專利名稱：精確育種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/357,661和60/377,602的優(yōu)先權(quán)，其在這里引作參考。本發(fā)明涉及通過(guò)修飾植物基因組中特異的、熟知的DNA而提高植物的營(yíng)養(yǎng)、健康和農(nóng)藝特性的方法。與傳統(tǒng)的植物育種相反，本發(fā)明的方法不會(huì)將未知的或有潛在毒性的基因引入到植物遺傳組成中。此外，本發(fā)明的方法與常規(guī)的遺傳工程策略不同，不將異源物種，即不能與將要通過(guò)遺傳工程修飾的植物交互可孕的植物的核酸摻入到植物的基因組中。通過(guò)本發(fā)明的植物育種方法開發(fā)的植株顯示改善的農(nóng)藝特性。本發(fā)明特別優(yōu)選的植株包括顯示改善了健康和塊莖貯藏特性的馬鈴薯，以及顯示提高了疾病和干旱耐受性的草坪草。
背景典型地一直是通過(guò)傳統(tǒng)的植物育種或者遺傳工程來(lái)改善植物的農(nóng)藝特性。傳統(tǒng)的育種一般導(dǎo)致將未知的核酸從一種植物轉(zhuǎn)移到另一種植物。遺傳工程技術(shù)將異源核酸引入到植物基因組中，即DNA不是來(lái)源于植物或者不是來(lái)源于與將要通過(guò)遺傳工程修飾的植物天然交互可孕的植物。例如，遺傳工程將非植物核酸引入到植物基因組中。傳統(tǒng)的育種和遺傳工程策略兩者都產(chǎn)生含有不期望和不需要的遺傳物質(zhì)的植物基因組，得到的雜交的或轉(zhuǎn)基因的植物顯示不利的特性?？梢宰C明這兩種策略的缺陷對(duì)轉(zhuǎn)基因植物是有害的，對(duì)食用這些產(chǎn)品的動(dòng)物和人也是有害的。
傳統(tǒng)育種依賴于未知DNA的轉(zhuǎn)移植物育種一般依靠植物染色體的隨機(jī)重組以產(chǎn)生具有新的和改善特性的變種。因此，通過(guò)篩選從植物雜交獲得的眾多子代，育種者能夠鑒定出那些顯示期望特性，例如產(chǎn)量增加、活力增強(qiáng)、疾病和昆蟲抗性提高、或者在干旱條件下生存能力增強(qiáng)的植株。然而，傳統(tǒng)的育種方法是費(fèi)力和耗時(shí)的，而且新的變種一般僅僅顯示相對(duì)適度的改善。
此外，傳統(tǒng)的植物育種一般導(dǎo)致將許許多多的未知基因轉(zhuǎn)移到植物基因組中。很可能那些轉(zhuǎn)移的基因中的一些編碼潛在的有害的變應(yīng)原，例如馬鈴薯塊莖蛋白、凝集素、殼多糖酶、蛋白酶、奇異果甜蛋白(thaumatin)樣蛋白、脂轉(zhuǎn)移蛋白、淀粉酶、胰蛋白酶抑制劑，以及種子貯藏蛋白(Breiteneder等，J Allergy Clin Immunol 10627-36)。
類似地，可能在毒素的生物合成中涉及漸滲基因，其中毒素包括山黛豆素(lathyrogens)、肼、芥子油苷和致甲狀腺腫物、香豆素、皂苷、生物堿、糖苷生物堿、生物胺、酶抑制劑，如凝集素(血細(xì)胞凝集素)、胰蛋白酶抑制劑、鰲合底物如肌醇六磷酸和草酸、核糖毒素(ribotoxins)、抗微生物肽、氨基酸如β-N-草酰氨基-L-丙氨酸、蒼術(shù)苷、夾竹桃苷、紫杉醇，和異喹啉(Pokorny，Cas Lek Cesk136267-70，1997)。通過(guò)努力“開發(fā)”以前沒有用作食物消費(fèi)的野生作物親屬的的遺傳多樣性，進(jìn)一步提高了意外地將這些毒物引入到人和動(dòng)物食物供應(yīng)品中的風(fēng)險(xiǎn)(Hoisington等，Proc Natl Acad SciUSA 965937-43，1999)。
盡管傳統(tǒng)的植物育種能夠容易地將在不期望的抗?fàn)I養(yǎng)化合物中涉及的基因引入到糧食作物和植物中，但是其不能容易地將它們除去。例如，花了約15年時(shí)間通過(guò)滅活Lpa基因減少谷物和水稻中有害的肌醇六磷酸水平(Raboy，J Nutr 132503S-505S，2002)。用長(zhǎng)的時(shí)間框架來(lái)實(shí)現(xiàn)積極的結(jié)果是不實(shí)際的，特別是由于現(xiàn)在急切地需要更有效地和高效地提高糧食作物質(zhì)量的方法。最近才發(fā)現(xiàn)與抗?fàn)I養(yǎng)化合物的合成有關(guān)的基因的一個(gè)實(shí)例是多酚氧化酶(PPO)基因，其氧化某些酚類化合物產(chǎn)生象苯氧基自由基和醌衍生物那樣的致突變的、致癌的和細(xì)胞毒性試劑(Kagan等，Biochemistry 339651-60，1994)。在植物如馬鈴薯的基因組中存在這個(gè)基因的多重拷貝，使得特別難于通過(guò)育種來(lái)減少PPO的活性。
如果對(duì)它們的遺傳基礎(chǔ)知道得很少或者一無(wú)所知，那么甚至需要更多的時(shí)間來(lái)除去抗?fàn)I養(yǎng)化合物。例如，一直沒有將基因與在一些被加熱到160℃或者更高時(shí)的馬鈴薯中高濃度丙烯酰胺的累積相聯(lián)系，丙烯酰胺是一種烈性神經(jīng)毒素和誘變劑(Tareke等，J Agric Food Chem.504998-5006，2002)。因此在使用傳統(tǒng)育種的加工期間很難高效地開發(fā)新的能產(chǎn)生較少丙烯酰胺的馬鈴薯變種。因此，需要種植具有較低水平的這類危險(xiǎn)化合物，但是沒有使用未知或異源核酸的馬鈴薯和其它富含碳水化合物的食物，例如小麥。
可在加工期間累積并且很難通過(guò)育種減少到最少或消除的其它抗?fàn)I養(yǎng)化合物包括美拉德反應(yīng)(Maillard-reaction)產(chǎn)物N-亞硝基-N-(3-酮-1，2-丁二醇)-3’-硝基酪胺(Wang等，Arch Toxixol7010-5，1995)，以及5-羥甲基-2-糠醛(Janzowski等，F(xiàn)ood ChemToxicol 38801-9，2000)。一直沒有被很好地表征的另外的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也已知顯示謗變特性(Shibamoto，Prog Clin Biol Res304359-76，1989)。
由于傳統(tǒng)的植物育種固有的不精確，要迅速地提高糧食作物中有益的營(yíng)養(yǎng)化合物的水平同樣可能是困難的。例如，期望提高各種作物中“抗性淀粉”的水平(Topping等，Physiol Rev 811031-64，2001)。這種淀粉最終負(fù)責(zé)促進(jìn)免疫應(yīng)答，抑制潛在的病原體，以及降低包括結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的疾病的發(fā)病率(Brid等，Curr Issues IntestMicrobiol 125-37，2000)。然而，僅可得到的抗性淀粉水平增加的植株是象玉米突變株“amylose extender”，“dull”，和“sugary-2”那樣低產(chǎn)量的變種。新的高抗性淀粉來(lái)源如馬鈴薯的產(chǎn)生將能夠?qū)⑦@種促進(jìn)健康的成分較廣泛地結(jié)合到飲食中。
不能安全地操縱植物的基因型經(jīng)常導(dǎo)致使用外部的化學(xué)藥品以誘導(dǎo)期望的基因型。盡管眾多的育種程序延遲塊莖發(fā)芽，然而例如，買不到不用發(fā)芽抑制劑處理就可以貯藏?cái)?shù)月的馬鈴薯變種。后者，如異丙基-N-氯苯基-氨基甲酸酯(CIPC)，與急性毒性和腫瘤發(fā)展有關(guān)聯(lián)，并可能以1mg/kg和5mg/kg之間的濃度存在于加工的馬鈴薯食品中。
遺傳工程依賴于外源DNA的轉(zhuǎn)移遺傳工程可以用于修飾、產(chǎn)生或除去植物的某些特性。盡管在提高植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康特征方面一直存在有限的進(jìn)步，但是絕大多數(shù)靶植物特性的改善促進(jìn)了容易栽培作物。因此，某些植物抵抗草苷膦除草劑，因?yàn)樗鼈兒屑?xì)菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Padgette等，Arch Biochem Biophys.258564-73，1987)。類似地，遺傳工程已經(jīng)生產(chǎn)了抗昆蟲、抗病毒和抗真菌的植物變種(Shah等，Trends in Biotechnology 13362-368，1995；Gao等，Nat Biotechnol.181307-10，2000；Osusky等，Nat Biotechnol.181162-6，2000)，但是幾乎沒有一種具有增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)或健康的益處。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的公知技術(shù)，將包括基因和調(diào)節(jié)元件的基因“表達(dá)盒”插入到從土壤桿菌分離的轉(zhuǎn)移DNAs(“T-DNAs”)的邊緣序列內(nèi)并整合到植物基因組中。因此，土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA材料的轉(zhuǎn)移經(jīng)典地包括下列標(biāo)準(zhǔn)步驟(1)遺傳元件的體外重組，其中至少一個(gè)元件是異源的，以生產(chǎn)用于轉(zhuǎn)化篩選的表達(dá)盒，(2)常常將這種表達(dá)盒與至少一種含有外源DNA的其它表達(dá)盒一起插入到雙載體的T-DNA區(qū)，其通常由兩側(cè)是T-DNA邊緣序列的土壤桿菌DNA的幾百個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，(3)將位于T-DNA邊緣之間的序列，常常伴隨另外雙載體序列的一些或全部一起，從土壤桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，以及(4)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。參見，例如美國(guó)專利號(hào)4,658,082、6,051,757、6,258,999、5,453,367、5,767,368、6,403,865、5,629,183、5,464,763、6,201,169、5,990,387、4,693,976、5,886,244、5,221,623、5,736,369、4,940,838、6,153,812、6,100,447、6,140,553、6,051,757、5,731,179、5,149,645、和EP 0120,516、EP 0257,472、EP 0 561,082、1,009,842A1、0853,675A1、0486,233B1、0554,273A1、0270,822A1、0174,166A1和WO 01/25459。
因此，遺傳工程方法取決于將外源核酸引入到食物供應(yīng)中。那些技術(shù)將由幾個(gè)到多于20個(gè)的從病毒、細(xì)菌和植物中分離的非固有的遺傳元件組成的復(fù)雜的融合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的植物種中。這樣的外源元件包括調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子和終止子，以及在新特性的表達(dá)中涉及的或者作為轉(zhuǎn)化事件鑒定或篩選標(biāo)記的基因。盡管在規(guī)章批準(zhǔn)前要檢驗(yàn)含有外源DNA的食物的安全，但是許多消費(fèi)者仍然關(guān)心表達(dá)外源蛋白的食用食品的遠(yuǎn)期效應(yīng)，該外源蛋白是通過(guò)從其它非植物種中獲得的基因產(chǎn)生的。
一個(gè)普遍使用的調(diào)節(jié)元件是花椰菜花葉病毒(CaMY)的35S“超級(jí)”啟動(dòng)子，其在植物工程中一般用于誘導(dǎo)與其直接連接的轉(zhuǎn)基因的高水平表達(dá)。然而，該35S啟動(dòng)子也能提高其附近的天然基因的表達(dá)(Weigel等，Plant Physiol.，1221003-13，2000)。這類啟動(dòng)子可能因此在內(nèi)源基因的表達(dá)中謗導(dǎo)不可預(yù)知的改變，可能導(dǎo)致不良效果，如增加生物堿產(chǎn)量。優(yōu)選的“強(qiáng)”啟動(dòng)子通常是那些從病毒中分離的啟動(dòng)子，這些病毒如水稻tungro桿狀病毒、玉米條斑病毒、木薯葉脈病毒、紫茉莉病毒、花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒、玄參花葉病毒和小球藻病毒。其它經(jīng)常使用的啟動(dòng)子克隆自細(xì)菌種，以及包括胭脂氨酸合酶和章魚氨酸合酶基因的啟動(dòng)子。
為了達(dá)到基因轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)終止，將終止子序列融合到轉(zhuǎn)基因的3’-末端并且終止子序列包括土壤桿菌的胭脂氨酸合成酶和章魚氨酸合成酶基因的遺傳元件?？梢允褂闷渌倪z傳元件來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)基因表達(dá)或?qū)⒈磉_(dá)的蛋白靶向某些細(xì)胞小室。這些元件包括促進(jìn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的內(nèi)含子和將外源基因靶向某些細(xì)胞小室的信號(hào)肽序列，常常來(lái)自外源植物種。
在新特性的表達(dá)中所涉及的某些基因最經(jīng)常源于異源來(lái)源。如果使用天然基因，那么經(jīng)常將它們反向以在轉(zhuǎn)基因植物中使該基因的表達(dá)沉默，并與外源DNA如選擇性標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)化。這種“反義”技術(shù)的主要缺點(diǎn)是反向的DNA通常含有在啟動(dòng)子和終止子之間插入的新的和未表征過(guò)的可讀框。因此，所有用來(lái)源于淀粉相關(guān)基因RI(Kossmann等，美國(guó)專利6,207,880)、L-和H-型葡聚糖磷酸化酶基因(Kawchuk等，美國(guó)專利5,998,701，1999)、多酚氧化酶基因(Steffens，美國(guó)專利6,160,204,2000)、以及淀粉分支酶I和II基因(Schwall等，NatureBiotechnology 18551-554，2000)的反義構(gòu)建物遺傳修飾的馬鈴薯植株都潛在地表達(dá)由至少50個(gè)氨基酸(表1)構(gòu)成的新肽。這些新肽可能妨礙植物發(fā)育和/或減少馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因而是不受歡迎的。
將常規(guī)的標(biāo)記物基因摻入到遺傳構(gòu)建物中并用于選擇轉(zhuǎn)化事件。它們賦予轉(zhuǎn)化植物抗生素抗性或除草劑抗性(美國(guó)專利No.6,174,724)、代謝優(yōu)點(diǎn)(美國(guó)專利No.5,767,378)或者形態(tài)異常表型(美國(guó)專利No.5,965,791)。這類標(biāo)記物一般來(lái)自細(xì)菌來(lái)源。
此外，由于T-DNA轉(zhuǎn)移的不忠誠(chéng)，在植物如番茄、煙草和馬鈴薯中約75％的轉(zhuǎn)化事件除了含有T-DNA外還含有質(zhì)粒“主鏈”序列(Kononov等，Plant J.11945-57，1997)。這種主鏈序列的存在是不受歡迎的，因?yàn)樗鼈兪峭庠吹牟⑶乙话愫袕?fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因標(biāo)記。
的確存在除去象異源標(biāo)記基因那樣元件的各種方法，但是很少有一種可很容易地適用于植物遺傳工程。根據(jù)一種這樣的方法，將標(biāo)記基因和期望的基因或核苷酸序列置于不同的載體上。用含有兩個(gè)載體的單個(gè)土壤桿菌菌株(美國(guó)專利No.6,265,638)或者用兩個(gè)土壤桿菌菌株，其中每個(gè)菌株攜帶兩個(gè)載體中的一個(gè)，用以感染植株可能會(huì)偶然導(dǎo)致無(wú)關(guān)聯(lián)的整合事件，其可以通過(guò)異雜交繁殖進(jìn)行遺傳分離。這種方法的主要缺點(diǎn)是基因座的遺傳分離可能是非常費(fèi)力和耗時(shí)的，特別是如果與T-DNA整合事件聯(lián)系在一起的話。此外，這種方法不能廣泛地在無(wú)性生殖的植物中應(yīng)用，該植物無(wú)性繁殖，如肯塔基藍(lán)草，或者營(yíng)養(yǎng)體繁殖的作物如馬鈴薯，由于近交衰退、高水平的雜合性以及低繁殖力水平，其不能很容易地被培育。
另一個(gè)除去異源遺傳元件的方法依靠將外源基因如選擇性標(biāo)記基因，插入到轉(zhuǎn)座元件中。該修飾的轉(zhuǎn)座元件可能接著以低頻率從基因組中被剪接出去。接著必需與未轉(zhuǎn)化的植株進(jìn)行傳統(tǒng)的雜交以便將轉(zhuǎn)座的元件與宿主分離(美國(guó)專利No.5,482,852)。正如對(duì)于以前的方法已經(jīng)描述的那樣，這種可選擇的方法不能用于營(yíng)養(yǎng)體繁殖或者無(wú)性生殖的植物系統(tǒng)。
除去標(biāo)記基因的第三種方法使用P1噬菌體的Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(Dale & Ow，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，8810558-62，1991)。在兩個(gè)lox位點(diǎn)之間將標(biāo)記基因與Cre重組酶基因和在Cre的誘導(dǎo)中涉及的嵌合基因(兩個(gè)基因都具有它們自己的啟動(dòng)子和終止子)一起插入，導(dǎo)致在再生過(guò)程期間切除由lox位點(diǎn)描繪的區(qū)域(Zuo等，Nat.Biotechnol.，19157-61，2001)。這種復(fù)雜的過(guò)程是效率低和不可靠的，并且可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。
最近的研究報(bào)道了一些植物基因本身可以被用作轉(zhuǎn)化標(biāo)記。這類植物標(biāo)記的實(shí)例包括Pga22(Zuo等，Curr Opin Biotechnol.13173-80，2002)、Ckil(Kakimoto，Science 274982-985，1996)和Esrl(Banno等，Plant Cell 132609-18，2001)。然而，所有這些基因都引起細(xì)胞分裂素反應(yīng)，這賦予了轉(zhuǎn)基因植物不良的表型。此外，一旦通過(guò)上述方法中的任何一種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，就將仍然需要除去這類植物標(biāo)記。
轉(zhuǎn)化植物的可選擇的方法也是基于外源遺傳元件的體外重組，并依賴于在大腸桿菌(E.coli)中用于保養(yǎng)的細(xì)菌質(zhì)粒序列，其中的部分序列是在轉(zhuǎn)化過(guò)程中共整合的。用外源DNA轉(zhuǎn)化植物的這類方法的實(shí)例描繪在美國(guó)專利Nos.5,591,616、6,051,757、4,945,050、6,143,949、4,743,548、5,302,523、和5,284,253。
通過(guò)省略再生前的任何篩選步驟也可能獲得無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物。這種方法的缺點(diǎn)是通過(guò)這種方法產(chǎn)生的絕大多數(shù)事件將代表未轉(zhuǎn)化植物或嵌合植物，因?yàn)樗鼈兺ǔ２皇莵?lái)源于單個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。使用無(wú)標(biāo)記物的步驟來(lái)鑒定在所有細(xì)胞中都含有相同的DNA插入片段的轉(zhuǎn)基因植物是極其困難和費(fèi)力的。
因此，需要改善植物使其超過(guò)可通過(guò)傳統(tǒng)的育種雜交和常規(guī)的遺傳基因工程技術(shù)得到的植株是非常重要的，其不依賴于將未知的或外源核酸插入到植物基因組中。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于精確修飾植物自身的遺傳材料的方法和組合物。因此，發(fā)明的“精確育種”策略不誘導(dǎo)不受歡迎的表型并且不將未知的或外源的核酸引入植物基因組中。
概述本發(fā)明提供遺傳性地提高植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和農(nóng)藝特性而不將未知的或外源DNA永久地或穩(wěn)定地?fù)饺氲皆撝参锘蚪M中的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，從期望的植物種或者從與期望的植物性親和的植物種中分離特異性的、熟知的核酸、基因元件以及基因，經(jīng)過(guò)修飾，接著重新插回到所期望的植物種的基因組中。該修飾可能需要突變分離的核酸序列，刪除分離核酸的部分序列，或者簡(jiǎn)單地將分離的核酸連接到另一個(gè)多核苷酸上，例如將分離的核酸亞克隆到質(zhì)粒載體中。
相應(yīng)地，通過(guò)本發(fā)明的方法學(xué)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物不具有包含任何外源物種核酸的基因組。因此，本發(fā)明的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物其基因組不包含非植物種的啟動(dòng)子，不包含非植物種的終止子，不包含非植物種的5’-非翻譯區(qū)，不包含非植物種的3’-非翻譯區(qū)，不包含非植物種的標(biāo)記基因，不包含非植物種的調(diào)節(jié)元件，不包含非植物種的基因，以及不包含從非植物種的基因組中獲得的任何其它多核苷酸。
因此，本發(fā)明提供-種生產(chǎn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物顯示不被非轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)的修飾表型，包括(a)用期望的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中生長(zhǎng)植物；和(c)篩選用所述期望的多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的顯示新表型的植物，其中從相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中長(zhǎng)出的植物不顯示該新表型。優(yōu)選地，期望的多核苷酸基本上由下列序列構(gòu)成(i)核酸序列，其分離自和/或天然屬于植物細(xì)胞基因組，或?qū)儆谙嗤N的其它植物，或者是分離自和/或天然屬于與分離的植物細(xì)胞所來(lái)源的植物性親和的植物種的基因組；和(ii)至少一種DNA序列，其是邊緣樣序列，其具有一序列，該序列天然屬于所述植物細(xì)胞的基因組或天然屬于相同種植物細(xì)胞的基因組，或者天然屬于與分離的植物細(xì)胞所來(lái)源的植物性親和植物的序列，其中邊緣樣序列能夠?qū)⑵谕亩嗪塑账岱€(wěn)定地整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。
本發(fā)明的優(yōu)選的方法需要產(chǎn)生顯示不被非轉(zhuǎn)化植物所表現(xiàn)的修飾表型的轉(zhuǎn)基因植物，包括(a)用土壤桿菌感染外植體，該土壤桿菌(Agrobacterium)帶有(i)一種“P-DNA”’載體，其含有期望的轉(zhuǎn)基因植物天然具有的多核苷酸，和(ii)一種含有包含選擇性標(biāo)記基因表達(dá)盒的“LifeSupport”載體；(b)選擇選擇性標(biāo)記基因短暫表達(dá)的時(shí)間，優(yōu)選1-10天，3-7天，或者4-5天；(c)將外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中以允許形成嫩枝；(d)篩選眾多嫩枝以確定哪些嫩枝在其基因組中包含期望的多核苷酸的至少一個(gè)拷貝，以及在那些嫩枝中哪些枝條在其基因組中不含有任何外源核酸，如選擇性標(biāo)記基因；和(e)允許在其基因組中含有期望的多核苷酸而不含有任何標(biāo)記基因DNA的嫩枝長(zhǎng)成整個(gè)植株，其中所得到的整個(gè)植物顯示修飾表型，該表型不被從相同種的非轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中長(zhǎng)出的植物所顯示。
根據(jù)這樣的方法，期望的多核苷酸(i)基本上僅由分離自和/或天然屬于植物細(xì)胞種或其性親和種的基因組的元件構(gòu)成；(ii)包括至少一種邊緣元件，該元件具有一個(gè)分離自或者天然屬于植物細(xì)胞種或其性親和種基因組的序列，該序列能夠?qū)⑵谕亩嗪塑账岱€(wěn)定地整合到暴露于載體的植物細(xì)胞的基因組中；和(iii)被穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)化植物的基因組中；其中該方法不將非植物種或外源DNA整合到轉(zhuǎn)化植物的基因組中。
此外，可以使用任何選擇性標(biāo)記基因作為成功轉(zhuǎn)化的指示物。例如，可以使用“新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶”標(biāo)記基因，或者使用“hpt”標(biāo)記基因以分別賦予對(duì)氨基糖苷類抗生素、卡那霉素和潮霉素的抗性。其它的標(biāo)記基因包括“bar”標(biāo)記基因，其賦予對(duì)除草劑膦絲菌素的抗性；“DHFR”標(biāo)記基因，其賦予對(duì)氨甲蝶呤的抗性；以及“ESPS”標(biāo)記基因，其賦予對(duì)Round-up除草劑的抗性。在現(xiàn)有技術(shù)中公知如何進(jìn)行這類標(biāo)記基因的表達(dá)以確定標(biāo)記基因是否已經(jīng)在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定地表達(dá)。相應(yīng)地，技術(shù)人員知道如何跟蹤標(biāo)記基因的表達(dá)以確定標(biāo)記基因僅在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中短暫地表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供制備穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物的方法，包括以下步驟(1)鑒定靶基因；(2)分離與所述靶基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨DNA序列；(3)可任選地修飾所述分離的前導(dǎo)或尾隨DNA；(4)可操作地將所述的前導(dǎo)或尾隨DNA連接到天然的調(diào)節(jié)元件上以形成表達(dá)盒；(5)將所述的表達(dá)盒插入位于雙載體上的P-DNA中，其中該雙載體也攜帶一個(gè)可操作的細(xì)胞分裂素基因，使得通過(guò)細(xì)胞分裂素基因的表達(dá)而檢測(cè)的外源性的其它雙載體序列意外插入；(6)將修飾的雙載體引入土壤桿菌中；(7)使用LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將重排的天然DNA穩(wěn)定地整合到植物細(xì)胞的基因組中；(8)再生含有重排的天然DNA的植物細(xì)胞；(9)棄去顯示過(guò)度生產(chǎn)細(xì)胞分裂素表型并且不能完全再生的植物；以及(10)維持與未轉(zhuǎn)化植物難區(qū)分的期望植物用于進(jìn)一步分析。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供修飾所選植物種的性狀表達(dá)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(1)鑒定將被修飾的性狀；(2)構(gòu)建基本上由分離自或天然屬于所選植物種的遺傳元件構(gòu)成的重組DNA分子，其中當(dāng)重組的DNA分子被整合到所選植物種的基因組中時(shí)，修飾了轉(zhuǎn)化植物種的性狀表達(dá)；(3)使用LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將重組的DNA分子穩(wěn)定地整合到所選植物種的細(xì)胞中；以及(4)鑒定顯示性狀的表達(dá)已被修飾的轉(zhuǎn)化植株。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)用兩種不同的土壤桿菌(Agrobacterium)菌株感染外植體將期望植株的天然多核苷酸插入期望植物的基因組中。第一個(gè)土壤桿菌菌株能夠?qū)⑻烊籇NA從P-DNA載體轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中；第二個(gè)菌株能將帶有選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)盒的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。后一種載體的實(shí)例包括這里描述的所謂“LifeSupport”載體。通過(guò)優(yōu)選能短暫表達(dá)標(biāo)記基因1-10天、3-7天，或4-5天的植株，并隨后將外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中，獲得眾多事件，其中部分事件代表含有至少一個(gè)多核苷酸拷貝的植株，但是缺乏T-DNA或標(biāo)記基因的任何拷貝。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用單一的土壤桿菌菌株，其帶有P-DNA載體和LifeSupport載體，其中P-DNA載體在P-DNA邊緣樣序列之間具有期望的天然興趣基因或多核苷酸，LifeSupport載體含有標(biāo)記基因的。標(biāo)記基因可以，或者不可以在P-DNA邊緣樣序列、T-DNA邊緣序列，或其它T-DNA樣邊緣序列之間插入。
因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-DNA載體含有至少兩個(gè)表達(dá)盒，其中一個(gè)包含由天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的天然的可篩選的或可選擇的標(biāo)記基因，然后是天然終止子。
通過(guò)優(yōu)選選擇表達(dá)至少2天，以及更優(yōu)選至少5天的天然標(biāo)記基因表達(dá)，隨后將外植物轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中，獲得眾多事件，其代表含有至少一個(gè)拷貝的引入的DNA被穩(wěn)定地整合到它們的基因組中的植株。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物來(lái)源的標(biāo)記基因編碼5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸(5-enolpyruvul-3-phosphoshikimic acid)合酶或色氨酸脫羧酶突變體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記物編碼耐鹽性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，耐鹽性基因具有SEQ ID 35中顯示的核苷酸序列，并在馬鈴薯中用于選擇轉(zhuǎn)化事件。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)修飾的性狀表達(dá)的特點(diǎn)是表達(dá)增加、表達(dá)降低或不能檢測(cè)的表達(dá)的增加。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供通過(guò)下列方法制備的植物，(1)鑒定將要被修飾的性狀；(2)構(gòu)建基本上由從所選植物種中分離的遺傳元件構(gòu)成的重組DNA分子，其中當(dāng)重組的DNA分子被整合到所選植物種的基因組中時(shí)，它修飾轉(zhuǎn)化的植物種中該性狀的表達(dá)；(3)通過(guò)LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將重組DNA分子穩(wěn)定地整合到所選植物種的細(xì)胞中；以及(4)鑒定顯示經(jīng)過(guò)修飾性狀表達(dá)的轉(zhuǎn)化植株。
在進(jìn)一步方面中，提供修飾所選植物種中性狀表達(dá)的方法。這種方法包括(1)鑒定將被修飾的性狀；(2)構(gòu)建基本上由下列部分構(gòu)成的重組DNA分子(a)從所選植物種中分離的遺傳元件，其中當(dāng)遺傳元件被整合到所選植物種的基因組中時(shí)，它修飾轉(zhuǎn)化植物種中該性狀的表達(dá)；和(b)從相同的植物種中分離的選擇性標(biāo)記基因；(3)通過(guò)LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將重組DNA分子穩(wěn)定地整合到所選植物種的細(xì)胞中；(4)檢測(cè)選擇性的標(biāo)記基因；以及(5)鑒定顯示經(jīng)過(guò)修飾性狀表達(dá)的轉(zhuǎn)化植株。
在一個(gè)另外的方面中，提供顯示性狀表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將重組DNA分子穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中，其中該DNA分子基本上由從相同種或從與該種性親和的植物中分離的遺傳元件構(gòu)成，其中該重組DNA分子修飾性狀的表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供被稱作“植物-DNA”(“P-DNA”)的分離的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該P(yáng)-DNA本身缺乏任何基因或其部分，并用末端T-DNA “邊緣樣”序列來(lái)描繪，它與任何烈性土壤桿菌菌株的T-DNA邊緣核苷酸序列有至少50％，至少75％，至少90％或者至少95％的序列同一性，其支持將整個(gè)P-DNA從土壤桿菌高效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“邊緣樣”序列促進(jìn)和便于與其相連的多核苷酸的整合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)修飾的P-DNA的末端序列的長(zhǎng)度為5-100堿基對(duì)、10-80堿基對(duì)、15-75堿基對(duì)、15-60堿基對(duì)、15-50堿基對(duì)、15-40堿基對(duì)、15-30堿基對(duì)、16-30堿基對(duì)、20-30堿基對(duì)、21-30堿基對(duì)、22-30堿基對(duì)、23-30堿基對(duì)、24-30堿基對(duì)、25-30堿基對(duì)、或者26-30堿基對(duì)。更優(yōu)選地，邊緣樣序列的長(zhǎng)度為20和28個(gè)核苷酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的P-DNA左邊和右邊的邊緣序列是分離自和/或天然屬于將被修飾的植物的基因組，并且核苷酸序列不與任何已知的土壤桿菌(Agrobacterium)來(lái)源的T-DNA的邊緣序列相同。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，P-DNA邊緣序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個(gè)不同于土壤桿菌種，如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根植物單胞菌(Agrobacterium rhizogens)T-DNA邊緣序列的核苷酸。或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的P-DNA邊緣或邊緣樣序列與土壤桿菌種，如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根植物單胞菌(Agrobacterium rhizogens)的T-DNA邊緣序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的序列同一性。更優(yōu)選地，天然植物的P-DNA邊緣序列與土壤桿菌(Agrobacterium)的T-DNA邊緣序列具有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的核苷酸序列同一性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可從植物基因組中分離邊緣樣序列，接著進(jìn)行修飾或者突變以改變效率，通過(guò)該效率能夠?qū)⒑塑账嵝蛄姓系搅硪粋€(gè)核苷酸序列中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在本發(fā)明的邊緣樣序列內(nèi)添加或者摻入其它的多核苷酸序列。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可修飾P-DNA的左邊緣或P-DNA的右邊緣以使其具有5’-和3’-多克隆位點(diǎn)或者另外的限制性酶切位點(diǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可修飾P-DNA邊緣序列以提高伴隨載體的主鏈DNA不被整合到植物基因組中的可能性。
在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在聚合酶鏈反應(yīng)中使用簡(jiǎn)并引物而從任何植物中分離P-DNAs。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，P-DNA來(lái)自馬鈴薯，用25個(gè)堿基對(duì)的末端來(lái)描繪，該末端與常規(guī)的T-DNA邊緣序列分別有80和88％的同一性，具有SEQ ID NO.1顯示的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-DNA來(lái)源于小麥，用25個(gè)堿基對(duì)的末端來(lái)描繪，該末端與常規(guī)的T-DNA邊緣分別有72％和92％的同一性，含有SEQ ID NO.34中顯示的核苷酸序列。
可以對(duì)這樣的P-DNA進(jìn)行修飾以使其包含位于邊緣樣序列之間的其它多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)修飾的P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移的第一個(gè)邊緣樣序列、啟動(dòng)子、可操作地連到啟動(dòng)子上的期望的多核苷酸、終止子以及也促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移的第二個(gè)邊緣樣序列構(gòu)成。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，期望的多核苷酸代表在正義和/或反義方向上的前導(dǎo)序列、尾隨序列或者基因的一個(gè)或幾個(gè)拷貝。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的P-DNA含有突變PPO基因和轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因兩者的表達(dá)盒。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的多核苷酸包括前導(dǎo)序列的正義和反義序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列與所選植物種細(xì)胞的內(nèi)在基因有關(guān)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列與從下列基因構(gòu)成的組中選出的基因有關(guān)PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的多核苷酸包括尾隨序列的正義和反義序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，尾隨序列與從下列基因構(gòu)成的組中選出的基因有關(guān)PPO基因、R1基因、L或H型α葡聚糖磷酸化酶基因、UDP葡萄糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的多核苷酸，如基因分離自和/或天然屬于將被轉(zhuǎn)化的植物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾或突變期望的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多核苷酸的突變可能使得期望的多核苷酸與其未突變型有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的異化。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，組成型啟動(dòng)子是馬鈴薯的泛素-3基因的啟動(dòng)子。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，組成型啟動(dòng)子是馬鈴薯的泛素-7基因的啟動(dòng)子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子對(duì)溫度敏感。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)于是ci21A啟動(dòng)子或C17啟動(dòng)子，每個(gè)都是從馬鈴薯中分離(Schneider等，Plant Physiol.113335-45，1997；Kirch等，Plant Mol Biol 33897-909，1997)出來(lái)的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以臨時(shí)方式調(diào)節(jié)位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是rbcS啟動(dòng)子(Ueda等，Plant Cell 1217-27，1989)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)脫落酸、創(chuàng)傷、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一個(gè)調(diào)節(jié)位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這種啟動(dòng)子是選自Rab 16A基因的啟動(dòng)子、α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子或pin2基因的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種啟動(dòng)子是從馬鈴薯中分離的GBSS啟動(dòng)子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠在大腸桿菌(E.coli)和土壤桿菌兩者中復(fù)制，并含有P-DNA或經(jīng)過(guò)修飾的P-DNA的P-DNA載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種載體在其主鏈中也含有細(xì)胞分裂素的基因表達(dá)盒以便能夠選擇抗主鏈整合的事件。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的核苷酸序列進(jìn)一步包括間隔元件。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，間隔元件是Ubi內(nèi)含子序列或GBSS間隔序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的核苷酸序列包括編碼功能失活蛋白的突變的天然基因，如果在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，其降低該蛋白的全部活性。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種突變的基因編碼缺乏結(jié)合銅的結(jié)構(gòu)域的功能失活的多酚氧化酶。
在另一個(gè)優(yōu)選的所實(shí)施方案中，期望的核苷酸序列包括編碼功能上有活性的蛋白的天然基因。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種基因編碼與煙草液泡轉(zhuǎn)化酶抑制劑同源的蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，位于P-DNA內(nèi)的表達(dá)盒的終止子是Ubi3終止子序列或所選植物種基因的3’-非翻譯區(qū)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種修飾靶植物細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(1)使用LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將修飾的P-DNA插入到靶植物細(xì)胞中至少一個(gè)細(xì)胞的基因組中；和(2)觀察在靶植物細(xì)胞中是否有表型的改變；其中在修飾的P-DNA中啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄與天然基因相關(guān)的正義和/或反義的非翻譯序列以減少該天然基因的表達(dá)，因而修飾靶植物細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在修飾的P-DNA中啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄一種基因使得在靶植物細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)該基因。
在另一個(gè)方面，提供一種制備含有修飾P-DNA的所選植物種的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。該方法包括用P-DNA載體和LifeSupport載體共轉(zhuǎn)染所選植物種的植物細(xì)胞，其中LifeSupport載體包括兩側(cè)是T-DNA的左邊緣和T-DNA的右邊緣的標(biāo)記基因和插入到載體主鏈中的突變型virD2基因，選擇短暫地表達(dá)標(biāo)記基因的植物細(xì)胞，以及分離含有整合到其基因組中的修飾P-DNA但不含有來(lái)自LifeSupport載體的任何核苷酸的植物細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該標(biāo)記基因賦予抗卡那霉素的抗性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中在卡那霉素抗性基因之后是酵母ADH終止子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，作為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的所選植物種的植物細(xì)胞在培養(yǎng)物中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，作為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的所選植物種的植物細(xì)胞在植物內(nèi)。
本發(fā)明也提供所選種的植株，其包含至少一個(gè)其基因組含有修飾的P-DNA的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該修飾的P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由其功能象T-DNA邊緣序列并且隨后跟以P-DNA序列的第一個(gè)末端、啟動(dòng)子、可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子兩者上的期望的核苷酸序列、以及用第二末端描繪的另外的P-DNA序列構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的多核苷酸代表在正義和/或反義方向上的前導(dǎo)序列、尾隨序列和基因的一個(gè)或幾個(gè)拷貝。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)想包含至少一個(gè)其基因組含有修飾的P-DNA的細(xì)胞的植物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供減少所選植物種中的基因表達(dá)的方法。該方法包括用P-DNA載體對(duì)來(lái)自所選植物種的植物細(xì)胞進(jìn)行LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中將這種載體的修飾的P-DNA穩(wěn)定地整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，修飾的P-DNA包括期望的能減少來(lái)自所選植物種的內(nèi)源基因表達(dá)的多核苷酸。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可以誘變所選植物種的天然基因并使用本發(fā)明的方法重新引入到植物中。優(yōu)選地，使用P-DNA載體將突變基因，例如突變的PPO基因整合到植物細(xì)胞的基因組中。
本發(fā)明也提供減少所選的植物種中多酚氧化酶基因的不希望要的表達(dá)的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括將修飾的P-DNA整合到所選植物種的基因組中，該修飾的P-DNA僅由從所選植物種或者從與所選植物種性親和的植物中分離的核苷酸序列構(gòu)成，在5’-到3’-方向上基本上由功能象T-DNA邊緣序列并且隨后跟以側(cè)翼P-DNA序列的第一個(gè)P-DNA末端；啟動(dòng)子；期望的核苷酸，其是與特異性的PPO基因相關(guān)的正義方向的尾隨核苷酸序列；特異性的PPO基因尾隨核苷酸序列的反義方向序列；終止序列，以及用第二末端的描繪其功能象T-DNA邊緣的另外的P-DNA序列構(gòu)成，其中啟動(dòng)子產(chǎn)生能減少特異性的PPO基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，因此減少植物的特異組織中的黑斑傷痕。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從先于特異性的PPO基因的5’-非翻譯區(qū)中獲得前導(dǎo)核苷酸序列的正義和反義方向的核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以通過(guò)另一個(gè)多核苷酸序列，在這里稱作內(nèi)含子或“間隔區(qū)”，將與PPO基因相關(guān)的正義和反義方向的前導(dǎo)或尾隨序列分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)或尾隨序列與馬鈴薯PPO基因相關(guān)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)或尾隨序列與在馬鈴薯塊莖中表達(dá)的馬鈴薯PPO基因相關(guān)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，前導(dǎo)或尾隨序列與在馬鈴薯的塊莖中除了表皮之外的所有部分中都表達(dá)的馬鈴薯PPO基因相關(guān)。
本發(fā)明也提供在所選植物種的塊莖中減少丙烯酰胺生產(chǎn)、貯藏期間誘導(dǎo)發(fā)芽、磷酸鹽蓄積、和/或冷誘導(dǎo)變甜的方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括用修飾的P-DNA對(duì)所選植物種進(jìn)行LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，該修飾的P-DNA僅包括從所選植物種或從與所選植物種性親和的植株中分離的核苷酸序列，在5’-到3’-方向上基本上由具有左邊緣樣序列的第一個(gè)P-DNA、啟動(dòng)子、期望的核苷酸序列，其是來(lái)自與R1基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義方向的核苷酸序列、這個(gè)前導(dǎo)序列的反義方向序列、終止序列、以及右邊緣樣序列構(gòu)成。一旦表達(dá)，產(chǎn)生能減少R1基因表達(dá)的前導(dǎo)-RNA雙鏈體，因而在植物中減少冷誘導(dǎo)的變甜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的正義和反義方向的核苷酸序列代表與R1基因相關(guān)的尾隨序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以通過(guò)另一個(gè)多核苷酸序列，這里稱作內(nèi)含子或“間隔區(qū)”，將與R1相關(guān)的正義和反義方向的前導(dǎo)序列或尾隨序列分離。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括用修飾的P-DNA對(duì)所選植物種進(jìn)行LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中該修飾的P-DNA與上面描述的P-DNA相似，但含有與α葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括用修飾的P-DNA對(duì)所選植物種進(jìn)行LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中該修飾的P-DNA含有轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用在前面段落中描述的修飾的P-DNA以減少美拉德反應(yīng)的額外的不想要的產(chǎn)物的蓄積，其發(fā)生在富含碳水化含物的食物，如馬鈴薯塊莖的加熱期間。這些不想要的產(chǎn)物包括一直與各種病理學(xué)相關(guān)的高級(jí)糖化末端產(chǎn)物(AGEs)。
本發(fā)明也提供提高植物和糧食作物貯藏器官中抗性淀粉水平的方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括用修飾的P-DNA對(duì)所選植物種進(jìn)行LifeSupport介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中該修飾的P-DNA含有與淀粉分支酶I和II基因有關(guān)的尾隨序列的融合的表達(dá)盒。
本發(fā)明也提供包含主要在塊莖中表達(dá)的馬鈴薯GBSS基因和馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因的啟動(dòng)子的分離的核苷酸序列。分離的啟動(dòng)子分別具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.40中所顯示的核苷酸序列。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供修飾所選植物性狀的方法，包括a.用期望的多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化所選植物的細(xì)胞，其中期望的多核苷酸基本上由所選植物、同種植物或者與所選植物性互交可孕的植物的天然核酸序列構(gòu)成，b.從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，其中轉(zhuǎn)化的植物含有穩(wěn)定整合到基因組中的期望的多核苷酸，并且其中期望的多核苷酸修飾該性狀。
在優(yōu)選的的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括用在植物細(xì)胞中短暫表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化的植物，其中沒有將選擇性標(biāo)記基因穩(wěn)定地整合，而將期望的多核苷酸穩(wěn)定地整合到基因組中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的“植物”是單子葉植物，從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的“植物”是雙子葉植物，從由avacado、馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化本發(fā)明方法的植物和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一種雙載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中第一個(gè)雙載體含有期望的多核苷酸，第二雙載體含有選擇性的標(biāo)記基因，其中選擇性的標(biāo)記基因可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子上。
根據(jù)本發(fā)明的方法，被修飾的性狀是從下列性狀構(gòu)成的組中選出提高的健康和營(yíng)養(yǎng)特性、改善的貯藏性、提高的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的重金屬耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆蟲耐受性、提高的水應(yīng)力耐受性、增強(qiáng)的冷和霜凍耐受性、增加顏色、增加甜味、提高活力、改善口味、改善質(zhì)地、降低磷酸鹽含量、提高發(fā)芽率、提高微營(yíng)養(yǎng)攝入、改善淀粉組成、提高花的壽命。
本發(fā)明也包括通過(guò)本發(fā)明方法制備的植物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供修飾所選植物性狀的方法，包括(a)鑒定要修飾的性狀；(b)構(gòu)建第一個(gè)多核苷酸，其基本上由從所選植物、同種植物、或與所選植物性互交可孕的植物中分離的天然遺傳元件構(gòu)成，其中天然的遺傳元件能夠修飾控制該性狀的基因的表達(dá)；
(c)構(gòu)建包含可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子上的選擇性標(biāo)記基因的第二多核苷酸；(d)用第一和第二多核苷酸共轉(zhuǎn)染來(lái)自所選植物的植物細(xì)胞；(e)選擇選擇性標(biāo)記基因的短暫表達(dá)；(f)對(duì)用第一個(gè)多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化但是不含有整合到基因組中的第二個(gè)DNA分子的植物細(xì)胞進(jìn)行篩選；和(g)從顯示該性狀的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳元件包括啟動(dòng)子、興趣序列、終止子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、間隔區(qū)或調(diào)節(jié)元件中的至少一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，權(quán)利要求4的方法，其中在第二個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)染前，用第一個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，或者反過(guò)來(lái)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，興趣序列是基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該基因是突變的或是野生型的多酚氧化酶基因或者是突變的或野生型的R1基因。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，興趣序列是前導(dǎo)序列或尾隨序列，其中前導(dǎo)或尾隨序列代表植物細(xì)胞天然基因的上游或下游序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，興趣序列包括可操作地連接到反義前導(dǎo)序列上的正義方向的前導(dǎo)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，興趣序列包括可操作地連接到反義尾隨序列上的正義方向的尾隨序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，終止子是酵母ADH終止子序列。
根據(jù)本發(fā)明，前導(dǎo)序列構(gòu)建物在5’-到3’-方向上包括啟動(dòng)子、正義方向上的前導(dǎo)序列、前導(dǎo)序列的反義序列、以及終止子，其中前導(dǎo)序列構(gòu)建物的表達(dá)產(chǎn)生便于向下調(diào)節(jié)與其相關(guān)的基因表達(dá)的雙鏈RNA分子。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區(qū)相關(guān)并位于其上游。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，尾隨構(gòu)建物在5’-到3’-方向上包括啟動(dòng)子、正義方向上的尾隨序列、尾隨序列的反義序列、以及終止子，其中尾隨序列構(gòu)建物的表達(dá)產(chǎn)生便于向下調(diào)節(jié)與其聯(lián)系的基因表達(dá)的雙鏈RNA分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，尾隨序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或者α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區(qū)相關(guān)并位于其下游。
該方法進(jìn)一步包括將植物細(xì)胞暴露于包含標(biāo)記元件的第二載體，其中該標(biāo)記在轉(zhuǎn)化的植物中短暫地表達(dá)，并且不被穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)化植物的基因組中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該標(biāo)記是除草劑的抗性基因、抗生素抗性基因、或NPTII。
優(yōu)選地，通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，第一雙載體帶有第一多核苷酸，第二雙載體帶有第二多核苷酸。
本發(fā)明提供另一個(gè)修飾所選植物中基因表達(dá)的方法，包括(a)鑒定功能基因；(b)構(gòu)建基本上由從所選植物、與所選植物同種的植物、或者與所選植物性互交可孕的植物中分離的天然遺傳元件構(gòu)成的第一多核苷酸，其中該天然遺傳元件能夠修飾該基因的表達(dá)；(c)構(gòu)建包含功能性選擇性標(biāo)記基因的第二多核苷酸；(d)用第一和第二多核苷酸共轉(zhuǎn)染來(lái)自所選植物的植物細(xì)胞；(e)選擇選擇性標(biāo)記基因的短暫表達(dá)；(f)篩選用第一個(gè)多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，但不含有整合到基因組中的第二多核苷酸的植物細(xì)胞；和(g)從顯示該基因的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化植物。
優(yōu)選地，通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，第一雙載體帶有第一多核苷酸，第二雙載體帶有第二多核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT中的至少一個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二多核苷酸包括選擇性標(biāo)記基因、Ω-突變的virD2多核苷酸、codA多核苷酸、以及codA∷upp融合多核苷酸中的至少一個(gè)。
本發(fā)明也包括通過(guò)這種方法制備的植物。
在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，提供顯示與其來(lái)源的非轉(zhuǎn)基因植物相比性狀的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的轉(zhuǎn)基因植物，其中用基本上由天然的遺傳元件構(gòu)成的期望的多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物，該天然的遺傳元件從該植物、同種植物、或者與該植物性互交可孕的植物中分離，其中該多核苷酸修飾性狀的表達(dá)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的“植物”是單子葉植物，從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的“植物”是雙子葉植物，從由avacado、馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，性狀從下列性狀構(gòu)成的組中選出提高的健康和營(yíng)養(yǎng)特性、增加的貯藏性、提高的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的重金屬耐受性、提高的干旱耐受性、提高的疾病耐受性、提高的昆蟲耐受性、提高的水應(yīng)力耐受性、增強(qiáng)的冷和霜凍耐受性、增加的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的結(jié)構(gòu)、降低的磷酸鹽含量、提高的發(fā)芽率、提高的微營(yíng)養(yǎng)攝入、改善的淀粉組成、提高的花的壽命。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，期望的多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT中的至少一個(gè)。
本發(fā)明也包括大小在從20到100bp范圍的分離的邊緣樣核苷酸序列，其與根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊緣序列有52％與96％的序列相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核苷酸序列是從單子葉植物中分離的，單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列是從雙子葉植物中分離的，該雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核苷酸序列是從馬鈴薯中分離的，并且具有在SEQ ID NO.94或95中顯示的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核苷酸序列與根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊緣序列有52％的序列相同。本發(fā)明包括包含這樣的核苷酸序列的載體。
本發(fā)明也提供制備用期望的多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，包括(a)從該植物中分離兩側(cè)是邊緣樣序列的P-DNA，其中邊緣樣序列與根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊緣序列有52％至96％的序列同一性；(b)在P-DNA邊緣樣序列之間插入期望的多核苷酸以形成P-DNA構(gòu)建物；和(c)用P-DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化來(lái)自該植物的植物細(xì)胞；和(d)從用P-DNA構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中重新獲得植株。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在由主鏈整合標(biāo)記基因構(gòu)成的載體上攜帶該P(yáng)-DNA構(gòu)建物，并且選擇不含有主鏈整合標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該主鏈整合標(biāo)記基因是細(xì)胞分裂素基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不選擇顯示過(guò)量生產(chǎn)細(xì)胞分裂素表型的植物枝條。在另一個(gè)實(shí)施方案中，主鏈整合標(biāo)記基因是IPT基因，不選擇顯示異常表型或者不能產(chǎn)生根的植物枝條。
在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物，該單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該植物細(xì)胞來(lái)自雙子葉植物，該雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選出。
優(yōu)選地，通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，第一雙載體具有第一多核苷酸，第二雙載體具有第二多核苷酸。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二雙載體包括陰性的選擇性標(biāo)記基因和Ω-突變的virD2基因中的至少一個(gè)，其中陰性的選擇性標(biāo)記基因是位于T-DNA右邊緣和T-DNA左邊緣內(nèi)，并且其中Ω-突變的virD2基因位于第二雙載體的主鏈內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二雙載體包括位于T-DNA右邊緣和T-DNA左邊緣內(nèi)的陰性選擇性標(biāo)記基因，以及位于第二雙載體主鏈內(nèi)的Ω-突變的virD2基因。
本發(fā)明也提供在5’-到3’-方向上基本上由第一T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、可操作地連接到啟動(dòng)子上的期望的多核苷酸序列、終止子以及第二T-DNA邊緣樣序列構(gòu)成的P-DNA，其中邊緣樣序列與T-DNA邊緣序列具有小于100％的序列同一性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、期望的多核苷酸以及終止子都是從相同植物、相同植物種、或性互交可孕的植物中分離出來(lái)的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，P-DNA進(jìn)而基本上由選擇性標(biāo)記基因構(gòu)成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、期望的多核苷酸、終止子和選擇性標(biāo)記基因都是從相同植物、相同植物種、或性互交可孕的植物中分離。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，P-DNA中的期望的多核苷酸序列是基因編碼區(qū)的上游或下游序列，其中該上游序列是前導(dǎo)序列，其中下游序列是尾隨序列。在這個(gè)實(shí)施方案中，T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、尾隨序列、終止子和選擇性標(biāo)記基因都是從相同植物、相同植物種、或性互交可孕的植物中分離出來(lái)的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供包含這樣的P-DNA構(gòu)建物的載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子對(duì)溫度敏感。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是小麥wcs120啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是在時(shí)序調(diào)控下。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是羧化酶啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧化酶啟動(dòng)子是玉米羧化酶啟動(dòng)子。
可以通過(guò)脫落酸、創(chuàng)傷、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一種來(lái)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是選自Rab 16A基因啟動(dòng)子、α淀粉酶基因啟動(dòng)子或者pin2基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。
在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列是所選植物種細(xì)胞的內(nèi)源基因的5’-非翻譯區(qū)的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，5’-非翻譯區(qū)位于基因的起始密碼子的上游，其中該基因從由PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p 5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因構(gòu)成的組中選出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，尾隨序列是位于選自下列基因的終止密碼子下游的基因的3’-非翻譯區(qū)的一部分PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因。
本發(fā)明的載體可以進(jìn)一步包括間隔元件，該間隔元件是Ubi內(nèi)含子序列或者GBSS間隔區(qū)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體包括終止子，該終止于是Ubi3終止子序列或內(nèi)源性植物基因的3’-非翻譯區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體包括可選擇性地連接到組成型啟動(dòng)子上的選擇性標(biāo)記基因以及可操作地連接到謗導(dǎo)型啟動(dòng)子上的Cre基因，其中選擇性標(biāo)記基因和Cre基因的兩側(cè)是第一重組酶的識(shí)別位點(diǎn)和第二重組酶的識(shí)別位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一重組酶的識(shí)別位點(diǎn)和第二重組酶的識(shí)別位點(diǎn)是lox位點(diǎn)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)于是溫度敏感的啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或時(shí)序啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是Ha hsp 17.7 G4啟動(dòng)子、小麥wcs120啟動(dòng)子、Rab 16A基因啟動(dòng)子、α淀粉酶基因啟動(dòng)子、pin2基因啟動(dòng)子、羧化酶啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步包括植物來(lái)源的標(biāo)記基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物來(lái)源的標(biāo)記基因是烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了修飾植物細(xì)胞的方法，包括將P-DNA序列整合到植物細(xì)胞的基因組中，其中該P(yáng)-DNA在5’-到3’-方向上基本上由第一T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、可操作地連接到啟動(dòng)子上的期望的多核苷酸序列、終止子以及第二T-DNA邊緣樣序列構(gòu)成，其中邊緣樣序列與T-DNA邊緣序列有小于100％的序列同一性，其中T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、期望的多核苷酸序列和終止子都分離自或天然屬于植物細(xì)胞的基因組，其中期望的多核苷酸包括與植物基因的上游或下游非編碼區(qū)相關(guān)的前導(dǎo)序列或尾隨序列的正義和反義序列，其中期望的多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生靶向與期望的多核苷酸相關(guān)的基因的雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄本，從而修飾植物細(xì)胞。
本發(fā)明也包括修飾植物的方法，包括(i)用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染植物中的至少一個(gè)細(xì)胞；(ii)選擇表達(dá)功能性的選擇性標(biāo)記的細(xì)胞；(iii)分離表達(dá)功能性的選擇性標(biāo)記的細(xì)胞；(iii)誘導(dǎo)功能性的Cre基因在分離的細(xì)胞中的表達(dá)；(iV)培養(yǎng)分離的細(xì)胞；和(ii)觀察培養(yǎng)的細(xì)胞的表型；其中與未轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞不同的表型表明靶植物細(xì)胞已經(jīng)被修飾。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種方法和本發(fā)明的其它方法的選擇步驟是通過(guò)鑒定抵抗抗生素的細(xì)胞而進(jìn)行的。
在另一個(gè)方面，鑒定其基因組含有P-DNA的靶植物細(xì)胞的方法，包括用本發(fā)明的載體和來(lái)源于第二土壤桿菌的載體共轉(zhuǎn)染植物靶細(xì)胞，該第二載體包含兩側(cè)是T-DNA左邊緣和T-DNA右邊緣的標(biāo)記基因以及Ω-突變的virD2基因，其中將P-DNA整合到植物靶細(xì)胞的基因組中，其中沒有將來(lái)源于第二土壤桿菌的載體的任何部分整合到植物靶細(xì)胞的基因組中，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在來(lái)源于第二土壤桿菌的載體中的標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
在另一個(gè)方面，提供鑒定其基因組含有整合盒的至少一部分的靶植物細(xì)胞的方法，進(jìn)而包括選擇在含卡那霉素的培養(yǎng)基中暫時(shí)生長(zhǎng)存活的細(xì)胞，其中所選擇細(xì)胞的基因組僅含有整合盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的靶植物細(xì)胞在植物內(nèi)。本發(fā)明也包括包含至少一個(gè)其基因組含有這樣的P-DNA的細(xì)胞的植物。
本發(fā)明也包括包含至少一個(gè)其基因組被人工操作以僅含有植物來(lái)源的核酸的細(xì)胞的植物，其中該植物的細(xì)胞不含有整合到細(xì)胞基因組中的外源核酸。
本發(fā)明也包括包含SEQ ID NO.93的多核苷酸序列的多核苷酸，其中多核苷酸的長(zhǎng)度為20至80個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸的長(zhǎng)度為21至70個(gè)核苷酸，22至50個(gè)核苷酸，23至40個(gè)核苷酸，或者為24至30個(gè)核苷酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括在SEQ ID NO.40中所顯示的塊莖特異性啟動(dòng)子。
本發(fā)明也包括基于土壤桿菌的制備不含有穩(wěn)定地整合在核DNA中的選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括a.構(gòu)建由多核苷酸構(gòu)成的第一雙載體，該多核苷酸基本上由在期望的功能基因的5’和3’末端可操作地連接到T-DNA邊緣或T-DNA邊緣樣序列上的期望的功能基因構(gòu)成；b.構(gòu)建由在功能性的選擇標(biāo)記基因的5’和3’末端可操作地連接到T-DNA邊緣或T-DNA邊緣樣序列上的功能性選擇標(biāo)記基因構(gòu)成的第二雙載體；c.用下列菌株培育植物細(xì)胞i.帶有第一和第二雙載體的土壤桿菌菌株；或
ii.帶有第一雙載體的第一土壤桿菌菌株和帶有第二雙載體的第二土壤桿菌菌株；d.選擇其中將期望的功能基因整合到植物核DNA中，而沒有將選擇性的標(biāo)記基因整合到植物的核DNA中的植物細(xì)胞，接著在含有適當(dāng)選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記基因是除草劑抗性基因或抗生素抗性基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是nNPTII基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是可操作地連接到泛素-7基因的啟動(dòng)子和酵母醇脫氫酶1(ADH)基因的終止子上的nptII結(jié)構(gòu)基因。根據(jù)這個(gè)方法，首先與第一土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)植物細(xì)胞，接著與第二土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)，或者反過(guò)來(lái)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一雙載體還包括雙整合標(biāo)記基因，該基因可用于檢測(cè)用雙載體主鏈序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙載體整合標(biāo)記基因從由除草劑抗性基因、抗生素抗性基因或NPTII構(gòu)成的組中選出。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二雙載體進(jìn)而包括在細(xì)菌和胞嘧啶脫氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(upp)的基因之間的基因融合，該基因融合在T-DNA或T-DNA邊緣樣序列之間插入，將植物細(xì)胞暴露于5-氟胞嘧啶，接著與第一和第二土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)以便選擇抗那些用第二雙載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二雙載體還包括減少主鏈整合的可能性的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的基因是Ω-突變的virD2基因，其中Ω-突變的virD2基因減少選擇性標(biāo)記基因整合到植物的核DNA中的頻率。
本發(fā)明也包括包含從馬鈴薯中分離的GBSS啟動(dòng)子的分離的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這個(gè)分離的核苷酸序列具有SEQ ID.NO.6或13的核苷酸序列。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1.在本發(fā)明中使用的一些P-DNA載體的圖示說(shuō)明。P-DNA區(qū)用灰盒顯示。“ipt”等于ipt基因的表達(dá)盒；“npt”等于nptII基因的表達(dá)盒；“mPPO”等于修飾的PPO基因的表達(dá)盒；“INH”等于轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因的表達(dá)盒；“GUS”等于GUS基因的表達(dá)盒；“LPPO”等于與PPO基因有關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒；“LPH”等于與磷酸化酶基因有關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒；“Alf”等于馬鈴薯Alfin同系物的表達(dá)盒。詳細(xì)描述見正文。
圖2.無(wú)基因的表達(dá)盒。
圖3.馬鈴薯和煙草轉(zhuǎn)化酶抑制劑蛋白的序列對(duì)比?！癝t”等于馬鈴薯；“Nt”等于煙草。
圖4.與各種PPO基因相關(guān)的尾隨序列的對(duì)比。
圖5.在本發(fā)明中使用的一些LifeSupport載體的圖示說(shuō)明?！癱odA”是codA基因的表達(dá)盒；“codA∷upp”是融合到upp上的codA基因的表達(dá)盒；“ΩvirD2”是ΩvirD2基因的表達(dá)盒。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明的“精確育種”策略改善植物和農(nóng)作物的農(nóng)藝性狀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及健康特性，不將未知的核酸、或外源物種的核酸引入植物種基因組中，并且不產(chǎn)生不想要的表型或有害的副作用。
因此，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物以及制備這樣植物的方法，該方法不將非植物種的核酸整合到該植物的基因組中。核酸、啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)元件、其它非編碼的基因序列、標(biāo)記、多核苷酸、以及整合到所選植物的基因組中的基因優(yōu)選地都是從將被轉(zhuǎn)化的植物、將被轉(zhuǎn)化的相同種的植物或者與被轉(zhuǎn)化植物性互交可孕的植物中分離出來(lái)。根據(jù)這里描述的方法，這樣的“天然”核酸可被誘變、修飾或與其它天然核酸共同加入表達(dá)盒中，并重新整合到所選植物的基因組中。相應(yīng)地，僅使用所選植物自己的核酸，或使用與所選植物性親和植物的核酸來(lái)改變轉(zhuǎn)基因植物的基因型和表型。
為了便于這種轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，本發(fā)明利用不是在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中使用的所有T-DNA載體實(shí)際上都被整合到植物基因組中的事實(shí)，即，盡管載體可能被植物細(xì)胞攝入，但是可能不發(fā)生實(shí)際的整合事件。根據(jù)本發(fā)明，可以使用這樣的載體將選擇性標(biāo)記基因帶到植物細(xì)胞中。然后通過(guò)測(cè)定標(biāo)記基因表達(dá)了多長(zhǎng)時(shí)間來(lái)篩選植物細(xì)胞，以確定標(biāo)記是否已經(jīng)被穩(wěn)定地整合到植物基因組中。相應(yīng)地，期望僅短暫地表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的植物細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兇頂z入了選擇性標(biāo)記基因，但沒有將其整合到它們的基因組中的細(xì)胞。
因此，通過(guò)使用這樣的“標(biāo)記載體”以及也用另一個(gè)含有期望的天然基因或多核苷酸的載體共轉(zhuǎn)化的植物，可以選擇兩個(gè)載體都攝入的植物細(xì)胞，從這些細(xì)胞中確定哪些細(xì)胞具有僅含有期望的基因或多核苷酸的基因組。可以修飾“標(biāo)記載體”進(jìn)而減少標(biāo)記物將被整合到植物基因組中的可能性。本發(fā)明提供以“LifeSupport”載體形式存在的這類“標(biāo)記載體”。
除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。一般地，這里使用的名稱、細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室方法、分子遺傳學(xué)，以及這里描述的核酸化學(xué)和雜交，都是現(xiàn)有技術(shù)中那些公知的和通常使用的方法。使用重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析，以及藥物配制和輸送的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般地，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行酶促反應(yīng)以及純化和/或分離步驟。一般根據(jù)公開的常規(guī)方法學(xué)來(lái)實(shí)施技術(shù)和方法，例如在Molecular cloning a laboratory manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Current protocols in molecular biology，John Wiley& Sons，Baltimore，MD(1989)公開的方法。
氨基酸序列這里使用的氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽、或蛋白及其片段，其分離自、屬于、或是在植物中天然存在的，或者是合成制備的，但包括內(nèi)源對(duì)應(yīng)物的核酸序列。
人工操縱的這里使用的“人工操縱的”意思是通過(guò)手工或通過(guò)機(jī)械方法或重組的方法，如通過(guò)遺傳工程技術(shù)，移動(dòng)、排列、操作或控制植物或植物細(xì)胞，以便產(chǎn)生與未被操作的天然存在的對(duì)應(yīng)物相比具有不同的生物學(xué)、生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)、或生理表型和/或基因型的植物或植物細(xì)胞。
無(wú)性繁殖通過(guò)從葉插、莖插、根插、塊莖芽眼、匍匐絲、單個(gè)植物細(xì)胞原生質(zhì)體、胼胝體等中產(chǎn)生整個(gè)植物的方法來(lái)生產(chǎn)子代，不包括配子的融合。
主鏈除去用于轉(zhuǎn)移的T-DNA或P-DNA序列之外的雙載體的核酸序列。
邊緣和邊緣樣序列“邊緣序列”是來(lái)源于土壤桿菌的特異性序列。典型地，左邊緣序列和右邊緣序列位于T-DNA的兩側(cè)，它們兩者都作為virD2催化的切割反應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。這樣的活性釋放位于這樣的邊緣序列之間的核酸。見下表2中的邊緣序列的實(shí)例。將釋放的核酸與virD2和virE2構(gòu)成復(fù)合體靶向經(jīng)常將核酸整合到植物細(xì)胞基因組中的植物細(xì)胞核。通常，使用兩個(gè)邊緣序列，左邊緣和右邊緣，將位于它們之間的核苷酸序列整合到另一個(gè)核苷酸序列中。也可能僅用一個(gè)邊緣序列，或者多于兩個(gè)邊緣序列，以這樣的方式完成期望核酸的整合。
根據(jù)本發(fā)明，“邊緣樣”序列是從將要修飾的所選植物種，或者與將要修飾的植物種性親和的植物中分離的，其功能象土壤桿菌(Agrobacterium)的邊緣序列。即，本發(fā)明的邊緣樣序列促進(jìn)和便于與其相連的多核苷酸的整合。本發(fā)明的植物DNA，即P-DNA優(yōu)選地含有邊緣樣序列。
P-DNA的邊緣樣序列長(zhǎng)度為5-100bp，10-80bp，15-75bp，15-60bp，15-50bp，15-40bp，15-30bp，16-30bp，20-30bp，21-30bp，22-30bp，23-30bp，24-30bp，25-30bp，或26-30bp。
本發(fā)明的邊緣樣序列可從任何植物中分離，如從馬鈴薯和小麥中分離。見SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.34，這些序列在任一末端含有分別從馬鈴薯和小麥中分離的邊緣樣序列。因此，本發(fā)明使用的P-DNA左側(cè)和右側(cè)邊緣序列是分離自和/或天然屬于將要修飾的植物的基因組。P-DNA邊緣樣序列在核苷酸序列上不同于任何已知的來(lái)源于土壤桿菌的T-DNA邊緣序列。因此，P-DNA邊緣樣序列可能具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個(gè)不同于土壤桿菌種，如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根植物單胞菌的T-DNA邊緣序列的核苷酸。即，本發(fā)明的P-DNA邊緣序列或邊緣樣序列與土壤桿菌種，如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根植物單胞菌的T-DNA邊緣序列具有至少95％，至少90％，至少80％，至少75％，至少70％，至少60％或至少50％的序列同一性，但不是100％序列同一性。這里使用的描述性術(shù)語(yǔ)“P-DNA邊緣”和“P-DNA邊緣樣”可以互換。
天然的P-DNA邊緣序列在核苷酸序列上與土壤桿菌的T-DNA邊緣序列具有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、52％、51％或50％的相似性。因而邊緣樣序列可從植物基因組中分離，并被修飾或突變以改變通過(guò)其能夠?qū)⒑塑账嵝蛄姓系搅硪粋€(gè)核酸序列中的效率?？稍诒景l(fā)明的邊緣樣序列內(nèi)加入或摻入其它的多核苷酸序列。因此，可以修飾P-DNA的左側(cè)邊緣序列或P-DNA的右側(cè)邊緣序列以使其具有5’-和3’-多克隆位點(diǎn)或者另外的限制性酶切位點(diǎn)?？梢孕揎桺-DNA的邊緣序列以提高不將伴隨載體的主鏈DNA整合到植物基因組中的可能性。
下列表2描繪了已知的T-DNA邊緣序列和在這里被鑒定為邊緣樣序列的序列。在表2中沒有一個(gè)被鑒定為“邊緣樣”的序列以前被鑒定為具有T-DNA邊緣樣結(jié)構(gòu)。通過(guò)本發(fā)明的方法在聚合酶鏈反應(yīng)中使用簡(jiǎn)并引物從馬鈴薯基因組DNA中分離馬鈴薯的邊緣樣序列。本發(fā)明包括使用任何P-DNA邊緣樣序列將共連接的多核苷酸轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的基因組中。
實(shí)際上，本發(fā)明包括具有SEQ ID NO.93ANGATNTATN6GT(SEQ IDNO.93)的核酸序列結(jié)構(gòu)的任何邊緣樣序列，其中“N”是任何核苷酸，如“A”、“G”、“C”、“T”代表的那些核苷酸。這個(gè)序列代表通過(guò)本發(fā)明鑒定的邊緣樣核酸的共有序列。
表2.“邊緣”和“邊緣樣”序列
Y＝C或T；R＝A或G；K＝G或T；M＝A或C；W＝A或T；S＝C或G；V＝A，C，或G；B＝C，G，或T。
邊緣樣序列的登記號(hào)為水稻染色體10 BAC OSJNBa0096G08基因組序列(AC078894.11)；擬南芥染色體3(NM_114337.1)；擬南芥染色體1(NM-105664.1)；嗜熱厭氧桿菌株MB4T，全部基因組244個(gè)區(qū)中的第118區(qū)(AE013091.1)；人克隆HQ0089(AF090888.1)；根瘤菌屬克隆rhiz98e12.q1k。*根據(jù)目前描述的本發(fā)明的方法獲得和分離了馬鈴薯左側(cè)和右側(cè)邊緣序列。
載體DNA“載體DNA”是用于攜帶某些遺傳元件并將它們傳遞到植物細(xì)胞中的DNA片段。在常規(guī)的外源DNA轉(zhuǎn)移中，這種載體DNA常常是土壤桿菌的T-DNA，用邊緣序列來(lái)描繪。這里描繪的載體DNA是從將要修飾的所選植物種中獲得的，并含有結(jié)構(gòu)上和功能上不同于T-DNA邊緣序列，但與這樣的T-DNAs具有同樣能力的末端，該能力能夠支持DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞或某些其它真核生物的核中以及隨后將這種DNA整合到這樣的真核生物的基因中。
基本上由……構(gòu)成基本上由某些元件“構(gòu)成”的組合物限于那些元件的包含物，以及那些實(shí)質(zhì)上不影響本發(fā)明的組合物的基本特性和新特性的元件。因此，只要該組合物不影響本發(fā)明的基本特性和新特性，即不含有不是從所選植物種或與所選植物種性親和的植物中分離的外源DNA，則該組合物可以被認(rèn)為是本發(fā)明組合物的組分，其特點(diǎn)是用用語(yǔ)“基本上由……構(gòu)成”表示。
簡(jiǎn)并引物“簡(jiǎn)并引物”是含有足夠的核苷酸變異的寡核苷酸，當(dāng)與相似的，但不是嚴(yán)格同源的序列雜交時(shí)，其能遷就堿基錯(cuò)配。
雙子葉植物(dicot)；其胚有兩個(gè)子葉的有花植物。雙子葉植物的實(shí)例包括但不限于煙草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、包括苜蓿和大豆的豆科植物、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌。
調(diào)節(jié)序列；指對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是標(biāo)準(zhǔn)的和已知的那些序列，其可以被包含在表達(dá)載體中，以在植物系統(tǒng)中提高和/或使興趣基因的轉(zhuǎn)錄最大化或提高和/或使得到的RNA翻譯最大化。這些包括但不限于啟動(dòng)子、肽輸出信號(hào)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。修飾核酸構(gòu)建物以提高在植物中的表達(dá)水平的方法在現(xiàn)有技術(shù)中通常也是已知的(見，例如Rogers等，260 J.Biol.Chem.3731-38，1985；Cornejo等，23 Plant Mol.Biol.56781，1993)。在加工植物系統(tǒng)以影響蛋白的轉(zhuǎn)錄率中，現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種因子，包括調(diào)節(jié)序列，如正向或負(fù)向作用序列、增強(qiáng)子和沉默子以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可能都有影響。本發(fā)明提供可在工程植物中利用這些因子中的至少一種來(lái)表達(dá)興趣蛋白。本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列是天然的遺傳元件，即從將被修飾的所選植物中分離的遺傳元件。
外源“外源”，對(duì)核酸來(lái)說(shuō)，意味著核酸來(lái)源于非植物生物或來(lái)源于與將要轉(zhuǎn)化的植物不同種的植物或者不是來(lái)源于不與將要轉(zhuǎn)化的植物性互交可孕的不屬于靶植物種的植物。
根據(jù)本發(fā)明，外源DNA或RNA代表在真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物、魚或鳥的遺傳組成中天然存在的核酸，但不是天然存在于將要轉(zhuǎn)化的植物中。因此，外源核酸是編碼例如不被轉(zhuǎn)化的植物天然生產(chǎn)的多肽的核酸。外源核酸不必編碼蛋白產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，期望的轉(zhuǎn)基因植物是不含整合在其基因組中的任何外源核酸的植物。
在另一個(gè)方面，可將天然遺傳元件摻入和整合到根據(jù)本發(fā)明所選的植物種的基因組中。從屬于所選植物種的植物或從與所選植物種性親和的植物中分離天然遺傳元件。例如，摻入到培養(yǎng)的馬鈴薯中的天然DNA可來(lái)源于任何基因型的馬鈴薯或與馬鈴薯(例如，S.demissum)性親和的任何基因型的野生型馬鈴薯種。
基因“基因”是指編碼區(qū)，不包括5’-或3’-端到該區(qū)的核苷酸序列。功能基因是可操作地連接到啟動(dòng)子或終止子上的編碼區(qū)。
遺傳重排是指可在活體內(nèi)以及在體外自然發(fā)生的遺傳元件的重新組合，其引入了遺傳材料的新組織。例如，在植物發(fā)育和性重組期間在體內(nèi)可自然發(fā)生在不同染色體的基因座上的多核苷酸的彼此拼接。相應(yīng)地，在體外通過(guò)非天然遺傳修飾技術(shù)形成的遺傳元件的重組與也可通過(guò)體內(nèi)性重組發(fā)生的重組事件相近似。
符合讀框的將核苷酸三聯(lián)體(密碼子)翻譯成期望的植物細(xì)胞中的重組蛋白的新生的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明包括以閱讀框架連到第二個(gè)核酸上的第一個(gè)核酸，其中第一個(gè)核酸序列是基因，第二個(gè)核酸是啟動(dòng)子或類似的調(diào)節(jié)元件。
整合是指將所選植物種，或與所選植物相同種的植物，或與所選植物種性親和植物的核酸序列插入到所選植物種細(xì)胞的基因組中。“整合”是指僅將天然的遺傳元件摻入到植物細(xì)胞的基因組中。為了整合天然的遺傳元件，如通過(guò)同源重組，本發(fā)明可“使用”非天然DNA作為這樣方法中的步驟。因此，本發(fā)明區(qū)分“使用”特定DNA分子和將特定DNA分子“整合”到植物細(xì)胞的基因組中。
引入如這里所用的，是指通過(guò)包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將一種核酸序列插入細(xì)胞中。
分離的“分離的”是指在物理上從其正常的、天然環(huán)境中分離出來(lái)的任何核酸或化合物。分離的材料可以被保持在含有例如溶劑、緩沖液、離子或其它成分的合適的溶液中，可以是純化的或非純化的形式。
前導(dǎo)序列在基因之前(或5’端)的被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的序列。
LifeSupport載體LifeSupport載體是一種含有位于T-DNA或T-DNA樣邊緣之間的可表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記的構(gòu)建物?？梢孕揎桳ifeSupport載體以限制這樣的標(biāo)記以及位于邊緣或邊緣樣序列之間的其它多核苷酸被整合到植物基因組中。例如，LifeSupport載體可以包括突變的virD2、codA∷upp融合，或這種遺傳元件的任何組合。因此，修飾的virD2蛋白將仍然支持T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核，但將限制隨后的T-DNAs的基因組整合的效率(Shurvinton等，Proc Natl Acad Sci USA，8911837-11841，1992；Mysore等，Mol Plant Microbe Interact，11668-683，1998)?；蛘撸谠偕翱墒褂胏odA∷upp基因融合作為陰性選擇性標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的構(gòu)建物中，LifeSupport載體包括可操作地連接到酵母ADH終止元件上的npt標(biāo)記。
單子葉植物其胚有一個(gè)子葉的有花植物。單子葉植物的實(shí)例包括單不限于草坪草、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥以及棕櫚。
天然的“天然的”遺傳元件是指天然存在于、來(lái)源于或?qū)儆趯⒁晦D(zhuǎn)化的植物基因組的核酸。因此，從將要轉(zhuǎn)化的植物或植物種的基因組中分離的，或者從與將要轉(zhuǎn)化植物種性親和或互交可孕的植物或植物種中分離的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子是“天然”的，即是植物種固有的。也就是說(shuō)，天然的遺傳元件代表植物育種者可以理解的用于通過(guò)傳統(tǒng)植物育種來(lái)改善植物的所有遺傳材料。根據(jù)本發(fā)明，天然核苷酸的任何變異也被認(rèn)為是“天然的”。在這個(gè)方面，“天然的”核酸也可從植物或其性親和植物種中分離，并被修飾或突變使得得到的變體在核苷酸序列上與從植物中分離的未被修飾的天然核酸有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％的相似性。天然核酸變種在核苷酸序列上也可能有少于約60％，少于55％，或少于50％的相似性。
從植物中分離的“天然的”核酸也編碼從該核酸中轉(zhuǎn)錄和翻譯的天然存在的蛋白產(chǎn)物的變體。因此，天然的核酸可能編碼與在分離的核酸來(lái)源的植物中所表達(dá)的未修飾的天然蛋白，在氨基酸序列上有高于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、或60％相似性的蛋白。
天然存在的核酸這個(gè)短語(yǔ)意思是核酸存在于所選植物種的基因組內(nèi)，并可能是DNA分子或RNA分子?？蓪⒄５脑谥参锓N的基因組中存在的限制性酶切位點(diǎn)改造成為外源性的DNA分子，如載體或寡核苷酸，即使該限制性酶切位點(diǎn)在物理上不是從該基因組中分離的。因此，本發(fā)明允許合成產(chǎn)生核苷酸序列，如限制性酶識(shí)別序列，只要該序列天然存在于所選植物種的基因組中，或者存在于與將要轉(zhuǎn)化的所選植物種性親和的植物中。
可操作地連接以這樣的方式結(jié)合兩個(gè)或更多的分子，使得它們?cè)谥参锛?xì)胞中聯(lián)合起來(lái)正確地行使功能。例如，當(dāng)啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，將啟動(dòng)子可操作地連接到結(jié)構(gòu)基因上。
P-DNA根據(jù)本發(fā)明，P-DNA(“植物DNA”)分離自植物基因組并且在每個(gè)末端，或僅在一個(gè)末端，包括T-DNA邊緣樣序列。邊緣樣序列優(yōu)選與土壤桿菌菌種，如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根植物單胞菌的T-DNA邊緣序列有至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少90％，或至少95％，但小于100％的序列同一性。因此，可用P-DNAs代替T-DNAs將土壤桿菌的核苷酸序列轉(zhuǎn)移到另一個(gè)多核苷酸序列中?？尚揎桺-DNA以便于克隆，并應(yīng)當(dāng)優(yōu)選不天然編碼蛋白或蛋白的一部分。P-DNA的特點(diǎn)是其在每個(gè)末端含有至少一個(gè)被稱作“P-DNA邊緣序列”或“P-DNA邊緣樣序列”的邊緣序列，上述兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換。參見上面“邊緣序列”和“邊緣樣”的定義。P-DNA也可被看作是“T-DNA樣”序列，見下面的定義。
植物包括被子植物和裸子植物如馬鈴薯、番茄、煙草、苜蓿、萵苣、胡蘿卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草坪草、小麥、水稻、大麥、高梁、燕麥、橡樹、桉樹、胡桃和棕櫚。因此，植物可以是單子葉或雙子葉的。這里使用的詞“植物”也包括植物細(xì)胞、種子、植物子代、不管是有性還是無(wú)性產(chǎn)生的繁殖體、以及這些中的任何一個(gè)的后代，如插條或種子。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、胼胝體、胚、分生組織區(qū)、胼胝組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物可能處于成熟期的各種階段，并且可以在液體或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或者在土壤或在花盆、溫室或田間合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在植物中引入的前導(dǎo)序列、尾隨序列或基因序列的表達(dá)可能是短暫的或是持久的?！八x植物種”可以是，但不限于這些“植物”中的任何一個(gè)的物種。
精確育種是指通過(guò)將核酸，如從所選植物種、或從與所選植物種相同的另一個(gè)植物、或從與所選植物種性親和的種中分離的天然基因和調(diào)節(jié)元件被穩(wěn)定地引入單個(gè)植物細(xì)胞中，隨后將這些遺傳修飾的植物細(xì)胞再生成整個(gè)植物以改善植物的方法。由于沒有將未知的或外源核酸永久地?fù)饺氲街参锘蚪M中，因此本發(fā)明的技術(shù)利用也通過(guò)常規(guī)植物育種獲得的相同的遺傳材料。
植物種屬于顯示至少某些性親和性的各種正式命名的植物組。
植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)廣義地是指遺傳修飾植物細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到合適的植物培養(yǎng)基中以維持、進(jìn)一步生長(zhǎng)、和/或進(jìn)一步發(fā)育的方法。
重組如這里使用的，該術(shù)語(yǔ)廣義地描述為賴以克隆基因、可進(jìn)行DNA測(cè)序以及可生產(chǎn)蛋白產(chǎn)物的各種技術(shù)。如這里使用的，該術(shù)語(yǔ)也描述為在將基因轉(zhuǎn)移到植物宿主系統(tǒng)的細(xì)胞中后所生產(chǎn)的蛋白。
選擇性標(biāo)記“選擇性標(biāo)記”典型地是編碼能賦予某種對(duì)抗生素、除草劑或有毒化合物的抗性的蛋白并且用于鑒定轉(zhuǎn)化事件的基因。選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括編碼對(duì)鏈霉素有抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(spt)基因、將甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi)基因、編碼卡那霉素和遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因、編碼對(duì)潮霉素有抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因，編碼對(duì)磺酰脲類除草劑有抗性的乙酰乳酸合酶(als)基因、編碼抑制谷氨酰胺合成酶如膦絲霉素或basta(例如，bar基因)作用的對(duì)除草劑有抗性的基因，或者現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它類似的基因。
有義抑制通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物中該基因的全部或部分基因的一個(gè)或更多個(gè)額外拷貝的表達(dá)來(lái)減少內(nèi)源基因的表達(dá)。
T-DNA樣“T-DNA樣”序列是從所選植物種，或從與所選植物種性親和的植物中分離的核酸，其與土壤桿菌種的T-DNA有至少75％，80％，85％，90％，或95％，但不是100％的序列同一性。T-DNA樣序列可包含一個(gè)或更多個(gè)邊緣或邊緣樣序列，其中每一個(gè)序列都能將核苷酸序列整合到另一個(gè)多核苷酸中。這里使用的“P-DNA”是T-DNA樣序列的一個(gè)實(shí)例。
尾隨序列在基因之后(或3’端)的轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列。
轉(zhuǎn)錄的DNA包含基因以及與該基因相關(guān)的非翻譯的前導(dǎo)序列和尾隨序列的DNA，通過(guò)前面的啟動(dòng)子的作用它被轉(zhuǎn)錄成單個(gè)mRNA。
轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子本發(fā)明的表達(dá)載體典型地在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)的相對(duì)端具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。可選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)用于穩(wěn)定mRNA以提高表達(dá)和/或用于將聚腺苷酸尾添加到基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上(Alber &Kawa saki，Mol.& Appl.Genetics 419-34，1982)。用作舉例說(shuō)明的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)包括豌豆RBCS基因的E9序列(Mogen等，Mol.CellBiol.，125406-14，1992)和各種泛素基因的終止信號(hào)。
植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將DNA穩(wěn)定地整合到植物細(xì)胞的基因組中的方法?！胺€(wěn)定地”是指細(xì)胞基因組內(nèi)的和通過(guò)細(xì)胞基因組的多核苷酸的持久的或非短暫的保留和/或表達(dá)。因此，穩(wěn)定地整合的多核苷酸是一種在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞基因組內(nèi)作為固定物的多核苷酸，并且可通過(guò)細(xì)胞或所得的轉(zhuǎn)化植物的相繼的子代被復(fù)制和增殖。轉(zhuǎn)化可以在天然條件下或使用現(xiàn)有技術(shù)中各種公知方法的人工條件下發(fā)生。轉(zhuǎn)化可能依賴于將核酸序列插入到原核或真核宿主細(xì)胞中的任何已知方法，包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案、病毒感染、頸須噬菌體、電穿孔、熱休克、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、聚乙二醇處理、顯微注射以及粒子轟擊。
轉(zhuǎn)基因?qū)⒈徊迦氲剿拗骰蚪M中的包括蛋白編碼區(qū)的基因。在本發(fā)明的上下文中，從宿主基因組中分離包含轉(zhuǎn)基因的元件。
轉(zhuǎn)基因植物含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因的遺傳修飾的植物。
使用本發(fā)明設(shè)想使用不同于將要轉(zhuǎn)化的所選植物種的物種的核酸以便于將天然的遺傳元件整合到所選植物的基因組中，只要這樣的外源核酸不被穩(wěn)定地整合到相同的宿主植物基因組中。例如，天然的遺傳元件被克隆、定位或操縱到其中的質(zhì)粒、載體或克隆構(gòu)建物可以來(lái)自與天然的遺傳元件來(lái)源不同的物種。
變體這里使用的“變體”應(yīng)被理解為意指偏離特定基因或蛋白的標(biāo)準(zhǔn)的或給定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“同工型”、“同種型”和“類似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“變異”形式。通過(guò)一個(gè)或更多氨基酸的添加、除去或取代而改變的氨基酸序列或者核苷酸序列的變化，可被認(rèn)為是“變體”序列。變體可以具有“保守的”改變，其中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如，用異亮氨酸代替亮氨酸。變體可具有“非保守的”改變，例如用色氨酸代替甘氨酸。相似的較小的變異也可以包括氨基酸的缺失或插入，或者兩者都有。使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的計(jì)算機(jī)程序，如載體NTI程序組(InforMax，MD)軟件可以發(fā)現(xiàn)在決定哪個(gè)氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失方面的指導(dǎo)。
因此應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這里描述的特定的方法學(xué)、方案、載體和試劑等，因?yàn)檫@些可以變化。也應(yīng)當(dāng)理解，這里使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。必需注意到這里和在所附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的“一”，“一個(gè)”以及“所述的”包括復(fù)數(shù)關(guān)系，除非上下文清楚地要求其它含義。因此，例如，提及“基因”是指涉及一個(gè)或更多基因，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。實(shí)際上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用這里描述的方法在植物宿主系統(tǒng)中表達(dá)任何天然的基因(目前或隨后已知的)。
P-DNA載體將重組DNA摻入到植物細(xì)胞中的優(yōu)選方法是土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。根據(jù)本發(fā)明，開發(fā)雙載體以產(chǎn)生僅含有天然的馬鈴薯核酸的遺傳修飾的馬鈴薯植株。這種載體在三個(gè)方面不同于常規(guī)的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化載體(1)本發(fā)明的載體不含有用T-DNA邊緣描繪的土壤桿菌來(lái)源的T-DNA序列，而含有兩側(cè)為邊緣樣序列的天然植物的DNA(P-DNA)片段，盡管邊緣樣序列在結(jié)構(gòu)和功能上不同于T-DNA邊緣，但是它們支持將P-DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，(2)本發(fā)明載體的主鏈可以含有標(biāo)記，如果將其整合到植物細(xì)胞的基因組中，該標(biāo)記會(huì)阻止這些細(xì)胞發(fā)育成成熟的植物，以及(3)本發(fā)明的載體在P-DNA末端之間不含有外源的選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明令人驚奇地表明，兩側(cè)是邊緣樣序列的P-DNA片段支持DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。通過(guò)使用基于馬鈴薯P-DNA末端和常規(guī)T-DNA邊緣之間的同源性所設(shè)計(jì)的引物，可從任何植物的基因組中分離P-DNA。接著檢驗(yàn)這些片段，如果有效，剮用于轉(zhuǎn)化僅含有天然DNA的植物。也可以使用程序，如“blastn”來(lái)搜索植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以尋找含有與T-DNA邊緣具有同源性的區(qū)域的DNA片段(Altschul等，J Mol Biol 215403-10，1990)。接著可以修飾經(jīng)過(guò)鑒定的P-DNAs以提高它們的效用。例如，可刪除分離的P-DNAs的內(nèi)部片段并可添加限制性酶切位點(diǎn)以便于克隆。在末端序列引入點(diǎn)突變也可能是有效的，它使得P-DNA在轉(zhuǎn)移DNA中更有效。
可在P-DNA邊緣樣序列之間插入任何基因表達(dá)盒。對(duì)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，這樣的表達(dá)盒可以由可操作地連接到馬鈴薯的基因和/或與該基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨序列上的馬鈴薯啟動(dòng)子以及隨后的馬鈴薯終止子構(gòu)成。表達(dá)盒可以含有另外的馬鈴薯遺傳元件，如符合讀框的融合到基因5’-末端的信號(hào)肽序列，以及可置于，例如啟動(dòng)子和興趣基因之間以提高表達(dá)的馬鈴薯內(nèi)含子。對(duì)于用修飾的P-DNA轉(zhuǎn)化小麥，在小麥P-DNA中插入的所有遺傳元件，包括P-DNA本身都來(lái)自小麥或與小麥性親和的植物種。
另一個(gè)分離P-DNAs的方法是通過(guò)產(chǎn)生土壤桿菌菌株文庫(kù)，其含有隨機(jī)的植物DNA片段而不是兩側(cè)為選擇性標(biāo)記基因的T-DNA?？梢詫⒂眠@種文庫(kù)感染的外植體置于含有適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的增殖培養(yǎng)基上，以鑒定支持將標(biāo)記基因從土壤桿菌中的載體轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的P-DNAs。
在轉(zhuǎn)化過(guò)程期間可能不僅天然修飾的P-DNA，而且另外的質(zhì)粒序列也從土壤桿菌被共同轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，這是一個(gè)不期望要的過(guò)程，因?yàn)檫@樣的質(zhì)?！爸麈湣毙蛄写矸侵参锏耐庠碊NA，如細(xì)菌DNA。本發(fā)明阻止含有主鏈序列的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞發(fā)育形成成熟的植物。因此，本發(fā)明使得在再生枝條期間區(qū)別含主鏈和不含主鏈的轉(zhuǎn)化事件成為可能。
選擇或篩選抗主鏈整合的事件的方法依賴于在載體的主鏈上，在P-DNA之外是否存在標(biāo)記，如異戊烯磷酸轉(zhuǎn)移酶(IPT)基因的表達(dá)盒。一旦主鏈整合了，IPT誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素的累積將改變轉(zhuǎn)化的枝條的性狀，并且阻止這些枝條生長(zhǎng)出根。可以使用能改變轉(zhuǎn)化的植物的葉、根、莖的性狀、質(zhì)地或顏色、高度或某些其它形態(tài)特征的任何其它基因來(lái)代替IPT基因用于篩選和/或選擇抗主鏈整合的事件。這樣的基因在這里被稱為“主鏈整合標(biāo)記”。因此，已知顯示可歸因于主鏈整合標(biāo)記基因表達(dá)的改變了形態(tài)特征的轉(zhuǎn)化植物除了含有期望的P-DNA外，在其基因組中還含有外源DNA。相應(yīng)地，具有與主鏈整合標(biāo)記相關(guān)的表型的植株是不期望要的。
本發(fā)明不限于僅使用IPT基因作為主鏈整合標(biāo)記；可以這種方式使用其它的基因。例如，主鏈整合標(biāo)記可以是土壤桿菌的反玉米素(transzeatine)合酶(TZS)基因(Krall等，F(xiàn)EBS Lett 527315-8，2002)或隱性的擬南芥屬(Arabidopsis)基因hocl(Catterou等，Plant J 30273-87，2002)。在本發(fā)明中，這種方法比一些在載體主鏈序列中插入毒性基因的方法更易于應(yīng)用。例如，參見EP 1009,842。
通過(guò)將主鏈整合標(biāo)記基因，如功能性細(xì)胞分裂素基因置于P-DNA的上游或下游，易于區(qū)別轉(zhuǎn)化事件。丟棄顯示改變了形態(tài)特性的轉(zhuǎn)化植株，因?yàn)樗鼈兒姓系交蚪M中的非天然的DNA序列。
另一種鑒定僅用天然DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的策略是使用聚合酶鏈反應(yīng)。通過(guò)使用特異性設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)主鏈序列的引物，可以鑒定和丟棄除了P-DNA外還含有外源主鏈序列的植物?？梢噪S后使用其它的引物組以進(jìn)一步證實(shí)是否完整地轉(zhuǎn)移了P-DNA。因此，通過(guò)使用基因的表達(dá)以改變植物的形態(tài)特性，或通過(guò)篩選在轉(zhuǎn)化植物中穩(wěn)定整合的外源DNA，可以鑒定和選擇僅用天然DNA序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株。
可以將特定宿主植物的遺傳元件插入到能在大腸桿菌和土壤桿菌兩者中復(fù)制的雙載體的P-DNA序列中?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔、三親株交配或熱休克處理而將得到的載體引入到被繳械的(disarmed)土壤桿菌菌株如LBA4404中。接著可通過(guò)整個(gè)植株或外植體的感染將新的菌株用于轉(zhuǎn)化單個(gè)的植物細(xì)胞。
可以將特定宿主植物的遺傳元件插入到能在大腸桿菌(E.coli)和土壤桿菌兩者中復(fù)制的雙載體的P-DNA序列中?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔、三親株交配或熱休克處理而將得到的載體引入到土壤桿菌菌株如LBA4404中。接著可通過(guò)整個(gè)植株或外植體的感染將新的菌株用于轉(zhuǎn)化單個(gè)的植物細(xì)胞。LBA4404含有被繳械的Ti-質(zhì)粒pAL4404，其帶有毒性作用基因和鏈霉素抗性基因。
LifeSupport載體盡管將細(xì)菌標(biāo)記基因穩(wěn)定地整合到植物細(xì)胞的基因組中便于轉(zhuǎn)化事件的鑒定，但是對(duì)植物基因組的這樣修飾是不期望要的，因?yàn)闃?biāo)記基因代表外源DNA。可通過(guò)發(fā)展新的基于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法來(lái)避免使用外源的標(biāo)記基因。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是依靠使用兩個(gè)土壤桿菌菌株的一種新方法一個(gè)菌株含有具有在植物細(xì)胞核中用于短暫表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因的雙載體，另一個(gè)菌株含有具有在植物基因組中用于穩(wěn)定整合的實(shí)際的興趣序列的P-DNA(見實(shí)施例7)。
一旦用土壤桿菌菌株進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染，那么一些植物細(xì)胞將接收到具有標(biāo)記基因的T-DNA以及具有興趣序列的P-DNA。沒有隨后通過(guò)將感染的外植體長(zhǎng)時(shí)間置于適當(dāng)?shù)目股刂衼?lái)選擇標(biāo)記基因的穩(wěn)定整合，而是僅將外植體短暫地暴露于抗生素中。這樣，所有短暫表達(dá)的標(biāo)記的基因的植物細(xì)胞將存活。因?yàn)橛捎趦?nèi)源核酸醇的活性，在絕大多數(shù)實(shí)例中T-DNAs將降解而不是穩(wěn)定地整合到它們宿主的基因組中，所以這里顯示在短暫選擇中存活的大多數(shù)植物細(xì)胞都發(fā)育成缺乏標(biāo)記基因的枝條。此外，本發(fā)明表明這些無(wú)標(biāo)記枝條中的相當(dāng)多的一部分含有穩(wěn)定整合的P-DNAs。
有許多提高無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化效率的工具。首先，本發(fā)明表明可以通過(guò)用兩個(gè)分別帶有T-DNA/標(biāo)記和P-DNA/興趣序列的土壤桿菌菌株感染外植體來(lái)增大這種頻率。首先用P-DNA菌株感染外植體，約4到6小時(shí)后用T-DNA菌株感染。
第二，可以修飾T-DNA菌株以表達(dá)Q突變的virD2基因。修飾的virD2蛋白將仍然支持將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核中，但是限制隨后的T-DNAs的基因組整合的效率(Shurvinton等，Proc Natl AcadSci USA，8911837-11841，1992；Mysore等，Mol Plant MicrobeInteract，11668-683，1998)。最優(yōu)選的表達(dá)修飾的virD2基因的方法是通過(guò)在T-DNA載體的主鏈中插入受vitD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ω突變的virD2基因。
第三，可通過(guò)將端粒序列插入T-DNA的左邊緣和右邊緣序列附近來(lái)進(jìn)一步減少穩(wěn)定的T-DNA整合(Chiuazzi & Signer，Plant Mol.Biol.，26923-934，1994)。
第四，可以增大帶有標(biāo)記基因的T-DNA區(qū)的尺寸以提高T-DNAs和P-DNAs共同移進(jìn)植物細(xì)胞核中的頻率，并且減少T-DNA的基因組整合的頻率。
第五，也可以通過(guò)使用攜帶兩個(gè)分別具有T-DNA和P-DNA的親和性雙載體的單個(gè)土壤桿菌菌株來(lái)提高T-DNAs和P-DNAs共同移進(jìn)植物細(xì)胞核中的頻率。兩個(gè)親和性的雙載體的實(shí)例是pSIM 1301來(lái)源的載體和pBI121來(lái)源的載體。
因?yàn)槎虝罕磉_(dá)的標(biāo)記基因通常將不整合到植物基因組中，所以不必這個(gè)基因和其調(diào)節(jié)序列兩者都代表天然DNA。實(shí)際上，使用外源調(diào)節(jié)序列以促進(jìn)感染的植物細(xì)胞中高水平的短暫的基因表達(dá)可能是有利的。本發(fā)明的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是含有GUS基因，隨后是酵母醇脫氫酶1(ADH1)終止子的表達(dá)盒在馬鈴薯細(xì)胞中高水平地短暫表達(dá)。然而，具有酵母CYC1終止子的相似的構(gòu)建物不能充分地起作用。也可以通過(guò)將標(biāo)記基因可操作地連接到非天然的啟動(dòng)子上來(lái)提高短暫的表達(dá)水平。這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例是，例如合成的啟動(dòng)子如糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Mori等，Plant J.，2779-86，2001；Bohner等，Mol.Gen.Genet.，264860-70，2001)、非天然的啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒和玄參花葉病毒的35S啟動(dòng)子，以及真菌的啟動(dòng)子。
作為上面描述的使用兩株土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法的可供替代的方法，也可以用包含具有天然標(biāo)記基因和感興趣的實(shí)際序列兩者的P-DNA的單個(gè)菌株來(lái)轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明表明可以使用耐鹽性基因作為轉(zhuǎn)化的天然標(biāo)記。這樣的耐鹽性基因包括擬南芥屬基因SOS1(Shi等，Nat Biotechnol.，2002)、AtNHX1(Apse等，Science，2851256-8，1999)、Avpl(Gaxiola等，Proc Natl Acad Sci USA，9811444-9，2001)以及CBF3(Kasuga等，Natl Biotechnol.17287-91，1999)的農(nóng)作物同系物。
通過(guò)本發(fā)明的精確育種方法學(xué)完成的遺傳元件的重排也可以通過(guò)遺傳重組的方法自發(fā)地發(fā)生。例如，所有植物都含有可以從一個(gè)染色體位置轉(zhuǎn)座到另一個(gè)染色體位置的元件。通過(guò)插入到啟動(dòng)子或基因中，這樣的轉(zhuǎn)座因子可提高、改變和/或減少基因的表達(dá)。例如，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因P-wr的啟動(dòng)子中插入玉米增變?cè)腁Mu4導(dǎo)致有條紋的紅果皮。在葉特異性的MADS盒基因ZMM19的啟動(dòng)子中插入相同的元件導(dǎo)致這種基因在玉米花序中的表達(dá)，導(dǎo)致穎片的葉狀延長(zhǎng)以及雄性和雌性花序中的其它改變，導(dǎo)致豆英谷物的非常令人滿意的表型。由于其奇特的雄花花穗和谷穗，豆英谷物對(duì)于某些土著美洲部落來(lái)說(shuō)具有宗教意義。許多基因也通過(guò)其它轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的修飾如倒位、缺失、添加以及異位重組而進(jìn)行重排。(Bennetzen，Plant Mol Biol42251-69，2000)。此外，植物DNA重排經(jīng)常通過(guò)基因內(nèi)的重組過(guò)程而發(fā)生。例如，通過(guò)重組在抗特異病原體的抗性中所涉及的基因，植物能夠產(chǎn)生具有新的特異性的抗性基因，并且因此與它們的病原體協(xié)同進(jìn)化(Ellis等，Trends Plant Sci 5373-9，2000)?；騼?nèi)重組的另一個(gè)實(shí)例涉及植物如何繁殖通過(guò)重組在自交不親和性中涉及的基因而使植物從異體受精過(guò)渡到自體受精(Kusaba等，Plant Cell13627-43，2001)。其它促進(jìn)基因組進(jìn)化的方法包括，例如，染色體斷裂和染色體間的重組。
提高植物和糧食作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為了通過(guò)精確育種來(lái)修飾農(nóng)作物的消極特性，如加工期間的丙烯酰胺累積、糖苷生物堿累積、不想要的高級(jí)糖化產(chǎn)物的累積、CIPC的累積、低水平的抗性淀粉、傷痕易感性、冷誘導(dǎo)的變甜、對(duì)疾病的易感性、低產(chǎn)量和低質(zhì)量，將至少一種特異性的表達(dá)盒摻入到宿主的基因組中。使用三種不同的方法來(lái)除去消極特性(1)過(guò)量表達(dá)阻止消極特性發(fā)生的基因，(2)為了用非功能性的蛋白將野生型的基因產(chǎn)物滴定出來(lái)，過(guò)量表達(dá)與消極特性相關(guān)的基因的突變形式，以及(3)通過(guò)表達(dá)與該基因相關(guān)的在正義和/或反義方向上的前導(dǎo)或尾隨序列片段的至少一個(gè)拷貝，使與消極特性相關(guān)的特異性基因沉默。
在馬鈴薯中與消極特性相關(guān)并在體外可被修飾使其編碼非功能蛋白的內(nèi)源基因的一個(gè)實(shí)例是多酚氧化酶(PPO)基因。一旦受到?jīng)_擊損傷，從質(zhì)粒中釋放的PPO基因產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(Koussevitzky等，J.Biol.Chem.，27327064-9，1998)，其中該基因產(chǎn)物將節(jié)導(dǎo)酚的氧化而產(chǎn)生各種苯氧基自由基和醌型衍生物，這些物質(zhì)是有毒的和/或最終形成想要的聚合物在農(nóng)作物中留下深色變色，或“黑斑”。
過(guò)度表達(dá)含有無(wú)功能的結(jié)合銅的結(jié)構(gòu)域的突變PPO基因可降低主要在塊莖和相關(guān)的器官如芽中表達(dá)的所有PPO基因的活性。突變使得多酚氧化酶蛋白失活，因?yàn)槠洳荒芙Y(jié)合銅。技術(shù)人員知道在什么位置進(jìn)行點(diǎn)突變，如果是這樣的話，那將損害基因產(chǎn)物的功能。申請(qǐng)人通過(guò)將馬鈴薯的PPO蛋白序列和甘薯PPO的蛋白序列進(jìn)行對(duì)比而鑒定了馬鈴薯PPO中的結(jié)合銅的結(jié)構(gòu)域(Klabunde等，Nat Struct.Biol.，51084-90，1998)。保守的區(qū)域，特別是那些在銅結(jié)合位點(diǎn)上含有保守的組氨酸的區(qū)域是使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物失活的靶。因?yàn)樵谶@樣的器官中PPO活性的幾乎完全缺乏可消極地影響植物抵抗病原體的能力，所以本發(fā)明也描繪了僅降低除了表皮之外的主要在成熟塊莖的所有部分中都表達(dá)的特異性PPO基因的改進(jìn)方法。由于通過(guò)使用與該基因相關(guān)的尾隨序列使這種特異性的PPO基因的沉默不能減少塊莖表皮中的PPO表達(dá)，因此將塊莖的該部分幾乎全部直接地暴露于試圖感染的病原體中。
通過(guò)PPO基因誘導(dǎo)的酶促褐變不僅降低馬鈴薯塊莖的質(zhì)量，其也消極地影響作物食品如小麥、鱷梨、香蕉、萵苣、蘋果以及梨。
與消極特性相關(guān)并且能夠通過(guò)使用與這些基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨序列而被沉默的其它基因包括R1基因和L型磷酸化酶基因。在淀粉降解成還原糖，如葡萄糖和果糖中涉及這兩個(gè)基因，還原糖一旦被加熱就參與美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生有毒產(chǎn)物如丙烯酰胺。本發(fā)明表明，通過(guò)降低R1或磷酸化酶的活性而減少冷誘導(dǎo)的變甜導(dǎo)致減少馬鈴薯油炸加工期間的非酶促褐變以及丙烯酰胺的累積。
本發(fā)明也表明在遺傳修飾的作物中過(guò)度表達(dá)某些天然基因的用途。通過(guò)在馬鈴薯中過(guò)度表達(dá)新分離的液泡轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因來(lái)降低蔗糖向還原糖的轉(zhuǎn)化，顯著地減少了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物如丙烯酰胺的水平。
本發(fā)明也預(yù)言顯示轉(zhuǎn)化酶抑制劑表達(dá)水平提高或者R1或磷酸化酶表達(dá)水平降低的馬鈴薯塊莖將不需要在貯藏前用化學(xué)發(fā)芽抑制劑如CIPC徹底處理，因?yàn)樗鼈兘档偷倪€原糖水平將(1)推遲發(fā)芽，和(2)允許在較低的溫度下貯藏，因而進(jìn)一步推遲發(fā)芽。極度降低的CIPC殘余水平或者缺乏進(jìn)一步提高了含有上述某種修飾的P-DNAs植物來(lái)源的加工食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
因此，來(lái)源于含有修飾的P-DNA塊莖的法國(guó)油炸食品或油煎土豆片將含有劇烈降低的CIPC殘余水平，進(jìn)一步提高它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
同時(shí)下調(diào)馬鈴薯塊莖中PPO以及R1或磷酸化酶基因表達(dá)的影響是協(xié)同的，因?yàn)椴粌H通過(guò)美拉德反應(yīng)的非酶促褐變，而且PPO酶介導(dǎo)的褐變也需要還原糖。因此，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中還原糖水平的降低也將限制PPO的活性以及對(duì)黑斑傷痕的易感性。因此，PPO、R1和磷酸化酶基因和/或與這些基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨序列代表可被分離、修飾以及再引入回植物中以下調(diào)這些基因的表達(dá)的興趣DNA片段。
除了開發(fā)傷痕抗性和降低的冷誘導(dǎo)變甜，通過(guò)不使用外源DNA的精確育種可以引入許多其它特性。例如，可以從野生型馬鈴薯種中分離疾病的抗性基因并插入對(duì)疾病易感的品種的基因組中。
修飾的植物和作物的環(huán)境效益如上面描述，R1或磷酸化酶的水平降低導(dǎo)致淀粉磷酸化的降低。這種淀粉磷酸化的降低導(dǎo)致馬鈴薯塊莖的磷酸含量降低90％(Vikso-Nielsen，Biomacromolecules，2836-43，2001)。這將導(dǎo)致馬鈴薯加工工廠廢水中的磷酸水平的降低，其現(xiàn)在約為25-40mg/L。因此，使用低磷酸的塊莖將減少釋放進(jìn)入環(huán)境中的磷酸而有助于保護(hù)重要的生態(tài)系統(tǒng)。此外，對(duì)于最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，低磷酸馬鈴薯可能需要用較少的磷酸施肥，其通過(guò)推遲可用磷酸資源的消耗而支持可更持續(xù)的農(nóng)業(yè)。
提高植物和糧食作物的農(nóng)業(yè)特性除了兩個(gè)重要的加工特性，即減少傷痕易感性和冷變甜之外，本發(fā)明也提供了逐漸重要的輸入特性，即耐鹽性。在本發(fā)明中描述的一些修飾的P-DNA構(gòu)建物含有耐鹽性基因作為轉(zhuǎn)化的天然標(biāo)記。重要地是，這個(gè)基因的效用不限于轉(zhuǎn)化方法中的篩選步驟。馬鈴薯植株中耐鹽性基因的過(guò)度表達(dá)能減少高鹽度土壤水平所誘導(dǎo)的脅迫癥狀，并將使在百分率正在增長(zhǎng)的含鹽度水平超過(guò)最大值2毫姆歐/厘米電導(dǎo)率水平的農(nóng)業(yè)土地上長(zhǎng)出含有修飾的P-DNA的新品種成為可能，該電導(dǎo)率水平是生長(zhǎng)常規(guī)品種的最適條件。
使用從所選植物種或從與所選植物種性親和的種中分離的調(diào)節(jié)元件一旦從感興趣的植物種中分離出前導(dǎo)序列、基因或尾隨序列并可任選地修飾，那么可將其可操作地連接到植物的啟動(dòng)子或類似的調(diào)節(jié)元件上用于在植物中適當(dāng)表達(dá)。調(diào)節(jié)元件如這些在特異性的組織中或以某種水平或在特定的時(shí)間用于表達(dá)與感興趣的基因相關(guān)的非翻譯序列。
取決于在修飾特性中所涉及的策略，可能必需限制對(duì)植物的特定區(qū)域的沉默。正常驅(qū)使內(nèi)源基因表達(dá)的啟動(dòng)子可能不適合組織特異性的表達(dá)。如在上面部分中描述的，細(xì)菌或病毒調(diào)節(jié)元件，如花椰菜花葉病毒的35S“超級(jí)”啟動(dòng)子的穩(wěn)定整合可導(dǎo)致無(wú)法預(yù)計(jì)的和不想要的事件。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面使用從所選的宿主植物種中分離的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，將與R1、磷酸化酶以及PPO基因相關(guān)的前導(dǎo)或尾隨序列可操作地連接到與顆粒結(jié)合的淀粉合酶基因的啟動(dòng)子上，為的是在馬鈴薯(S.tuberosum)中應(yīng)用(Rohde等，JGen& Breed，44，311-315，1990)。這種啟動(dòng)子經(jīng)常被其他人用于驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)并且在馬鈴薯塊莖中格外有活性(van der Steege等，PlantMol Biol，2019-30，1992；Beaujean等，Biotechnol.Bioeng，709-16，2000；Oxenboll等，Pro Natl Acad Sci USA，97639-44，2000)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，也可以將這種啟動(dòng)子用于修飾的R1、磷酸化酶以及PPO基因的前導(dǎo)或尾隨序列的表達(dá)。
或者，可將其它馬鈴薯啟動(dòng)子可操作地連接到馬鈴薯的興趣序列上。這樣的啟動(dòng)子包括在馬鈴薯塊莖中促進(jìn)表達(dá)的馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子(Bevan等，Nucleic Acid Res，144625-38，1986)，或其片段、馬鈴薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利No.5,932,783)以及泛素基因的啟動(dòng)子(Garbarino等，PlantPhysiol，1091371-8，1995)。
也可通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和在構(gòu)建物中可操作地連到目的多核苷酸上的調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)前導(dǎo)和/或尾隨序列的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括那些對(duì)溫度敏感的啟動(dòng)子，如熱或冷休克啟動(dòng)子。例如馬鈴薯ci21A-和C17-啟動(dòng)子是冷誘導(dǎo)的(Kirch等，Plant Mol Biol，33897-909，1997；Schneider等，Plant Physiol，113335-45，1997)。
可以使用對(duì)某些物質(zhì)象抗生素、其它化學(xué)物質(zhì)或pH應(yīng)答的其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，已知脫落酸和赤霉酸影響植物細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH等(and in so doing)，調(diào)節(jié)Rab 16A基因和α淀粉酶1/6-4啟動(dòng)子(Heimovaara-Dijkstra等，Plant Mol Biol，4815-20，1995)。已知脫落酸、創(chuàng)傷和茉莉酮酸甲酯也誘導(dǎo)馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Lorberth等，Plant J，2477-86，1992)。
在另一個(gè)實(shí)例中，一些核苷酸序列在時(shí)序控制下，僅在植物的某個(gè)發(fā)育階段期間或在一天中的某個(gè)時(shí)間期間被激活而表達(dá)下游序列。例如，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rbcS)基因的小亞單位的馬鈴薯啟動(dòng)子可指導(dǎo)細(xì)胞特異的光調(diào)控的表達(dá)(Fritz等，Proc Natl AcadSci USA，884458-62，1991)。技術(shù)人員非常精通誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的這些典型類型。
在調(diào)節(jié)表達(dá)中使用某些聚腺苷酸化信號(hào)改變mRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性可能也是有效的。特別是，當(dāng)一些聚腺苷酸化信號(hào)可操作地連接到多核苷酸的3’末端時(shí)導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄本易于降解。
因此，可以通過(guò)將其可操作地與一個(gè)或更多個(gè)這樣的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)序列、3’聚腺苷酸化信號(hào)、3’非翻譯區(qū)、信號(hào)肽等連接而調(diào)控基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，如這里描述的那些，以及最終將被整合到植物基因組中的DNA序列和調(diào)節(jié)元件都是從將通過(guò)本發(fā)明的精確育種方法修飾的所選植物種的DNA中獲得。即，來(lái)源自、分離自和克隆自其它物種，如細(xì)菌、病毒、微生物、哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物以及性不親和的植物種的DNA序列和調(diào)節(jié)元件不被整合到轉(zhuǎn)化植物的基因組中。只要不將該外源DNA整合到植物基因組中，在本發(fā)明中可使用與所選植物種的基因組異源的DNA以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化構(gòu)建物。
本發(fā)明不僅提供通過(guò)整合從所選植物種，或從與所選植物種性親和的植物中獲得的DNA轉(zhuǎn)化植物種的方法，而且也提供可調(diào)控該DNA表達(dá)的方法。相應(yīng)地，可以通過(guò)如前面描述的，組織特異性的或某一其它策略來(lái)優(yōu)化某個(gè)序列的表達(dá)。
使用從所選植物種中分離的終止序列除了引發(fā)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件，天然的表達(dá)盒也需要位于轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)區(qū)3’-末端的終止轉(zhuǎn)錄的元件?？蓮南嗤蚧驈牟煌蛑蝎@得轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)?？梢赃x擇尤其用于穩(wěn)定mRNA以增強(qiáng)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
這種特別的元件，即所謂的“3’-非翻譯區(qū)”在轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定、定位和終止基因轉(zhuǎn)錄中很重要。在這個(gè)方面，本領(lǐng)域人員公知3’-非翻譯區(qū)可形成某種發(fā)夾環(huán)。相應(yīng)地，本發(fā)明預(yù)想可以將3’-非翻譯區(qū)可操作地連接到被克隆的多核苷酸的3’末端，以便可以將得到的mRNA轉(zhuǎn)錄本暴露于對(duì)由3’非翻譯區(qū)賦予的序列和結(jié)構(gòu)起作用的因子中。
可以從分離出啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)基因的植物種中亞克隆泛素基因的3’序列，并且插入到轉(zhuǎn)基因的下游以確保轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)終止。不管用哪一個(gè)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)使它們的表達(dá)，都可以將兩個(gè)典型的轉(zhuǎn)基因融合到馬鈴薯泛素基因(Ubi3)的終止序列上。
實(shí)施例實(shí)施例1P-DNAs的克隆這個(gè)實(shí)施例表明T-DNA邊緣序列對(duì)土壤桿菌是特異的。該實(shí)施例也顯示植物含有T-DNA邊緣樣序列，并且提供從馬鈴薯和小麥中分離的通過(guò)這樣的邊緣樣序列描繪的DNA片段的序列。
常規(guī)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使用土壤桿菌來(lái)源的T-DNAs作為將外源DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中的載體(Schilperoort等，美國(guó)專利4940838，1990)。盡管T-DNAs通常包括幾百個(gè)堿基對(duì)，用左邊緣(LB)和右邊緣(RB)重復(fù)序列描繪，但是它們可能也僅由這樣的邊緣序列構(gòu)成。T-DNA邊緣序列在DNA轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著極其重要的作用，因?yàn)樗鼈兤鹬鳛関irD2-催化的切割反應(yīng)的特異性的識(shí)別位點(diǎn)的作用。將與土壤桿菌的virD2和virE2形成復(fù)合體的釋放的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到經(jīng)常成功地整合到植物基因組中的植物細(xì)胞核中。用于外源DNA轉(zhuǎn)移的所有T-DNA邊緣序列都來(lái)自根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根植物單胞菌的胭脂氨酸和章魚氨酸菌株(表2)。這些邊緣序列和經(jīng)常位于土壤桿菌(Agrobacterium)DNA兩側(cè)的一些序列存在于成千的雙載體中，這些雙載體包括，例如pPAM(AY027531)、pJawohl(AF408413)、pYL156(AF406991)、pINDEX(AF294982)、pC1300(AF294978)、pBI121(AF485783)、pLH9000(AF458478)、pAC161(AJ315956)、BinHygTOp(Z37515)、pHELLSGATE(AJ311874)，pBAR-35S(AJ251014)、pGreen(AJ007829)、pBIN19(X77672)、pCAMBIA(AF354046)、pX6-GFP(AF330636)、pER8(AF309825)、pBI101(U12639)、pSKI074(AF218466)、pAJ1(AC138659)、pAC161(AJ315956)、pSLJ8313(Y18556)，以及pGV4939(AY147202)。最近，在chrysopine型Ti質(zhì)粒pTiChry5中鑒定了T-DNA邊緣序列的兩個(gè)同系物(Palanichelvam等，Mol Plant Microbe Interact 131081-91，2000)。左邊緣同系物與位于pTi15955的T-DNA中間的無(wú)活性的邊緣同系物相同。右邊緣同系物異常背離功能T-DNA的邊緣序列。因此這些同系物在支持將DNA從pTiChry5轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中不可能具有功能活性。
僅需要用天然DNA使轉(zhuǎn)化植物成為可能的新方法的開發(fā)，首先需要取代包括LB和RB的T-DNA。不幸的是，在包括那些由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center For Biotechnology Information)、基因組研究所(The Institute for Genomic Research)以及SANGER維護(hù)的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中高級(jí)BLAST搜索沒能鑒定出植物的任何邊緣序列。因此，必需考慮與T-DNA的邊緣序列相似，但不完全相同的植物DNA序列，在這里稱為“邊緣樣”(邊緣樣)序列。表2中顯示在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出的植物邊緣樣序列的實(shí)例。試圖用邊緣樣序列取代T-DNA邊緣序列的提議是因?yàn)檫吘壭蛄惺歉叨缺Ｊ氐?見表2)。在其它細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)如IncP、PC194，以及φX174的切口區(qū)中這些序列的大部分也是高度保守的，表明這些序列是綴合樣DNA轉(zhuǎn)移所必需的(Waters等，Proc Natl Acad Sci 881456-60，1991)。由于在關(guān)于對(duì)邊緣序列的要求上沒有可靠的數(shù)據(jù)，因此整個(gè)邊緣序列似乎在切割過(guò)程中很重要。試圖通過(guò)檢驗(yàn)邊緣突變體在支持DNA轉(zhuǎn)移中的效率來(lái)致力于這個(gè)問(wèn)題的單個(gè)研究是不可靠的，因?yàn)殛幮詫?duì)照似乎沒有恰當(dāng)?shù)仄鹱饔?van Haaren等，Plant Mol Biol 13523-531，1989)。此外，在這種研究的結(jié)果中沒有一個(gè)在分子學(xué)上被證實(shí)。盡管有這些擔(dān)心，但是也在表2中顯示了兩個(gè)可能有效的邊緣突變體。
在邊緣序列中，基于同源性，鑒定了T-DNA邊緣基序(表2)。盡管這種基序包括13,824個(gè)變體，這些變體中的許多變體在轉(zhuǎn)移DNA中可能沒有功能，或者可能是不適當(dāng)?shù)?，但是其代表T-DNA邊緣序列是什么樣或可能是什么樣序列的最寬泛可能的定義。接著用這種邊緣基序在公眾可得的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中使用“基序?qū)Ρ群退阉鞴ぞ摺?Bailey和Gribskov，Bioinformatics 1448-54，1998)以及“高級(jí)BLASTN”(“核苷酸錯(cuò)配罰分”＝-1；“期望值”＝105；Altschul等，Nuclei Acids Res 253389-3402，1997)搜索同系物。這些搜索在非土壤桿菌的生物中再次沒能鑒定出任何相同的匹配。
為了嘗試和提高分離出含有相當(dāng)于邊緣基序的邊緣樣序列的馬鈴薯DNA片段的幾率，從100個(gè)遺傳各異的登記號(hào)(所謂的“核心收集品”，由美國(guó)馬鈴薯基因庫(kù)提供，WI)中分離出DNA。這種DNA是混合的，并且用作使用各種寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)的模板，其中寡核苷酸被設(shè)計(jì)成退火到邊緣或邊緣樣序列上。對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行序列分析，接著用嵌套引物使用反向PCR進(jìn)一步證實(shí)序列。馬鈴薯DNA片段中特別感興趣的一個(gè)片段含有無(wú)任何主要的可讀框的新序列，其描繪為邊緣樣序列(表2)。這種片段的邊緣樣序列之一含有至少5個(gè)與T-DNA邊緣序列的錯(cuò)配；另一個(gè)邊緣樣序列含有至少2個(gè)錯(cuò)配。盡管兩個(gè)序列都含有與邊緣基序的一個(gè)錯(cuò)配，但是仍要檢驗(yàn)它們支持DNA轉(zhuǎn)移的能力。為了那個(gè)目的，通過(guò)內(nèi)部缺失首先將該片段的大小減少到0.4千個(gè)堿基對(duì)(SEQ ID NO.1)。得到的片段被稱為“P-DNA”(植物DNA)以區(qū)別于土壤桿菌來(lái)源的T-DNA。從馬鈴薯變種RussetRanger的基因組中分離類似的片段，但是不用于任何進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
基于P-DNA和T-DNA邊緣序列之間的差異，使用具有下列簡(jiǎn)并引物的延伸酶擴(kuò)增系統(tǒng)(Life Technologies)來(lái)分離小麥的P-DNA5’-GTTTACANHNBNATATATCCTGYCA-3’(Bor-F)(SEQ ID NO.56)和5’TGRCAGGATATATNVNDNTGTAAAC 3’(Bor-R)(SEQ ID NO.57)。得到的825個(gè)堿基對(duì)的片段顯示為SEQ ID NO.2，并用于取代常規(guī)雙載體的T-DNA。可通過(guò)在P-DNA末端之間插入GUS基因表達(dá)盒，并用含有所得載體的土壤桿菌(Agrobacterium)感染小麥來(lái)檢驗(yàn)這種構(gòu)建物的效率。
實(shí)施例2用P-DNA載體轉(zhuǎn)化煙草這個(gè)實(shí)施例表明，盡管P-DNA末端和T-DNA邊緣序列之間存在結(jié)構(gòu)(序列差異)和功能(轉(zhuǎn)化頻率)的差別，但是可以以與T-DNA類似的方式使用P-DNA以將DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到煙草細(xì)胞中。
通過(guò)除去常規(guī)雙載體pCAMBIA1301(Cambia，AU)的全部T-DNA區(qū)獲得可在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌兩者中維持的無(wú)T-DNA載體。這通過(guò)同時(shí)將pSIM1301的5.9kb SacII-SphI片段與使用寡核苷酸對(duì)從pCAMBIA1301中擴(kuò)增的兩個(gè)片段連接而完成，其中寡核苷酸對(duì)分別為5’CCGCGGTGATCACAGGCAGCAAC 3’(SEQ ID NO.58)和5’AAGCTTCCAGCCAGCCAACAGCTCCCCGAC 3’(SEQ ID NO.59)，以及5’AAGCTTGGCTACTAGTGCGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA 3’(SEQ ID NO.60)和5’GCATGCTCGAGATAGGTGACCACATACAAATGGACGAACGG 3’(SEQ IDNO.61)。
為了使篩選抗主鏈整合的事件成為可能，將包含被Ubi3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的土壤桿菌異戊烯轉(zhuǎn)移酶(IPT)基因和其后Ubi3終止子的表達(dá)盒(SEQ ID NO.3)作為2.6kbp SacII片段插入到上面描述的無(wú)T-DNA載體的主鏈中，產(chǎn)生pSIM100-OD-IPT。預(yù)期表達(dá)IPT基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞將累積細(xì)胞分裂素并長(zhǎng)成不能發(fā)育根的異常枝條。
將實(shí)施例1中描述的0.4kbP-DNA片段插入pSIM100-OD-IPT中以產(chǎn)生pSIM111(圖1；SEQ ID NO.4)。
為了檢驗(yàn)使用pSIM111是否能夠獲得含有P-DNAs(包括位于P-DNA末端之間的任何序列)而無(wú)另外載體主鏈的轉(zhuǎn)化植物，將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)的基因表達(dá)盒插入到pSIM111的P-DNA中產(chǎn)生pSIM108(圖1)。
通過(guò)比較pSIM108和含有具有常規(guī)T-DNA邊緣序列的修飾P-DNA的對(duì)照載體之間的轉(zhuǎn)化頻率，檢驗(yàn)P-DNA末端在支持DNA轉(zhuǎn)移中的效率。這種對(duì)照載體，稱為pSIM109，是通過(guò)用寡核苷酸對(duì)5’ACTAGTGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAGAG 3’(SEQ ID NO.62)和5’-AAGCTTTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACGAAG-3’(SBQ ID NO.63)擴(kuò)增含有NPTII基因表達(dá)盒的全部P-DNA而產(chǎn)生的。這些實(shí)施例中使用的第二個(gè)對(duì)照載體是常規(guī)的雙載體pBI121(基因庫(kù)登記號(hào)AF485783)，其含有在規(guī)則的T-DNA上插入的相同NPTII基因表達(dá)盒。根據(jù)如下方法將雙載體引入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞中。將感受態(tài)LB4404細(xì)胞(50μL)在37℃在存在1μg載體DNA的條件下溫育5分鐘，在液氮(約-196℃)中冷凍約15秒，在37℃再溫育5分鐘。添加1ml液體肉湯培養(yǎng)基(LB)后，經(jīng)處理的細(xì)胞在28℃生長(zhǎng)3小時(shí)，并平鋪于含有鏈霉素(100mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的LB/瓊脂上。接著從單個(gè)LBA4404克隆的過(guò)夜培養(yǎng)物中分離載體DNAs并通過(guò)限制性酶切分析檢查以確定是否存在完整的質(zhì)粒DNA。
通過(guò)使10倍稀釋的過(guò)夜生長(zhǎng)的LBA4404∷pSIM108細(xì)胞生長(zhǎng)5-6小時(shí)，在2,800RPM下離心15分鐘沉淀細(xì)胞，用補(bǔ)充了蔗糖(3％，pH 5.7)的MS液體培養(yǎng)基(Phytotechnology)沖洗細(xì)胞并在相同培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞到OD600nm為0.2進(jìn)行模型植物煙草的試驗(yàn)轉(zhuǎn)化。接著用懸液感染4周齡的體外生長(zhǎng)的煙草植株的葉外植體。將感染的煙草外植體在25℃在Percival生長(zhǎng)室(16小時(shí)光照)內(nèi)，在含有6g/L瓊脂的協(xié)同培養(yǎng)基(1/10MS鹽，3％蔗糖，pH5.7)上培養(yǎng)2天，隨后轉(zhuǎn)移到含有替卡西林-克拉維酸(150mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的M401/瓊脂培養(yǎng)基中。表3中顯示在接下來(lái)的4周內(nèi)每個(gè)外植體所產(chǎn)生的胼胝體的數(shù)量。我們的數(shù)據(jù)表明通過(guò)天然的末端或常規(guī)T-DNA邊緣序列描繪的P-DNAs在轉(zhuǎn)化的煙草中比T-DNAs的效率高約50％。增加的P-DNA轉(zhuǎn)化效率可歸因于不同的CG含量或P-DNA的其它未知的結(jié)構(gòu)特征。
實(shí)施例3用P-DNA載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯這個(gè)實(shí)施例表明可以以類似T-DNA的方式，使用P-DNA將DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到馬鈴薯細(xì)胞中。
根據(jù)下列方法通過(guò)用土壤桿菌菌株感染4周齡體外生長(zhǎng)的RussetRanger小植株的莖外植體進(jìn)行馬鈴薯轉(zhuǎn)化。10倍稀釋的過(guò)夜生長(zhǎng)的培養(yǎng)物生長(zhǎng)5-6小時(shí)，在2,800RPM下離心15分鐘沉淀細(xì)胞，用補(bǔ)充了蔗糖(3％，pH 5.7)的MS液體培養(yǎng)基(Phytotechnology)沖洗，在相同培養(yǎng)基中重懸到OD600nm為0.2。接著用重懸的細(xì)胞感染0.4-0.6mm的節(jié)間馬鈴薯節(jié)段。將感染的莖在22℃在Percival生長(zhǎng)室(16小時(shí)光照)內(nèi)，在含有6g/L瓊脂的協(xié)同培養(yǎng)基(1/10MS鹽，3％蔗糖，pH 5.7)上培養(yǎng)2天，隨后轉(zhuǎn)移到含有特美汀(150mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的胼胝體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM，補(bǔ)充了3％蔗糖3、2.5mg/L的玉米素核苷、0.1mg/L萘乙酸以及6g/L瓊脂的MS)中。在CIM上培養(yǎng)1個(gè)月后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有替卡西林-克拉維酸和卡那霉素(分別為150和100mg/L)的枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM，補(bǔ)充了3％蔗糖、2.5mg/L玉米素核苷、0.3mg/L赤霉酸GA3以及6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基)中。3-4周后，計(jì)數(shù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因胼胝體和/或抽芽的外植體的數(shù)量。如在煙草中所示，用pSIM108感染的顯示胼胝體的莖外植體的數(shù)量高于那些在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中用常規(guī)雙載體pBI121感染的數(shù)量(表3)。隨后從這些胼胝體中長(zhǎng)出的枝條可以被分成兩個(gè)不同的類型。第一種類型的枝條與用LBA∷pBI121轉(zhuǎn)化的對(duì)照枝條在表型上無(wú)法區(qū)分。第二種類型的枝條顯示IPT表型。后一種類型的枝條生長(zhǎng)受阻，僅有非常小的葉子，顯示亮綠至黃顏色，一旦轉(zhuǎn)移到無(wú)激素培養(yǎng)基中就不能生根。為了進(jìn)一步確定IPT表型的枝條是否含有穩(wěn)定整合到它們基因組中的IPT基因，將所有的枝條轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充了3％蔗糖和150mg/L替卡西林-克拉維酸MS培養(yǎng)基的Magenta盒中，允許再生長(zhǎng)3到4周，用于分離DNA。這種植物DNA作為PCR反應(yīng)中的模板，該反應(yīng)含有設(shè)計(jì)為退火到IPT基因上的寡核苷酸對(duì)5’-GTCCAA CTT GCA CAG GAA AGA C-3’，和5’CAT GGA TGA AAT ACT CCT GAGC 3’。如表4顯示，PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定在IPT表型和IPT基因存在之間嚴(yán)格的相關(guān)性。也檢查在從用pBI121轉(zhuǎn)化中獲得的植物中是否存在主鏈DNA。這是通過(guò)在從轉(zhuǎn)化事件中分離的DNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)完成的，該反應(yīng)使用“pBI121主鏈引物”5’CGGTGTAAGTGAACTGCAGTTGCCATG 3’(SEQ ID NO.64)，和5’CATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGS 3’(SEQ ID NO.65)。擴(kuò)增出0.7kbp的條帶表明發(fā)生了主鏈整合。通過(guò)比較表4顯示的數(shù)據(jù)，可推斷對(duì)于P-DNA載體和T-DNA主鏈，整合頻率是相似的。
進(jìn)行第二個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)無(wú)IPT的植物是否不含有任何其它的主鏈序列。因?yàn)镮PT表達(dá)盒靠近左邊緣樣序列，所以將這個(gè)實(shí)驗(yàn)的寡核苷酸對(duì)設(shè)計(jì)成退火到靠近右邊緣樣序列的主鏈序列上5’CACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAG 3’(SEQ ID NO.66)和5’TCCTAATCGACGGCGCACCGGCTG 3’(SEQ ID NO.67)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)對(duì)IPT基因呈陽(yáng)性的植物對(duì)主鏈的這個(gè)其它部分也呈陽(yáng)性。
對(duì)馬鈴薯變種RUsset Burbank進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)IPT表型的評(píng)價(jià)，顯示pSIM108和pSIM109的主鏈整合頻率可與Russet Ranger中的那些相比(見表4和5)。
實(shí)施例4馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，這個(gè)實(shí)施例表明過(guò)度表達(dá)新的馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因?qū)⑻岣唏R鈴薯塊莖的加工和健康特性。
設(shè)計(jì)下列引物以擴(kuò)增煙草液泡轉(zhuǎn)化酶抑制劑Nt-inhhl的新馬鈴薯同系物(Greiner等，Nature Biotechnology，17，708-711，1999)5’AAAGTTGAATTCAAATGAGAAATTTATTC 3’(SEQ ID NO.68)和5’TTTTAAGCTTTCATAATAACATTCTAAT 3’(SEQ ID NO.69)。通過(guò)混合下列成分進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)4μl植物DNA、2μl向前的引物(10pM/ml)、2μl反相引物、25μl Hot Start Master Mix(Qiagen CatalogNr.203443)以及17μl水。使用PTC-100熱循環(huán)儀(MJ Research)讓這種反應(yīng)混合物接受下列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件的處理(1)95℃，5分鐘(1個(gè)循環(huán))，(2)94℃，1分鐘；45℃，1分鐘；以及72℃，4分鐘(35個(gè)循環(huán))，(3)72℃，10分鐘(1個(gè)循環(huán))。在0.8％瓊脂糖凝膠上加入全部產(chǎn)物，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，CA)從凝膠中純化540個(gè)堿基對(duì)的條帶。接著將這種純化的片段連接到pGEM-T Easy(Promega，WI)上并使用Max高效感受態(tài)細(xì)胞(GibcoBRL，MD)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)DH5α中。從轉(zhuǎn)化的DH5α中分離的重組質(zhì)粒DNA的序列分析顯示，存在由編碼推定的181個(gè)氨基酸蛋白(SEQ ID NO.5)的543個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的單一可讀框；簇對(duì)比顯示與Nt-inhh有70％的同源性(圖2)。這種高水平的同源性擴(kuò)展到15個(gè)氨基酸的N末端區(qū)，表明馬鈴薯同系物靶向液泡。有趣地是，馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶抑制劑同系物，稱為St-inhl，與稱為Nt-inhl的專利煙草細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)化酶抑制劑(專利WO98/04722；圖2)僅有43％同源性。
盡管在未修飾的馬鈴薯塊莖中存在St-inhl基因，但是其表達(dá)水平不足以全部抑制轉(zhuǎn)化酶和減少冷誘導(dǎo)的變甜。為了提高馬鈴薯的貯藏特性，將St-inhl基因融合到顆粒粘附淀粉合酶基因(GBSS)的新的增加塊莖的啟動(dòng)子上，已知該啟動(dòng)子促進(jìn)塊莖中基因的高水平表達(dá)。使用正向的引物5’GAACCATGCATCTCAATC 3’(SEQ ID NO.70)和反向引物5’GTCAGGATCCCTACCAAGCTACAGATGAAC 3’(SEQ IDNO.71)，通過(guò)進(jìn)行PCR反應(yīng)從馬鈴薯載培品種Russet Ranger中分離GBSS啟動(dòng)子。在pGEM-T中克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析表明這種新啟動(dòng)子含有658個(gè)堿基對(duì)(SEQ ID NO.6)。接著將得到的啟動(dòng)子/基因融合連接到馬鈴薯泛素基因的3’調(diào)節(jié)序列(UbiT；SEQ ID NO.7)，因而確保轉(zhuǎn)化酶抑制基因轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)終止。
在雙載體的T-DNA邊緣序列之間插入這種表達(dá)盒，使用得到的載體pSIM320轉(zhuǎn)化上面描述的Russet Ranger。將9個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系中的3個(gè)插條種植在土壤中并在生長(zhǎng)室(光照11個(gè)小時(shí)，20℃)內(nèi)生長(zhǎng)4周。接著從每個(gè)品系中收獲至少3個(gè)小塊莖并轉(zhuǎn)移到4℃的冰箱中以誘導(dǎo)冷變甜。4周后，通過(guò)使用Accu-Chek儀和檢驗(yàn)條(RocheDiagnostics，IN)或者葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑(Megazyme，Ireland)測(cè)定這些冷藏的小塊莖中的葡萄糖水平。將這些水平與6個(gè)未轉(zhuǎn)化品系和用pSIM110來(lái)源的載體轉(zhuǎn)化的6個(gè)缺乏轉(zhuǎn)化酶抑制基因的“載體對(duì)照”系的平均葡萄糖水平進(jìn)行比較。如在表6中所示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因系累積的葡萄糖少于“載體對(duì)照”系中的40％，表明馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶抑制劑同系物有功能活性。
下列實(shí)驗(yàn)顯示塊莖中存在的還原糖的量與塊莖加工期間丙烯酰胺的產(chǎn)量相關(guān)。從農(nóng)田中收獲新鮮的Russet Ranger馬鈴薯塊莖并貯藏在4℃以謗導(dǎo)冷變甜；對(duì)照塊莖貯藏在18℃。4周后，測(cè)定兩組塊莖中的葡萄糖水平。隨后，沖洗塊莖，在華氏165度漂白8分鐘或12分鐘，切成0.290×0.290微條，在華氏160度浸入1％焦磷酸鈉溶液，在華氏160度干燥直到喪失干重的14+2％，在華氏390度油炸40秒以達(dá)到最初油炸含水量的64±2％，在華氏-15度冷凍20分鐘，在最初的6分鐘內(nèi)搖動(dòng)托盤2-3次。接著通過(guò)Covance實(shí)驗(yàn)室(WI)分析得到的法國(guó)油炸食品的丙烯酰胺水平。如表7所示，在18℃貯藏的塊莖中葡萄糖的水平低于0.1mg/g的檢出水平，而冷貯藏的塊莖含有平均3.4mg/g的葡萄糖。這個(gè)表也顯示在由后者馬鈴薯生產(chǎn)的油炸食品中含有的丙烯酰胺水平比由貯藏在18℃的馬鈴薯生產(chǎn)的油炸食品高出約10倍。甚至對(duì)在18℃貯藏的馬鈴薯使用比在4℃貯藏的馬鈴薯還短的漂白時(shí)間來(lái)生產(chǎn)相似顏色(分別是78和71的顏色ids)的油炸食品，仍然在丙烯酰胺累積上得到5倍的差異(表7)。因此，似乎在塊莖中還原糖如葡萄糖的量和這些塊莖來(lái)源的油炸食品中丙烯酰胺的累積之間有直接的聯(lián)系。
為了測(cè)定pSIM320品系中還原葡萄糖的水平是否限制加工誘導(dǎo)的丙烯酰胺的累積，將加工冷貯藏的pSIM320品系小塊莖切成楔形物，漂白8分鐘，在0.5％SAPP中浸30秒，在華氏160度干燥4.5分鐘，在華氏380度油炸40秒，在華氏-15度冷凍15分鐘，最后在華氏160度中干燥3分10秒。然后將加工過(guò)的材料運(yùn)送到Covance實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行丙烯酰胺測(cè)定。如表6所示，從具有最低量葡萄糖的小塊莖中獲得的法國(guó)油炸食品累積最低水平的丙烯酰胺。在“320-2”和“320-4”品系中葡萄糖水平減少40％，與之相關(guān)的丙烯酰胺水平減少5倍。
實(shí)施例5與馬鈴薯R1基因相關(guān)的前導(dǎo)和尾隨序列使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，這個(gè)實(shí)施例表明可使用與馬鈴薯R1基因相關(guān)的新的前導(dǎo)序列以有效地提高馬鈴薯塊莖的加工和健康特性。也可預(yù)言可以以相同的方式利用與該相同基因相關(guān)的新的尾隨序列。
作為過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因的替換方法，發(fā)展不使用任何實(shí)際基因序列限制丙烯酰胺產(chǎn)生的方法。這樣的抑制方法是基于使塊莖表達(dá)的R1基因沉默。以前已經(jīng)顯示通過(guò)來(lái)源于該基因的1.9kb基因片段的反義表達(dá)可使與這種淀粉相關(guān)的基因沉默(Kossmann等，美國(guó)專利6,207,880)。然而，大DNA片段的反義表達(dá)是不良的，因?yàn)檫@樣的片段含有新的可讀框(表1)。作為上述方法的一種更安全的方式，從馬鈴薯中分離與R1基因相關(guān)的小前導(dǎo)序列。通過(guò)使用GIBCO BRL提供的5’RACE試劑盒在Russet Ranger馬鈴薯植株塊莖的全部RNA上進(jìn)行cDNA末端的快速擴(kuò)增以獲得這種前導(dǎo)序列。序列分析表明，與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列由179個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成(SEQ ID NO.8)。將被馬鈴薯泛素內(nèi)含子(SEQ ID NO.9)隔開的這種前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝置于GBSS啟動(dòng)子和UbiT之間。在圖3中顯示得到的與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列的表達(dá)盒(SEQ ID NO.10)。在(圖3；SEQ ID Nos.12)中顯示類似的表達(dá)盒，其含有來(lái)自GBSS啟動(dòng)子的間隔區(qū)(SEQ ID NO.11)，代替Ubi內(nèi)含子隔開R1尾隨序列的正義和反義拷貝。在圖3中顯示含有GBSS啟動(dòng)子的較長(zhǎng)形式的另外的變體(SEQ ID NOs.14-15)。
為了檢驗(yàn)與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列在限制丙烯酰胺產(chǎn)生中的效率，將在圖3中所顯示的表達(dá)盒作為KpnI-XbaI片段在雙載體的T-DNA邊緣序列之間插入。使用具有得到的pSIM332載體的土壤桿菌LBA4404株轉(zhuǎn)化Russet Ranger馬鈴薯。為了誘導(dǎo)塊莖的形成，將25個(gè)代表獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的枝條轉(zhuǎn)移到土壤中并置于生長(zhǎng)室內(nèi)(光照11個(gè)小時(shí)，25℃)。3周后，將至少3個(gè)小塊莖/品系在4℃貯藏4周以誘導(dǎo)淀粉轉(zhuǎn)移。隨后根據(jù)實(shí)施例4中描述的方法測(cè)定這些冷藏的小塊莖中的葡萄糖水平，并與未轉(zhuǎn)化的植株和載體對(duì)照中的平均葡萄糖水平相比較。如表8中所示，來(lái)自所有25個(gè)品系的小塊莖顯示冷藏后葡萄糖水平降低了。與對(duì)照相比，預(yù)計(jì)在來(lái)自顯示R1表達(dá)水平減少的小塊莖的法國(guó)油炸食品中丙烯酰胺的水平大約減少了2倍。在成熟的塊莖中期望對(duì)下調(diào)R1基因表達(dá)的影響更強(qiáng)烈。
作為基于前導(dǎo)序列方法的替換方法，產(chǎn)生含有與R1相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒。通過(guò)在從馬鈴薯栽培品種RussetRanger的微塊莖中分離的全部RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)而獲得這種尾隨序列。使用Omniscript RT試劑盒(Qiagen，CA)產(chǎn)生互補(bǔ)DNA，然后用作使用Hots tart DNA聚合酶(Qiagen，CA)的PCR反應(yīng)的模板，該反應(yīng)使用基因特異性反相引物R1-1(5’GTTCAGACAAGACCACAGATGTGA 3’)?？寺〉絧GEM-T上的擴(kuò)增的DNA片段的序列分析表明，與R1相關(guān)的尾隨序列由333個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成(SEQID NO.16)。通過(guò)在GBSS啟動(dòng)子和Ubi終止子之間插入的Ubi內(nèi)含子或GBSS間隔區(qū)將尾隨序列的正義和反義拷貝隔開(圖3；SEQ IDNos.17-18)。在圖3中顯示含有較大GBSS啟動(dòng)子的類似形式(SEQID NOs.19-20)。
可根據(jù)上面描述的方法測(cè)定葡萄糖和丙烯酰胺的水平。期望顯示葡萄糖濃度降低約50％或更多的塊莖在油炸過(guò)程中也累積少于約50％的丙烯酰胺?？稍诔墒斓霓r(nóng)田生長(zhǎng)的塊莖中進(jìn)一步確定修飾植株的經(jīng)改善的健康和貯藏特性。
可通過(guò)使用AOAC方法995.11食物中的磷(全部)(45.1.33AOAC國(guó)際正式分析方法，第17版)來(lái)測(cè)定馬鈴薯塊莖中的磷酸水平。通過(guò)在馬弗爐中干灰化隨后用酸消化來(lái)制備樣品。然后中和溶解的樣品，用鉬酸-抗壞血酸溶液處理并與一系列磷標(biāo)準(zhǔn)(經(jīng)過(guò)類似處理)進(jìn)行比較。使用雙光束分光光度計(jì)在823納米進(jìn)行比色分析。預(yù)期磷含量會(huì)顯著降低，這對(duì)環(huán)境有利。
實(shí)施例6與L-α葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，這個(gè)實(shí)施例表明可使用與馬鈴薯L-α葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的新前導(dǎo)序列以有效地提高馬鈴薯塊莖的加工和健康特性。
以前已經(jīng)顯示可通過(guò)α葡聚糖磷酸化酶基因的0.9kb片段的反義表達(dá)來(lái)減少冷誘導(dǎo)的變甜(Kawchuk等，美國(guó)專利5,998,701,1999)。然而，這些相對(duì)大的DNA片段的反義表達(dá)是不良的，因?yàn)樗鼈兒行碌暮臀幢幻枋龅目勺x框，如果這些可讀框在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)就可能影響食物的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量(表1)。
作為上述方法的更安全的方式，從成熟塊莖的RNA中分離與L型葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的小前導(dǎo)和尾隨序列。用于這個(gè)目的所使用的引物對(duì)是5’-GGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAG-3’(SEQ ID NO.72)和5’-GAATTCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGC-3’(SEQ ID NO.73)。擴(kuò)增得到273個(gè)堿基對(duì)的前導(dǎo)序列，顯示為SEQ ID NO.21。類似地，使用“直接”引物5’-GGAACATTGAAGCTGTGG-3’(SEQ ID NO.74)和寡-dT引物來(lái)擴(kuò)增與L型葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的158個(gè)堿基對(duì)的“尾隨序列”(SEQ ID NO.22)。
然后使用這些尾隨或前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)表達(dá)盒以修飾L型葡聚糖磷酸化酶基因的表達(dá)，并如此通過(guò)限制淀粉轉(zhuǎn)移來(lái)降低油炸產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平。以與實(shí)施例5中描述的類似方式構(gòu)建這些表達(dá)盒，并描述在圖3中(SEQ ID Nos.23-26)。使用含有稱為pSIM216的具有這種表達(dá)盒的雙載體的土壤桿菌菌株感染馬鈴薯莖，產(chǎn)生25個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。將來(lái)自這些植株的小塊莖在4℃貯藏4周以誘導(dǎo)冷變甜。然后分析經(jīng)冷藏小塊莖的葡萄糖水平。如表9所示，所有轉(zhuǎn)基因品系的小塊莖顯示葡萄糖水平降低。
使用顯示葡萄糖濃度至少降低50％的4個(gè)品系(216-2、216-5、216-10以及216-21品系)以評(píng)價(jià)加工誘導(dǎo)的丙烯酰胺水平。盡管在來(lái)自前3個(gè)品系的油炸塊莖中丙烯酰胺水平與對(duì)照類似，但是來(lái)自216-21品系的法國(guó)油炸食品僅累積相當(dāng)于野生型的45％的丙烯酰胺水平(每十億分之136305)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在實(shí)施例4中描述的對(duì)過(guò)度表達(dá)馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因塊莖的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樾枰咸烟?和果糖)濃度相對(duì)大的降低以限制在冷藏的小塊莖中熱誘導(dǎo)的丙烯酰胺累積。因?yàn)槠谕诔墒斓摹?16”塊莖中磷酸化酶基因的沉默更有效，所以也期望在用這樣的塊莖生產(chǎn)的法國(guó)油炸食品中丙烯酰胺水平的降低更顯著?？稍诔墒斓膲K莖中進(jìn)一步確定修飾的植株具有改善的健康和貯藏特性。
實(shí)施例7修飾的多酚氧化酶基因使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，這個(gè)實(shí)施例表明可使用缺乏功能性銅結(jié)合位點(diǎn)的修飾的多酚氧化酶基因以有效地減少塊莖的傷痕易感性。
以前已經(jīng)顯示，可通過(guò)1.8kb PPO基因的反義表達(dá)來(lái)減少黑斑傷痕易感性(Steffens，美國(guó)專利6,160,204，2000)。然而，這個(gè)大基因的反向互補(bǔ)序列的表達(dá)是不希望要的，因?yàn)樗行碌暮臀疵枋鲞^(guò)的可讀框，其編碼由超過(guò)100個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，可能潛在地影響食物的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量(表1)。作為上述方法的更安全的方式，修飾PPO基因以編碼非功能蛋白。
通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從Russet Ranger中分離野生型的馬鈴薯PPO基因。首先，從Russet Ranger芽中分離基因組DNA。然后使用DNA聚合酶和寡核苷酸引物5’CGAATTCATGGCAAGCTTGTGCAATAG3’(PPO-F)(SEQ ID NO.75)和5’CGAATTCTTAACAATCTGCAAGACTGATCG 3’(PPO-R)(SEQ ID NO.76)從馬鈴薯基因組DNA中擴(kuò)增馬鈴薯PPO基因。將這些設(shè)計(jì)成與馬鈴薯PPO基因的5’-和3’-端互補(bǔ)。將擴(kuò)增的1.6kb片段克隆到pGEM-TEASY載體(Promega)上，通過(guò)序列分析進(jìn)一步證實(shí)其代表功能性的PPO基因(SEQ ID NO.27)。
通過(guò)將這種蛋白與甘薯PPO蛋白進(jìn)行對(duì)比，鑒定馬鈴薯PPO中的結(jié)合銅的結(jié)構(gòu)域，其中甘薯的PPO蛋白顯示在92位含有保守的半胱氨酸(Cys)殘基、236位上含有谷氨酰胺(Glu)殘基、以及在與兩個(gè)活性位點(diǎn)銅配位的88，109，118，240，244和274位上含有組氨酸(His)殘基(Klabunde等，Nature Structural Biol.，51084-1090，1998)。在馬鈴薯PPO中也存在這些半胱氨酸、谷氨酰胺以及組氨酸。
通過(guò)使用PCR突變?nèi)〈姆椒óa(chǎn)生無(wú)活性的PPO基因。使用3對(duì)引物和野生型Russet Ranger PPO作為模板，通過(guò)Proof Start Taq DNA聚合酶(Qiagen)擴(kuò)增出3個(gè)片段。第一對(duì)引物分別稱為P1-F和P2-R，其序列是5’GAGAGATCTTGATAAGACACAACC 3’(SEQ ID NO.77)和5’CATTACC1ATAAGCC2CAC3TGTATATTAGCTTGTTGC 3’(SEQ ID NO.78)(1“A”突變成“C”，導(dǎo)致在186位上的半胱氨酸被甘氨酸取代；2“A”突變成“C”，導(dǎo)致在183位上的半胱氨酸被色氨酸取代；3“A”突變成“C”，導(dǎo)致在182位上的組氨酸被谷氨酰胺取代)。第二對(duì)引物分別稱為P3-F和P4-R，其序列是5’GTGCTTATAGAATTGGTGGC3’(SEQ ID NO.79)和5’TAGTTCCCGGGAGTTCAGTG 3’(SEQ ID NO.80)。第三對(duì)引物分別稱為P5-F和P6-R，其序列是5’CTCCCGGGAACTATAGG4AAACATTCCTCT5CGGTCCTGTCCACATCTGGTC 3’(SEQID NO.81)和5’GTGTGATATCTGTTCTTTTCC 3’(SEQ ID NO.82)(4“A”突變成“G”，導(dǎo)致在326位上的谷氨酰胺被甘氨酸取代；5“A”突變成“T”，導(dǎo)致在330位上的組氨酸被亮氨酸取代)。
使用引物P1-F和P2-R擴(kuò)增80個(gè)堿基對(duì)的片段，并用BglII消化。這個(gè)片段含有一個(gè)粘性末端(BglII)和一個(gè)鈍性末端，并在銅結(jié)合位點(diǎn)I上具有3個(gè)突變。使用引物P3-F和P4-R擴(kuò)增并用XmaI消化的0.4kb片段含有一個(gè)鈍性末端和一個(gè)粘性末端(XmaI)。使用引物P5-F和P6-R擴(kuò)增0.2kb片段，并用XmaI和EcoRV消化。這具有粘性末端(XmaI)和鈍性末端(EcoRY)的第三個(gè)片段在銅結(jié)合位點(diǎn)II中有2個(gè)突變。接著用上面3個(gè)連接的PCR擴(kuò)增片段取代克隆的野生型馬鈴薯PPO的BglII和EcoRV片段。通過(guò)序列分析進(jìn)一步確定修飾的PPO基因中存在全部5個(gè)點(diǎn)突變(SEQ ID NO.28)。為了產(chǎn)生修飾的PPO(mPPO)的表達(dá)盒，將下列4個(gè)片段同時(shí)連接起來(lái)(1)含有GBSS啟動(dòng)子的BamHI-HindIII片段，(2)含有突變型PPO的HindIII-SacI片段，(3)含有Ubi-3終止子的SacI-KpnI片段，以及(4)用KpnI和BamHI消化的質(zhì)粒pBluescript。然后在雙載體的邊緣序列之間插入這種表達(dá)盒而產(chǎn)生pSIM314。
通過(guò)用pSIM314轉(zhuǎn)化Russet Ranger莖外植體來(lái)評(píng)價(jià)mPPO基因表達(dá)盒的效率。將含有這種表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物的節(jié)插條置于補(bǔ)充了7％蔗糖的MS培養(yǎng)基中。在18℃黑暗培養(yǎng)5周后，分離微塊莖并鑒定PPO活性。對(duì)于這個(gè)目的，將1g馬鈴薯塊莖在液氮中粉碎。然后將這種粉末加到5ml含有50mM兒茶酚的50mM MOPS(3-(N-嗎啉子基)丙磺酸)緩沖液(pH 6.5)中，在室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)約1小時(shí)。然后沉淀固體部分，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，通過(guò)測(cè)量OD 410對(duì)時(shí)間的變化而測(cè)定PPO活性。如表10所示，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照或用不含突變型PPO基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，從一些轉(zhuǎn)基因系中分離的微塊莖顯示多酚氧化酶活性顯著降低。在“314-9”、“314-17”以及“314-29”品系中觀察到PPO活性最強(qiáng)烈的降低。為了檢驗(yàn)突變型PPO基因的表達(dá)是否也降低了小塊莖中的PPO活性，在土壤中種植轉(zhuǎn)基因系的生根的小植物，并在生長(zhǎng)室內(nèi)培養(yǎng)4周。對(duì)分離的小塊莖的PPO測(cè)定表明，在決大多數(shù)實(shí)例中微塊莖中降低的PPO活性與小塊莖中降低的活性相關(guān)(表10)。可以繁殖顯示PPO活性降低的轉(zhuǎn)基因系，在溫室和農(nóng)田中進(jìn)行檢驗(yàn)以進(jìn)一步確定成熟的塊莖中“低傷痕”表型。由于微塊莖和小塊莖表達(dá)多種多酚氧化酶，所以其中的一些與主要在成熟的塊莖中表達(dá)的靶向多酚氧化酶僅有有限的序列同源性，在如“314-9”和“314-17”品系的成熟塊莖中可以預(yù)期PPO活性甚至?xí)鼧O度降低。數(shù)據(jù)表明無(wú)功能活性的PPO基因的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致降低傷痕易感性。也可在農(nóng)田生長(zhǎng)的成熟塊莖中進(jìn)一步證實(shí)修飾植物的經(jīng)過(guò)改善的健康和貯藏特性。
實(shí)施例8對(duì)馬鈴薯塊莖的非表皮組織特異的多酚氧化酶基因的尾隨序列使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，這個(gè)實(shí)施例表明，可使用與馬鈴薯PPO基因相關(guān)的新的尾隨序列以有效地減少塊莖的傷痕易感性。
使用反轉(zhuǎn)錄PCR也分離與在馬鈴薯塊莖中表達(dá)的PPO基因相關(guān)的尾隨序列。第一個(gè)PCR反應(yīng)的引物是PPO-1(5’GAATGAGCTTGACAAGGCGGAG 3’(SEQ ID NO.83))和寡-dT；第二個(gè)嵌套式PCR反應(yīng)的引物是PPO-2(5’CTGGCGATAACGGAACTGTTG 3’(SEQID NO.84))和寡-dT。克隆到pGEM-T上的擴(kuò)增的DNA片段的序列分析顯示存在154個(gè)堿基對(duì)的尾隨序列(SEQ ID NO.29)。接著將被Ubi內(nèi)含子隔開的這種尾隨序列的正義和反義拷貝融合到上面描述的GBSS啟動(dòng)子和Ubi3終止子上，以產(chǎn)生在圖3中所示的表達(dá)盒(SEQID NO.30)。在圖3中顯示含有被GBSS間隔區(qū)隔開的尾隨序列片段的可選擇的構(gòu)建物(SEQ ID NO.31)。在圖3中顯示具有較大GBSS啟動(dòng)子的類似形式(SEQ ID Nos.32-33)。有趣地是，主要在成熟塊莖中表達(dá)的PPO基因的尾隨序列(圖4中用P-PPO3表示)不同于主要在包括微塊莖的其它組織中表達(dá)的PPO基因的尾隨序列(圖4中用PPOM-41和PPOM-44表示)。由于不同的與PPO基因相關(guān)的尾隨序列之間的低同源性，因此使用P-PPO3尾隨序列將僅導(dǎo)致成熟的塊莖特異PPO基因的沉默。由于很難用PPO基因本身的序列來(lái)完成這種非常特異性的基因的沉默，因而表明了使用非編碼序列進(jìn)行基因沉默的優(yōu)點(diǎn)。為了顯示PPO活性的程度，將0.5ml 50mM的兒茶酚用移液管滴在切成薄片的遺傳修飾的小塊莖的切面上。與對(duì)照相比，塊莖區(qū)可見的褐變減少約5到10倍。有趣地是，盡管是這樣，但是在馬鈴薯外皮上沒有觀察到褐變。似乎使用的尾隨序列特異性地使主要在皮層和髓中表達(dá)但不在表皮中表達(dá)的PPO基因沉默。因?yàn)镻PO基因可能在某種防御反應(yīng)中起某種作用，所以這種意外的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)保護(hù)塊莖本身不受一些病原體試圖通過(guò)外皮感染是有益的。為了定量測(cè)定PPO活性，根據(jù)實(shí)施例7中描述的方法進(jìn)行測(cè)定。表11顯示與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化的小塊莖中PPO活性降低最高達(dá)到80％。因?yàn)榕c小塊莖和微塊莖相比，這些塊莖更主要地表達(dá)靶PPO基因，所以預(yù)計(jì)在成熟塊莖中降低的水平甚至將更多?？稍诔墒靿K莖中進(jìn)一步證實(shí)如“217-7”和“217-26”品系的改善的特性。
實(shí)施例9提高抗性淀粉水平的表達(dá)盒增加塊莖中直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例可以進(jìn)一步提高馬鈴薯產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。一個(gè)可以提高直鏈淀粉含量的方法是基于編碼淀粉分支酶(SBE)I和II基因的反義表達(dá)(Schwall等，Nature Biotechnology18551-554，2000)。這種方法的缺點(diǎn)是(1)通過(guò)利用反義技術(shù)同時(shí)沉默兩個(gè)不同基因的效率非常低，(2)相對(duì)大的SBE-I和SBE-II基因序列的反義表達(dá)導(dǎo)致可讀框(表1)的不合需要的表達(dá)，(3)包含兩個(gè)反義表達(dá)盒的相應(yīng)的構(gòu)建物是不必要的大而復(fù)雜的，因而，增加了重組的機(jī)會(huì)并降低了轉(zhuǎn)化頻率。
我們的提高馬鈴薯中直鏈淀粉含量的方法是基于與兩個(gè)基因都相關(guān)的尾隨序列的表達(dá)。這些尾隨序列(SEQ ID NO.34和35)是用下列引物對(duì)進(jìn)行分離的5’GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTA 3’(SEQ IDNO.85)，5’CTAATATTTGATATATGTGATTGT 3’(SEQ ID NO.86)，5’ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAG 3’(SEQ ID NO.87)，以及5’ACTAAGCAAAACCTGCTGAAGCCC 3’(SEQ ID NO.88)。單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)被泛素-7內(nèi)含子隔開的，其后是泛素-3終止子的兩個(gè)尾隨序列的正義和反義融合的表達(dá)。全部表達(dá)盒的大小僅為2.5kb。
實(shí)施例10開發(fā)無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法這個(gè)實(shí)施例表明不需要選擇性標(biāo)記基因的穩(wěn)定整合也可有效地轉(zhuǎn)化植物。
這個(gè)方法首先利用靶向植物細(xì)胞核的DNAs經(jīng)常不能隨后整合到植物細(xì)胞的基因組中的現(xiàn)象。本發(fā)明人獲得了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將感染的外植體置于含有適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的植物培養(yǎng)基上5天，可能選擇出暫時(shí)表達(dá)含有選擇性標(biāo)記基因的非整合T-DNA的細(xì)胞。用于開發(fā)當(dāng)前方法的第二個(gè)現(xiàn)象是不同雙載體的T-DNAs經(jīng)常靶向相同的植物細(xì)胞核。通過(guò)使用兩個(gè)不同的雙載體一個(gè)含有T-DNA上的選擇標(biāo)記，另一個(gè)含有具有實(shí)際的興趣序列的T-DNA或P-DNA，可以使用短暫的選擇系統(tǒng)而獲得大量胼胝體、枝條或植株，其重要的一部分代表無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化事件。
使用被稱為pSIM011的常規(guī)雙載體來(lái)代表具有“興趣序列”的載體，在這個(gè)檢驗(yàn)實(shí)例中，興趣序列是位于常規(guī)T-DNA上的β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因表達(dá)盒。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的第二個(gè)雙載體在pSIM011衍生物的T-DNA邊緣序列之間含有包含被泛素-7基因的強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因和其后的胭脂氨酸合酶(nos)基因的終止序列的表達(dá)盒。
令人驚奇的是，也可通過(guò)用酵母醇脫氫酶1(ADH)基因的終止子(基因庫(kù)登記號(hào)V01292，SEQ ID NO.56)取代nos終止子來(lái)獲得高水平的短暫NPTII基因表達(dá)水平。這個(gè)發(fā)現(xiàn)很有趣，因?yàn)榻湍窤DH1終止子與任何植物終止子都沒有同源性。重要地是，這里應(yīng)當(dāng)注意到，許多酵母終止子在植物中不能充分發(fā)揮作用。例如，在上面描述的GUS基因后是酵母異-1-細(xì)胞色素c(CYC1)終止子(基因庫(kù)登記號(hào)SCCYT1)的類似實(shí)驗(yàn)中，幾乎沒有觀察到GUS基因表達(dá)。通過(guò)用酵母ADH1終止子取代nos終止子產(chǎn)生具有選擇性標(biāo)記基因NPTII的經(jīng)過(guò)改善的載體。含有用于短暫轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記基因的雙載體被稱為“LifeSupport”(圖5)。
用兩個(gè)分別含有pSIM011和LifeSupport的根癌農(nóng)桿菌LBA4404株同時(shí)感染馬鈴薯莖外植體。1/10稀釋的每個(gè)菌株的過(guò)夜生長(zhǎng)的培養(yǎng)物在它們沉淀前生長(zhǎng)5-6小時(shí)，根據(jù)實(shí)施例3中描述的方法洗滌并重懸到OD600nm為0.4。然后用以每個(gè)細(xì)菌0.2(OD600nm)的終密度的重懸細(xì)胞感染0.4-0.6cm節(jié)間馬鈴薯片段。如在實(shí)施例3中的方法處理感染的莖，主要區(qū)別是用卡那霉素進(jìn)行的選擇限于在胼胝體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前5天。然后，允許外植體在僅含有替卡西林-克拉維酸(timentine)150mg/L而無(wú)選擇性抗生素的新鮮CIM和SIM中進(jìn)一步發(fā)育。對(duì)從感染日起約3個(gè)月內(nèi)從40-60％感染的莖中發(fā)育的胼胝體中長(zhǎng)出的枝條的葉片，檢驗(yàn)GUS表達(dá)并進(jìn)行PCR分析以鑒定含有興趣序列但不含標(biāo)記基因的事件。如表12所示，11％的枝條代表無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化事件。
也使用上述的兩菌株方法轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)在約2個(gè)月內(nèi)發(fā)育的枝條進(jìn)行GUS測(cè)定和PCR分析。經(jīng)過(guò)鑒定的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化事件的高頻率(18％)意味著所開發(fā)的方法可用于非馬鈴薯植物種(表12)。
重要地是，用兩個(gè)不同的土壤桿菌菌株順序感染而不是同時(shí)感染，導(dǎo)致提高了無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的效率。通過(guò)用含有pSIM011的土壤桿菌菌株感染馬鈴薯莖外植體，將感染的外植體置于協(xié)同培養(yǎng)平板上4小時(shí)，然后用LifeSupport載體重新感染，發(fā)現(xiàn)了順序感染的令人驚奇的效果。在這個(gè)實(shí)施例中，如前面描述的方法處理雙重感染的外植體。如表13所示，在兩個(gè)不同的感染之間4小時(shí)的滯后時(shí)間導(dǎo)致馬鈴薯中無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化事件的頻率增加2倍。
實(shí)施例11用DSIM340進(jìn)行精確育種這個(gè)實(shí)施例表明精確育種的效率。通過(guò)將馬鈴薯的遺傳元件插入到馬鈴薯中(見實(shí)施例1、4和7)，使用無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化(實(shí)施例10)來(lái)提高馬鈴薯植株的健康和農(nóng)藝特性。
通過(guò)將突變型PPO和轉(zhuǎn)化酶抑制劑兩者的表達(dá)盒插入到雙載體pSIM112’中，產(chǎn)生含有在P-DNA末端之間插入的轉(zhuǎn)化酶抑制劑和突變型多酚氧化酶基因兩個(gè)表達(dá)盒的雙載體，稱為pSIM340(圖1)。用pSIM340和進(jìn)一步改進(jìn)的LifeSupport載體同時(shí)感染馬鈴薯莖外植體。接著共培養(yǎng)感染的外植體，進(jìn)行短暫選擇，以及誘導(dǎo)繁殖和產(chǎn)生前面討論過(guò)的枝條。3個(gè)月后，將小枝條轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中并允許其再生長(zhǎng)3周。然后根據(jù)實(shí)施例2和3中描述的方法，對(duì)枝條進(jìn)行表型分析，收集葉片材料用于分子分析以確定是否存在主鏈、標(biāo)記基因以及具有興趣序列的P-DNA。如表14所示，1.2％的事件代表含有pSIM340的修飾P-DNA但無(wú)LifeSupport的植株。這種無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的頻率低于使用T-DNA轉(zhuǎn)化的頻率，這再次表明在P-DNA和T-DNA之間存在功能上有差別。
實(shí)施例12選擇抗LifeSupport T-DNAs的穩(wěn)定整合這個(gè)實(shí)施例表明，通過(guò)使用細(xì)菌的胞嘧啶脫氨酶基因來(lái)選擇抗LifeSupport T-DNAs的穩(wěn)定整合可以提高精確育種方法的效率。
前面的實(shí)施例表明，使用修飾的P-DNA的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的效率比使用常規(guī)的T-DNA的低幾倍。為了提高產(chǎn)生僅含有修飾P-DNA枝條的效率，在LifeSupport載體的T-DNA邊緣序列之間插入包括細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(upp)基因(InvivoGen，CA)的自殺基因融合的表達(dá)盒，產(chǎn)生pSIM346(圖5)。用一個(gè)含有pSIM340的菌株和另一個(gè)含有pSIM346的菌株感染馬鈴薯的莖外植體，隨后置于下列培養(yǎng)基中(1)協(xié)同培養(yǎng)基中2天，(2)CIMTK培養(yǎng)基中以選擇短暫的標(biāo)記基因表達(dá)5天，(3)CIMT培養(yǎng)基中以允許短暫表達(dá)的標(biāo)記基因的植物細(xì)胞繁殖30天，(4)含有500mg/L無(wú)毒的5-氟胞嘧啶(5-FC)的SIMT培養(yǎng)基中，其中無(wú)毒的5-氟胞嘧啶通過(guò)植物細(xì)胞表達(dá)codAupp而轉(zhuǎn)化成有毒的5-氟尿嘧啶(5-FU)，以選擇抗LifeSupport T-DNA的穩(wěn)定整合。胼胝體在4周內(nèi)在SIMT中產(chǎn)生枝條。將這些枝條轉(zhuǎn)移到含有替卡西林-克拉維酸(timentine)的MS培養(yǎng)基中，并允許生長(zhǎng)直到獲得足夠的用于PCR分析的組織。然后從100個(gè)枝條中提取DNA并用于確定是否存在P-DNA、LifeSupport和主鏈。如表15所示，被分析的枝條中沒有一個(gè)含有LifeSupport T-DNA，第一次表明，可將codAupp基因融合用作再生前的陰性選擇性標(biāo)記。更重要地是，我們的結(jié)果表明，抗LifeSupport T-DNA整合的陰性選擇提高僅含有修飾的P-DNA的枝條的頻率。通過(guò)將短暫的標(biāo)記基因表達(dá)的陽(yáng)性選擇與抗codAupp基因融合的穩(wěn)定整合的陰性選擇結(jié)合，僅含有修飾P-DNA枝條的頻率比僅使用短暫標(biāo)記基因表達(dá)的陽(yáng)性選擇高約5倍(表15)。
通過(guò)使用LifeSupport載體pSIM350(圖5)，無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的效率甚至得到極度增加，該載體與pSIM346類似但含有取代codAupp基因融合的codA基因。如上面描述的方法處理用pSIM340和pSIM350同時(shí)感染的馬鈴薯的莖外植體，用分子學(xué)的方法檢驗(yàn)所得到的51個(gè)枝條是否發(fā)生僅含有pSIM340的T-DNA區(qū)的事件。有趣地是，這種PCR分析顯示一些枝條含有codA基因(表15)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明，在植物中codA與codAupp不一樣，不是緊密的陰性選擇標(biāo)記。更重要地是，顯示大量枝條(29％)代表無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的事件。
不是同時(shí)用pSIM340和pSIM350感染外植體，而是順序地感染可進(jìn)一步提高效率。通過(guò)用pSIM340感染外植體以及4小時(shí)后用pSIM350再感染，預(yù)期無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的頻率將是大約30-40％。
實(shí)施例13減少LifeSupport T-DNAs的整合這個(gè)實(shí)施例表明，通過(guò)使用Ω突變的virD2基因減少LifeSupportT-DNA整合到植物基因組中，可以提高精確育種方法的效率。
一直顯示土壤桿菌蛋白vird2的Ω區(qū)域?qū)τ谠摰鞍字С謱-DNA整合到植物基因組中的能力很重要(Mysore等，Mol Plant MicrobeInteract 11668-83，1998)?；谶@個(gè)觀察，產(chǎn)生了含有插入到它們的主鏈序列中SacII位點(diǎn)上的Ω突變的virD2蛋白表達(dá)盒的修飾的LifeSupport載體。通過(guò)從質(zhì)粒pCS45(Walt Ream博士贈(zèng)送，俄勒岡州大學(xué)，OR，USA-，SEQ ID NO.36)中擴(kuò)增2.2kb DNA片段而獲得該表達(dá)盒。使用稱為pSIM401Ω(圖5)的含有這種表達(dá)盒的LifeSupport衍生物，來(lái)支持用pSIM340的經(jīng)過(guò)修飾的P-DNA對(duì)馬鈴薯植株的轉(zhuǎn)化。在短暫選擇和枝條誘導(dǎo)后，用分子學(xué)方法檢驗(yàn)100個(gè)枝條是否存在轉(zhuǎn)基因。如表15中所示，4.4％的枝條僅含有修飾的P-DNA，這表明使用Ω-virD2將元標(biāo)記轉(zhuǎn)化的效率提高了約4倍(表15)。
通過(guò)將LifeSupport T-DNA的大小從3.7kb(在pIM401Ω中)增加到8.1kb(在被稱為pSIM341Ω的pSIM401Ω衍生物中；圖5)來(lái)進(jìn)一步提高效率。通過(guò)從用pSIM340和pSIM341Ω同時(shí)感染的馬鈴薯莖外植體中再生枝條，顯示81個(gè)分析事件中的7個(gè)(7％)代表無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的事件(表15)。
通過(guò)用pSIM340和LifeSupport順序感染外植體而不是同時(shí)感染，可獲得進(jìn)一步提高。以與實(shí)施例10中描述的類似方式，通過(guò)用pSIM340感染外植體，4小時(shí)后用LifeSupport再感染，僅含有修飾的P-DNA植株的頻率可增加約一倍。
實(shí)施例14開發(fā)使用1個(gè)菌株的方法這個(gè)實(shí)施例表明，也可以通過(guò)使用含有P-DNA載體和LifeSupport兩者的單個(gè)土壤桿菌菌株獲得高頻率的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)生可同時(shí)在土壤桿菌中維持的兩個(gè)相容的雙載體。使用這種系統(tǒng)用于僅整合修飾的P-DNA，而不是用于穩(wěn)定整合兩個(gè)分別含有興趣DNA和標(biāo)記基因的T-DNAs(Komari等，美國(guó)專利5731179，1998)。
第一個(gè)載體，被稱為pSIM356，含有在P-DNA末端之間插入的包括被Ubi7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因以及隨后的UbiT的表達(dá)盒。這個(gè)載體的主鏈部分含有來(lái)自pVS1和pBR322的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)、用于細(xì)菌選擇的壯觀霉素抗性基因、以及能夠在植物中選擇抗主鏈整合的IPT基因的表達(dá)盒(圖1)。第二個(gè)載體，被稱為pSIM363，含有在常規(guī)T-DNA邊緣序列之間插入的包括被Ubi7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NPTII基因以及隨后的酵母ADH1終止子的表達(dá)盒(圖5)。這個(gè)載體的主鏈部分含有ColE1(基因庫(kù)號(hào)V00268)和oriV(基因庫(kù)號(hào)M20134)的細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)，以及用于細(xì)菌選擇的卡那霉素抗性基因。
在100個(gè)煙草枝條中檢驗(yàn)使用pSIM356和pSIM363來(lái)提高無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化頻率的思想。如表16中所示，約19％的再生枝條含有無(wú)標(biāo)記基因的興趣DNA。通過(guò)將這種使用1個(gè)菌株的方法用于馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)也能夠提高無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化的效率。經(jīng)檢驗(yàn)的60個(gè)獨(dú)立枝條中的9個(gè)(15％)含有pSIM340T-DNA而缺乏LifeSupportT-DNA(表16)。
可將使用1個(gè)菌株的方法與實(shí)施例12中描述的方法聯(lián)合以使短暫的標(biāo)記基因表達(dá)的陽(yáng)性選擇與抗codA基因穩(wěn)定整合的陰性選擇相結(jié)合。為了這個(gè)目的，開發(fā)了LifeSupport載體pSIM36(圖5)。可使用一起含有這種載體和P-DNA載體的土壤桿菌菌株來(lái)有效地產(chǎn)生僅含有位于穩(wěn)定整合在它們基因組的P-DNA內(nèi)的興趣基因表達(dá)盒的植株。
實(shí)施例15依靠天然標(biāo)記的精確育種方法除了用僅含有期望序列的P-DNAs轉(zhuǎn)化農(nóng)作物以引入有益的特性外，本發(fā)明也提供用含有另外的天然標(biāo)記基因的P-DNAs轉(zhuǎn)化這類植物的方法。我們選擇的新的和天然的標(biāo)記基因是擬南芥(Arabidopsis)液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和苜蓿alfin-1基因的馬鈴薯同系物。這些基因的表達(dá)不僅允許鑒定轉(zhuǎn)化事件，而且也給轉(zhuǎn)化植物提供耐鹽性。因此在面積逐漸增加的農(nóng)田中，高鹽度水平將較小地影響含耐鹽性標(biāo)記的馬鈴薯植株。
使用寡核苷酸對(duì)5’CCCGGGATGGCTTCTGTGCTGGCT 3’(SEQ IDNO.89)和5’GGTACCTCATGGACCCTGTTCCGT 3’(SEQ ID NO.90)，在從美國(guó)馬鈴薯基因庫(kù)(WI)中獲得的稱為“LBR4”的晚疫抗性品種的cDNA中擴(kuò)增兩種形式的液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同系物，稱為Ps t(馬鈴薯耐鹽性)。它們的序列顯示為SEQ ID NO.37和38。使用引物5’-CCCGGGTATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTG 3’(SEQ ID NO.91)和5’-ACTAGTTAAACTCTAGCTCTCTTGC 3’(SEQ ID NO.92)從LBR4馬鈴薯DNA中擴(kuò)增與alfin-1同源的第三個(gè)基因(SEQ ID NO.39)。通過(guò)在修飾的pSIM341載體的常規(guī)T-DNA邊緣序列之間插入與Ubi7啟動(dòng)子的融合，評(píng)價(jià)Pst基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的效率。在短暫的選擇期后，允許卡那霉素抗性細(xì)胞增殖和發(fā)育成枝條。然后將這些枝條轉(zhuǎn)移到含有100-150mM氯化鈉的培養(yǎng)基中。耐鹽性的枝條代表含有修飾的pSIM341的T-DNA的轉(zhuǎn)化事件。
實(shí)施例16塊莖特異性的啟動(dòng)子新分離的塊莖特異性的啟動(dòng)子可取代使用的GBSS啟動(dòng)子以發(fā)展在前面的實(shí)施例中描述的表達(dá)盒。通過(guò)用馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因(基因庫(kù)登記號(hào)D17332)(SEQ ID NO.39)的特異性的引物，使用反向聚合酶鏈反應(yīng)從Russet Burbank馬鈴薯植株的基因組中分離這種啟動(dòng)子。通過(guò)產(chǎn)生含有由這種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因以及NPTII標(biāo)記基因表達(dá)盒的雙載體來(lái)檢驗(yàn)PIP啟動(dòng)子的效率。使用含有用GBSS啟動(dòng)子取代PIP啟動(dòng)子的相似構(gòu)建物作為對(duì)照。通過(guò)用含有雙載體的土壤桿菌菌株感染莖外植體，共培養(yǎng)2天，并在CIMTK培養(yǎng)基上選擇2個(gè)月而獲得轉(zhuǎn)化枝條。將這些枝條轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)形成根，然后種植在土壤中。在溫室中生長(zhǎng)3個(gè)月后可檢測(cè)塊莖的GUS表達(dá)。
實(shí)施例17精確育種的優(yōu)選構(gòu)建物和轉(zhuǎn)化方法除了pSIM340，可以使用許多的其它載體，通過(guò)用修飾P-DNAs轉(zhuǎn)化來(lái)改善馬鈴薯植株。這類載體中的兩種含有與除了在表皮外，在所有塊莖組織中都表達(dá)的PPO基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒(見實(shí)施例8)。載體pSIM370含有另外一個(gè)與磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒(見實(shí)施例6)。載體pSIM371含有馬鈴薯alfin-1同系物的第三個(gè)表達(dá)盒(圖1)。
第三個(gè)可選擇的載體，稱為pSIM372，含有馬鈴薯alfin-1同系物表達(dá)盒以及與PPO相關(guān)的尾隨序列、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列和與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列的融合體的正義和反義拷貝的表達(dá)盒。
對(duì)于使用1個(gè)菌株的方法，優(yōu)選的LifeSupport載體是pSIM365。對(duì)于使用2個(gè)菌株的方法，優(yōu)選的載體是pSIM367，其在質(zhì)粒主鏈中含有在T-DNA邊緣序列之間的NPTII和codA的表達(dá)盒以及另一個(gè)ΩvirD2的表達(dá)盒(圖5)。
用含有pSIM365以及載體pSIM370、371和372中的任何一個(gè)載體的1個(gè)菌株感染馬鈴薯的莖外植體，或者用分別含有pSIM366和優(yōu)選的興趣載體中的任何一個(gè)的2個(gè)菌株順序地感染馬鈴薯莖外植體。共培養(yǎng)2天以及短暫地選擇5天后，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖/再生以及除去土壤桿菌(Agrobacterium)。30天后，將外植體再次轉(zhuǎn)移到相同的但現(xiàn)在也含有5-FU的培養(yǎng)基中以除去含有LifeSupport T-DNAs的事件。將隨后在胼胝體上長(zhǎng)出的枝條轉(zhuǎn)移到可能含有100-200mM鹽的再生培養(yǎng)基中以篩選耐鹽性事件。允許IPT陰性的枝條生根并發(fā)育成成熟的植株。預(yù)計(jì)這些植株中的大部分(10％-100％)代表含有具有穩(wěn)定整合到它們基因組中的興趣核苷酸序列的P-DNA的無(wú)標(biāo)記的和無(wú)主鏈的植株。
表1.在反義馬鈴薯系中潛在表達(dá)未表征過(guò)的多肽
表3.轉(zhuǎn)化效率
表4.從Russet Ranger轉(zhuǎn)化中得到的主鏈整合
NA不能應(yīng)用的表5.從Russet Burbank轉(zhuǎn)化中得到的主鏈整合
表6.來(lái)自經(jīng)冷藏的pSIM320小塊莖的法國(guó)油炸食品中的丙烯酰胺水平
NA不能得到的表7.來(lái)自未轉(zhuǎn)化的成熟塊莖的法國(guó)油炸食品中的丙烯酰胺水平
*值越高表明完成的油炸產(chǎn)品的顏色越亮表8.在冷藏的pSIM332小塊莖中的葡萄糖水平
表.9在冷藏的pSIM216小塊莖中的葡萄糖水平
表10.表達(dá)修飾PPO基因馬鈴薯系的PPO活性
表11.在表達(dá)與PPO基因相關(guān)的修飾的尾隨序列的馬鈴薯小塊莖中的PPO活性
表12.用LifeSupport載體+pSIM011進(jìn)行的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化
共轉(zhuǎn)化的對(duì)于GUS和NPT PCR均呈陽(yáng)性僅有興趣基因?qū)τ贕US PCR呈陽(yáng)性未轉(zhuǎn)化的對(duì)于GUS和NPT PCR均呈陰性的植物表13.用LifeSupport載體和pSIM011順序轉(zhuǎn)化馬鈴薯
未轉(zhuǎn)化對(duì)于標(biāo)記和興趣基因PCR呈陰性的植株表14.用P-DNA載體pSIM340+LifeSupport進(jìn)行的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化
共轉(zhuǎn)化對(duì)于pSIM340的PPO基因以及LifeSupport的NPT基因PCR都呈陽(yáng)性未轉(zhuǎn)化對(duì)于PPO和NPTII PCR均呈陰性的植物表15.用pSIM340+改善的LifeSupport載體進(jìn)行的無(wú)標(biāo)記的馬鈴薯轉(zhuǎn)化
共轉(zhuǎn)化對(duì)于pSIM340的PPO基因和LifeSupport的NPT基因PCR均呈陽(yáng)性未轉(zhuǎn)化對(duì)于PPO和NPTII PCR均呈陰性的植物表16.用含有pSIM356和pSIM363的單個(gè)土壤桿菌菌株進(jìn)行的無(wú)標(biāo)記的馬鈴薯轉(zhuǎn)化
共轉(zhuǎn)化對(duì)于pSIM356的GUS基因和LifeSupport的NPT基因PCR均呈陽(yáng)性未轉(zhuǎn)化對(duì)于PPO和NPTII PCR均呈陰性的植物
SEQ ID NosSEQ ID No.1馬鈴薯P-DNA。SEQ ID NO.1的粗體下劃線部分分別代表P-DNA的左(5’-)和右(3’-)邊緣樣序列.
SEQ ID No.2小麥的P-DNASEQ ID No.3IPT基因的表達(dá)盒SEQ ID No.4雙載體pSIM111SEQ ID No.5馬鈴薯的轉(zhuǎn)化酶抑制的基因SEQ ID No.6馬鈴薯的GBSS啟動(dòng)子SEQ ID No.7馬鈴薯的泛素-3基因的終止子SEQ ID No.8與R1基因相關(guān)的馬鈴薯前導(dǎo)序列SEQ ID No.9馬鈴薯的泛素內(nèi)含子SEQ ID No.10與R1基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.11間隔區(qū)SEQ ID No.12與R1基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.13較長(zhǎng)的馬鈴薯GBSS啟動(dòng)子SEQ ID No.14與R1基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.15與R1基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.16與R1基因相關(guān)的馬鈴薯尾隨序列SEQ ID No.17與R1基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.18與R1基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.19與R1基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.20與R1基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.21與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的馬鈴薯前導(dǎo)序列SEQ ID No.22與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的馬鈴薯尾隨序列SEQ ID No.23與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.24與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒
SEQ ID No.25與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.26與L葡聚糖磷酸化酶基因相關(guān)的前導(dǎo)序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.27馬鈴薯的PPO基因SEQ ID No.28修飾的無(wú)活性的馬鈴薯PPO基因SEQ ID No.29與PPO基因相關(guān)的馬鈴薯尾隨序列SEQ ID No.30與PPO基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的表達(dá)盒SEQ ID No.31與PPO基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.32與PPO基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.33與PPO基因相關(guān)的尾隨序列的正義和反義拷貝的可選擇的表達(dá)盒SEQ ID No.34與淀粉分支酶基因相關(guān)的馬鈴薯尾隨序列SEQ ID No.35與淀粉分支酶基因相關(guān)的馬鈴薯尾隨序列SEQ ID No.36Ω突變的virD2基因的表達(dá)盒SEQ ID No.37馬鈴薯的耐鹽性基因Pst1SEQ ID No.38馬鈴薯的耐鹽性基因Pst2SEQ ID No.39馬鈴薯的耐鹽性基因Pst3SEQ ID No.40馬鈴薯塊莖的特異啟動(dòng)子SEQ ID No.56酵母ADH的終止子SEQ ID No.94小麥的左邊緣樣序列SEQ ID No.95小麥的右邊緣樣序列
SECID1GTTTACAGTACCATATATCCTGTCAGAGGTATAGAGGCATGACTGGCATGATCACTAAATTGATGCCCACAGAGGAGACTTATAACCTACAGGGGCACGTAGTTCTAGGACTTGAAAGTGACTGACCGTAGTCCAACTCGGTATAAAGCCTACTCCCAACTAAATATATGAAATTTATAGCATAACTGCAGATGAGCTCGATTCTAGAGTAGGTACCGAGCTCGAATTCCTTACTCCTCCACAAAGCCGTAACTGAAGCGACTTCTATTTTTCTCAACCTTCGGACCTGACGATCAAGAATCTCAATAGGTAGTTCTTCATAAGTGAGACTATCCTTCATAGCTACACTTTCTAAAGGTACGATAGATTTTGGATCAACCACACACACTTCGTTTACACCGGTATATATCCTGCCASEQID2TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAACAACCATAATCAGGCTGTAATTATCAAGAGAACTAATGACAAGAAGCAGAGCTTATCAAGTGTTTCGTCCAGCTGTAACATGGGCACAAAAGCTTGCTTGATGCATGTCTGGCTTTTCAAAGAGCAATGTATTCTCAGGTACCTGCACGTTTGATCCCCTACCACGTACAAGACGAGCAGAAAGGACATGTCTGCAGAAACTTAGACACATCCATTGCAGACTCGTTCCGAAGCATCAGGAGAGTAGTCAGCAATGGTCATCTGCTGATGTAAATTAATTGATTGTTGGTAATCAAATTTTAACAGCAATATATATAATATATCAATAGTATATTGAACTATGAAAGACTGTAATCATATATAACAGCATACAAATTGTCGTGGAAACAAGAGGAGCTCATCAAGTGTTTAGTTCAGAAATAGCTAACCAAGAATGCAATATAAATAGGGGTACTGAGCTCCCTTCAAAATTACTAACTTCAGAATAGCTAACCAAGAATGCAATGGCATTGCATAATTTAAACAACTGTCAGCACCAATCTCTGACTGAAGGCAGTTTACCCATTCAGAAGAGCACACATTTTCTGAACGACAACTCTGAGCGGGGATTGTTGACAGCAGCAATTAATCTGGCCTCAAGATGGTTTCCAACAACATAGATCAGATACAGCACTCAAGCACCCAATAATCAGCCAGTACTGATCTGGTTACCACTGCAATTGATTAACAGATGAACTGTGAAATTAAGATTTAACTGACAGTAATATATACCAGTTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAACSEQID3CTGCAGCCAAAGCACATACTTATCGATTTAAATTTCATCGAAGAGATTAATATCGAATAATCATATACATACTTTAAATACATAACAAATTTTAAATACATATATCTGGTATATAATTAATTTTTTAAAGTCATGAAGTATGTATCAAATCACATATGGAAAAAAATTAACTATTCATAATTTAAAAAAATAGAAAAGATACATCTAGTGAAATTAGGTGCATGTATCAAATACATTAGGAAAAGGGCATATTCTTGATCTAGATAATTAACGATTTTGATTTATGTATAATTTCCAAATGAAGGTTTATATCTACTTCAGAAATAACAATATACTTTTATCAGAACATTCAACAAAGTAACAACCAACTAGAGTGAAAAATACACATTGTTCTCTAAACATACAAAATTGAGAAAAGAATCTCAAAATTTAGAGAAACAAATCTGAATTTCTAGAAGAAAAAAATAATTATGCACTTTGCTATTGCTCGAAAAATAAATGAAAGAAATTAGACTTTTTTAAAAGATGTTAGACTAGATATACTCAAAAGCTATCAAAGGAGTAATATTCTTCTTACATTAAGTATTTTAGTTACAGTCCTGTAATTAAAGACACATTTTAGATTGTATCTAAACTTAAATGTATCTAGAATACATATATTTGAATGCATCATATACATGTATCCGACACACCAATTCTCATAAAAAGCGTAATATCCTAAACTAATTTATCCTTCNAGTCAACTTAAGCCCAATATACATTTTCATCTCTAAAGGCCCAAGTGGCACAAAATGTCAGGCCCAATTACGAAGAAAAGGGCTTGTAAAACCCTAATAAAGTGGCACTGGCAGAGCTTACACTCTCATTCCATCAAACAAAGAAACCCTAAAGCCGCAGCGCCACTGATTTCTCTCCTCCAGGCGAAGATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTAACGGGGAAGACGATCACCCTAGAGGTTGAGTCTTCCGACACCATCGACAATGTCAAAGCCAAGATCCAGGACAAGGAAGGGATTCCCCCAGACCAGCAGCGTTTGATTTTCGCCGGAAAGCAGCTTGAGGATGGTCGTACTCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGTCAACTCTCCATCTCGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGCGTCGCACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCGTAATTGTTTTTGGCTTTGTCCTGTTGTGGCAGGGCGGCAAATACTTCCGACAATCCATCGTGTCTTCAAACTTTATGCTGGTGAACAAGTCTTAGTTTCCACGAAAGTATTATGTTAAATTTTAAAATTTCGATGTATAATGTGGCTATAATTGTAAAAATAAACTATCGTAAGTGTGCGTGTTATGTATAATTTGTCTAAATGTTTAATATATATCA
TAGAACGCAATAAATATTAAATATAGCGCTTTTATGAAATATAAATACATCATTACAAGTTGTTTATATTTCGGGTGGACTAGTTTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGGAATTCSEQID4AGCTTTGGCAGGATATATACCGGTGTAAACGAAGTGTGTGTGGTTGATCCAAAATCTATCGTACCTTTAGAAAGTGTAGCTATGAAGGATAGTCTCACTTATGAAGAACTACCTATTGAGATTCTTGATCGTCAGGTCCGAAGGTTGAGAAAAATAGAAGTCGCTTCAGTTACGGCTTTGTGGAGGAGTAAGGGTACCTACTCTAGAATCGAGCTCATCGTTATGCTATAAATTTCATATATTTAGTTGGGAGTAGGCTTTATACCGAGTTGGACTACGGTCAGTCACTTTCAAGTCCTAGAACTACGTGCCCCTGTAGGTTATAAGTCTCCTCTGTGGGCATCAATTTAGTGATCATGCCAGTCATGCCTCTATACCTCTGACAGGATATATGGTACTGTAAACACTAGTTGTGAATAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTGAGATCTCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGGTCACCTATCTCGAGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGCCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTCCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGATACGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTCCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACACATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGAGGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGCGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGCAAAAAGAGTTGCTAGCTCTTGATCC
GGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAATAACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGATCCTGCAGCCAAAGCACATACTTATCGATTTAAATTTCATCGAAGAGATTAATATCGAATAATCATATACATACTTTAAATACATAACAAATTTTAAATACATATATCTGGTATATAATTAATTTTTTAAAGTCATGAAGTATGTATCAAATACACATATGGAAAAAATTAACTATTCATAATTTAAAAAATAGAAAAGATACATCTAGTGAAATTAGGTGCATGTATCAAATACATTAGGAAAAGGGCATATATCTTGATCTAGATAATTAACGATTTTGATTTATGTATAATTTCCAAATGAAGGTTTATATCTACTTCAGAAATAACAATATACTTTTATCAGAACATTCAACAAAGTAACAACCAACTAGAGTGAAAAATACACATTGTTCTCTAAACATACAAAATTGAGAAAAGAATCTCAAAATTTAGAGAAACAAATCTGAATTTCTAGAAGAAAAAAATAATTATGCACTTTGCTATTGCTCGAAAAATAAATGAAAGAAATTAGACTTTTTTAAAAGATGTTAGACTAGATATACTCAAAAGCTATCAAAGGAGTAATATTCTTCTTACATTAAGTATTTTAGTTACAGTCCTGTAATTAAAGACACATTTTAGATTGTATCTAAACTTAAATGTATCTAGAATACATATATTTGAATGCATCATATACATGTATCCGACACACCAATTCTCATAAAAAGCGTAATATCCTAAACTAATTTATCCTTCAAGTCAACTTAAGCCCAATATACATTTTCATCTCTAAAGGCCCAAGTGGCACAAAATGTCAGGCCCAATTACGAAGAAAAGGGCTTGTAAAACCCTAATAAAGTGGCACTGGCAGAGCTTACACTCTCATTCCATCAACAAAGAAACCCTAAAAGCCGCAGCGCCACTGATTTCTCTCCTCCAGGCGAAGATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTAACGGGGAAGACGATCACCCTAGAGGTTGAGTCTTCCGACACCATCGACAATCTCAAAGCCAAGATCCAGGACAAGGAAGGGATTCCCCCAGACCAGCAGCGTTTGATTTTCGCCGGAAAGCAGCTTGAGGATGGTCGTACTCTTGCCGACTACAACATCCAGAAGGAGTCAACTCTCCATCTCGTGCTCCGTCTCCGTGGTGGTGGATCCATGGACCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGAAAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGATCGGGTCCAATGCTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTGAAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCCAAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTTATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGTGCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAAGCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAAGAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGATATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAGCTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCATGCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAAGGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGCGTCGCACCTGTCTTCATCTGGATAAGATGTTCGTAATTGTTTTTGGCTTTGTCCTGTTGTGGCAGGGCGGCAAATACTTCCGACAATCCATCGTGTCTTCAAACTTTATGCTGGTGAACAAGTCTTAGTTTCCACGAAAGTATTATGTTAAATTTTAAAAATTTCGATGTATAATGTGGCTATAATTGTAAAAATAACTATCGTAAGTGTGCGTGTTATGTATAATTTGTCTAAATGTTTAATATATATCATAGAACGCAATAAATATTAAATATAGCGCTTTTATGAAATATAAATACATCATTACAAGTTGTTTATATTTCGGGTGGACTAGTTTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGGAATTCTATCCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGASEQID5ATGAGAAATTTATTCCCCATATTGATGCTAATCACCAATTTGGCACTCAACAACGATAACAACAACAACAACAACAACAACAATAATTATAATCTCATACACGCAACGTGTAGGGAGACCCCATATTACTCCCTATGTCTCACCACCCTACAATCCGGTCCACGTAGTAACGAGGTTGAGGGTGGTGATGCCATCACCACCCTAGGCCTCATCATGGTGGACGCGGTGAAATCAAAGTCCATAGAAATAATGGAAAAAATAAAAGAGCTAGAGAAATCGAACCCTGAGTGGCGGGCCCCACTTAGCCAGTGTTACGTGGCGTATAATGCCGTCCTACGAGCCGATGTAACGGTAGCCGTTGAAGCCTTAAAGAAGGGTGCCCCCAAATTTGCTGAAGATGGTATGGATGATGTTGTTGCTGAAGCACAAACTTGTGAGTATAGTTTTAATTATTATAATAAATTGGATTTTCCAATTTCTAATTTGAGTAGGGAAATAATTGAACTATCAAAAGTTGCTAAATCCATAATTAGAATGTTATTATGASEQID6GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGACACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGSEQID7TTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAAC
TATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGSEQID8ACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAAAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATSEQID9GTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGSEQID10GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID11GTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGSEQID12GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCACCTTATTTCACTACCACTTTCCACTCTCCAATCCCCATACTCTCTGCTCCAATCTTCATTTTGCTTCGTGAATTCATCTTCATCGAATTTCTCGACGCTTCTTCGCTAATTTCCTCGTTACTTCACTAGAAATCGACGTTTCTAGCTGAACTTGAGTGAATTAAGCCAGTGGGAGGATGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCATCCTCCCACTGGCTTAATTCACTCAAGTTCAGCTAGAAACGTCGATTTCTAGTGAAGTAACGAGGAAATTAGCGAAGAAGCGTCGAGAAATTCGATGAAGATGAATTCACGAAGCAAAATGAAGATTGGAGCAGAGAGTATGGGGATTGGAGAGTGGAAAGTGGTAGTGAAATAAGGTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAAGGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID13GAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCA
TCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACSEQID14GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTT1TTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID15GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGA1AAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAAGTACATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID16TCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGSEQID17GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAA
ATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID18GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATCATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQIDl9GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID20GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTCATATTCTAGTTGTATGTTGTTCAGAGAAGACCACAGATGTGATCATATTCTCATTGTATCAGATCTGTGACCACTTACCTGATACCTCCCATGAAGTTACCTGTATGATTATACGTGATCCAAAGCCATCACATCATGTTCACCTTCAGCTATTGGAGGAGAAGTGAGAAGTAGGAATTGCAATATGAGGAATAATAAGAAAAACTTTGTAAAAGCTAAATTAGCTGGGTATGATATAGGGAGAAATGTGTAAACATTGTACTATATATAGTATATACACACGCATTATGTATTGCATTATGCACTGAATAATACCGCAGCATCAAAGAAGGAATTCGTGGTAACTTTTA
CTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGCGGTATTATTCAGTGCATAATGCAATACATAATGCGTGTGTATATACTATATATAGTACAATGTTTACACATTTCTCCCTATATCATACCCAGCTAATTTAGCTTTTACAAAGTTTTTCTTATTATTCCTCATATTGCAATTCCTACTTCTCACTTCTCCTCCAATAGCTGAAGGTGAACATGATGTGATGGCTTTGGATCACGTATAATCATACAGGTAACTTCATGGGAGGTATCAGGTAAGTGGTCACAGATCTGATACAATGAGAATATGATCACATCTGTGGTCTTCTCTGAACAACATACAACTAGAATATGAAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID21TTAGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAAASEQID22GAGGGGGAAGTGAATGAAAAATAACAAAGGCACAGTAAGTAGTTTCTCTTTTTATCATGTGATGAAGGTATATAATGTATGTGTAAGAGGATGATGTTATTACCACATAATAAGAGATGAAGAGTCTCATTTTCTGCTTAAAAAAACAATTCACTGGCSEQID23GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACACAACACACTTAATTCCTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCG1ATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID24GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATATATAGTAAAAAATAGTCTAGA5EQID25GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAA
TACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATTCTCCTCCATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTCACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID26GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCGAGTGTGGGTAAGTAATTAAGTTAGGGATTTGTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTGCAGGAGATTTTCGTGCTTTTATTGATAAATAAAAAAAGGGTGACATTTAATTTCCACAAGAGGACGCAACACAACACACTTAATTCCTGTGTGTGAATCAATAATTGACTTCTCCAATCTTCATCAATAAAATAATTCACAATCCTCACTCTCTTATCACTCTCATTCGAAAAGCTAGATTTGCATAGAGAGCACAGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCTGTGCTCTCTATGCAAATCTAGCTTTTCGAATGAGAGTGATAAGAGAGTGAGGATTGTGAATTATTTTATTGATGAAGATTGGAGAAGTCAATTATTGATTCACACACAGGAATTAAGTGTGTTGTGTTGCGTCCTCTTGTGGAAATTAAATGTCACCCTTTTTTTATTTATCAATAAAAGCACGAAAATCTCCTGCACTACTCCCCTGCACTCTCTTATATTTGTCCATTTCCCACAAATCCCTAACTTAATTACTTACCCACACTCTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID27ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACATTGTGCTTATTGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGAAAACATTCCTCACGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAASEQTD28
ATGGCAAGCTTGTGCAATAGTAGTAGTACATCTCTCAAAACTCCTTTTACTTCTTCCTCCACTTCTTTATCTTCCACTCCTAAGCCCTCTCAACTTTTCATCCATGGAAAACGTAACCAAATGTTCAAAGTTTCATGCAAGGTTATCAATAATAACGGTGACCAAAACGTTGAAACGAATTCTGTTGATCGAAGAAATGTTCTTCTTGGCTTAGGTGGTCTTTATGGTGTTGCTAATGCTATACCATTAGCTGCATCCGCTGCTCCAACTCCACCTCCTGATCTCTCGTCTTGTAGTATAGCCAGGATTAACGAAAATCAGGTGGTGCCGTACAGTTGTTGCGCGCCTAAGCCTGATGATATGGAGAAAGTTCCGTATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTCCGTGTCCGTCAGCCTGCTCATGAAGCTAATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATCTGGCGATTAGTCGAATGAGAGATCTTGATAAGACACAACCTTTAAACCCTATTGGTTTTAAGCAACAAGCTAATATACAGTGGGCTTATGGTAATGGTGCTTATAGAATTGGTGGCAAAGAGTTACAAGTTCATAATTCTTGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACTTGTACTTCCACGAGAGAATCGTGGGAAAATTCATTGATGATCCAACTTTCGCTTTGCCATATTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGTATGCGTTTTCCTGCCATGTATGATCGTGAAGGGACTTCCCTTTTCGATGTAACACGTGACCAAAGTCACCGAAATGGAGCAGTAATCGATCTTGGTTTTTTCGGCAATGAAGTCGAAACAACTCAACTCCAGTTGATGAGCAATAATTTAACACTAATGTACCGTCAAATGGTAACTAATGCTCCATGTCCTCGGATGTTCTTTGGTGGGCCTTATGATCTCGGGATTAACACTGAACTCCCGGGAACTATAGGAAACATTCCTCTCGGTCCTGTCCACATCTGGTCTGGTACAGTGAGAGGTTCAACTTTGCCCAATGGTGCAATATCAAACGGTGAGAATATGGGTCATTTTTACTCAGCTGCTTTGGACCCGGTTTTCTTTTGCCATCACAGCAATGTGGATCGGATGTGGAGCGAATGGAAAGCGACAGGAGGGAAAAGAACAGATATCACACATAAAGGTTGGTTGAACTCCGAGTTCTTTTTCTATGATGAAAATGAAAACCCTTACCGTGTGAAAGTCCGAGACTGTTTGGACACGAAGAAGATGGGGTATGATTATGCACCAATGGCCACCCCGTGGCGTAACTTCAAGCCAATAACAAAAACTACAGCTGGGAAAGTGAATACAGCTTCTCTTCCGCCAGCTAGCAATGTATTCCCAGTGGCTAAACTCGACAAAGCAATTTCGTTTTCCATCAATAGGCCGACTTCGTCAAGGACTCAACAAGAGAAAAATGCACAAGAGGAGATGTTGACATTCAGTAGCATAAGATATGATAACAGAGGGTACATAAGGTTCGATGTGTTCCTGAACGTGGACAATAATGTGAATGCGAATGAGCTTGACAAGGCGGAGTTTGCGGGGAGTTATACTAGTTTGCCACATGTTCATAGAGCTGGTGAGACTAATCATATCGCGACTGTTGATTTCCAGCTGGCGATAACGGAACTGTTGGAGGATATTGGTTTGGAAGATGAAGATACTATTGCGGTGACTCTGGTGCCAAAGAGAGGTGGTGAAGGTATCTCCATTGAAAGTGCGACGATCAGTCTTGCAGATTGTTAASEQID29TTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGTTTGGGSEQID30GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAAGCCCTAAATTTGGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID31GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAAGAAGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGMTTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGGATATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID32GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGATGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTAC
TCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCAAGGTTAGAAATCTTCTCTATTTTTGGTTTTTGTCTGTTTAGATTCTCGAATTAGCTAATCAGGTGCTGTTATAGCCCTTAATTTTGAGTTTTTTTTCGGTTGTTTTGATGGAAAAGGCCTAAAATTTGAGTTTTTTTACGTTGGTTTGATGGAAAAGGCCTACAATTGGAGTTTTCCCCGTTGTTTTGATGAAAAAGCCCCTAGTTTGAGATTTTTTTTCTGTCGATTCGATTCTAAAGGTTTAAAATTAGAGTTTTTACATTTGTTTGATGAAAAAGGCCTTAAATTTGAGTTTTTCCGGTTGATTTGATGAAAAAGCCCTAGAATTTGTGTTTTTTCGTCGGTTTGATTCTGAAGGCCTAAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTCTCCGGCTGTTTTGATGAAAAAGCCCTAAATTTGAGTTTTTTCCCCGTGTTTTAGATTGTTTGGTTTTAATTCTCGAATCAGCTAATCAGGGAGTGTGAAAAGCCCTAAAATTTGAGTTTTTTTCGTTGTTCTGATTGTTGTTTTTATGAATTTGCAGATGGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID33GGTACCGAACCATGCATCTCAATCTTAATACTAAAAAATGCAACAAAATTCTAGTGGAGGGACCAGTACCAGTACATTAGATATTATCTTTTATTACTATAATAATATTTTAATTAACACGAGACATAGGAATGTCAAGTGGTAGCGGTAGGAGGGAGTTGGTTCAGTTTTTTAGATACTAGGAGACAGAACCGGAGGGGCCCATTGCAAGGCCCAAGTTGAAGTCCAGCCGTGAATCAACAAAGAGAGGGCCCATAATACTGTCGATGAGCATTTCCCTATAATACAGTGTCCACAGTTGCCTTCCGCTAAGGGATAGCCACCCGCTATTCTCTTGACACGTGTCACTGAAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTCACACTCACTCACTCACACAGCTCAACAAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTGTTCATCTGTAGCTTGGTAGATTCCCCTTTTTGTAGACCACACATCACGGATCCTTAGTCTCTATTGAATCTGCTGAGATTACACTTTGATGGATGATGCTCTGTTTTTGTTTTCTTGTTCTGTTTTTTCCTCTGTTGAAATCAGCTTTGTTGCTTGATTTCATTGAAGTTGTTATTCAAGAATAAATCAGTTACAATTATGGAATTCGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTGATTTCATGCATGTTTCCCTACATTCTATTATGAATCGTGTTATGGTGTATAAACGTTGTTTCATATCTCATCTCATCTATTCTGATTTTGATTCTCTTGCCTACTGAATTTGACCCTACTGTAATCGGTGATAAATGTGAATGCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCAGAAATCAATTTCTGTTTTGTTTTTGTTCATCTGTAGCTTGATATCCTTCTTTGATGCTGATCCATAATTGTAACTGATTTATTCTTGAATAACAACTTCAATGAAATCAAGCAACAAAGCTGATTTCAACAGAGGAAAAAACAGAACAAGAAAACAAAAACAGAGCATCATCCATCAAAGTGTAATCTCAGCAGATTCAATAGAGACTAAGCTTTTGATTTTAATGTTTAGCAAATGTCCTATCAGTTTTCTCTTTTTGTCGAACGGTAATTTAGAGTTTTTTTTGCTATATGGATTTTCGTTTTTGATGTATGTGACAACCCTCGGGATTGTTGATTTATTTCAAAACTAAGAGTTTTTGCTTATTGTTCTCGTCTATTTTGGATATCAATCTTAGTTTTATATCTTTTCTAGTTCTCTACGTGTTAAATGTTCAACACACTAGCAATTTGGCTGCAGCGTATGGATTATGGAACTATCAAGTCTGTGGGATCGATAAATATGCTTCTCAGGAATTTGAGATTTTACAGTCTTTATGCTCATTGGGTTGAGTATAATATAGTAAAAAAATAGTCTAGASEQID34GTCCATGATGTCTTCAGGGTGGTAGCATTGACTGATGGCATCATAGTTTTTTTTTTAAAAGTATTTCCTCTATGCATATTATTAGTATCCAATAAATTTACTGGTTGTTGTACATAGAAAAAGTGCATTTGCATGTATGTGTTTCTCTGAAATTTTCCCCAGTTTTTGGTGCTTTGCCTTTGGAGCCAAGTCTCTATATGTATAAGAAAACTAAGAACAATCACATATATCAAATATTAGSEQID35ACGAACTTGTGATCGCGTTGAAAGATTTGAACGCTACATAGAGCTTCTTGACGTATCTGGCAATATTGCATCAGTCTTGGCGGAATTTCATGTGACAACAAGGTTTGCAATTCTTTCCACTATTAGTAGTGCAACGATATACGCAGAGATGAAGTGCTGAACAAACATATGTAAAATCGATGAATTTATGTCGAATGCTGGGACGGGCTTCAGCAGGTTTTGCTTAGTSEQID36CCGCGGTTTTCTCTCCATCGCGTCAGAGGCCGGTTTTCGTCGGCATCGAAGAGGGCCACTCGTTTACCGTCATTTGCCAAAGCAGCGCAAAGGCCCATGAGTGCGGTGGTTTTGCCAGCACCCCCTTTGAAAGAGCAAAACGTCAAAAGTTGCATATTCTGATCCCGCCTGTCCTGTGAAACGGAGTGCATTTGTATTTTTGTTCGTATAAATGTTTTTGTGATTATCGATGAGTAAAAGCGTTGTTACACTATTTTTTATTTCAAATTCGTTATAATTAAATTGCAATTGTAGCAATTATATTCGGTTTTTCCTGTAAATATACTGTTGATTTCATATCGAGTAGGGCTAGACTTTAATCTGTCTACCCGGGCACATTTCGTGCTGGAGTATTCAGACCTTCCGCTTTTTTTGGAGGAAGCTATGTCAAAACACACCAGAGTCACGTCGAGTGAGACTGCCATCAACCAGCATCGATCCCTGAACGTTGAAGGGTTTAAGGTCGTGAGTGCCCGTCTGCGATCGGCCGAGTATGAAACCTTTTCCTATCAAGCGCGCCTGCTGGGACTTTCGGATAGTATGGCAATTCGCGTTGCGGTGCGTCGCATCGGGGGCTTTCTCGAAATAGATGCACACACCCGAGAAAAGATGGAAGCCATACTTCAGTCCATCGGAATACTCTCAAGTAATGTATCCATGCTTCTATCTGCCTACGCCGAAGACCCTCGATCGGATCTGGAGGCTGTGCGAGATGAACGTATTGCTTTTGGTGAGGCTTTCGCCGCCCTCGATGGCCTACTCCGCTCCATTTTGTCCGTATCCCGGCGACGGATCGACGGTTGCTCGCTATTGAAAGGTGCCTTGTAGCACTTGACCACGCACCTGACGGGAGAAAATTGGATGCCCGATCGCGCTCAAGTAATCATTCGCATTGTGCCAGGAGGTGGAACCAAGACCCTTCAGCAGATAATCAATCAGTTGGAGTACCTGTCCCGTAAGGGAAAGCTGGAACTGCAGCGTTCAGCCCGGCATCTCGATATTCCCGTTCCGCCGGATCAAATCCGTGAGCTTGCCCAAAGCTGGGTTACGGAGGCCGGGATTTATGACGAAAGTCAGTCAGACGATGATAGGCAACAAGACTTAACAACACACATTATTGTAAGCTTCCCCGCAGGTACCGACCAAACCGCAGCTTATGAAGCCAGCCGGGAATGGGCAGCCGAGATGTTTGGGTCAGGATACGGGGGTGGCCGCTATAACTATCTGACAGCCTACCACGTCGACCGCGATCATCCACATTTACATGTCGTGGTCAATCGTCGGGAACTTCTGGGGCACGGGTGGCTGAAAATATCCAGGCGCCATCCCCAGCTGAATTATGACGGCTTACGGAAAAAGATGGCAGAGATTTCACTTCGTCACGGCATAGTCCTGGATGCGACTTCGCGAGCAGAAAGGGGAATAGCAGAGCGACCAATCACATATGCTGAACATCGCCGCCTTGAGCGGATGCAGGCTCAAAAGATTCAATTCGAAGATACAGATTTTGATGAGACCTCGCCTGAGGAAGATCGTCGGGACCTCAGTCAATCGTTCGATCCATTTCGATCGGACCCATCTACCGGCGAACCGGACCGTGCAACCCGACATGACAAACAACCGCTTGAACAGCACGCCCGTTTCCAGGAGTCCGCCGGCTCCAGCATCAAAGCCGACGCAC
GGATCCGCGTATCATTGGAGAGCGAGCGGAGTGCCCAACCATCCGCGTCCAAAATCCCTGTAATTGGGCATTTCGGGATTGAGACTTCCTATGTCGCTGAAGCCAGCGTGCGCAAACGAAGCGGCATTTTCGGTACTTCTCGCCCGGTGACTGACGTTGCCATGCACACAGTCAAGCGCCAGCAGCGATCAAAACGACGTAATGACGAGGAGGCAGGTCCGAGCGGAGCAAACCGTAAAGGATTGAAGGCTGCGCAAGTTGATTCCGAGGCAAATGTCGGTGAGCAAGACACTCGCGATGACAGCAACAAGGCGGCTGATCCGGTGTCTGCTTCCATCGGTACCGAGCAACCGGAAGCTTCTCCAAAGCGTCCGCGTGACCGTCACGATGGAGAATTGGGTGGACGCAAACGTGCAAGAGGTAATCGTCGCTCGAGCTCGAGCGGGGGGACCTAGAGACAGGAAGGACCGAATAATGGCCGCGGSEQID37ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAGCTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTAAACTTCATTACTATAATGATGTTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCCATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTCGACCTTACGAGCATGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTATATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACTTGCTGGCCGAATTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACCGTCTTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCACTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACACTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGACTAATCTTGCTTGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTATCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGCGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCTGAGGTACCAATCSEQID38ATGGCTTCTGTGCTGGCTTCTCTGTTTCCAAAACTGGGCTCTTTGGGTACTTCAGATCATGCTTCTGTTGTATCCATCAACCTCTTTGTGGCACTCCTTTGTGCTTGCATCATCATTGGTCATCTCTTGGAGGAGAACCGCTGGGTTAATGAGTCCATTACTGCCCTCATAATTGGTTTGTGTACAGGAGTGGTTATCTTGCTCGTAAGTGGTGGAAAGAACTCACACCTTCTGGTTTTCAGTGAAGATCTCTTTTTCATATATGTACTTCCTCCAATCATATTTAATGCAGGGTTTCAGGTAAAAAAGAAGCAATTTTTCGTGAACTTCATTACTATAATGATGTTCGGAGCCATTGGTACCCTGGTCTCATGTGCCATTATATCATTAGGTGCAATTCAAACTTTCAAGAAGTTGGACATTGAATTTCTAGATATTGGGGATTATCTTGCAATTGGAGCAATATTTGCTGCCACAGATTCCGTCTGCACATTGCAGGTCCTACATCAGGATGAGACACCCCTCCTTTACAGTCTTGTATTTGGAGAAGGAGTTGTAAATGATGCTACATCGGTGGTGCTTTTCAATGCTATTCAAAACTTTGACCTTACGAGCGTGAATCCCAGTATAGCCCTCAGTTTCCTTGGCAACTTCTTCTATCTGTTCCTTGCTAGCACTTTACTGGGAGCAGGAACTGGTCTTCTTAGTGCTTACATTATCAAGAAGCTGTATTTTGGCAGGCACTCCACAGATCGTGAGGTTGCCCTTATGATGCTCATGGCTTACTTATCATACATGCTGGCTGAACTATTCTATTTGAGTGGGATTCTCACTGTATTTTTCTGTGGTATTGTAATGTCTCATTACACTTGGCACAATGTGACCGAGAGTTCAAGAGTCACTACAAGGCACGCTTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCAGAGACTTTCCTCTTCCTCTATGTCGGCATGGATGCTTTGGATATCGAGAAGTGGAAATTTGTTGGTGACAGGCCTGGATTATCAATTTCCGTGAGTTCAATACTGATGGGATTAATCTTGCTGGGGAGAGCTGCCTTTGTTTTTCCATTATCATTCTTCTCCAACTTAATGAAGAAATCCTCGGAGCAAAAAATTACCTTTAGGCAGCAAGTGATAATATGGTGGGCAGGTTTGATGAGAGGCGCAGTGTCCATGGCACTGGCATATAATAAGTTCACTCGTTGGGGGACACACTCAACTGCAGGACAATGCAATAATGATTACCAGCACGATAACCATTGTTCTATTCAGCACAATGGTATTCGGTTTAATGACAAAACCCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACCACAGAGGCAATTGAGTACAGTGTCATCAGGTGCAAATACTCCAAAGTCTCTAACAGCCCCACTCCTAGGCAGTCGAGAGGACTCTGAAGTTGATTTAAATGTTCCAGATCTTCCTCACCCACCAAGTTTGAGGATGCTACTTACCGCACCAAGTCATAAAGTGCATCGGTACTGGCGCAAGTTTGACGATGCATTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGTCGGGGATTTGCTCCTCCTGCCCCTGGTTCTCCAACGGAACAGGGTCCATGAGGTACAATCSEQID39ATGGAAAATTCGGTACCCAGGACTGTAGAAGAAGTATTCAACGATTTCAAAGGTCGTAGAGCTGGTTTAATCAAAGCACTAACTACAGATGTCGAGAAGTTTTATCAATCGTGTGATCCTGAAAAGGAGAACTTGTGTCTCTATGGGCTTCCTAATGAAACATGGGAAGTAAACCTCCCTGTAGAGGAGGTGCCTCCAGAACTTCCGGAGCCAGCATTGGGCATAAACTTCGCACGTGATGGAATGCAAGAGAAAGACTGGTTATCACTTGTTGCTGTTCACAGTGATTCATGGCTGCTTTCTGTTGCATTTTACTTTGGTGCAAGGTTTGGGTTCGGCAAGAGTGAAAGGAAGAGGCTTTTCCAAATGATAAATGATCTCCCAACAGTGTTTGAAGTTGTTACCGGAGCTGCTAAACAGACACGTGATCCCCCTCACAACAATAGCAACAAAAGCAAATCAAGTGGAAAGCCTCGACAGCCAGAGTCCCAACTCAAGGCAGTAAAGGTGTCTCCACCTAAAATGGAGAACGACAGTGGGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAGGATGAACAAGGAGCAACTCTCTGTGGAGCTTGTGGTGATAATTATGCCACTGATGAATTCTGGATTTGCTGTGATATTTGTGAGAGATGGTTCCATGGCAAATGTGTGAAGATTACCCCAGCAAAAGCTGAGCATATCAAGCAGTACAAGTGTCCTAGTTGCAGTAGCAAGAGAGCTAGAGTTTAASEQID40TGACATCTGCCAATAAAGCCAAGAATAATTGGCATTAACATGACCAAAAAAATGGTTTGGCAGCATTAAGTCAAATAAAAAAGCTACTTTAATATAAAATAATATTAAAATGCTTAATAACCAACAGTTTATAAGAAGGTTAATGTTAACATGGATGAGGAATGACCAAAAGGGGAATTATATATTAACCTTTAAATCAATCTAATTCTCTCTTTTTGTTTCTAGCTATATTTACTCGATAGATAAACTCTCTTACTTGACGAATTTTTTGATACAAGAAGACATATTTCATCATGATTTTAATTCGTCGTGTCAAATTTATTAAATAGTTTAATTTTAATCGTAAATTTAGATATGAAATTTAAAAAAAAATAAATATATACATATTTGAAGAATACATAAAAAGTACATATAAATCACAAATATTTAATAATTCAAGATATTAAAACACATAGAAAAATAATTACTTACAAAGAAATTCTTATTTGAATCCTCTAAATTCGAGAAGTGCAACACAAACTGAGACGAAGAAAATGAATAATAATATTTGATAAGAAATTTATTATAATTGAATGACCATTTAAGTAATTACGGGTAATAACACAATAAGGAACTGTAGTCATTTTTAATACATGGCAAGGAATATGAGAGTGTGATGAGTCTATAAATAGAAGGCTTCATTAGTGTAGAGGAGTCACAAACAAGCAATACACAAATAAAATTAGTAGCTTAAACAAGATG
SEQID56TTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCSEQID94TGGCAGGATATATGAGTGTGTAAACSEQID95TTGGCAGGATATATCCCTCTGTAAAC
權(quán)利要求
1.修飾所選植物特性的方法，包括a.用期望的多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化所選植物的細(xì)胞，其中所述的期望的多核苷酸基本上由所選植物、相同種植物或與所選植物性互交可孕的植物的天然核酸序列構(gòu)成，b.從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物含有穩(wěn)定地整合到基因組中的所述的期望的多核苷酸，其中所述的期望的多核苷酸修飾所述的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用在所述的植物細(xì)胞中短暫表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)染所述的植物細(xì)胞，鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，從所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化植物，其中不穩(wěn)定地整合所述的選擇性標(biāo)記基因，并且將所述的期望的多核苷酸穩(wěn)定地整合到基因組中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物是單子葉植物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物是雙子葉植物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的特性從由提高的健康和營(yíng)養(yǎng)特性、改善的貯藏性、提高的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的對(duì)重金屬的耐受性、提高的對(duì)干旱的耐受性、提高的對(duì)疾病的耐受性、提高的對(duì)昆蟲的耐受性、提高的對(duì)水應(yīng)力的耐受性、增強(qiáng)的對(duì)冷和霜凍的耐受性、增加的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的結(jié)構(gòu)、降低的磷酸鹽含量、提高的發(fā)芽率、提高的微營(yíng)養(yǎng)攝入、改善的淀粉組成、提高的花的壽命構(gòu)成的組中選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的期望的多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT。
9.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化所述的植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中第一雙載體含有所述的期望的多核苷酸，第二雙載體含有功能性的選擇標(biāo)記基因，其中將所述的功能性的選擇標(biāo)記基因可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子上。
13.通過(guò)權(quán)利要求1的方法制備的植物。
14.修飾所選植物的特性的方法，包括(a)鑒定將要修飾的特性；(b)構(gòu)建基本上由從所述的所選植物、相同種植物或與所述的所選植物性互交可孕的植物中分離的天然遺傳元件構(gòu)成的第一個(gè)多核苷酸，其中所述的遺傳元件能夠修飾控制所述特性的功能基因的表達(dá)；(c)構(gòu)建包含功能性的選擇性標(biāo)記基因的第二個(gè)多核苷酸；(d)用所述的第一個(gè)和第二個(gè)多核苷酸共轉(zhuǎn)染所述的所選植物的植物細(xì)胞；(e)選擇所述的功能性的選擇性標(biāo)記基因的短暫表達(dá)；(f)篩選用所述第一個(gè)多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化但不含有整合到基因組中的所述第二個(gè)多核苷酸的植物細(xì)胞；(g)從顯示所述特性的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的植物是單子葉植物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述的植物是雙子葉植物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的雙子葉植物從由鱷梨、馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述的特性從由提高的健康和營(yíng)養(yǎng)特性、改善的貯藏性、提高的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的對(duì)重金屬的耐受性、提高的對(duì)干旱的耐受性、提高的對(duì)疾病的耐受性、提高的對(duì)昆蟲的耐受性、提高的對(duì)水應(yīng)力的耐受性、增強(qiáng)的對(duì)冷和霜凍的耐受性、增加的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的結(jié)構(gòu)、降低的磷酸鹽含量、提高的發(fā)芽率、提高的微營(yíng)養(yǎng)攝入、改善的淀粉組成、提高的花的壽命構(gòu)成的組中選擇。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述的遺傳元件包括啟動(dòng)子、興趣序列、終止子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、間隔區(qū)或調(diào)節(jié)元件中的至少一個(gè)。
21.權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化所述的植物細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。
23.權(quán)利要求22的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中第一雙載體具有所述的第一多核苷酸，第二雙載體具有所述的第二多核苷酸。
25.修飾所選植物功能基因表達(dá)的方法，包括(a)構(gòu)建基本上由從所述的所選植物、與所述的所選植物相同種的植物、或者與所述的所選植物性互交可孕的植物中分離的天然遺傳元件構(gòu)成的第一多核苷酸，其中所述的天然遺傳元件能夠修飾所述功能基因的表達(dá)；(b)構(gòu)建包含可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子上的選擇性標(biāo)記基因的第二多核苷酸；(c)用所述的第一和第二多核苷酸共轉(zhuǎn)染所述的所選植物的植物細(xì)胞；(d)選擇所述的選擇性標(biāo)記基因的短暫表達(dá)；(e)篩選用所述的第一多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化但不含整合到基因組中的第二多核苷酸的植物細(xì)胞；以及(f)從顯示所述基因的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化的植物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的植物是單子葉植物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述的植物是雙子葉植物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
30.權(quán)利要求25的方法，其中通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化所述的植物細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一個(gè)雙載體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中第一雙載體具有所述的第一多核苷酸，第二雙載體具有所述的第二多核苷酸。
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述的第一多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、與PPO相關(guān)的尾隨序列、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT中的至少一個(gè)。
35.權(quán)利要求25的方法，其中所述的第二多核苷酸包括選擇性的標(biāo)記基因、Ω突變的virD2多核苷酸、codA多核苷酸、以及codA::upp融合多核苷酸中的至少一個(gè)。
36.通過(guò)權(quán)利要求25的方法制備的植物。
37.顯示與其來(lái)源的非轉(zhuǎn)基因植物相比，特性的表達(dá)經(jīng)過(guò)修飾的轉(zhuǎn)基因植物，其中用基本上由天然遺傳元件構(gòu)成的期望的多核苷酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化所述的轉(zhuǎn)基因植物，該多核苷酸是從所述植物、相同種的植物、或者與所述植物性互交可孕的植物中分離出來(lái)的，其中所述的多核苷酸修飾所述特性的表達(dá)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的植物，其中所述的植物是單子葉植物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的植物，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的植物，其中所述的植物是雙子葉植物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的植物，其中所述的雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的特性，其中所述的特性從由提高的健康和營(yíng)養(yǎng)特性、改善的貯藏性、提高的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的對(duì)重金屬的耐受性、提高的對(duì)干旱的耐受性、提高的對(duì)疾病的耐受性、提高的對(duì)昆蟲的耐受性、提高的對(duì)水應(yīng)力的耐受性、增強(qiáng)的對(duì)冷和霜凍的耐受性、增加的顏色、增加的甜味、提高的活力、改善的口味、改善的結(jié)構(gòu)、降低的磷酸鹽含量、提高的發(fā)芽率、提高的微營(yíng)養(yǎng)攝入、改善的淀粉組成、提高的花的壽命構(gòu)成的組中選擇。
43.根據(jù)權(quán)利要求37的期望的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包括P-DNA、GBSS啟動(dòng)子、Ubi7啟動(dòng)子、Ubi3啟動(dòng)子、PIP啟動(dòng)子、修飾的PPO基因、與PPO相關(guān)的尾隨序列、轉(zhuǎn)化酶抑制劑基因、耐鹽性基因、與R1相關(guān)的前導(dǎo)序列、與磷酸化酶相關(guān)的前導(dǎo)序列、與R1相關(guān)的尾隨序列、與SBE相關(guān)的尾隨序列、Ubi內(nèi)含子、GBSS間隔區(qū)、UbiT中的中的至少一個(gè)。
44.一種分離的邊緣樣核苷酸序列，其大小為20-100bp，與根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊緣序列有52％至96％的序列同一性。
45.權(quán)利要求44的分離的核苷酸序列，其中從單子葉植物中分離所述的核苷酸序列。
46.權(quán)利要求45的分離的核苷酸，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
47.權(quán)利要求44的分離的核苷酸序列，其中從雙子葉植物中分離所述的核苷酸序列。
48.權(quán)利要求47的分離的核苷酸序列，其中所述的雙子葉植物從由馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
49.權(quán)利要求44的核苷酸序列，它分離自馬鈴薯并具有在SEQ IDNO.54或55中所示的核苷酸序列。
50.權(quán)利要求44的核苷酸序列，它分離自小麥并具有在SEQ IDNO.94或95中所示的核苷酸序列。
51.制備用期望的多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物的方法，包括(a)從所述的植物中分離兩側(cè)是邊緣樣序列的P-DNA，其中所述的邊緣樣序列與根癌農(nóng)桿菌的T-DNA邊緣序列有52％至96％的序列同一性。(b)在所述的P-DNA邊緣樣序列之間插入所述的期望的多核苷酸以形成P-DNA構(gòu)建物；和(c)用所述的P-DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化所述植物的植物細(xì)胞；和(d)從用所述的P-DNA構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中重新獲得植物。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中將所述的P-DNA構(gòu)建物負(fù)載在由主鏈整合標(biāo)記基因構(gòu)成的載體上，選擇不含有所述的主鏈整合標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述的主鏈整合標(biāo)記基因從由細(xì)胞分裂素基因構(gòu)成的組中選出，其中不選擇顯示過(guò)量生產(chǎn)細(xì)胞分裂素表型的植物枝條。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述的主鏈整合標(biāo)記基因是IPT基因，并且不選擇顯示異常表型或不能生長(zhǎng)出根的植物枝條。
55.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述的植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述的單子葉植物從由小麥、草皮、草坪草、谷類植物、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、蝴蝶花、百合、洋蔥、香蕉、甘蔗、高梁、以及棕櫚構(gòu)成的組中選擇。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述的植物細(xì)胞來(lái)自雙子葉植物。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述的雙子葉植物從由鱷梨、馬鈴薯、煙草、番茄、甜菜、花莖甘藍(lán)、木薯、甘薯、胡椒、棉花、一品紅、豆科植物、苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、以及仙人掌構(gòu)成的組中選擇。
59.權(quán)利要求51的方法，其中通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)染所述的植物細(xì)胞。
60.權(quán)利要求59的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化依賴于使用至少一種雙載體。
61.權(quán)利要求60的方法，其中土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用第一雙載體和第二雙載體。
62.權(quán)利要求61的方法，其中第一雙載體具有所述的P-DNA構(gòu)建物。
63.權(quán)利要求61的方法，其中第二雙載體包括陰性選擇性標(biāo)記基因和Ω突變的virD2基因中的至少一個(gè)，其中陰性選擇性標(biāo)記基因位于T-DNA的右邊緣序列和T-DNA的左邊緣序列內(nèi)，其中Ω突變的virD2基因位于第二雙載體的主鏈內(nèi)。
64.包含權(quán)利要求44的核苷酸序列的載體。
65.在5’-到3’-方向上，基本上由第一T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、可操作地連接到啟動(dòng)子上的期望的多核苷酸序列、終止子以及第二T-DNA邊緣樣序列構(gòu)成的P-DNA，其中邊緣樣序列與T-DNA邊緣序列具有低于100％的序列同一性。
66.權(quán)利要求65的P-DNA，其中所述的T-DNA邊緣樣序列、所述的啟動(dòng)子、所述的期望的多核苷酸以及所述的終止子都是從相同的植物、相同的植物種、或性互交可孕的植物中分離出來(lái)的。
67.權(quán)利要求65的P-DNA，它進(jìn)一步基本上由選擇性標(biāo)記基因構(gòu)成。
68.權(quán)利要求67的P-DNA，其中所述的T-DNA邊緣樣序列、所述的啟動(dòng)子、所述的期望多核苷酸、所述的終止子以及所述的選擇性標(biāo)記基因都是從相同的植物、相同的植物種、或性互交可孕的植物中分離出來(lái)的。
69.權(quán)利要求65的P-DNA，其中期望的多核苷酸序列是基因編碼區(qū)的上游或下游序列，其中上游序列是前導(dǎo)序列，其中下游序列是尾隨序列。
70.權(quán)利要求69的P-DNA，其中所述的T-DNA邊緣樣序列、所述的啟動(dòng)子、所述的前導(dǎo)序列、所述的尾隨序列、所述的終止子以及所述的選擇性標(biāo)記基因都是從相同的植物、相同的植物種、或性互交可孕的植物中分離出來(lái)的。
71.一種包含從馬鈴薯中分離的GBSS啟動(dòng)子的分離的核苷酸序列。
72.權(quán)利要求71的分離的核苷酸序列，它具有SEQ ID NO.6或13的核苷酸序列。
73.包含權(quán)利要求65的P-DNA的載體。
74.根據(jù)權(quán)利要求74的載體，其中所述的啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的載體，其中可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子對(duì)溫度敏感。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的載體，其中可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是小麥wcs120啟動(dòng)子。
77.根據(jù)權(quán)利要求74的載體，其中所述的啟動(dòng)子在時(shí)序調(diào)節(jié)下。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的載體，其中所述的啟動(dòng)子是羧化酶啟動(dòng)子。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的載體，其中羧化酶啟動(dòng)子是玉米羧化酶啟動(dòng)子。
80.根據(jù)權(quán)利要求74的載體，其中通過(guò)脫落酸、創(chuàng)傷、茉莉酮酸甲酯或赤霉酸中的任何一種調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的載體，其中所述的啟動(dòng)子是從Rab 16A基因的啟動(dòng)子、α淀粉酶基因的啟動(dòng)子或pin2基因的啟動(dòng)子中選出的啟動(dòng)子。
82.根據(jù)權(quán)利要求73的載體，其中所述的啟動(dòng)子是組織特異性的啟動(dòng)子。
83.根據(jù)權(quán)利要求69的載體，其中所述的前導(dǎo)序列是與所選的植物種細(xì)胞的內(nèi)源性基因相關(guān)的5’-非翻譯區(qū)的一部分。
84.根據(jù)權(quán)利要求69的載體，其中5’-非翻譯區(qū)是基因起始密碼子的上游序列，該基因從由PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因構(gòu)成的組中選出。
85.根據(jù)權(quán)利要求69的載體，其中所述的尾隨序列是與位于選自下列基因的終止密碼子下游的基因相關(guān)的基因的3’-非翻譯區(qū)的一部分PPO基因、R1基因、HOS1基因、S-腺苷高半胱水解酶基因、II類肉桂酸-4-羥化酶基因、肉桂酰-輔酶A還原酶基因、肉桂酰醇脫氫酶基因、咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、Nin88基因、Lol p5基因、變應(yīng)原基因、P450羥化酶基因、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、脯氨酸脫氫酶基因、內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶基因、玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶基因、以及1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因。
86.根據(jù)權(quán)利要求65的載體，它進(jìn)一步包括作為Ubi內(nèi)含子序列或GBSS間隔區(qū)序列的間隔區(qū)元件。
87.根據(jù)權(quán)利要求65的載體，其中所述的終止子是Ubi3終止子序列或內(nèi)源性的植物基因的3’-非翻譯區(qū)。
88.根據(jù)權(quán)利要求65的載體，它進(jìn)一步包括可操作地連接到組成型啟動(dòng)子上的選擇性標(biāo)記基因以及可操作地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上的Cre基因，其中選擇性標(biāo)記基因和Cre基因的兩側(cè)是第一重組酶的識(shí)別位點(diǎn)和第二重組酶的識(shí)別位點(diǎn)。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的載體，其中第一重組酶的識(shí)別位點(diǎn)和第二重組酶的識(shí)別位點(diǎn)是1ox位點(diǎn)。
90.根據(jù)權(quán)利要求88的載體，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是溫度敏感的啟動(dòng)子、可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、或時(shí)序啟動(dòng)子。
91.根據(jù)權(quán)利要求88的載體，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是Ha hsp17.7G4啟動(dòng)子、小麥wcs120啟動(dòng)子、Rab 16a基因啟動(dòng)子、α淀粉酶基因啟動(dòng)子、pin2基因啟動(dòng)子、羧化酶啟動(dòng)子。
92.根據(jù)權(quán)利要求65的載體，它進(jìn)一步包括植物來(lái)源的標(biāo)記基因。
93.根據(jù)權(quán)利要求92的載體，其中植物來(lái)源的標(biāo)記基因是烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶基因、耐鹽性基因、或PST1基因、PST2基因、或PST3基因。
94.修飾植物細(xì)胞的方法，包括將P-DNA序列插到植物細(xì)胞的基因組中，其中在5’到3’方向上，P-DNA基本上由第一個(gè)T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、可操作地連接到啟動(dòng)子上的期望的多核苷酸序列、終止子、以及第二個(gè)T-DNA邊緣樣序列構(gòu)成，其中邊緣樣序列與T-DNA邊緣序列有少于100％的序列同一性，其中T-DNA邊緣樣序列、啟動(dòng)子、期望的多核苷酸、以及終止子都分離自或?qū)儆谥参锛?xì)胞的基因組，其中期望的多核苷酸包括與植物基因的上游或下游的非編碼區(qū)相關(guān)的前導(dǎo)序列或尾隨序列的正義和反義序列，其中期望的多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生靶向與期望的多核苷酸相關(guān)的基因的雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄本，從而修飾植物細(xì)胞。
95.修飾植物的方法，包括(i)用權(quán)利要求88的載體轉(zhuǎn)染植物的至少一個(gè)細(xì)胞；(ii)選擇表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)胞；(iii)分離表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)胞；(iii)在分離的細(xì)胞中誘導(dǎo)Cre基因的表達(dá)；(iv)培養(yǎng)分離的細(xì)胞；和(ii)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的表型；其中不同于未轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞的表型表明靶植物細(xì)胞已經(jīng)被修飾。
96.根據(jù)權(quán)利要求14或95的方法，其中通過(guò)鑒定哪些細(xì)胞抵抗抗生素而完成選擇步驟。
97.鑒定基因組含有P-DNA的靶植物細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求65的載體以及來(lái)源于第二個(gè)土壤桿菌的載體共轉(zhuǎn)染植物靶細(xì)胞，其中來(lái)源于第二個(gè)土壤桿菌的載體包括兩側(cè)是T-DNA邊緣序列或T-DNA邊緣樣序列的標(biāo)記基因以及Ω突變的virD2基因，其中將權(quán)利要求65的載體的P-DNA整合到植物靶細(xì)胞的基因組中，并且其中不將來(lái)源于第二個(gè)土壤桿菌的載體的任何部分整合到植物靶細(xì)胞的基因組中，其中Ω突變的virD2基因位于主鏈內(nèi)。
98.根據(jù)權(quán)利要求97的方法，其中來(lái)源于第二個(gè)土壤桿菌的載體中的標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
99.鑒定基因組含有根據(jù)權(quán)利要求98的整合盒的至少一部分的靶植物細(xì)胞的方法，它進(jìn)一步包括選擇在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中時(shí)序生長(zhǎng)存活的細(xì)胞，其中所選細(xì)胞的基因組僅含有整合盒。
100.根據(jù)權(quán)利要求94、95或97中任何一項(xiàng)的方法，其中靶植物細(xì)胞位于植物內(nèi)。
101.包含至少一個(gè)其基因組含有根據(jù)權(quán)利要求65的P-DNA的細(xì)胞的植物。
102.包含至少一個(gè)其基因組被人工操縱以僅含有植物來(lái)源核酸的細(xì)胞的植物，其中沒有一個(gè)細(xì)胞含有被整合到細(xì)胞的基因組中的外源核酸。
103.權(quán)利要求102的植物，其中所述的細(xì)胞能夠表達(dá)植物來(lái)源的核酸中的至少一個(gè)，該核酸的表達(dá)修飾了與植物相關(guān)的特性。
104.減少所選植物種中的黑斑擦傷的方法，包括(i)將用邊緣樣序列描繪的P-DNA整合到所選植物種的基因組中，其中P-DNA僅包含天然屬于或分離自所選植物種的多核苷酸，或者包含天然屬于或分離自與所選植物種性親和的植物種的多核苷酸，其中P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由啟動(dòng)子、PPO基因的正義方向的前導(dǎo)核苷酸序列、前導(dǎo)核苷酸序列的反義方向序列以及終止序列構(gòu)成，其中所述的啟動(dòng)子產(chǎn)生雙鏈RNA分子，其中所述的雙鏈RNA分子造成內(nèi)源性PPO基因表達(dá)減少，因此減少植物中的黑斑擦傷。
105.減少所選植物種中的黑斑擦傷的方法，包括將用邊緣樣序列描繪的P-DNA整合到所選植物種的基因組中，其中P-DNA僅包含天然屬于或分離自所選植物種的核苷酸序列，或者包含天然屬于或分離自與所選植物種性親和的植物種的多核苷酸，其中P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由啟動(dòng)子、PPO基因的正義方向的尾隨核苷酸序列、尾隨核苷酸序列的反義方向序列以及終止序列構(gòu)成，其中所述的啟動(dòng)子產(chǎn)生雙鏈RNA分子，其中所述的雙鏈RNA分子造成PPO基因表達(dá)減少，因此減少植物中的黑斑擦傷。
106.減少所選植物種中的冷誘導(dǎo)變甜的方法，包括將用邊緣樣序列描繪的P-DNA整合到所選植物種的基因組中，其中P-DNA僅包含從所選植物種中分離的核苷酸序列，或者包含天然屬于或分離自與所選植物種性親和的植物種的多核苷酸，其中P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由啟動(dòng)子、與R1基因相關(guān)的正義方向的前導(dǎo)核苷酸序列、前導(dǎo)核苷酸序列的反義方向序列以及終止序列構(gòu)成，其中所述的啟動(dòng)子產(chǎn)生雙鏈RNA分子，其中所述的雙鏈RNA分子減少R1基因的表達(dá)，因此減少植物中冷誘導(dǎo)的變甜。
107.減少所選植物種中的冷誘導(dǎo)變甜的方法，包括將用邊緣樣序列描繪的P-DNA整合到所選植物種的基因組中，其中P-DNA僅包含從所選植物種中分離的核苷酸序列，或者由天然屬于或分離自與所選植物種性親和的植物種的多核苷酸，其中P-DNA在5’-到3’-方向上基本上由啟動(dòng)子、與R1基因相關(guān)的正義方向的尾隨核苷酸序列、尾隨核苷酸序列的反義方向序列以及終止序列構(gòu)成，其中所述的啟動(dòng)子產(chǎn)生雙鏈RNA分子，其中所述的雙鏈RNA分子減少R1基因的表達(dá)，因此減少植物中冷誘導(dǎo)的變甜。
108.權(quán)利要求8的方法，其中興趣序列是基因。
109.權(quán)利要求108的方法，其中所述的基因是經(jīng)過(guò)修飾的多酚氧化酶、多酚氧化酶基因、或經(jīng)過(guò)修飾的R1基因、或R1基因。
110.權(quán)利要求8的方法，其中所述的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
111.權(quán)利要求8的方法，其中所述的終止子是酵母ADH的終止子序列。
112.權(quán)利要求8的方法，其中興趣序列是前導(dǎo)或尾隨序列，其中前導(dǎo)或尾隨序列代表植物細(xì)胞的天然基因的上游或下游序列。
113.權(quán)利要求112的方法，其中興趣序列包括可操作地連接到反義前導(dǎo)序列上的正義方向的前導(dǎo)序列。
114.權(quán)利要求112的方法，其中興趣序列包括可操作地連接到反義尾隨序列上的正義方向的尾隨序列。
115.權(quán)利要求113的方法，其中前導(dǎo)序列構(gòu)建物在5’-到3’-方向上包括啟動(dòng)子、正義方向的前導(dǎo)序列、前導(dǎo)序列的反義序列、以及終止子，其中前導(dǎo)序列構(gòu)建物的表達(dá)產(chǎn)生便于下調(diào)與其相關(guān)的基因表達(dá)的雙鏈RNA分子。
116.權(quán)利要求115的方法，其中前導(dǎo)序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區(qū)相關(guān)，并位于其上游。
117.權(quán)利要求113的方法，其中尾隨序列構(gòu)建物在5’-到3’-方向上包括啟動(dòng)子、正義方向的尾隨序列、尾隨序列的反義序列、以及終止子，其中尾隨序列構(gòu)建物的表達(dá)產(chǎn)生便于下調(diào)與其相關(guān)的基因表達(dá)的雙鏈RNA分子。
118.權(quán)利要求117的方法，其中尾隨序列與PPO基因、R1基因、L型磷酸化酶基因、或α葡聚糖磷酸化酶基因的編碼區(qū)相關(guān)，并位于其下游。
119.權(quán)利要求9的方法，它進(jìn)一步包括將植物細(xì)胞暴露于含有標(biāo)記元件的第二載體，其中該標(biāo)記在轉(zhuǎn)化的植物中短暫地表達(dá)，并且沒有被穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)化植物的基因組中。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述的標(biāo)記是除草劑的抗性基因。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述的細(xì)胞分裂素基因是抗生素的抗性基因。
122.權(quán)利要求119的方法，其中所述的標(biāo)記是NPTII。
123.包含SEQ ID NO.93的多核苷酸序列的多核苷酸，其中該多核苷酸的長(zhǎng)度為20至80個(gè)核苷酸。
124.權(quán)利要求123的多核苷酸，其中所述的多核苷酸的長(zhǎng)度為21至70個(gè)核苷酸。
125.權(quán)利要求123的多核苷酸，其中所述的多核苷酸的長(zhǎng)度為22至50個(gè)核苷酸。
126.權(quán)利要求123的多核苷酸，其中所述的多核苷酸長(zhǎng)度為23至40個(gè)核苷酸。
127.權(quán)利要求123的多核苷酸，其中所述的多核苷酸長(zhǎng)度為24至30個(gè)核苷酸。
128.權(quán)利要求4的方法，其中在用第二個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)染之前用第一個(gè)多核苷酸轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。
129.如SEQ ID NO.40所示的塊莖特異性的啟動(dòng)子。
130.基于土壤桿菌的制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，該轉(zhuǎn)因植物細(xì)胞不含有被穩(wěn)定地整合在核DNA中的選擇標(biāo)記基因，該方法包括a.構(gòu)建包含基本上由所述期望的基因構(gòu)成的多核苷酸的第一雙載體，其中該基因在其5’和3’末端可操作地連接到T-DNA邊緣序列或T-DNA邊緣樣序列上；b.構(gòu)建包含在所述的選擇性標(biāo)記基因的5’和3’末端可操作地連接到T-DNA邊緣序列或T-DNA邊緣樣序列上的選擇性標(biāo)記基因的第二雙載體；c.將植物細(xì)胞與下列材料一起培養(yǎng)i.帶有所述第一和所述第二雙載體的土壤桿菌菌株；或ii.帶有所述第一雙載體的第一土壤桿菌菌株以及具有所述第二雙載體的第二土壤桿菌(Agrobacterium)菌株；d.在含有適當(dāng)?shù)倪x擇試劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，選擇其中將所述的期望基因整合到植物核DNA中，而沒有將所述的選擇性標(biāo)記基因整合到植物核DNA中的植物細(xì)胞。
131.根據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中所述的選擇性標(biāo)記基因是除草劑的抗性基因或抗生素的抗性基因。
132.根據(jù)權(quán)利要求131的方法，其中所述的抗生素的抗性基因是nptII基因。
133.根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中所述的抗生素的抗性基因是可操作地連接到泛素-7基因的啟動(dòng)子和酵母醇脫氫酶1(ADH)基因的終止子上的nptII結(jié)構(gòu)基因。
134.根據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中首先將所述的植物細(xì)胞與所述的第一土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)，接著隨后將所述的植物細(xì)胞與所述的第二土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)，或者反過(guò)來(lái)。
135.根據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中所述的第一雙載體進(jìn)一步包括雙整合標(biāo)記基因，其可用于檢測(cè)用雙載體主鏈序列穩(wěn)定整合的植物細(xì)胞。
136.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述的雙載體整合標(biāo)記基因從由除草劑抗性基因、抗生素抗性基因、或NPTII構(gòu)成的組中選擇。
137.根據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中所述的第二雙載體進(jìn)一步包括在細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶(codA)和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(upp)基因之間的基因融合體，該融合體在T-DNA或T-DNA邊緣樣序列之間插入，在與所述的第一和第二土壤桿菌菌株一起培養(yǎng)之后，將植物細(xì)胞暴露于5-胞嘧啶以選擇抗那些用所述的第二雙載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
138.根據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中所述的第二雙載體進(jìn)一步包括Ω突變的virD2基因，其中所述的Ω突變的virD2基因減少所述的選擇性標(biāo)記基因整合到所述植物的核DNA中的頻率。
139.權(quán)利要求44的分離的邊緣樣核苷酸序列，其中該序列的長(zhǎng)度是25個(gè)核苷酸。
140.權(quán)利要求61的方法，其中第二雙載體包括陰性的選擇性標(biāo)記基因和妨礙整合的基因中的至少一個(gè)，其中陰性的選擇性標(biāo)記基因位于T-DNA右邊緣序列和T-DNA左邊緣序列內(nèi)，其中妨礙整合的基因位于第二雙載體的主鏈內(nèi)。
141.權(quán)利要求99的方法，其中時(shí)序生長(zhǎng)1到5天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的植物育種方法。該方法通過(guò)使用也在傳統(tǒng)育種中使用的遺傳材料來(lái)改善作物的農(nóng)藝性狀。不像在傳統(tǒng)育種中進(jìn)行的隨機(jī)有性重組整個(gè)基因組，而是在體外重排特定的遺傳元件并插回到單個(gè)的植物細(xì)胞中。通過(guò)這種新的植物育種方法獲得的植株不含有異源核酸，但是僅含有來(lái)自選作轉(zhuǎn)化的植物種或與所選植物種性親和植物的核酸。提供了通過(guò)這種新的植物育種方法開發(fā)的植物。特別地，提供顯示改善的塊莖貯藏和健康特性的馬鈴薯植株。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1753995SQ03808643
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2003年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月20日
發(fā)明者C·M·T·羅門斯, J·葉, H·顏, K·M·M·斯沃爾茲, J·梅嫩德斯－胡馬拉, L·W·布林克霍夫, C·里切爾 申請(qǐng)人:J·R·西姆普羅特公司