專利名稱：：用于防止或抑止焙烤食品的烘焙過程中的硬化及其作用的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及一種用以防止或抑止焙烤食品的烘焙過程中的硬化及其相關作用的方法和組合物，包含至少一種中間熱穩(wěn)定和/或熱穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶。
背景技術(shù)：
：消費者喜歡購買新鮮的面包并且他們希望面包能夠長時間保持新鮮。抑止硬化對于焙烤食品原料的生產(chǎn)者來說始終是一個挑戰(zhàn)。面包生產(chǎn)越來越集中化并且離發(fā)送點越來越遠的事實帶給添加劑和配料的發(fā)展更大的壓力以保持面包的柔軟。柔軟的面包卷(softroll)，漢堡包，小圓面包(bun)和面粉糕餅制品也遭遇硬化和失去柔軟性?，F(xiàn)在有許多已知的抑止面包和松軟焙烤制品硬化的配料。脂肪和乳化劑例如經(jīng)蒸餾的單酸甘油酯和stearoyllactylates已經(jīng)被使用了數(shù)十年。單糖，二糖和多糖具有對于水分保持和結(jié)合的積極的影響。水分丟失通常都與硬化有關聯(lián)，并且糖類對于焙烤食品的口感有積極影響，因此減少了硬化的感覺。公知的是淀粉酶對于硬化和淀粉降解具有有益的效果。面包硬化是個復雜的現(xiàn)象。它所被感受得到的是面包皮的柔軟，面包屑的硬化和新鮮面包的氣味的消失。面包屑的硬化不僅是由于如Boussingault((1852)Ann.Chim.Phys.3，36，490)所證明的儲存過程中水分的喪失造成的。它是一些物理-化學過程的結(jié)果。在過去的許多年里，研究者們努力弄清楚這些過程并形成了不同的理論。以前，面包的硬化僅僅歸咎于淀粉的降解(Katz，J.R.(1930)Z.Phys.Chem.，150，37-59)。通過X-光衍射表明面包中的淀粉在儲存過程中形成一種微-晶體結(jié)構(gòu)。后來，表明水溶性淀粉部分在面包硬化過程中減少了(Schoch等(1947)CerealChem.，24，231-249)，其包括在焙烤過程中淀粉顆粒吸收水分。線性直鏈淀粉鏈變得可溶并擴散到水相中。越來越多的直鏈淀粉及時出現(xiàn)在水相中。所以直鏈淀粉被部分地從溶脹的淀粉顆粒中濾出。支鏈淀粉仍然留在這些顆粒中。這個濾出的過程受到可用水分的限制。在冷卻過程中，直鏈淀粉迅速地降解并形成一種凝膠。由于立體化學的干擾，支鏈淀粉的降解據(jù)信包括主要外部支鏈的組合并需要比降解直鏈淀粉更長的時間，假設在硬化過程中突出，在產(chǎn)品冷卻后出現(xiàn)，更慢地聚集。支鏈淀粉形成分子內(nèi)鍵合。淀粉在面包硬化中的顯著作用是通過使用糖酶以減少或減慢焙烤食品的硬化而進一步被揭示。其表明(ConnJ.F.等(1950)CerealChem.，27，191-205)來自細菌或真菌來源的淀粉酶減緩面包硬化的速率，并導致較為松軟的面包屑結(jié)構(gòu)。耐熱性α-淀粉酶或β-淀粉酶的加入是最有效的。然而，這也導致形成粘性面包屑。文獻EP0412607中公開使用耐熱性α-1，6-內(nèi)切葡聚糖酶或α-1，4-外切葡聚糖酶以減少硬化；EP0234858公開了使用一種耐熱性麥芽糖β-淀粉酶以保持面包屑的松軟。然而，仍然不清楚的是抗-硬化作用是由于所產(chǎn)生的糊精還是由于直鏈淀粉、支鏈淀粉以及隨之產(chǎn)生的減少的晶化趨勢的修飾造成的。乳化劑如甘油單油酸酯和sodiumstearoyllactylate的影響似乎證實了面包屑硬化中淀粉的作用(SchusterG.(1985)EmulgatorenfürLebensmittel-SpringerVerlag323-329)。這些導致淀粉構(gòu)象變化的乳化劑和淀粉之間的相互作用是所觀察到的硬化減少的原因。由于在淀粉結(jié)構(gòu)和硬化之間并非一直存在良好的相關性(ZobelH.F.等人(1959)CerealChem.，36，441)，其它面粉組分也被研究。面粉蛋白質(zhì)在面包屑硬化過程中的作用被進行了研究但是發(fā)現(xiàn)它們沒有淀粉重要(Cluskey，J.E.(1959)CerealChem.，36，236-246.)，Dragsdorf，R.D.等人((1980)CerealChem.，57，310-314)研究了面包儲藏過程中淀粉和面筋之間水的遷移。這些作者總結(jié)由于淀粉cristallinity中的變化，其吸收更多的水分，所以水分從面筋中遷移到淀粉中，因此更少的游離水可利用。在最近的研究(Martin等(1991)CerealChem.，68(5)，498-503和503-507)中，看來高分子量糊精不具有對面包屑的抗硬化作用。相反，高DP糊精會涉及和/或形成與蛋白質(zhì)原纖維的氫鍵，因此有效地交聯(lián)面筋。因此，硬化速率被提高了。一般認為稍弱(weaker)面粉中面筋與淀粉顆粒的相互作用更強。這導致面包屑硬化更快。然而更好的面筋質(zhì)量和更強的面粉也導致更高的面包體積并因此得到松軟的面包屑。Axford等人(1968)(引用在Faridi，H.(1985)Rheologyofwheatproducts，AACC，p.263-264))表明面包的比容是衡量硬化的速率和程度的主要因素。所以面筋在面包硬化中的作用仍然是不確定的，少有人進行基于面筋修飾以減緩硬化的嘗試。蛋白酶在焙烤部門得以應用已經(jīng)有很長的歷史。它們大都被面包工人使用以減少機械的面團成熟對于不尋常的強或堅硬的面筋的需求。它們減少面團的粘度并提高生面團的膨脹度。在最后的產(chǎn)品中，它們提高結(jié)構(gòu)的可壓縮性、面包體積和面包顏色。通過某些肽的產(chǎn)生也改善了香味。這些蛋白酶通過酶化而不是通過機械力使得面筋變得醇香。它們減少了面團的稠度，減少了面粉試驗儀的值(farinographvalue)。在焙烤中常使用的蛋白酶來自米曲霉(Aspergillusoryzae)和枯劃芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。到目前為止，與堿性蛋白酶相比，中性的細菌蛋白酶對于面筋更有活性。木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶是從番木瓜、菠蘿和無花果中提取的硫醇-蛋白酶。尤其是，木瓜蛋白酶對于面筋具有特別好的活性。細菌蛋白酶和木瓜蛋白酶，尤其是中性蛋白酶，被用于需要顯著松弛面團的餅干，面包棍和薄脆餅干中。然而，在面包制造中，一種更為溫和的真菌蛋白酶的水解是優(yōu)選的。蛋白酶也有很嚴重的缺點。蛋白酶的作用并不及時受到限制，它在混合后繼續(xù)進行并及時地削弱面團的結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象提高了削弱面團的危險并增加了面團的粘度。有時，它們的作用甚至由于發(fā)酵過程中的pH值下降而提高。在焙烤中蛋白酶的使用需要嚴格控制發(fā)酵量和面團醒發(fā)(proofing)條件。蛋白酶在焙烤中失活(Kruger，J.E.(1987)EnzymesandtheirroleincerealtechnologyAACC290-304)。尤其是中性細菌蛋白酶和木瓜蛋白酶應當被非常小心的定量，因為如果過量會導致面團過度松弛。這可能會導致在進爐之前面團下癟或是減少的面包體積和更加開放的面包屑結(jié)構(gòu)。尤其是在歐洲，其面粉比美國和加拿大的更弱些，過量使用蛋白酶的風險普遍存在。此外，蛋白酶也增加了粘度，這是由于通過水解作用水從面筋中得以釋放(Schwimmer，S.(1981)Sourcebookoffoodenzymology-AVIPublishing，583-584)。這意味著在歐洲實際上蛋白酶并不常使用于面包制作中。文獻EP021179公開一種α-淀粉酶制劑的使用，所述蛋白酶(失活的)與乳化劑一起使用以抑止硬化。Conforti等人((1996)FSTA，96(12)，M0190介紹摘要)在脂肪替代松餅中加入一種包含細菌淀粉酶，真菌淀粉酶和真菌蛋白酶的酶混合物。作為對照的含脂肪的松餅更松軟些。酶的處理降低了硬化速度?？紤]到有淀粉酶，這是不足為奇的。公知的是脂肪酶也軟化面包屑和一定程度減緩面包屑硬化速率(WO94/04035實施例2)。真菌蛋白酶對高溫敏感。它們在大約50℃或更高的中溫至高溫范圍內(nèi)的蛋白水解能力一般是很弱的。有些細菌中性和堿性蛋白酶對高溫處理具有抵抗性。至今為止關于例如在大約60℃高溫范圍能保持良好肽酶活性的具耐熱性的細菌來源的蛋白酶的報道很少見。文獻EP1186658公開由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)屬，尤其是M2-4菌株的細菌產(chǎn)生的該類酶。然而，所公開的酶混合物在大約70℃時完全喪失其活性。源自芽孢桿菌屬(Bacillus)的耐熱性蛋白酶，在去污劑配方中是優(yōu)選的，所述蛋白酶可以對氧化劑耐受。源自芽孢桿菌屬的堿性耐熱性蛋白酶也在洗滌和去污劑配方中使用。木瓜蛋白酶非常耐熱并需要在90℃-100℃下延長加熱以實現(xiàn)失活。菠蘿蛋白酶沒有這么穩(wěn)定并在大約70℃時就能失活。其它耐熱性蛋白酶是由地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)NS70(ChemicalAbstracts，127，4144CA)，地衣芽孢桿菌MIR29(ChemicalAbstracts，116，146805CA)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)(ChemicalAbstracts，124，224587CA)，諾卡氏菌(Nocardiopsis)(ChemicalAbstracts，114，162444CA)和熱擬桿菌(Thermobacteroides)(ChemicalAbstracts，116，146805CA)產(chǎn)生。這并不是完整的列表，但它表明耐熱性絲氨酸蛋白酶以及它們的應用的重要性，主要是在洗滌劑中的應用。沒有文獻提及其用于焙烤和抗-硬化性能。公知的是脂肪酶也軟化面包屑和一定程度減緩面包屑硬化速率(WO94/04035實施例2)。真菌蛋白酶對高溫敏感。有些細菌中性和堿性蛋白酶對高溫處理具有抵抗性。源自芽孢桿菌屬的耐熱性蛋白酶，在去污劑配方中是優(yōu)選的，所述蛋白酶可以對氧化劑耐受。源自芽孢桿菌的堿性耐熱性蛋白酶也在洗滌和去污劑配方中使用。木瓜蛋白酶非常耐熱并需要在90℃-100℃下延長加熱以實現(xiàn)失活。菠蘿蛋白酶沒有這么穩(wěn)定并在大約70℃時就能失活。其它耐熱性蛋白酶是由地衣芽孢桿菌NS70(ChemicalAbstracts，127，4144CA)，地衣型芽孢桿菌MIR29(ChemicalAbstracts，116，146805CA)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(ChemicalAbstracts，124，224587CA)，諾卡氏菌(ChemicalAbstracts，114，162444CA)和熱擬桿菌(ChemicalAbstracts，116，146805CA)產(chǎn)生。這并不是完整的列表，但它表明耐熱性絲氨酸蛋白酶以及它們的應用的重要性，通常在洗滌劑中。沒有文獻提及其用于焙烤和抗-硬化性能。木瓜蛋白酶是熱帶番木瓜樹的果實的乳汁中的一種具蛋白水解活性的成分。天然的經(jīng)干燥的乳汁含有至少4種半胱氨酸蛋白酶的混合物。嗜熱菌蛋白酶是一種由革蘭氏陽性嗜熱細菌耐熱性水解蛋白芽孢桿菌(Bacillusthermoproteolyticus)分泌的細胞外金屬內(nèi)切肽酶?，F(xiàn)有技術(shù)角蛋白酶是一種對角蛋白有活性的蛋白酶，一種以哺乳動物表皮、頭發(fā)、毛、趾甲和皮毛上的一種成分存在的硬蛋白。這種酶的實際應用是作為脫毛劑組合物的一種成分；作為皮革生產(chǎn)中助脫毛劑，降解角蛋白并重組到紡織品結(jié)構(gòu)中。已知該酶未應用于食品工業(yè)中。水生棲熱菌(Thermusaquaticus)是一種屬于Archea的超嗜熱菌(hyperthermophile)。眾所周知的“Taq多聚酶”TM就是從這種生物中分離的。激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)是這個屬中另一種代表。耐熱性蛋白酶從這些生物體中分離。熱酶(thermitase)是一種源自普通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)的細胞外內(nèi)切肽酶。由于其對肽鍵相對低的切割特異性，熱酶有許多應用。它適于生產(chǎn)用于健康或其它特別的飲食的部分水解蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面是關于一種用于抑止或延遲焙烤食品的焙烤過程中的硬化及其相關作用的方法，所述方法包括在所述焙烤產(chǎn)品的配料中加入足夠有效量的至少一種耐熱性蛋白酶的步驟。優(yōu)選的是所述蛋白酶是中性或堿性蛋白酶，最優(yōu)選的是堿性蛋白酶。優(yōu)選的是中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶具有高于60℃的最佳溫度活性，優(yōu)選是高于70℃，更優(yōu)選是高于75℃或甚至高于80℃。本發(fā)明方法中所使用優(yōu)選的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶呈現(xiàn)出在最適溫度的蛋白酶活性與25℃的蛋白酶活性的比值高于10，優(yōu)選高于15。同樣，該酶優(yōu)選在焙烤過程中具有活性并優(yōu)選在上升過程中不具有活性。這些中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶可以通過本領域技術(shù)人員公知的方法從天然存在的真核生物或原核生物中提取而獲得，可以通過合成或基因工程獲得。優(yōu)選的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶是可以從菌株水生棲熱菌(LMG8924)中方便獲得的Taq蛋白酶，或是角蛋白酶，優(yōu)選分離自地衣芽孢桿菌(LMG7561)，或是分離自普通高溫放線菌屬的熱酶。這三種蛋白酶都屬于絲氨酸肽酶類。木瓜蛋白酶(屬于半胱氨酸肽酶類)和嗜熱菌蛋白酶(屬于金屬肽酶類)都被包括在進行的焙烤試驗中，它們對于焙烤過程和所得產(chǎn)品并不能減少硬化和/或具有不良的副作用和/或負作用。本發(fā)明的方法中，中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶可以與其它酶一起使用，例如耐熱性α-淀粉酶，β-淀粉酶，中間耐熱性生麥芽糖淀粉酶，脂肪酶，轉(zhuǎn)糖基酶(glycolsyltransferase)或支鏈淀粉酶。該耐熱性蛋白酶也可以被加入到非酶性的添加劑中例如乳化劑(單酸甘油酯，甘油二酯和/或stearoyllactylades)。在焙烤過程中，其它合適的乳化劑也可被加入到所述中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶中。存在協(xié)同或累加作用。因此，本發(fā)明的方法會產(chǎn)生改良的焙烤制品，優(yōu)選選自由面包，軟面包卷(softroll)，百吉餅(bagel)，油炸圈餅(donut)，丹麥酥皮餅(danishpastry)，漢堡包卷，比薩(pizza)，皮塔餅(pitabread)和蛋糕組成的組中。本發(fā)明的另一方面是關于用于焙烤制品的抗硬化組合物，包括至少一種耐熱性蛋白酶。本發(fā)明的另一實施方案是一種改良劑組合物，更優(yōu)選的是一種面包改良劑組合物，包括至少一種中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶和改良劑組合物常用活性成分。改良劑組合物對于面包師來說是一個公知的概念。它是一種活性成分的混合物，例如酶和乳化劑，其與做面包的常用配料例如水和面粉混合在一起。本發(fā)明進一步的實施方案是關于所述中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶的用途，尤其是本發(fā)明的角蛋白酶在食品工業(yè)更優(yōu)選的在焙烤制品中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶在焙烤制品中的應用。優(yōu)選的是，這些絲氨酸蛋白酶是堿性蛋白酶但也可以是中性蛋白酶。所述酶制劑具有對面包屑柔軟度和延遲焙烤制品硬化的顯著的效果。所述酶制劑的特征在于對面團流變學、面包屑結(jié)構(gòu)和所得面包體積沒有不利的影響。該酶在25℃-40℃的溫度具有低活性意味著其在面團靜止和/或發(fā)起時不必降低活性。該酶具有60℃-80℃或更高的最適溫度。該酶在焙烤過程中或失活或不失活。本發(fā)明的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶的特征在于具有如抗硬化劑的積極作用。這種作用在與其它抗-硬化酶組合時尤為顯著。作為其它抗硬化酶的例子，本領域技術(shù)人員會選擇源自地衣芽胞桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱性淀粉酶和耐熱性生麥芽糖淀粉酶(如源自Novozymes的Novamyl)。它們的作用也與單-和二甘油酯，stearoyllactylates和其它用于焙烤的乳化劑的抗硬化作用累加。本發(fā)明的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶可以被用于面包、軟面包卷、百吉餅、油炸圈餅、丹麥酥皮餅、漢堡包卷、比薩、皮塔餅和蛋糕和其硬化及其抑止是一個質(zhì)量問題的其它焙烤制品。本發(fā)明的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶可以通過原核生物(細菌)和真核生物(真菌，Archea，動物，植物等)產(chǎn)生和/或可以用本領域公知的任何技術(shù)通過基因工程或甚至通過合成而得到?；旧希景l(fā)明所使用的蛋白酶的最重要的特性是1)它們的耐熱性在保持酶穩(wěn)定的PH條件下，它們具有高于60℃的最適溫度，優(yōu)選高于70℃，甚至更優(yōu)選高于75℃，高于80℃或85℃。2)最適溫度的活性與在25℃的活性的比值至少高于10，優(yōu)選高于15。3)它們屬于絲氨酸蛋白酶類。優(yōu)選的是，本發(fā)明的蛋白酶不會在高于60℃，優(yōu)選高于70℃、75℃、80℃或甚至85℃的溫度下喪失其活性。本發(fā)明的酶可以在焙烤過程中產(chǎn)品內(nèi)達到的(當充分焙烤時，對于酵母發(fā)酵焙烤食品至少大約75℃和對于化學發(fā)酵焙烤食品至少大約90℃-95℃)非常高的內(nèi)在溫度下仍然有活性。在最佳溫度范圍內(nèi)，溫度可以為大約60℃至61℃、62℃、63℃、......84℃、85℃、......89℃、90℃、......94℃、95℃，包括其中所有的整數(shù)。本發(fā)明的酶優(yōu)選角蛋白酶、Taq蛋白酶和/或熱酶。角蛋白酶優(yōu)選由地衣芽胞桿菌(例如地衣芽孢桿菌LMG7561)產(chǎn)生。Taq蛋白酶優(yōu)選由水生棲熱菌(實施例水生棲熱菌LMG8924)產(chǎn)生。熱酶優(yōu)選由普通高溫放線菌產(chǎn)生。蛋白酶可以通過使用任意適當?shù)募夹g(shù)從各自的微生物中獲得。例如，蛋白酶制劑可以由一種微生物發(fā)酵并然后通過本領域公知技術(shù)如離心和超濾法從所得肉湯中分離含有蛋白酶的制劑而獲得。蛋白酶也可以通過于宿主生物體克隆編碼合適的蛋白酶的DNA序列，在細胞內(nèi)-或細胞外表達該蛋白酶并收集所產(chǎn)生的酶而獲得。優(yōu)選，所述蛋白酶以允許精確的和/或或多或少精確的定量的形式存在。當該蛋白酶是一種含有多于一種酶類的復雜的天然混合物的一部分時，定量可能是困難的。在這種情況下，可能需要包括一步或更多步純化。蛋白酶也可能通過耐熱性或非耐熱性絲氨酸蛋白酶或酶的直接進化或基因改組(geneshuffling)而獲得。只要它們具有肽切割活性，就認為它們是本發(fā)明范圍的蛋白酶。令人驚奇的是，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)對于生面團流變學不具明顯作用的蛋白酶的使用對于柔軟度和面包屑硬化的延遲具有顯著的效果。與對照相比，對面包屑的彈性沒有不利的影響或沒有提高面包的粘度。其作用與已知抗-硬化劑(例如α-淀粉酶)累加，并可以開發(fā)具有更長的儲存期的面包和其它松軟焙烤制品。蛋白酶的選擇十分的重要。蛋白酶應當在混合和隨后的醒發(fā)中沒有不利作用。否則能被施用的劑量就太低了以至于無法減慢硬化的速度以保持良好的面包彈性。酶的最適溫度越高，其對于面包屑結(jié)構(gòu)和生面團流變的負作用就越小。本發(fā)明將在下面非限制性實施例和所示附圖中得以詳細闡述。附圖簡介圖1表示以在pH7.0下，0.1M磷酸鹽緩沖溶液中aqualysinI(◆，實線)，角蛋白酶(●，虛線)的相對活性(％)的函數(shù)表示的蛋白酶最適溫度。圖2表示在存在和缺失Novamyl(0-8g/100kg面粉)下加入Taq蛋白酶(0U◆，800U▲)對面包硬化的延遲作用。圖3表示在存在和缺失Novamyl(0-8g/100kg面粉)下在面包中加入角蛋白酶(0U◆，800U■)后對面包硬化的提高的延遲作用。圖4表示在pH7.0下，0.1M磷酸鹽緩沖溶液中，以相對活性(％)的函數(shù)表示的熱酶最適溫度。圖5表示以相對活性(％)的函數(shù)表示的熱酶的熱穩(wěn)定性。發(fā)明優(yōu)選實施方式說明一種所用優(yōu)選絲氨酸蛋白酶是從菌株地衣芽孢桿菌LMG7561中獲得，其具有角蛋白酶活性。通過氨基酸相似性和苯基甲基磺酰氟化物抑止，角蛋白酶被證明是一種絲氨酸蛋白酶。所述角蛋白酶是通過在下列培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株地衣芽孢桿菌LMG7561獲得的0.5g/lNH4Cl，0.5g/lNaCl，0.3g/lK2HPO4，0.4g/lKH2PO4，0.1g/lMgCl2.6H2O，2g/l檸檬酸，0.1g/l酵母提取液和10g/l羽粉(feathermeal)。培養(yǎng)基用磷酸調(diào)節(jié)至pH6.5。沒有施加pH對照。在通氣條件下(p260％，1.25vvm)45℃下培養(yǎng)40小時，之后培養(yǎng)基被收集進一步濃縮。上清夜然后通過膜超濾(分子截斷5,000Da)被濃縮。這樣所獲得角蛋白酶粗提液被冷凍保藏直到其被用于焙烤試驗。這樣所獲得的角蛋白酶溶液在60℃pH8.0下呈現(xiàn)出最高活性。在pH范圍7至9下，測量到高于最高活性的85％。60℃加熱該溶液一小時，酶的活性并沒有任何喪失。70℃加熱該酶14分鐘，酶的活性減少50％。在角蛋白上進行了活性測定。對于標準測量，4g角蛋白被溶于100ml氫氧化鈉。在溶解后，用3.2M磷酸慢慢調(diào)節(jié)pH值至8.0。加入蒸餾水直到終體積達到200ml。5ml底物溶液在60℃下預保溫。加入1ml酶溶液并在60℃下保溫。然后加入5ml14％TCA(三氯乙酸)到經(jīng)培養(yǎng)的酶溶液中?；旌?0分鐘。該溶液被過濾，在275nm下測量其相對于一空白溶液的吸光度(在TCA加入后酶被加入)。其活性以KU/ml表示發(fā)酵含有300-1500KU/ml。為了焙烤的目的，其活性以基于protazym片測定的mU/ml來表示。該KU僅被用于證明角蛋白酶的存在。所述Taq蛋白酶是通過在下列培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株水生棲熱菌LMG8924獲得的1g/l胰蛋白胨；1g/l酵母提取物；100ml/l鹽溶液和900ml蒸餾水。用1MNaOH調(diào)節(jié)pH至8.2，然后在121℃滅菌15分鐘。該鹽溶液具有如下組分1g/l次氮基乙酸；0.6g/lCaSO4.2H2O；1g/lMgSO4.7H2O；80mg/lNaCl，1.03g/lKNO3；6.89g/lNaNO3；2.8g/lNa2HPO4.12H2O；10ml/lFeCl3.6H2O溶液(47mg/100ml)；10ml/l微量元素溶液和1l蒸餾水。所述微量元素溶液具有如下組分0.5ml/lH2SO4；1.7g/lMnSO4.H2O；0.5g/lZnSO4.7H2O；0.5g/lH3BO3；25mg/lCuSO4.5H2O；25mg/lNa2MoO4.2H2O；46mg/lCoCl2.6H2O和1l蒸餾水。通氣條件下(pO260％，4vvm)60℃下培養(yǎng)24小時，然后培養(yǎng)基被收集進一步濃縮。水生棲熱菌LMG8924產(chǎn)生至少兩種細胞外蛋白酶。其中一種細胞外蛋白酶被稱為aqualysinI，它是從早期穩(wěn)定期直到細胞停止生長被線性分泌的一種堿性蛋白酶。蛋白水解活性的最佳溫度在70至80℃之間。另一種被稱為aqualysinII，它是一種中性蛋白酶，其產(chǎn)生從第四天起出現(xiàn)，該蛋白酶的濃度線性持續(xù)5天。在95℃獲得最高活性(所測最高溫度)。發(fā)酵提取物在焙烤試驗的發(fā)酵的一天后被使用。由于發(fā)酵在一天后停止，出現(xiàn)的蛋白酶是aqualysinI。aqualysinI被微生物絲氨酸蛋白酶抑止物強烈的抑止，其可以被歸類為一種堿性絲氨酸蛋白酶。然后上清夜通過膜超濾(分子截斷10,000Da)被濃縮。這樣所獲得Taq蛋白酶粗提液被冷凍保藏直到其被用于焙烤試驗。這樣獲得的Taq蛋白酶溶液在80℃呈現(xiàn)出最高活性。當在80℃加熱該溶液一小時，基本不會喪失酶活性。在90℃下加熱10分鐘，酶活性減少60％。通過azurine-交聯(lián)酪蛋白(AZCL-酪蛋白)對該蛋白酶的活性進行測定。其通過染色和交聯(lián)酪蛋白從而產(chǎn)生在一種在水中水合但不溶于水的物質(zhì)來制備。蛋白酶的水解作用產(chǎn)生水溶性染色片段，并且其釋放速率(在590nm的吸光度增加)可能與酶活性((ProtazymeAKTablets，Megazyme，Ireland)直接相關。一片protazymeAK片在pH7.0下100mMNa2HPO4.2H2O中60℃溫育5分鐘。一份酶的等份試樣(1.0ml)被加入，并且反應被允許持續(xù)正好10分鐘。該反應由加入磷酸鈉(10ml，2％w/v，pH12.3)停止。使試管在室溫中靜止大約2分鐘，其內(nèi)含物被過濾。在590nm下測量該濾出液相對于一底物空白的吸光度。其活性表示為mU/ml＝(34.2*(Abs590酶-Abs590空白)+0.6)/稀釋度在嗜熱微生物普通高溫放線菌中，眾所周知在繁殖的對數(shù)生長期許多蛋白質(zhì)水解酶被分泌到周圍的介質(zhì)中。在培養(yǎng)基的濾出液的5種蛋白水解成分中一種蛋白酶占總活性的70至80％，稱為熱酶。熱酶是一種細胞外熱穩(wěn)定性絲氨酸蛋白酶。pH曲線表現(xiàn)出在pH7.5至9.5之間的廣泛的最適度。該酶在pH6.4至7.6范圍內(nèi)顯示出最高活性，高于pH8.0和低于pH5.75不穩(wěn)定性升高，尤其是在溫度提高和較長時間段。依賴于底物的大小，熱酶在從65℃(明膠)，70℃(魚精蛋白)至85℃(偶氮酪蛋白)的范圍呈現(xiàn)出最高活性。最適溫度與最大底物(偶氮酪蛋白)作用時是最明顯的在85℃時的活性比25℃時高12倍。所述熱酶是通過在具有下列成分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株普通高溫放線菌NRRLb-1617獲得的在蒸餾水中的小麥淀粉(20g/l)，細菌用蛋白胨(5g/l)，酵母提取物(3g/l)和麥芽提取物(3g/l)。培養(yǎng)在45℃，12l/min通氣和200rpm轉(zhuǎn)動下進行。在培養(yǎng)24小時后收集上清液。由于培養(yǎng)物上清液中含有大量α-淀粉酶活性，一種初步純化步驟被進行以從α-淀粉酶活性中分離蛋白酶活性從而進行焙烤試驗。上清液通過膜超濾(分子截斷10,000Da)被濃縮。熱酶通過S-瓊脂糖柱(Pharmacia)的柱層析進行純化。該柱用500mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，然后用10mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)和5mMCaCl2平衡。α-淀粉酶活性成分沒有結(jié)合到柱上，熱酶通過10mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)，5mMCaCl2和1MNaCl洗脫。洗脫部分用10mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)和5mMCaCl2透析，并被用于進行焙烤試驗。副活性例如-淀粉酶活性通過PhadebasAmylaseTestTM(Pharmacia&Upjohn)被檢測。底物是帶有藍色染料的水不溶性交聯(lián)淀粉聚合物。其被-淀粉酶水解以形成水溶性藍色片段。該藍色溶液的吸光度就是試樣中-淀粉酶活性的函數(shù)。木聚糖酶副活性通過XylazymeMethodTM(Megazyme)被檢測。所使用的底物是azurine-交聯(lián)木聚糖。該底物通過染色和交聯(lián)高度純化的木聚糖(來自birchwood)以產(chǎn)生一種水合但不溶于水的物質(zhì)來制備。通過內(nèi)-(1，4)-β-D-木聚糖酶水解產(chǎn)生水溶性染料片段，其釋放速率(在590nm的吸光度升高)與酶活性直接相關。所獲Taq蛋白酶溶液沒有呈現(xiàn)出任何-淀粉酶和木聚糖酶副活性。所獲角蛋白酶溶液沒有木聚糖酶活性，通過Phadebas檢測其含有少于8U/mlα-淀粉酶活性。所獲熱酶溶液在經(jīng)純化步驟后沒有呈現(xiàn)任何α-淀粉酶和木聚糖酶副活性。焙烤試驗在1kg面包中進行?；九浞绞?以克表示)面粉(Duo)1500水840新鮮酵母(Bruggeman，Belgium)75氯化鈉30部分氫化棕櫚油21經(jīng)蒸餾單酸甘油酯3蔗糖6抗壞血酸0.06下面的面包制作過程被采用各種成分在DiosnaSP24混合器中2分鐘低速混合，在6分鐘高速混合。最終面團的溫度是29℃。在25℃大量發(fā)酵20分鐘后，用Euro200S(Bertrand-ElectroluxBaking)以R8/L19制成600g面團塊并被鑄形。面團塊在35℃發(fā)面50分鐘，其具有95％的相對濕度。然后這些面包在MIWECONDO(MichealWenz-Arnstein-德國)爐中230℃下用蒸汽(焙烤之前0.1L以及烤面包之后0.2L)焙烤。本領域技術(shù)人員顯而易見的是用其它供應商的設備也能獲得同樣的最終結(jié)果。面包的柔軟度通過TA-XT2結(jié)構(gòu)分析儀(StableMicroSystemsUK)進行檢測。面包被切成塊并且4塊1cm的產(chǎn)生25％變形的力被檢測。這稱之為硬度。硬度在焙烤后的第1天和第6天被檢測。兩種測量值之間的差別是“柔軟度的喪失”柔軟度的喪失＝第6天的變形力-第1天的變形力這是一種相對測量。其絕對值沒有意義，但應當與對照值進行比較以進行解釋。其彈性是上述力與松弛20秒后的力之間的差別。當彈性低于對照面包時，這意味著面包屑變得彈回性減弱。當受壓時，面包屑不會保持原來的形狀，這意味著在切塊或操作的過程中面包屑結(jié)構(gòu)可以不可逆地丟失。重要的是，與對照面包相比通過加入酶就不會丟失彈性。在面包面團中加入本發(fā)明中的酶不會改變發(fā)面時間，面包的濕度和特定的裝載體積。面包的最初濕度含量輕微的改變，但所有烤過的面包塊在室溫下的六天儲藏時間內(nèi)丟失大約同樣數(shù)量水分。實施例實施例1Taq蛋白酶根據(jù)前述方法加入Taq蛋白酶(最終存在不同劑量的來自Novozymes(Denmark)的Novamyl10000BG)焙烤面包。劑量以焙烤試驗中使用的100kg面粉重量表示。下面表1表示在前面所定義的焙烤后的第1天和第六天之間柔軟度的喪失。表1柔軟度Novamylg/100kg800UTaq蛋白酶0UTaq蛋白酶01402092.5128152596118868105實施例顯示使用Taq蛋白酶會延遲面包的硬化。將Taq蛋白酶與中間耐熱性生麥芽糖淀粉酶(如Novamyl，Novozymes的商業(yè)酶)一起使用會顯著延遲面包硬化。因此在耐熱性絲氨酸淀粉酶與α-淀粉酶之間存在協(xié)同作用。其作用在更高劑量的Novamyl(參見圖2)時更顯著。表2表示面包屑的彈性幾乎不被使用Taq蛋白酶所影響。表2彈性Novamylg/100kg800UTaq蛋白酶0UTaq蛋白酶061.561.92.563.163.4563.064.2863.464.9實施例2角蛋白酶根據(jù)前述方法加入角蛋白酶(最終存在來自Novozymes(Denmark)的Novamyl10000BG)焙烤面包。下表3中的劑量以焙烤試驗中使用的100kg面粉重量表示。該表表示在前面所定義的焙烤后的第1天和第六天之間柔軟度的喪失。表3柔軟度Novamylg/100kg800U角蛋白酶0U角蛋白酶01212092.59512656411185059從該實驗中明顯的是加入耐熱性絲氨酸蛋白酶角蛋白酶對于面包的柔軟度具有顯著的作用。與耐熱性生麥芽糖淀粉酶如Novamyl(參見圖3)具有累加效應。經(jīng)證實，通過單獨檢測淀粉酶，制劑中存在少量的淀粉酶對于柔軟度和松弛率沒有影響。表4也顯示當使用這種蛋白酶時，對于松弛率沒有不利的影響。表4彈性Novamylg/100kg800U角蛋白酶0U角蛋白酶062.663.62.564.365.0565.565.8865.465.8實施例3熱酶根據(jù)前述方法加入熱酶(最終與來自Novozymes(Denmark)的Novamyl10000BG聯(lián)用)焙烤面包。下表5中的劑量以焙烤試驗中使用的100kg面粉重量表示。表5表示在前面所定義的焙烤后的第1天和第六天之間柔軟度的喪失。表5柔軟度Novamylg/100kg10.500U熱酶0U熱酶01401972.58710756510286268從該實驗中明顯看出加入耐熱絲氨酸蛋白酶熱酶對于面包的柔軟度具有顯著的作用。與耐熱性生麥芽糖淀粉酶如Novamyl也具有累加效應。經(jīng)純化熱酶，在制劑中不存在可能對柔軟度和松弛率有影響的α-淀粉酶。表6也顯示當使用這種蛋白酶時，對于松弛率沒有不利的影響。表6彈性Novamylg/100kg10500U熱酶0U熱酶062642.56465564.666.3864.466.2熱酶的在0.1M磷酸鹽緩沖液中的pH7.0下的蛋白酶最佳相對活性和熱穩(wěn)定性(以給定溫度下的功能或相對穩(wěn)定性表示)分別在圖4和圖5中列出。僅用Taq蛋白酶、角蛋白酶和/或熱酶，作為混合物和/或與耐熱性淀粉酶(如Novamyl)一起處理顯著影響面包柔軟度。當加入Taq蛋白酶、角蛋白酶和/或熱酶，經(jīng)酶處理的面包更軟。實施例顯示出就柔軟度和硬化而言，根據(jù)本發(fā)明的耐熱性絲氨酸蛋白酶延長焙烤產(chǎn)品的貨架期。實施例4角蛋白酶，熱酶和Taq蛋白酶對面包屑結(jié)構(gòu)和面包感覺特征的影響上述本發(fā)明的中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶對于面包屑結(jié)構(gòu)沒有負作用，然而其它非耐熱性蛋白酶或?qū)儆谄渌鞍酌割惾缒竟系鞍酌?半胱氨酸肽酶)或嗜熱菌蛋白酶(金屬肽酶)卻有負作用。使用例如木瓜蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶導致面包屑結(jié)構(gòu)更開放，這依賴于所使用的劑量。使用本發(fā)明的耐熱性絲氨酸蛋白酶對焙烤產(chǎn)品的體積沒有影響。加入角蛋白酶，熱酶和/或Taq蛋白酶，面包皮顏色、面包皮特征、面包屑顏色、面包香味和面包口感都不發(fā)生顯著的改變。實施例5Taq蛋白酶在蛋糕中的應用配方MixSatinCrèmeCake1000g雞蛋350g油300g水225g方法混合器Hobart工具Padle速度1分鐘速度1和2分鐘速度2然后加入油和水，1分鐘速度1，刮下和2分鐘速度1奶蛋糊重量300g溫度180℃時間45分鐘下表7中的劑量以焙烤試驗中使用的100kg面粉重量表示。表7表示在焙烤后的4天，1星期，2星期和3星期后測量的柔軟度的喪失。表7柔軟度0UTaq蛋白酶600UTaq蛋白酶1200UTaq蛋白酶4天3963212371星期4923792982星期5424572684星期687441308權(quán)利要求1、用于在焙烤制品的焙烤過程中阻止或延遲硬化的方法，包括在所述焙烤制品中加入足夠有效量的至少一種中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶的步驟。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶具有高于60℃的最佳活性溫度，優(yōu)選高于70℃并更優(yōu)選高于75℃。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于最佳溫度的蛋白酶活性與在25℃的蛋白酶活性的比例高于10，優(yōu)選高于15。4、根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其特征在于中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶通過從天然存在的真核或原核生物體中提取、通過合成或基因工程而獲得。5、根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其特征在于中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶是中性蛋白酶或更優(yōu)選的是堿性蛋白酶。6、根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其特征在于所述蛋白酶選自由aqualysinI、aqualysinII、熱酶和角蛋白酶組成的組。7、根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的法，其特征在于耐熱性絲氨酸蛋白酶是從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)LMG8924中分離的Taq蛋白酶，分離自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)LMG7561的角蛋白酶和/或分離自普通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)的耐熱蛋白酶。8、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，進一步包括加入另一種抗-硬化添加劑的步驟，所述的抗-硬化添加劑選自耐熱性α-淀粉酶，β-淀粉酶，中間耐熱性生麥芽糖淀粉酶，脂肪酶，轉(zhuǎn)糖基酶，支鏈淀粉酶和乳化劑，優(yōu)選單酸甘油酯，甘油二酯和/或stearoyllactylates。9、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述焙烤制品選自由面包、軟面包卷、百吉餅、油炸圈餅、丹麥酥皮餅、漢堡包卷、比薩、皮塔餅和蛋糕組成的組。10、用于阻止和延遲焙烤制品的焙烤過程中的硬化的改良劑，其特征在于其包括至少一種中間耐熱性或耐熱性絲氨酸蛋白酶。11、如權(quán)利要求10所述改良劑，其特征在于所述蛋白酶具有高于60℃的最適活性溫度，優(yōu)選高于70℃，更優(yōu)選高于75℃。12、如權(quán)利要求10或11所述改良劑，其特征在于最適溫度的蛋白酶活性與25℃的蛋白酶活性的比值高于10，優(yōu)選高于15。13、如權(quán)利要求10-12任一項中所述改良劑，其特征在于所述蛋白酶是通過從天然存在的原核或真核生物體中提取、通過合成或通過基因工程而獲得的。14、如權(quán)利要求10-13任一項中所述改良劑，其特征在于所述蛋白酶是Taq蛋白酶、角蛋白酶和/或熱酶。15、如權(quán)利要求10-14任一項中所述改良劑，其特征在于所述蛋白酶選自由aqualysinI、aqualysinII、角蛋白酶和熱酶組成的組。16、根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一個的改良劑，其特征在于所述耐熱性絲氨酸蛋白酶是從水生棲熱菌LMG8924分離的Taq蛋白酶、從地衣芽孢桿菌LMG7561中分離的角蛋白酶和/或從普通高溫放線菌中分離的熱酶。17、如權(quán)利要求10-16任一項中所述改良劑，其特征在于其進一步包括另外的抗-硬化添加劑，所述抗-硬化添加劑選自耐熱性α-淀粉酶，β-淀粉酶，中間耐熱性生麥芽糖淀粉酶，脂肪酶，轉(zhuǎn)糖基酶，支鏈淀粉酶和乳化劑，優(yōu)選單酸甘油酯，甘油二酯和/或stearoyllactylates。18、如權(quán)利要求10-17任一項中所述改良劑，其特征在于所述改良劑是一種面包改良劑。19、角蛋白酶在食品應用中的用途。20、角蛋白酶在焙烤制品的焙烤過程中的用途。21、如權(quán)利要求19或20的用途，其中所述角蛋白酶是中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶。22、根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其特征在于所述角蛋白酶是從地衣芽孢桿菌LMG7561中分離的。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于防止或抑止焙烤食品的烘焙過程中硬化的方法，其包括在所述焙烤制品中加入足夠量的至少一種中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶的步驟。本發(fā)明進一步涉及一種用于防止或抑止焙烤食品的烘焙過程中的硬化的改良劑，其特征在于其包括至少一種中間耐熱性和/或耐熱性絲氨酸蛋白酶。文檔編號A21D8/04GK1649501SQ0380953公開日2005年8月3日申請日期2003年4月7日優(yōu)先權(quán)日2002年4月5日發(fā)明者F·阿納特,F·沃爾特,N·維克曼斯申請人:普瑞圖斯股份有限公司