專利名稱：Hiv調(diào)節(jié)/輔助蛋白的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述蛋白包含選自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白的核酸，包含所述核酸的載體，以及制備所述蛋白的方法。所述融合蛋白，核酸和載體可用作至少部分預(yù)防HIV感染的疫苗。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子。像所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，該病毒的基因組編碼Gag，Pol和Env蛋白。此外，該病毒的基因組還編碼調(diào)節(jié)蛋白，即Tat和Rev，以及輔助蛋白，即Vpr，Vpx，Vpu，Vif和Nef。
盡管公共衛(wèi)生組織努力控制AIDS流行病的播散，新發(fā)感染的數(shù)目仍在增長。世界衛(wèi)生組織估計(jì)2000年末，全球感染的人數(shù)達(dá)3.61千萬，比根據(jù)十年前的數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)的數(shù)目高50％(WHO&UNAIDS，UNAIDS，2000)。從全球來看，2000年新發(fā)HIV感染的數(shù)目在530萬。
由于該流行病的持續(xù)傳播，臨床上仍需要有效的疫苗?，F(xiàn)已發(fā)展出一些不同的HIV-1疫苗遞送策略例如新的載體或者輔劑系統(tǒng)，并在不同的前臨床背景和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了評估。進(jìn)入III期臨床實(shí)驗(yàn)的第一種候選疫苗是以明礬中的包膜gp120蛋白(Francis等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998；14(Suppl 3)(5)S325-31))為基礎(chǔ)的。盡管該疫苗在較早的II期實(shí)驗(yàn)中不是很成功，其III期實(shí)驗(yàn)還是已經(jīng)開始了。
多年來基于包膜抗原對預(yù)防性疫苗投入努力之后，最近更多的努力集中在將調(diào)節(jié)蛋白例如Tat，Nef和Rev用作候選疫苗抗原上。這些調(diào)節(jié)性抗原在治療中已經(jīng)使用了幾年(Miller等，Nature Medicine 1997，3，389-94，Calarota等，Lancet 1998，351，1320-5，Ayyavoo等，AIDS，2000，14，1-9)。近來，在小型臨床前實(shí)驗(yàn)中對預(yù)防性疫苗的研究顯示，這些抗原的應(yīng)用很有前途。使用Tat和Rev，或單獨(dú)的Tat作為候選的預(yù)防性疫苗顯示可控制SIVmac(Osterhaus等，Vaccine 1999，17，2713-4)。此外，還表明針對該病毒早期調(diào)節(jié)蛋白的CTL對于在該病毒產(chǎn)生高水平的成熟病毒粒前消除感染的細(xì)胞很重要(van Baalen等，J.Gen.Virol 1997，78，1913-8；Addo等，PNAS，2001，98，1781-6)。
盡管HIV的調(diào)節(jié)/輔助蛋白誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，但如果不是全部也是大多數(shù)都有嚴(yán)重的副作用，從而限制了它們作為疫苗的用途Nef，Tat和Vpu已顯示在下調(diào)CD4+和/或MHC I類分子的表達(dá)中起作用(Howcroft等，Science，1993，260，1320-2；Schwartz等，Nature Med.1996，2，338-42；Swann等，Virology，2001，282，267-77；Janvier等，J.Virol.，2001，78，3971-6，Weissmann等，PNAS 1998，95，11601-6)。已知Tat介導(dǎo)體內(nèi)的急性免疫抑制(Cohen等，PNAS，1999，96，10842-10847)。還描述了Vpr的免疫抑制作用(Ayyavoo等，Nature Med.，1997，31117-1123)。已經(jīng)描述了Vpr和Vpx在酵母細(xì)胞中具有不同的細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性效果(Zhang等，Virology，1997，230，103-12)。因此，HIV的大多數(shù)輔助/調(diào)節(jié)蛋白似乎具有疫苗配方中不期望的功能特性。
降低HIV蛋白的有害效果的試驗(yàn)在WO 02/06303中描述。具體地，WO 02/06303公開了包含HIV Vif，Vpu和Nef的氨基酸序列的融合蛋白，其中所述組成蛋白和另一種組成蛋白連續(xù)，或者被非組成蛋白如氨基酸序列分開，形成了蛋白水解的裂解位點(diǎn)。已知優(yōu)選使用包含位于組成蛋白之間的蛋白水解位點(diǎn)的融合蛋白。由于所述組成蛋白被蛋白水解的裂解位點(diǎn)分開，產(chǎn)生了已知有害的天然HIV蛋白。為降低由融合蛋白裂解產(chǎn)生的HIV蛋白的任何有害影響，WO 02/06303提示使用減毒蛋白。因此，WO 02/06303教導(dǎo)我們使用包含HIV Vif，Vpr和Nef蛋白的融合蛋白，其中的裂解位點(diǎn)被插入HIV蛋白之間，并且其中的HIV蛋白是減毒蛋白。然而，減毒蛋白的缺點(diǎn)在于減毒蛋白的氨基酸序列和天然蛋白的氨基酸序列不同，使得利用減毒蛋白進(jìn)行的免疫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答只能微弱地識別天然蛋白或甚至根本不識別天然蛋白。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生對HIV的多種或所有調(diào)節(jié)/輔助蛋白產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答的疫苗，具體是有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，其中所述疫苗中或由疫苗產(chǎn)生的調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白比天然的單獨(dú)的調(diào)節(jié)/輔助蛋白的功能低，從而使得與天然HIV蛋白相比，所述疫苗中的輔助/調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生不期望的副作用的危險(xiǎn)性降低，并且其中較弱活性的HIV蛋白誘導(dǎo)與天然HIV蛋白類似的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
通過提供一種融合蛋白實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的，所述融合蛋白包含選自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。具體地，本發(fā)明的目的已經(jīng)通過編碼所述融合蛋白的核酸和載體實(shí)現(xiàn)了。
如果融合蛋白在包括人細(xì)胞的動物細(xì)胞中產(chǎn)生，該融合蛋白被細(xì)胞蛋白酶裂解的方式不會獲得具有天然N和C末端的輔助/調(diào)節(jié)蛋白。
由于作為融合蛋白一部分的HIV蛋白與單獨(dú)的HIV蛋白相比，其具有改變的二級/三級結(jié)構(gòu)，所述融合蛋白中的HIV蛋白比單獨(dú)的蛋白的功能弱，甚至完全沒有功能。功能較弱甚至沒有功能的調(diào)節(jié)/輔助蛋白不具有天然構(gòu)象的HIV蛋白的不良副作用。就免疫原性而言，所述融合蛋白的免疫源性與形成融合蛋白的單獨(dú)的HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的免疫源性相比基本沒有差別。具體而言，由于呈遞給免疫系統(tǒng)的表位相同，就細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答而言基本上沒有差別。當(dāng)將融合蛋白給藥患者時(shí)的考慮也一樣。
本發(fā)明術(shù)語“HIV”指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何HIV組，亞型(分化株)，株或分離株。具體地，HIV可以是HIV-1或HIV-2。HIV-1被分成9種亞型(分化株A到I)，而HIV-2可以被分成5種亞型(A到E)，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明最優(yōu)選的HIV分化株是HIV-1分化株A，B和C。然而，本發(fā)明不限于這些最優(yōu)選的分化株。
HIV調(diào)節(jié)蛋白Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat，Vpx和Nef的蛋白序列是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。通過實(shí)施例，且不限于所述的實(shí)施方案，可參考genebank數(shù)據(jù)庫公開的各種序列，具體是Genebank登錄號為K03455的HIV-1分離株HXB2R的序列。在該genebank條目(entry)中，詳述了各種HIV1基因的序列和所述基因編碼的蛋白的序列。
優(yōu)選形成所述融合蛋白的HIV蛋白來自同一分化株。根據(jù)可選的實(shí)施方案，形成融合蛋白的HIV蛋白來自兩種或更多種分化株。也可能形成所述融合蛋白的一種或多種HIV蛋白是HIV-1蛋白或HIV-2蛋白。
形成所述融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列優(yōu)選是由已知HIV分離株編碼的序列，即所述融合蛋白中的HIV蛋白的氨基酸序列和天然存在的HIV分離株編碼的相應(yīng)蛋白的氨基酸序列相同?？蛇x地，融合蛋白中的一種或多種HIV蛋白的氨基酸序列可以是共有序列，即已知HIV分離株中不會發(fā)現(xiàn)，但與多種或所有已知的HIV分離株顯示最佳同源性的序列-尤其就CTL表位而言。計(jì)算共有序列的計(jì)算機(jī)算法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。
在可選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白可以包含作為所述融合蛋白的一部分的一種或多種HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物。本發(fā)明術(shù)語“HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物”指與天然存在的相應(yīng)的HIV蛋白相比，具有改變的氨基酸序列的HIV蛋白。改變的氨基酸序列可能是這樣的序列，其中HIV蛋白的一種或多種氨基酸序列被替換，插入或刪除。更具體地，“HIV蛋白的氨基酸序列的衍生物”是當(dāng)融合蛋白中的相應(yīng)氨基酸序列與已知的HIV分離株的各HIV蛋白的氨基酸序列相比，顯示至少50％的同源性，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的同源性的氨基酸序列。即使僅僅在一種HIV分離株的相應(yīng)蛋白中發(fā)現(xiàn)了同源性，氨基酸序列也被認(rèn)為具有上述的序列同源性，而不考慮其它分離株中可能有顯示較低同源性的相應(yīng)蛋白。通過實(shí)施例，如果融合蛋白中的Vpr衍生物顯示與一種HIV分離株的Vpr序列具有95％的同源性，但與(所有)其它HIV分離株僅僅有50％-70％的同源性，所述Vpr衍生物的同源性被認(rèn)為是至少90％。
已指出與單獨(dú)的蛋白相比，融合蛋白中的HIV蛋白具有降低的活性，或者甚至根本沒有活性，這是由于融合蛋白中的蛋白構(gòu)象和生物活性蛋白的天然構(gòu)象不同。然而，可能需要進(jìn)一步降低融合蛋白中的HIV蛋白具有生物活性這一危險(xiǎn)性。為此，尤其優(yōu)選的作為融合蛋白的一部分的單獨(dú)的HIV蛋白的“衍生物”是其中的多個(gè)氨基酸被去除，插入或替代的氨基酸序列衍生物來獲得具有降低的活性或者根本不具有活性的HIV蛋白，其中多個(gè)氨基酸更優(yōu)選不超過10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過5個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知測定HIV蛋白是否具有降低的生物活性的方法。
對于病毒在活體內(nèi)的復(fù)制很重要的Vif蛋白的分子機(jī)制仍然是未知的，但Vif具有強(qiáng)的自我結(jié)合(selfassociation)的傾向性。這種多聚化對Vif在病毒生存周期中的功能是重要的(Yang S.等，J Biol Chem 2001；2764889-4893)。此外，vif還和病毒核蛋白復(fù)合物特異性結(jié)合，并且可能具有功能上的意義(Khan M.A.等，J Virol.2001；75(16)7252-65)。因此，具有降低的活性的vif蛋白顯示降低的多聚化能力和/或降低的與核蛋白復(fù)合物的結(jié)合。
Vpr蛋白在病毒生存周期中起重要作用。Vpr調(diào)節(jié)病毒前整合復(fù)合物的核轉(zhuǎn)運(yùn)，并促進(jìn)非分裂細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的感染(Agostini等，AIDS Res HumRetroviruses 2002；18(4)283-8)。此外，通過與LTR反應(yīng)，它還可介導(dǎo)反式激活活性(Vanitharani R.等，Virology 2001；289(2)334-42)。因此，具有降低的活性的vpr顯示降低的反式激活作用或者甚至不能反式激活和/或與病毒前整合復(fù)合物反應(yīng)。
Vpx與Vpr高度同源，對于非分裂細(xì)胞中有效的病毒復(fù)制也很重要。Vpx通過與gag前體多聚蛋白p6結(jié)構(gòu)域的相互作用而被包裝在病毒顆粒中。和Vpr一樣，Vpx參與將前整合復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到核中(Mahalingam等，J.Virol2001；75(1)362-74)。因此，具有降低的活性的Vpx顯示降低的通過gag前體與前整合復(fù)合物結(jié)合的能力。
Vpu蛋白已知和CD4的細(xì)胞質(zhì)尾相互作用并導(dǎo)致CD4降解(Bour等，Virology 1995；69(3)1510-20)。因此，具有降低的活性的Vpu具有降低的激發(fā)CD4降解的能力。
已知充分定性的Tat蛋白的相關(guān)生物活性是通過與反式激活反應(yīng)元件(TAR)的相互作用進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的反式激活。已顯示Tat能夠反式激活缺乏除TAR以外的HIV序列的異源性啟動子(Han P.等，Nucleic Acid Res 1991；19(25)7225-9)。因此，具有降低活性的tat蛋白顯示降低的通過TAR元件來反式激活啟動子。
Nef蛋白對于病毒復(fù)制而言非常重要，它通過誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD4的下調(diào)導(dǎo)致疾病的進(jìn)展(Lou T等，J Biomed Sci 1997；4(4)132)。這種下調(diào)是由CD4和Nef之間的直接作用引起的(Preusser A.等，Biochem Biophys ResCommun 2002；292(3)734-40)。因此，具有降低的功能的Nef蛋白顯示降低的與CD4的相互作用。
Rev的相關(guān)作用是通過與病毒RNA的Rev-反應(yīng)元件(RRE)的相互作用啟動的轉(zhuǎn)錄后反式激活(Iwai等，1992；Nuceic Acids Res 1992；20(24)6465-72)。因此，具有降低的活性的Rev顯示與RRE的降低的相互作用。
本發(fā)明的融合蛋白包含選自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列。所述融合蛋白優(yōu)選包含5，6或所有所述的HIV蛋白。融合蛋白中HIV蛋白的順序不重要。
至少4種不同的HIV蛋白中的一種或多種可以以兩個(gè)或更多個(gè)拷貝包含于融合蛋白中。因此，通過實(shí)施例，本發(fā)明的融合蛋白可包含Vif，Vpr，Vpu和兩個(gè)拷貝的Rev。所述HIV蛋白的兩個(gè)或多個(gè)拷貝的氨基酸序列可以完全相同?？蛇x地，這些拷貝的氨基酸序列可以不同，尤其是使用來自不同的HIV株或分化株的蛋白序列(例如，一拷貝的HIV-1 Rev和一拷貝的HIV-2Rev)。
融合蛋白中相鄰的HIV蛋白可無需其它氨基酸而被融合，或者以融合蛋白中兩個(gè)相鄰的HIV蛋白被至少一個(gè)其它氨基酸分離的方式融合。兩種方式的組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，在包含四種HIV蛋白的氨基酸序列的融合蛋白中，兩個(gè)相鄰的HIV蛋白可以直接互相連接，而第三個(gè)和第四個(gè)HIV蛋白可以通過其它氨基酸連接。術(shù)語“其它氨基酸”在本文的實(shí)施方案中指在天然存在的HIV蛋白中的相應(yīng)位置上沒有發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
因此，本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選具有以下通式+P1---P2---P3---P4---P5*---P6*---P7*+其中P1-P7是不同的HIV蛋白，選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Tat，Rev和Nef，其中所述融合蛋白包含至少四種不同的所述HIV蛋白，即P1-P4和可選的一種(P5*)，兩種(P5*---P6*)或三種(P5*---P6*---P7*)添加的所述HIV蛋白?？s寫“---”獨(dú)立地表示1到n個(gè)加入的氨基酸。當(dāng)“---”代表0個(gè)氨基酸時(shí)，相鄰的HIV蛋白無需其它氨基酸而直接相互融合。當(dāng)“---”代表1到n個(gè)氨基酸時(shí)，相鄰的HIV蛋白被一到n個(gè)氨基酸分離。加入的氨基酸的上限，即整數(shù)n，有賴于細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生或表達(dá)的融合蛋白的最大體積。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所有“---”獨(dú)立代表0到20，更優(yōu)選代表0到10，更優(yōu)選1到5個(gè)其它氨基酸。
根據(jù)可選的實(shí)施方案，至少一個(gè)“---”代表其它蛋白質(zhì)的氨基酸序列或其一部分，所述蛋白不是選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef的HIV蛋白。因此，根據(jù)這一可選的實(shí)施方案，所述其它蛋白側(cè)接調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白。該其它蛋白可以是任何蛋白。更優(yōu)選該其它蛋白包含可以幫助誘導(dǎo)對HIV的更好的免疫反應(yīng)的其它表位。因此，所述其它蛋可以是HIV Env，Gag，和/或Pol蛋白或其一部分。文中術(shù)語Env，Gag和Pol的“一部分”指來自所述蛋白之一的氨基酸片段，其包含至少一個(gè)表位。更優(yōu)選該術(shù)語“一部分”指來自所述蛋白的至少10個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。根據(jù)相關(guān)的實(shí)施方案，至少一個(gè)“---”代表作為所述融合蛋白一部分的蛋白P1-P7的一種或幾種的氨基酸序列。因此，在這種情況下，所述融合蛋白可以包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的一種或多種所述蛋白，其是該融合蛋白的一部分。已指出該蛋白的拷貝可以具有或可以不具有相同的氨基酸序列。
上述通式中，縮寫“+”獨(dú)立代表0到n個(gè)其它的末端氨基酸。因此，本發(fā)明的融合蛋白在該蛋白的C和/或N末端可以包含或可以不包含其它氨基酸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，至少一個(gè)“+”代表一種其它蛋白的氨基酸序列或其一部分，所述蛋白不選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述融合蛋白包含位于C和/或N末端的其它蛋白，所述蛋白不是選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat或Nef。該其它蛋白可以是任何蛋白。更優(yōu)選該其它蛋白包含其它表位，可以幫助誘導(dǎo)對HIV的更好的免疫應(yīng)答。例如，所述其它蛋白可以是HIV Env，Gag和/或Pol蛋白或其一部分。本文術(shù)語Env，Gag和/或Pol的“一部分”指來自所述蛋白之一的氨基酸片段，其包含至少一個(gè)表位。更優(yōu)選術(shù)語“一部分”指至少10個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)，最優(yōu)選至少50個(gè)來自所述蛋白之一的氨基酸。
根據(jù)可選的實(shí)施方案，至少一個(gè)“+”代表使得該融合蛋白的檢測或純化更容易的氨基酸序列。因此，至少一個(gè)“+”可以是例如一種標(biāo)記例如His標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明，所述融合蛋白不被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。更具體地，在人細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的融合蛋白不被加工成具有單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知如何檢測在人細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白是否被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白的方法。本文提供的參考文獻(xiàn)是Ayyavoo等，AIDS 2000，14，1-9，具體參考所述文獻(xiàn)的圖2中公開的試驗(yàn)。簡言之，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕易地在人細(xì)胞例如Hela細(xì)胞中表達(dá)各融合蛋白；所述細(xì)胞隨后被裂解并使用對單獨(dú)的HIV蛋白特異的抗體，對所述細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)或者免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，所述單獨(dú)的HIV蛋白在一起形成各種HIV融合蛋白。對于本發(fā)明的融合蛋白而言，沒有檢測到明顯量的大小對應(yīng)于單獨(dú)的HIV調(diào)節(jié)/輔助蛋白的大小的HIV蛋白。
為保證本發(fā)明的融合蛋白不被加工成具有天然N末端和C末端的單獨(dú)的HIV蛋白，所述融合蛋白不應(yīng)包含位于形成融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列之間的細(xì)胞蛋白酶的特定裂解序列，所述序列將導(dǎo)致產(chǎn)生具有天然N和C末端的HIV蛋白。因此，上文通式中的縮寫形式“---”不包含細(xì)胞蛋白酶的特定裂解序列，其可能導(dǎo)致產(chǎn)生具有天然N和C末端的HIV蛋白。具體地，所述融合蛋白不包含位于形成融合蛋白的不同HIV蛋白的氨基酸序列之間的裂解序列PEKRAVVG(單字母氨基酸密碼)。細(xì)胞蛋白的其它裂解序列也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。因此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以輕易避免包含可能產(chǎn)生具有天然N和C末端的單獨(dú)的HIV蛋白的(細(xì)胞)蛋白酶裂解序列。半胱氨酸蛋白酶的裂解序列的實(shí)例是Ile/Leu-X-Thr-X-Gly。
本發(fā)明的蛋白不包含生產(chǎn)同時(shí)具有天然N和C末端的HIV蛋白的特定裂解序列。然而，只要這些裂解位點(diǎn)不能介導(dǎo)同時(shí)具有天然N末端和天然C末端的HIV蛋白的產(chǎn)生，通常不排除融合蛋白中的蛋白之間的細(xì)胞蛋白酶裂解位點(diǎn)的存在。具體地，上文通式中的縮寫氨基酸序列“---”可以包含參與MHC I或MHC II上被呈遞的短肽的產(chǎn)生的蛋白酶的裂解位點(diǎn)。根據(jù)該實(shí)施方案，裂解反應(yīng)的結(jié)果是產(chǎn)生優(yōu)選少于20個(gè)氨基酸的短肽片段，其N或C末端可對應(yīng)于一個(gè)HIV輔助/調(diào)節(jié)蛋白的N或C末端。然而，當(dāng)這些短肽在抗原呈遞的過程中被產(chǎn)生時(shí)，它們不具有其來源的HIV蛋白任何的活性。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明定義的融合蛋白的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA。如果意圖通過使用例如質(zhì)?；蛞訢NA病毒為基礎(chǔ)的載體的DNA載體，將核酸插入人細(xì)胞中，優(yōu)選所述核酸是DNA。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知構(gòu)建編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸的方法。不必拘泥于下述方法，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以從包含一種或多種調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白的編碼序列的基因組HIV克隆，亞基因組HIV克隆，或者任何起始原料例如質(zhì)粒開始。如果該調(diào)解/輔助蛋白的編碼序列位于連續(xù)的閱讀框架中，所述編碼序列可通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀獍鼍幋a序列的核酸而分離。由此獲得的DNA片段可被用于進(jìn)一步的克隆?？蛇x地，輔助/調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列可通過使用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得。如果該調(diào)解/輔助蛋白由一種以上的外顯子編碼，如Tat和Rev那樣，需要獨(dú)立地克隆不同的外顯子并將其融合產(chǎn)生調(diào)節(jié)/輔助蛋白的連續(xù)閱讀框架，或者利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)例如PT-PCR。
編碼序列也可以通過基因合成提供，例如通過使用一套互補(bǔ)的和/或重疊寡核苷酸產(chǎn)生基因。
為獲得融合蛋白，編碼所述融合蛋白的核酸優(yōu)選包含連續(xù)閱讀框架。因此，除最后一段編碼HIV蛋白或其它蛋白的序列以外，所有序列的終止密碼子優(yōu)選被突變成編碼氨基酸的密碼子或者被完全刪除。優(yōu)選，如果PCR使用特定的引物，其可無需終止密碼子擴(kuò)增該編碼序列，可輕易實(shí)現(xiàn)所述過程。換言之，根據(jù)該可選方案，下游引物不應(yīng)與終止密碼子互補(bǔ)。因此擴(kuò)增的DNA片段不包含終止密碼子并可被克隆進(jìn)入克隆載體中。可選地，也可能將含有終止密碼子的編碼序列克隆到克隆載體中。所述終止密碼子可在以后被消除，例如通過使用特異性核酸內(nèi)切酶或者通過誘變。
克隆步驟的結(jié)果可以產(chǎn)生編碼本發(fā)明的融合蛋白的連續(xù)閱讀框架。
獲得融合蛋白的表達(dá)必要的調(diào)節(jié)元件可以是任何驅(qū)動所需表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的調(diào)控元件。如果意圖在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中制備融合蛋白，優(yōu)選使用細(xì)菌或噬菌體啟動子。如果意圖在真核細(xì)胞中表達(dá)該融合蛋白，優(yōu)選使用真核或病毒啟動子/增強(qiáng)子。如果意圖通過使用痘病毒啟動子(見下文)表達(dá)該融合蛋白，優(yōu)選使用例如7.5啟動子或AT I啟動子的痘病毒啟動子。
如上述，該融合蛋白可包含融合配偶體，其不是選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat和Nef的HIV蛋白。因此，該融合蛋白可以包含其它蛋白的氨基酸序列或其一部分。其它蛋白的實(shí)例是HIV Gag，Pol和Env蛋白。因此，本發(fā)明的核酸也可包含一種或多種其它蛋白或其一部分的編碼序列，所述編碼序列位于編碼至少四種調(diào)節(jié)/輔助HIV蛋白或其衍生物的開放閱讀框架中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述核酸可進(jìn)一步包含獨(dú)立的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒編碼幫助進(jìn)一步增強(qiáng)對HIV的免疫應(yīng)答的其它蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸還可包含一種表達(dá)盒，其含有選自Gag，Pol和Env中的至少一種的其它HIV蛋白的編碼序列或其部分。更優(yōu)選地，所述核酸除了融合蛋白的編碼序列以外，還可包含所有HIV蛋白Gag，Pol和Env的編碼序列。所述核酸優(yōu)選是載體的一部分。所述核酸還可以是病毒基因組或病毒載體的其一部分，優(yōu)選例如MVA的痘病毒載體。因此，可以從痘病毒載體中表達(dá)所述融合蛋白以及其它HIV蛋白，例如選自Gag，Pol和Env的至少一種其它HIV蛋白。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸的載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的載體。載體可以是例如pBR322的質(zhì)粒載體或者pUC系列的載體。更優(yōu)選的載體是病毒載體。本文術(shù)語“病毒載體”指包含病毒基因組的感染性和/或減毒病毒。在這種情況下，本發(fā)明的核酸是各病毒載體的病毒基因組的一部分和/或構(gòu)成病毒基因組。所述重組載體可用來感染細(xì)胞或細(xì)胞系，具體用于感染包括人在內(nèi)的活動物。本發(fā)明典型的病毒載體是腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或者以腺伴隨病毒2(AAV2)為基礎(chǔ)的載體。更優(yōu)選痘病毒載體。所述痘病毒優(yōu)選金絲雀痘病毒，禽痘病毒或痘苗病毒。更優(yōu)選的是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G等(1994)，Vaccine121032-40)。典型的MVA毒株是MVA575，其保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，保藏號是ECACCV00120707。更優(yōu)選的是MVA-BN或其衍生物，其在2001年11月22日提交給歐洲專利局的PCT申請PCT/EP01/13628中描述，題目是“ModifiedVaccinia Ankara Virus Variant”。MVA-BN保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號是ECACC V00083008。通過使用MVA-BN或其衍生物，解決了其它的技術(shù)問題，以提供一種尤其安全的針對HIV的病毒疫苗，這是因?yàn)镸VA-BN病毒載體是完全減毒的病毒，其來自改良的安卡拉痘苗病毒，并且特征是其喪失了在人細(xì)胞中再生性復(fù)制的能力。MVA-BN由于缺乏在人類中復(fù)制的能力，而比已知的其它痘苗病毒株更安全。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將MVA-BN和MVA-BN的衍生物作為含有本發(fā)明的DNA的病毒載體。MVA-BN的特征，能夠評估MVA是不是MVA-BN或其衍生物的生物試驗(yàn)的描述，以及能夠獲得MVA-BN或其衍生物的方法在上述對比文件PCT/EP01/13628中公開，所述對比文件包含在文中作為參考。
因此，根據(jù)這些實(shí)施方案，本發(fā)明優(yōu)選涉及重組MVA，例如MVA-BN，其病毒基因組中包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的表達(dá)盒。
將本發(fā)明的核酸插入所述病毒基因組的方法和獲得重組病毒的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。
在重組痘苗病毒中，本發(fā)明的DNA的表達(dá)優(yōu)選，但非排除性地，在痘病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下，所述啟動子更優(yōu)選為痘苗病毒啟動子。本發(fā)明的DNA優(yōu)選插入到病毒基因組的非必要區(qū)(non-essential region)中。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，異源性核酸序列被插入痘病毒基因組天然存在的缺失位點(diǎn)中(PCT/EP96/02926中公開)。然而，只要能得到重組痘苗病毒，插入位點(diǎn)的性質(zhì)對本發(fā)明而言并不重要。因此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕易構(gòu)想到其它適宜的插入位點(diǎn)。
優(yōu)選所述病毒載體，尤其是痘病毒載體的病毒基因組中除了包含本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列以外，還可以包含選自HIV Gag，Pol和Env基因的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。更優(yōu)選所述病毒載體，尤其是痘病毒載體，除了包含本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列以外，還可以包含所有編碼HIV Gag，Pol和Env的HIV基因。這些其它的基因可以被插入本發(fā)明相同的核酸中。根據(jù)該實(shí)施方案，所有HIV基因可位于該病毒基因組的相同插入位點(diǎn)。在可選的實(shí)施方案中，所述其它基因被插入該病毒基因組的不同位點(diǎn)上。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將本發(fā)明的核酸，載體或融合蛋白用作至少部分預(yù)防HIV感染和AIDS的疫苗?！耙呙纭笔且环N化合物，即誘導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的核酸，融合蛋白，載體或病毒。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的“疫苗”以本發(fā)明的融合蛋白為基礎(chǔ)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸，具體為DNA用作疫苗。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知給藥本發(fā)明的包含真核表達(dá)盒的裸DNA，尤其肌肉內(nèi)給藥所述DNA導(dǎo)致表達(dá)盒編碼的蛋白的表達(dá)。所述蛋白暴露給免疫系統(tǒng)，并激發(fā)了特定的免疫反應(yīng)。
在可選的實(shí)施方案中，通過將本發(fā)明的載體給藥來進(jìn)行疫苗接種，所述載體具體是病毒載體，更優(yōu)選痘病毒載體，最優(yōu)選痘苗病毒載體，例如MVA載體。
為制備以痘苗病毒為基礎(chǔ)的疫苗，將本發(fā)明的病毒轉(zhuǎn)化成生理可接受的形式。這一過程可根據(jù)制備用作天花疫苗的痘病毒疫苗的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行(如Stickl，H.等 Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所述)。例如，純化的病毒以配置在約10mM Tris，140mM NaCl Ph7.4中，滴度為5×108TCID50/ml保藏在-80℃。為制備疫苗丸，例如在存在2％的蛋白胨和1％的人白蛋白的條件下，102-108的病毒顆粒在含有100ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的安瓿瓶(優(yōu)選玻璃安瓿瓶)中凍干?？蛇x地，所述疫苗丸可通過逐步冷凍-干燥配制劑中的病毒制備。該配制劑可以含有適宜在活體內(nèi)給藥的其它添加物，例如甘露醇，葡聚糖，糖，甘油，乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者含有其它添加物例如抗氧化劑或者惰性氣體，穩(wěn)定劑或者重組蛋白(例如人血清白蛋白)。所述玻璃安瓿瓶隨后被密封，并可以在4℃和室溫之間保存幾個(gè)月。然而，一般來說，安瓿瓶優(yōu)選儲存在-20℃以下。接種用的凍干物可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液中，優(yōu)選生理鹽水或者Tris緩沖液，并且可系統(tǒng)或局部地給藥，即腸胃外，肌肉內(nèi)或者任何其它本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的給藥途徑。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以已知的方式優(yōu)化給藥的方式，劑量和給藥次數(shù)。痘病毒載體最優(yōu)選的是皮下或肌肉內(nèi)給藥。
如果疫苗是包含本發(fā)明的DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及在第一次接種(“激發(fā)接種”)和第二次接種(“強(qiáng)化接種“)中，給藥治療有效量的疫苗。
如果疫苗是包含本發(fā)明的DNA的MVA-BN載體或其衍生物，本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及接種的試劑盒，所述試劑盒含有位于第一小瓶/容器中的用于第一次接種(“激發(fā)”)的本發(fā)明的MVA-BN病毒載體和位于第二小瓶/容器中的用于第二次接種(“強(qiáng)化”)的本發(fā)明的MVA-BN病毒載體。
因此，本發(fā)明在疫苗實(shí)施方案中涉及包含本發(fā)明的核酸，載體或者融合蛋白的疫苗，以及所述核酸，載體或蛋白在制備疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及通過將本發(fā)明的融合蛋白，本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的載體，給藥需要上述物質(zhì)的包括人在內(nèi)的動物，保護(hù)包括人在內(nèi)的動物不受HIV的感染。
此外，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的蛋白的方法，包括以下步驟(i)使用本發(fā)明的核酸或載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，或(ii)使用本發(fā)明的病毒載體感染宿主細(xì)胞，(iii)在步驟(i)的轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞或者(ii)的感染后的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，和(iv)回收所述融合蛋白。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的核酸或載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞或者使用本發(fā)明的病毒載體感染的宿主細(xì)胞。
根據(jù)另一實(shí)施方案，所述融合蛋白可包含選自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Vpx和Tat中的至少三種不同的蛋白。所述融合蛋白優(yōu)選包含4，5種或所有的所述HIV蛋白。根據(jù)該實(shí)施方案，典型的融合蛋白包含HIV蛋白Vpr，Vif，Vpu，Rev和Tat的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。如上述，融合蛋白中HIV蛋白的順序不重要。上述所有優(yōu)選的實(shí)施方案也適用于該可選的實(shí)施方案。
附圖簡述

圖1寡核苷酸退火的圖解該圖片顯示了四種寡核苷酸的退火。它們是單鏈的，并可以通過互補(bǔ)的末端退火。缺口可以通過顯示校正活性的聚合酶(例如Pfx聚合酶)填補(bǔ)。
圖2蛋白斑(blob)的四種基因的退火的圖解vif基因顯示與vpr片段的重疊序列，vpu編碼片段顯示與rev基因(灰色)的重疊序列。PCR片段變性后，重疊互補(bǔ)末段發(fā)生雜交。產(chǎn)生的缺口使用Pfx聚合酶填補(bǔ)。Vif-vpr片段和vpu-rev片段的重疊序列融合，可再次用于融合。
圖3為把異源基因插入MVA基因組，克隆重組載體中本發(fā)明融合蛋白的編碼序列的策略融合的vif，vpr，vpu和rev多聚蛋白編碼區(qū)用包含Cla1和Apal限制性位點(diǎn)的引物擴(kuò)增。所述pCR產(chǎn)物被克隆到Cla1/Apal切割的載體pBNX65中，所述載體含有痘病毒AT1啟動子。Tat編碼區(qū)使用含有Acc651限制性位點(diǎn)的引物通過PCR擴(kuò)增，并連接到Acc651線性化的pBNX65+vif-rev。產(chǎn)生的表達(dá)盒(AT1啟動子+編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列)用Pac1限制性酶分離并插入重組載體中，使得異源基因插入MVA基因組14L基因間區(qū)(pBNX39)。PBNX39含有與MVA基因組插入位點(diǎn)側(cè)接的序列(F1 14L和F214L)同源的序列。為在MVA基因組和pBNX39同源重組以后篩選重組病毒，所述載體還含有大腸桿菌gpt基因(磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因)。純化所述重組病毒以后，通過Flank 1和Flank 1的重復(fù)序列(Flrpt)之間的同源重組可消除選擇盒。
圖4MVA基因組的圖解MVA含有線性基因組，其經(jīng)Hind III(A-O)限制后顯示特征性片段。14L和15L基因之間的非功能區(qū)位于I片段中。使用pBNX39將異源基因插入位置56767-56768。
實(shí)施例編碼HIV Vif-Vpr-Vpu-Rev-Tat融合蛋白的DNA的生成HIV基因組的單基因可通過使用標(biāo)準(zhǔn)PCR法通過PCR從基因組DNA制備，或通過合成技術(shù)制備，該過程基于通過重疊序列的寡核苷酸退火并填補(bǔ)產(chǎn)生的單鏈缺口。
為產(chǎn)生以寡核苷酸為基礎(chǔ)的基因的編碼區(qū)，從而將其插入編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸中，設(shè)計(jì)了具有15bp重疊的40個(gè)核苷酸聚合的寡核苷酸。所述寡核苷酸的序列基于來自IIIB株的HIV1分離株HXB2R的基因圖譜。退火反應(yīng)或PCR中用于分離所需序列的寡核苷酸的設(shè)計(jì)使得在產(chǎn)生的編碼區(qū)中，用于終止翻譯的終止密碼子被消除。Tat基因是使用含有終止密碼子的寡核苷酸合成的，該基因?qū)⒈徊迦刖幋a本發(fā)明的融合蛋白的核酸的最后的位置，并因此應(yīng)當(dāng)含有正確終止多聚蛋白的翻譯的終止三聯(lián)密碼。
為進(jìn)行寡核苷酸退火反應(yīng)，進(jìn)行了10個(gè)循環(huán)的兩步Pfx聚合酶(Gibco-BRL)反應(yīng)(95℃變性，并在68℃退火/延伸)。在該反應(yīng)中，寡核苷酸的重疊序列退火，而且缺口也被Pfx校正聚合酶填補(bǔ)(圖1)。
為合成vif編碼區(qū)，即編碼所述融合蛋白的核苷酸序列中的第一個(gè)被編碼的基因，使用基因組HIV cDNA進(jìn)行了PCR。PCR的進(jìn)行使得vif編碼區(qū)與隨后的vpr基因的前15bp融合，使得vif和vpr隨后退火。Vpr編碼區(qū)包含HIV HXB2R基因組的堿基對5559-5847，通過10種寡核苷酸的退火制備。產(chǎn)生的缺口被填補(bǔ)，隨后的PCR用于擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有與vif和vpu的側(cè)翼區(qū)融合的vpr編碼區(qū)，其中vif和vpu的側(cè)翼區(qū)被插入在vpr的編碼區(qū)之后。
使用與合成vif相同的cDNA通過PCR擴(kuò)增Vpu編碼區(qū)，生成的產(chǎn)物含有用來與vpr和rev融合的側(cè)翼區(qū)。
通過14種寡核苷酸的退火合成rev編碼區(qū)，其包含HIV HXB2R基因組的堿基對5970-6045和8379-8650的區(qū)，以及與vpu和tat退火的15個(gè)堿基對的重疊序列。
tat編碼區(qū)通過使用10種寡核苷酸產(chǎn)生，其包含HIV HXB2R基因組的堿基對5831-6045和8379-8466。
vif和vpr編碼區(qū)以及vpu和rev編碼區(qū)通過所述兩個(gè)片段的重疊序列的退火以及兩步Pfx聚合酶反應(yīng)進(jìn)行融合(圖2)。對融合產(chǎn)物再進(jìn)行PCR以后，所述片段經(jīng)純化，并經(jīng)vpr和vpu的重疊序列互相接連(圖2)。所得產(chǎn)物(vif-vpr-vpu-rev的編碼序列)的PCR擴(kuò)增后，tat編碼區(qū)通過位于含有痘病毒AT1啟動子的pBluescriptKS+載體中相鄰的克隆位點(diǎn)克隆vif-vpr-vpu-rev片段和tat而被融合(圖3，pBNX65)。完整的表達(dá)盒隨后通過Pac1限制性酶分離并插入pBNX39中(圖3)。PBNX39含有與MVA基因組同源的序列，從而可通過同源重組插入該基因組的非編碼區(qū)(14L)中。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其包含選自Vif，Vpr，Vpu，Vpx，Rev，Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述HIV蛋白選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，或Tat。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其包含HIV蛋白Vif，Vpr，Vpu，Rev和Tat的氨基酸序列，或者包含一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。
4.權(quán)利要求1-3之一的融合蛋白，其中至少兩種HIV蛋白的氨基酸序列互相融合而無需其它氨基酸。
5.權(quán)利要求1-4之一的融合蛋白，其中至少兩種HIV蛋白的氨基酸序列被至少一種其它的氨基酸分開。
6.權(quán)利要求1-5之一的融合蛋白，其中至少一種HIV蛋白的氨基酸序列和融合配偶體融合，所述融合配偶體不是選自Vif，Vpr，Vpx，Vpu，Rev，Tat或Nef的HIV蛋白。
7.編碼權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白的核酸。
8.權(quán)利要求7的核酸，其中所述核酸是DNA。
9.權(quán)利要求8的核酸，其中該融合蛋白從所述DNA中的表達(dá)受選自真核細(xì)胞，原核細(xì)胞和病毒啟動子的調(diào)控元件控制。
10.權(quán)利要求9的核酸，其中所述病毒啟動子是痘病毒啟動子。
11.權(quán)利要求7-10之一的核酸，其中所述核酸還包含選自Gag，Pol和Env中至少一種的其它HIV蛋白的編碼序列。
12.權(quán)利要求11的核酸，其中所述核酸包含HIV Gag，Pol和Env蛋白的編碼序列。
13.包含權(quán)利要求7-12之一的核酸的載體。
14.權(quán)利要求13的載體，其是病毒載體。
15.權(quán)利要求14的載體，其中所述病毒載體是痘病毒載體，具體是痘苗病毒載體。
16.權(quán)利要求15的載體，其中所述痘苗病毒載體是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
17.權(quán)利要求16的載體，其中所述MVA選自保藏在歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)的保藏號為V00120707的MVA-575，和保藏在ECACC的保藏號為V00083008的MVA-BN。
18.制備權(quán)利要求1-6之一的蛋白的方法，包含以下步驟-使用權(quán)利要求7-12之一的核酸或權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，或-使用權(quán)利要求14-17之一的病毒載體感染宿主細(xì)胞，-在轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞或感染后的宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，和-回收該融合蛋白。
19.一種宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求7-12之一的核酸或權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)染，或者被權(quán)利要求14-17之一的病毒載體感染。
20.權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白，權(quán)利要求7-12之一的核酸或者權(quán)利要求13-17之一的載體，其用作藥物。
21.權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白，權(quán)利要求7-12之一的核酸或者權(quán)利要求13-17之一的載體，其用作疫苗。
22.一種疫苗，其包含權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白，權(quán)利要求7-12之一的核酸或者權(quán)利要求13-17之一的載體。
23.權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白，權(quán)利要求7-12之一的核酸或者權(quán)利要求13-17之一的載體在制備疫苗中的用途。
24.保護(hù)包括人類的動物免受HIV感染的方法，所述方法是通過將以下物質(zhì)給藥包括人的動物權(quán)利要求1-6之一的融合蛋白，權(quán)利要求7-12之一的核酸或者權(quán)利要求13-17之一的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述蛋白包含選自Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和Nef中的至少四種HIV蛋白的氨基酸序列或者一種或多種所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融合蛋白不被加工成單獨(dú)的具有天然N和C末端的HIV蛋白。本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白的核酸，包含所述核酸的載體，以及制備所述蛋白的方法。所述融合蛋白，核酸和載體可用作至少部分預(yù)防HIV感染的疫苗。
文檔編號C12N15/863GK1653085SQ03811119
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者保羅·豪利, 桑賈·利勒, 伊娃·費(fèi)爾德 申請人:巴法里安諾迪克有限公司