shè)定加權(quán)系數(shù)1，雖然其未包含于表4所示的算法中。不受任何特定理論的束縛，從算法中除去I54L是因為其是相對罕見的突變因此其不在數(shù)據(jù)集中頻繁出現(xiàn)。因為其是罕見的，其可對大組樣品的分析產(chǎn)生小的作用或不產(chǎn)生作用，但是，當(dāng)其存在于特定病毒，或來自特定患者的病毒，其顯著地促成洛匹那韋抗性。
從開始至版本10，全部3個數(shù)據(jù)集的總一致性增加而PT-R，GT-S組中數(shù)據(jù)的百分比顯著降低；接近測試數(shù)據(jù)集中的7倍和驗證數(shù)據(jù)集中的約6倍。
表7提供了給每個突變設(shè)定的加權(quán)或加權(quán)系數(shù)的列表。
該表可用于預(yù)測特定HIV株是否可能對洛匹那韋的敏感性降低。根據(jù)表7，給對該病毒株中檢測到的在表7中所列的每個蛋白酶突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)。然后將加權(quán)系數(shù)相加從而得到HIV的總分。如果總分是6或大于6，則該HIV可能具有對洛匹那韋治療的抗性，而如果總分低于6，則該HIV可能具有對洛匹那韋治療的敏感性。
6.7 實施例7二次改進(jìn)的算法以及對其改良的精確度的說明本實施例說明了可通過調(diào)整被認(rèn)為具有對洛匹那韋治療的基因型抗性或敏感性的特定HIV株所需的順序總分從而構(gòu)建降低PT-R，GT-S和PT-S，GT-R結(jié)果的發(fā)生率的算法。
分析2195個樣品的聯(lián)合數(shù)據(jù)集，即含有“測試數(shù)據(jù)集”和”驗證數(shù)據(jù)集”的數(shù)據(jù)集。將不含有與對蛋白酶抑制劑的表型抗性相關(guān)的原發(fā)突變的，不與高于2的對任何蛋白酶抑制劑的IC50倍數(shù)變化(“FC”)相關(guān)的或含有在一個或多個與對洛匹那韋敏感性降低相關(guān)的位置上具有不同氨基酸殘基的蛋白酶的病毒株混合物(如果混合包含在NL4-3 HIV株中的位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸)的樣品除去。將1099個樣品的最終數(shù)據(jù)集用于改變實施例6中所述的算法以便改善其總一致性。
使用與表7所列相同的加權(quán)系數(shù)。在改變的算法中，臨界值變?yōu)?～8，即，如果特定HIV的總分為8或更高，則HIV具有對洛匹那韋治療的基因型抗性而如果總分小于8，則該HIV具有對洛匹那韋治療的基因型敏感性。使用臨界值8，總一致性，90.5％，高于臨界值6所發(fā)現(xiàn)的(表8)。圖15提供了使用臨界值8的散點圖。與圖2和7對比可以觀察到PT-R，GT-S和PT-S，GT-R結(jié)果的降低。
當(dāng)在算法中使用臨界值7時，可觀測到甚至更高的91.5％總一致性(表8)。這可見于圖16中。
6.8 實施例8與安潑那韋抗性相關(guān)的突變對洛匹那韋抗性的作用本實施例證明了與HIV的安潑那韋(“APV”)抗性的增加相關(guān)的特定突變也與洛匹那韋抗性的增加相關(guān)。
圖17顯示了HIV中與對安潑那韋(“APV”)抗性相關(guān)的蛋白酶突變對針對洛匹那韋抗性的作用。將具有對安潑那韋敏感性降低的HIV-1分離群在體外選擇并獲自用安潑那韋治療的患者。這些分離群的基因型分析顯示了對APV的抗性與HIV-1蛋白酶基因中的8個突變相關(guān)，所述突變5個原發(fā)的(V32I、I50V、I54L/M和I84V)和3個繼發(fā)的(M46I/L和I47V)。參見Maguire等，2002，Antimicrob AgentsChemother 46731-738。無一例外地，這些突變的每一個均與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)(表1)。V32I和I47V還已知可由LPV體外選擇。Carrillo等，1998，J.Virol.727532-41。表9中總結(jié)了這些突變和這些突變彼此的結(jié)合與I84V對LPV和APV敏感性的作用。每組中APV的FC中值是9.5倍或更高，如可預(yù)期的。但是LPV FC中值通常被平行化，且通常高于APV的值。這一發(fā)現(xiàn)可用于研究這兩個蛋白酶抑制劑間交叉抗性的程度。
在與基于單變量分析的APV FC≥2.5相關(guān)的26個突變的列表中，其中23個還與LPV FC≥2.5相關(guān)(表10)。采用回歸分析法，分析了兩個PIs的FC(log-轉(zhuǎn)換的)間的相關(guān)性。圖18顯示了洛匹那韋倍數(shù)變化(“Log LPV FC”)對安潑那韋倍數(shù)變化(“Log APV FC”)的二變量散點圖。深色點(圖例中的“APV GT-R”)表示具有對安潑那韋基因型抗性的那些樣品，而淺色點(圖例中的“APV GT-S”)表示具有對安潑那韋基因型敏感性的樣品。圖18顯示了對于具有對安潑那韋基因型抗性的樣品，安潑那韋和洛匹那韋間的相關(guān)性高于(相關(guān)系數(shù)，R2＝0.52)那些具有對安潑那韋基因型敏感性的(相關(guān)系數(shù)，R2＝0.39)(從該分析中除去對任一蛋白酶抑制劑的FC＜2.5的全部樣品)。具有對任一蛋白酶抑制劑PT-R的全部樣品的76％，和APVGT-R樣品的82％，對兩者均具有抗性。而被確定為對APV GT-R的樣品的95％也具有PT-R，80％也具有對LPV的PT-R(表11)。
盡管有該相關(guān)性，但APV突變單獨存在不足以LPV FC＞10，需要從表1中所列的那些與對LPV敏感性降低的相關(guān)突變中8個或多個突變的累積。
本說明書所引用的全部參考文件均為全文引入作為參考。
此處提供的實際的和預(yù)測的實施例僅用于具體描述本發(fā)明而不意欲以任何方式限制本發(fā)明。
表1洛匹那韋突變突變 FC＜10 FC≥10 ％R:％S P值L10F 16 25 9 ＜0.0001L10P 15 25 3 0.0001L10I*105 97 2 ＜0.0001G16E*823 6 ＜0.0001K20I 21 24 6 ＜0.0001K20I*14 24 3 0.0001K20M 610 9 ＜0.0001K20M*410 5 0.0045K20R 17 13 4 0.0002L24I 710 8 ＜0.0001V32I 918 11＜0.0001V32I*918 4 0.0004L33IFV**38 47 7 ＜0.0001L33F*14 42 6 ＜0.0001E34DKQ**418 25＜0.0001E34Q*212 120.0001K43T*422 11＜0.0001M46I 49 57 6 ＜0.0001M46L 16 19 7 ＜0.0001M46I*49 57 2 ＜0.0001M46L*16 19 2 0.009M46V*無效 無效無效 無效I47V*522 8 ＜0.0001I47A 無效 無效無效 無效I47V 522 25＜0.001
G48V 750 40 ＜0.0001G48V*750 14 ＜0.0001I50V 122 123 ＜0.0001I50V*125 48 ＜0.0001I54A 022 -N/A- ＜0.0001I54L 無效 無效 無效無效I54M 621 20 ＜0.0001I54S 014 -N/A- ＜0.0001I54T 05-N/A- ＜0.0001I54V 747 37 ＜0.0001I54A*022 -N/A- ＜0.0001I54M*621 7 ＜0.0001I54S*014 -N/A- ＜0.0001I54T*05-N/A- 0.0045I54V*747 13 ＜0.0001K55R 13 12 5 ＜0.0001Q58E 19 26 8 ＜0.0001Q58E*18 26 3 0.0003L63T*411 5 0.002I66FV**14 12 5 0.0001A71I 578 0.0007G73C 2617 0.0002G73T 10 13 7 ＜0.0001T74ASP**27 37 8 ＜0.0001T74S*14 25 3 0.0001L76V 1634 ＜0.0001L76V*1612 0.0076P79ADE**3611 0.0006V82A 14 73 29 ＜0.0001
V82F 2 6 17 0.0002V82A*1473 10 ＜0.0001V82S 0 7 -N/A-＜0.0001V82S*0 7 -N/A-0.0005I84A*無效 無效無效 無效I84L*無效 無效無效 無效I84V 4133 4＜0.0001L89I*0 5 -N/A-0.0045L89M*7 13 40.0004起始樣品的數(shù)量＝2038。
*起始樣品的數(shù)量＝1418(除去不具有任何與蛋白酶抑制劑相關(guān)的原發(fā)突變且不具有對于任何蛋白酶抑制劑的高于2的IC50倍數(shù)變化(“FC”)的樣品后)。
**對所有變體同樣處理。
-N/A-不適用(結(jié)果被0除)。
FCIC50的倍數(shù)變化。
％R含有突變的樣品占全部PT-R，GT-S樣品的百分?jǐn)?shù)。
％S含有突變的樣品占全部PT-S，GT-S樣品的百分?jǐn)?shù)。
表2將位置數(shù)量與含有突變的樣品數(shù)相關(guān)聯(lián)位置數(shù)含有突變的樣品數(shù)1109 13 22 32 43 51 63 70 80 934＜1065＞1061＞2046＞1004 10～201520～100
表3HIV蛋白酶每個位置發(fā)現(xiàn)突變的樣品數(shù)位置 樣品數(shù)P1 0P9 0D25 0G27 0D29 0T31 0P44 0G78 0G86 0L97 0N98 0Q2 1T26 1A28 1G49 1G52 1V56 1P81 1G94 1F99 1I3 2L5 2G40 2
位置樣品數(shù)W6 3W42 3R87 4T96 4R8 5G51 5Y59 5T80 6Q7 7E21 7G68 7V75 12G17 13L38 17L23 20T4 24A22 24N83 25E65 33P79 39T91 39K45 45L76 57C95 59P39 61Q18 63D30 74I50 80
位置樣品數(shù)N88 89K70 96E34 101I66 103C67 110I47 112V32 116V11 117Q92 121I85 131L24 134G16 136Q61 144K55 153G48 156F53 159Q58 159L89 186T74 202K43 208K14 210H69 213R57 237T12 244D60 247L19 297L33 411G73 416
位置 樣品數(shù)I64 458I84 482I15 489I72 518R41 534I13 556K20 631V77 708E35 735V82 741M46 780I93 823N37 826I54 834M36 841I62 897L90 946A71 1047L10 1242L63 1858
表4算法構(gòu)建和在測試數(shù)據(jù)的應(yīng)用
表5算法應(yīng)用于驗證數(shù)據(jù)集1PT-S，PT-R，PT-S，PT-R，％PT-R，％PT-S，總一致性No.
GT-R GT-R GT-S GT-S GT-SGT-R起始 37130 302 54103％ 7.1％82.6％138140 301 448.4％ 7.3％84.3％10 66175 273 9 1.7％ 12.6％ 85.7％數(shù)據(jù)集中樣品的數(shù)量＝523.
表6算法應(yīng)用于驗證數(shù)據(jù)集2PT-S，PT-R，PT-S，PT-R，％PT-R，％PT-S，總一致性No. GT-R GT-R GT-S GT-S GT-SGT-R起始 8 86172 4113.4％ 2.6％ 84.0％1 8 94172 3310.7％ 2.6％ 86.6％1025120 155 7 2.3％ 8.1％ 89.6％數(shù)據(jù)集中樣品的數(shù)量＝307(從表7的523個樣品的起始數(shù)據(jù)集中除去含有位于與對洛匹那韋的敏感性降低相關(guān)的任何位置的氨基酸的混合物的樣品后)。
表7加權(quán)系數(shù)
表8組合數(shù)據(jù)集的分析臨界值 PT-S，PT-S，PT-R，PT-R，總一致性GT-R GT-S GT-R GT-S6 93404 589 1390.4％7 63434 572 3091.5％8 50447 548 5490.5％
表9APV突變對LPV和APV敏感性的影響基因型組n中位數(shù)LPV FC中位數(shù)APV FC野生型(所有原發(fā)位置)623 0.6 0.6不包含任何測試的突變1096 2.1 1.632 26 12 9.547 8191 2650 42 54 2054a9160 2284 247 7.1 1132，47 23 7.5 1232，84 3124 5146b，5416 138 8447，54 388 4247，84 428 1254，84 22 93 6732，47，54 17 146 4046，54，84 29 30 4747，54，84 320 2432，46，47，54 4208 13032，47，54，84 5227 13032，46，47，54，84 6200 130a僅I54L或MbM46I或L
表10APV和LPV FC＞2.5相關(guān)的突變APV APV/LPV10 10F11 112332I 32I33F 33F34Q 34Q43T 43T47V 47V48M 48M50V 50V53L 53L54A 54A54L 54L54M 54M54S 54S54T 54T55 5558E 58E6671L 71L76V 76V79 7982F 82F84V 84V9295 95％R:％S＞5的突變和P＜0.01，對于FC＞2.5
表11LPV-APV交叉抗性的統(tǒng)計總結(jié)樣品百分比類別 AllaAPV GT-RAPV FC＞2.5并且LPV FC＞10 82 83LPV FC＞10并且APV FC＞2.5 91 99每個PT-R，兩個均PI PT-R76 82APV FC＞2.561 95LPV FC＞10 55 80a不具有蛋白酶抑制劑FC＞2的樣品且未排除蛋白酶抑制劑原發(fā)突變；n＝1099。
序列表<110>Petropoulos，ChristosParkin，NeilChappey，Clolombe<120>確定致病病毒對蛋白酶抑制劑的敏感性的組合物和方法<130>11068-026-228<140>PCT/US 03/04362<141>2003-02-14<150>US 60/357,171<151>2002-02-15<150>US 60/359,342<151>2002-02-22<150>US 60/392,377<151>2002-06-26<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>99<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>1Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly1 5 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 25 30
Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly35 40 45Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile50 55 60Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr65 70 75 80Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr85 90 95Leu Ash Phe<210>2<211>297<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<400>2cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 60gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgaa tttgccagga120agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat180cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca240cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gctgcacttt aaatttt 29權(quán)利要求
1.一種確定HIV對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明HIV對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。
2.一種確定HIV感染的個體對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該個體對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中檢測突變。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測突變。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變選自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。
6.一種分離的寡核苷酸，其長度為約10～約100核苷酸，該寡核苷酸編碼HIV中的蛋白酶，該酶包括所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的突變，其中突變與對蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)，但其前提條件是所述突變不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。
7.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約90個核苷酸。
8.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約80個核苷酸。
9.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約70個核苷酸。
10.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約60個核苷酸。
11.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約50個核苷酸。
12.權(quán)利要求6的分離的寡核苷酸，其中寡核苷酸的長度為約10～約40個核苷酸。
13.一種確定人免疫缺陷病毒(HIV)對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括(a)在所述HIV中，檢測是否存在表7中所列的一個或多個HIV蛋白酶突變；(b)對表7中提供的每一突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)；和(c)加上所述加權(quán)系數(shù)而獲得所述HIV的總分，其中如果所述總分等于或高于6，則所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
14.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述總分等于或高于7，則所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
15.權(quán)利要求13的方法，其中如果所述總分等于或高于8，則所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
16.權(quán)利要求13的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中檢測所述突變。
17.權(quán)利要求13的方法，其中在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測所述突變。
18.一種確定感染人免疫缺陷病毒(HIV)的個體對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括(a)在來自所述個體的樣品中，檢測是否存在表7中所列的一個或多個HIV蛋白酶突變；(b)對表7中提供的每一突變設(shè)定加權(quán)系數(shù)；和(c)加上所述加權(quán)系數(shù)而獲得所述個體的總分，其中如果所述總分等于或高于6，則所述個體耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
19.權(quán)利要求18的方法，其中如果所述總分等于或高于7，則所述個體耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
20.權(quán)利要求18的方法，其中如果所述總分等于或高于8，則所述個體耐受用所述蛋白酶抑制劑治療的可能性增加。
21.權(quán)利要求18的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中檢測所述突變。
22.權(quán)利要求18的方法，其中在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測所述突變。
23.權(quán)利要求1、2、13或18的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。
24.權(quán)利要求1、2、13或18的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是洛匹那韋。
25.權(quán)利要求4、17或22的方法，其中所述蛋白酶中所述突變的所述是否存在通過將序列特異性寡核苷酸探針與所述人免疫缺陷病毒的編碼所述突變的核酸序列雜交進(jìn)行檢測，其中雜交的出現(xiàn)指示所述突變的所述存在與否。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述序列特異性寡核苷酸探針與編碼所述突變的核酸雜交且雜交的存在指示所述突變的存在。
27.權(quán)利要求4、17或22的方法，其中通過核酸測序檢測所述蛋白酶中所述突變的所述存在與否。
28.權(quán)利要求2或18的方法，其中個體正在接受或已經(jīng)接受用所述或不同蛋白酶抑制劑的先前治療。
29.權(quán)利要求1、2、13或18的方法，其中蛋白酶含有與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的序列。
30.權(quán)利要求1、2、13或18的方法，其中蛋白酶含有與SEQ ID NO1具有至少80％同一性的序列。
31.權(quán)利要求1、2、13或18的方法，其中所述方法包括在2或多個氨基酸位點檢測是否存在與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變。
32.一種確定HIV對用第一個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在與用第二個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該HIV對用所述第一個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。
33.一種確定HIV感染的個體對用第一個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測在HIV蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在與用第二個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該個體對用所述第一個蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中第一個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。
35.權(quán)利要求32或33的方法，其中第二個蛋白酶抑制劑是洛匹那韋或安潑那韋。
36.一種確定HIV對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的編碼蛋白酶的核酸中檢測在所述蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸是否存在與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該HIV對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是V32I或I47V。
37.一種確定HIV感染的個體對用蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測在HIV蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸是否存在與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在指示該個體對用該蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低的可能性增加，但其前提條件是所述突變不是V32I或I47V。
38.權(quán)利要求37或38的方法，其中與用所述蛋白酶抑制劑治療的敏感性降低相關(guān)的突變選自L10F、F53L和A71L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種確定抗病毒藥有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型臨床臨界值指導(dǎo)的配對表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的綜合分析。一方面，該算法允許使用者為患者提供有效治療。該算法有助于預(yù)測受感染的個體是否對抗病毒化合物治療發(fā)生應(yīng)答，從而允許設(shè)計有效治療方案而不會給患者帶來不需要的副作用。而且由于避免了施用無效藥物，故可以節(jié)省大量的時間和費用。
文檔編號C12Q1/68GK1646704SQ03808382
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月15日
發(fā)明者N·T·帕金, C·查皮, C·J·佩特羅普洛斯 申請人:瓦羅洛吉克公司