專利名稱：基于應激蛋白寡聚化的方法和產品的制作方法
1.引言本發(fā)明涉及免疫學、疾病的免疫治療、應激蛋白介導的免疫調節(jié)和疫苗開發(fā)領域。更特別地，本發(fā)明涉及測定熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的方法和篩選調節(jié)熱休克蛋白-肽復合物生物活性的試劑的方法。本發(fā)明也涉及通過促進其寡聚化而增強免疫治療部分，例如熱休克蛋白-肽復合物的免疫原性的方法。
2.發(fā)明背景在現代醫(yī)學中，免疫治療或疫苗接種已經實際上消除了例如脊髓灰質炎、破傷風、肺結核、水痘、麻疹、肝炎等疾病。使用接種疫苗的方法利用了免疫系統預防傳染性疾病的能力。用非活的物質，例如蛋白質接種疫苗一般導致抗體應答或CD4+輔助T細胞應答。Raychaudhuri和Morrow(1993)Immunology Today 14344-348。另一方面，接種疫苗或用活的物質，例如活細胞或傳染性病毒感染一般導致CD8+細胞毒性的T-淋巴細胞(CTL)應答。CTL應答對于預防癌癥、傳染性病毒和某些細菌是決定性的。這提出了實際的問題，獲得CTL應答的唯一方式是使用本身為病原體的活因子。該問題一般通過使用減弱的病毒株和菌株或通過殺死可用作疫苗接種的完整細胞而避免。這些策略已經很好地進行，但是使用減弱毒株總是攜帶了該減弱的因子可能與宿主DNA基因重組而變成強毒株的風險。因此，需要可以通過用非活的物質，例如蛋白質以特異的方式接種疫苗來誘導CD8+CTL應答的方法。已經發(fā)現熱休克蛋白-肽復合物具有作為抗癌和抗傳染性疾病疫苗的特別用途。(Srivastava等人，(1994)Curr.Op.Imbu.6728；Srivastava(1993)Adv.Cancer Res.62153)。
熱休克蛋白(hsps)，也稱為應激蛋白，最初被鑒定為是細胞針對熱休克反應合成的蛋白質。已經根據它們的分子量將Hsps分類為幾個家族，例如，hsp90、hsp70、hsp60、sm hsp等，并且每個家族由大約1-5個緊密相關的蛋白質組成。Srivastava，2002，Annu.Rev，Immunol.20395-425。盡管家族內的成員是緊密相關的，但在個別的hsp家族間只有一點或幾乎沒有明顯的同源性。熱休克蛋白在所有形式生命的所有細胞中和在多種胞內位置表達。它們在正常情況下大量表達并且它們的表達可作為熱休克或其他形式應激，包括暴露于毒素、氧化性應激、缺乏葡萄糖等的結果而被有力地誘導到很高的水平，(參見Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol. 20395-425)。
對熱休克和其他生理應激反應的細胞應答的研究顯示hsps不僅參與在細胞對這些不利條件的防護中，而且參與在無應力細胞中實質的生物化學和免疫方法中。Hsps實現各種伴護功能。例如，定位于細胞胞質、細胞核、線粒體或內質網(Lindquist等人，1988，Ann.Rev.Genetics 22631-677)的hsp70家族的成員，參與對細胞免疫系統的抗原呈遞，并且也參與正常細胞中蛋白質的傳遞、折疊和裝配。Hsps也能夠結合蛋白質或肽，并在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH時釋放結合的蛋白質或肽。
Srivastava等人已經證明了近交小鼠對甲基膽蒽-誘導的肉瘤的免疫應答(Srivastava等人，1988，Immunol.Today 978-83)。在這些研究中，發(fā)現負責這些腫瘤的個別獨特的免疫原性的分子是96kDa的糖蛋白(gp96)和84-86kDa的胞內蛋白質(Srivastava等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 833407-3411；Ullrich等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833121-3125)。用分離自特定腫瘤的gp96或hsp84/86免疫小鼠使得該小鼠對該特定的腫瘤免疫，但不對抗原性獨特的腫瘤免疫。對編碼gp96和hsp84/86的基因的分離和表征顯示它們之間有顯著的同源性，并且顯示gp96和p84/86分別是相同的熱休克蛋白在內質網網狀和胞質中的對應物(Srivastava等人，1988，Immunogenetics 28205-207；Srivastava等人，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol. 167109-123)。進一步地，顯示hsp70引發(fā)對從中分離出它的腫瘤的免疫性，但不是對抗原性獨特的腫瘤的免疫性。然而，發(fā)現缺乏hsp70的肽喪失了它的免疫原活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.1781391-1396)。這些觀察表明，熱休克蛋白本身不是免疫原性的，但是與抗原性肽形成非共價的復合物，并且該復合物可引發(fā)對該抗原性肽的特異性免疫(Srivastava，1993，Adv.Cancer Res.62153-177；Udono等人，1994，J.Immunol.，1525398-5403；Suto等人，1995，科學Science 2691585-1588)。
這些現象已經在含有已知和未知抗原的腫瘤和病毒模型中觀察到(Srivastava等人(1998)Immunity 8657；Ciupitu等人(1998)J.Exp.Med.5685；Arnold等人(1995)J Exp.Med.182885)。與gp96、hsc70和hsp84/hsp86結合的抗原性肽的存在已經在該抗原性肽是已知的細胞中從結構上得到證明(Nieland等人(1996)Proc. Nat′L.Acad.Sci.USA 936135；Breloer等人(1998)Eur.J.Immunol.281016；Ishii等人(1999)Immunol.J.1621303)。用熱休克蛋白-肽復合物接種疫苗適用于預防(Srivastava等人(1986)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 833407；Ullrich等人(1986)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 833121；Peng等人(1997)J.I.Meth.20413；Basu和Srivastava(1999)J.Exp.Med.189797)和治療癌癥(Tamura等人(1997)Science 278117；Yedavelli等人(1999)Int.J.Mol.Med.3243)并用于預防傳染性疾病(Ciupitu等人(1998)J.Exp.Med.5685)。對人癌癥免疫治療的途徑的轉換目前正在研究中，該研究使用gp96復合物(Janetzki等人(1998)J.Immunother.4269；Amato等人(1999)ASCO會議，摘要1278；Lewis等人(1999)ASCO會議摘要1687)或hsp70復合物作為自體同源的疫苗并且使用個別患者的癌癥作為熱休克蛋白源(Ménoret和Chandawarkar(1998)Semin.in Oncology 25654)。
幾個hsps，包括hsp104、hsp90、hsp70和hsp60已經顯示具有ATP酶活性(Scheibel等人(1997)J.Biol.Chem.27218608-18613；Richter等人(2001)J.Biol.Chem.27633689；Lopez-Buesa等人(1998)Proc.Nat′l.Acad.Sci.9515253；Schirmer等人(1998)J.Biol.Chem.27315546)。對于hsp90，也已經觀察到ATP的結合和水解與其分子伴侶功能相關(Obermann等人(1998)J.Cell Biol.143901；Panaretou等人(1998)EMBO J.174829)。然而，ATP酶活性和構象變化在體內促進hsp90的生物活性的作用仍然是進一步研究的主題。
Gp96，是熱休克蛋白hsp90家族的成員，也已經有報道其具有ATP酶活性(Li等人(1993)EMBO J.123143)。然而，該觀測已經受到Wearsch和Nicchitta的挑戰(zhàn)，他們認為gp96的肽結合活性是獨立于腺嘌呤核苷酸的，并且ATP的結合和水解不是gp96的固有特性((1997)J.Biol.Chem.2725152)。這些研究者也表明在gp96制劑中極輕微的ATP酶活性是由極少量的污染的酪蛋白激酶II引起的。Wearsch，Voglino和Nicchitta進一步報道，結合gp96的肽在存在或缺少ATP或ADP時是相同的，并且該結合隨著化學變性/復性或瞬時的熱休克之后而分別被激發(fā)2倍或4倍((1998)Biochem.375709)。
已經顯示Gp96作為非共價締合的亞基的二聚體而存在(Wearsch和Nicchitta(1996)Prot.Exp.Pur.7114)。已經提出肽被裝配為更高級有序的gp96復合物(Sastry和Linderoth，J.Biol. Chem.27412023)。已經進一步顯示熱休克產生三級構象的變化，從而增加溶劑和肽對疏水結構域的易接近性(Wassenberg等人(2000)J.Biol.Chem.27522806)。然而，Wassenberg等人(上述)表示支持內在的ATP結合和ATP酶活性的證據是有爭議的，然而關于腺苷核苷酸的分子堿基介導對gp96底物相互作用的調節(jié)將要達成一致。盡管對gp96的生物物理學和生物化學進行了研究，gp96和肽底物之間相互作用的調節(jié)仍然沒有被完全了解。而在主要的組織相容性復合物類別I的抗原加工和呈遞途徑中關于核苷酸結合和構象變化對gp96-肽復合物功能的影響更是知之甚少。
因為正在開發(fā)免疫治療劑，了解這些相互作用的機制和它們如何影響這些復合物的生物活性變得至關重要。在一個方面，本發(fā)明提供檢測和測量hsp和hsp-抗原復合物的生物活性的方法，其中可應用該方法根據hsp-抗原復合物來確定免疫治療劑的效價。
Hsps，例如gp96、hsp90、hsp70、鈣網蛋白、hsp 10和grpl70，也是已知作為許多肽的伴侶(關于綜述，參見Srivastava等人，1998，Immunity 8657-665；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425)。例如，腫瘤衍生的gp96攜帶腫瘤的抗原性肽，來自病毒感染的細胞的gp96制品攜帶病毒表位(Suto和Srivastava，1995，Science2691585-1588)，而來自用模型抗原，例如卵清蛋白或β-半乳糖苷酶轉染的細胞的gp96制品與相應的表位相關(Arnold等人，1995，J.Exp.Med.182885-889；Breloer等人，1998，Eur.J.Immunol.281016-1021)。Hsp-肽復合物，無論分離自細胞(Tamura等人，1997，科學Science 278117-120)，或在體外重新組成(Blachere等人，1997，J.Exp.Med.1861183-1406)都是優(yōu)良的免疫原并且已經被廣泛使用以引發(fā)特異于hsp-伴侶的抗原性肽的CD8+T細胞特異應答(關于綜述，參見Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol. 20395-425)。
可以使用純化自癌細胞的hsps和肽的非共價復合物來治療和預防癌癥，并且已在1996年4月11日的PCT公開物WO 96/10411和1997年3月20日的公開物WO 97/10001中有描述(分別為1998年4月12日發(fā)行的美國專利號5,750,119，和1998年11月17日發(fā)行的美國專利號5,837,251，每個專利在此全部引入作為參考)。應激蛋白-抗原復合物的分離和純化已有描述，例如來自病原體-感染的細胞，并且被用于治療和預防由該病原體，例如病毒、和其他胞內病原體，包括細菌、原生動物、真菌和寄生蟲所引起的感染(參見，例如1995年9月21日PCT公開的WO 95/24923)。免疫原性的應激蛋白-抗原復合物也可以通過應激蛋白和抗原性肽的體外結合而制備，并且這種復合物用于治療和預防癌癥和傳染性疾病的用途已經在1997年3月20日的PCT公開物WO 97/10000中有描述(2000年2月29日發(fā)行的美國專利號6,030,618)。使用應激蛋白-抗原復合物來在體外將呈現抗原的細胞敏化用于過繼性免疫療法的用途在1997年3月20日PCT公開的WO97/10002中有描述(也參見1999年11月16日發(fā)行的美國專利號5,985,270)。
引發(fā)更大免疫應答的hsps和肽的復合物可用于增強免疫治療傳染性疾病和癌癥。另一方面，本發(fā)明提供了用于增強熱休克蛋白或包括熱休克蛋白和抗原性分子的復合物的免疫原性的復合物、組合物和方法。
在此對參考文獻的引證或評論不應被看作承認其是相對于本發(fā)明的現有技術。
3.發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供檢測熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的方法。本發(fā)明也包括該方法在測定包括熱休克蛋白-肽復合物的免疫治療劑的活性；在評估受試個體對疫苗或免疫治療的應答；以及在篩選調節(jié)熱休克蛋白-肽復合物的活性的因子中的用途。
本發(fā)明中使用的hsp可選自任何hsp家族，包括例如但不限于，hsp70家族、hsp90家族和hsp60家族。此外，本發(fā)明使用的hsp可選自任何hsp，包括但不限于hsp90、gp96(grp94)、hsp 104、hsp 70和hsp 60。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用的hsp是gp96。
可以通過本發(fā)明評估的生物活性包括但不限于，免疫活性，例如肽抗原對抗原呈遞細胞的呈遞(抗原再呈遞)和T細胞的活化。在一個實施方案中，術語生物活性限于免疫活性。hsp-肽復合物的免疫活性是直接與其在預防和治療應用中的用途相關的。許多其他的生物學活性是本領域已知的，并且包括例如但不限于，誘導產生生物反應的調節(jié)物，例如但不限于細胞因子，例如人巨噬細胞化學誘引蛋白質-1(MCP-1)和一氧化氮(NO)；結合受體，例如CD91(α-2-巨球蛋白受體，α2MR)和/或CD36；抗原性分子的結合和釋放；以及引起動物中腫瘤的退化，延長患腫瘤動物的存活期并消除感染的能力。該生物活性可能在體內和/或體外發(fā)生或被觀察到。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供檢測熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的方法，包括測定熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性并且使用該熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性作為生物活性的指標?？墒褂帽绢I域已知的用于確定ATP酶活性的任何方法，例如但不限于涉及ATP的酶反應，例如但不限于基于發(fā)光酶的分析，和檢測ATP、ADP、AMP和/或無機磷酸的濃度和/或數量的方法，例如但不限于離子交換色譜法、生物發(fā)光分析、HPLC、放射性同位素分析或免疫親和分析。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供檢測熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽的生物活性的方法，包括確定熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物寡聚體的數量并且使用熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的存在作為熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的指標?？墒褂帽绢I域已知用于測定熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的大小和/或構象的任何方法，例如但不限于大小排阻色譜法、凝膠電泳、免疫測定、梯度離心、過濾器、光散射分析或分析超離心。在多種實施方案中，熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體是優(yōu)選的。
可結合使用本發(fā)明的方法以確定包括熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的組合物的生物活性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供篩選調節(jié)熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的潛在的治療化合物的方法。該方法包括在不存在化合物時測量熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性的步驟；讓熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物與化合物接觸；將沒有接觸化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性與接觸了該化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性比較；并且使用接觸了化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物與沒有接觸化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性之間的任何差異作為該化合物調節(jié)生物活性的指標。該方法可進一步包括在存在格爾德霉素或任何其他特異性的核苷酸結合hsps的抑制劑，例如NECA時確定ATP酶活性，其中受到存在的格爾德霉素或任何其他特異性的核苷酸結合抑制劑抑制的該ATP酶活性被用作該生物活性的指標。當可能存在其他種類的ATP酶時，這個步驟是特別有效的。
在另一實施方案中，提供篩選潛在的治療化合物的方法，包括在不存在化合物時測量熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的數量；使熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物與化合物接觸；比較沒有接觸化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的數量與接觸了化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的數量；以及使用接觸了化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體與沒有接觸化合物的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的數量之間的任何差異作為該化合物調節(jié)生物活性的指標。在多種實施方案中，該熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體是優(yōu)選的。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供針對其生物活性篩選熱休克蛋白和復合物的變體的方法，包括確定變體的ATP酶活性或由該變體或變體和其正常的對應物形成的寡聚結構的存在。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供調節(jié)熱休克蛋白和其復合物的生物活性的方法，包括使熱休克蛋白和復合物與調節(jié)ATP酶活性或該熱休克蛋白和復合物的寡聚化的化合物接觸?？墒褂眠@種化合物調節(jié)受試個體的免疫功能。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷部分歸因于受試個體免疫系統異?；騺喺９δ艿氖茉噦€體狀況的方法，所述方法包括利用熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或從受試個體獲得的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的存在作為該熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的指標，其中該生物活性與受試個體中一種或多種免疫功能相關，由此ATP酶活性或寡聚體的數量的變化表明狀況的變化。在多種實施方案中，熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體是優(yōu)選的。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供用于確定受試個體中癌癥或傳染性疾病的預后的方法，包括使用熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或從受試個體獲得的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的寡聚體的存在作為熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的指標，其中該生物活性與應答或靶向癌癥細胞或引起傳染性疾病的因子的一種或多種免疫功能相關，由此ATP酶活性或寡聚體的數量的變化指示預后的變化。在多種實施方案中，熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體是優(yōu)選的。
在一個實施方案中，hsp或hsp-肽復合物可從來自受試個體的樣品，例如組織樣品或血樣獲得；hsp或hsp-肽復合物可隨后被進一步分離和/或純化。
可使用本發(fā)明的方法提供熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的基于質量的比活性?？梢允褂迷撔畔⒄{控用于診斷或治療應用的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的質量或效價?？墒褂迷撔畔⒃O計更經濟的和更有效的制劑和劑量。
本發(fā)明進一步提供包括包含熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的組合物的試劑盒，其中使用該熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或寡聚體的數量作為熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性的指標，以及用于測定熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或寡聚體的數量的指導說明。在多種實施方案中，熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體是優(yōu)選的。
另一方面，本發(fā)明提供用于增強熱休克蛋白或包括熱休克蛋白和抗原性分子的復合物的免疫原性的復合物、組合物和方法。本發(fā)明也涉及改進抗原遞送到細胞的方式從而提供更有效的和因此更強效的疫苗制劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的純化的復合物；其中該熱休克蛋白已經通過與寡聚劑接觸而寡聚化，附帶條件是該寡聚劑不是凝集素、4，4′-雙苯胺基-1，1′-聯萘-5，5′-二磺酸(″bis-ANS″)、戊二醛或磺基琥珀酰亞胺基(4-疊氮水楊酰胺基)己酸(″SASD″)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的純化的復合物；其中熱休克蛋白已經通過與寡聚劑共價結合而被寡聚化，附帶條件是寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在某些實施方案中，該熱休克蛋白非與寡聚劑共價結合。在一些實施方案中，寡聚劑選自可結合熱休克蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈霉抗生物素蛋白和衍生的聚乙二醇(″PEG″)的雙特異性的或多價的抗體。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是作為復合物從細胞裂解物中分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或用呈現傳染性疾病因子的抗原性的因子感染的細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供純化的寡聚的復合物的群體，所述群體中的每種復合物包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該復合物已經通過與寡聚劑接觸而被寡聚化，條件是該寡聚劑不是凝集素、bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中所述群體中的至少一種復合物包括不同于所述群體中另一種復合物的抗原性分子的抗原性分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供純化的寡聚復合物的群體，所述群體中的每種復合物包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該復合物已經通過與寡聚劑共價結合而被寡聚化，條件是該寡聚劑不是凝集素、bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中所述群體中的至少一種復合物包括不同于所述群體中另一種復合物的抗原性分子的抗原性分子。在一些實施方案中，該熱休克蛋白與寡聚劑非共價結合。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是從細胞裂解物中作為復合物而被分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或用呈現傳染性疾病因子的抗原性的媒介感染的細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的純化的復合物；其中熱休克蛋白已經通過與寡聚劑接觸而被寡聚化，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在特定的實施方案中，本發(fā)明提供包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的純化的復合物；其中熱休克蛋白已經通過與寡聚劑共價結合而被寡聚化，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。優(yōu)選地，該復合物進一步包括抗原性分子，并且更優(yōu)選地，該熱休克蛋白在與寡聚劑接觸之前是以與抗原性分子的復合物形式存在的。備選地，該熱休克蛋白最初沒有接觸抗原性分子，但在其寡聚化后接觸抗原性分子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物的藥物組合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中熱休克蛋白已經通過與寡聚劑接觸而被寡聚化，條件是寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些實施方案中，該藥物組合物包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些實施方案中，該藥物組合物包括藥物學上可接受的載體和治療有效劑量的純化的復合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化。在其他的實施方案中，該藥物組合物包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白，抗原性分子和藥物學上可接受的載體，其中該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化，并且其中該藥物組合物存在于注射器中。在特定的實施方案中，該熱休克蛋白非共價結合寡聚劑。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是從細胞裂解物中作為復合物分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或受呈現傳染性疾病因子的抗原性的媒介感染的細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物中的復合物以用于治療或預防癌癥或傳染性疾病的有效量存在。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供包括包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白的純化復合物的試劑盒；其中熱休克蛋白已經通過接觸寡聚劑而寡聚化，條件是寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在某些實施方案中，該試劑盒包括包含寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白的純化復合物；其中該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化，條件是寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些實施方案中，該熱休克蛋白非共價結合寡聚劑。在一些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。優(yōu)選地，該試劑盒包括進一步包含抗原性分子的復合物。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是從細胞裂解物中作為復合物分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或受呈現傳染性疾病因子的抗原性的媒介感染的細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供通過使復合物與足夠引起該復合物的寡聚化的適量寡聚劑接觸而增強包含免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的復合物的抗原性或免疫原性的方法，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在另一個實施方案中，增強復合物的抗原性或免疫原性的方法包括使包含免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的復合物與足夠引起該復合物寡聚化的適量寡聚劑接觸，其中該熱休克蛋白共價結合該寡聚劑。在特定的實施方案中，本方法使用的復合物包括與抗原性分子通過非共價鍵復合的免疫活化的熱休克蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，抗原性分子是肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的復合物分離自細胞裂解物，優(yōu)選來自癌性細胞或受呈現傳染性疾病因子的抗原性的媒介感染的細胞。在特定的實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供通過首先使hsp與足夠引起該hsp寡聚化的寡聚劑接觸而增強免疫活化的hsp肽復合物的抗原性或免疫原性的方法，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD；隨后將該寡聚的hsp接觸抗原性分子。在某些實施方案中，該方法包括使hsp與足夠引起該hsp寡聚化的適量寡聚劑接觸，其中熱休克蛋白共價結合該寡聚劑，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD；并隨后將該寡聚的hsp接觸抗原性分子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供治療或預防癌癥或傳染性疾病的方法，包括對需要這種治療或預防的受試個體施用治療有效量的純化復合物，其中該復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子；其中該熱休克蛋白已經通過接觸寡聚劑而寡聚化，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中該抗原性分子分別顯示所述癌癥的腫瘤特異性或與腫瘤相關的所述的抗原或所述的傳染性疾病因子的抗原性。在某些實施方案中，本方法使用的復合物包括已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化的熱休克蛋白。在一些實施方案中，本方法中使用的復合物包括已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化的熱休克蛋白，條件是該寡聚劑不是戊二醛。在其他的實施方案中，該寡聚劑不是bis-ANS或SASD。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是從細胞裂解物中作為復合物分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或受呈現傳染性疾病因子的抗原性的因子感染的細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該細胞從受試個體獲得。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供治療或預防癌癥或傳染性疾病的方法，包括對需要這種治療或預防的受試個體施用治療有效量的包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物的藥物組合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該熱休克蛋白已經通過接觸寡聚劑而寡聚化，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中該抗原性分子分別呈現所述癌癥的腫瘤特異性或與腫瘤相關的抗原或所述傳染性疾病因子的抗原性。在一些實施方案中，該方法包括施用治療有效量的包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物的藥物組合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化。在一些實施方案中，本方法使用的復合物包括已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化的熱休克蛋白，條件是該寡聚劑不是戊二醛。在其他的實施方案中，該寡聚劑不是bis-ANS或SASD。在特定的實施方案中，本方法包括施用治療有效量的包括藥物學上可接受的載體和純化的復合物的藥物組合物，所述的復合物包括寡聚的、免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，其中(a)該熱休克蛋白已經通過共價結合寡聚劑而寡聚化，(b)該藥物組合物存在于注射器中，以及(c)該抗原性分子顯示癌癥的腫瘤特異性或與腫瘤相關的抗原或傳染性疾病因子的抗原性。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子的復合物分離自細胞裂解物，優(yōu)選來自癌性細胞或用呈現傳染性疾病因子的抗原性的因子感染的細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該細胞從受試個體獲得。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備藥物組合物的方法，包括(a)使復合物與足夠引起該復合物寡聚化的適量寡聚劑接觸，其中該復合物包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD；以及(b)將寡聚的復合物與藥物學上可接受的載體組合。在一些實施方案中，該方法包括(a)使復合物與足夠引起該復合物寡聚化的適量寡聚劑接觸，其中該復合物包括免疫活化的熱休克蛋白和抗原性分子，并且其中該寡聚劑共價結合寡聚劑，條件是該寡聚劑不是bis-ANS、戊二醛或SASD；以及(b)將寡聚的復合物與藥物學上可接受的載體混合。在某些實施方案中，該熱休克蛋白是gp96或hsp90。在優(yōu)選的實施方案中，熱休克蛋白和抗原性分子是從細胞裂解物中作為復合物分離的，優(yōu)選來自癌性細胞或受呈現傳染性疾病因子的抗原性的媒介感染的細胞。
4.附圖簡述

圖1. SEC跡線表明當加熱hsp-肽復合物時，該蛋白質快速地形成較高分子量的聚集物。
圖2.圖表A表明在50℃和60℃加熱gp9630分鐘后有二聚體水平的下降，當在60℃加熱時下降的速率更快。在30分鐘時兩個樣品都不包含二聚體。圖表B顯示在50℃和60℃加熱30分鐘后，gp96的NECA結合能力下降，當在60℃加熱時下降的速率更快。在30分鐘時兩個樣品的gp96都不結合NECA。圖表C和D表明，當加熱gp96復合物到50℃和60℃30分鐘時，gp96復合物刺激小鼠的APC分泌MCP-1和NO的能力快速下降。圖表E和F表明，酸性pH分別對二聚體水平和gp96結合NECA的能力的影響。二聚體水平和NECA結合能力在pH3.0時都顯著地減少。圖表G和H表明，酸性pH對gp96復合物刺激小鼠的APCs分別分泌MCP-1和NO的能力的影響。MCP-1和NO的分泌在pH 3.0下都顯著地減少了。
圖3.從人卵巢腫瘤細胞制備的gp96復合物的SEC跡線，其中級分8-10相應于hsp-肽復合物的二聚體。
圖4.從人卵巢腫瘤細胞制備的gp96復合物的單個級分的SEC跡線，其中級分8-10相應于hsp-肽復合物的二聚體。
圖5.單個級分的銀染SDS-PAGE凝膠表示在圖3和4中。級分2-5包含gp96的大部分較高分子量的聚集物，同時級分8-10表示二聚體。
圖6.級分的ATP酶活性表示在圖3-5中。表示二聚體的級分8-10，具有最高的ATP酶活性，而表示聚集物的級分(級分2-5)和其他類型的級分(級分11-15)具有顯著減少的ATP酶活性。
圖7.雜合抗原再呈遞分析表明，與小鼠抗原AH1十九聚體結合的來源于人的gp96導致與單獨的gp96或AH1十九聚體相比，抗原再呈遞活性的劑量依賴性增加，其以IFN-γ的分泌表示。頂部的條帶顯示應用于APCs和CTLs的樣品的IFN-γ水平。第二和第三條帶是單獨的CTLs和APCs的對照。每個數據組單獨包含未加載gp96和AH1十九聚體的培養(yǎng)基作為陰性對照并且將可直接交換到MHC 1分子表面上的AH1九聚體肽作為陽性對照。gp96/AH1十九聚體復合物以10μg/mL施加或用未加載的gp96以1∶3，1∶10或1∶30稀釋。結果顯示劑量依賴性的IFN-γ應答并且沒有經未加載的gp96的刺激。對照表明該活性是特異于加載了AH1十九聚體的gp96。當在60℃加熱蛋白質-肽復合物樣品10分鐘，已知在該情況下引起蛋白質的完全聚集，消除了刺激T細胞的能力。
圖8.實驗結果，其中將重組的gp96在指定的溫度孵育10分鐘并隨后分析二聚體的％和ATP酶活性。該圖顯示溫度誘導的聚集和ATP酶活性損失之間直接相關。
5.發(fā)明詳述在一個方面，在此描述的本發(fā)明提供用于檢測和測量熱休克蛋白和熱休克蛋白-抗原性分子的復合物或熱休克蛋白-肽復合物(″hsp-肽復合物″或″hsp復合物″)的生物活性的方法?？梢允褂帽景l(fā)明的方法來測定患有疾病的受試個體的預后和受試個體對治療的反應。還可以使用本方法篩選調節(jié)hsp-肽復合物生物活性的治療劑和篩選與具有增加或減少的生物活性的變體hsp形成的復合物。
本發(fā)明部分地以為了理解gp96-肽復合物的結構和其功能特性之間的關系而進行的研究為基礎。本發(fā)明者已經證明二聚的gp96具有ATP酶活性，能夠為特異的T淋巴細胞再呈遞抗原，并且能誘導MCP-1和氧化氮(NO)的產生。高分子量的聚集物可如在此所例證的，通過熱處理而產生，并且這種形式聚集的gp96在所有的4個生物測定中是非活性的。第6節(jié)提供的數據也證明抗原再呈遞的丟失、MCP-1的產生和NO的產生與二聚的gp96的丟失相伴隨。
本發(fā)明者研究的結果證明，ATP酶活性是gp96的固有功能；ATP酶活性與二聚體的gp96相關；二聚的gp96是為ATP酶活性所必需的；ATP酶活性不與gp96的形式，例如gp96的高分子量聚集物相關，認為該聚集物是非活性的是由于變性或其他的構象變化。根據這些結果，本發(fā)明者根據二聚的gp96與ATP酶活性以及二聚的gp96與抗原再呈遞和T細胞活化的相互關系確定ATP酶活性是生物活性穩(wěn)定性的相關的和可靠的量度。
隨著對hsps和hsp-肽復合物在治療和診斷多種疾病中的功效而進行的研究的增加，有必要迅速并便宜地確定hsp-肽復合物的生物活性。本發(fā)明提供根據ATP酶活性和/或hsp-肽復合寡聚物的存在來檢測生物活性的方法，該方法是定量的和敏感的。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供根據確定hsp或hsp-肽復合物的ATP酶活性而評估hsp或hsp-肽復合物的生物活性的方法。ATP酶活性的存在將表明hsp或hsp-肽復合物是生物活化的，而缺乏ATP酶活性將表明hsp或hsp-肽復合物是非生物活化的。
如在此所使用的，術語″生物活性″包括但不限于免疫活性，例如，肽抗原對抗原遞呈細胞的呈遞(抗原再呈遞)以及T細胞的活化。在一個實施方案中，術語生物活性限于免疫活性。hsp-肽復合物的免疫活性是直接與其在預防和治療應用中的用途相關的。許多其他的生物活性是本領域已知的，并且被包括例如但不限于，誘導產生生物反應調節(jié)物，例如但不限于細胞因子，例如人巨噬細胞化學誘引蛋白-1(MCP-1)，和氧化氮(NO)；結合受體，例如CD91(α-2-巨球蛋白受體，α2MR)和/或CD36；抗原性分子的結合和釋放；以及引起動物中腫瘤退化，延長患腫瘤動物的存活期和消除感染的能力。生物活性可在體內和/或體外發(fā)生或被觀察到。
術語″hsp″表示非共價結合抗原性分子的熱休克蛋白。術語″hsp-肽復合物″表示包括非共價結合熱休克蛋白的抗原性分子的復合物。優(yōu)選地，抗原性分子是抗原性的蛋白質或肽。熱休克蛋白，也可互換地被稱為應激蛋白，在本發(fā)明的實施中是有用的，它可選自符合下列標準的任何細胞蛋白質(1)它是當細胞遭受緊張刺激時其胞內濃度增加的蛋白質；(2)它能夠結合其他的蛋白質或肽；以及(3)它能夠在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH，例如1、2、3、4、5或6時，釋放結合的蛋白質或肽；或者它是顯示與任何具有上述所有特性的細胞蛋白質具有至少35％同源性的蛋白質。優(yōu)選地，該hsps和hsp-肽復合物是人hsps和hsp-肽復合物。
Hsps已經分類成為hsp家族，包括但不限于hsp90、hsp70和hsp60。在一個實施方案中，hsp和hsp-肽復合物包括單個hsp家族的成員，例如hsp70、hsp90和hsp60。已經證明具有ATP酶活性的種屬包括但不限于，hsp90、gp96(grp94)、hsp104、hsp70和hsp60。在某些實施方案中，gp96，也稱為grp94，是優(yōu)選的hsp，并且gp96-抗原性分子復合物是本發(fā)明優(yōu)選的hsp-肽復合物。
許多方法適用于檢測和/或測量hsp或hsp-肽復合物的ATP酶活性。一般地，這種方法通過確定ATP的降低、ADP的增加、AMP的增加和/或無機磷酸的增加而確定水解了的ATP的數量從而測量ATP酶活性。非限制性的實例包括生物發(fā)光、HPLC和涉及[γ-32P]-標記的ATP的免疫親和剝離技術以及薄層色譜法。這種方法的細節(jié)在第5.2節(jié)描述。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供根據測定寡聚hsp或hsp-肽復合物的存在和/或濃度而評估hsp或hsp-肽復合物的生物活性的方法。在優(yōu)選的實施方案中，該寡聚體結構是如在gp96的情況中觀察到的二聚體結構。因此，不是限于并且只是為了示例的目的，在下文使用術語二聚的或二聚化。樣品中二聚的hsp或hsp-肽復合物的存在將表明樣品中的hsp或hsp-肽復合物是生物活化的，而不存在二聚hsp或二聚hsp-肽復合物將表明hsp或hsp-肽復合物的生物活性是減少的。辨別來自高級聚集物、單體和降解產物的二聚體可以通過確定hsp或hsp-肽復合物的大小和/或形狀而進行。本發(fā)明提供通過大小檢測hsp二聚體的方法，包括但不限于常規(guī)的色譜技術，包括但不限于大小排阻色譜法和離子交換色譜法；常規(guī)的電泳技術，包括但不限于單向和雙向電泳以及毛細管電泳；質譜法；光散射分析；分析超離心(AUC)；以及使用過濾器，包括但不限于分子量截止過濾器。這些方法的細節(jié)在第5.3節(jié)有描述。
本發(fā)明也提供通過構象檢測hsp二聚體的方法，包括但不限于使用多克隆或單克隆抗體針對特定構象的蛋白質進行特異性靶向。一個實施方案包括使用抗體針對單體和寡聚構象的hsp進行靶向。在優(yōu)選的實施方案中，這種抗體不結合除了hsp和/或hsp-肽的二聚體外的hsp或hsp-肽復合物的形式。這些方法的細節(jié)在第5.10節(jié)有描述。
在具體的實施方案中，評估hsp或hsp-肽復合物的生物活性的方法包括檢測和/或測量ATP酶活性并且確定二聚hsp或二聚hsp-肽復合物的存在和/或濃度。
本發(fā)明的方法具有許多應用的領域。在一個實例中，本方法可被用于商業(yè)性生產hsp-肽復合物。本發(fā)明提供迅速而廉價的方式，根據其生物活性調控和監(jiān)測hsp肽復合物的質量，從而可以替代進行昂貴且費時的基于細胞的生物鑒定。這個方法的細節(jié)在第5.5節(jié)有描述。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷伴隨免疫成分的疾病或預后受試個體中癌癥或傳染性疾病的方法。這種方法的細節(jié)在第5.6節(jié)有描述。
本發(fā)明還可用于篩選調節(jié)hsp或hsp-肽復合物的生物活性的治療劑。這種方法的細節(jié)在第5.8節(jié)有描述。在另一實施方案中，可使用本發(fā)明的方法篩選hsps和其復合物的變體、片段和衍生物，它們具有未改變的hsp或hsp-肽復合物的類似的生物活性。優(yōu)選地，hsps和其復合物的變體、片段和衍生物的生物活性相對于未改變的hsp或hsp-肽復合物是更高的。
在另一實施方案中，如第5.7節(jié)所描述的，本發(fā)明提供通過使hsp或hsp-肽復合物與抑制或促進hsp或hsp-肽復合物的ATP酶活性，和/或破環(huán)/去穩(wěn)定或穩(wěn)定hsp或hsp-肽復合物的二聚結構的化合物接觸而調節(jié)hsp或hsp肽復合物的生物活性的方法。
另一方面，本發(fā)明涉及利用寡聚劑促進熱休克蛋白或包含熱休克蛋白的免疫活性復合物的寡聚化。在優(yōu)選的實施方案中，該寡聚劑將促進生成gp96的二聚體或其多重類型。特別地，本發(fā)明提供包含免疫活性部分，例如用寡聚劑寡聚化的熱休克蛋白的復合物制劑。也提供了使用該制劑用于預防和治療癌癥和傳染性疾病，并且在受試個體中引發(fā)免疫應答的方法。本發(fā)明在多種情況下是有用的，例如當需要增強免疫治療部分的生物效價時；通過特異的和/或備選的受體或非受體介導的事件促進疫苗遞送到抗原遞呈細胞中；改進免疫治療部分的遞送；改善免疫治療部分的輔助能力；或捕獲次級免疫治療/免疫活化部分并且經特異受體介導的攝取將其遞送到抗原遞呈細胞中。
本發(fā)明提供包含免疫活性部分，例如用寡聚劑寡聚化的熱休克蛋白的復合物的組合物。該復合物可進一步包含一種或多種抗原性分子，優(yōu)選顯示癌癥或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的肽。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚的熱休克蛋白和hsp-抗原性分子復合物具有ATP酶活性。在特定的實施方案中，本發(fā)明的寡聚的熱休克蛋白是沒有變性的，例如加熱變性的hsps。如在此所使用的，″寡聚物″包括″二聚體″，″三聚體″和更高數量的單元，包括聚合物。在特定的實施方案中，gp96的″寡聚物″是二聚體或多重的二聚物。
如在此所使用的，關于復合物，術語″純化的″是指復合物的制劑至少是總蛋白重量的60％的復合物。在一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少70％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少80％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少90％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少95％，而在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少99％。如在此所使用的，關于熱休克蛋白，術語″純化的″是指hsp的制劑至少是總蛋白重量的60％的hsp。在一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少70％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少80％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少90％。在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少95％而在另一個實施方案中，它是指總蛋白重量的至少99％。在一些實施方案中，純度是指通過SDS-PAGE凝膠上的表觀而測得的均質性。在優(yōu)選的實施方案中，hsp非共價結合例如肽的抗原性分子。
本發(fā)明也提供包括用于有效治療或預防傳染性疾病或癌癥的適量復合物和藥物學上可接受的載體的藥物組合物，其中所述復合物包含與寡聚劑寡聚的熱休克蛋白。該復合物可進一步包括一種或多種顯示癌癥類型的抗原或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子，優(yōu)選為肽。
如在此所使用的，除非另有說明，術語″免疫活化的hsp″是指hsp調節(jié)、優(yōu)選刺激或增強免疫應答，優(yōu)選靶向與hsp結合的抗原性分子的免疫應答的能力。
許多寡聚劑是本領域已知的。術語″寡聚劑″是指促進其他分子寡聚化，例如熱休克蛋白寡聚化的化合物。寡聚劑可共價或非共價地結合例如熱休克蛋白的分子。在一個實施方案中，寡聚劑可共價結合兩個或多個熱休克蛋白并從而引起熱休克蛋白的寡聚化。在另一個實施方案中，寡聚劑可非共價地結合兩個或多個熱休克蛋白并從而引起熱休克蛋白的寡聚化。在另一個實施方案中，寡聚劑可共價結合一個熱休克蛋白分子并且通過非共價結合另一個熱休克蛋白分子上的相似或不同的寡聚劑而促進寡聚化。在某些實施方案中，2個結合的熱休克蛋白是相同的。在優(yōu)選的實施方案中，寡聚的熱休克蛋白非共價結合抗原性分子例如肽。
如在此所使用的，除非另有指明，當單獨使用時，術語″分子″，″復合物″，″熱休克蛋白″，″應激蛋白″，″抗原性分子″和″寡聚劑″也包括該分子的復數，并且可以指相關分子的群體。
在本發(fā)明的一些實施方案中，熱休克蛋白顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子的抗原性。如在此所使用的，術語″抗原性″和″免疫原性″是指分子分別結合抗體或主要的組織相容性復合物(″MHC″)分子和產生免疫應答的能力。如在此所使用的，″癌癥類型″是指例如乳房、肺、卵巢的起源組織的細胞類型。在一個實施方案中，抗原性分子顯示傳染性因子的抗原的抗原性。在另一個實施方案中，抗原性分子顯示相對于在所述細胞類型的非癌性細胞中的其表達，在癌細胞中過表達的抗原的抗原性。例如該抗原性分子可以是腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原，在一個實施方案中，與腫瘤相關的抗原是相對于正常細胞，在腫瘤細胞中以較高水平表達的抗原；腫瘤特異抗原是只在腫瘤細胞而不在正常細胞中表達的抗原。
本發(fā)明進一步提供純化的復合物群體，其中每個復合物包括與寡聚劑寡聚的熱休克蛋白。該復合物可以進一步包括一種或多種顯示癌癥類型的抗原或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子，例如為肽。在一個實施方案中，熱休克蛋白包括但不限于，hsp70、hsp90、gp96、鈣網蛋白、hspl10、grpl70或其組合。
本發(fā)明提供制備對癌癥或傳染性疾病因子是免疫原性的復合物的方法，該方法使熱休克蛋白或hsp-抗原性分子的復合物與足夠促進該熱休克蛋白寡聚化的適量寡聚劑接觸。在一個實施方案中，寡聚的復合物包括共價結合寡聚劑的熱休克蛋白。在另一個實施方案中，抗原性分子顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子的抗原性。在另一個個實施方案中，寡聚的復合物包括免疫活化的的熱休克蛋白。本發(fā)明進一步提供通過在此所描述的方法制備的組合物。在特定的實施方案中，寡聚劑不是凝集素。
在一個實施方案中，抗原性分子是在體內與hsps結合的肽，并且該復合物可以從細胞分離。備選地，該復合物可從hsp和抗原性分子的純化制品體外生產。在另一個實施方案中，癌癥或傳染性因子的抗原可以通過純化自天然源、通過化學合成或重組以及通過例如在此所描述的體外方法獲得。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供制備寡聚復合物的方法，其中該復合物包括免疫活化的hsp和抗原性分子，通過使該復合物與足夠促進該復合物寡聚化的適量寡聚劑接觸而寡聚化。在另一個實施方案中，寡聚的復合物通過使hsp與足夠促進該hsp寡聚化的適量寡聚劑接觸而首先寡聚化該免疫活化的hsp；并且將該寡聚的hsp接觸令人感興趣的抗原性分子而制備。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備寡聚復合物的方法，包括從細胞分離免疫活化的hsp-抗原性分子的復合物；從hsp-抗原性分子的復合物中除去內源的抗原性分子，例如肽；將hsp與外源的令人感興趣的抗原性分子，例如不同的肽接觸，其中該hsp現在與外源的抗原性分子形成復合物；以及將新形成的復合物與足夠促進該新形成的復合物寡聚化的適量寡聚劑接觸。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備寡聚復合物的方法，包括從細胞分離免疫活化的hsp-抗原性分子的復合物；從hsp-抗原性分子的復合物中除去內源的抗原性分子，例如肽；將hsp與足夠促進該hsp寡聚化的適量寡聚劑接觸；以及將寡聚的hsp接觸外源的令人感興趣的抗原性分子，例如不同的肽，其中該寡聚的hsp現在與外源的抗原性分子形成復合物。
本發(fā)明進一步提供增強包括熱休克蛋白的復合物免疫原性的方法，包括使該復合物共價或非共價結合寡聚劑。在一個實施方案中，該復合物包括與抗原性分子相關的熱休克蛋白。
本發(fā)明的組合物和方法可被用于多種狀況。例如，可以使用本發(fā)明的組合物在需要治療或預防癌癥或傳染性疾病的個體或對象中引發(fā)免疫應答。需要治療或預防癌癥或傳染性疾病的個體或對象是動物，優(yōu)選為哺乳動物、非人類的靈長類，并且最優(yōu)選為人類。如在此所使用的術語″動物″包括但不限于，陪伴動物(例如，貓或狗)、動物園動物、野生動物，包括鹿、狐貍和浣熊、耕畜、家畜和家禽，包括馬、牛、羊、豬、火雞、鴨、雞和嚙齒類。
根據本發(fā)明，對受試個體施用寡聚的免疫活化的復合物導致在受試個體中調節(jié)對特異于令人感興趣的抗原來源的抗原性的肽免疫應答，例如，引發(fā)、刺激、增強和/或持續(xù)免疫應答。寡聚的復合物可作為單劑或復劑給藥。免疫原性的劑量可根據不同的受試個體和不同的治療或預防應用而不同。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過亞免疫原性數量的疫苗組合物誘導免疫應答的方法，其中寡聚化促進由一定量的疫苗組合物誘導免疫應答，而當沒有寡聚化時該疫苗組合物不足以誘導免疫應答。
本發(fā)明還可以通過將免疫治療部分接觸寡聚劑促進該部分的寡聚化而增加免疫治療部分的生物活性。如在此所使用的，術語″免疫治療部分″是指作為免疫治療復合物的部分的分子。如在此所使用的，術語″寡聚化″是指形成聚合體或聚合體中間物的過程。在一個實施方案中，免疫治療部分形成二聚體或多重的二聚體。在另一個實施方案中，免疫治療部分形成更高級的物質，即具有多于2個亞基的寡聚物。
本發(fā)明也可用于通過受體介導的事件增加疫苗到抗原遞呈細胞(APCs)中的攝取。本發(fā)明還可用于通過非受體介導的事件來增加疫苗攝取到抗原遞呈細胞中。例如，熱休克蛋白締合的抗原性肽可經抗原遞呈細胞通過非受體介導的事件而攝取，包括但不限于胞飲作用、噬菌作用以及hsp-肽復合物與細胞表面成分非特異的相互作用并隨后插入和/或轉移越過細胞膜。熱休克蛋白的寡聚化可增加這種攝取。
本發(fā)明可以進一步用于改善免疫治療部分的輔助能力。如在此所使用的，術語″輔助能力″是指非抗原性物質與抗原聯合增強免疫應答的能力，例如通過誘導炎癥性反應導致免疫活化細胞，例如抗體形成細胞或T淋巴細胞的局部匯流。具有輔助能力的免疫治療部分可在疫苗制備中治療性地使用，因為它們增加產生針對小量抗原的抗體或T淋巴細胞并且延長抗體產生或T細胞活化的時間。免疫治療部分的寡聚化可以增加其輔助能力。如在此所使用的，免疫治療部分是指應激蛋白，例如熱休克蛋白。在一個實施方案中，熱休克蛋白是hsp70、hsp90、gp96、鈣網蛋白、hsp110、grp170或其組合。
本發(fā)明可以進一步用于增強例如熱休克蛋白的免疫治療部分的抗原性或免疫原性，例如通過將其接觸足夠量的寡聚劑以促進其寡聚化。抗原性或免疫原性的增強可用如第5.15節(jié)中所論述的幾種方式證明。在優(yōu)選的實施方案中，用于證明增強抗原性或免疫原性的分析包括但不限于，抗原再呈遞分析，例如如第8節(jié)所描述的。
如在此所使用的，″調節(jié)″是指免疫治療部分的特性例如抗原性或免疫原性的改變。在一個實施方案中，它指抗原性免疫原性的增加、增強或強化。在另一個實施方案中，它是指抗原性或免疫原性的降低或抑制。如在此所使用的″調節(jié)劑″，乃指″調節(jié)″另一個化合物的特性。
本發(fā)明還可用于改善免疫治療部分的遞送。
本發(fā)明進一步提供捕獲次級免疫治療部分并在受試個體中經受體介導的攝取遞送所述部分至抗原遞呈細胞的方法，包括對受試個體在存在寡聚劑時施用包括第一蛋白和第二蛋白的復合物的組合物。該復合物可以進一步包含一種或多種抗原性分子，優(yōu)選顯示癌癥或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的肽。在一個實施方案中，第二蛋白質不同于第一蛋白質。在另一個實施方案中，與第一蛋白質相關的抗原性分子可被抗原遞呈細胞吸收，而與第二蛋白質相關的抗原性分子不能被抗原遞呈細胞正常吸收。第一蛋白質與第二蛋白質的寡聚化能夠使與第二蛋白質相關的抗原性分子被抗原遞呈細胞吸收。
在一個實施方案中，第一和第二蛋白質都是熱休克蛋白。在另一個實施方案中，第一蛋白質是熱休克蛋白，包括但不限于hsp70、hsp90、gp96、鈣網蛋白、hspl10、grpl70或其組合，但第二蛋白質不是熱休克蛋白。在另一個實施方案中，第一蛋白質不是熱休克蛋白，但第二蛋白質是熱休克蛋白。在一個實施方案中，第一蛋白質進一步與顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子相關。在另一個實施方案中，第二蛋白質進一步與顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子相關。
本發(fā)明進一步提供治療或預防癌癥或傳染性疾病的方法，包括對受試個體施用本發(fā)明的組合物。在一個實施方案中，該組合物包括包含熱休克蛋白、抗原性分子和寡聚劑的復合物，其中該抗原性分子顯示所述癌癥抗原或所述傳染性疾病因子的抗原的抗原性。
在另一個實施方案中，該組合物是包括上述復合物和藥物學上可接受的載體的藥物組合物。在另一個實施方案中，包括上述復合物和藥物學上可接受的載體的藥物組合物存在于例如小瓶或注射器的容器中。
在另一實施方案中，治療或預防癌癥類型或傳染性疾病的方法，包括對受試個體施用(a)一種或多種熱休克蛋白、寡聚劑和第一抗原性分子的復合物，其中第一抗原性分子顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子抗原的抗原性，以及(b)在該復合物的給藥前、給藥的同時或給藥后，對受試個體施用包括用致敏化量的熱休克蛋白與寡聚劑和第二抗原性分子的第二復合物體外致敏的抗原遞呈細胞組合物，其中所述的第二抗原性分子顯示所述癌癥或所述傳染性疾病因子的第二抗原的抗原性。APC可選自本領域已知的抗原遞呈細胞，包括但不限于巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞及其組合，并優(yōu)選為巨噬細胞。在一個實施方案中，第一復合物與用于致敏APCs的第二復合物相同。在另一個實施方案中，第一復合物不同于用于致敏APCs的第二復合物。在APCs和本發(fā)明的組合物同時施用的特定實施方案中，APCs和本發(fā)明的組合物可存在于相同的組合物(包括APCs和復合物)或不同的組合物中。根據本發(fā)明的過繼性免疫療法(利用致敏的APCs)容許通過與寡聚的分子復合物孵育而活化免疫的抗原遞呈細胞。對腫瘤或傳染物的體外反應性可使用在活體內的細胞前測量。這種體外加強繼之以克隆選擇和/或擴展和患者給藥組成了有效的治療和/或預防策略。
在一個實施方案中，復合物的免疫活化部分，例如與顯示癌癥抗原或傳染性疾病因子的抗原性的肽結合的熱休克蛋白是受試個體自體固有的；即它分離自受試個體本身的細胞(例如，當需要治療癌癥時從患者的腫瘤活組織檢查中制備)。備選地，該復合物可以是與被施用本發(fā)明分子復合物的組合物的受試個體異源的。在一個實施方案中，該復合物是體外制備的，例如來自重組的表達熱休克蛋白的培養(yǎng)細胞。
用于與熱休克蛋白結合以產生特定復合物的外源性抗原及其片段和衍生物可選自本領域已知的物質，并且通過本領域已知的免疫測定較容易地鑒定，是能夠結合抗體或MHC分子或產生免疫應答的物質。熱休克蛋白和抗原性分子的特異復合物可分離自患者的癌癥或癌癥前期的組織，或來自癌細胞系，或可體外產生(在外源性抗原被用作抗原性分子的實施方案中是必需的)。
本發(fā)明進一步提供包括藥物制劑或包含本發(fā)明復合物的組合物的試劑盒。本發(fā)明也提供包括包含免疫活化的熱休克蛋白或其復合物和寡聚劑的容器的試劑盒。任選地，根據本發(fā)明的方法制備寡聚復合物的指導說明可以包括在試劑盒內。
在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及用于預防和治療初級和轉移性腫瘤疾病的方法和組合物。
本發(fā)明的治療方式和藥物組合物可與附加的免疫應答熱休克蛋白、治療劑或生物反應調節(jié)物使用，包括但不限于細胞因子、化療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、激素、抗體、多核苷酸、放射和光動力治療劑、抗生素、抗病毒的、抗原生動物的化合物和抗真菌的化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與用于治療癌癥的放射療法或一種或多種化療劑一起施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物與用于治療傳染性疾病的抗菌的、抗病毒的或抗真菌的試劑一起施用。
除癌癥治療外，本發(fā)明的組合物可用于預防多種癌癥，例如用于作為家族史的結果而易患病的受試個體或由于環(huán)境因素而增加患癌癥風險的受試個體。
本發(fā)明也提供具體的治療方式、藥物組合物和試劑盒。
5.1熱休克蛋白制劑用于實現本發(fā)明的熱休克蛋白，也可互換地稱為應激蛋白，可選自符合下列標準的任何細胞蛋白質(1)它是當細胞遭受緊張刺激時其胞內濃度增加的蛋白質；(2)它能夠結合其他的蛋白質或肽；以及(3)它能夠在存在腺苷三磷酸(ATP)或例如1、2、3、4、5或6的低pH時，釋放結合的蛋白質或肽；或者它是顯示與任何具有上述所有特性的細胞蛋白質具有至少35％同源性的蛋白質。
其中hsp-肽復合物用于非疫苗治療方式聯合給藥，優(yōu)選地，該肽是抗原性的或與病癥相關的。在特別優(yōu)選的實施方案中，預期對患有特殊類型癌癥的受試個體給藥的治療方式的治療性結果通過施用hsp-肽復合物而改善，其中該肽顯示該類型癌癥抗原的抗原性。
在本發(fā)明中，hsp的制備可包括但不限于未結合的hsp70、hsp90、gp96、鈣網蛋白、hsp 110或grp 170或其與肽結合的非共價的或共價復合物。
在一個實施方案中，hsp70、hsp90、gp96、鈣網蛋白、hsp 10或grp170與肽的共價或非共價復合物可在手術后從癌癥患者獲得的腫瘤細胞制備和純化，用作本發(fā)明組合物中的特異復合物。
根據在此所描述的方法，內源性結合hsps或MHC抗原的免疫原性或抗原性的肽可用作特異性的抗原性分子。例如，可制備這種肽來刺激不同腫瘤抗原(例如，酪氨酸酶、gp100、黑素-A、gp75、粘蛋白等)和病毒蛋白質，包括但不限于，免疫缺陷病毒類型I(HIV-I)、人類免疫缺陷性病毒類型II(HIV-II)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、單純性皰疹類型I(HSV-I)、單純性皰疹類型II(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、棘病毒、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒和脊髓灰質炎病毒的蛋白質的細胞毒素T細胞應答。在該實施方案中，其中抗原性分子是在體內結合Hsps的肽，該復合物可分離自細胞，或備選地，在體外產生自每種hsps和抗原性分子的純化制劑。在一些實施方案中，該抗原性分子是外源性抗原及其片段和衍生物。
在另一個實施方案中，癌癥(例如腫瘤)或傳染性因子(例如病毒抗原、細菌抗原等)的抗原可以通過從天然源純化、通過化學合成或重組方式，以及通過例如如下所述的結合hsps的體外方法獲得。
在一個實施方案中，其中所使用的特異的hsp-抗原性分子的復合物是在活體內細胞中產生的復合物，可使用例如如下所述的示范性的純化方法。備選地，在希望通過體外結合Hsps而使用抗原性分子的實施方案中，為了這種用途Hsps可在存在ATP或例如1、2、3、4、5或6的低pH時，從內源的hsp-肽復合物純化。Hsps還可以化學合成或重組產生。在此所描述的方法可用來從任何真核細胞，例如組織、分離的細胞，或感染了預選的胞內病原體的無限增殖的真核細胞系、腫瘤細胞或腫瘤細胞系分離特異的Hsp-肽復合物或單獨的Hsps。
5.1.1 Hsp-肽復合物的來源回收hsp-肽復合物的來源可根據所得到的hsp-肽復合物的預期用途來選擇。既然hsp-肽復合物在所有的細胞中都有發(fā)現，則任何組織或細胞樣品都可用作來源。Hsp-肽復合物也可經壞死性的細胞死亡從細胞釋放到細胞環(huán)境中；因此體液、分泌物、培養(yǎng)物上清液、發(fā)酵培養(yǎng)基等都可以是回收hsp-肽復合物的來源。
Hsp-肽復合物可從癌性的或受感染的細胞中回收。受感染的和癌性的細胞可適當地通過本領域已知的方法從非癌性的或未感染的細胞(例如，正常細胞)體外制備。(參見例如美國專利號6,017,540，其在此全部引入作為參考。)對于與傳染性疾病的治療和預防相關的應用，抗原性的hsp-肽復合物可從任何受感染的細胞獲得，包括完整的組織、分離的細胞，和用胞內病原體感染或轉化的無限增殖的細胞系。該抗原性的hsp-肽復合物可回收自受傳染性因子，以及特別是受胞內病原體感染的細胞。已經證明包含分離自受胞內病原體感染的細胞的抗原性的hsp肽復合物，并隨后施用于哺乳動物的疫苗可有效地刺激針對受相同病原體感染的細胞的細胞免疫應答。具體地，該免疫應答通過靶向并破壞包含胞內病原體的細胞的細胞毒素T細胞級聯而介導。盡管不限于胞內病原體，但是在此所使用的胞內病原體包括任何能存活的生物體，包括但不限于，能夠在哺乳動物細胞內存在并導致哺乳動物中疾病的病毒、細菌、真菌、原生動物和胞內寄生物。
Hsp-肽復合物可回收自受病毒感染的細胞，該病毒包括但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、HSV-1、HSV-II、牛瘟鼻病毒、艾可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、棘病毒、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩其病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、HIV-I和HIV-II。此外，抗原性的hsp-肽復合物還可收集自用病毒基因轉染的細胞。
Hsp-肽復合物可回收自細菌感染的細胞，包括但不限于，用導致肺結核、淋病、傷寒、腦膜炎、骨髓炎、腦膜炎球菌敗血癥、子宮內膜炎、結膜炎、腹膜炎、腎盂腎炎、咽炎、敗血癥septic arghritis、蜂窩組織炎、會厭炎、輸卵管炎、中耳炎、志賀菌痢疾、腸胃炎等細菌感染的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，該hsps或hsp-肽復合物也可回收自用胞內細菌感染的細胞，該細菌包括但不限于，分枝桿菌、立克次氏體、支原體、奈瑟氏菌和軍團菌。
Hsp-肽復合物還可回收自用包括但不限于利什曼蟲、Kokzidioa和錐蟲屬的胞內原生動物感染的細胞。此外，hsps或hsp-肽復合物可回收自用包括但不限于衣原體和立克次氏體的胞內寄生物感染的細胞。Hsp-肽復合物也可以回收自用細菌感染的細胞系。
可使用分離自癌癥，包括分離自轉移到多重位點的癌癥的組織或細胞作為本方法中hsps或hsp-肽復合物的來源。例如，也可使用在血液、淋巴或其他體液中循環(huán)的白血病細胞，還可使用實體瘤組織(例如，來自活體檢查的初生組織)。
Hsp-肽復合物可回收自腫瘤細胞，包括但不限于，例如在原發(fā)點為間充質的腫瘤(肉瘤)即，纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；軟骨肉瘤；骨肉瘤；血管肉瘤；內皮肉瘤；淋巴管肉瘤；滑膜肉瘤；間皮肉瘤；尤文氏肉瘤；粒細胞性白血??；單核細胞性白血病；惡性淋巴瘤；淋巴細胞白血癥；漿細胞瘤；平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤。此外，預期該方法可用于從在原發(fā)點為上皮細胞的腫瘤(癌)的腫瘤細胞回收hsps或hsp-肽復合物，即鱗狀上皮細胞或表皮癌；基底細胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳頭狀癌；乳頭狀腺癌；囊腺癌；髓樣癌；未分化癌(單一的癌)；支氣管癌；支氣管肺癌；黑素癌；腎細胞癌；肝細胞癌；膽管癌；乳頭狀癌；轉移細胞癌；鱗狀上皮細胞癌；絨毛膜癌；精原細胞瘤；胚胎癌惡性畸胎瘤和畸胎癌。Hsps或hsp-肽復合物還可回收自白血病細胞，例如，急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(原粒細胞的、早幼粒細胞的、骨髓單核細胞的、單核細胞的和紅白血病)；慢性白血病(慢性髓細胞的(有粒白細胞的)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；和真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom′s巨球蛋白血癥和重鏈病。hsp-肽復合物可以通過從化學致癌物或輻射誘導的腫瘤的腫瘤細胞回收?；瘜W致癌物包括與香煙煙霧相關的致癌物，例如烴類和致癌的氣體、食物、化妝品或其他的污染物。hsp-肽復合物可回收自腫瘤細胞系。
對于涉及疾病的診斷、預后或計量對治療的應答，特別是對免疫治療或疫苗應答的相關應用，hsp-肽復合物可回收自體液、血液、淋巴等。
5.1.2 Hsp70-肽復合物的制備和純化hsp70-肽復合物的純化先前已有描述，參見例如，Udono等人，1993，J.Exp.Med.1781391-1396。可使用的方法提供如下，例如但不限于最初，腫瘤細胞懸浮在由30mM碳酸氫鈉pH 7.5，和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)組成的3體積的1×裂解緩沖液中。然后，超聲處理沉淀顆粒，置于冰上，直到通過顯微鏡檢確定為＞99％的細胞裂解。作為超聲處理的替代，細胞可以通過機械剪切裂解并且在該處理中一般將細胞重懸于30mM碳酸氫鈉pH 7.5，1mM PMSF中，在冰上孵育20分鐘并隨后在Dounce勻漿器中均質化直到＞95％的細胞裂解。
然后在1,000g離心該裂解物10分鐘以除去未破損的細胞、細胞核和其他細胞碎屑。所得到的上清液在100,000g再離心90分鐘，收獲該上清液并隨后與用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡的Con A Sepharose混合。當通過機械剪切裂解該細胞時，該上清液在與Con A Sepharose混合之前用等體積的2×裂解緩沖液稀釋。然后容許該上清液與Con A Sepharose在4℃結合2-3小時。收獲未結合的物質并相對于10mM Tris-乙酸pH 7.5，0.1mM EDTA，10mMNaCl，1mM PMSF透析36小時(3次，每次100體積)。然后將該滲析液在17,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心20分鐘。然后收獲所得到的上清液并且施加到用20mM Tris-乙酸pH 7.5，20mM NaCl，0.1mMEDTA和15mM 2-巰基乙醇平衡的Mono Q FPLC柱上。然后將該柱用20mM-500mM的NaCl梯度洗脫并隨后通過十二烷磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分級洗脫級分，并且使用適當的抗hsp70抗體(例如來自StressGen的克隆N27F3-4)通過免疫印跡表征。
匯集對抗hsp70抗體有強免疫活性的級分并且用硫酸銨沉淀hsp70-肽復合物；特異地用50％-70％的硫酸銨切開。然后所得到的沉淀物通過在17,000rpm(SS34Sorvall轉子)離心并且用70％的硫酸銨洗滌收獲。然后溶解洗滌過的沉淀并且通過在SephadexR G25柱(Pharmacia)上凝膠過濾除去任何殘余的硫酸銨。如有必要，如此獲得的hsp70制品可如上所述通過Mono Q FPLC柱重提純。
可使用本方法將該hsp70-肽復合物純化至明顯的均一性。一般可從1g細胞/組織純化1mg的hsp70-肽復合物。
純化hsp70-肽復合物的改進方法包括將細胞蛋白質接觸ADP或附著于固體基質的ATP的非水解類似物，以使得裂解物中的hsp70可結合ADP或非水解的ATP類似物，并且洗脫結合的hsp70。優(yōu)選的方法使用附著于固體基質的ADP的柱色譜法(例如，ADP-瓊脂糖)。參見，例如，Peng，1997，免疫方法雜志J.Immuno.Meth.20413-21。所得到的hsp70制品是較高純度的。hsp70的產率也顯著增加大約超過10倍。備選地，使用ATP的非水解類似物代替ADP的色譜法可被用于純化hsp70-肽復合物。例如但不限于，hsp70-肽復合物的純化可以通過ADP-瓊脂糖色譜法如下進行Meth A肉瘤細胞(5億個細胞)在低滲緩沖液中均質化并且該裂解物于4℃在100,000g離心90分鐘。將上清液施加到ADP-瓊脂糖柱上。該柱在緩沖液中洗滌并且用5柱體積的3mM ADP洗脫。將該hsp70-肽復合物在洗脫的總的15個級分中通過10個級分洗脫在級分2中。該洗脫級分經SDS-PAGE分析?？墒褂眠@些方法將該hsp70-肽復合物純化至明顯的均一性。
5.1.3 Hsp90-肽復合物的制備和純化可使用的方法例如但不限于如下所提供的最初，將腫瘤細胞懸浮在由30mM碳酸氫鈉pH 7.5，和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)組成的3體積的1×裂解緩沖液中。然后，超聲處理沉淀顆粒，置于冰上，直到通過顯微鏡檢確定＞99％的細胞被裂解。作為超聲處理的替代，可以通過機械剪切裂解細胞并且在該處理中細胞一般被重懸于30mM碳酸氫鈉pH 7.5，1mM PMSF中，在冰上孵育20分鐘并隨后在Dounce勻漿器中均質化直到＞95％的細胞被裂解。
然后在1,000g離心該裂解物10分鐘以除去未破損的細胞、細胞核和其他細胞碎屑。將所得到的上清液在100,000g再離心90分鐘，收獲該上清液并隨后與用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的ConA Sepharose混合。當通過機械剪切裂解細胞，上清液在與Con ASepharose混合之前用等體積的2×裂解緩沖液稀釋。然后容許該上清液與Con A Sepharose在4℃結合2-3小時。收獲未結合的物質并相對于pH 7.4，0.1mM的EDTA，250mM的NaCl，1mM PMSF透析36小時(3次，每次100體積)。然后滲析液于17,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心20分鐘。然后收獲所得到的上清液并施加到用透析緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱上。然后用200mM-600mM NaCl的鹽梯度洗脫該蛋白質。
所洗脫的級分通過SDS-PAGE分級并且將包含hsp90-肽復合物的級分通過使用抗hsp90抗體，例如3G3(Affinity Bioreagents)的免疫印跡鑒定?？墒褂眠@些方法將Hsp90-肽復合物純化至明顯的均一性。一般可從1g細胞/組織純化150-200μg的hsp70-肽復合物。
5.1.4 Gp96-肽復合物的制備和純化可使用的方法提供如下，例如但不限于將腫瘤的沉淀顆粒重懸在3體積的由30mM碳酸氫鈉緩沖液(pH7.5)和1mM PMSF組成的緩沖液中，并且容許細胞在冰上膨脹20分鐘。然后將該細胞沉淀顆粒在Dounce勻漿器(勻漿器的適當間隙可根據各種細胞類型變化)中在冰上均質化直到＞95％的細胞被裂解。
在1,000g離心該裂解物10分鐘以除去未破損的細胞、細胞核和其他細胞碎片。然后將來自該離心步驟的上清液于100,000g再次離心90分鐘。gp96-肽復合物可純化自100,000個沉淀顆?；蛏锨逡?。
當從上清液純化時，將上清液用等體積的2×裂解緩沖液稀釋并且將上清液與用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的Con ASepharose于4℃混合2-3小時。然后，將勻漿填柱并且用1×裂解緩沖液洗滌直到OD280降至基線。然后，將該柱用1/3柱床體積的溶于含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗滌，用石蠟膜片密封該柱，并且于37℃孵育15分鐘。然后將該柱冷卻到室溫并且除去柱底部的石蠟膜。將5柱體積的α-MM緩沖液施加到柱上并且通過SDS-PAGE分析洗脫液。一般所得到的物質大約為60-95％純，然而這取決于細胞類型和所使用的組織相對于裂解緩沖液的比率。然后將樣品施加到用含有5mM磷酸鈉，pH 7的緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)上。再用0-1M的NaCl梯度從柱上洗脫蛋白質并且gp96級分在400mM和550mM NaCl之間洗脫。
然而，可以通過2個單獨或結合使用的附加步驟來改進該方法，以不斷地產生明顯均質化的gp96-肽復合物。一個任選的步驟包括在ConA純化步驟前的硫酸銨沉淀而另一個任選的步驟包括在Con A純化步驟后代替Mono Q FPLC步驟的DEAE-Sepharose純化。
在第一個任選的步驟中，例如如下描述，將由100,000g離心步驟產生的硫酸銨上清液通過加入硫酸銨而產生50％硫酸銨的終濃度。緩慢加入硫酸銨，同時在置于一托盤冰水中的燒杯中溫和攪拌溶液。該溶液于4℃攪拌大約1/2-12小時，并將所得到的溶液于6,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心。除去由該步驟產生的上清液，通過加入硫酸銨溶液而產生70％的硫酸銨飽和度，并于6,000rpm離心(SorvallSS34轉子)。收獲由此步驟所得到的沉淀顆粒并且懸浮在含有70％硫酸銨的PBS中以漂洗該沉淀顆粒。將該混合物于6,000rpm(SorvallSS34轉子)離心并將沉淀顆粒溶于含有2mM Ca2+和Mg2+的PBS中。未溶解的物質通過于15,000rpm(Sorvall SS34轉子)的短暫離心而除去。然后，該溶液與Con A Sepharose混合并且遵循如前所述的方法。
在第二個任選的步驟中，例如如下描述，收集包含洗脫自Con A柱的級分的gp96并通過透析將緩沖液交換為5mM磷酸鈉緩沖液，pH7,300mm NaCl，或優(yōu)選地通過在Sephadex G25柱上交換緩沖液。緩沖液交換后，將該溶液與預先用5mM磷酸鈉緩沖液pH 7，300mM的NaCl平衡的DEAE-Sepharose混合。將該蛋白質溶液和珠溫和地混合1小時并灌入柱。然后，將該柱用5mM磷酸鈉緩沖液，pH7，300mMNaCl洗滌，直到280nm處的吸光率降低到基線。再從柱上用5體積的5mM磷酸鈉緩沖液，pH 7，700mM NaCl洗脫結合的蛋白質。匯集含有蛋白質的級分并用5mM磷酸鈉緩沖液，pH 7稀釋以降低鹽濃度到175mM。然后將所得到的物質施加到用5mM磷酸鈉緩沖液，pH 7平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)上，并將結合Mono Q FPLC柱(Pharmacia)的蛋白質如前所述洗脫出來。
然而可以認識到，本領域的技術人員可以通過常規(guī)實驗評估將第二個任選步驟合并入純化方法的效益。此外，也可認識到增加每個任選步驟的效益可能取決于起始材料的來源。
當gp96級分分離自100,000g沉淀顆粒，將該沉淀顆粒懸浮于5體積的含有1％脫氧膽酸鈉或1％氧酰果(oxtyl)吡喃葡糖苷的PBS(但無Mg2+和Ca2+)中并且在冰上孵育1小時。將該懸浮液于20,000g離心30分鐘并將所得到的上清液相對于PBS的幾種改變(也無Mg2+和Ca2+)透析以除去去污劑。將該透析液于100,000g離心90分鐘，收獲上清液，并且分別將鈣和鎂加入上清液至2mM的終濃度。然后參見上面，通過從100,000g上清液分離gp96-肽復合物的未改進的或改進的方法來純化樣品。
可以使用該方法將gp96-肽復合物純化到明顯的均一性。可從1g細胞/組織分離10-20μg的gp96。
從gp96-肽復合物分離hsp可在存在ATP或低pH時進行?？墒褂眠@兩個方法從gp96-肽復合物洗脫肽。第一個途徑包括在存在ATP時孵育gp96-肽復合物制品。另一個途徑包括在低pH緩沖液中孵育gp96-肽復合物制品。可以應用這些方法和本領域已知的任何其它方法從hsp-肽復合物分離hsp和肽。
5.1.5 Hsp110-肽復合物的制備和純化由Wang等人，2001，J.Immunol.166(1)490-7描述的可使用的方法提供如下，例如但不限于細胞或組織的沉淀顆粒(40-60ml)，例如腫瘤細胞組織的沉淀顆粒，在5體積的低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2，和蛋白酶抑制劑)中經Dounce勻漿作用而均質化。該裂解物于4,500×g離心以及隨后在100,000×g離心2小時。如果該細胞或組織源于肝，則首先將所得到的上清液施加到藍色的Sepharose柱(Pharmacia)上以除去白蛋白。另外，將所得到的上清液施加到預先用結合緩沖液(20mMTris -HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2；和15mM 2-ME)平衡的Con A-Sepharose柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。將結合的蛋白質用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的結合緩沖液洗脫。
將未與Con A-Sepharose結合的物質首先相對于20mMTris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl和15mM 2-ME的溶液進行透析，并隨后施加到DEAE-Sepharose柱上并經100-500mM NaCl的鹽梯度洗脫。收集含有hsp110的級分，進行透析，并加載到用20mM Tris-HCl，pH7.5；200mM NaCl；和15mM2-ME平衡的Mono Q(Pharmacia)10/10柱上。將結合的蛋白質用200-500mM的NaCl梯度洗脫。級分如王等人，1999，J.Immunol.1623378所描述的經SDS-PAGE分析，然后用hsp 110的抗體進行免疫印跡。含有hsp110的所收集的級分經Centriplus(Amicon，Beverly，MA)濃縮并施加到Superose 12柱(Pharmacia)上。將蛋白質經流速為0.2ml/min的40mM Tris-HCl，pH 8.0；150mM NaCl；和15mM2-ME洗脫。
5.1.6 Grp-170-肽復合物的制備和純化由王等人，2001，J.Immunol.166(1)490-7所描述的可使用的方法提供如下，例如但不限于將細胞或組織的沉淀顆粒(40-60ml)，例如腫瘤細胞組織的沉淀顆粒，在5體積的低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2，和蛋白酶抑制劑)中經Dounce勻漿作用而均質化。將該裂解物于4,500×g離心以及隨后在100,000×g離心2小時。如果該細胞或組織原于肝，則首先將所得到的上清液施加到藍色的Sepharose柱(Pharmacia)上以除去白蛋白。另外，將所得到的上清液施加到預先用結合緩沖液(20mMTris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mMMnCl2；和15mM 2-ME)平衡的Con A-Sepharose柱(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。將結合的蛋白質用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis)的結合緩沖液洗脫。
Con A-Sepharose-結合的物質首先相對于20mM Tris-HCl，pH7.5，和150mM NaCl進行透析，并隨后施加到Mono Q柱上以及經150-400mM的NaCl梯度洗脫。濃縮收集的級分并施加到Superose 12柱(Pharmacia)上。收集含有均質化的grpl70的級分。
5.1.7 HSPs的重組表達可以使用本領域已知的方法來重組生產hsps?？梢詫⒕幋a熱休克蛋白的核酸序列插入在宿主細胞中用于增殖和表達的表達載體中。
如在此所使用的表達構建體，是指編碼與一種或多種能夠使hsp在合適的宿主細胞中表達的調控區(qū)域可操作地相關的hsp的核苷酸序列?！蹇刹僮鞯叵嚓P的″是指其中調控區(qū)域和待表達的hsp序列相連并且以容許轉錄和最終翻譯的方式安置的聯系。
為hsp的轉錄所必需的調控區(qū)域可由表達載體提供。如果要表達缺乏其同源的起始密碼子的hsp基因序列，則可以提供翻譯的起始密碼子ATG。在適合的宿主-構建體系統中，細胞轉錄因子，例如RNA聚合酶可結合表達構建體上的調控區(qū)域以在宿主生物體中影響改進的hsp序列的轉錄。基因表達所需的調控區(qū)域的精確特性可以根據宿主細胞的不同而改變。一般地，需要能夠結合RNA聚合酶并促進可操作地結合的核酸序列的轉錄的啟動子。這種調控區(qū)域可以包括與轉錄和翻譯起始相關的5′非編碼序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。編碼序列的3′非編碼區(qū)域可以包含轉錄的終止調控序列，例如終止子和多聚腺苷酸酸化位點。
為了使具有調控功能的DNA序列，例如啟動子附著于hsp基因序列上或將hsp基因序列插入載體的克隆位點，可以將提供適當相容的限制性酶切位點的接頭或適配接頭通過本領域公知的技術(Wu等人，1987，酶學方法Methods in Enzymol，152343-349)連接到cDNAs的末端。用限制性內切酶切割后可進行改變以通過向后消化產生平末端或填平單鏈DNA的末端，然后連接。備選地，可以通過使用含有所需限制性內切酶位點的引物的PCR擴增DNA而將所需的限制性內切酶位點引入DNA片段。
可將包括與調控區(qū)域可操作地相關的hsp序列的表達構建體直接引入適當的宿主細胞，以用于hsp-肽復合物的表達和生產而不需要進一步的克隆。參見，例如，美國專利號No.5,580,859。表達構建體也可包含易于將hsp序列，例如通過同源重組整合到宿主細胞基因組中的DNA序列。在這種情況下，不必使用包括適用于合適宿主細胞的復制原點的表達載體，以在該宿主細胞中增殖和表達hsp。
可使用的多種表達載體包括但不限于質粒、粘性質粒、噬菌體、噬菌?；蛐揎椀牟《尽Ｒ话愕?，這種表達載體包括用于在適當的宿主細胞中增殖載體的復制的功能性原點，用于插入hsp基因序列的一種或多種限制性核酸內切酶位點和一種或多種篩選標記。該表達載體必須與可能來源于原核或真核生物體的相容的宿主細胞一起使用，該生物體包括但不限于細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物和人。
對于適當加工的hsp或hsp-肽復合物的長時間、高產率生產，在哺乳動物細胞中的穩(wěn)定表達是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^使用包含可選擇標記的載體而將穩(wěn)定表達hsp或hsp-肽復合物的細胞系工程化。例如但不限于，根據表達構建體的導入，可容許工程化的細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，并隨后轉移到選擇培養(yǎng)基中。表達構建體中的選擇性標記賦予對篩選的抗性并最適地容許細胞穩(wěn)定地將表達構建體整合到其染色體中，以及在培養(yǎng)基中生長并擴展為細胞系。這種細胞可長期培養(yǎng)，同時連續(xù)不斷地表達hsp。
重組的細胞可在溫度、孵育時間、光密度和培養(yǎng)基組合物的標準條件下培養(yǎng)。然而，重組細胞的生長條件可能與表達hsps和抗原性蛋白質的條件不同。也可使用改進的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基來增加hsp的生產。例如，可將包含hsps和其同源的啟動子的重組細胞暴露于加熱或其他環(huán)境應力或化學應力。可應用本領域已知的任何技術來建立用于生產hsp或hsp-肽復合物的最優(yōu)條件。
5.1.8肽的合成可代替重組技術生產hsp的備選方法是肽的合成。例如，整個hsp或相當于hsp部分的肽可以通過使用肽合成儀合成。可使用常規(guī)的肽合成方法或本領域公知的其他合成方法。
具有hsp或其部分氨基酸序列的肽可使用與由Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所描述的相似方法通過固相肽合成法合成。在合成中，將具有經保護的側鏈的N-α-保護的氨基酸逐步加入到由其C末端連接的增長的多肽鏈和不溶的聚合支持物，即聚苯乙烯珠上。通過將N-α-去保護氨基酸的氨基連接到已經通過將其與例如二環(huán)己基碳二亞胺的試劑反應而活化的N-α-去保護氨基酸的羧基上而合成肽。將自由氨基連接到活化的羧基上導致肽鍵的形成。最通常使用的N-α-保護基包括酸不穩(wěn)定的Boc和堿不穩(wěn)定的Fmoc。詳細的合適的化學物質、樹脂、保護基、保護的氨基酸和試劑是本領域公知的，因此在此不詳細論述(參見，Atherton等人，1989，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第二版，Springer-Verlag)。
所得到的hsp的純化可使用常規(guī)方法完成，例如使用凝膠滲透、分配的制備性的HPLC和/或離子交換色譜法。合適的基質和緩沖液的選擇是本領域公知的，因此在此不詳細描述。
5.2確定ATP酶活性的方法根據本發(fā)明，可使hsp或hsp-肽復合物的ATP酶活性相互關聯，并因此確定hsp或hsp-肽復合物的生物活性。本發(fā)明的方法可用于檢測樣品中有生物學活性的hsp或hsp-肽復合物的存在或缺乏。該方法可以是定量的，以使得當樣品中hsp或hsp-肽復合物的量是已知的時，可推導出比生物活性。樣品中hsp或hsp-肽復合物的比生物活性可用于評估樣品的治療或預防數量。該比活性還可用于比較含有hsp或hsp-肽復合物的樣品的生物學活性。該方法可進一步包括在存在格爾德霉素或任何其他結合hsps的核苷酸的特定抑制劑(例如，腺苷類似物5′-N-乙基酰胺基-腺苷(NECA))時確定ATP酶活性，其中受到存在的格爾德霉素或任何其他結合核苷酸的特定抑制劑抑制的ATP酶活性與生物學活性相關。當其他類型的ATP酶可能存在于樣品中時，該步驟是特別有效的。
可以測量ATP酶活性的任何方法都能使用。非限制性的實例包括涉及ATP、ADP和/或AMP的形成或消耗的酶反應，例如但不限于基于發(fā)光酶的分析，以及檢測ATP、ADP、AMP和/或無機磷酸鹽的濃度和/或數量的方法，例如但不限于離子交換色譜法。
在一個特定的實施方案中，可以使用生物發(fā)光的ATP分析。例如但不限于，該分析可如下進行
使用Millipore BIOMAX spin柱(10Kda MWCO)將蛋白質樣品濃縮到蛋白質濃度為500μg/ml。將Gp96(1μg)與含有20％DMSO或包含400μM特異抑制劑格爾德霉素的20％DMSO的ATP(10-30倍摩爾過量的)溶液混合。然后將該混合物于37℃孵育4小時。隨后，用PBS將單個樣品稀釋到100μL。通過使用分子裝置Lmax光度計和ROCHE CLII生物發(fā)光試劑盒將50μL各個樣品中含有的ATP與ATP標準曲線相比較而定量。DMSO和DMSO/格爾德霉素測量值之間ATP濃度的差異表示特異于gp96水解的ATP的數量。作為備選的，在該分析中可以將格爾德霉素替換為NECA。
在另一個實施方案中，可以使用離子交換色譜法。例如但不限于，該分析可如下進行將-0.5mg/mL的Gp96樣品與10×摩爾比的ATP于37℃，在存在5mM MgCl2和25mM KCl的PBS中孵育。在多個時間點采集等分樣品并且使用離子交換HPLC系統確定剩余的ATP。對于格爾德霉素抑制實驗，將格爾德霉素以相對于ATP為1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的比率加入混合物。在多個時間點采集等分樣品用于ATP分析。經酪蛋白激酶II的ATP水解在下列條件下進行測試將0.5U/mL酪蛋白激酶II與20μg/mL ATP、有或無格爾德霉素(格爾德霉素相對于ATP的比率為1∶1，1∶2，1∶5和1∶10)的2mg/ml酪蛋白混合，并于37℃，在含有10mM MgCl2、130mM KCL和5mM DTT的40mMHEPES中孵育。在多個時間點采集等分樣品并分析ATP濃度。
通過使用Partisil SAX柱(2.1×250mm，10μm，Alltech)的離子交換HPLC測量ATP濃度，并且以0.25mL/min，使用0.3-1M磷酸銨的線性梯度在25分鐘內進行洗脫。所有的色譜法在Waters AllianceHPLC系統上以215nm的吸光率進行檢測。完全分離的ATP形成ADP和AMP，并且根據使用ATP標準曲線的峰面積而量化。對于gp96的特異性ATP酶活性可以表示為每毫克gp96蛋白質每小時的ATP水解數量(nmol/mg/hr)。對于酪蛋白激酶II的特異性ATP酶活性可表示為每單位蛋白質每小時的ATP水解數量(nmol/U/hr)。所有比率的值相對于單獨含有ATP而沒有加入gp96或酪蛋白激酶II的樣品所確定的背景水解進行校正。
還可使用利用[γ-32P]標記的ATP和薄層色譜法的免疫親和分離技術測量ATP酶活性，例如但不限于提供如下。(Li和Srivastava(1993)EMBO J.123143；Wearsch和Nicchitta(1997)J.Biol.Chem.2725152)一般地，1μg純化的gp96或hsp70與20μM[γ-32P]ATP在含有20mM HEPES，pH7.2，20mM NaCL和2mM MgCl2的20μl反應體積中于37℃孵育1h。然后將1μl反應混合物點到聚亞乙基亞胺(PEI)纖維素板上。相對于1∶1比率的1M LiCl和1M HCOOH進行薄層色譜。然后干燥平板，暴露于感光膠片并且切除和計算相應的放射性斑點。從產生自[γ-32P]ATP的[α-32P]ADP和[α-32P]AMP的數量確定ATP酶活性，即以[ADP+AMP]/[ATP+AMP+ADP]×100％計算的ATP水解的百分比。減去缺乏純化的gp96或hsp70的背景的ATP水解。
還可使用HPLC測量ATP酶活性。如下列提供，例如但不限于將Gp96(2μg；PBS中200μg/ml)加入等體積的含有ATP(160μM)、10mM MgCl2和20％DMSO的PBS。在對照實驗中，將格爾德霉素(160μM)溶于DMSO而代替單獨的DMSO。并于37℃孵育混合樣品4小時。接著，加入80μL 100mM的KH2PO4(pH 4.0)以淬滅反應并將樣品加載入HPLC自動采樣器以用于注射。使用在含有1％乙腈的60mM KH2PO4(pH 6.0)中平衡的Aquasil C18柱(250mm×4.6mm)而分離自ATP的ADP。流速是0.5ml/min。根據自動化的峰值積分法將ADP的數量定量并且與ADP標準曲線比較。
還可使用本領域已知的放射性同位素分析來確定hsp或hsp-肽-復合物的ATP酶活性。
5.3通過大小確定寡聚結構的方法根據本發(fā)明，hsp或hsp-肽復合物的寡聚結構可用于確定hsp或hsp-肽復合物的生物活性。本發(fā)明的方法可用于檢測樣品中有生物學活性的hsp或hsp-肽復合物的存在或缺乏。該方法可以是定量的，以使得當樣品中hsp或hsp-肽復合物的量是已知的時，可推導出特定的生物活性。樣品中hsp或hsp-肽復合物特定的生物活性可用于估計治療或預防的樣品數量。該比活性還可用于比較含有hsp或hsp-肽復合物的樣品的生物學活性。
本領域已知的用于檢測或測量存在寡聚結構的任何方法都能被使用。優(yōu)選地，該方法被設計成能用于hsp。還可以使用監(jiān)測寡聚化進程的方法。
在一個特定的實施方案中，可使用大小排阻色譜法。由Chadli等人(1999)J.Biol.Chem.2744133-4139描述的方法，提供如下，例如但不限于使用FPLC系統(Amersham pharmacia Biotech)的大小排阻色譜，于4℃在用50mM Tris-HCL，pH 8.65平衡的Superose 6或Superose 1210/30柱上進行。洗脫使用相同的緩沖液以0.2ml/min的流速進行。通過在280nm的UV吸光率檢測所洗脫的蛋白質。將該柱用AmershamPharmacia Biotech的高和低分子量標準化試劑盒校準。所使用的標準是甲狀腺球蛋白(669kDa)、鐵蛋白(440kDa)、過氧化氫酶(232kDa)、醛縮酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)和胰凝乳蛋白酶原(25kDa)。分別使用藍色萄聚糖和重鉻酸鉀確定空體積和總體積。
在另一個實施方案中，可以使用SDS和Native PAGE。由Chadli等人(1999)J.Biol.Chem.2744133-4139描述的方法，提供如下，例如但不限于SDS和Native PAGE和銀染在Phast系統(Amersham PharmaciaBiotech)上進行。分子量校準試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)包括磷酸化酶b(94kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵白蛋白(43kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20kDa)和α-乳白蛋白(14.4kDa)。
于4℃在Multipore II(Amersham Pharmacia Biotech)上使用10％的聚丙烯酰胺Clean凝膠，375mM Tris緩沖液，pH 8.9進行NativePAGE。使用包含甲狀腺球蛋白(669kDa)、鐵蛋白(440kDa)、過氧化氫酶(232kDa)、乳酸鹽脫氫酶(140kDa)和牛血清白蛋白(67kDa)的校準試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)，根據制造商的推薦評估蛋白質的表現分子量。銀染條帶的掃描在使用生物圖像軟件(Millipore)的Omni介質掃描儀設備上進行。
將在native PAGE上分辨的Hsp樣品電轉移到硝化纖維素上。將空氣干燥的過濾物在含有10％脫脂奶粉的PBS、0.05％ Tween 20(PBST)中孵育2h，用PBST洗滌，與抗hsp90抗體Ab119(37)(1∶4000)或d7α(28)(1∶4000)孵育2h，用PBST洗滌，與抗兔或抗鼠的抗體一起孵育1h，用PBST洗滌，并用ECL(Amersham PharmaciaBiotech)顯色。
另一個實施方案中，可使用凝膠過濾色譜法。由Wearsch和Nicchitta(1996)Biochem.3516760-9描述的方法提供如下，例如但不限于TSK-GEL g3000 SW分析凝膠過濾柱(Tosohaus，Montgomeryville，PA)在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)或緩沖液A(110mMKOAc，25nM K-HEPES，pH 7.2，20mM NaCl，1mM Mg(OAc)2，0.1mM CaCl2)中平衡。將125μL體積的樣品以0.6mL/min的流速注射到柱上。收集0.5mL的級分并經SDS-PAGE分析。每個樣品的Stokes半徑(Rs)通過與標準(甲狀腺球蛋白，Rs＝8.5nm，660kDa；去鐵鐵蛋白，Rs＝3.5nm，66kDa；卵白蛋白，Rs＝3.1nm，43kDa)相比較而確定。其中指明，grp94在分析前于室溫與4mM Zwittergent3-12在125μL的緩沖液A或1×PBS中孵育45分鐘。
在另一實施方案中，可以使用雙向電泳。由Wearsch和Nicchitta(1996)Prot.Exp.Pur.7114-121描述的方法提供如下，例如但不限于對于第一維(非還原的)，將樣品置于0.5M Tris、5％SDS、0.01％溴酚藍中并在55℃加熱10分鐘。制備2個1μg的純化grp94樣品，其中在樣品緩沖液中包含50mM DTT。包含5微克的高分子量標準和IgG作為對照。將樣品加載到注入毛細管的7.5％凝膠上并在Mini-ProteanII 2-D Cell(Bio-Rad)中以200V電泳。提取管狀凝膠，在0.5M Tris，5％SDS，0.1M DTT中于55℃孵育15分鐘，覆蓋到預備的7.5％平板凝膠上，并且在第二維上電泳。將蛋白質用考馬斯藍染色劑顯色。
還可使用速率沉積法確定hsp或hsp-肽復合物的多聚體結構。下列分析，如由Wearsch和Nicchitta(1996)Biochem.3516760-9所進行的，例如呈現如下，但不限于對于沉降系數(s)的確定，在平行于已知標準的蔗糖梯度上分析樣品。對天然的grp94，彈性蛋白酶-消化的grp94和體外合成的grp94-ΔC(參見構建體的制備)在補充有緩沖液A的15-30％蔗糖的梯度上進行分析。對體外合成的grp94-Cexp翻譯產物和grp94-MBP融合蛋白質在補充有PBS的10-25％蔗糖梯度上進行分析。制備11.5mL的梯度并用Auto Densi-Flow IIc(Buchler Instruments，Lenexa，KS)收獲。將200μL體積的樣品加載到梯度上并在Beckman SW41轉子中以40,000rpm在室溫下離心20h。使用過氧化氫酶(11.3S)、酵母乙醇脫氫酶(7.4S)、BSA(4.3S)、卵白蛋白(3.5S)和胰凝乳蛋白酶原A(2.6S)作為標準。從梯度中收集0.5mL的級分并通過SDS-PAGE(grp94樣品)或通過280nm的吸光率(蛋白質標準)分析。
也可由本領域的任何人員使用質譜法以確定gp96和/或gp 96復合物的寡聚結構。
在另一個實施方案中，以實施例的方式提供但不限于，可以使用過濾器確定gp96二聚體和/或gp96復合物二聚體的存在和/或數量。在優(yōu)選的實施方案中，這種過濾器是分子量截止的過濾器，它容許特定大小的分子通過同時截留較大的分子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，使用光散射分析確定寡聚體的gp96和/或gp96復合物的存在或濃度。
在另一實施方案中，可以使用分析超離心來確定gp96二聚體和/或gp96復合物二聚體的存在和/或數量。該技術對于有經驗的技術人員是公知的。
在另一個實施方案中，可以使用梯度離心確定gp96二聚體和/或gp96復合物二聚體的存在和/或數量。該技術對于有經驗的技術人員是公知的。
5.4確定生物活性的方法根據本發(fā)明，可以使用hsp和/或hsp-肽復合物的寡聚結構或ATP酶的活性作為檢測或測量hsp或hsp-肽復合物的生物活性的替代。特別感興趣的hsp和/或hsp-肽復合物的生物活性包括但不限于免疫活性，例如，肽抗原呈遞到抗原遞呈細胞(抗原再呈遞)和T細胞的活化；誘導生產生物應答修飾物質，例如但不限于細胞因子，例如，人巨噬細胞化學誘引蛋白質-1(MCP-1)和一氧化氮(NO)；受體，例如CD91(α-2-巨球蛋白受體，α2MR)和/或CD36的結合；抗原性分子的結合和釋放；以及能夠引起動物中腫瘤的退化，延長患腫瘤動物的存活期并消除感染。該生物活性可能在體內和/或體外發(fā)生或被觀察到。
hsps結合肽的能力是表觀的，但對于該肽加載的機制還不清楚。Gp96是在內質網中發(fā)現的蛋白質并在體外結合大量的肽而在體內沒有明顯的氨基酸特異性。
實際上，對于gp96在免疫應答中的作用，首先肽必須結合hsp(Sastry和Linderoth(1999)J.Biol.Chem.27412023-12035)。Sastry和Linderoth(上述)已經描述了檢測肽與gp96結合的測定方法。簡而言之，肽-芘與1摩爾過量的gp96于室溫下在低鹽緩沖液中(20mMHEPES，pH 7.9，20mM NaCl，2mM MgCl2)孵育10分鐘。使用70,000分子量截止值的薄膜透析該混合物2h以除去任何未結合的肽-芘。通過340nm的激發(fā)而監(jiān)測滯留物的熒光。在這個波長下，蛋白質的生色團(Trp和Tyr)不吸收紫外線，而只有芘被激發(fā)。
經hsps的抗原性肽的再呈遞是另一個顯著的生物活性。本發(fā)明者已經證明gp96二聚體結構的丟失與其抗原再呈遞活性的丟失相關。經RAW264.7APCs介導的免疫應答和特異于gp96復合物肽的CTLs受到由CTLs分泌的IFN-γ水平的調節(jié)。IFN-γ是本領域已知的一般免疫狀況指標的細胞因子；它也在腫瘤識別和排斥中扮演重要的角色。二聚的gp96能刺激IFN-γ以劑量依賴的方式分泌，同時聚集的gp96不刺激IFN-γ的分泌。再呈遞測定例如但不限于，在第8節(jié)中的描述。
在應答hsp或hsp-肽復合物的出現時，抗原遞呈細胞分泌MCP-1并產生NO。MCP-1在血液單核細胞和組織巨噬細胞的炎癥性應答中扮演重要角色。NO也已經被證明是免疫應答的顯著調節(jié)劑(Wei等人，(1995)自然Nature 375408-411)。
CD91/α2M受體是熱休克蛋白的細胞表面受體。CD91/α2M受體在多種配體的胞吞作用中起作用。除α2M外，其他的α2MR配體包括脂蛋白-肽復合物、乳鐵傳遞蛋白、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和外毒素。因此，α2M受體在多種細胞代謝過程中發(fā)揮作用，包括胞吞作用、抗原呈遞、膽固醇調節(jié)、含有脂蛋白的ApoE的清除，以及乳糜微粒殘余物的脫除。因此，本發(fā)明的方法可容許檢測或測量hsp或hsp-肽復合物結合或阻遏其他分子結合CD91/α2M受體的能力。
CD36也已經顯示作為熱休克蛋白的受體而起作用。CD36是B類清除劑受體家族的成員并且主要在毛細血管內皮細胞、乳腺分泌上皮細胞、分化的脂肪細胞、B細胞、巨噬細胞和幾種類型的腫瘤細胞中表達。CD36被認為在血小板粘附和聚集、凋亡細胞的吞噬作用和長鏈脂肪酸的代謝中起作用。特別地，熱休克蛋白gp96已經顯示結合CD36并在這些細胞中刺激一氧化氮和化學因子的產生。(Panjwani等人，2000，Cell Stress & Chaperones 5(4)373-397；2000年10月6日提交的美國臨時申請No.60/238865)。因此，本發(fā)明的方法可容許檢測或測量hsp或hsp-肽復合物結合或阻遏其他分子結合CD36的能力。
5.5質量控制和標準化中的用途根據本發(fā)明，hsp或hsp-肽復合物的寡聚結構或ATP酶活性可用于確定hsp或hsp-肽復合物的生物活性。本發(fā)明的方法可用于檢測樣品中有生物學活性的hsp或hsp-肽復合物的存在或缺乏。該方法可以是定量的，以使得當樣品中hsp或hsp-肽復合物的量是已知的時，可推導出比生物活性。樣品中hsp或hsp-肽復合物的比生物活性可用于評估樣品的治療或預防的數量。該比活性還可用于比較含有hsp或hsp-肽復合物的樣品的生物學活性。
本發(fā)明的方法可用于在hsp-肽復合物的工業(yè)生產和貯存期間hsp-肽復合物制品的質量控制。hsp-肽復合物制品的質量方面包括可與其比活性相關的制品效價；與貯存要求、貯存歷史相關的制品穩(wěn)定性及其對效價的影響。本發(fā)明的方法還可用于確定或預測可源自于hsp或hsp-肽復合物的給定制品的劑量數目，特別是在對患者特異性的hsp-肽復合物的制品的范圍內。
Hsps及其復合物具有許多商業(yè)用途。hsp-肽復合物用于治療和預防癌癥和傳染性疾病的用途已經在美國專利號6,030,618；5,935,576；5,750,119；5961,979；6,048,530；5,837,251和6,017,540中有描述。在體外用于敏化抗原呈現細胞供過繼性免疫療法之用的應激蛋白-抗原復合物的用途在1997年3月20日PCT公開物WO 97/10002中有描述(也參見1999年11月16日公開的美國專利號5,985,270)。本發(fā)明的方法也對用于改進包括hsp或hsp-肽復合物的治療的劑型和功效有用，例如在美國臨時申請No.60/232,779；以及美國專利申請No.09/693,643中所描述的，其在此全部引入作為參考。
本發(fā)明的方法可用于替代在第5.5節(jié)中所描述的相對昂貴和繁重的生物測定。本發(fā)明的方法可用于在制造過程中監(jiān)測調控需求的適應性。
5.6在診斷和預后中的用途在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于診斷部分歸因于受試個體免疫系統功能的受試個體狀況的方法，所述的方法包括使獲得自受試個體的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的二聚體的存在與熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性相關。既然生物活性與受試個體的一種或多種免疫功能相關，ATP酶活性或二聚體數量的變化表明狀況的變化。本發(fā)明的方法提供監(jiān)測免疫系統健康的一般狀況、免疫系統非抗原特異性的方面和/或監(jiān)測受試個體免疫應答性的便利方式。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于確定受試個體中癌癥或傳染性疾病的預后的方法，包括使獲得自受試個體的熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或熱休克蛋白熱休克蛋白-肽復合物寡聚體的存在與熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的生物活性相關，其中該生物活性與應答或靶向癌癥細胞或引起傳染性疾病的因子的一種或多種免疫功能相關。這種免疫功能與抗原呈遞、對抗原應答的擴大以及在特異性和非特異性方面的效應細胞的功能相關。因此，ATP酶活性或二聚體數量的變化表明預后的變化。
在本發(fā)明的另一實施方案中，癌癥或傳染性疾病的預后可以通過測量分離自受試個體的癌細胞或受感染細胞的hsp和/或hsp-肽復合物的ATP酶活性和/或多聚體結構而建立。由這種細胞產生的hsp或hsp-肽復合物的生物活性反映了癌細胞或受感染細胞的體內免疫原性，并且可用于提供癌癥或傳染性疾病的預后。
在多種實施方案中，本發(fā)明的方法還可用于監(jiān)測接受例如疫苗、化學療法、輻射或免疫療法的治療后的受試個體的免疫狀況。
5.7調節(jié)HSPs和Hsp-肽復合物的生物活性在另一實施方案中，本發(fā)明提供調節(jié)熱休克蛋白和其復合物的生物活性的方法，包括使熱休克蛋白和復合物與調節(jié)ATP酶活性或該熱休克蛋白和復合物的寡聚化的化合物接觸。這種化合物可用于調節(jié)受試個體的免疫功能并且可如下所述的本發(fā)明的方法鑒定。
hsp或hsp-肽復合物的生物活性的調節(jié)可用于治療免疫缺乏病癥(例如但不限于免疫抑制藥物、化學療法和放射性照射的用途)，或與過度活化的免疫系統相關的病癥(例如但不限于過敏反應、移植排斥反應和自身免疫疾病)。
5.8藥物篩選本發(fā)明還可用于篩選調節(jié)hsp或hsp-肽復合物的生物學活性的治療劑。在一個實施方案中，可以通過將試劑接觸包括hsp或hsp-肽復合物的組合物，并隨后確定該組合物中hsp或hsp-肽復合物的ATP酶活性或其二聚化而篩選它。
相對于未接觸的組合物，ATP酶活性或二聚體的增加可能鑒定能增加生物學活性的作為治療劑的測試的化合物。
與未接觸的組合物相比，ATP酶或二聚體的降低可能鑒定能降低生物學活性的作為治療劑的測試的化合物。
治療劑的實例包括但不限于肽、小分子、肽模擬物、抗體、脂類、碳水化合物、抗生素，包括格爾德霉素類似物(例如，17-聯合-氨基格爾德霉素)；和核苷酸類似物(參見Rosser等人，J.Bio.Chem.2000，27522789)。
也可以測試治療劑看看它們是否增加或減少hsp對于增減hsp生物活性的試劑或環(huán)境因素的抗性。這些實施方案包括首先，通過檢測ATP酶活性或二聚體來測量組合物中hsp的生物活性，第二，將待篩選的試劑接觸包括hsp的組合物并隨后再次測量生物活性，以及最終將該組合物與試劑或改變本領域已知的抑制或促進生物活性的環(huán)境因素，例如pH或溫度接觸，以及然后第三次測量生物活性。如此可確定所篩選的試劑是否通過增加或減少已知的hsp生物活性的抑制劑或促進劑的效應而調節(jié)hsp的生物活性。
本發(fā)明的方法還可用于篩選調節(jié)hsp生物活性的方式?？蓪⒒衔锛尤牒蛷暮衕sp-肽復合物的組合物中除去，同時測量加入前后的hsp肽復合物或該化合物的生物活性?？蓮慕M合物中加入或減去的化合物包括但不限于，離子、酸、堿、鹽、金屬、氣體、液體、固體、酶、蛋白質、脂類、碳水化合物、肽和核苷酸。也可測試化合物以確定它們是否增加或減少hsp對于本領域已知的增加或減少hsp-肽復合物生物活性的試劑或環(huán)境因素的抗性。
5.9用于確定生物活性的試劑盒本發(fā)明也提供用于實現本發(fā)明的方法和/或治療方式的試劑盒。一個實施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽復合物作為陽性對照的容器、ATP的容器和格爾德霉素容器的試劑盒。另一個實施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽復合物作為陽性對照的容器和gp96構象特異性抗體的試劑盒。另一個實施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽復合物作為陽性對照的容器和分子量截止過濾器的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒也包括用于確定熱休克蛋白或熱休克蛋白-肽復合物的ATP酶活性或二聚體數量的指導說明。
5.10重組HSPs的合理設計本發(fā)明的方法也可用于篩選增減生物活性的變體hsps。變體可以通過本領域的技術人員使用包括誘變、易錯PCR、基因改組的重組DNA技術產生。一旦獲得重組的hsp，可使用本發(fā)明的方法測量重組的hsp和復合物的生物活性。
5.11針對HSP的構象特異性的抗體在另一實施方案中，本發(fā)明提供通過利用構象特異性的多克隆或單克隆抗體，包括但不限于重組抗體，其片段和衍生物檢測hsp的寡聚體或hsp或hsp-肽復合物的特異構象的方法。在一個實施方案中，這種抗體只結合具有特定構象的hsp和/或hsp-肽復合物，例如二聚體，而不結合hsp和/或hsp-肽復合物的其他形式。該結合的抗體可以通過本領域已知的技術，例如ELISA定量。在特定的實施方案中，該抗體結合單體和寡聚的(非二聚體)hsp和/或hsp-肽復合物，但不結合二聚體。在另一實施方案中，該抗體結合存在于hsp或hsp-肽復合物單體形式上的表位，其中當hsp或hsp-肽復合物寡聚化或二聚化時所述的表位被掩蓋。
構象特異的多克隆和/或單克隆抗體可以通過本領域公知的技術產生。在這些實例中，抗體特異于待測量的hsp或hsp-肽復合物的二聚體。
構象特異的抗體也可用于分離或濃縮顯示生物活性的hsp或hsp-肽復合物?？梢允褂帽绢I域已知的任何方法，例如親合純化。這容許組合物制品包括高度有效的hsp或hsp-肽復合物。
可以使用本領域已知的用于在hsps或hsp-肽復合物中檢測構象變化的任何方法，包括例如但不限于內在的熒光、圓二色性、量熱法或確定與蛋白質構象不一致的配體結合的測定方法。
5.12抗原性分子下列小節(jié)提供對作為本發(fā)明的hsp-肽復合物的抗原/免疫原性成分有用的肽的綜述，以及如何鑒定這種肽，例如用于在體外復合hsps和抗原性分子的肽的重組表達。然而，在本發(fā)明的實施中，不必已知hsp/肽-復合物的抗原性分子的同一性，例如當該hsp/肽復合物可作為復合物群直接從癌性細胞或受病原體感染的組織純化時。
在一個實施方案中，抗原性肽可源自癌細胞或受導致傳染性疾病的病原體或傳染物感染的細胞。病原體或傳染物的實例包括但不限于，病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲等。優(yōu)選地，病原體是感染人的病原體。抗原性的肽可以通過獲得自癌細胞、受感染細胞或與癌細胞、受感染細胞或包括病毒顆粒的病原體共用抗原決定簇或顯示相似抗原性的抗原性細胞的蛋白質(例如，胞質和/或膜-衍生蛋白)的蛋白水解消化產生?？乖缘碾囊部梢酝ㄟ^將蛋白質暴露于ATP、鹽酸胍和/或酸而產生。抗原性的肽也可從顯示導致傳染性疾病因子(病原體)或這種因子變體的抗原性的抗原性細胞產生。
既然完整的癌細胞、受感染細胞或其他的抗原性細胞可用于本方法，就不必在使用本方法之前分離或表征或甚至了解抗原性肽的同一性?？梢愿鶕c抗原相關的疾病的特性來選擇抗原性細胞的來源。在本發(fā)明的一個實施方案中，任何組織或分離自癌癥的細胞，包括分離自已經轉移到多重位點的癌癥的細胞可用作本方法中的抗原性細胞。例如，也可使用在血液、淋巴或其他體液中循環(huán)的白血病細胞，還可使用實體瘤組織(例如，來自活體檢查的初生組織)。癌癥的非限制性的目錄，其中在此可使用的細胞提供于下列的第5.18節(jié)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，受病原體或傳染物感染的任何細胞，即受感染的細胞，可以用作制備抗原性肽的抗原性細胞。特別地，受胞內病原體，例如病毒、細菌、真菌、寄生蟲、或原生動物感染的細胞是優(yōu)選的。在此可以使用的能感染細胞的傳染物的示范性目錄提供于第5.18節(jié)中。
在另一實施方案中，可導致傳染性疾病的任何病原體或傳染物可用作制備抗原性肽的抗原性細胞。病原體或傳染物的變體，例如但限于復制有缺陷的變體、非病原的或減弱的變體、非傳染性的變體，也可用作這個目的的抗原性細胞。例如，許多可體外培養(yǎng)或分離自感染物質的病毒、細菌、真菌、寄生蟲和原生動物可以作為抗原性細胞的來源?？梢允褂帽绢I域已知的用于繁殖這些病原體，包括病毒顆粒的方法。可用作抗原性細胞的病原體或傳染物的示范性目錄提供于第5.18節(jié)中。
來源于癌癥組織、癌細胞或受感染細胞的細胞系也可用作抗原性的細胞。癌癥或受感染的組織、細胞或起源于人的細胞系是優(yōu)選的。癌細胞、受感染細胞或抗原性細胞可以通過本領域已知的任何方法鑒定和分離。例如，癌細胞或受感染細胞可以通過形態(tài)學、酶活測定、增殖測定或病原體或導致癌癥的病毒的存在而被鑒定。如果令人感興趣的抗原的特征是已知的，抗原性細胞也可以通過本領域已知的任何生物化學或免疫的方法被鑒定或分離。例如，癌細胞或受感染的細胞可以通過外科手術、內窺鏡檢查、其他活體檢查技術、來自體液(例如血液)、親和色譜法和熒光活化細胞分類法(例如，具有針對細胞表達的抗原的熒光標記抗體)而分離。顯示相似抗原性的抗原性細胞具有一種或多種共同針對受試個體中所需的免疫應答的抗原決定簇(例如，用于治療或預防的目的)。
優(yōu)選地，當用于治療或預防癌癥時，使用已知的腫瘤特異性(即，在腫瘤細胞中表達的)或與腫瘤相關的抗原(即，在腫瘤細胞中過表達的)或其片段或衍生物。例如，這種腫瘤特異的或與腫瘤相關的抗原包括但不限于KS1/4泛-癌抗原((Perez和Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)；卵巢癌抗原(CA125)(Yu等人，1991，Cancer Res.51(2)468-475)；前列腺的過磷酸鹽(Tailer等人，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)；前列腺特異的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli等人，1993，Cancer Res.53227-230)；與黑素瘤相關的抗原p97(Estin等人，1989，J.Natl.CancerInst.81(6)445-446)；黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)；高分子量的黑色素瘤抗原(Natali等人，1987，Cancer 5955-63)和前列腺特異性膜抗原。其他的可結合hsps的外源性抗原包括在癌細胞中高頻率突變的部分或蛋白質，例如致癌基因(例如ras，特別是只發(fā)生在4個氨基酸殘基(12、13、59或61)上的活化突變的ras突變體(Gedde-Dahl等人，1994，Eur.J.Immunol.24(2)410-414))和腫瘤抑制基因(例如p53，因為已經確定多種突變體的或多形態(tài)的p53肽抗原能夠刺激細胞毒素的T細胞應答(Gnjatic等人，1995，Eur.J.Immunol.25(6)1638-1642)。
優(yōu)選地，當用于治療或預防病毒性疾病時，包括已知病毒的表位的合適的蛋白質和肽可在合適的細胞中表達。例如，這種抗原性表位來自病毒，該病毒包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、單純性皰疹類型I(HSV-I)、單純性皰疹類型II(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾可病毒，輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、棘病毒、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩其病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、天花病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、人類免疫缺陷性病毒類型I(HIV-I)和人類免疫缺陷性病毒類型II(HIV-II)。
優(yōu)選地，當用于治療或預防細菌感染時，包括已知細菌的表位的合適的蛋白質和肽可在合適的細胞中表達。例如，這種細菌表位可來源于多種細菌，該細菌包括但不限于，革蘭氏陽性芽胞桿菌(例如，李斯特菌、芽胞桿菌，例如炭疽桿菌、丹毒絲菌屬種)、革蘭氏陰性芽胞桿菌(例如，巴爾通氏體、布魯氏桿菌、彎曲桿菌、腸桿菌、埃希氏桿菌、弗朗西斯氏菌、嗜血桿菌、克雷伯氏桿菌、摩根氏菌、變形桿菌、普羅威登斯菌、假單胞菌、沙門氏桿菌、沙雷氏菌、志賀氏桿菌、弧菌和耶爾森氏菌屬種)、螺旋體細菌(例如，疏螺旋體屬種，包括導致Lyme疾病的布氏疏螺旋體和鉤端螺旋體)、厭氧菌(例如，放線菌和梭狀芽胞桿菌屬種，包括破傷風梭菌、肉毒梭菌、產氣莢膜梭菌)、革蘭氏陽性和陰性的球狀細菌、鏈球菌屬種、肺炎球菌屬種、葡萄球菌屬種(例如，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌)、奈瑟氏球菌屬種(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌)。
優(yōu)選地，當用于治療或預防真菌感染時，包括已知真菌的表位的合適的蛋白質和肽可在合適的細胞中表達。例如，這種抗原性表位可來源于多種真菌，包括曲霉(例如，Aspergillus fumigatus)、隱球酵母(例如，新型隱球菌)、Sporotrix、球孢子菌、副球霉菌、組織胞漿菌、芽生菌、念珠菌(例如，白色念珠菌)、酒曲菌、Rhizomucor、犁頭霉和蛙糞霉屬種。
優(yōu)選地，當用于治療或預防寄生蟲感染時，包括已知的原生動物、線蟲或蠕蟲感染表位的合適的蛋白質和肽可在合適的細胞中表達。例如，這種抗原性表位可來源于多種原生動物，包括但不限于Entoamoeba、變形體、利什曼蟲、艾美蟲、隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、弓形蟲和錐蟲屬種。
5.12.1抗原性蛋白質的制備在本發(fā)明的一個實施方案中，提供源自癌細胞、受感染細胞或病原體的蛋白質制品。例如，為了治療癌癥，該蛋白質制品是手術后從獲得自癌癥患者的腫瘤細胞制備的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，令人感興趣的一種或多種抗原性蛋白質在通過導入編碼這種抗原的重組表達系統而改變的細胞系中合成，并且使用這種細胞制備蛋白質。蛋白質可獲得自一種或多種細胞級分，例如，抗原性細胞的胞液，或它們可從抗原性細胞的膜或細胞壁中提取或溶解出來。本領域已知的任何用于細胞溶解、細胞內容物的分級分離和蛋白質的富集或分離技術都能被使用。參見，例如，Current Protocols in Immunology，vol.2，chapter 8 Coligan等人(編輯)，John Wiley和Sons，Inc.；Pathogenicand Clinical MicrobiologyA Laboratory Manual，Rowland等人，LittleBrown和Co.，1994年6月；其在此全部引入作為參考。根據所使用的分離細胞內容物的技術，細胞級分包括至少20，50、100，500、1,000、5,000、10,000或20,000種不同的蛋白質。
如在此所使用的，術語″蛋白質制品″是指從抗原性細胞，抗原性細胞的細胞級分或病毒顆粒獲得的蛋白質混合物。蛋白質可獲得自例如細胞質的細胞級分。蛋白質也可以是非細胞質的蛋白質(例如，來自細胞壁、細胞膜或細胞器的蛋白質)或兩者皆是。細胞級分可以包括但不限于，胞質級分、膜級分和細胞器級分，例如核、線粒體、溶酶體和內質網衍生的級分。蛋白質制品可從非重組或重組的細胞獲得。
在特定的實施方案中，蛋白質制品沒有經受任何從抗原性細胞的其它蛋白質中選擇性地除去或保留一種或多種特定蛋白質的制備方法。
在特定的實施方案中，蛋白質制品是未分離和/或純化的總的細胞裂解物，并且可能包含細胞的其他非蛋白質物質。
在另一個特定的實施方案中，蛋白質制品是細胞級分中未經受進一步的分級分離或純化的總的蛋白質，并且可能包含細胞的其他非蛋白質物質。
另一實施方案中，蛋白質制品是病毒顆粒制品中總的蛋白質。
在特定的實施方案中，蛋白質制品包括抗原性細胞的總的細胞蛋白質、總的胞質蛋白質，或總的膜結合的蛋白質。
在多種實施方案中，蛋白質制品包括至少20，50、100，500、1,000、5,000、10,000或20,000種不同的蛋白質。大量不同的抗原性蛋白質存在于抗原性細胞的蛋白質制品中。此外，蛋白質制品中的蛋白質可能在體外結合hsps前經受蛋白酶消化的步驟。備選地，蛋白質制品中的蛋白質可能在體外結合hsps前不經受蛋白酶消化的步驟。
為了制備抗原性細胞或病毒顆粒的蛋白質制品，抗原性細胞的裂解或細胞壁、細胞膜或病毒顆粒結構的破壞可以使用本領域已知的標準方法進行。在多種實施方案中，抗原性細胞可以例如通過機械剪切、超聲處理、凍融、調節(jié)細胞周圍介質的滲透性或這些技術的組合而裂解。在其他的實施方案中，抗原性細胞可以通過例如去污劑的化學品裂解。
一旦細胞裂解，可將細胞碎屑、非蛋白質的物質或不包含胞質和/或從膜得到的蛋白質的物質(包括細胞器膜中的蛋白質)除去。這些成分的除去可以通過例如低速離心或過濾的技術完成。除去細胞碎屑和完整的細胞后，可以使用高速離心的步驟分離上清液中的胞質蛋白質和沉淀顆粒中收集的膜衍生的蛋白質。本領域通常已知的標準方法容許進一步從沉淀顆粒中分離膜衍生的蛋白質?？梢允褂帽绢I域通常已知的標準技術從病毒顆粒提取病毒蛋白質。這些分離方法根據存在于抗原性細胞、細胞液或膜中分子普遍的和總的大小、密度和/或電荷而起作用。這些分離方法不是用來從其他蛋白質中選擇性地除去或保留任何一種或多種特定的蛋白質。
在多種實施方案中，來自抗原性細胞的蛋白質可任意地通過其普遍的生物化學和/或生物物理學特性，例如大小、密度、電荷、細胞定位或其組合而分離。可使用本領域已知的許多技術進行該分離。
示范性地但不限于，可用于制備包含胞質蛋白質的蛋白質制品的方法提供如下將來源于患者活體檢查的可能為腫瘤細胞的細胞或體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，或受到病原體感染的細胞，懸浮在包含30mM碳酸氫鈉，pH7.5，1mM PMSF的3體積1×裂解緩沖液中，在冰上孵育20分鐘，并隨后將低滲溶脹的細胞在dounce勻漿器中均質化直到＞95％細胞裂解。作為剪切作用的替代，可在冰上超聲處理細胞直到通過顯微鏡檢查確定＞99％的細胞裂解。當使用超聲處理時，在超聲處理前將細胞懸浮在例如可包含1mM PMSF的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的緩沖液中。
然后將該裂解物在1,000×g離心10分鐘以除去完整的細胞、細胞核和其他細胞碎屑。將所得到的上清液在大約100,000×g再次離心大約1小時，并回收上清液?？梢詫?00,000×g的上清液相對于PBS或其他合適的緩沖液于4℃透析36小時(3次，每次100倍體積)，以提供本發(fā)明的可溶解的胞質蛋白質。如有必要，制品中的不溶性物質可以通過過濾或低速離心除去。
如下示范性地提供但不限于，可用于制備包含膜-衍生的蛋白質的蛋白質制品的方法將來源于患者活體檢查的可能為腫瘤細胞的細胞或體外培養(yǎng)的腫瘤細胞或受到病原體感染的細胞懸浮在包含30mM碳酸氫鈉，pH 7.5，1mM PMSF的3體積1×裂解緩沖液中，在冰上孵育20分鐘，并隨后將低滲溶脹的細胞在dounce勻漿器中均質化直到＞95％細胞裂解。作為剪切作用的替代，可在冰上超聲處理細胞直到通過顯微鏡檢確定＞99％的細胞裂解。當使用超聲處理時，在超聲處理前將細胞懸浮在例如可包含1mM PMSF的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的緩沖液中。
然后將裂解物在100,000×g離心10分鐘以收集細胞膜。膜衍生的蛋白質可從脂雙分子層取出并且通過將沉淀顆粒再懸浮于含有1％脫氧膽酸鈉(無Ca2+和Mg2+)的5體積PBS中并且在冰上孵育1h而從100,000g的沉淀顆粒(膜衍生的蛋白質位于其中)中分離出來。將所得到的懸浮液于20,000g離心30分鐘，以及收獲所得到的上清液并相對于幾種PBS的代替物(也無Mg2+和Ca2+)透析以除去去污劑。將所得到的透析液在100,000g離心90分鐘并進一步純化上清液。然后將鈣和鎂都加入上清液達到2mM的終濃度。如有必要，可以通過過濾或低速離心將制品中的不溶性物質除去。
在具體的實施方案中，從抗原性細胞獲得的胞質和/或膜衍生的蛋白質群可不經蛋白酶處理或更進一步的提取或選擇過程而直接結合hsp。備選地，蛋白質可在結合前受到蛋白酶處理。
5.12.2抗原性肽的制備根據本發(fā)明，可任選地消化從抗原性細胞獲得的胞質和膜衍生的蛋白質以產生抗原性的肽。在一個實施方案中，胞質或膜衍生的蛋白質分別被用于消化。在另一個實施方案中，胞質蛋白質和膜衍生的蛋白質在消化反應中組合以產生抗原性的肽。在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶消化中所使用的蛋白質制品沒有經受任何從抗原性細胞或抗原性細胞的細胞質或膜的另一種蛋白質中選擇性地除去或保留一種或多種特定蛋白質的制備方法。
多種蛋白酶或蛋白水解酶可用于本發(fā)明以從抗原性細胞的蛋白質制品生產包含抗原性肽的肽群。酶促消化可個別進行或適當地與任何本領域公知的蛋白水解酶組合進行，這些酶包括但不限于胰蛋白酶、葡萄球菌肽酶I(又名蛋白酶V8)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶G、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。胰蛋白酶是切割賴氨酸和精氨酸的羧基末端側鏈的高度特異的絲氨酸蛋白酶。由于切割位點數目的限制，預期留下許多MHC-結合的完整表位。葡萄球菌肽酶I是絲氨酸蛋白酶，具有在谷氨酸和天冬殘基后切割的特異性。消化可使用單個蛋白酶或蛋白酶的混合物進行。將所使用的蛋白酶或蛋白水解酶在適合于該特定酶的條件下孵育。優(yōu)選地，酶是純化的。非酶催化的方法，例如溴化氰裂解，也可用于產生肽?？蓪⒋牡鞍踪|制品等分成各自使用不同酶的多元反應，并且所得到的肽可任選地匯集在一起備用。在酶促反應中可不必完全消化該蛋白質。這些反應導致產生存在于蛋白質制品中的各自蛋白質的互異的和不同組的肽。當抗原性肽結合hsps時，生產不同的肽組提供了產生能夠針對蛋白質制品中的抗原誘導免疫應答的抗原性肽的更大的可能性。在優(yōu)選的實施方案中，將待消化的蛋白質制品等分成2個分離的反應并且使用2種不同的蛋白水解酶產生存在于蛋白質制品中的蛋白質的2組不同的肽。根據蛋白質、酶和反應條件，未消化的蛋白質可在反應中保留。在優(yōu)選的實施方案中，分別使用胰蛋白酶和葡萄球菌肽酶I以消化蛋白質制品。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，酶促消化在該肽結合hsps前終止。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以使用抑制劑來終止酶促消化。可以在本發(fā)明中使用的酶促抑制劑包括但不限于PMSF、苯丁抑制素、抑氨肽酶肽、亮抑酶肽和半胱氨酸蛋白酶抑制劑，取決于在蛋白質消化中所使用的酶。大部分蛋白酶的抑制劑是本領域中公知的。備選地，另一個終止酶促消化的方法是通過從反應中以物理方式除去酶。這可以通過將所選擇的酶結合到例如樹脂的固相上，或結合到可以通過公知的方法例如離心或過濾而容易地從反應中除去的物質上來進行。容許蛋白質制品接觸或流經固相一段時間。這種固定化的酶可商業(yè)上購買或可以通過本領域公知的用于固定化酶的方法生產。
在消化反應的末尾，可任選地在制備中將肽從低分子量的物質，例如二肽或單個的氨基酸殘基分離。任選地，可以通過肽的普遍的生物化學和/或生物物理學特性，例如大小、電荷或其組合而分離肽?？梢允褂帽绢I域已知的任何技術進行分離。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，內源性性存在于抗原性細胞中的肽可單獨或與通過蛋白水解消化胞質和膜衍生的蛋白質而產生的肽結合用于本發(fā)明。內源性性存在于抗原性細胞中的肽包括體內結合hsp和/或MHC類型I和II的分子的肽。根據本發(fā)明，這種直接分離自抗原性細胞的蛋白質制品的肽可結合hsps。
在一個實施方案中，可在存在ATP或低pH時將抗原性肽從hsp-肽復合物中洗脫下來?？墒褂眠@些實驗條件從可能潛在包含有效的抗原決定簇的細胞中分離肽。一旦分離，可使用常規(guī)的氨基酸測序方法學測定每種抗原性肽的氨基酸序列。然后這種抗原性分子可以通過化學合成或重組方法生產、純化并體外結合hsps。
示范性地但不限于，將可用于從hsp-肽復合物洗脫肽的方法提供如下將令人感興趣的hsp-肽復合物通過Centricon 10裝置(Millipore)離心以除去任何與復合物松散相關的低分子量物質?？沙ゴ蠓肿恿康募壏植⑼ㄟ^SDS-PAGE分析，同時可如下所述通過HPLC對低分子量的級分進行分析。在一個示范性的方法中，將大分子量級分中的hsp-肽復合物與10mM ATP在室溫下孵育30分鐘。在另一個示范性的方法中，將乙酸或三氟乙酸(TFA)加入應激蛋白-肽復合物中達到10％的終濃度(vol/vol)，并且將混合物在室溫下或在沸水浴中或在任何兩者之間的溫度下孵育10分鐘(參見，Van Bleek等人，1990，自然Nature348213-216；和Li等人，1993，EMBO Journal 123143-3151)。
將所得到的樣品如前所述通過Centricon 10裝置離心。回收高和低分子量的級分。剩余的大分子量的應激蛋白-肽復合物可與ATP或于低pH中再孵育以除去任何剩余的肽。
匯集所得到的低分子量級分，通過蒸發(fā)濃縮并溶于0.1％的TFA。然后通過使用例如用0.1％TFA平衡的VYDAC C18反相柱的反相高壓液相色譜法(HPLC)將已溶解的物質分離。然后以大約0.8ml/min的流速通過用0.1％TFA中的0-80％的乙腈線性梯度發(fā)展的柱洗脫未結合物質。肽的洗脫可以通過OD210監(jiān)測并收集含有肽的級分。
在另一個實施方案中，抗原性肽可分離自MHC-肽復合物。從MHC分子分離潛在的免疫原性肽是本領域公知的。參見，例如，Falk等人，1990自然Nature 348248-251；Rotzsche等人，1990自然Nature348252-254 Elliott等人，1990，自然Nature 348191-197；Falk等人，1991，自然Nature 351290-296；Demotz等人，1989，自然Nature 343682-684；Rotzsche等人，1990，科學Science 249283-287，其所公開的內容在此引入作為參考。
在一些實施方案中，MHC-肽復合物可以通過常規(guī)的免疫親和方法分離。然后可以通過將復合物在存在大約0.1％TFA的乙腈中孵育而將該肽從MHC-肽復合物洗脫出來?？煞蛛x洗脫的肽并通過反相HPLC純化。所洗脫的肽的氨基酸序列可以通過本領域公知的手工或自動的氨基酸測序技術而確定。一旦潛在保護的肽的氨基酸序列已經確定，可使用本領域公知的常規(guī)的肽合成或其他的方法而大量合成該肽。
與上述分離的肽具有相同的氨基酸序列的肽可使用與由Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所描述的相似方法通過固相肽合成法合成。在合成期間，將具有受保護的側鏈的N-α-保護的氨基酸逐步加入通過其C-末端連接的延伸的多肽鏈和不溶的聚合支持物，即聚苯乙烯珠?？梢酝ㄟ^連接N-α-去保護的氨基酸和已通過將其與例如二環(huán)己基碳二亞胺的試劑反應而活化的N-α-保護的氨基酸的羧基來合成肽。將自由氨基連接到活化的羧基上導致肽鍵的形成。通常所使用的N-α保護基包括酸不穩(wěn)定的Boc和堿不穩(wěn)定的Fmoc。
在一個實施方案中，將C末端的N-α-保護的氨基酸首先附著于聚苯乙烯珠上。然后除去N-α-保護基。去保護的α-氨基與緊鄰的N-α-保護的氨基酸的活化的α-羧基偶聯。重復該方法直到合成所需要的肽。然后將所得到的肽從不溶的聚合支持物上切割下來并且將氨基酸側鏈去保護。更長的肽可以通過縮合受保護的肽片段而得到。詳細的合適的化學物質、樹脂、保護基、受保護的氨基酸和試劑是本領域公知的(參見，Atherton等人，1989，Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，PeptideChemistry，A Practical Textbook，第二版，Springer-Verlag)。
所得到的肽的純化使用常規(guī)方法完成，例如使用凝膠滲透、分配的制備性的HPLC和/或離子交換色譜法完成。合適的基質和緩沖液的選擇是本領域公知的，因此在此不詳細描述。
5.12.3外源的抗原性分子顯示病原體或癌癥的腫瘤特異性的已知抗原或與腫瘤相關抗原的抗原性的分子，例如其抗原或抗原性的部分，可被選擇用作抗原性的分子以用于結合熱休克蛋白。本領域已知的幾個測定方法可用于測定免疫原性或抗原性，包括但不限于，使用例如放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、″三明治″免疫測定、免疫放射測定法、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、體內免疫測定(例如使用膠態(tài)金、酶或放射性同位素標記)、蛋白質印跡、免疫沉淀反應、凝集測定(例如，凝膠凝集測定、血細胞凝集測定)、補體固定測定、免疫熒光測定、蛋白質A測定和免疫電泳測定等技術的競爭性的和非競爭性的測定系統。在一個實施方案中，抗體結合是通過檢測第一抗體上的標記而檢測的。在另一個實施方案中，第一抗體是通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結合而檢測。在進一步的實施方案中，第二抗體是標記的。許多用于檢測免疫測定中的結合的方法是本領域中已知的并且預期可被使用。在一個用于檢測免疫原性的實施方案中，T細胞介導的應答可以通過標準方法測定，例如通過體外細胞毒性測定或體內延遲型超敏性測定來測定。
用作抗原性分子的潛在有效的抗原或其衍生物也可以通過多種標準鑒定，例如在病原體傳染性的中和中抗原的涉及(其中需要治療或預防這種病原體的感染)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner等人(編輯的)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，第388-389頁)、類型或種群的專一性、經患者抗血清或免疫細胞的識別，和/或抗血清或免疫細胞的特異于該抗原的保護效應的證明。此外，當需要治療或預防由病原體引起的疾病時，抗原的編碼表位應優(yōu)選及時地或在相同病原體的不同分離物之間顯示小的或沒有抗原變異的程度。
5.13 HSP/抗原性分子復合物的體外生產在不使用hsps和與其在體內的內源性相關的肽的特異復合物的實施方案中，hsps和抗原性分子的復合物是體外生產的。如本領域的技術人員所認識到的，通過上述方法分離或化學合成或重組產生的肽可與多種純化的天然的或體外重組的應激蛋白重新構成以產生免疫原性的非共價的應激蛋白-抗原性分子的復合物。備選地，外源性的抗原或抗原性的或免疫原性的片段或其衍生物可結合應激蛋白以用于本發(fā)明的免疫治療疫苗或預防疫苗。優(yōu)選地，用于體外結合應激蛋白和抗原性分子的示范性的方法如下論述。
在結合前，將hsps用ATP或低pH預處理以除去與令人感興趣的hsp相關的任何肽。當使用ATP方法時，通過加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，如Levy等人，1991，細胞Cell 67265-274所描述的而將過量的ATP從制品中除去。當使用低pH方法時，通過加入pH改變試劑而將緩沖液再調節(jié)到中性的pH。
混合抗原性的分子(1μg)和預處理的hsp(9μg)以達到大約5個抗原性分子1個應激蛋白的摩爾比率。然后，將混合物于4℃-45℃在例如含有20mM磷酸鈉，pH 7.2，350mM NaCl，3mM MgCl2和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的適當的結合緩沖液中孵育15分鐘-3小時。將該制劑通過Centricon 10裝置(Millipore)離心以除去任何未結合的肽。肽與應激蛋白的結合物可以通過SDS-PAGE進行測定。這是用于體外結合分離自從內源性的hsp-肽復合物解離的肽的MHC-肽復合物的優(yōu)選方法。
在本發(fā)明的，例如但不限于，并且優(yōu)選用于生產hsp70和外源抗原性分子例如蛋白質的復合物的備選實施方案中，將5-10微克純化的hsp與等摩爾量的抗原性分子在100微升體積的20mM磷酸鈉緩沖液pH7.5，0.5M NaCl 3mM MgCl2和1mM ADP中于37℃孵育1hr。進一步將該孵育的混合物在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋到1ml。
在本發(fā)明的，例如但不限于，并且優(yōu)選用于生產gp96或hsp90和肽的復合物的備選實施方案中，將5-10微克純化的gp96或hsp90與等摩爾量的或過量的抗原性肽在例如含有20mM磷酸鈉緩沖液pH 7.5，0.5M NaCl，3nM MgCl2的適當緩沖液中于50-65℃孵育5-20分鐘。將該孵育的混合物冷卻到室溫并且如有必要通過Centricon 10裝置(Millipore)離心一或多次以除去任何未結合的肽。
結合后，可任選地使用例如如下所述的混合的淋巴細胞靶細胞測定(MLTC)對免疫原性的應激蛋白-抗原性分子復合物進行體外測定。一旦免疫原性的復合物已經被分離，可使用優(yōu)選的給藥方法和如下所述的賦形劑進一步在動物模型中任選地表征它們。
5.14HSPs和抗原性分子的寡聚化本發(fā)明的寡聚劑可以是本領域中已知的促進2個或多個hsps或hsps和抗原性分子復合物的寡聚化的任何化合物。所使用的寡聚劑包括通過共價結合來促進寡聚化的分子和通過非共價結合熱休克蛋白或hsp-抗原性分子復合物來促進寡聚化的分子。一般地，通過共價結合來促進兩個或多個部分之間寡聚化的寡聚劑被稱作“交聯劑”或“交聯制劑”。交聯劑是一般可與特定的化學基團發(fā)生反應，以容許2個或多個部分結合而產生寡聚物的化合物。
交聯劑可以是雙官能團的；即它們包含2個可發(fā)生反應的基團，可與2個不同的部分或同一部分的2個區(qū)域反應或共價連接，或是多官能團的，例如三官能團的。此外，交聯劑可以是同功能的(例如，同源雙功能的)或異功能的(例如異雙功能的)。在同雙功能的交聯制劑中，反應性基團是相同的并且這些試劑偶聯類似的功能基團。在異雙功能的交聯制劑中，反應基團具有不同的化學特性，容許不同功能的基團之間形成交聯。下面論述幾種示范性的同雙功能和異雙功能的交聯制劑。
在此所使用的術語“寡聚劑”也包括促進免疫治療部分，例如通過非共價結合的熱休克蛋白的寡聚的試劑。這種寡聚劑的實例，包括但不限于雙價(或雙特異性)抗體。生物素化和半抗原化試劑以及其同源的結合伴侶被認為是交聯試劑或非共價的寡聚劑。這些試劑交聯或共價結合有待寡聚的靶物的生物素或半抗原部分。共價修飾的靶物上的生物素或半抗原部分隨后非共價地與可附著于其他靶分子上的抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白(生物素)或免疫球蛋白G(IgG)相互作用?？股锼氐鞍住㈡溍箍股锼氐鞍?、結合中性抗生物素蛋白生物素的蛋白和結合捕獲抗生物素蛋白生物素的蛋白可緊密地結合至多4個分子的生物素化的靶物而IgG可結合至多2個半抗原。
本發(fā)明提供用于偶聯第一熱休克蛋白分子和第二熱休克蛋白分子的化學交聯試劑，其中第一和第二熱休克蛋白分子可以是，但不必一定是相同的。在一個實施方案中，交聯試劑是同雙功能交聯試劑，并且一般將第一熱休克蛋白分子上的胺基或巰基分別偶聯至第二熱休克蛋白分子上的胺基或巰基上。同雙功能的交聯試劑包括，例如同雙功能的胺交聯劑，比如戊二醛、雙(亞胺基酯)、雙(琥珀酰亞胺酯)、二異氰酸鹽(酯)和二酰氯。同雙功能交聯試劑的實例包括但不限于對疊氮苯基乙二醛一水合物(APG)、1，8-雙-馬來酰亞胺三亞乙基二醇(BM[PEO]3)、3，3’-二硫代二[硫代琥珀酰亞胺基丙酸酯]；(DTSSP)、雙[2-(硫代琥珀酰亞胺氧羰基氧基)乙基]砜(硫代-BSOCOES)、二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽(DSS)、乙二醇二[硫代琥珀酰亞胺基琥珀酸酯](硫代-EGS)、N，N’-二(3-馬來酰亞胺基丙?；?-2-羥基-1，3-丙二胺、PEG二(對-硝基苯基碳酸酯)和辛二酸二甲基酯二鹽酸鹽(DMS)。上述及其他同雙功能交聯劑都可從商業(yè)上購買，例如，Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技術有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)。根據在此所公開的內容，本領域的技術人員將能夠選擇或設計其他的交聯劑用于本發(fā)明的應用。
在另一個實施方案中，交聯劑是聚乙二醇(“PEG”)，優(yōu)選具有衍生的偶聯或激活部分(例如硫醇、三氟甲磺酸酯、tresylate、aziridune、環(huán)氧乙烷或優(yōu)選馬來酰亞胺)。例如馬來酰亞胺基一甲氧基PEG的化合物是示范性的活化的PEG化合物。其他的實例包括，一甲氧基聚(乙二醇)-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)或NHS-聚(乙二醇)-馬來酰亞胺(PEG-MAL)。本發(fā)明包括使用PEG連接劑交聯第一和第二熱休克蛋白分子。
在另一實施方案中，交聯劑是異雙功能交聯劑，并且一般使第一熱休克蛋白分子上的胺基偶聯第二熱休克蛋白分子上的巰基或相反進行。異雙功能交聯劑的實例包括但不限于N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sSMCC)、2-亞氨基硫代環(huán)戊烷(Traut’s試劑)、N-[α-馬來酰亞胺基乙酰氧基]琥珀酰亞胺酯(AMAS)、N-β-馬來酰亞胺基丙酸(BMPA)、N-[β-馬來酰亞胺基丙酸]酰肼·TFA(BMPH)、1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、[N-e-馬來酰亞胺基己酰氧基]琥珀酰亞胺酯(EMCS)、N-[g-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)；間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)和N-琥珀酰亞胺碘代乙酸酯(SIA)。上述及其他同雙功能交聯劑都可商業(yè)上購買，例如從Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技術有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)購買。根據在此所公開的內容，本領域的技術人員將能夠選擇或設計其他的交聯劑用于本發(fā)明的應用。
在另一實施方案中，交聯制劑是三官能團的。三官有團交聯劑的每個分子具有3個不同的反應性或結合基團，并且可寡聚例如熱休克蛋白的3個不同的生物分子。三官能團交聯劑的實例包括但不限于β-[三(羥甲基)膦基]丙酸(THPP)和三-琥珀酰亞胺基胺基三乙酸(TSAT)。上述及其他同雙功能的交聯劑都可商業(yè)上購買，例如Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技術有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)。根據在此所公開的內容，本領域的技術人員將能夠選擇或設計其他的交聯劑用于本發(fā)明的應用。
本發(fā)明的交聯劑是指可促進2個或多個熱休克蛋白分子之間寡聚的任何化合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的交聯劑是線性的或支鏈的取代的脂肪族的化合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的交聯劑是環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基或取代的雜環(huán)烷基。在一個實施方案中，交聯劑是光活性的。
在一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑是鏈霉抗生物素蛋白-生物素連接劑。在該實施方案中，生物素可與第一熱休克蛋白結合，同時抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可與第二熱休克蛋白結合。生物素對抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白的強親和力導致生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素蛋白的穩(wěn)定結合，這種結合又可促進與生物素和抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白綴合的熱休克蛋白分子的寡聚化。在一些實施方案中，第一和第二熱休克蛋白分子是相同的。
在另一實施方案中，寡聚劑是多價的，例如，雙價(也稱作雙特異性)抗體。雙特異性抗體非共價地結合第一和第二蛋白質例如熱休克蛋白，其中該抗體對于蛋白是特異性的，并以此促進第一和第二蛋白質的寡聚。在一些實施方案中，第一和第二蛋白質是相同的。
根據本發(fā)明，所使用的寡聚劑并不破壞例如hsp-肽復合物的熱休克蛋白部分的免疫調節(jié)活性。在一個實施方案中，寡聚劑不破壞例如肽的抗原性分子與熱休克蛋白的結合。在另一實施方案中，寡聚劑不破壞hsp與其受體的結合。在另一實施方案中，寡聚劑在中性pH下是活化并有功能的。
根據上面所公開的內容，其他用于促進熱休克蛋白寡聚的寡聚劑對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。上述所公開的，以及可從例如Sigma(St.Louis，MO；參見Sigma目錄，2002-2003，第573-580頁)，Pierce生物技術有限公司(Rockford，IL；參見PierceBiotechnology，Inc.目錄，2001-2002，第294-334頁)或MolecularProbes(Eugene，OR；參見Molecular Probes手冊，第9版，2002，第5章)的幾個公司商業(yè)購買的其他交聯劑，每種都在此全部引入作為參考。
在本發(fā)明具體的實施方案中，某些化合物不能用作寡聚劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不是凝集素。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑是凝集素。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不是戊二醛。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不是硫代琥珀酰亞胺基(4-疊氮基水楊酰氨基)己酸酯(“SASD”)。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不能是BAG家族蛋白的成員(參見Takayama和Reed，2001，自然細胞生物學Nature Cell Biology 3E237-E241)。
在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不是4，4′-雙苯胺基-1，1′-聯萘-5，5′-二磺酸(“雙-ANS”)、1，8-苯胺基萘磺酸鹽(″8-ANS″)或N-乙基羧酰胺基腺苷(″NECA″)。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚劑不是包含腺苷部分或其結構類似物的化合物。腺苷部分的結構類似物包括在腺苷的2’、3’和5’位具有任何種類的取代的分子(參見Gewirth等人，美國專利申請公開No.2002/0160496)。
5.15 HSP-肽復合物免疫原性的測定任選地，本發(fā)明的特異復合物和稀釋的復合物都可以使用本領域已知的任何方法測定免疫原性。例如但不限于，可使用下列方法中的一種。
5.15.1 MLTC分析簡要地，使用任何便利的給藥途徑將一定量特異的或稀釋的hsp-肽復合物注射小鼠。作為陰性對照，用，例如用作非特異的或稀釋的復合物的hsp-肽復合物給其他小鼠注射。已知含有特定抗原的細胞，例如腫瘤細胞或受傳染性疾病的因子感染的細胞，可以作為該分析的陽性對照。在7-10天內給小鼠分開注射兩次。在最后免疫的十天后取出脾臟并釋放淋巴細胞。釋放的淋巴細胞可隨后在體外通過加入表達令人感興趣的抗原的死細胞而受到再刺激。
例如，8×106的免疫脾細胞可用4×104的絲裂霉素C處理而刺激或在含10％胎牛血清的3ml的RPMI培養(yǎng)基中，γ-照射(5-10,000rads)含有令人感興趣的抗原(或轉染合適基因的細胞，根據具體情況而定)的細胞而刺激。在某些情況下，可以將33％次級混合的淋巴細胞培養(yǎng)上清液包括在培養(yǎng)基中，以作為T-細胞生長因子的來源(參見Glasebrook等人，1980，J.Exp.Med.151876)。為了檢測免疫后初級細胞毒素的T-細胞應答，可將脾細胞無刺激培養(yǎng)。在一些實驗中，也可用抗原性明確的細胞再刺激免疫小鼠的脾細胞，以測定細胞毒素的T-細胞應答的特異性。
六天后在4小時的51Cr-釋放測定中(參見Palladino等人，1987，Cancer Res.475074-5079和Blachere等人，1993，免疫治療雜志J.Immunotherapy 14352-356)檢測培養(yǎng)物的細胞毒性。在測定中，將混合的淋巴細胞培養(yǎng)物加入靶細胞懸液以達到不同的效應子靶(E∶T)比率(通常為1∶1-40∶1)。通過將1×106的靶細胞在含有20mCi51Cr/ml的培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1小時而預標記靶細胞。標記后將細胞洗滌三次。每個測試點(E∶T)比率重復進行三次，并且引入合適的對照以測量自發(fā)的51Cr釋放(未在測定中加入淋巴細胞)和100％的釋放(用洗滌劑裂解細胞)。培養(yǎng)細胞混合物4小時后，以200g離心細胞5分鐘而沉淀。釋放到上清液中的51Cr的量由γ計數器測量。細胞毒性百分數是將測試樣品中的cpm減去自發(fā)釋放的cpm，除以總的洗滌劑釋放的cpm減去自發(fā)釋放的cpm而測量的。
為了阻斷MHC I類級聯反應，將來源于K-44雜交瘤細胞(抗-MHCI類雜交瘤)的濃縮的雜交瘤上清液加入測試樣品中至終濃度為12.5％。
5.15.2 CD4+T-細胞增殖測定初級T-細胞來源于脾、新鮮的血液或CSF，并使用FICOLL-PAQUE PLUS(Pharmacia，Upsalla，Sweden)離心純化，其基本的描述在Kruse和Sebald，1992，EMBO J.113237-3244中。將外周血單核細胞與表達抗原性分子的細胞裂解物一起培養(yǎng)7-10天?？扇芜x地，在測定前24-48小時將抗原呈遞細胞加入培養(yǎng)物，以保證在裂解物中含有并提供抗原。然后離心收獲細胞，并在RPMI 1640培養(yǎng)基(GibcoBRL，Gaithersburg，Md.)中洗滌。將5×104的活化的T-細胞/孔(PHA-胚細胞)在含有10％胎牛血清，10mM HEPES，pH 7.5，2mM L-谷氨酸，100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素硫酸鹽的RPMI 1640培養(yǎng)基中在96孔板上于37℃培養(yǎng)72小時，用1μCi3H-胸苷(DuPont NEN，Boston，Mass.)/孔脈沖6小時，收獲，并在TOPCOUNT閃爍計數器(Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.)中測定放射性。
5.15.3抗體應答分析在本發(fā)明的某個實施方案中，通過測定對接種復合物的應答中產生的抗體而確定hsp-肽復合物的免疫原性。在實施方案的一個模式中，將微量滴定板(96-孔免疫平板II，Nunc)用50μl/孔在疫苗(例如Aβ42)中所使用的0.75μg/ml純化的非-hsp-復合物形式的肽，在PBS中于4℃鋪被16小時以及在20℃鋪被1小時。將孔排空并且每孔用200μl的PBS-T-BSA(含有0.05％(v/v)TWEEN 20和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)在20℃封閉1小時，然后用PBS-T洗滌三次。加入50μl/孔的血漿或來源于接種動物的CSF(例如模型小鼠或患者)在20℃施用1小時，并且將平板用PBS-T洗滌三次。然后在與50μl/孔的羊抗鼠或抗人免疫球蛋白于20℃孵育1小時后，量熱測定抗肽的抗體活性，視情況而定，與在PBS-T-BSA中稀釋為1∶1,500的辣根過氧化酶(Amersham)和(如上用PBS-T進一步洗滌三次后)50μl的鄰苯二胺(OPD)-H2O2底物溶液連接。5分鐘后加入150μl的2M H2SO4中止反應，并在Kontron SLT-210光度計(SLT Lab-instr.，Zurich，瑞士)中于492nm測定光吸收值(參照為620nm)。
5.15.4細胞因子檢測分析針對本發(fā)明的hsp-肽復合物的CD4+T細胞增殖應答可以通過檢測和定量特定細胞因子的水平來測定。在一個實施方案中，例如，可使用IFN-γ檢測分析來測定胞內細胞因子以檢驗本發(fā)明復合物的免疫原性。在這種方法的實例中，將來自用hsp-肽復合物治療的受試個體的外周血單核細胞用給定腫瘤的肽抗原或傳染性疾病因子的肽抗原刺激。然后使用通過流式細胞儀檢測的T-細胞特異性標記的抗體將細胞染色，例如結合FITC的抗CD8和PerCP-標記的抗CD4抗體。洗滌后，將細胞固定，滲透化并和與人IFN-γ(PE-抗-IFN-γ)反應的染料標記的抗體反應。使用標準技術經流式細胞儀分析樣品。
備選地，過濾免疫分析、酶聯免疫點分析(ELISPOT)測試都可用于檢測T-細胞周圍的特定細胞因子。在一個實施方案中，例如，將硝酸纖維素支持的微量滴定板用純化的細胞因子特異性初級抗體，即抗-IFN-γ鋪被，并且封閉平板以避免由于非特異性結合其他蛋白質而產生的背景。將含有從用hsp-肽復合物治療的受試個體得到的分泌細胞因子的細胞的單核血細胞樣品稀釋到微量滴定板上。加入標記的，例如生物素標記的、次級抗細胞因子抗體。然后可以檢測抗體細胞因子復合物。與酶結合的鏈霉抗生物素蛋白-細胞因子-分泌細胞可以通過可見的、顯微鏡的或電子檢測方法而顯示出“點”。
5.15.5四聚體分析在另一實施方案中，可使用“四聚體染色法”分析(Altman等人，1996，Science 27494-96)來鑒定抗原特異性的T-細胞。例如，在一個實施方案中，包含特異的肽抗原，例如腫瘤特異性抗原的MHC分子可多聚化形成可溶性的肽四聚體，并且例如通過與鏈霉抗生物素蛋白結合而標記。然后MHC-肽抗原復合物與獲得自用hsp-肽復合物治療的受試個體的T-細胞群混合。可以使用生物素染色表達令人感興趣的抗原，即腫瘤特異性抗原的T-細胞。
5.16與過繼性免疫療法的結合過繼性免疫治療是指治療癌癥或傳染性疾病的治療方法，其中將免疫細胞施用于宿主，以便細胞根據具體情況，直接或間接介導對腫瘤細胞和/或抗原成分的特異免疫或腫瘤抑制或傳染病治療。(參見1999年11月16日公開的美國專利號5,985,270，其在此全部引入作為參考)。作為任選的步驟，根據在此所描述的方法，將APC用與抗原性(或免疫原性)分子復合的hsp敏化并用于過繼性免疫治療。
在具體的實施方案中，使用任何給藥途徑，通過施用稀釋的復合物的治療可任選地與使用hsp-抗原性分子復合物敏化的APC的過繼性免疫療法結合。Hsp-肽復合物-敏化的APC可以單獨給藥，也可以與稀釋的hsp-肽復合物結合給藥，或在稀釋的hsp-肽復合物給藥前或后給藥。此外，給藥的方式可以變化，包括但不限于，例如皮下、靜脈內或肌肉內給藥，盡管皮內或粘膜給藥是優(yōu)選的。
5.16.1獲得巨噬細胞和抗原呈遞細胞抗原呈遞細胞，包括但不限于巨噬細胞、樹突細胞和B-細胞，如Inaba，K.等人，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702所描述的，優(yōu)選通過在體外從人外周血細胞或骨髓的干細胞和祖細胞產生而獲得。
APC可以通過本領域已知的多種方法獲得。在優(yōu)選的方面，使用從人血細胞中獲得的人巨噬細胞。例如但不限于，巨噬細胞可如下獲得將單核細胞通過Ficoll-Hypaque梯度離心從患者(優(yōu)選為待治療的患者)的外周血分離，并接種到用患者自身的血清或其他AB+人血清預先鋪被的組織培養(yǎng)皿中。在37℃培養(yǎng)細胞1小時，然后吸去未粘附的細胞。對于留在培養(yǎng)皿中的粘附細胞，加入冷的(4℃)含1mM EDTA的磷酸鹽緩沖液，并在室溫放置15分鐘。收獲細胞，用RPMI緩沖液洗滌，并懸浮在RPMI緩沖液中。如Inaba，K.等人，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702中所描述的細節(jié)，可以通過在37℃與巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)一起培養(yǎng)而獲得數目增加的巨噬細胞；通過與粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)一起培養(yǎng)而獲得數目增加的樹突細胞。
5.16.2用hsp-肽復合物敏化巨噬細胞和APCs可以用結合抗原性分子的hsp，優(yōu)選通過將細胞與復合物在體外培養(yǎng)而敏化APCs。將APC用hsp和抗原性分子的復合物，通過在體外與hsp-復合物于37℃培養(yǎng)15分鐘至24小時而敏化。例如但不限于，4×107的巨噬細胞可在1ml的簡單RPMI培養(yǎng)基中，與每毫升10微克的gp96-肽復合物或每毫升100微克的hsp90-肽復合物在37℃培養(yǎng)15分鐘至24小時。將細胞洗滌三次，并重懸在優(yōu)選為無菌的生理培養(yǎng)基中，達到便于給患者注射的濃度(例如1×107/ml)。優(yōu)選地，被注射敏化的APCs的患者就是最初從中分離APC的患者(自體同源的實施方案)。
任選地，敏化的APCs刺激例如，抗原特異性的、I型限制性的細胞毒素T-淋巴細胞(CTL)的能力可以通過它們刺激CTLs釋放腫瘤壞死因子的能力，以及它們作為這種CTLs的靶物的能力來進行監(jiān)測。
5.16.3敏化的APC的再注入將hsp-抗原性分子-敏化的APCs通過常規(guī)的臨床方法，優(yōu)選為靜脈方式再次注入患者體內。再次注入這些活化的細胞，優(yōu)選通過全身給藥進入自體同源的患者體內。根據患者的病況，患者通常接受大約106到大約1012的敏化的巨噬細胞。在一些療法中，患者可任選地接受附加的合適劑量的生物應答調節(jié)劑，包括但不限于細胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其他細胞生長因子。
5.17被動免疫治療本發(fā)明的組合物也可用于被動免疫治療癌癥和傳染病。被動免疫是對宿主的短期保護，通過施用針對異源生物體的預先形成的抗體而實現。例如，包括從受到傳染性生物體感染的細胞獲得的稀釋的hsp-肽復合物的本發(fā)明的組合物，可用于激發(fā)受試個體的免疫應答，從受試個體中分離血清，并用于治療或預防在另一受試個體中由傳染性生物體導致的疾病。
5.18疾病的預防和治療根據本發(fā)明，將本發(fā)明的組合物，包括例如來源于抗原細胞的消化的胞質和/或膜-衍生的蛋白質或病毒顆粒的肽的抗原性肽和hsp的復合物，施用于患有癌癥或傳染病的受試個體。在一個實施方案中，“治療”或“處理”是指癌癥或傳染病或至少其中一種的可識別癥狀的改善。在另一實施方案中，“治療”或“處理”是指改善至少一種與癌癥或傳染病相關的可測量的物理參數，而不必讓受試個體覺察到。在另一實施方案中，“治療”或“處理”是指抑制癌癥或傳染病的進展，或是身體上的，例如，可識別癥狀的穩(wěn)定，或是生理上的，例如，物理參數的穩(wěn)定，或兩者皆是。
在某些實施方案中，將本發(fā)明的組合物施用于受試個體，作為預防癌癥或傳染病的措施。如在此所使用的，“預防”或“防止”是指減少患已知癌癥或傳染病的風險。在實施方案的一個模式中，本發(fā)明的組合物作為預防措施而施用于遺傳性的易患癌癥的個體。在實施方案的另一模式中，本發(fā)明的組合物作為預防措施而施用于暴露于致癌物質的個體，其中致癌物質包括但不限于化學試劑、放射線、香煙煙霧或其組合，或施用于暴露于傳染疾病因子的個體。在特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物作為預防措施而施用于周圍環(huán)境暴露在致癌物質，例如香煙煙霧中的個體。
例如，在某些實施方案中，本發(fā)明組合物的給藥，相對于缺乏所述的組合物時的生長，導致將癌細胞的生長或傳染因子抑制或減緩了至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
根據本發(fā)明的方法制備的組合物包括熱休克蛋白和抗原肽群的復合物。該組合物顯示在腫瘤位點誘導炎癥反應并最終可以導致所治療的癌癥患者中腫瘤負荷的消退。根據本發(fā)明的方法制備的組合物可以增強受試個體的免疫競爭性并激發(fā)針對傳染因子的特異性免疫或針對前腫瘤細胞和腫瘤細胞的特異性免疫。這些組合物能夠阻止傳染病的發(fā)作和進展，并抑制腫瘤細胞的生長和擴展。
結合治療是指使用其他形式的hsp-肽復合物或本發(fā)明的組合物來預防或治療癌癥和傳染病。本發(fā)明組合物的給藥可以增加抗癌試劑或抗傳染的效果，并且反之亦然。優(yōu)選地，該另外的形式不是基于hsp的形式，即這種形式不包括熱休克蛋白作為成分。這種方法通常被稱為聯合治療、附加治療或結合治療(在此該術語可相互交換)。通過聯合治療，可觀察到加性效力或加性治療效果。也可預料到協同作用中治療效果大于加性作用。使用聯合治療也可提供比單獨施用治療形式或hsp-肽復合物更好的治療方案。加性或協同效果可容許調節(jié)單一的或兩種形式的劑量和/或劑量頻率以減少或避免不想要的或不利的效應。
在各種特定的實施方案中，聯合治療包括將hsp-肽復合物施用于已經用治療形式治療過的受試個體，其中單獨給藥的該治療形式在臨床上不足以治療該個體，以致于其需要另外有效的治療，例如，該受試個體對無hsp-肽復合物給藥的治療形式不產生應答。在這樣的實施方案中包括的方法，包括將hsp-肽復合物施用于接受治療形式的受試個體，其中所述個體對治療有應答，但是遭受副作用、復發(fā)、形成抗性等。這樣的受試個體可能對單獨使用治療形式不應答或難以控制治療，即至少癌細胞的某些重要部分或病原體并沒有被殺死或它們的細胞分裂沒有受到抑制。當根據本發(fā)明的方法所預期的方式給藥時，本實施方案提供的包括將hsp-肽復合物施用于單獨使用治療形式時難以醫(yī)治的受試個體的本發(fā)明的方法，可以提高治療形式的治療效果。治療形式的效果的確定可以使用本領域已知的方法在體內或體外測定。本領域所接受的難以醫(yī)治的意義在癌癥的上下關系中是眾所周知的。在一個實施方案中，癌癥或傳染病是難以醫(yī)治的或非應答性的，其分別指癌癥細胞或病原體的數目沒有顯著的減少或增加。治療的這些受試個體是接受化療或放療的。
根據本發(fā)明，本發(fā)明的復合物可與許多不同類型的治療模式一起使用。一些這樣的模式對于特定類型的癌癥或傳染病尤其有效。許多其他的模式對免疫系統的功能有作用，并且通常應用于腫瘤形成和傳染病。
在一個實施方案中，本發(fā)明的復合物與一種或多種生物應答調節(jié)劑聯合使用以治療癌癥或傳染病。一組生物反應調節(jié)劑是細胞因子。在一個這樣的實施方案中，將細胞因子施用于接受hsp-肽復合物的受試個體。在另一個這樣的實施方案中，將hsp復合物施用于接受與細胞因子聯合使用的化療試劑的受試個體。在各種實施方案中，可使用一種或多種細胞因子并選自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TNFβ、G-CSF、GM-CSF、TGF-β、IL-15、IL-18、GM-CSF、INF-γ、INF-α、SLC、內皮單核細胞激活的蛋白-2(EMAP2)、MIP-3α、MIP-3β，或MHC基因，例如HLA-B7。另外，細胞因子的其他實例包括TNF家族的其他成員，包括但不限于與TNF-α-相關的誘導凋亡的配體(TRAIL)、與TNF-α-相關的誘導激活的細胞因子(TRANCE)、與TNF-α-相關的凋亡弱誘導劑(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、淋巴毒素α(LT-α)、淋巴毒素β(LT-β)、OX40配體(OX40L)、Fas配體(FasL)、CD27配體(CD27L)、CD30配體(CD30L)、41BB配體(41BBL)、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17，和AITR-L，或其功能部分。參見例如，Kwon等人，1999，Curr.Opin.Immunol.11340-345關于TNF家族的綜述。優(yōu)選地，hsp-肽復合物在治療形式前給藥。在特定的實施方案中，本發(fā)明的一種或多種復合物施用于接受與IL-12聯合用于治療癌癥的環(huán)磷酰胺的受試個體。
在另一實施方案中，本發(fā)明的復合物與一種或多種生物應答調節(jié)劑聯合使用，其中的生物應答調節(jié)劑是多種配體、受體和免疫系統的信號傳導分子的激動劑或拮抗劑。例如，生物應答調節(jié)劑包括但不限于Toll類受體(TLR-2、TLR-7、TLR-8和TLR-9；LPS；，41BB配體、OX40配體、ICOS和CD40的激動劑以及Fas配體、PD1和CTLA-4的拮抗劑。這些激動劑和拮抗劑可以是抗體、抗體片段、肽、與肽類似的化合物和多糖。
在另一實施方案中，本發(fā)明的復合物與作為免疫刺激核酸的一種或多種生物應答調節(jié)劑聯合使用。這類核酸，其中許多是包含沒有甲基化的CpG基序的寡核苷酸，對于脊椎動物淋巴細胞來說是促有絲分裂的，并且已知增強免疫應答。參見Woolridge等人，1997，Blood 892994-2998。這類寡核苷酸在國際專利
發(fā)明者J·R·扎布雷基, C·劉, S·A·蒙克斯, A·瓦塞爾曼, P·K·斯里瓦斯塔瓦 申請人:抗基因公司, 康涅狄格大學健康中心