專(zhuān)利名稱(chēng)：肽,含有該肽的藥物組合物和用于治療癌癥的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)于治療癌癥有效的肽、含有所述肽或其類(lèi)似物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
近來(lái)，癌癥已成為繼心臟病之后的第二大人類(lèi)死亡因素。癌癥通常是通過(guò)外科手術(shù)、放療、化療、免疫療法和高熱等方法來(lái)治療。在所有這些療法中，為了清除癌癥細(xì)胞，切除活細(xì)胞以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡成為重要的目標(biāo)。
如上面提到的，癌癥治療的目的是清除癌癥細(xì)胞。將誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的基因引入癌細(xì)胞的基因治療方法已發(fā)展起來(lái)。
然而，在涉及導(dǎo)入誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的基因的基因治療方法中，目前還沒(méi)有辦法將基因?qū)胨械陌┘?xì)胞。因此，很難達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，也就是清除癌細(xì)胞。再者，在涉及導(dǎo)入可增強(qiáng)免疫應(yīng)答的基因的基因治療方法中，由于免疫應(yīng)答在多個(gè)步驟上受到復(fù)雜的調(diào)控，已證實(shí)很難通過(guò)單獨(dú)操作一個(gè)基因來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
另一方面，對(duì)于由于缺失細(xì)胞內(nèi)某一特定物質(zhì)而造成的疾病，如免疫缺陷而言，將可補(bǔ)充該物質(zhì)的基因?qū)爰?xì)胞的基因治療方法已顯示很成功。因此，這種策略在癌癥的基因治療，也即通過(guò)產(chǎn)生某種物質(zhì)來(lái)治療癌癥中也是重要的。
促腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin)首先是在人嗜鉻細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的，它是一種包含52個(gè)氨基酸的肽(Kitamura，K.et al.“Adrenomedullin，a novelhypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma”，Biochem.Biophys.Res.Commun.192553-560(1993))。促腎上腺髓質(zhì)素是通過(guò)連續(xù)的酶促降解和酰胺化過(guò)程，從含有185個(gè)氨基酸的前激素原產(chǎn)生出來(lái)的一種降血壓肽。經(jīng)過(guò)這些酶促降解和酰胺基化步驟，產(chǎn)生了含有52個(gè)氨基酸的促腎上腺髓質(zhì)素。
促腎上腺髓質(zhì)素存在于許多組織，包括正常的腎上腺/髓質(zhì)、心房、心室、內(nèi)皮細(xì)胞、肺、腦、腎和骨，并且已知其具有血管擴(kuò)張活性。通過(guò)其血管擴(kuò)張活性，促腎上腺髓質(zhì)素還參與多種細(xì)胞的血管新生。已經(jīng)證明，在各種癌細(xì)胞中的促腎上腺髓質(zhì)素含量高于正常細(xì)胞。由于血管新生對(duì)于癌細(xì)胞的增殖是必須的，為治療癌癥的目的，可通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖。
因此，一旦發(fā)現(xiàn)一種能夠抑制促腎上腺髓質(zhì)素誘導(dǎo)的血管新生的化合物，就有可能證明其可有效用于治療各種癌癥。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供新的可用于治療各種癌癥如胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌以及胰腺癌的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
注意到促腎上腺髓質(zhì)素在癌細(xì)胞中高水平表達(dá)并且涉及血管新生后，本發(fā)明者們考慮在癌癥治療中使用促腎上腺髓質(zhì)素的拮抗劑，并且尋找了在治療癌癥中有用的新化合物。
經(jīng)過(guò)深入研究后，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，含有經(jīng)部分缺失的促腎上腺髓質(zhì)素氨基酸序列的一種肽，對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，因此在癌癥治療中有效。
因此，本發(fā)明提供一種肽，其含有在SEQ ID NO1氨基酸序列N-末端缺失至少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供用于治療癌癥的肽，其含有在SEQ ID NO1公布的氨基酸序列N-末端至少缺失一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明提供基因，所含的DNA中具有編碼上述肽或用于治療癌癥的肽的核苷酸序列。
而且，本發(fā)明提供重組載體，其含有編碼上述肽或用于治療癌癥的肽的DNA。
另外，本發(fā)明提供含有前述重組載體的轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生上述肽或治療癌癥的肽的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子、產(chǎn)生并富集所述肽或用于治療癌癥的肽、以及收集所述肽等步驟。
本發(fā)明還提供藥物組合物、尤其是用于癌癥治療的藥物組合物，其包括上述肽或用于癌癥治療的肽。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述在缺氧條件下，各種細(xì)胞系培養(yǎng)中促腎上腺髓質(zhì)素mRNA的表達(dá)。
圖2描述由于對(duì)腫瘤施用本發(fā)明肽引起的腫瘤大小的變化。
圖3是一張照片，描述從小鼠摘出的腫瘤。
圖4描述對(duì)從小鼠摘出的腫瘤稱(chēng)重的結(jié)果。
圖5是一系列的照片，顯示用抗-CD31抗體對(duì)腫瘤組織染色后的結(jié)果。
圖6是一系列照片，顯示用抗-PCNA抗體染色腫瘤細(xì)胞的結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最好模式在下文中，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述。
本發(fā)明的肽包含在由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽的N-末端至少缺失了一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。具體地說(shuō)，本發(fā)明的肽包含在由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽的N-末端缺失了1～25、1～20、1～15、1～10或1～5個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在這里，由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽是人源的促腎上腺髓質(zhì)素。
本發(fā)明的肽可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法，通過(guò)用蛋白水解酶切割由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽而獲得。
人促腎上腺髓質(zhì)素cDNA的核苷酸序列已經(jīng)確定出來(lái)(Kitamura，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，720(1993))。因此，所需要的肽可以通過(guò)如下步驟獲得，合成含有編碼所需肽核苷酸序列的DNA，將合成的DNA插入載體，用含有該DNA的載體轉(zhuǎn)化宿主，培養(yǎng)由此獲得的轉(zhuǎn)化子以便產(chǎn)生該肽。作為選擇，本發(fā)明的肽可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的常規(guī)肽合成方法來(lái)產(chǎn)生。
本發(fā)明的肽還可以是在C-末端有1～10、優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸缺失的那些。此類(lèi)在C-末端有氨基酸缺失的肽，可以通過(guò)上述肽合成方法或轉(zhuǎn)化子方法來(lái)制備。
本發(fā)明的肽可用作治療癌癥的組合物。一些氨基酸可以缺失、替換或添加，只要所得的肽具有對(duì)癌癥的治療效果即可。一般來(lái)說(shuō)，即使當(dāng)肽的全部氨基酸序列中1～5、更優(yōu)選1～3個(gè)氨基酸已經(jīng)缺失、替換或添加，也基本上認(rèn)為這些肽是等同的。
本發(fā)明肽的C-末端通常是羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但也可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。這里，酯中R的例子包括C1-6烷基如甲基、乙基、n-丙基、異丙基以及n-丁基；C3-8環(huán)烷基如環(huán)戊烷基和環(huán)己烷基；C6-12芳基如苯基和α-萘基；以及廣泛用作口服酯的新戊酰氧甲基(pivaloyloxymethyl)酯。
另外，當(dāng)上述肽在除了C-末端以外的其它位置具有羧基(或羧酸根)時(shí)，這種羧基可以被酰氨化或酯化。舉例來(lái)說(shuō)如酯，諸如上述C-末端的酯，可以用作本發(fā)明中的肽。此外，本發(fā)明還包括下述肽，其N(xiāo)-末端通過(guò)體內(nèi)切割作用產(chǎn)生的谷氨酸殘基轉(zhuǎn)變成了焦谷氨酸；還包括下述肽，其中分子內(nèi)氨基酸側(cè)鏈上的OH、COOH、NH2、SH等用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)(例如，C1-6?；T如甲?；鸵阴；?保護(hù)起來(lái)；還包括偶聯(lián)蛋白，諸如與糖鏈偶聯(lián)的糖蛋白。
上述肽的鹽優(yōu)選那些明確可被生理所接受的酸的鹽。此類(lèi)鹽包括與無(wú)機(jī)酸(如鹽酸、磷酸、氫溴酸以及硫酸)以及與有機(jī)酸(如乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸以及苯甲磺酸)形成的鹽。
本發(fā)明中用于治療癌癥的肽描述如下。
本發(fā)明中用于治療癌癥的肽是那些具有如下氨基酸序列的肽，其中在由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽的N-末端缺失了至少一個(gè)氨基酸。具體地說(shuō)，本發(fā)明的肽包含以下氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽的N-末端缺失了1～25、1～20、1～15、1～10或1～5個(gè)氨基酸。在這里，由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽是人源的促腎上腺髓質(zhì)素。
本發(fā)明中用于治療癌癥的肽，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法，通過(guò)用蛋白水解酶切割由SEQ ID NO1公布的氨基酸序列組成的肽而獲得。
人促腎上腺髓質(zhì)素cDNA的核苷酸序列已經(jīng)確定出來(lái)(Kitamura，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，720(1993))。因此，所需要的用于治療癌癥的肽可以通過(guò)如下步驟獲得，合成含有編碼所需肽核苷酸序列的DNA，將合成的DNA插入載體，用含有該DNA的載體轉(zhuǎn)化宿主，培養(yǎng)由此獲得的轉(zhuǎn)化子以便產(chǎn)生該肽。該肽也可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的常規(guī)肽合成方法來(lái)產(chǎn)生。
本發(fā)明中用于治療癌癥的肽，還可以是那些其中C-末端的1～10、優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸缺失的肽。此類(lèi)在C-末端有氨基酸缺失且用于治療癌癥的肽，可以通過(guò)上述肽合成方法或轉(zhuǎn)化子方法來(lái)制備。
在本發(fā)明用于癌癥治療的肽中，與上述本發(fā)明的肽相似，其它氨基酸也可以缺失、替換或添加。
而且，用于治療癌癥的肽的酰胺、酯或鹽也與上述那些本發(fā)明中的肽相似。
本發(fā)明的肽和用于治療癌癥的肽的一個(gè)具體例子是，含有SEQ ID NO2公布的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明的肽和用于治療癌癥的肽，可用于治療各種癌癥，如胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌以及胰腺癌。引導(dǎo)入癌細(xì)胞后，相信本發(fā)明的肽和用于治療癌癥的肽可以抑制癌細(xì)胞的血管新生，并通過(guò)這種抑制效果抑制癌細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明的肽和用于治療癌癥的肽的抗癌活性，可以進(jìn)行評(píng)估，例如通過(guò)將這些肽施用給已產(chǎn)生了癌癥的動(dòng)物如小鼠，然后研究癌細(xì)胞的消失。
其次，對(duì)帶有含編碼本發(fā)明肽或用于治療癌癥的肽(下文中也簡(jiǎn)單稱(chēng)為“肽”)的核苷酸序列的DNA的基因也進(jìn)行了描述。如上所述，人促腎上腺髓質(zhì)素cDNA已經(jīng)測(cè)序。因此，根據(jù)公布的核苷酸序列，需要的肽可通過(guò)合成含有編碼所需肽的核苷酸序列的DNA分子來(lái)獲得。
含有編碼本發(fā)明肽的DNA的重組載體，可按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)方法來(lái)制備，例如，通過(guò)將編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列與一個(gè)合適的載體相連接(插入)。本發(fā)明不限于某一特定的載體，只要該載體可以在所選擇的宿主中復(fù)制。實(shí)例可包括質(zhì)粒DNA和噬菌體DNA。
重組載體可通過(guò)如下步驟來(lái)制備，切出含有編碼本發(fā)明肽的DNA的DNA片斷，然后將它連接在適宜表達(dá)載體中的啟動(dòng)子的下游?？捎糜诒景l(fā)明的合適載體包括，起源于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的質(zhì)粒(如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118或pBluescript)；起源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的質(zhì)粒(如pUB110、pTP5、或pC194)；起源于酵母的質(zhì)粒(如pSH19、pSH15、YEp13或YCp50)；噬菌體如λ噬菌體；以及動(dòng)物病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒或桿狀病毒。在本發(fā)明的上下文中，任何啟動(dòng)子都可以使用，只要他們適于在用來(lái)表達(dá)目的基因的宿主中使用。舉例來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的啟動(dòng)子如下當(dāng)宿主是大腸埃希氏菌時(shí)，有trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、λPL啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子和araBAD啟動(dòng)子；當(dāng)宿主屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)時(shí)，有SPO1啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子、XYL啟動(dòng)子、HWP啟動(dòng)子和CWP啟動(dòng)子；當(dāng)宿主是枯草芽孢桿菌時(shí)，有SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子和penP啟動(dòng)子；而當(dāng)宿主是酵母時(shí)，有PHO5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子以及ADH啟動(dòng)子。當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞用作宿主時(shí)，可用的啟動(dòng)子包括SRα啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、HSV-TK啟動(dòng)子等等。另外，當(dāng)昆蟲(chóng)細(xì)胞用作宿主時(shí)，多角體啟動(dòng)子、OplE2啟動(dòng)子等是優(yōu)選的。
除了上述的啟動(dòng)子，如果需要，表達(dá)載體還可包括增強(qiáng)子、剪接信號(hào)、poly(A)加尾信號(hào)、選擇標(biāo)記、SV40復(fù)制起點(diǎn)(在下文中有時(shí)縮寫(xiě)為“SV40ori”)，以及諸如此類(lèi)本領(lǐng)域內(nèi)已知的那些。此外，如果需要的話(huà)，用本發(fā)明的DNA編碼的蛋白也可以表達(dá)為與另一種蛋白(例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和蛋白A)的融合蛋白。這種融合蛋白可以用位點(diǎn)特異性蛋白酶切割來(lái)分成各自獨(dú)立的蛋白。
合適的宿主細(xì)胞的例子包括，埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、昆蟲(chóng)、以及動(dòng)物細(xì)胞。合適的埃希氏菌屬細(xì)菌的具體實(shí)例包括大腸埃希氏菌K12·DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60，160(1968))、JM103(Nucleic Acids Research 9，309(1981))、JA221(Journal ofMolecular Biology 120，517(1978))、HB101(Journal of Molecular Biology 41，459(1969))、DH5α和JM109。合適的芽孢桿菌屬細(xì)菌實(shí)例包括，枯草芽孢桿菌MI114(Gene 24，255(1983))、207-21(Journal of Biochemistry 95，87(1984))和短芽孢桿菌(Bacillus brevis)。合適的酵母實(shí)例包括，釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)NCYC1913、NCYC2036，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)。合適的動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施例包括，猴COS-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(下文中縮寫(xiě)為CHO)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞dhfr基因缺陷型(下文縮寫(xiě)為CHO(dhfr-))、小鼠L細(xì)胞、小鼠AtT-20細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠GH3細(xì)胞、人FL細(xì)胞以及HEK293細(xì)胞。
上述宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來(lái)完成。典型的用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法在下述文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述Proc.Natl.Acad.Sci.USA69，2110(1972)；Gene 17，107(1982)；Molecular & General Genetics 168，111(1979)；Methods in Enzymology 194，182-187(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，1929(1978)；Cell Technology(Suppl.8)New Cell TechnologyExperimental Protocol 263-267(1995)(Shujunsha)；以及Virology 52，456(1973)。
當(dāng)用編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)化植物從而獲得轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，該基因可以通過(guò)例如以下手段導(dǎo)入植物，電穿孔法、衣桿菌(Agrobacterium)法、粒子槍法或PEG法。舉例來(lái)說(shuō)，采用電穿孔法時(shí)，基因是在一個(gè)裝備有脈沖控制器的電穿孔儀中，于500～600V以及100μF作用20msec的條件下導(dǎo)入宿主的。
使用農(nóng)桿菌方法時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)如下步驟獲得，將植物表達(dá)載體構(gòu)建入適宜的農(nóng)桿菌如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，然后在無(wú)菌條件下按照如真空浸潤(rùn)法(在Bechtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，316，1194-1199(1993)中描述的)，侵染宿主的葉片段。
使用粒子槍方法時(shí)，可以直接使用植物體、植物器官(如葉片、花瓣、莖、根和種子)以及植物組織(如上皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部和維管束)，或使用從其中制備的節(jié)段或原生質(zhì)體。如此制備的樣品接著用基因轉(zhuǎn)移儀處理(例如，BIOLISTIC POS 1000/He，BioRad)。這種處理通常是在約1000～1100psi壓力下進(jìn)行約5～10cm距離；不過(guò)，處理?xiàng)l件可根據(jù)植物和樣品來(lái)變化。
此外，可用于轉(zhuǎn)化的植物可以是針葉類(lèi)、闊葉類(lèi)樹(shù)木、雙子葉、單子葉植物等等任何一種。
將重組載體導(dǎo)入細(xì)菌如大腸埃希氏菌的方法沒(méi)有特別的限制，只要其能夠成功地將DNA導(dǎo)入選擇的細(xì)菌。例如，可以使用鈣離子法(Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110(1972))及電穿孔法。
用酵母作宿主時(shí)，其中用于導(dǎo)入重組載體的方法也沒(méi)有特別限制，只要該法能夠成功將DNA導(dǎo)入酵母。例如，可以使用電穿孔法、原生質(zhì)球法及乙酸鋰法。
用動(dòng)物細(xì)胞作宿主時(shí)，其中用于導(dǎo)入重組載體的方法也沒(méi)有特別限制，只要其能夠成功將DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞。例如，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法及脂轉(zhuǎn)染法。
用昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主時(shí)，用于導(dǎo)入重組載體的方法也沒(méi)有特別限制，只要其能夠成功將DNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞。例如，可以使用磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法及電穿孔法。
基因?qū)胨拗骺赏ㄟ^(guò)如PCR法、Southern雜交法以及Northern雜交法來(lái)確證。例如，從轉(zhuǎn)化子制備DNA然后設(shè)計(jì)DNA特異引物來(lái)進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR的條件與用于制備上述質(zhì)粒的條件相似。然后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳，用溴化乙啶、SYBR綠溶液等染色。檢測(cè)到單一泳帶的擴(kuò)增產(chǎn)物說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功。擴(kuò)增產(chǎn)物還可以通過(guò)用熒光染料等標(biāo)記引物進(jìn)行PCR來(lái)預(yù)先檢測(cè)。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物可以被固定在固相基質(zhì)如微孔板上，然后用熒光或酶反應(yīng)來(lái)鑒定。
本發(fā)明的肽可通過(guò)培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子、產(chǎn)生并積累肽然后收集肽的過(guò)程來(lái)制備。在本發(fā)明的上下文中，肽通過(guò)培養(yǎng)來(lái)積累，其形式不僅可以是培養(yǎng)上清，也可以是任何形式的培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞，或是細(xì)胞或細(xì)菌的裂解產(chǎn)物。本發(fā)明中，用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子的方法沒(méi)有特別限定，任何常規(guī)用于培養(yǎng)宿主的方法都可以使用。
舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)宿主是微生物時(shí)，如大腸埃希氏菌或酵母，培養(yǎng)基既可以是天然培養(yǎng)基也可是合成培養(yǎng)基，只要其含有碳源、氮源、礦物質(zhì)等可被微生物代謝的物質(zhì)，并能有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。作為碳源的例子包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖以及淀粉；有機(jī)酸如乙酸和丙酸；以及醇類(lèi)如乙醇和丙醇。作為氮源的例子包括氨、無(wú)機(jī)或有機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨；其它含氮化合物；以及蛋白胨、肉汁和玉米漿。作為礦物質(zhì)的例子包括，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅以及碳酸鈣。培養(yǎng)通常在由振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等形成的有氧條件下進(jìn)行。宿主是大腸埃希氏菌時(shí)，培養(yǎng)在大約15～43℃進(jìn)行約12～48h。當(dāng)宿主是芽孢桿菌屬細(xì)菌時(shí)，培養(yǎng)在大約30～40℃進(jìn)行約12～100h。當(dāng)宿主是酵母時(shí)，培養(yǎng)在大約20～35℃進(jìn)行約24～100h。如果必要，可對(duì)培養(yǎng)進(jìn)行通風(fēng)和攪拌。當(dāng)要求調(diào)節(jié)pH時(shí)，常規(guī)采用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等進(jìn)行。
當(dāng)利用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子作為重組表達(dá)載體的啟動(dòng)子時(shí)，用于含有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基可根據(jù)需要添加誘導(dǎo)物。例如，當(dāng)所用表達(dá)載體包含T7啟動(dòng)子時(shí)，可以在培養(yǎng)基中另外添加入IPTG等進(jìn)行培養(yǎng)。此外，當(dāng)所用表達(dá)載體包含可被吲哚乙酸(IAA)誘導(dǎo)的trp啟動(dòng)子時(shí)，可將IAA等加入培養(yǎng)基。
培養(yǎng)利用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主所獲得的轉(zhuǎn)化子時(shí)，合適的培養(yǎng)基有通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基或是在其中補(bǔ)充了胎牛血清的此類(lèi)培養(yǎng)基。培養(yǎng)一般是在約5％二氧化碳中，在37℃進(jìn)行1～30天。
當(dāng)本發(fā)明中的肽通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生時(shí)，蛋白粗提物可通過(guò)例如，包括以下步驟的方法來(lái)獲得用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法收集細(xì)胞；在適宜的緩沖液中懸浮；通過(guò)如超聲波、溶菌酶、和/或凍融法破碎細(xì)胞；然后離心并/或過(guò)濾。緩沖液可以包括蛋白變性劑，如尿素和鹽酸胍，以及表面活性劑如Triton X-100。當(dāng)肽分泌到培養(yǎng)基中的情況下，在培養(yǎng)后利用本領(lǐng)域已知的方法收集培養(yǎng)上清液并使之與細(xì)胞分離。包含在上清液中的蛋白質(zhì)或因此獲得的提取物，可通過(guò)恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的分離/純化方法來(lái)進(jìn)行純化。也就是說(shuō)，所感興趣的蛋白可單獨(dú)或恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用如硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析以及親和層析來(lái)純化。
由此獲得的本發(fā)明肽可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法或那些與已知方法相似的方法轉(zhuǎn)變?yōu)辂}類(lèi)。同樣地，肽以鹽的形式獲得后，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法或那些與已知方法相類(lèi)似的方法，可將之轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂尚问交蛄硪环N鹽的形式。此外，由轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蛋白，可以根據(jù)需要在純化前或純化后，用適宜的蛋白修飾酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶處理成片斷。另外，蛋白可通過(guò)用蛋白修飾酶如激酶處理而進(jìn)行修飾。本發(fā)明蛋白或其鹽形式在樣品中的存在，可通過(guò)各種結(jié)合試驗(yàn)、使用特異性抗體的酶免疫檢測(cè)等方法來(lái)確定。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物闡述如下。本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物含有本發(fā)明的肽或用于治療癌癥的肽。本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物除了本發(fā)明的肽或用于治療癌癥的肽外，還含有藥物可接受的載體。本發(fā)明的肽的含量，是根據(jù)能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、減少癌細(xì)胞數(shù)目、或受試病人用藥后表現(xiàn)療效所需的量來(lái)確定的。對(duì)病人的用藥劑量通常是根據(jù)病人的體表面積、體重、征兆等來(lái)確定的。動(dòng)物和人之間劑量的相互關(guān)系是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，而病人的體表面積可以從病人的身高和體重來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明中肽的適宜劑量可在約0.1mg/kg～約0.5mg/kg范圍內(nèi)。劑量?jī)?yōu)選根據(jù)用藥方法和賦型劑的量來(lái)變化；當(dāng)其它治療方法如其它抗癌藥和放療與該肽聯(lián)合使用時(shí)，劑量還會(huì)改變。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可以非腸道方式用藥，例如，皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)方式。腸道內(nèi)用藥的藥物制劑具體實(shí)例可包括，含約5％葡萄糖或其它藥用賦形劑以及本領(lǐng)域內(nèi)已知在等滲鹽溶液中使用的活化劑的水溶液。增溶劑如環(huán)糊精和其它本領(lǐng)域內(nèi)已知的增溶劑，是可添加的賦形劑實(shí)例。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可利用常規(guī)技術(shù)，采用本領(lǐng)域已知的其它方法摻入用于給藥的藥物制劑中。舉例來(lái)說(shuō)，藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可摻入用于口服給藥的藥物制劑如膠囊、凝膠或片劑中。膠囊由本領(lǐng)域內(nèi)已知的藥物可接受材料如明膠或纖維素衍生物組成。片劑可通過(guò)將本發(fā)明的肽和固相載體以及潤(rùn)滑劑混合后，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法壓制而成。適宜的固相載體實(shí)例包括淀粉和糖皂土。本發(fā)明的肽可以如下方式給藥，如含有乳糖或甘露醇作為粘合劑、并含有已知的填充材料和/或片成形劑的硬殼片劑形式，或?yàn)槟z囊的形式。
含有本發(fā)明的肽或用于治療癌癥的肽的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物，可用于治療各種癌癥，如胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌和胰腺癌。本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物當(dāng)導(dǎo)入癌細(xì)胞后，所含的肽或用于治療癌癥的肽確信可以抑制癌細(xì)胞的血管新生，并由于有該抑制作用可阻止癌細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物的抗癌活性，可通過(guò)以下過(guò)程來(lái)評(píng)估，在動(dòng)物如小鼠中產(chǎn)生癌癥，然后將藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物對(duì)該動(dòng)物給藥，繼而檢查癌的消失。
另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可包含含有編碼本發(fā)明肽或用于治療癌癥的肽的DNA的基因。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可以采用非病毒載體或病毒載體的劑型來(lái)給藥。
使用非病毒載體時(shí)，編碼本發(fā)明肽或用于治療癌癥的肽的DNA可采用重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞或組織，該載體可通過(guò)下述技術(shù)將該DNA插入常用的基因表達(dá)載體來(lái)制備。介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞的方法實(shí)例包括，磷酸鈣共沉淀法和采用玻璃毛細(xì)管的DNA直接注射法。
其它介導(dǎo)基因進(jìn)入組織的方法實(shí)例包括，利用內(nèi)在型脂質(zhì)體、靜電類(lèi)脂質(zhì)體、HVJ-紙質(zhì)體和改進(jìn)型HVJ-脂質(zhì)體(HVJ-AVE脂質(zhì)體)進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移法；受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法；用粒子槍將DNA分子和載體(金屬粒子)一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法；直接轉(zhuǎn)移裸-DNA的方法；以及通過(guò)正電荷聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法。這里，適宜的表達(dá)載體包括pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1和pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
適于給藥的病毒載體例如有，重組腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。具體來(lái)講，可利用含有編碼本發(fā)明肽的DNA的重組表達(dá)載體將基因?qū)爰?xì)胞，該DNA插入在有致毒能力的DNA或RNA病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、新培斯病毒、仙臺(tái)病毒、SV40和人免疫缺陷病毒(HIV)中，以便用這些重組病毒感染細(xì)胞。
在上述病毒載體中，已知腺病毒的感染效率與其它病毒載體相比是非常高的。從這點(diǎn)來(lái)看，腺病毒載體系統(tǒng)是優(yōu)選使用的。
將本發(fā)明中的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物導(dǎo)入病人體有如下方法，即通過(guò)直接將藥物組合物導(dǎo)入病人體內(nèi)的體內(nèi)方法，或是通過(guò)體外方法先將藥物組合物導(dǎo)入從病人體提取的特定類(lèi)型細(xì)胞中，然后將該細(xì)胞返回病人身體。
當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)體內(nèi)方法給藥時(shí)，可根據(jù)將用于處理的靶體如細(xì)胞、組織及靶器官，通過(guò)適合的途徑來(lái)用藥。例如，可用靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或直接施入靶癌病灶所在組織的方式來(lái)給藥。
各種藥物劑型(如液體)都適于上述給藥形式并可常規(guī)使用。例如，在包含DNA作為有效成分的注射劑的情況下，該注射劑可依照常規(guī)方法制備，該常規(guī)方法是將DNA溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如，緩沖溶液如PBS、生理鹽水和無(wú)菌水)，如果必要，使用濾器和其同類(lèi)物過(guò)濾以消毒該溶液，并且隨后將溶液充入無(wú)菌容器。如果必要，通常使用的載體和其同類(lèi)物可添加到注射劑中。此外，脂質(zhì)體，如HVJ-脂質(zhì)體，可以是脂質(zhì)體配制劑的形式，例如懸浮液，冷凍的形式，或經(jīng)離心濃縮的冷凍形式。
另外，為了有助于將基因定位到感染區(qū)域附近，可制備緩釋劑型(如，微球)以植入到感染區(qū)域的鄰近地區(qū)。也可采用滲透泵或其類(lèi)似物持續(xù)地并緩慢地將基因給到感染區(qū)域。
選擇性導(dǎo)入癌細(xì)胞可通過(guò)靶向在癌細(xì)胞表面特異表達(dá)的癌癥抗原或靶向在癌細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中明顯高表達(dá)的癌癥抗原(如，運(yùn)鐵蛋白受體和EGF受體)而獲得。
例如，本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可使用免疫-脂質(zhì)體特異地導(dǎo)入癌細(xì)胞，該免疫-脂質(zhì)體是通過(guò)將包含編碼本發(fā)明肽的DNA的藥物組合物放入與單克隆抗體偶聯(lián)的脂質(zhì)體中而獲得的，該單克隆抗體抗癌細(xì)胞的特定表面抗原。
藥物制劑中的DNA含量可根據(jù)所治療的疾病，病人的年齡和體重等等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可用于治療各種癌癥，如胃癌，結(jié)腸直腸癌，肺癌，卵巢癌，肝癌和胰腺癌，該組合物含有包含編碼本發(fā)明肽，或者治療癌癥的肽的DNA的基因。導(dǎo)入細(xì)胞后，相信本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物可產(chǎn)生本發(fā)明的肽，該肽抑制癌細(xì)胞的血管生成并且因?yàn)榇艘种谱饔枚种瓢┘?xì)胞的增殖。
本發(fā)明的肽或治療癌癥的肽可用于治療上述描述的癌癥。用肽進(jìn)行治療的動(dòng)物沒(méi)有特別限制，并且包括人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物，如大鼠，猴，狗，貓，小鼠，豚鼠，倉(cāng)鼠，家兔，和野兔。
本發(fā)明的藥物組合物或用于癌癥治療的藥物組合物的抗癌活性可通過(guò)，例如，使動(dòng)物如小鼠產(chǎn)生癌癥，給藥物組合物或治療癌癥的藥物組合物，并且檢查癌細(xì)胞大小的變化來(lái)進(jìn)行評(píng)估。
在下文中，將用實(shí)施例來(lái)更加細(xì)致地說(shuō)明本發(fā)明，但是不應(yīng)直接理解為限制于此。
實(shí)施例1不同的癌細(xì)胞株在低氧條件下培養(yǎng)，通過(guò)Northern印跡法檢測(cè)促腎上腺髓質(zhì)素mRNA的表達(dá)。使用低氧培養(yǎng)箱(Wakenyaku Industry)，在低氧條件下癌細(xì)胞株在1％的O2濃度中培養(yǎng)12小時(shí)。也在20％的O2濃度中進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，從不同的癌細(xì)胞株中用TRIZOL試劑(LIFETECHNOLOGIES)抽提RNA。在甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳RNA(20μg)，并且隨后與促腎上腺髓質(zhì)素特異性探針雜交。結(jié)果見(jiàn)圖一。
下面列出了這里所使用的癌細(xì)胞株KATO III 胃癌細(xì)胞株HCT116直腸癌細(xì)胞株DLD1 直腸癌細(xì)胞株KM-12 直腸癌細(xì)胞株P(guān)C-6 肺癌細(xì)胞株TAOV 卵巢癌細(xì)胞株P(guān)CI-10胰腺癌細(xì)胞株HepG2 肝癌細(xì)胞株TTOV 卵巢癌細(xì)胞株P(guān)CI-19胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CI-35胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CI-43胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3胰腺癌細(xì)胞株KMP-2 胰腺癌細(xì)胞株圖1描述了從不同癌細(xì)胞株中抽提的RNA的Northern印跡分析結(jié)果，顯示28S的部分與促腎上腺髓質(zhì)素特異的探針?lè)磻?yīng)。如圖1所示，在低氧(1％氧氣)濃度下培養(yǎng)的癌細(xì)胞(在圖1中用H表示)中，促腎上腺髓質(zhì)素mRNA與正常氧(2％氧氣)濃度下培養(yǎng)的癌細(xì)胞(在圖1中用N表示)中的mRNA相比，有所增加。這一趨勢(shì)在胰腺癌細(xì)胞中尤其顯著。
實(shí)施例2在CB17lcr-scid J1小鼠(CLEA JAPAN Inc.)的背側(cè)皮下植入107PCI-43細(xì)胞。已證實(shí)PCI-43細(xì)胞增殖會(huì)形成腫瘤，并且7天后腫瘤直徑超過(guò)5mm。經(jīng)過(guò)這一確認(rèn)后，促腎上腺髓質(zhì)素和本發(fā)明的肽(溶于0.1ml生理鹽水)各50μg，分別從第七天起每天一次地注入腫瘤直到第16天。由SEQ ID NO2組成的肽用作本發(fā)明的肽(在下文中也指“促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑”)這一肽從Wako Pure Chemical Industries，Ltd購(gòu)買(mǎi)。
腫瘤直徑每三天肉眼觀測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2，該圖顯示促腎上腺髓質(zhì)素、促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑和生理鹽水(V3)各自給藥的腫瘤大小。橫軸代表植入PCI-43細(xì)胞后的天數(shù)，縱軸代表腫瘤體積(mm3)的大小。圖上部的箭頭表示促腎上腺髓質(zhì)素、促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑和生理鹽水的給藥時(shí)間。每組使用五只CB17lcr-scid J1小鼠。
如圖2清楚顯示的，在第7天到第16天于促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥的組里，腫瘤尺寸變小并且在第21天時(shí)變得幾乎肉眼不可見(jiàn)。相反地，在促腎上腺髓質(zhì)素-和生理鹽水-給藥組里，腫瘤尺寸幾乎沒(méi)變。
實(shí)施例3在CB17lcr-scid J1小鼠(CLEA JAPAN Inc.)的背側(cè)皮下植入107PCI-43細(xì)胞。已證實(shí)PCI-43細(xì)胞增殖會(huì)形成腫瘤，并且7天后腫瘤直徑超過(guò)5mm。經(jīng)過(guò)這一確認(rèn)后，促腎上腺髓質(zhì)素和促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑(溶于0.1ml生理鹽水)各50μg，分別從第七天起每三天一次地注入腫瘤，即，第7天，第10天，第13天和第16天。這里使用的促腎上腺髓質(zhì)素和促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑與實(shí)施例1中使用的那些相同。
第21天時(shí)處死小鼠，摘出腫瘤并稱(chēng)重。摘出的腫瘤照片見(jiàn)圖3，腫瘤稱(chēng)重結(jié)果見(jiàn)圖4。
從圖3清晰可見(jiàn)，在促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥組中，腫瘤尺寸與促腎上腺髓質(zhì)素給藥組相比，變小了。此外，如圖4清晰顯示的，在促腎上腺髓質(zhì)素給藥組中的腫瘤重量約為0.05g，而促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥組中約為0.03g，其減少到促腎上腺髓質(zhì)素給藥組的大約一半。
實(shí)施例4檢測(cè)了本發(fā)明肽對(duì)血管新生的作用。實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例3中使用的小鼠的腫瘤組織上進(jìn)行。摘出小鼠的腫瘤組織，用抗CD31的抗體對(duì)CD31抗原進(jìn)行染色，該抗原是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的細(xì)胞表面標(biāo)記。染色按照下述方法進(jìn)行。使用5只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
液氮冷凍腫瘤組織以制備冷凍切片。冷凍切片在白蛋白溶液中預(yù)處理30分鐘，然后用過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，然后，用抗CD31的抗體室溫處理切片1小時(shí)。漂洗后，用二抗處理切片1小時(shí)，用ECL(Amersham)顯色。
染色結(jié)果見(jiàn)圖5。來(lái)自促腎上腺髓質(zhì)素給藥組小鼠的腫瘤組織染色結(jié)果見(jiàn)圖5的左側(cè)部分，而促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥小鼠的腫瘤組織染色結(jié)果見(jiàn)右側(cè)部分。在圖5中，染成棕色的區(qū)域代表新生成的血管。從圖5清晰可見(jiàn)，促腎上腺髓質(zhì)素給藥組中，新生成粗的血管，而在促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥組中，新生成的血管是細(xì)的，證明了對(duì)血管生成的抑制。
其次，任意選擇實(shí)施例4中使用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的100根新生血管，來(lái)測(cè)量它們各自的直徑。表1中，新生血管根據(jù)其直徑分為三組(小于2μm，2μm到8μm之間以及8μm或更大)，各組的數(shù)目以及血管直徑的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差一同展示。表1中，AM代表促腎上腺髓質(zhì)素，AMA代表促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑。
表1

如表1中明確顯示的，在使用了促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑的小鼠中，血管直徑變小，幾乎沒(méi)有一根血管具有顯著大的直徑，此外還顯示出了對(duì)血管新生的抑制。另外，在使用了促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑的小鼠中，血管直徑只有那些促腎上腺髓質(zhì)素給藥小鼠的一半。
實(shí)施例5測(cè)定本發(fā)明肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響。用抗-增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體對(duì)實(shí)施例2中所用小鼠腫瘤細(xì)胞的PCNA染色。染色方法與實(shí)施例4相同。實(shí)驗(yàn)中使用5只小鼠。結(jié)果顯示于圖6。施用促腎上腺髓質(zhì)素的小鼠腫瘤細(xì)胞的染色結(jié)果顯示于圖6的左邊，促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥小鼠的結(jié)果顯示于右邊。
如在圖6中明確看到的，很多與抗-PCNA抗體反應(yīng)的細(xì)胞存在于促腎上腺髓質(zhì)素給藥組中，在促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥組中只有很少細(xì)胞與抗-PCNA抗體反應(yīng)。PCNA-標(biāo)記指標(biāo)在促腎上腺髓質(zhì)素給藥組和促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥組中分別為25.8±3.9和6.3±5.2。因此，與促腎上腺髓質(zhì)素給藥小鼠相比，促腎上腺髓質(zhì)素拮抗劑給藥小鼠中的增殖細(xì)胞減少了約1/4。
如上所詳細(xì)描述的，本發(fā)明肽抑制癌細(xì)胞的血管新生，并且由于此抑制作用而阻止了細(xì)胞增殖。因此，本發(fā)明肽可用于治療各種癌癥，諸如胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、以及胰腺癌。
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<150>JP 2002-075575<151>2002-03-19<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>52<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys1 5 10 15Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln20 25 30Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser35 40 45Pro Gln Gly Tyr50<210>2<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp1 5 10 15Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr20 25 30
權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了至少一個(gè)氨基酸。
2.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了1～25個(gè)氨基酸。
3.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了1～20個(gè)氨基酸。
4.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了1～15個(gè)氨基酸。
5.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了1～10個(gè)氨基酸。
6.一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽，其中從N-末端缺失了1～5個(gè)氨基酸。
7.權(quán)利要求1～6之一的肽，其中從C-末端缺失了1～10個(gè)氨基酸。
8.權(quán)利要求1～6之一的肽，其中從C-末端缺失了1～5個(gè)氨基酸。
9.權(quán)利要求1～8之一的肽，其中的氨基酸有部分缺失、替換或添加。
10.權(quán)利要求1～9之一所述肽的酰胺或酯或鹽。
11.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了至少一個(gè)氨基酸。
12.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了1～25個(gè)氨基酸。
13.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了1～20個(gè)氨基酸。
14.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了1～15個(gè)氨基酸。
15.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了1～10個(gè)氨基酸。
16.一種用于癌癥治療的肽，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列且從N-末端缺失了1～5個(gè)氨基酸。
17.權(quán)利要求1～16之一所述用于癌癥治療的肽，其從C-末端缺失了1～10個(gè)氨基酸。
18.權(quán)利要求1～16之一所述用于癌癥治療的肽，其從C-末端缺失了1～5個(gè)氨基酸。
19.權(quán)利要求1～8之一所述用于癌癥治療的肽，其有氨基酸的部分缺失、替換或添加。
20.權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的酰胺或酯或鹽。
21.權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽，其中所述癌癥是胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
22.權(quán)利要求20所述用于癌癥治療的肽的酰胺或酯或鹽，其中所述的癌癥是胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
23.一種基因，其DNA具有編碼權(quán)利要求1～9之一所述肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的核苷酸序列。
24.一種重組載體，含有編碼權(quán)利要求1～9之一所述的肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的DNA。
25.一種轉(zhuǎn)化子，含有權(quán)利要求24的重組載體。
26.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1～9之一所述的肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的方法，其中的方法包括如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)化子；產(chǎn)生并積累權(quán)利要求1～9之一所述的肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽；收集該肽。
27.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1～9之一所述的肽，或權(quán)利要求10所述肽的酰胺、酯或鹽。
28.一種用于癌癥治療的藥物組合物，含有權(quán)利要求1～9之一所述的肽，或權(quán)利要求10的肽的酰胺、酯或鹽。
29.權(quán)利要求28的用于癌癥治療的藥物組合物，其中的癌癥是胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
30.一種藥物組合物，其包含基因，該基因含有編碼權(quán)利要求1～9之一所述的肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的DNA。
31.一種用于癌癥治療的藥物組合物，其包含基因，該基因含有編碼權(quán)利要求1～9之一所述的肽、或權(quán)利要求11～19之一所述用于癌癥治療的肽的DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有從SEQ ID NO1所示氨基酸序列N－末端缺失至少一個(gè)氨基酸所衍生的氨基酸序列的肽，所述肽具有抑制癌細(xì)胞的血管新生，和由于這種抑制作用所產(chǎn)生的對(duì)癌細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制的效應(yīng)。所述肽可用于治療如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌等癌癥。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1753909SQ0381143
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2003年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月19日
發(fā)明者小林正伸 申請(qǐng)人:株式會(huì)社康福來(lái)