專利名稱：身高相關基因的制作方法
人類性別間的身高差異主要是有兩個因素引起的第一，由生物活性的生殖腺類固醇的性別二態(tài)性決定的激素因素；第二，Y特異性生長基因引起的基因因素，稱為GCY(Tanner，et al.，1966；Smith，et al.，1985；Ogata & Matsuo，1992)。盡管廣泛的基因作圖在人的Y染色體上尋找這一基因(Ogata，et al.1995，Salo，et al.1995，Rousseaux-Prevoet，et al.1996，De Rosa，et al.1997)，它的精確定位依然未知。新的證據(jù)顯示Y-染色體末端缺失的鑒定中使用不恰當?shù)募毎z傳方法為闡明GCY-臨界區(qū)帶來了困難。為克服這些難題，發(fā)明人僅對de novo中間缺失的患者的Y染色體進行了GCY分析(Kirsch，et al.2000)。對末端缺失的病人，這一方法可以將GCY定位到特定的染色體區(qū)間，而無需排除X0-鑲嵌現(xiàn)象和/或i(Yp)和idic(Yq11)染色體。
7個正常身高的成年男性，一個臨界身高的男性，以及一個身材矮小的有大片段中間缺失的病人，對他們進行重疊中間缺失直接比對，確證GCY臨界區(qū)在標記物DYZ3和DYS11之間。此區(qū)域約有1.6-1.7Mb的基因組DNA。為提高靠近著絲粒的所需區(qū)域的分辨率，發(fā)明人用我們的細菌人工染色體(BAC)/p1-衍生人工染色體(PAC)重疊群建立了另外的新的對染色體上此部分有特異性的STS標記物。用這些新的Y-染色體STSs的分子缺失分析可以將臨界區(qū)限制在700kb的基因組區(qū)內。
較佳地，這些區(qū)域接近染色體上已鑒定區(qū)域的兩旁被排除的區(qū)域。
較佳地，這些區(qū)域在SKY1和sK83間。它可以含有SKY1和sK83中的一個或兩個區(qū)。較佳地，這些區(qū)域在Sky8和sK83間(最好包括Sky8和sK83中的一個或兩個區(qū))，或SKY1和SKY4間。
本發(fā)明提供Y染色體上DYZ3和DYS11間的一個分離出的區(qū)域，它含有GCY。較佳地，Y染色體是人的Y染色體。
較佳的區(qū)域在sY79和sY81間，最好接近Y染色體上被排除的區(qū)域但在此區(qū)域的外面較佳。
也提供GCY研究所用的引物。
本發(fā)明進一步提供分離的基因/假基因序列，它們影響了人類性別相關的身高差異。它們可以是一個或多個圖中鑒定的一個或多個基因或假基因序列。
本發(fā)明進一步包括與GCY蛋白有相同功能的蛋白質，與GCY蛋白有大于65％的同源性，大于70％的同源性，大于75％的同源性，大于80％的同源性，大于85％的同源性，大于90％的同源性較佳，大于95％的同源性最佳。有GCY基因活性較佳，例如，當它在哺乳動物體內表達時，對雄性哺乳動物的身高有影響。
也提供了探測或擴增GCY區(qū)所用的引物。它們可以用本技術領域熟知的放射性或非放射性標記物及其應用方法標記和應用。這些方法包括PCR，Southern或Northern blotting。
實驗證據(jù)將被詳細描述并參考圖例，其中表1是病人和他們的兄弟姐妹的成年身高的比較。
表2是新的Y染色體STSs的表。
表3是AZFc區(qū)家族變體的序列的PCR/限制性消化分析。
表4是物理圖譜建立時鑒定的BAC和PAC克隆的匯總。
表5是對先天身材矮小的成年男性進行染色體微小缺失篩選所用的基因組引物的匯總。
表6是分離的外顯子誘捕克隆的序列的匯總。
表7A是預測基因的引物對的匯總，7B是Adlican Y-拷貝(ADLY)特異性引物對的匯總，7C是ADLY RT-PCR引物序列的匯總。
表8是外顯子誘捕克隆的RT-PCR引物序列。
表9a & b顯示ADLX和ADLY間的外顯子的同源性。
表10是GCY區(qū)的基因/假基因的序列差異性和同源性的匯總。


圖1.人Y染色體長臂缺失作圖上圖是人Y染色體的圖譜，其左邊是Yp端粒，右邊是Yq端粒。下面顯示的是對身高正?；蛏聿陌〉某赡昴行缘腨-染色體的低分辨率的分析結果。沿著上圖列出了95個Y-染色體STSs。除SKY3和SKY8(詳細見表2)，所有其它STSs已有報道(Vollrath et al.，1992，Jones et al.，1994，Reijo et al.，1995)?？瞻讌^(qū)或灰色框表示標記物缺失或存在，未進行相關檢測。星號表示各自斷點區(qū)中不能被檢測的標記物。所有以前公布的病人的資料被重新調查，用于初步分析的相同的DNA樣品2被研究。(請注意，#293病人的中間缺失的最近端的和末梢的斷點在隨體II類序列內。)圖2.人末梢Yq11.23的DAZ基因座內序列家族變體(SFV)分類A.人DAZ基因簇附近Y-染色體的概觀和擴增子結構。每一擴增子均用特定的條帶(A，B，D，E，X)表示。上面的箭頭表示一個擴增子家族每一成員相對于其它成員的取向。條帶X表示的擴增子來自1號染色體的一部分，它被轉座到DAZ基因簇的末端并部分復制。
B.根據(jù)人Y染色體物理圖譜選擇的Y-特異性STSs和SFVs的精確定位。標記物sY157比較明顯，經(jīng)多重PCR分析，它可能只存在一個拷貝(詳細見正文)。
C.對人DAZ基因簇序列內發(fā)生Y-染色體重排的患者進行的STS和SFV分析的匯總。灰色框表示標記物缺失或存在。
D.#1972病人基因組DNA中的SKY10和SKY12序列家族變體分類。檢測在表3中有描述。沿著右側列出了片段大小(bp表示)。產(chǎn)物通過3％NuSieve瓊脂糖(3∶1)凝膠電泳分離，溴乙錠染色觀察。
圖3.人Y染色體長臂近著絲粒區(qū)的結構示意圖A.圖顯示主要的前后串聯(lián)重復區(qū)段的分布和序列同源性的大概結構。這些區(qū)域基本可以分成3種不同的區(qū)以5bp隨體序列為標志的最近端區(qū)(G)，和1號染色體有高度同源性的中心區(qū)(O)，含X/Y同源序列的末稍區(qū)(B)。在此區(qū)域內的新確立和已確立的STS標記物的精確定位在下面闡明。底部邊沿顯示了用新的STS標記物構建的PAC/BAC重疊群。詞頭RP1，5各表示PAC克隆和RP11BAC克隆。
B.對身材矮小和身高正常的病人進行高分辨率STS作圖鑒定得到的GCY臨界區(qū)的定位。黑色框和白色框分別表示STS存在或缺失。條紋框顯示斷點所在的劑量未知的區(qū)域。
圖4.GCY臨界區(qū)的分子特征鑒定a.兩個最嚴重的病人的缺失示意圖。SKY1和sY83劃定了它的界限，因為在Y0308克隆中發(fā)現(xiàn)一個不同的缺失(見圖3)標志了SKY1是它的一個界限。也標出了AZFa區(qū)臨近GCY區(qū)末端。b.有不同同源性的三個片段的結構劃分。綠色表示含5bp重復序列的片段，橙色表示和染色體亞間隔1q43同源的片段，藍色表示和Xp22同源的。c.來自GCY區(qū)基因組序列的已測序的BAC克隆的詳細描述。d.作為外顯子擴增基質的PAC克隆的精確定位。e.所有外顯子誘捕克隆的定位。由于它很小且為單拷貝，外顯子誘捕克隆etal內容物不能進行進一步的實驗分析。f.所有計算機得到的數(shù)據(jù)的文件編制設為以下幾個層次基因模型(取向；外顯子/內含子結構)-明顯的假基因(外顯子/內含子結構；取向)-啟動子?；蚰Ｐ偷娜∠蚩捎妙伾硎?紅取向向著著絲粒；藍取向向著端粒)。請注意被CITB-144J01，CITB-298B15和CITB-203M13覆蓋的染色體區(qū)已在Sargent et al.1990中被透徹地研究。
圖5.GCY區(qū)的基因/假基因和它們的功能祖先之間的同源性比較。標明Y-染色體拷貝的精確定位。實際結構基因的基因對特異同源性和亞染色體定位用藍色表示。
圖6.KIAA1470進化史。左邊顯示染色體運動。右上圖豎的小條帶顯示1p36功能祖先的外顯子/內含子結構。連續(xù)的退化事件使KIAA1470在1q43和Yq11上形成兩個假基因。1q43和Yq11上的兩個拷貝相互間有98％的核苷酸序列同源性，在KIAA1470基因家族的12個反轉錄子中是最高的。它們與主基因分別有77％和79％的同源性。
圖7.X-和Y-特異的adlican基因/假基因結構特征比較。ADLX的編碼基因用框表示。ADLY相應的假定外顯子(也用框表示)經(jīng)同源性探查確定。ADLY假定反轉錄單元的主要重排用黑色三角形顯示。ADLX和ADLY的mRNA和ORF的大小也標明了。RT-PCR檢測所用引物在它們各自的定位上顯示。分隔線上下方相同的顏色表示對兩個轉錄物均無選擇性。僅在線的下方標出的RT-PCR引物是ADLY特異性的。
材料和方法GCY臨界區(qū)的確定患者的篩選患者#293，JOLAR，#28，#63和#95的臨床癥狀已有詳細描述(Skare et al.1990.，Ma et al.1993.，F(xiàn)oresta et al.1998.，Kleiman et al.1999)?；颊遈0308與Pryor et al.1997研究中的病例1符合?；颊逿.M.，#1947和#1972是患有先天不育的表型正常的男性。基因組樣品從外周血白細胞中抽提(#28，#63，#95，Y0308，T.M.，#1947，#1972)或來自類淋巴母細胞(#293，JOLAR)。從正常男性和女性外周血白細胞中分離的DNA作為內部對照。
身高評估由于所有個體都有不同的人種起源，身高和各自的國家身高標準比較(表1)?；颊叩哪挲g范圍較小。如果可能，應注意父母和兄弟姐妹間的成年身高比較。數(shù)據(jù)和身高標準偏差分數(shù)(SDS)在表1中匯總。為計算SDS，從相應國家身體生長調查中取平均成年身高和標準偏差。
PCR分析反應體系總體積50微升(75mM Tris/HCl pH9.0，20mM(NH4)2SO4，0.1％(w/v)Tween20，1.5mM MgCl2)含每種寡核苷酸引物1.0mM，100ng基因組DNA模板，5單位Taq DNA聚合酶(Eurogentec)，以及每種dNTP 1mM(MJ Research，Inc.)熱循環(huán)如下95℃預變性5分鐘后，樣品進行30個循環(huán)，其中94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，最后72℃5分鐘延伸。多重PCR操作見Henegaiu et al.1994，有微小改動。Alu-Alu PCR操作見Nelson et al.1991。小于1kb的擴增產(chǎn)物溶于3％NuSieve瓊脂糖/1％SeaKem GTG瓊脂糖(FMC)溶于1xTBE(0.089M Tris-borate/0.089M硼酸/20mM EDTA，pH8.0)。大于1kb的擴增產(chǎn)物及Alu-Alu-PCR產(chǎn)物的分離用溶于1xTBE的1.5％SeaKem GTG瓊脂糖凝膠。
PCR引物Y-特異STSs，基因座和PCR條件之前已有描述(Vollrath et al.1992；Jones et al.1994；Reijo et al.1995)。新的Y-染色體STSs序列在表2中列出。Y-特異STSs稱為SKY，它們或者衍生自YAC，BAC和PAC末端序列或來自用Alu引物的多種組合擴增的克隆內部序列。設計標記物SKY10，11，12和13的引物擴增基因組DAZ基因座中跨特殊限制性位點的片段(SKY10來自RP11-487K20(AC024067)，RP11-70G12(AC006983)，RP11-141N04(AC008272)，RP11-366C06(AC015973)，RP11-560I18(AC053522)，RP11-175B09(AL359453)，SKY11和SKY12來自RP11-245K04(AC007965)，RP11-100J21(AC017005)，RP11-506M09(AC016752)，RP11-589P14(AC025246)和SKY13來自RP11-100J21(AC017005)，RP11-589P14(AC025246)，RP11-823D08(AC073649)，RP11-251M08(AC010682)，RP11-978G18(AC073893))以探測“序列家族變體”(SFVs)。
PCR產(chǎn)物的限制性分析PCR產(chǎn)物溶解在瓊脂糖凝膠上，切下適當?shù)哪z帶，用GFXTMPCR DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)根據(jù)操作步驟分離DNA。SKY5和SKY6的擴增片段分別用TaqI和BsmI消化。為探測SKY10，SKY11，SKY12和SKY13的SFVs，PCR產(chǎn)物用表3列出的限制性酶消化。
BAC/PAC/YAC末端片段測序進行末端測序的BAC/PAC克隆的DNA用Nucleobond PC100 Kit(Macherey-Nagel)純化。末端片段用熱測序酶熒光標記的引物循環(huán)測序試劑盒(Pharmacia)直接測序，并用Pharmacia A.L.F.express(Amersham Pharmacia Biotech)分析。YAC末端片段用Alu/載體-PCR合成，用TOPO-TA克隆試劑盒(Invitrogen)亞克隆到pCR2.1中。根據(jù)描述進行測序。
熒光原位雜交從初級血樣或無限增殖細胞系中獲得分裂中期分布。根據(jù)標準操作制備(Lichter & Cremer 1992)。粘粒DNA和質粒DNA經(jīng)缺口平移法用生物素-16-dUTP(La Roche)標記。有中期分布的載玻片在70％乙醇中于4℃放置一周。將200-300納克標記了的質?；蛘沉NA，20-30微克人Cot-1 DNA(GIBCO BRL)和雜交緩沖液(50％甲醛，10％硫酸葡聚糖，2xSSC，pH7.0)混合，70℃變性5分鐘，37℃預退火30分鐘。載玻片在70％甲醛，2xSSC，pH7.0中于72℃變性2分鐘(Ried etal.1992)。預退火的探針在增濕器內于37°雜交過夜。洗滌載玻片，用抗生素蛋白-連接的熒光素異硫氰酸鹽(FITC)染色。信號用生物素標記的抗-抗生素蛋白后用抗生素蛋白-FITC染色放大。制造商在說明書中提供的所有的人的端粒(Oncor)應和探針相符。染色體用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二氫氯化物(DAPI)復染。使用一個冷的帶電核裝置照相系統(tǒng)(Photometrics，Tucson AZ，USA)分別攝影。用Macintosh Quadra 900控制相機，用軟件包Nu200 2.0(Photometrics)將圖像合成為TIF格式。每一種熒光染料記錄單獨的灰色比例熒光圖像。圖像經(jīng)掃描后，用Adobe Photoshop軟件進一步處理。
尋找身高基因微小缺失篩選外顯子擴增PAC克隆鳥槍法亞克隆到pSPL3B中。Y-染色體特異性PAC克隆的基因組DNA用Sau3AI部分消化。100納克分離出的4-10Kb范圍內的片段和100納克經(jīng)BamHI消化并脫去磷酸的pSPL3B連接。連接反應轉化到大大過量的E.coli XI-1藍色細胞(Stratagene)，每一份轉化細胞在選擇性培養(yǎng)基(青霉素)上倒平板。形成的菌落收集分離質粒DNA。
細胞培養(yǎng)和電穿孔。COS7細胞在加了10％滅活的小牛血清的DME培養(yǎng)基中增殖。用于轉染的COS7細胞在第5和15代間，長到75％連生后胰蛋白酶消化，離心收集，用冰冷的Dulbecco氏PBS洗滌。4×109細胞在冷的0.7毫升Dulbecco氏PBS中重懸，在預冷的電穿孔小管中和15微升溶于0.1毫升Dulbecco氏PBS的DNA結合。冰上放置10分鐘后，細胞輕輕重懸，在BioRad Gene Pulser2中電穿孔(1.2kV，25μf)，再放到冰上。10分鐘后細胞轉到含10毫升預溫的，CO2預平衡的培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)皿中(100毫米)。
RNA分離，RT-PCR和克隆。轉染72小時后分離細胞質粒DNA(QIAGEN RNeasyKit)，第一鏈的合成操作根據(jù)制造商推薦的步驟，有小的改動5微克RNA加到含每種dNTP 10mM和2μM寡核苷酸SA2的溶液中?；旌衔镉?5℃加熱5分鐘后冰浴至少多一分鐘。加入含10xPCR緩沖液(Perkin-Elmer Cetus)，25mM MgCl2，0.1M DTT和RNAsin(35單位/微升)的反應混合物后，逆轉錄反應在42℃進行2分鐘。然后加入1微升SuperScript II RT(200單位/微升；Gibco BRL)，反應在42℃溫育90分鐘，50℃溫育30分鐘。完整cDNA合成反應及轉換為雙鏈DNA，用有限次的PCR擴增循環(huán)，100微升反應混合物體系如下1xPCR緩沖液(Perkin-ElmerCetus)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μM SA2，1μM SD6和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。進行6次擴增循環(huán)，包括94℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃5分鐘。為消除空載和假陽性產(chǎn)物，反應中直接加入50單位BstXI(New EnglandBiolabs)，于55℃溫育過夜。
用內部引物進行第二次PCR擴增時用上述10微升的消化物，100微升反應體系如下1xPCR緩沖液(Perkin-Elmer Cetus)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μM(CAU)4-SD2，1μM(CUA)4-SA4和2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。進行25次擴增循環(huán)，包括94℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃3分鐘。產(chǎn)物電泳分離，大于純SD2/SA4 RT-PCR產(chǎn)物的片段根據(jù)制造商的操作步驟剪切并亞克隆到pAMP1中(CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL)。在大大過量的E.coli XL-2藍色細胞(Stratagene)中進行連接反應，細胞倒在含X-Gal/IPTG的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
候選外顯子的鑒定。挑出所有白色菌落，轉到有選擇性培養(yǎng)基的384孔板，在37℃溫育過夜。上面覆蓋或沒有覆蓋帶陽性電荷尼龍膜(Amersham)的24.5×24.5厘米培養(yǎng)板用一個384定位針轉移裝置在37℃溫育過夜。收集培養(yǎng)板上長出的菌落制備質粒，尼龍膜上的菌落用于colony lifts檢測。插入的質粒剪切，純化，和含有以PAC克隆EcoRI消化物作為原基質的尼龍膜雜交。然后分離出突出的條帶和colony lifts雜交以鑒定候選外顯子。分離候選外顯子用Sequitherm EXCEL II DNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)測序。序列被自動分析在ALFExpress DNA測序儀上讀出。表6列出了分離的外顯子誘捕克隆的序列。
外顯子誘捕。來自Y-染色體特異PAC(P1衍生的人工染色體)克隆RP1-148J07，RP5-1160A12，RP1-301P22，RP4-532I07和RP1-114A11的DNA用Sau3AI部分消化，4-10Kb范圍內的片段單獨亞克隆到pSPL3B中。轉化COS7細胞，72小時后用QIAGEN RNeasy試劑盒收集細胞質粒RNA。根據(jù)制造商推薦的操作進行cDNA合成(Gibco-BRL)?？寺∥稽c兩側的引物用于鑒定比純SD2/SA4 RT-PCR產(chǎn)物大的產(chǎn)物。這些片段被剪切，亞克隆(CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL)到pAMP1中，并測序。外顯子誘捕克隆通過隨機引發(fā)用32P-dCTP標記，作為Southern blots的雜交探針。雜交65℃下在標準雜交緩沖液(Singh & Jones 1984)放置16小時。洗滌65℃下，在0.1xSSC，0.1％SDS中洗三次，每次20分鐘。
計算機基因預測。用NIX(http//menu.hgmp.mrc.ac.uk)和Rummage(http//gen100.imb-jena.de)軟件包分析BCA克隆RP11-75F05，RP11-461H06，RP11-333E09，RP11-558M10，CITB-298B15和CITB-144J01的完整基因組序列和已知基因的同源性以及有效基因容量。將BAC序列遞交到FirstEF(http//www.cshl.org/mzhanglab)得到計算機鑒定的啟動子和第一個外顯子。
逆轉錄的polyA+-RNAs和cDNA文庫。向Clontech或Invitrogen購買16種胎兒和成年組織的polyA+-RNA。用QIAGEN Oligotex試劑盒分離來自3種骨肉瘤和1種骨髓成纖維細胞系的人polyA+-RNAs。第一鏈cDNA的合成根據(jù)描述(Rao et al.1997)進行操作。從Clontech或Stratagene獲得14個cDNA文庫。一個40個cDNA文庫的集合由德國人類基因組計劃研究中(RZPD)提供。若要求可得到完整的列表。
潛在的轉錄單元的鑒定。對外顯子進行同源性比較和開放閱讀框(ORF)分析后，設計RT-PCR擴增的引物。序列在表8中匯總。如果外顯子誘捕克隆只有一個外顯子，在半巢式PCR時兩個外顯子特異性引物和cDNA文庫特異性引物結合。從預測的基因模型設計引物跨過外顯子/內含子邊界擴增。為提供轉錄的證據(jù)，用引物篩選一系列cDNA文庫和polyA+-RNAs(見上)。若有同源擴增子共擴增的可能，引物應位于Y-特異性限制位點的兩側。
進化層分類。根據(jù)Li，1993確定GCY區(qū)的基因/假基因和它們的功能/非功能祖先之間的序列差異。從下列基因組序列中抽提所有假基因序列BAC克隆RP11-75F05(AC011293)的KIAA1470PY，BAC克隆RP11-498M14(AL445675)的KIAA1470P1，BAC克隆RP11-333E09(AC011302)的ADLY，BAC克隆CITB-144J01(AC004772)的ARSFP和RPS24P1，BAC克隆RP11-418N20(AC119620)的RPS24PX，BAC克隆RP11-461H06(AC012502)的ASSP6和BAC克隆GS1-536K07(AC004616)的ASSP4。所有其它基因的序列從公開的cDNAs獲得，GenBank登錄號是ADLX(AF245505)，ARSF(XM_035467)，RPS24(NM_033022)，ASS(X01630)，KIAA1470(AB040903)。THC604695PY未分析，因為只能得到它的一部分最末端外顯子(含幾乎全部的3’UTR)用于和X-染色體EST基因簇比較(AA662182和AA662138)。
結果中間缺失的作圖我們研究了9個成年男性的DNA，他們患有先天不育癥但其它都正常。這9個男性中，7個人的身高沒有特別。一個患者，#293，身高157厘米，屬于身材矮小(SDS-2.9)，另一個Y0308身高165.5厘米為臨界身高，在美國正常身高標準(SDS-1.7)的第三個百分點。他的父母及兄弟姐妹的成年身高在正常范圍內(表1)，他的兄弟比他高20.5厘米。和他的預計身高(178厘米)和預計身高范圍(169-187厘米)相比可以認為他屬于身材矮小。所有的男性都已單獨被確證發(fā)生了Y-染色體大的de novo中間缺失。其中只有兩個患者進行過早先的染色體研究。
在我們定位GCY基因座時，我們的注意力集中到Y染色體長臂的一部分，它被身材矮小的患者的中間缺失的區(qū)域所限定(圖1)。最近，一張結合了758個有序的STSs和199個完整測序的BAC克隆的詳細的人Y染色體物理圖譜被構建出來(Tilford et al.2001)。我們采用了一個小小改動的PCR多重體系(Henegariu et al.1994)檢測Y染色體長臂上是否存在28個DNA基因座。對可獲得足夠DNA進行進一步PCR分析的患者檢測了額外的STSs。結果，9個中間缺失斷點中的8個可以定位。由于有正常身高的患者JOLAR，#28，#63，#95，T.M.，#1947的缺失相互重疊，大部分Y染色體的長臂都可以排除是GCY的臨界區(qū)。
由于患者#1972的缺失的末梢斷點不在Y染色體長臂的特異性部分，缺失(末端或中間)的性質仍不明確。他的缺失和患者#1947及T.M.的確實也沒有重疊。僅僅依靠基于STS的中間卻是作圖方法得到的結果，sY158末梢區(qū)并不能排除是潛在的GCY臨界區(qū)。然而，多重PCR分析總顯示出STS sY157(一種Y衍生的標記物，十分接近sY158)擴增產(chǎn)物濃度較低。針對這一問題，我們更詳細研究了患者#1972的重排Y染色體。
熒光原位雜交和患者#1972的序列家族變體分類患者#1972的Y染色體的總的完整性通過粘粒LLOYNC03”M”34F05(PAR1)和LLOYNC03”M”49B02(PAR2)以及Y著絲粒特異性探針Y-97和端粒特異性探針“所有人的端?！盕ISH展示出來(數(shù)據(jù)未顯示)。注意到人DAZ基因座結構排布的復雜性(圖2A)，我們特別尋找了序列家族變體(SFVs)。為防止將序列錯誤誤當作單個核苷酸差異，對至少在兩個重疊BAC克隆中存在的SFVs進行了PCR/限制性消化檢測試驗。這些SFVs的定位在圖2B中顯示。由于這些SFVs可以代表等位基因變體，十個無關的正常德國男性被測定類型。在所有情況下，期望的片段模式都可以在Y染色體衍生的序列中檢測到。相反，從1號染色體衍生的BAC克隆RP11-560I18的基因組序列推出的片段模式不能被確證(詳細見表3)。每種SFV-特異性PCR/限制性消化都可比作相應BAC克隆中的存在/缺失。
患者#1972基因組DNA進行全部四種序列家族變體(SKY10/Tsp509I，SKY11/NlaIII，SKY12/MseI和SKY13/Cac8I+TfiI)分類揭示了一個Y衍生的非等位基因序列變體的缺失(表3和圖2C，D)。對于SKY10，末梢拷貝被刪除。并不奇怪，在所有其它分類實驗中，各SFVs較近端的拷貝都顯示出被刪除。下一步，我們研究了帶有最末梢斷點的兩個患者的SFVs(#95和#1947)。用基因組DNA，我們測定SKY11，SKY12和SKY13的兩個非等位基因變體以及SKY10的一個非等位基因變體在患者#1947體內缺失，而對所有被檢測的SFVs，一個非等位基因變體在患者#95體內缺失。
綜上，這些結果證明患者#1972的Y染色體中間缺失的近端斷點在患者#1947的中間缺失中，由此排除了此基因組區(qū)是潛在GCY臨界區(qū)的可能。
GCY臨界區(qū)的精確定位基于對人Y染色體長臂兩側區(qū)的分子分析(Williams和Tyler-Smith 1997)，由標記物sY78(DYZ3)和sY83(DYS11)界定的GCY臨界區(qū)物理范圍估計包括1.6-1.7Mb(圖3A)DNA。此區(qū)最近端400kb僅含有用Alu序列從Y染色體分離到的5bp隨體序列。因此，此Y染色體恒定區(qū)不太可能有編碼序列。GCY臨界區(qū)的其余部分由X/Y同源區(qū)以及常染色體/Y同源序列區(qū)組成。此試驗開始時，在YAC克隆中這個區(qū)域只能得到有限的覆蓋度。為精確GCY臨界區(qū)并產(chǎn)生基因尋找基質，必須建立此區(qū)域的BAC/PAC重疊群。
我們主要通過BAC，PAC和YAC克隆的末端片段以及用Alu-Alu寡核苷酸引物對的不同組合擴增的克隆內部序列測序建立了25個額外的標記物。其中，只有7個是Y特異性的(SKY1，SKY2和SKY4-8)(詳細見表2)。在建物理圖譜時鑒定的BAC和PAC克隆在表4中匯總。同時，其中的一些克隆被完整測序，因為它們形成了人Y染色體測序的瓦狀路線的一部分(Tilford et al.2001)?？寺^(qū)標記物sY78和SKY6之間的近端部分尚未測序。覆蓋整個GCY臨界區(qū)的克隆的篩選在圖3中描述。
BAC RP11-295P22和BAC RP11-322K23間重疊的確定是重疊群構建過程中最關鍵的步驟。我們懷疑兩個克隆相對的末端片段衍生的Y特異性標記物從相同的5bp隨體區(qū)內兩個不同的基因座擴增了相同大小的片段。通過檢測幾個已知切割5bp隨體中的(TGGAA)n共有序列的限制性酶，我們發(fā)展了基因座特異性PCR/限制性消化測試。用適當?shù)腜CR/限制向消化測試法將所有的BAC克隆分類到這個序列區(qū)可以將它們精確定位從而確定它們的重疊。
為縮小GCY基因的臨界區(qū)，我們檢測了新建立的STSs在患者#293，Y0308和JOLAR體內是否存在。這些結果可以將GCY基因限制在小范圍內(圖3和圖4)。直接序列比較顯示被測序的BAC克隆RP11-322K23，RP11-75F05，RP11-461H06，RP11-333E09，RP11-558M10，CITB-298B15和CITB-203M13完全覆蓋了Y-STSsSKY8和sY83(DYS11)之間已作圖的區(qū)域，提示它的大小約為700kb。此區(qū)基本可被分為三個明確的區(qū)間以5bp重復片段為標志的近端區(qū)，和1號染色體高度同源的中心區(qū)以及包括X/Y同源序列的末梢區(qū)。由于GCY臨界區(qū)最末梢部分(以BAC克隆CITB-144J01 bp1為開始)在AZFa臨界區(qū)鑒定過程中已進行過透徹的研究，結果顯示其中沒有功能基因，我們不再對其進行進一步的詳細的基因組DNA分析。GCY臨界區(qū)的最近端區(qū)僅含有隨體3型的5bp共有序列(TGGAA)n，因此它也不太可能含有任何基因。排除這兩個區(qū)域后，我們可以集中研究420kbDNA的小區(qū)域。用Advanced PipMaker軟件進行的大規(guī)模序列比對結果顯示沒有Y特異性序列整合到1號染色體和/或X染色體同源區(qū)。
我們也已經(jīng)建立了新的Y特異性標記物，能夠均一地分散到整個420kb的DNA(表5)。
GCY臨界區(qū)內外顯子誘捕GCY區(qū)的邊界通過兩位患者JOLAR和Y0308得到確定(圖3)。PAC克隆，RP1-148J07，延伸到僅包括隨體3型的5bp重復序列的基因組片段。末梢PAC克隆，RP1-83D22部包括在試驗分析內，因為sY82末梢區(qū)在確定AZFa區(qū)轉錄潛能的過程中已經(jīng)被分析(Sargent et al.1999)。為鑒定可能編碼GCY的轉錄子，我們用來自GCY區(qū)的5個PAC克隆作為基質進行外顯子誘捕(RP1-148J07上至RP1-114A11，圖4)。每一個來自GCY區(qū)的PAC克隆分別亞克隆進行外顯子誘捕。對誘捕產(chǎn)物進行核苷酸測序鑒定出9個不同的外顯子誘捕克隆，其中的兩個含有兩個外顯子(圖4，表6)。所有的外顯子誘捕克隆分離出幾個拷貝。所有11個假定外顯子的外顯子/內含子邊界和結合位點共有序列匹配。定位到GCY區(qū)的誘捕產(chǎn)物用PCR檢驗在男性和女性以及身材矮小GCY缺失的男性體內是否存在。所有外顯子誘捕克隆在Southern blots上僅有一個男性特異性片段顯示出來。
計算機分析已確定的BAC克隆我們用NIX和Rummage軟件包提供的基因預測程序分析了完整的GCY區(qū)的基因組序列。同時用BLASTN或FASTA運算法則分析了GenBank的非冗余(nr)數(shù)據(jù)庫中的同源序列。例如，BAC RP11-75F05，包含一個和染色體1p36上的轉錄單元KIAA1470有77％同源性的1Kb片段(圖5)。例如，在BAC RP11-461H06和CITB-144J01上，長2.5和1Kb的序列分別和染色體9q34，10q22上的基因ASS，RPS24有88％和81％同源性。Y染色體拷貝ASSP6和RPS24P1，代表假基因，在Xp22上有一個祖先，但已轉座到Y染色體上。RP11-333E09和CITB-144J01上的兩個假基因，THC604695PY和ARSFP，代表了Xp22特異性基因被刪除的拷貝。
BAC RP11-333E09包括了染色體Xp22(ADLX)上的adlican基因的一個被剔除的復制(ADLY)。ADLX在骨關節(jié)炎組織中表現(xiàn)出上調，從而很可能在骨代謝中起重要作用。因此，Y染色體拷貝成為一個與生長有關的重要的候選基因。除了染色體內重組會導致外顯子3和4的丟失，它的基本結構排布(圖7)及與ADLX的序列同源性仍可以編碼一個有小分子性質的功能性蛋白。這個現(xiàn)象由于所有基因尋找程序得到的相同的預測基因模型而變得更加可信(cf1；圖4)。考慮到預測的ADLY啟動子的功能以及猜測ADLY會在也在X染色體上使用的ATG密碼子處起始，閱讀框內+359處的終止密碼會過早地終止轉錄。預測在ADLY最后一個內含子的正鏈上有一個額外的啟動子。然而，啟動子的位置和潛在ADLY表達的意義之間并沒有明顯關系。
應用不同的基因尋找程序，我們檢測到在GCY區(qū)中有17個基因模型(Fig.4f)。僅有5個(ar1，cf1，cr1)和同源性查詢鑒定出的轉錄單元有重疊。對14個模型的理論上的翻譯沒有找到匹配的蛋白質?？紤]到定位和取向，RirstEF預測的啟動子可能在KIAA1470P，ADLY，RPS24P1和ARSFP內。
總之，沒有確定外顯子誘捕克隆和基因模型/同源性或假基因KIAA1470PY，ASSP6和THC604695PY。ADLY被認為是最有價值的GCY候選基因座，我們直接比較Y和X衍生的拷貝的外顯子/內含子的邊界區(qū)(表9b)。ADLX的3和4外顯子在Y拷貝上被剔除。余下的3個內部外顯子仍有正確的5’和3’拼接位點。
尋找轉錄單元對所有外顯子誘捕克隆進行同源搜尋，預測的基因模型違背GenBank的dbEST段且不產(chǎn)生任何Y特異性EST。用所有假定轉錄單元相應的引物進行PCR和PCR/限制性消化檢測。由ADLY，最有可能的GCY候選基因座的所有外顯子(表7B，7C)衍生得到的引物(表7B，7C)，用來篩選骨肉瘤和骨髓成纖維細胞系的逆轉錄polyA+-RNAs。結果顯示ADLX在所有檢測的細胞系中表達(除了神經(jīng)元組織)，但沒有檢測到ADLY特異性轉錄產(chǎn)物。更大范圍內的，對來自多種成年和胎兒組織的polyA+-RNAs進行篩選，得到的結果是相同的。我們也檢測了來自21個組織和49個cDNA文庫的polyA+-RNAs中GCY區(qū)的所有假定轉錄單元的表達情況。RP-PCR并沒有檢測到轉錄的基因。
GCY臨界區(qū)的進化特性Y染色體和其它染色體區(qū)有高度同源性，這與那些區(qū)域向著Y染色體進化的近期的轉座結果是一致的。更細微的差別是同源基因對的同義核苷酸差異(Ks)使它們能夠被歸入明確的進化層，1-4組(Lahn和Page 1999)。GCY區(qū)所有基因對的Ks值以及不同進化層的參考基因的Ks值在表6中列出。我們注意到，X-Y的分化約在3000-5000萬年前開始，所有X-Y基因對的Ks值都可分到最近的進化層中(第4組)。這個分類與X染色體基因的實際功能狀態(tài)是無關的。比較GCY區(qū)的Y拷貝和他們的功能祖先之間的Ks值，結果顯示X染色體拷貝的消失發(fā)生在X-Y重組之前。更突出的是1號染色體和Y染色體基因對的Ks值之間的差異。KIAA1470P1/KIAA1470PY基因對的低Ks值指出了一次更近的向人Y染色體的轉座(圖5)。支持的證據(jù)來自靈長類動物的熒光原位免疫雜交，顯示此事件發(fā)生在5-6百萬年前(Wimmer et al. 2002)。比較KIAA1470PY和它位于1q36上的功能祖先得到的Ks值可以將根本的染色體內轉座發(fā)生的時間定在15000-17000萬年前。
非同義取代頻率(Ka)是進化時間和選擇性限制因素對編碼的蛋白共同的作用，因此限制度可以用Ks/Ka表示(Li，1993)值大于1表示對兩個同源物都存在限制因素，值小于1表示至少一個同源物上沒有限制因素。所有測定的Ks/Ka值提示沒有對Y拷貝的自然選擇，因此突出了它們的假基因的地位。
我們搜尋了GenBank的nr數(shù)據(jù)庫的同源性演變和GCY區(qū)的末梢邊界來精確測定染色體雅趣1q43和Xp22上的同源區(qū)的物理范圍。為鑒定高度保守的片段，我們用Advanced PipMaker(Schwartz et al.2000，http//bio.ces.psu.edu)比較相應的DNA。檢查復合點陣可以鑒定在同源序列上缺失的GCY區(qū)上的那些部分。由于保守區(qū)內Y/1和Y/X的總同源性分別在94-97％和96-99％的范圍內，假定的編碼蛋白的外顯子并不需要高于非編碼區(qū)的平均百分數(shù)的同一性。點陣分析顯示，所有新的序列在GCY區(qū)從它的常染色體及X染色體平衡區(qū)上分離出來后會聚集在Y染色體的GCY區(qū)上，它們僅屬于重復起源。整個LINEs家族成員數(shù)量上的明顯優(yōu)勢就可以證明這一點。
討論自從存在Y染色體特異性生長基因這一課題被第一次提出后，人們作了很多努力來確定它的精確定位。盡管最初的研究把目標一致指向了Y染色體長臂上的一個普通的區(qū)域(Salo et al.1995)，后來的研究轉向了兩個非重疊臨界區(qū)的鑒定(Rousseaux-Prevost et al.1996，Ogata et al.1995，De Rosa et al.1997)。FISH分析提出了最初的研究所用的患者有45，X0細胞和/或i(Yp)或idic(Yq11)染色體這一明確的證據(jù)，從而解決了這一明顯的矛盾(Kirsch et al.2000)。兩個遺傳參數(shù)均影響一個特定個體的成年身高，由此可能預測此類病人是否丟失GCY。因此，對帶有de novo中間缺失的病人的研究對GCY的定位問題更有針對性。
在區(qū)分特別是在著絲粒附近帶有微小中間缺失的病人的過程中，愈加明確的是de novo中間缺失的病人是很少的。這促使我們擴大尋找?guī)в写骴e novo中間缺失病人的范圍，而不考慮他們的實際成年身高。我們檢查了9個成年患者，其中的7個有正常身高。此外，我們能夠展示重疊缺失，因此排除了GCY在Y特異性標記物DYS11和假常染色體區(qū)2(PAR2)之間。兩個患者，#293和Y0308，帶有的中間缺失將GCY臨界區(qū)的大小限制在約700kb的DNA。因此，推測此區(qū)域在正常人體生長所需要的一個或多個基因內。
外顯子擴增和GCY區(qū)的基因建模。
盡管更多的注意力已轉移到Yq11上的多個精子缺乏(AZF)關鍵區(qū)域以及Y編碼的睪丸特異的或普遍表達的基因，至今還未系統(tǒng)地找到GCY區(qū)的轉錄單元。我們已采用外顯子擴增，同源性尋找，計算機基因預測來鑒定此區(qū)內的假定基因。這些信息提供了多種手段來檢測參與調控人體縱向生長的基因。到現(xiàn)在為止，鑒定GCY基因的主要問題在于缺乏定位到人Y染色體內的這一部分的潛在轉錄單元。在本研究之前，僅有兩個假基因，RPS24P1和ARSFP，在基因圖譜上，它們是定位在GCY臨界區(qū)內的(Sargent et al.1999)。
通過外顯子擴增，我們分離了9個不同的外顯子誘捕克隆，其中的兩個有兩個外顯子組成。人類基因組計劃對GCY區(qū)平行測序的結果幫助我們完成了GCY區(qū)內潛在轉錄單元的編錄。在此區(qū)內沒有Y特異性ESTs。用Nix和Rummage軟件程序分析完整的BACs序列數(shù)據(jù)以預測序列內的潛在基因。我們已經(jīng)鑒定了4個新的基因/假基因和17個基因模型。17個基因模型中，僅有5個與鑒定的基因/假基因有同源性。一個和ADLY(cf1)同源的基因模型經(jīng)所有基因尋找程序一致預測。然而，多種基因尋找程序可能過高的估計了基因模型cf1的可能性。如存在于ADLY中的很大的外顯子，被正確預測的可能性較小，但它們也最不可能被完全忽略。結果是，大外顯子的存在使將實際的假基因當作功能性基因的可能增大了。盡管有正確的拼接位點，誘捕假定的ADLY轉錄單元的外顯子的失敗，可能是Y染色體序列的一個內在的性質。用于外顯子誘捕實驗(Reijo et al.1995)的Cosmid/P1克隆中AEFc片段的存在使得DAZ成為在這一位點上可能存在的八個基因家族中檢測出的唯一基因。
出人意料的是我們沒有發(fā)現(xiàn)在基因模型和外顯子誘捕克隆中存在一致性?？赡芡怙@子的擴增依賴于基因組中功能性剪切位點的存在，而基因模型主要基于同步六元實驗(一種能檢測特定開放閱讀框中六核苷酸序列出現(xiàn)幾率的實驗方法)。另一方面正確的剪切位點的預測就顯得沒那么重要，因為這樣的信號傳感器攜帶信息量較少而且往往被降解。因此外顯子誘捕克隆并不是預測基因模型所必需的，盡管誘捕的外顯子的一個片段含有75到200個核苷酸，是外顯子能精確預測的長度。同樣的，與一個明確的基因模型相關聯(lián)的假定外顯子并不一定代表真正的外顯子。
由于外顯子誘捕克隆和/或基因模型最后被證明是同一轉錄本的一部分或者并不代表任何基因，因而在GCY區(qū)域中最終的基因數(shù)可能要小一些。盡管在此區(qū)域中可能存在轉錄單元，但要找到核心區(qū)域仍比較復雜，因為GCY位點突變造成的表型很難精確定義。這就使預測基因表達譜變得很困難，特別是在基因功能未知的時候。人類生長是受多因素影響的，因此生長障礙比較常見。雖然至今已確定了至少9個生長控制基因，但是只有很少的導致疾病的突變存在于這些基因中。這些區(qū)域中轉錄單元的確定應采用突變研究方式，特別是在全長基因/假基因已被克隆之后。
雖然我們已廣泛篩選了反轉錄polyA+-RNAs和cDNA文庫，但還未檢測到任何Y特異性的轉錄本。這就使我們對于所采用的方法是否合適提出疑問。為驗證其可行性我們檢驗了在GenePage(http；//genome-www5.Stanford.edu)中對于骨骼發(fā)育至關重要的20個基因的表達模式。我們的篩選可以確定每個所選基因都有至少兩個拷貝。這就驗證了一個具有非常確定邊界的以及/或表達模式有時間性的特殊基因的存在。
進化特性是否能作為研究GCY基因座的線索？我們采用兩種方式進一步研究GCY核心區(qū)域的分子起源。首先我們通過與直接和功能祖先的比較確定GCY區(qū)域中基因/假基因的功能狀態(tài)。所有基因對的Ks/Ka都為1到2，說明Y拷貝是假基因。這一結果將X-Y基因對劃分為進化第4層，因為此層的基因都具有非常相似的進化歷史。這一類中只有一個例外就是AMELX/Y，仍編碼有功能的X拷貝和Y拷貝。通過與1p36上有功能的祖先相比較，KIAA1470的Y拷貝應歸類于假基因。另外我們采用大范圍序列比較來確定GCY區(qū)的亞區(qū)及其在Xp22和1q43中的同源區(qū)之間的潛在差異，但沒有檢測到保守的亞區(qū)或是新近插入GCY核心區(qū)域的小染色體片段。而且在同源染色體序列上同步進行的啟動子預測也沒有顯示差別。此結果清楚地說明在GCY核心區(qū)域確實存在重排，并且有潛在的雄性特異性調節(jié)機制的基因。
表1 患者及其兄弟姐妹的成年身高比較
標準偏差分數(shù)(SDS)通過下式計算SDS＝(X-M)/SD，其中X是個體成年身高，M和SD是正常人群平均成年身高及正常人群±1標準偏差(M)母親，(F))父親，(S)姐妹，(B)兄弟，(NA)未得到表2 Y-染色體STSs左引物 右引物 產(chǎn)物SKY1 GGACATTTGGCTGCAGAGATTGGCAATGCACTCTCATCAT 255SKY2 TCAGGACAGACAGGCTGCTACCTGCCACTGAGCTCCTTAC ～1700SKY3 TTCTCCCTCATCTTCCAAGCGCTTCCATCCATTAGCAAGG 167SKY4 CCTTTCATTCCATTCTCTTCCA CGCACTTTATGGACTGCAA 111SKY5*CCCTCGTCCATTTCTTTTGACCTCGAATTTAATGGATTGC 202SKY6*TCAATGGATGCACAGTGTGGC TCCACTGAATTCCATTGCAC 328SKY7 GGGAGTGCAAAGGGAAAGATCTTTCCATGGGGTGACATTC 223SKY8 CCATTCATTCGAGTTCATTACG ATTGGAATGGAATCGGACAG 189SKY9 GGCCGATGGTCAAACTGTTAGAAACGGGCTCTGAAATTCT 531SKY10*ATAAGGGGCAGGTTTGTCACGCTACTTATTCAGTGTTAACTGACAC 329SKY11*AAAGTGGGTGAAGGACATGGTTTTTGTTTGTGGCAGGTG 469SKY12*TTGAGTCACTGGGGATAACTG TATGGCCCACAACACTTCA 216SKY13*GGCAGCCTAGAAAGTCTTGTTC CCCTTGGGATTTTGTCTGTT 198有*標記的標記物擴增來自一個以上的基因組基因座的DNA片段(詳見PCR產(chǎn)物的限制性分析章節(jié))。
染色體1衍生的BAC克隆RP11-560I18(AC053522)遞交的序列經(jīng)引物對SKY10擴增后在基因組片段中沒有Tsp509I限制性位點。片段限制性分析，分別擴增自男性和女性的基因組DNA，含有1號染色體作為唯一人源染色體的體細胞雜交細胞系以及BAC RP11-560I18顯示兩個約180bp和約155bp的片段，說明在BAC克隆的完整序列中有一個序列錯誤。
表4 創(chuàng)建物理圖譜過程中鑒定的BAC和PAC克隆匯總Y-STSs陽性BACs(RPCI11) 陽性PACs(RPCI1，3-5)sY83 未篩選 83D22sY82 未篩選 83D22，114A11，157G08，966C15GY8 未篩選 114A11，168E21，271D03，635F21，sY81 未篩選 301P22，1079J08，1078C20，1160A1214A3C*未篩選 148J07，1136A14，1160A12，1196I23sY79 75F05，79E14，102G24，322K23， 1149H11417D23，600D11，612E10，725I12，863I08，903M02，1125H21SKY1 376B16，544C11，544M21 56A05，85D24，958M03SKY2 79P12，295P22，376L20，828O24， 829H08886I11，910C06SKY4 75F05，322K23，612E10not screenedSKY5 174I24，271E18，295P22，588E18， not screened620J20，632F11，684H19，705O19SKY6 174I24，271E18，295P22，588E18， not screened620J20，632F11，684H19，705O19*14A3C是一個雜交探針在Tyler-Smith er al.1993中有描述，它檢測到了一個3.5kb的Y-特異性HindIII一片段和一個另外的常染色體片段。
表5 對先天身材矮小的成年男性進行微小缺失篩選所用的基因組引物對
表6 分離的外顯子誘捕克隆的序列外顯子誘捕克隆
表7A 預測的基因的引物對
1預測產(chǎn)物大小(bp)；2潛在Y-衍生的轉錄拷貝用標出的限制性酶切割，未切割的潛在的X-衍生的轉錄物；3表示引物在含BAC(a，b，c或d)的預測的基因中的位置(從著絲粒列端粒)。
表7B Adlican Y拷貝的引物對
表7C ADLY的RT-PCR引物序列引物序列(5‘→3‘)在ADLY1中的位置 在ADLX中的位置 ADL外顯子2正向引物AdlYEx1 GACTCCTGGCCTTGACTTGA44-63-- 1cf1 TCTCTGTGGTGCTGATCCTG184-203 184-203 2AdlYEx5 CAGCGAAGGAAAGCACATTT2177-2196-- 5C21 CTGTCCAGTCCTCAGGAAGC5089-51085620-56395cf1-4a ACAGCGGGCGCTATGAGT 5971-59886502-65196反向引物AdlYEx2 CAGGATCAGCACCACAGAGA203-184 203-184 2GCAAGAATCTGGGCTCTCAC914-895 1435-14165AdlYEx5 GGGTGTAATTTTCTCCCATTG 3103-3083-- 5cf1-4b CTGACGTCCGTCCTCTGC 6143-61266631-66146cf1-6453ATGGACAGTGATCCGGTTTC7158-71397649-763071ADLY指根據(jù)和功能性X-adlican同源性比較而預測的基因。
2外顯子的計數(shù)是以X-拷貝的外顯子/內含子排布為基礎的。
請注意用cflfor/rev進行RT-PCR從adlican拷貝生成不同大小的產(chǎn)物cf1-4a/cf1-6453和C21/Cf1-4b擴增產(chǎn)物含有染色體特異性限制性位點(cf1-4a/cf1-6453Y-BamHI，X-PsyI；C21/cf1-4b；Y-NlaIII，X-SacI)。
表8 外顯子誘捕克隆RT-PCR引物序列外顯子誘捕克隆 正向引物 反向引物eta2 GCACCATTAGTGCGCTTGTGAGCATCAGGGGTGTCTTCTaTTACATAGAATGGTAACTCCTTTTGCeta3 bAACTCCTTTTGCACCTCGTGaGCTGATGCTCAGAGTGTGGAeta4bGATTGCTGGCTGTGTCACCaTTTAAAATTCCTTCTAAACTTTTTCCetc1 bCCCATTTCTGCTCAATTTTCAaGCTGAACATTATTTCTTATTCCAGAetc2 bAGAGGACTAGGATTCATGGGATTaTGAAATGGCAAACCTTTCAGAetc3bGGCAGAGACTCTCCTACATATTCetc4 TGGCCTATAAAGGGATCAATG GGTGCAGGAGGGTGATTAAGaGAAAGCCACCAAGAGTGGACetc5 bACCAATATCCAAGGGACATGAeta2的產(chǎn)物大小175bp，etc4產(chǎn)物大小166bp。
進行單個外顯子誘捕克隆的半巢式PCR操作a外面的引物；b里面的引物表9a 外顯子同源性比較
表9b 保守外顯子的外顯子/內含子邊界區(qū)
表10 GCY區(qū)的基因/假基因及其同源物的序列變異
如果GCY區(qū)的基因在X染色體或1號染色體的衍生拷貝沒有功能，Y-拷貝另外和它們的功能祖先比較。
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權利要求
1.Y染色體上SKY1和sY83之間的一個分離的區(qū)域，包含Y特異性生長基因GCY。
2.如權利要求1所述的分離的區(qū)域，大小約為700Kb。
3.如權利要求1或2所述的分離的區(qū)域，其中的Y染色體是人的染色體。
4.如權利要求1或3所述的分離的區(qū)域，在SKY8和sY83之間。
5.如權利要求1或3所述的分離的區(qū)域，在sY79和sY81之間。
6.一種分離的GCY蛋白，由Y染色體上SKY1和sY83之間的一個區(qū)域編碼。
7.如權利要求6所述的分離的GCY蛋白，由SKY8和sY83之間的一個區(qū)域編碼。
8.如權利要求7所述的分離的GCY蛋白，由sY79和sY81之間的一個區(qū)域編碼。
9.如權利要求8所述的分離的GCY蛋白，是ADLY或其功能片段。
10.一種核酸引物，它具有選自于表2，5，6，7A，7B，7C或8中所列的核酸序列中的一個核酸序列。
11.一種研究GCY定位或鑒定和身高有關的GCY基因的方法，包括如權利要求10所述的引物的應用，以選擇性擴增或檢測核酸分子的某個區(qū)域。
12.一種和權利要求6-9的GCY蛋白有大于65％的同源性的分離的蛋白，它對人的性別相關身高差異有影響。
13.核酸分子的應用，包括Y染色體上標記物SKY8和sY83之間的分離的區(qū)域的至少一個部分，或其中的補充序列以鑒定和身高有關的GCY基因的存在或缺失。
全文摘要
本發(fā)明涉及Y染色體上分離的區(qū)域和基因，含有Y特異性生長基因GCY。同時提供探針和引物。
文檔編號C12N15/09GK1649896SQ03809224
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月25日 優(yōu)先權日2002年4月26日
發(fā)明者古德龍A·拉波爾德, 施特凡·基施 申請人:古德龍A·拉波爾德