專利名稱：用于細胞角蛋白類檢測的核酸擴增用引物以及使用該引物的檢查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于細胞角蛋白檢測的核酸擴增用引物。
背景技術(shù)：
細胞角蛋白(以下，在本說明書中記載為“CK”)是形成細胞纖維性骨架的蛋白質(zhì)之一，形成一個至少由20個基因的組構(gòu)成的家族，眾所周知的有人CK18、人CK19和人CK20等。CK是在上皮細胞中表達的。
例如，據(jù)報道人CK18不僅在乳腺、肺、大腸、胃等正常組織表達，而且也在各種各樣的癌組織中表達，但是CK18既不在上皮系組織，也不在淋巴節(jié)中表達。另外據(jù)報道CK19在肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等中表達，并證實在正常組織和癌組織中的人CK19的表達量有差異。據(jù)報道人CK20在大腸癌、胃癌、默克爾氏細胞癌、婦科粘液癌、轉(zhuǎn)移上皮癌、胰腺癌·膽管癌中表達，也已經(jīng)證實在正常組織和癌組織中的人CK20的表達量有差異。
因此，通過研究在淋巴節(jié)等組織中人CK18、人CK19和/或人CK20有無表達，可以確認(rèn)癌有無轉(zhuǎn)移，另外通過研究在上述正常組織和癌組織中表達量的差異被證實，也可以確認(rèn)癌的轉(zhuǎn)移。
癌細胞離開原病灶部位，經(jīng)由血流或淋巴系轉(zhuǎn)移到全身。在癌手術(shù)中，由于必須要盡可能確實切除病灶，所以要求對轉(zhuǎn)移進行正確檢測，根據(jù)轉(zhuǎn)移的程度進行適當(dāng)處置。因此，手術(shù)中的向淋巴節(jié)的癌轉(zhuǎn)移診斷具有極其重要的意義。例如，對于乳腺癌，為了提高QOL，有使清掃范圍縮小的傾向，但手術(shù)中的淋巴節(jié)癌轉(zhuǎn)移診斷可以成為用于決定最小限度的淋巴節(jié)清掃范圍的重要的指針。對于食道癌，通過檢測淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移的部位，可以成為用于決定選擇開腹、閉胸、頸部切開中哪一種手術(shù)方式的指針。對于前列腺癌，如果發(fā)現(xiàn)淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移，就可作為決定中止摘出手術(shù)，進行激素療法等意圖的指標(biāo)，而對于胃癌，也可作為手術(shù)方式以及術(shù)后的治療方針的選擇指針。另外，如果考慮到對患者的負(fù)擔(dān)，手術(shù)中的癌轉(zhuǎn)移診斷必須要迅速進行。
作為向淋巴節(jié)的癌轉(zhuǎn)移診斷的1種手法，有對作為癌標(biāo)志的CK蛋白質(zhì)進行檢測的方法。例如，通過將切除的淋巴節(jié)冷凍，然后對冷凍組織的切斷面進行染色等進行檢測，但由于通過這樣的手法只獲得切斷面的信息，所以存在著沒有發(fā)現(xiàn)微小癌轉(zhuǎn)移的危險性。
隨著近年來基因解析技術(shù)的發(fā)展，通過檢測癌標(biāo)志基因的表達，已經(jīng)可以有效地進行癌診斷了。例如PCR法是通過反復(fù)進行將DNA解離為單鏈，將DNA鏈中特定區(qū)域夾住的引物的結(jié)合，利用DNA聚合酶催化的DNA合成反應(yīng)，可以將目的DNA片段擴增數(shù)十萬倍以上的方法(特開昭61-274697)，可以作為各種樣品中核酸的高靈敏度分析法使用。例如，由于可以進行動物體液或來自組織的樣品中核酸的分析，所以在傳染病或遺傳病或癌的診斷等中是有用的。
在RNA的檢測中可以利用RT-PCR法。所謂RT-PCR法是從例如腫瘤組織提取RNA，以寡(dT)或隨機六聚體作為引物通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成cDNA，用PCR法對該cDNA進行擴增，進行檢測的方法。使用該方法診斷成纖維細胞瘤的例子已有報告(北海道醫(yī)學(xué)雜志，p.135-141，Vol.66(2)，(1991))。通過RT-PCR已經(jīng)可以由切除的組織進行CK的mRNA表達的檢測，可以一定程度地避免癌轉(zhuǎn)移漏診的問題。在腫瘤或癌的診斷領(lǐng)域中，這樣的核酸擴增方法已經(jīng)逐漸實用化(《臨床檢查法提要》，第31版1314頁，金原出版株式會社，1998年9月20日發(fā)行)。
然而，PCR法中需要將雙鏈模板DNA變性為單鏈的操作，擴增反應(yīng)需要在幾個溫度條件下反復(fù)進行。另外，一般來說，要獲得可檢測的擴增產(chǎn)物要花費2小時左右時間，作為要求迅速性的手術(shù)中進行的檢查并不理想。
作為PCR法以外的DNA擴增方法，報告了LAMP法(專利文獻1)。LAMP法是利用包括當(dāng)鏈置換反應(yīng)進行時在擴增產(chǎn)物的末端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物在內(nèi)的多個引物的基因擴增法。首先，在初期反應(yīng)中，通過2種內(nèi)部引物(FIP、RIP)和2種外部引物(F3引物、R3引物)以及鏈置換型DNA聚合酶由模板DNA合成在兩端具有單鏈回環(huán)部分的啞鈴狀的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)成為擴增循環(huán)的起點結(jié)構(gòu)，從該結(jié)構(gòu)的3’末端一側(cè)以自己為模板進行DNA的延伸·合成反應(yīng)。擴增產(chǎn)物由許多重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，重復(fù)結(jié)構(gòu)單位由夾在引物之間的構(gòu)成被擴增區(qū)域的2條核酸堿基序列成反向的同一鏈內(nèi)的互補性區(qū)域構(gòu)成。LAMP法其特征是不需要由雙鏈模板DNA向單鏈的熱變性操作，擴增反應(yīng)全部在等溫條件下連續(xù)進行(非專利文獻1、2)。模板為RNA時，通過在模板為DNA時的反應(yīng)液組成中再添加逆轉(zhuǎn)錄酶，可以同樣合成起點結(jié)構(gòu)進行擴增(RT-LAMP)。如果利用LAMP法，在30分鐘左右就可獲得檢測需要的充分?jǐn)U增產(chǎn)物。因此，由于核酸檢測需要的時間被縮短，可以應(yīng)用于例如以迅速決定治療方針為目的的向淋巴節(jié)的癌轉(zhuǎn)移的診斷中。另外由于可以迅速得到結(jié)果，所以預(yù)期也適用于手術(shù)中診斷。
適用于LAMP法的引物的基本考慮方法在專利文獻1和專利文獻2中都有記載。
關(guān)于人CK18檢測用的PCR用引物或探針已有報告(非專利文獻3)。同樣，關(guān)于人CK19檢測用的PCR用引物或探針也已有報告(專利文獻3、非專利文獻4)。另外，關(guān)于人CK20檢測用的PCR用引物或探針也已有報告(非專利文獻5、6)。
然而，作為人CK檢測用，適用于LAMP法的引物的報告還沒有，人們期待著對其的開發(fā)。另外，在適用于其他的核酸擴增手段的引物中，也希望構(gòu)建除了眾所周知的引物之外的新引物或?qū)y定有用的引物組。(先有文獻)專利文獻1國際公開WO 00/28082號公報專利文獻2國際公開WO 02/24902號公報專利文獻3美國US 6203992專利公報非專利文獻1Bioventure、Vol.1，No.1，p.109-115(2001)非專利文獻2BIO INDUSTRY、Vol.18，No.2，p.15-29(2001)
非專利文獻3Gene，159(1)，p.43-47(1995)非專利文獻4Breast Cancer Research and Treatment 60，p.143-151(2000)非專利文獻5British J.of Cancer，77(8)，p.1327-1332(1998)非專利文獻6British J.of Cancer，82(8)，p.157-160(2000)發(fā)明內(nèi)容(發(fā)明要解決的課題)本發(fā)明目的在于提供在用于檢測人CK的核酸擴增反應(yīng)中使用的新的引物。更具體講涉及提供通過LAMP法進行核酸擴增用的引物。
(用于解決課題的手段)本發(fā)明人為了解決上述課題，反復(fù)進行研究，結(jié)果實現(xiàn)了構(gòu)建有效適用于LAMP法的用于檢測人CK的核酸擴增用引物。
即本發(fā)明由以下各項內(nèi)容構(gòu)成。
1.核酸擴增用引物，用于通過LAMP法檢測細胞角蛋白。
2.上述1所述的核酸擴增用引物，其中細胞角蛋白是從細胞角蛋白18、細胞角蛋白19和細胞角蛋白20選出來的。
3.用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，含有從以下組中選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸1)含有選自序列1表示的堿基序列的270～1375位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列1和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列2～341中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
4.含有由從序列66～88或179～341表示的堿基序列中的任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物。
5.上述3或4所述的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
6.用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列1表示的堿基序列的270～1375位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列1和/或其互補鏈的連續(xù)堿基至少5個以上的寡核苷酸；2)由序列2～341中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
7.上述6所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
8.上述7所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中選擇至少4種。
9.上述6～8中任一項所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物中至少有2種識別序列1所示堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
10.上述7～9中任一項所述的引物組，其特征是上述引物組中含有的引物識別序列1所示的堿基序列和/或其互補鏈中的至少6處區(qū)域。
11.一種引物組，是由從序列234～341表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，其特征在于含有由分類為(a)序列234～286和(b)序列287～341的(a)以及(b)中各選擇一個引物的組合。
12.一種引物組，其特征是在上述11的引物組中，作為由從序列66～88或序列179～201表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，還含有由分類為(c)序列66～88和(d)序列179～201的(c)以及(d)中各選擇一個引物的組合。
13.一種引物組，其特征是在上述11或12的引物組中，作為由從序列202～233表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，還含有由分類為(e)序列202～219和(f)序列220～233的(e)以及(f)中各選擇一個引物的組合。
14.由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列234、287、66和179表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列252、297、68和182表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列259、307、72和184表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列278、331、79和193表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
15.由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列234、287、66、179、203和220表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列252、297、68、182、211和223表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列259、307、72、184、212和226表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列278、331、79、193、214和228表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
16.由以下所示的1)～8)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，1)作為引物含有序列280、334、82和195表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；
2)作為引物含有序列281、335、83和196表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列282、336、84和197表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列282、337、84和197表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；5)作為引物含有序列283、338、85和198表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；6)作為引物含有序列284、339、86和199表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；7)作為引物含有序列285、340、87和200表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；8)作為引物含有序列286、341、88和201表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
17.由以下所示的1)～6)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列282、336、84、197、216和229表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列282、337、84、197、216和230表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列282、337、84、197、216和231表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列283、338、85、198、217和232表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；5)作為引物含有序列286、341、88、201、218和233表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；6)作為引物含有序列286、341、88、201、219和233表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
18.人細胞角蛋白18的核酸檢測方法，是通過從上述3或4所述的引物選擇必需的引物，或選擇上述5～17任一項所述引物而使用。
19.含有由以下組中選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物1)至少含有由序列342表示的堿基序列的270～930位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列342和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列343～432中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
20.含有由從序列357～361或378～434表示的堿基序列中任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物。
21.上述19或20所述的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
22.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列342表示的堿基序列的270～930位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列342和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列343～434中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
23.上述22所述的用于人細胞角蛋白19檢測的引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
24.上述22或23所述的用于人細胞角蛋白19檢測的引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
25.上述22～24中任一項所述的用于人細胞角蛋白19檢測的引物組，其特征是在上述引物組含有的引物中至少有2種識別序列342所示的堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
26.上述22～25中任一項所述的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物至少識別序列342所示的堿基序列和/或其互補鏈中的6處區(qū)域。
27.一種引物組，其特征是作為由從序列413～434表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，含有由分類為(a)序列413～417、419、422或424～427、以及(b)序列418、420、421、423或428～434的(a)以及(b)中各選擇一個引物的組合。
28.一種引物組，其特征是在上述27的引物組中，它還包括作為由從序列357～361或序列378～384表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物中，由分類為(c)序列357～361和(d)序列378～384的(c)以及(d)中各選擇一個引物的組合。
29.一種引物組，其特征是在上述27或28選擇的各個引物的組合中，還包括作為由從序列385～412表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物中，由分類為(e)序列385～398和(f)序列399～412的(e)以及(f)中各選擇一個引物的組合。
30.一種引物組，是作為由各個序列所示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，包括以下所示的1)～4)的任一個組合1)從分類為(a)序列413～417、(b)序列418、(c)序列357、(d)序列378的各個分類選擇一個引物的組合；2)從分類為(a)序列419、(b)序列420～421、(c)序列358、(d)序列379的各個分類選擇一個引物的組合；3)從分類為(a)序列422、(b)序列423、(c)序列359、(d)序列380的各個分類選擇各引物的組合；4)從分類為(a)序列424～427、(b)序列428～434、(c)序列360～361、(d)序列381～384的各個分類選擇一個引物的組合。
31.一種引物組，是作為由各個序列所示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，包括以下所示的1)～4)的任一組合1)從分類為(a)序列413～417、(b)序列418、(c)序列357、(d)序列378、(e)序列385～391、(f)序列399～402的各個分類選擇一個引物的組合；2)從分類為(a)序列419、(b)序列420～421、(c)序列358、(d)序列379、(e)序列392～393、(f)序列403～406的各個分類選擇一個引物的組合；3)從分類為(a)序列422、(b)序列423、(c)序列359、(d)序列380、(e)序列394～396、(f)序列403～409的各個分類選擇一個引物的組合；4)從分類為(a)序列424～427、(b)序列428～434、(c)序列360～361、(d)序列381～384、(e)序列397～398、(f)序列411～412的各個分類選擇一個引物的組合。
32.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，由以下所示的1)～3)中任一個構(gòu)成1)作為引物含有序列413、418、357和378表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列419、421、358和379表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列424、431、360和381表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
33.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成1)作為引物含有序列413、418、357、378、385和402表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列419、421、358、379、392和404表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列422、423、359、380、394和407表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列424、431、360、381、397和411表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
34.核酸檢測方法，使用從上述19或20所述引物選擇的必需的引物，或從上述21～33任一項選擇的引物組。
35.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物；含有由以下組中選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸1)含有由序列435表示的堿基序列的340～490位或495～1050位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列435和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列436至460中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
36.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，由從序列443、444或454～474表示的堿基序列中任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成。
37.上述35或36所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
38.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列435表示的堿基序列的340～1050位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列435和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；
2)由序列436至460中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
39.上述38所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
40.上述39所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
41.上述38～40中任一項所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組含有的引物中至少有2種識別序列435所示的堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
42.上述38～41中任一項所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物至少識別序列435所示的堿基序列和/或其互補鏈中的6處區(qū)域。
43.一種引物組，其特征是作為由從序列461～466以及468～473表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，包括由分為(a)序列461～466和(b)序列468～473的(a)以及(b)中選擇一個引物的組合。
44.用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中在上述43項中選擇的各引物的組合中作為引物還包括序列444以及序列455所示的堿基序列的寡核苷酸。
45.用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中在上述43或44所述的引物組中作為引物還包括序列457和/或459或460所示的堿基序列的寡核苷酸。
46.用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中作為引物包括序列443、454、467以及474所示的堿基序列的寡核苷酸。
47.用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中作為引物除了使用序列443、454、467以及474所示的堿基序列的寡核苷酸之外，還使用序列456和/或458所示的堿基序列的寡核苷酸。
48.核酸檢測方法，使用從上述35或36所述的引物選擇必需的引物，或從上述37～47任一項選擇的引物組。
49.上述18、34或48所述的核酸檢測方法，其中核酸檢測方法是LAMP法。
50.在上述18、34、48或49所述核酸檢測方法中使用的試劑。
51.在上述18、34、48或49所述核酸檢測方法中使用的試劑盒。
52.利用上述18、34、48或49所述核酸檢測方法的核酸檢測系統(tǒng)。附圖簡單說明

圖1是表示使用人CK18的引物組I進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-1)圖2是表示使用人CK18的引物組II進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-1)圖3是表示使用人CK18的引物組III進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-1)圖4是表示使用人CK18的引物組IV進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-1)圖5是表示使用人CK18的引物組I(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-2)圖6是表示使用人CK18的引物組I(不含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例1-2)圖7是表示使用人CK18的引物組I進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例1-3)圖8是表示使用人CK19的引物組A(不含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-1)圖9是表示使用人CK19的引物組A(不含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-1)
圖10是表示使用人CK19的引物組A(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-1)圖11是表示使用人CK19的引物組A(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-1)圖12是表示使用人CK19的引物組A(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-1)圖13是表示使用人CK19的引物組C(不含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖14是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖15是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖16是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖17是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖18是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖19是表示使用人CK19的引物組C(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-2)圖20是表示使用人CK19的引物組D(不含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-3)圖21是表示使用人CK19的引物組D(含有Loop引物)進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-3)圖22是表示使用人CK19的引物組A進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-4)圖23是表示使用人CK19的引物組B進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-4)圖24是表示使用人CK19的引物組C進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-4)圖25是表示使用人CK19的引物組D進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-4)圖26是表示使用人CK19的引物組A進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例2-5)圖27是表示使用人CK19的引物組B進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例2-5)圖28是表示使用人CK19的引物組C進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例2-5)圖29是表示使用人CK19的引物組D進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例2-5)圖30是表示使用人CK19的引物組C進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-6)圖31是表示使用人CK19的引物組C進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例2-7)圖32是表示使用人CK20的引物組1進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例3-2)圖33是表示使用人CK20的引物組1進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例3-3)圖34是表示使用人CK20的引物組3進行LAMP法時的結(jié)果的圖。(實驗例3-4)圖35是表示使用人CK20的引物組3進行LAMP法時的擴增特異性的圖。(實驗例3-5)具體實施方式
(引物設(shè)計)本發(fā)明提供可適用于人CK的核酸擴增法、最好是適用于LAMP法的核酸擴增用的引物。該引物可以選擇含有來自例如眾所周知的序列1，342，435等表示的CK的堿基序列和/或其互補序列的至少5個以上連續(xù)堿基的適當(dāng)?shù)墓押塑账?，進行設(shè)計。
LAMP法中使用的引物的基本思路是象專利文獻1記載的那樣。具體來說，從要擴增的靶DNA的3’末端一側(cè)開始依次規(guī)定F3c、F2c、F1c的區(qū)域，從5’末端一側(cè)依次規(guī)定R3、R2、R1的區(qū)域，選擇含有至少相對于這6個區(qū)域，實質(zhì)上同一的堿基序列、或?qū)嵸|(zhì)上互補的堿基序列的寡核苷酸鏈，至少設(shè)計4種引物。
所謂實質(zhì)上同一的堿基序列定義如下。即，以某種堿基序列為模板合成的互補鏈與目的堿基序列進行雜交，當(dāng)給予互補鏈合成的起點時，該序列與目的堿基序列實質(zhì)上是同一的。例如，所謂與F2實質(zhì)上同一的堿基序列除了完全與F2相同的堿基序列之外，還包括起到與F2雜交后給予可成為互補鏈合成的起點的堿基序列的模板作用的堿基序列。
根據(jù)本發(fā)明，為了賦予構(gòu)成寡核苷酸的堿基序列的特征使用的同一、或互補的用語無論哪一個都不需要完全同一、或完全互補。就是說，所謂與某序列同一也包括與對某序列可以進行雜交的堿基序列互補的序列。另外，所謂互補指的是在嚴(yán)格條件下可以進行雜交，可以提供成為互補鏈合成起點的3’末端的序列。
本發(fā)明的引物，具有在以下所述各種核酸合成反應(yīng)中給予基于環(huán)境的維持必要的特異性，同時可以與互補鏈進行堿基對結(jié)合程度的鏈長。具體來說，如5～200堿基對，最好是10～50堿基對。由于催化序列依賴性的核酸合成反應(yīng)的眾所周知的聚合酶識別的引物的鏈長最低為5堿基左右，所以進行雜交的部分的鏈長必須在此以上。此外，為了保持作為堿基序列的特異性，希望維持10堿基以上的長度。另一方面，由于過長的堿基序列通過化學(xué)合成制備困難，所以例舉了希望為上述那樣鏈長的范圍。
在本發(fā)明中使用的稱之為模板的用語指的是可成為互補鏈合成的模板的一側(cè)的核酸。具有與模板互補的堿基序列的互補鏈雖然具有作為可與模板進行雜交的鏈的意思，但兩者的關(guān)系說到底只不過相對的關(guān)系。就是說，作為互補鏈合成的鏈可以再起到模板的作用。即互補鏈可以成為模板。
在本發(fā)明中，由靶DNA的堿基序列選擇的引物構(gòu)成各個FIP(正向內(nèi)引物，forward inner primer)、F3(正向外引物，forward outerprimer)、RIP(反向內(nèi)引物，reverse inner primer)以及R3引物(反向外引物，reverse outer primer)的任一個。
FIP設(shè)計成在3’末端帶有與靶DNA的F2c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上互補的F2區(qū)域的堿基序列，在5’末端帶有與靶DNA的F1c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列。此時，在F2以及F1c的序列間可以插入與靶DNA無關(guān)的序列。與該靶DNA無關(guān)的序列的長度只要是0～50堿基、優(yōu)選是0～40堿基都是容許的。
F3引物設(shè)計成具有與和靶DNA的F3c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上互補的F3區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列。
RIP設(shè)計成在3’末端帶有與靶DNA的R2c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上互補的R2區(qū)域的堿基序列，在5’末端帶有與靶DNA的R1c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列。RIP也與FIP同樣，在R2以及R1c的序列間可以插入與靶DNA無關(guān)的序列。
R3引物設(shè)計成具有與和靶DNA的R3c區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上互補的R3區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列。
另外，在LAMP法中通過并用至少一種以上的loop(回環(huán))引物，可以縮短擴增時間(專利文獻2)。所謂Loop引物指的是與啞鈴結(jié)構(gòu)的5’末端一側(cè)的回環(huán)的單鏈部分，具體來說如具有與R1區(qū)域和R2區(qū)域之間，或F1區(qū)域和F2區(qū)域之間互補的序列的引物。通過使用Loop引物，有可能增加DNA合成的起點。該Loop引物設(shè)計成可與在DNA合成過程中生成的FIP或RIP不進行雜交的回環(huán)區(qū)域雜交。
(人CK18檢測用的引物的設(shè)計)人CK18檢測用的引物可以選擇含有來自由已知的序列1所示的1412堿基構(gòu)成的堿基序列和/或其互補序列的至少5個以上連續(xù)堿基的適當(dāng)?shù)墓押塑账?，進行設(shè)計。另外序列1所示的堿基序列來自于Genbankaccession No.4557887。
人CK18檢測用的引物也可以按照上述引物的原理選擇區(qū)域進行設(shè)計。
人CK18檢測用引物的區(qū)域要注意堿基組成、GC含量、二級結(jié)構(gòu)、Tm值等，識別DNA的堿基序列的長度，堿基數(shù)可以選擇至少5個堿基以上，優(yōu)選10～30個堿基，更優(yōu)選17～25個堿基。Tm值一般可以通過Nearest Neighbor法求得。DNA區(qū)域選擇Tm值為55～65℃、最好是58～64℃的區(qū)域，GC含量選擇40～70％、最好是50～65％的含量。
利用這樣的條件，在本發(fā)明中選擇的引物區(qū)域包含在序列1所示的堿基序列的270～1375位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域、最好是堿基序列的280～580位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域。
人CK18檢測用引物是從以下各組的寡核苷酸選擇、設(shè)計的1)包含在序列1表示的堿基序列的270～1375位區(qū)域和/或其互補鏈的區(qū)域、堿基數(shù)至少5個以上的寡核苷酸，2)由序列2～41表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，3)上述1)或2)所述寡核苷酸的互補鏈，4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸，或5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列。
寡核苷酸可以通過本身眾所周知的方法制造，例如可以通過化學(xué)方式合成。也可以利用限制性內(nèi)切酶將天然的核酸切斷，改變、或連接成以上述那樣的堿基序列構(gòu)成。具體來說，可以通過寡核苷酸合成裝置(Applied Biosystems公司生產(chǎn)Expedite Model 8909 DNA合成儀)等進行合成。另外，使1個至數(shù)個堿基置換、缺失、插入或附加的變異的寡核苷酸合成法也可以使用眾所周知的方法。例如，可以單獨或適當(dāng)組合部位特異的突變導(dǎo)入法、基因同源重組法、引物延伸法或PCR法，根據(jù)例如，Molecular Cloning；A Laboratory Manual、《分子克隆實驗指南》，2版、Sambrook等人編、冷泉諾實驗室出版社，紐約，1989年；《LaborManual基因工程》、村松正實編、丸善株式會社、1988年；[PCR技術(shù)，DNA擴增的原理和應(yīng)用]、Ehrlich，HE.編、Strockton出版公司，1989年等記載的方法，或?qū)@些方法進行改變后實施，例如可以利用Ulmer的技術(shù)(Science(1983)219666)。
嚴(yán)格的雜交條件可以選擇一般都知道的條件。作為該條件的例子，如在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉、pH7.6、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸、以及20μg/ml的DNA的溶液中于42℃下雜交過夜后，于室溫下在2×SSC中清洗一次，然后在約65℃下用0.1×SSC·0.1％SDS清洗二次的條件。
這里要擴增的核酸的模板由于是人CK18的mRNA，使用的引物必須要設(shè)計成不擴增檢體中所含有的基因組DNA那樣的引物。具體來說，希望在本發(fā)明引物組包含的引物中至少有一個含有跨越人CK18基因中多個外顯子的區(qū)域。通過想了這樣的辦法，來自基因組DNA的序列的擴增可被排除，可以有選擇地擴增來自人CK的mRNA的序列。
(人CK19檢測用的引物的設(shè)計)人CK19檢測用的引物也可以與人CK18檢測用引物同樣進行設(shè)計。人CK19檢測用的引物可以選擇含有來自由已知的序列342所示的1360堿基構(gòu)成的堿基序列和/或其互補序列構(gòu)成的至少5個以上連續(xù)堿基的適當(dāng)?shù)墓押塑账?，進行設(shè)計。另外序列342所示的堿基序列來自于Genbank accession No.4504916。
人CK19檢測用的引物也可以根據(jù)上述原理，選擇區(qū)域進行設(shè)計。
人CK19檢測用引物的區(qū)域包含在序列342所示的堿基序列的270～930位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域、最好是堿基序列的270～560位、370～585位、625～854位的區(qū)域或655～930位及其互補鏈的區(qū)域。
人CK19檢測用引物是從以下各組的寡核苷酸進行選擇、設(shè)計的1)包含在序列342表示的堿基序列的270～930位區(qū)域和/或其互補鏈的區(qū)域、最好是堿基序列的270～560位、370～585位、625～854位的區(qū)域或655～930位及其互補鏈的區(qū)域的，至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸，2)由序列343～382表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，3)上述1)或2)所述寡核苷酸的互補鏈，4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸，或5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列。(人CK20檢測用的引物的設(shè)計)人CK20檢測用的引物也可以與人CK18檢測用引物或人CK19檢測用引物同樣進行設(shè)計。人CK20檢測用的引物可以選擇含有來自由已知的序列435所示1275堿基構(gòu)成的堿基序列和/或其互補序列構(gòu)成的至少5個以上連續(xù)堿基的適當(dāng)?shù)墓押塑账?，進行設(shè)計。另外序列435所示的堿基序列來自于Genbank accession No.402644。
人CK20檢測用的引物也可以根據(jù)上述的原理選擇區(qū)域進行設(shè)計。
人CK20檢測用引物的區(qū)域包含在序列435所示的堿基序列的340～1050位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域、最好是堿基序列的340～490位、495～570位或790～1050位及其互補鏈的區(qū)域。
人CK20檢測用引物是從以下各組的寡核苷酸進行選擇、設(shè)計的1)包含在序列435表示的堿基序列的340～1050位區(qū)域和/或其互補鏈的區(qū)域、比較好的是堿基序列的340～490位或790～1050位區(qū)域和/或其互補鏈的區(qū)域、最好是堿基序列的340～490位、495～570位或495～1050位區(qū)域和/或其互補鏈的區(qū)域的，至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸，2)由序列436～474表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，3)上述1)或2)所述寡核苷酸的互補鏈，4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸，或5)含有上述1)～4)所述寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列。
(引物組)使用本發(fā)明的引物進行擴增時，要將至少2種引物組合作為引物組使用。在LAMP法中，要將至少4種引物(FIP、F3引物、RIP、R3引物)組合作為引物組使用。另外，也可以將1種以上的回環(huán)(Loop)引物組合作為引物組使用。
(RT-LAMP法)
RT-LAMP法是以RNA為模板的LAMP法，LAMP法的基本思路如專利文獻1所述的那樣。利用RT-LAMP法可以在一個溶液中由模板RNA合成cDNA，并合成LAMP法的起點結(jié)構(gòu)。具體來說，經(jīng)過以下的1)步驟后，通過反復(fù)進行2)～5)步驟，反復(fù)進行DNA的延伸，進行靶DNA的擴增。
1)RIP與模板RNA鏈結(jié)合，與模板RNA鏈互補的DNA鏈進行延伸。該反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄酶、例如來自AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶等。
2)F3引物使在上述1)合成的從FIP開始的DNA鏈從模板RNA邊脫落，與模板RNA鏈互補的DNA鏈邊進行延伸。以后DNA鏈的延伸依賴于DNA聚合酶。
3)RIP與上述2)脫落的DNA結(jié)合后，DNA鏈進行延伸。
4)R3引物使在上述3)伸長的從RIP開始的DNA邊脫落，與由FIP開始的DNA互補的DNA鏈邊進行延伸，合成LAMP法的起點結(jié)構(gòu)。
5)在上述4)脫落的DNA鏈的兩端序列由于具有與同一DNA鏈的序列中互補的序列，所以可各自進行雜交，兩端帶有Loop(回環(huán))結(jié)構(gòu)。
另外，例如象BcaDNA polymerase那樣，存在具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性的兩種活性的酶，使用這樣的酶時，上述反應(yīng)可以使用1個酶實施。
(檢測方法)在LAMP法中，由于合成的DNA鏈具有與自己的序列互補的序列，所以其大部分形成堿基對。利用該特征，可以進行擴增產(chǎn)物的檢測。如果在有象溴乙錠、SYBER GREEN I、或Pico Green那樣的雙鏈嵌入劑的熒光色素存在下，使用本發(fā)明的引物實施核酸擴增，伴隨著產(chǎn)物的增加可以觀察到熒光強度的增大。如果對其進行監(jiān)測，可以同時追蹤閉鏈體系中DNA的擴增和熒光的增加(參見《臨床檢查法提要》、31版1318頁；特開2001-242169號公報。以下簡單稱之為“實時(real-time)法”)。
另外，利用LAMP法，在擴增反應(yīng)過程中作為副產(chǎn)物生成不溶性的焦磷酸鎂，出現(xiàn)白色混濁。因此通過目視對反應(yīng)液的混濁進行確認(rèn)，或通過測定反應(yīng)液的吸光度或散射光強度，檢測濁度，或用有色的濾膜過濾反應(yīng)液確認(rèn)膜上的殘渣，可以檢測擴增產(chǎn)物的有無(參見國際公開WO01/83817號)(試劑、試劑盒、其他)使用本發(fā)明的引物進行核酸檢測時需要的各種試劑類可以預(yù)先進行包裝做成試劑盒。具體來說，提供作為本發(fā)明的互補鏈合成的引物，或作為置換用的引物所需要的各種寡核苷酸、具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶、作為互補鏈合成的底物的dNTP、進行鏈置換型的互補鏈合成的DNA聚合酶、賦予適合酶反應(yīng)的條件的緩沖液、如有必要，提供象RNase抑制劑那樣用于除去抑制擴增反應(yīng)的物質(zhì)的藥劑，另外根據(jù)需要，作為試劑盒提供用于反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要的試劑類。
本發(fā)明包括核酸擴增用引物以及引物組、以及使用這些引物的核酸檢測方法、在核酸檢測方法中使用的檢測試劑、核酸檢測試劑盒等以及核酸檢測系統(tǒng)的整體。
(實施例)以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體說明，但本發(fā)明并限定于這些實施例。
(實施例1-1)由人CK18堿基序列選擇區(qū)域使用探針設(shè)計軟件由人CK18堿基序列研究適合LAMP法的區(qū)域位置。F1c以及R1c按照Tm值為58.5～63.5℃、F2以及R2按照Tm值為61.5～62.5℃、F3以及R3按照Tm值為58.5～62.5℃的條件選擇區(qū)域，結(jié)果選擇了如下所示的區(qū)域。被選擇的區(qū)域包含在序列1所示的堿基序列的340～1050位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域。
F1c對應(yīng)于序列1所示序列上堿基位置的互補鏈的區(qū)域442-420 tgaagtaatggctccagtctctg (序列2)439-418 agtaatggctccagtctctgac(序列3)443-421 ttgaagtaatggctccagtctct (序列4)419-403 acctggggtcccttctt (序列5)414-396 gggtcccttcttctccaag (序列6)413-394 ggtcccttcttctccaagtg (序列7)412-393 gtcccttcttctccaagtgc (序列8)411-392 tcccttcttctccaagtgct (序列9)410-392 cccttcttctccaagtgctc (序列10)409-390 ccttcttctccaagtgctcc (序列11)584-568 acagactggcgcatggc (序列12)620-602 tcaatgaccttgcggagcc (序列13)621-602 atcaatgaccttgcggagcc (序列14)622-603 catcaatgaccttgcggagc (序列15)623-603 tcatcaatgaccttgcggagc (序列16)666-648 agcctcgatctctgtctcc (序列17)743-726 gagctggcaatctgggct(序列18)742-725 agctggcaatctgggctt(序列19)741-724 gctggcaatctgggcttg(序列20)740-720 ctggcaatctgggcttgtagg (序列21)739-720 tggcaatctgggcttgtagg (序列22)738-719 ggcaatctgggcttgtaggc (序列23)756-740 cacggtcaacccagagc (序列24)795-777 gatcttggcgaggtcctga (序列25)809-789 cggatgtctgccatgatcttg (序列26)829-810 ccagctcgtcatattgggcc (序列27)
913-894 cagcagactgtgtggtgacc (序列28)941-924 gtgagcgtcgtctcagca (序列29)1008-987 gctggccttcagatttctcatg (序列30)355-335 ccaggctcctcactctgtcca (序列31)430-410 tccagtctctgacctggggtc (序列32)588-569 ctccacagactggcgcatgg (序列33)769-748 gggcatctacctccacggtcaa (序列34)897-877 gaccactgtggtgctctcctc (序列35)925-904 cagctccaacctcagcagactg (序列36)1263-1242 ggtttgcatggagttgctgctg (序列37)F2序列1所示序列上的堿基位置的區(qū)域376-392 gagagcaaaatccggga(序列38)377-393 agagcaaaatccgggag(序列39)378-394 gagcaaaatccgggagc(序列40)384-400 aatccgggagcacttgg(序列41)369-385 gaggctggagagcaaaa(序列42)523-540 cgtcttgctgctgatgac (序列43)524-542 gtcttgctgctgatgactt (序列44)543-565 tagagtcaagtatgagacagagc (序列45)544-565 agagtcaagtatgagacagagc (序列46)546-566 agtcaagtatgagacagagct(序列47)588-604 gaacgacatccatgggc(序列48)660-676 cgaggctctcaaggagg(序列49)661-677 gaggctctcaaggagga(序列50)662-678 aggctctcaaggaggag(序列51)687-706 catgaagaagaaccacgaag (序列52)
719-736 gcctacaagcccagattg (序列53)747-763 gttgaccgtggaggtag (序列54)768-784 ccccaaatctcaggacc (序列55)839-855 accgagaggagctagac (序列56)878-894 aggagagcaccacagtg (序列57)943-960 gagctgagacgtacagtc (序列58)295-314 gagaccatgcaaagcctgaa(序列59)369-388 gaggctggagagcaaaatcc(序列60)523-542 cgtcttgctgctgatgactt(序列61)708-729 ggaagtaaaaggcctacaagcc (序列62)837-857 gaaccgagaggagctagacaa (序列63)864-884 gtctcagcagattgaggagag (序列64)1202-1221 tggaagatggcgaggacttt (序列65)F3序列1所示序列上的堿基位置的區(qū)域322-338 ctggcctcttacctgga (序列66)293-309 aggagaccatgcaaagc (序列67)470-489 tcttcgcaaatactgtggac(序列68)466-486 cagatcttcgcaaatactgtg (序列69)473-491 tcgcaaatactgtggacaa (序列70)476-495 caaatactgtggacaatgcc(序列71)523-540 cgtcttgctgctgatgac (序列72)546-566 agtcaagtatgagacagagct (序列73)624-643 caccaatatcacacgactgc(序列74)687-706 catgaagaagaaccacgaag(序列75)695-712 agaaccacgaagaggaag (序列76)747-763 gttgaccgtggaggtag (序列77)
812-829 cccaatatgacgagctgg (序列78)845-864 aggagctagacaagtactgg(序列79)855-873 caagtactggtctcagcag (序列80)907-923 tctgctgaggttggagc (序列81)275-294 gaggcatccagaacgagaag(序列82)349-366 agcctggagaccgagaac (序列83)490-507 aatgcccgcatcgttctg (序列84)672-690 ggaggagctgctcttcatg (序列85)807-824 ccgggcccaatatgacga (序列86)840-859 ccgagaggagctagacaagt(序列87)1176-1193 tgagatcgccacctaccg(序列88)R1c序列1所示序列上的堿基位置的區(qū)域444-463 gatcatcgaggacctgaggg(序列89)420-442 cagagactggagccattacttca (序列90)424-447 gactggagccattacttcaagatc(序列91)425-448 actggagccattacttcaagatca(序列92)426-450 ctggagccattacttcaagatcatc (序列93)427-451 tggagccattacttcaagatcatcg (序列94)428-451 ggagccattacttcaagatcatcg(序列95)429-453 gagccattacttcaagatcatcgag (序列96)430-454 agccattacttcaagatcatcgagg (序列97)431-454 gccattacttcaagatcatcgagg(序列98)432-456 ccattacttcaagatcatcgaggac (序列99)433-457 cattacttcaagatcatcgaggacc (序列100)587-605 agaacgacatccatgggct (序列101)588-606 gaacgacatccatgggctc (序列102)
589-607 aacgacatccatgggctcc (序列103)590-607 acgacatccatgggctcc (序列104)598-614 catgggctccgcaaggt (序列105)632-649 tcacacgactgcagctgg (序列106)624-645 caccaatatcacacgactgcag (序列107)630-649 tatcacacgactgcagctgg(序列108)631-649 atcacacgactgcagctgg (序列109)685-708 ttcatgaagaagaaccacgaagag(序列110)739-756 agctctgggttgaccgtg (序列111)740-756 gctctgggttgaccgtg (序列112)741-757 ctctgggttgaccgtgg (序列113)742-758 tctgggttgaccgtgga (序列114)743-759 ctgggttgaccgtggag (序列115)744-760 tgggttgaccgtggagg (序列116)746-764 ggttgaccgtggaggtaga (序列117)747-767 gttgaccgtggaggtagatgc (序列118)748-767 ttgaccgtggaggtagatgc(序列119)749-767 tgaccgtggaggtagatgc (序列120)750-768 gaccgtggaggtagatgcc (序列121)751-768 accgtggaggtagatgcc (序列122)766-783 gcccccaaatctcaggac (序列123)812-831 cccaatatgacgagctggct(序列124)855-877 caagtactggtctcagcagattg (序列125)924-941 tgctgagacgacgctcac (序列126)947-966 tgagacgtacagtccagtcc(序列127)1016-1032 acagcctgagggaggtg (序列128)
360-379 cgagaaccggaggctggaga (序列129)443-464 agatcatcgaggacctgagggc (序列130)592-611 gacatccatgggctccgcaa (序列131)778-799 caggacctcgccaagatcatgg (序列132)900-921 cacacagtctgctgaggttgga (序列133)928-948 gagacgacgctcacagagctg(序列134)1277-1296 ccacccgccggatagtggat (序列135)R2對應(yīng)于序列1所示序列上的堿基位置的互補鏈的區(qū)域540-523 gtcatcagcagcaagacg (序列136)541-523 agtcatcagcagcaagacg (序列137)494-475 gcattgtccacagtatttgc (序列138)493-474 cattgtccacagtatttgcg (序列139)492-473 attgtccacagtatttgcga (序列140)491-473 ttgtccacagtatttgcga (序列141)490-472 tgtccacagtatttgcgaa (序列142)489-470 gtccacagtatttgcgaaga (序列143)488-468 tccacagtatttgcgaagatc(序列144)487-467 ccacagtatttgcgaagatct(序列145)486-466 cacagtatttgcgaagatctg(序列146)678-662 ctcctccttgagagcct(序列147)677-661 tcctccttgagagcctc(序列148)676-660 cctccttgagagcctcg(序列149)675-659 ctccttgagagcctcga(序列150)673-657 ccttgagagcctcgatc(序列151)672-655 cttgagagcctcgatctc (序列152)667-651 gagcctcgatctctgtc(序列153)
666-649 agcctcgatctctgtctc(序列154)665-649 gcctcgatctctgtctc (序列155)713-696 acttcctcttcgtggttc(序列156)721-702 ggccttttacttcctcttcg (序列157)714-696 tacttcctcttcgtggttc (序列158)762-746 tacctccacggtcaacc (序列159)809-792 cggatgtctgccatgatc(序列160)808-790 ggatgtctgccatgatctt (序列161)829-812 ccagctcgtcatattggg(序列162)877-858 caatctgctgagaccagtac (序列163)874-856 tctgctgagaccagtactt (序列164)922-906 ctccaacctcagcagac (序列165)985-969 agtccaggtcgatctcc (序列166)1006-987 tggccttcagatttctcatg (序列167)1011-994 caagctggccttcagatt (序列168)1086-1070 aaggtgcagcaggatcc (序列169)437-417 taatggctccagtctctgacc (序列170)515-496 tcaatctgcagaacgatgcg (序列171)669-649 gagagcctcgatctctgtctc (序列172)669-650 gagagcctcgatctctgtct (序列173)857-837 ttgtctagctcctctcggttc (序列174)857-838 ttgtctagctcctctcggtt (序列175)981-962 caggtcgatctccaaggact (序列176)1008-989 gctggccttcagatttctca (序列177)1350-1331 gctggcttaatgcctcagaa(序列178)
R3對應(yīng)于序列1所示序列上的堿基位置的互補鏈的區(qū)域566-546 agctctgtctcatacttgact(序列179)541-523 agtcatcagcagcaagacg (序列180)540-523 9gtcatcagcagcaagacg (序列181)721-702 ggccttttacttcctcttcg (序列182)713-696 acttcctcttcgtggttc (序列183)740-724 ctggcaatctgggcttg(序列184)786-769 gaggtcctgagatttggg (序列185)854-837 tctagctcctctcggttc (序列186)877-858 caatctgctgagaccagtac (序列187)922-906 ctccaacctcagcagac(序列188)910-894 cagactgtgtggtgacc(序列189)893-877 actgtggtgctctcctc(序列190)960-943 gactgtacgtctcagctc (序列191)1021-1005 ggctgttctccaagctg (序列192)1056-1039 catctgtagggcgtagcg (序列193)1141-1125 catactcctgggcctgg (序列194)476-458 gcgaagatctgagccctca (序列195)538-521 catcagcagcaagacggg (序列196)688-670 tgaagagcagctcctcctt (序列197)885-866 gctctcctcaatctgctgag (序列198)1008-989 gctggccttcagatttctca(序列199)1030-1012 cctccctcaggctgttctc(序列200)1370-1352 ccaaagggtaccctgcttc(序列201)Loop F對應(yīng)于序列1所示序列上的堿基位置的互補鏈的區(qū)域419-403 acctggggtcccttctt(序列202)
414-396 gggtcccttcttctccaag (序列203)413-394 ggtcccttcttctccaagtg (序列204)399-380 caagtgctcccggattttgc (序列205)398-380 aagtgctcccggattttgc (序列206)397-379 agtgctcccggattttgct (序列207)396-378 gtgctcccggattttgctc (序列208)395-377 tgctcccggattttgctct (序列209)394-376gctcccggattttgctctc(序列210)567-544 cagctctgtctcatacttgactct (序列211)584-568 acagactggcgcatggc (序列212)709-688 cctcttcgtggttcttcttcat(序列213)916-898 cctcagcagactgtgtggt (序列214)913-894 cagcagactgtgtggtgacc (序列215)567-544 cagctctgtctcatacttgactct (序列216)743-726 gagctggcaatctgggct(序列217)1243-1224 tgtccaaggcatcaccaaga(序列218)1242-1222 gtccaaggcatcaccaagatt (序列219)Loop R序列1所示序列上的堿基位置的區(qū)域474-495 cgcaaatactgtggacaatgcc(序列220)466-489 cagatcttcgcaaatactgtggac (序列221)444-463 gatcatcgaggacctgaggg (序列222)626-646 ccaatatcacacgactgcagc (序列223)617-640 ttgatgacaccaatatcacacgac (序列224)632-649 tcacacgactgcagctgg(序列225)659-676 tcgaggctctcaaggagg(序列226)767-784 cccccaaatctcaggacc(序列227)
970-986 gagatcgacctggactc (序列228)622-643 gacaccaatatcacacgactgc (序列229)621-643 tgacaccaatatcacacgactgc(序列230)623-644 acaccaatatcacacgactgca (序列231)810-829 ggcccaatatgacgagctgg (序列232)1296-1315 tggcaaagtggtgtctgaga (序列233)(實施例1-2)CK18檢測用引物的設(shè)計由實施例1-1選擇的區(qū)域的序列獲得適用于LAMP法的如下核酸擴增用引物。
FIP(由連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的堿基序列構(gòu)成的引物)09FA971-376 tgaagtaatggctccagtctctggagagcaaaatccggga(序列234)09FA971-377 tgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccgggag(序列235)09FA971-378 tgaagtaatggctccagtctctggagcaaaatccgggagc(序列236)09FA971-384 tgaagtaatggctccagtctctgaatccgggagcacttgg(序列237)09FA974-376 agtaatggctccagtctctgacgagagcaaaatccggga (序列238)09FA974-377 agtaatggctccagtctctgacagagcaaaatccgggag (序列239)09FA974-378 agtaatggctccagtctctgacgagcaaaatccgggagc (序列240)09FA974-384 agtaatggctccagtctctgacaatccgggagcacttgg (序列241)09FA970-376 ttgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccggga(序列242)09FA970-377 ttgaagtaatggctccagtctctagagcaaaatccgggag(序列243)09FA970-378 ttgaagtaatggctccagtctctgagcaaaatccgggagc(序列244)09FA970-384 ttgaagtaatggctccagtctctaatccgggagcacttgg(序列245)09FA999-369 gggtcccttcttctccaaggaggctggagagcaaaa(序列246)09FA994-369 acctggggtcccttcttgaggctggagagcaaaa (序列247)09FA1000-369 ggtcccttcttctccaagtggaggctggagagcaaaa (序列248)
09FA1002-369 tcccttcttctccaagtgctgaggctggagagcaaaa (序列249)09FA1004-369 ccttcttctccaagtgctccgaggctggagagcaaaa (序列250)12FA829-523 acagactggcgcatggccgtcttgctgctgatgac (序列251)12FA829-524 acagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgactt (序列252)13FA793-543 tcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (序列253)13FA793-544 tcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc(序列254)13FA793-546 tcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct (序列255)13FA792-543 atcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (序列256)13FA792-544 atcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (序列257)13FA792-546 atcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct(序列258)13FA791-543 catcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc (序列259)13FA791-544 catcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (序列260)13FA791-546 catcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct(序列261)13FA790-543 tcatcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc (序列262)13FA790-544 tcatcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (序列263)13FA790-546 tcatcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct (序列264)14FA747-588 agcctcgatctctgtctccgaacgacatccatgggc (序列265)18FA675-660 ggcaatctgggcttgtaggccgaggctctcaaggagg(序列266)18FA670-660 gagctggcaatctgggctcgaggctctcaaggagg (序列267)18FA670-662 gagctggcaatctgggctaggctctcaaggaggag (序列268)18FA674-660 tggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagg(序列269)18FA674-662 tggcaatctgggcttgtaggaggctctcaaggaggag(序列270)18FA675-661 ggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagga(序列271)18FA675-662 ggcaatctgggcttgtaggcaggctctcaaggaggag(序列272)19FA657-687 cacggtcaacccagagccatgaagaagaaccacgaag(序列273)21FA618-719 gatcttggcgaggtcctgagcctacaagcccagattg(序列274)21FA604-747 cggatgtctgccatgatcttggttgaccgtggaggtag (序列275)
23FA584-768 ccagctcgtcatattgggccccccaaatctcaggacc(序列276)27FA500-839 cagcagactgtgtggtgaccaccgagaggagctagac(序列277)29FA472-878 gtgagcgtcgtctcagcaaggagagcaccacagtg (序列278)32FA405-943 gctggccttcagatttctcatggagctgagacgtacagtc (序列279)ek 335-295 ccaggctcctcactctgtccagagaccatgcaaagcctgaa (序列280)ek 410-369 tccagtctctgacctggggtcgaggctggagagcaaaa(序列281)ek 569-523 ctccacagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgac(序列282)ek 748-708 gggcatctacctccacggtcaaggaagtaaaaggcctacaagcc (序列283)ek 877-837 gaccactgtggtgctctcctcgaaccgagaggagctagacaa(序列284)ek 904-864 cagctccaacctcagcagactggtctcagcagattgaggagag (序列285)ek 1242-1202 ggtttgcatggagttgctgctgtggaagatggcgaggacttt (序列286)(序列287)RIP(由連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的堿基序列構(gòu)成的引物)09RA444-873 gatcatcgaggacctgaggggtcatcagcagcaagacg (序列288)09RA444-872 gatcatcgaggacctgagggagtcatcagcagcaagacg (序列289)09RA420-927 cagagactggagccattacttcacacagtatttgcgaagatctg (序列290)09RA420-925 cagagactggagccattacttcatccacagtatttgcgaagatc (序列291)09RA420-923 cagagactggagccattacttcatgtccacagtatttgcgaaa (序列292)09RA420-919 cagagactggagccattacttcagcattgtccacagtatttgc (序列293)09RA424-927 gactggagccattacttcaagatccacagtatttgcgaagatctg(序列294)09RA424-923 gactggagccattacttcaagatctgtccacagtatttgcgaa (序列295)09RA424-921 gactggagccattacttcaagatcattgtccacagtatttgcga (序列296)12RA598-737 catgggctccgcaaggtcctccttgagagcctcg (序列297)12RA587-746 agaacgacatccatgggctgagcctcgatctctgtc (序列298)12RA588-737 gaacgacatccatgggctccctccttgagagcctcg (序列299)12RA588-746 gaacgacatccatgggctcgagcctcgatctctgtc (序列300)
12RA588-748 gaacgacatccatgggctcgcctcgatctctgtctc (序列301)12RA590-737 acgacatccatgggctcccctccttgagagcctcg (序列302)12RA590-746 acgacatccatgggctccgagcctcgatctctgtc (序列303)12RA590-748 acgacatccatgggctccgcctcgatctctgtctc (序列304)12RA598-740 catgggctccgcaaggtccttgagagcctcgatc(序列305)12RA598-746 catgggctccgcaaggtgagcctcgatctctgtc(序列306)13RA632-700 tcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (序列307)13RA632-692 tcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg(序列308)13RA632-699 tcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (序列309)13RA624-700 caccaatatcacacgactgcagacttcctcttcgtggttc (序列310)13RA624-699 caccaatatcacacgactgcagtacttcctcttcgtggttc (序列311)13RA624-692 caccaatatcacacgactgcagggccttttacttcctcttcg(序列312)13RA631-700 atcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (序列313)13RA631-699 atcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc(序列314)13RA631-692 atcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (序列315)13RA630-700 tatcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc(序列316)13RA630-699 tatcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (序列317)13RA630-692 tatcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (序列318)14RA685-651 ttcatgaagaagaaccacgaagagtacctccacggtcaacc (序列319)18RA743-604 ctgggttgaccgtggagcggatgtctgccatgatc (序列320)18RA743-605 ctgggttgaccgtggagggatgtctgccatgatctt (序列321)18RA747-604 gttgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc (序列322)18RA749-604 tgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc (序列323)18RA751-604 accgtggaggtagatgcccggatgtctgccatgatc (序列324)18RA749-605 tgaccgtggaggtagatgcggatgtctgccatgatctt(序列325)18RA751-605 accgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatctt (序列326)19RA766-584 gcccccaaatctcaggacccagctcgtcatattggg (序列327)
(序列328)23RA855-491 caagtactggtctcagcagattgctccaacctcagcagac (序列329)27RA924-428 tgctgagacgacgctcacagtccaggtcgatctcc (序列330)29RA947-402 tgagacgtacagtccagtcccaagctggccttcagatt(序列331)29RA947-407 tgagacgtacagtccagtcctggccttcagatttctcatg (序列332)32RA1016-327 acagcctgagggaggtgaaggtgcagcaggatcc (序列333)ek 360-417 cgagaaccggaggctggagataatggctccagtctctgacc (序列334)ek 443-496 agatcatcgaggacctgagggctcaatctgcagaacgatgcg (序列335)ek 592-649 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtctc (序列336)ek 592-650 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtct (序列337)ek 778-837 caggacctcgccaagatcatgggaaccgagaggagctagacaa(序列338)ek 900-962 cacacagtctgctgaggttggacaggtcgatctccaaggact (序列339)ek 928-989 gagacgacgctcacagagctggctggccttcagatttctca (序列340)ek 1277-1331 ccacccgccggatagtggatgctggcttaatgcctcagaa (序列341)F3引物(由各個序列表示的堿基序列構(gòu)成的引物)F309-322(序列 66)、F309-293(序列 67)、F312-470(序列 68)、F312-466(序列 69)、F312-473(序列 70)、F312-476(序列 71)、F313-523(序列 72)、F314-546(序列 73)、F319-624(序列 74)、F321-687(序列 75)、F321-695(序列 76)、F323-747(序列 77)、F327-812(序列 78)、F329-845(序列 79)、F329-855(序列 80)、F332-907(序列 81)、F3 8 (序列 82)、F3 13 (序列 83)、F3 14 (序列 84)、F3 16 (序列 85)、F3 23 (序列 86)、F3 29 (序列 87)、F3 37 (序列 88)
R3引物(由各個序列表示的堿基序列構(gòu)成的引物)R309-847(序列 179)、R309-872(序列 180)、R309-873(序列 181)、R312-692(序列 182)、R312-700(序列 183)、R313-673(序列 184)、R314-627(序列 185)、R318-559(序列 186)、R319-536(序列 187)、R321-491(序列 188)、R321-503(序列 189)、R321-520(序列 190)、R323-453(序列 191)、R327-392(序列 192)、R329-357(序列 193)、R332-272(序列 194)、R3 8 (序列 195)、R3 13 (序列 196)、R3 14 (序列 197)、R3 16 (序列 198)、R3 21 (序列 199)、R3 35 (序列 200)、R3 37 (序列 201)Loop引物(由各個序列表示的堿基序列構(gòu)成的引物)LF09-944 (序列 202)、LF09-999 (序列 203)、LF09-1000(序列 204)、LF09-1014(序列 205)、LF09-1015(序列 206)、LF09-1016(序列 207)、LF09-1017(序列 208)、LF09-1018(序列 209)、LF09-1019(序列 210)、LF12-846 (序列 211)、LF13-829 (序列 212)、LF18-704 (序列 213)、LF29-497 (序列 214)、LF29-500 (序列 215)、LF 14(序列 216)、LF 20(序列 217)、LF 371 (序列 218)、LF 372 (序列 219)、LR09-474 (序列 220)、LR09-466 (序列 221)、LR09-444 (序列 222)、LR12-616 (序列 223)、LR12-617 (序列 224)、LR12-632 (序列 225)、LR13-659 (序列 226)、LR18-767 (序列 227)、
LR29-970 (序列228)、LB 14 (序列229)、LB 151(序列230)、LB 152 (序列231)、LB 371(序列232)、LB 372 (序列233)、(實施例2-1)由人CK19堿基序列選擇區(qū)域使用探針設(shè)計軟件由序列342記載的人CK19堿基序列研究適合LAMP法的區(qū)域位置。F1c以及R1c按照Tm值為58.5～63.5℃、F2以及R2按照Tm值為61.5～62.5℃、F3以及R3按照Tm值為58.5～62.5℃的條件選擇區(qū)域，結(jié)果選擇了如下所示的區(qū)域。被選擇的區(qū)域包含在序列342所示的堿基序列的270～930位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域。
F1c處于序列342記載的序列的互補鏈上的區(qū)域426-405 5’-tgtagtagtggctgtagtcgcg-3’ (序列343)429-407 5’-tcgtgtagtagtggctgtagtcg-3’(序列344)479-458 5’-ggagttctcaatggtggcacca-3’ (序列345)716-700 5’-ttggcccctcagcgtac-3’(序列346)752-735 5’-agcggaatccacctccac-3’ (序列347)747-728 5’-aatccacctccacactgacc-3’ (序列348)746-728 5’-atccacctccacactgacc-3’(序列349)745-728 5’-tccacctccacactgacc-3’ (序列350)F2序列342記載的序列上的區(qū)域352-370 5’-agctagaggtgaagatccg-3’(序列351)364-380 5’-agatccgcgactggtac-3’(序列352)360-376 5’-gtgaagatccgcgactg-3’(序列353)417-437 5’-actactacacgaccatccagg-3’(序列354)658-674 5’-aagagctggcctacctg-3’(序列355)690-709 5’-gaggaaatcagtacgctgag-3’ (序列356)
F3序列342記載的序列上的區(qū)域275-293 5’-gctaaccatgcagaacctc-3’ (序列357)375-392 5’-tggtaccagaagcagggg-3’ (序列358)628-645 5’-acctggagatgcagatcg-3’ (序列359)658-674 5’-aagagctggcctacctg-3’ (序列360)661-677 5’-agctggcctacctgaag-3’ (序列361)R1c序列342記載的序列上的區(qū)域533-516 5’-gtgccaccattgagaactcc-3’ (序列362)485-505 5’-tgtcctgcagatcgacaacgc-3’ (序列363)486-506 5’-gtcctgcagatcgacaacgcc-3’ (序列364)727-744 5’-aggtcagtgtggaggtgg-3’ (序列365)764-783 -tctcgccaagatcctgagtg-3’ (序列366)766-785 5’-tcgccaagatcctgagtgac-3’ (序列367)772-793 5’-agatcctgagtgacatgcgaag-3’(序列368)R2處于序列342記載的序列的互補鏈上的區(qū)域533-516 5’-ggttcggaagtcatctgc-3’ (序列369)545-526 5’-cgtctcaaacttggttcgga-3’ (序列370)547-528 5’-tccgtctcaaacttggttcg-3’ (序列371)790-773 5’-cgcatgtcactcaggatc-3’ (序列372)841-824 5’-caggcttcagcatccttc-3’ (序列373)848-832 5’-ggtgaaccaggcttcag-3’ (序列374)847-831 5’-gtgaaccaggcttcagc-3’ (序列375)845-828 5’-gaaccaggcttcagcatc-3’ (序列376)843-827 5’-accaggcttcagcatcc-3’ (序列377)
R3處于序列342記載的序列的互補鏈上的區(qū)域556-540 5’-agagcctgttccgtctc-3’ (序列378)567-584 5’-gtggaggccgacatcaac-3’(序列379)841-824 5’-caggcttcagcatccttc-3’(序列380)916-900 5’-tcggacctgctcatctg-3’ (序列381)925-908 5’-tcagtaacctcggacctg-3’(序列382)923-907 5’-agtaacctcggacctgc-3’ (序列383)921-905 5’-taacctcggacctgctc-3’ (序列384)Loop F處于序列342記載的序列的互補鏈上的區(qū)域395-381 5’-aggcccctgcttctg-3’ (序列385)393-379 5’-gcccctgcttctggt-3’ (序列386)392-376 5’-cccctgcttctggtacc-3’ (序列387)392-375 5’-cccctgcttctggtacca-3’(序列388)393-376 5’-gcccctgcttctggtacc-3’(序列389)395-380 5’-aggcccctgcttctgg-3’(序列390)394-379 5’-ggcccctgcttctggt-3’(序列391)457-440 5’-agaatcttgtcccgcagg-3’(序列392)456-440 5’-gaatcttgtcccgcagg-3’ (序列393)699-680 5’-tgatttcctcctcatggttc-3’(序列394)698-679 5’-gatttcctcctcatggttct-3’(序列395)694-676 5’-tcctcctcatggttcttct-3’ (序列396)734-318 5’-actgacctggcctccca-3’ (序列397)724-710 5’-cctcccacttggccc-3’ (序列398)Loop R序列342記載的序列上的區(qū)域493-510 5’-agatcgacaacgcccgtc-3’ (序列399)
(序列400)495-509 5’-atcgacaacgcccgt-3’ (序列401)496-509 5’-tcgacaacgcccgt-3’ (序列402)506-520 5’-ccgtctggctgcaga-3’ (序列403)507-520 5’-cgtctggctgcagatga-3’ (序列404)508-525 5’-gtctggctgcagatgact-3’ (序列405)509-526 5’-tctggctgcagatgactt-3’ (序列406)752-767 5’-tccgggcaccgatctc-3’ (序列407)756-771 5’-ggcaccgatctcgcca-3’ (序列408)755-769 5’-gggcaccgatctcgc-3’ (序列409)757-771 5’-gcaccgatctcgcca-3’ (序列410)805-822 5’-tcatggccgagcagaacc-3’ (序列411)806-821 5’-catggccgagcagaac-3’ (序列412)(實施例2-2)CK19檢測用引物的設(shè)計由實施例2-1選擇的區(qū)域的序列獲得適用于LAMP法的如下核酸擴增用引物。
將各個引物表示為在本發(fā)明RT-LAMP法中使用的引物組，每一個區(qū)域都分為A～D4個組。A組的各個引物是由序列342表示的堿基序列的270～560位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的，B組的各個引物同樣是由370～585位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域、C組的各個引物同樣是由625～854位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域、D組的各個引物同樣是由655～930位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域的各個區(qū)域選擇。
(A組)FIP(連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的引物)FA-401 5’-tgtagtagtggctgtagtcgcgagctagaggtgaagatccg-3’ (序列413)(連接了序列343以及351所示堿基序列的序列)
FA-403 5’-tgtagtagtggctgtagtcgcgagatccgcgactggtac-3’(序列414)(連接了序列343以及352所示堿基序列的序列)FA-404 5’-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagctagaggtgaagatccg-3’(序列415)(連接了序列344以及351所示堿基序列的序列)FA-405 5’-tcgtgtagtagtggctgtagtcggtgaagatccgcgactg-3’ (序列416)(連接了序列344以及351所示堿基序列的序列)FA-406 5’-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagatccgcgactggtac-3’ (序列417)(連接了序列344以及352所示堿基序列的序列)RIP(連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的引物)RA-401 5’-gtgccaccattgagaactccggttcggaagtcatctgc-3’ (序列418)(連接了序列362以及369所示堿基序列的序列)F3引物(與F3區(qū)域的堿基序列同一的序列)F3-401 5’-gctaaccatgcagaacctc-3’ (序列357)R3引物(與R3區(qū)域的堿基序列同一的序列)R3-401 5’-agagcctgttccgtctc-3’ (序列378)Loop引物(與loop F區(qū)域或loop R區(qū)域的堿基序列同一的序列)LPF-4015’-aggcccctgcttctg-3’ (序列385)LPF-4025’-gcccctgcttctggt-3’ (序列386)LPF-4035’-cccctgcttctggtacc-3’ (序列387)LPF-4045’-cccctgcttctggtacca-3’ (序列388)LPF-4055’-gcccctgcttctggtacc-3’ (序列389)LPF-4065’-aggcccctgcttctgg-3’ (序列390)LPF-4075’-ggcccctgcttctggt-3’ (序列391)LPR-4015’-agatcgacaacgcccgtc-3’ (序列399)
LPR-402 (序列400)LPR-4035’-atcgacaacgcccgt-3’ (序列401)LPR-4045’-tcgacaacgcccgt-3’(序列402)(B組)FIP(連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的引物)FA1-EK 5’-ggagttctcaatggtggcaccaactactacacgaccatccagg-3’ (序列419)(連接了序列346以及354所示堿基序列的序列)RIP(連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的引物)RA2-EK 5’-tgtcctgcagatcgacaacgccgtctcaaacttggttcgga-3’ (序列420)(連接了序列363以及370所示堿基序列的序列)RA6-EK 5’-gtcctgcagatcgacaacgcctccgtctcaaacttggttcg-3’ (序列421)(連接了序列364以及371所示堿基序列的序列)F3引物(與F3區(qū)域的堿基序列同一的序列)F3-EK 5’-tggtaccagaagcagggg-3’(序列358)R3引物(與R3區(qū)域的堿基序列同一的序列)R3-EK 5’-gtggaggccgacatcaac-3’(序列379)Loop引物(與loop F區(qū)域或loop R區(qū)域的堿基序列同一的序列)LPF1-EK5’-agaatcttgtcccgcagg-3’(序列392)LPF2-EK5’-gaatcttgtcccgcagg-3’ (序列393)LPR1-EK5’-ccgtctggctgcaga-3’ (序列403)LPR2-EK5’-cgtctggctgcagatga-3’ (序列404)LPR3-EK5’-gtctggctgcagatgact-3’(序列405)LPR4-EK5’-tctggctgcagatgactt-3’(序列406)
(C組)FIP(連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的引物)FA-1101 5’-ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3’ (序列422)(連接了序列346以及355所示堿基序列的序列)RIP(連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的引物)RA-1101 5’-aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3’ (序列423)(連接了序列365以及372所示堿基序列的序列)F3引物(與F3區(qū)域的堿基序列同一的序列)F3-1101 5’-acctggagatgcagatcg-3’ (序列359)R3引物(與R3區(qū)域的堿基序列同一的序列)R3-1101 5’-caggcttcagcatccttc-3’ (序列380)Loop引物(與loop F區(qū)域或loop R區(qū)域的堿基序列同一的序列)LPF1-1101 5’-tgatttcctcctcatggttc-3’ (序列394)LPF1-1102 5’-gatttcctcctcatggttct-3’ (序列395)LPF1-1102 5’-tcctcctcatggttcttct-3’ (序列396)LPR1-1101 5’-tccgggcaccgatctc-3’ (序列407)LPR1-1102 5’-ggcaccgatctcgcca-3’ (序列408)LPR1-1103 5’-gggcaccgatctcgc-3’ (序列409)LPR1-1104 5’-gcaccgatctcgcca-3’ (序列410)(D組)FIP(連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的引物)FA-601 5’-agcggaatccacctccacgaggaaatcagtacgctgag-3’ (序列4243)
(連接了序列347以及356所示堿基序列的序列)FA-602 5’-aatccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3’ (序列425)(連接了序列348以及356所示堿基序列的序列)FA-603 5’-atccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3’(序列426)(連接了序列349以及359所示堿基序列的序列)FA-604 5’-tccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3’ (序列427)(連接了序列350以及356所示堿基序列的序列)RIP(連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的引物)RA-601 5’-tctcgccaagatcctgagtgcaggcttcagcatccttc-3’ (序列428)(連接了序列366以及373所示堿基序列的序列)RA-602 5’-tctcgccaagatcctgagtgggtgaaccaggcttcag-3’(序列429)(連接了序列366以及374所示堿基序列的序列)RA-603 5’-tctcgccaagatcctgagtggtgaaccaggcttcagc-3’(序列430)(連接了序列366以及375所示堿基序列的序列)RA-604 5’-tctcgccaagatcctgagtggaaccaggcttcagcatc-3’ (序列431)(連接了序列366以及376所示堿基序列的序列)RA-605 5’-tctcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatcc-3’(序列432)(連接了序列367以及377所示堿基序列的序列)RA-606 5’-tcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatccttc-3’ (序列433)(連接了序列368以及373所示堿基序列的序列)RA-607 5’-agatcctgagtgacatgcgaagcaggcttcagcatccttc-3’ (序列434)(連接了序列349以及359所示堿基序列的序列)F3引物(與F3區(qū)域的堿基序列同一的序列)F3-601 5’-aagagctggcctacctg-3’(序列360)F3-602 5’-agctggcctacctgaag-3’(序列361)R3引物(與R3區(qū)域的堿基序列同一的序列)
R3-6015’-tcggacctgctcatctg-3’ (序列381)R3-6025’-tcagtaacctcggacctg-3’(序列382)R3-6035’-agtaacctcggacctgc-3’ (序列383)R3-6045’-taacctcggacctgctc-3’ (序列384)Loop引物(與loop F區(qū)域或loop R區(qū)域的堿基序列同一的序列)LPF-601 5’-actgacctggcctccca-3’ (序列397)LPF-602 5’-cctcccacttggccc-3’ (序列398)LPR-601 5’-tcatggccgagcagaacc-3’(序列411)LPR-602 5’-catggccgagcagaac-3’(序列412)(實施例3-1)由人CK20堿基序列選擇區(qū)域使用探針設(shè)計軟件由序列435記載的人CK20堿基序列研究適合LAMP法的區(qū)域位置。F1c以及R1c按照Tm值為58.5～63.5℃、F2以及R2按照Tm值為61.5～62.5℃、F3以及R3按照Tm值為58.5～62.5℃的條件選擇區(qū)域，結(jié)果選擇了如下所示的區(qū)域。被選擇的區(qū)域包含在序列435所示的堿基序列的340～1050位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域。
F1c處于序列435記載的序列的互補鏈上的區(qū)域920-900 5’-ttcatgctgagatgggactgg-3’(序列436)915-895 5’-gctgagatgggactggagttc-3’(序列437)436-416 5’-caatttgcaggacacaccgag-3’(序列438)F2序列435記載的序列上的區(qū)域847-865 5’-gaggttcaactaacggagc-3’(序列439)850-869 5’-gttcaactaacggagctgag-3’ (序列440)855-872 5’-actaacggagctgagacg-3’ (序列441)370-388 5’-attgaagagctgcgaagtc-3’(序列442)
F3序列435記載的序列上的區(qū)域345-3675’-cgactacagtgcatattacagac-3’ (序列443)805-8225’-cagcaacaggtcacagtg-3’(序列444)R1c序列435記載的序列上的區(qū)域940-9585’-ctagaggagaccaaggccc-3’ (序列445)939-9585’-tctagaggagaccaaggccc-3’(序列446)947-9665’-agaccaaggcccgttacagc-3’(序列447)452-4725’-ctgctgaggacttcagactga-3’ (序列448)R2處于序列435記載的序列的互補鏈上的區(qū)域1004-9875’-agagagctcaacagcgac-3’ (序列449)1007-9905’-tccagagagctcaacagc-3’ (序列450)994-978 5’-acagcgactggaggttg-3’(序列451)1000-9845’-agctcaacagcgactgg-3’(序列452)523-505 5’-cttggagatcagcttccac-3’(序列453)R3處于序列435記載的序列的互補鏈上的區(qū)域556-535 5’-gtagggttaggtcatcaaagac-3 ’(序列454)1044-1027 5’-gcgttccatgttactccg-3’ (序列455)Loop F處于序列435記載的序列的互補鏈上的區(qū)域409-389 5’-gcagttgagcatccttaatct-3’(序列456)891-875 5’-ctcaaggctctgggagg-3’(序列457)Loop R序列435記載的序列上的區(qū)域480-499 5’-gactgagagaggaatacgtc-3’ (序列458)968-985 5’-gccagttagccaacctcc-3’ (序列459)
970-985(序列460)(實施例3-2)CK20檢測用引物的設(shè)計由實施例3-1選擇的區(qū)域的序列獲得適用于LAMP法的如下核酸擴引用引物。
FIP(連接了區(qū)域F1c以及F2的堿基序列的引物)KFA 5’-ttcatgctgagatgggactgggaggttcaactaacggagc-3’ (序列461)(連接了序列436以及439所示堿基序列的序列)KFA-5a5’-ttcatgctgagatgggactgggttcaactaacggagctgag-3’ (序列462)(連接了序列436以及440所示堿基序列的序列)KFA-5b5’-ttcatgctgagatgggactggactaacggagctgagacg-3’ (序列463)(連接了序列436以及441所示堿基序列的序列)KFA-5d5’-gctgagatgggactggagttcgttcaactaacggagctgag-3’ (序列464)(連接了序列437以及439所示堿基序列的序列)KFA-5e5’-gctgagatgggactggagttcgttcaactaacggagctgag-3’ (序列465)(連接了序列437以及440所示堿基序列的序列)KFA-5f5’-gctgagatgggactggagttcactaacggagctgagacg-3’ (序列466)(連接了序列437以及441所示堿基序列的序列)AFA 5’-caatttgcaggacacaccgagattgaagagctgcgaagtc-3’ (序列467)(連接了序列438以及442所示堿基序列的序列)RIP(連接了區(qū)域R1c以及R2的堿基序列的引物)KRA-5 5’-ctagaggagaccaaggcccagagagctcaacagcgac-3’ (序列468)(連接了序列445以及449所示堿基序列的序列)KRA-5a5’-tctagaggagaccaaggccctccagagagctcaacagc-3’ (序列469)(連接了序列446以及450所示堿基序列的序列)KRA-5c5’-tctagaggagaccaaggcccacagcgactggaggttg-3’ (序列470)(連接了序列446以及451所示堿基序列的序列)
KRA-5d5’-agaccaaggcccgttacagcagagagctcaacagcgac-3’ (序列471)(連接了序列445以及449所示堿基序列的序列)KRA-5e5’-agaccaaggcccgttacagctccagagagctcaacagc-3’ (序列472)(連接了序列446以及450所示堿基序列的序列)KRA-5f5’-agac caaggcccgttacagcagctcaacagcgactgg-3’ (序列473)(連接了序列447以及452所示堿基序列的序列)ARAf 5’-ctgctgaggacttcagactgacttggagatcagcttccac-3’(序列474)(連接了序列448以及453所示堿基序列的序列)F3引物(與F3區(qū)域的堿基序列同一的序列)AF3 5’-cgactacagtgcatattacagac-3’ (序列443)KF3-5 5’-cagcaacaggtcacagtg-3’ (序列444)R3引物(與R3區(qū)域的堿基序列同一的序列)AR3 5’-gtagggttaggtcatcaaagac-3’ (序列454)KR3-55’-gcgttccatgttactccg-3’ (序列455)Loop引物(與loop F區(qū)域或loop R區(qū)域的堿基序列同一的序列)

(實驗例)通過實驗例1～3測定、確認(rèn)使用上述獲得的CK18、CK19或CK20檢測用的各種引物實施RT-LAMP法時的效果。
(實驗例1-1)擴增的確認(rèn)將人CK18檢測用的各種引物按照以下組合用RT-LAMP法進行測定時，就各個引物組進行以研究從反應(yīng)開始直至能夠確認(rèn)擴增為止所需要的時間為目的的實驗。
1)人CK18RNA樣品的制備方法通過使用以人CK18的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物進行RT-PCR，從來自KATOIII(胃癌細胞)的總RNA分離人CK18cDNA。使用體外的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Riboprobe in vitro transcription system(Promega公司生產(chǎn)))由克隆到pBluescript(STRATAGENE公司生產(chǎn)的質(zhì)粒)的人CK18cDNA合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過260nm的吸光度測定算出得到的原液的RNA濃度，以該值為基礎(chǔ)用50ng/μl酵母RNA(Amibon公司生產(chǎn))使人CK18的RNA拷貝數(shù)稀釋調(diào)整到60000、6000、600、60、6以及0(對照)，作為模板。
2)人CK18檢測用引物組按照(表1)的組合使用各種引物。
(表1)引物組(各個編號表示序列，引物指的是由各個序列表示的序列構(gòu)成的引物)引物組 IIIIII IVFIP 234 252 259 278RIP 287 297 307 332F3引物 66 6872 79R3引物 179 182 184 193Loop引物 203 211 212 214(loop F)Loop引物 220 223 226 228(loop R)
3)反應(yīng)液組成dNTPs(GIBCO公司生產(chǎn)) 0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol) 5mMbetaine(Sigma公司生產(chǎn)) 640mMThermopol buffer(New England Biolabs)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司生產(chǎn)) 1.25UBst DNA聚合酶(New England Biolabs公司生產(chǎn)) 16U溴乙錠(ethidium bromide) 0.125mg/ml引物FIP 40pmol，RIP 40pmol，F(xiàn)3引物5pmol，R3引物 5pmol，Loop引物(lopp F，loop R)各20pmol4)RT-LAMP法向含有上述6種引物的反應(yīng)液23μl中添加2μl人CK18的RNA樣品，于65℃下加溫1小時。
5)擴增的確認(rèn)擴增產(chǎn)物由于具有雙鏈結(jié)構(gòu)，溴乙錠嵌入后發(fā)熒光。用ABI公司生產(chǎn)的PRISM7700通過實時法測定其熒光強度的增加(Rn)。
6)結(jié)果圖1～4分別給出了使用I～IV各個引物組時的結(jié)果。結(jié)果表明就各個引物組來說，人CK18模板的量越多，直至能夠確認(rèn)擴增所需時間越短。就引物組I以及III來說，即使600拷貝20分鐘以內(nèi)也可以確認(rèn)擴增，對于引物組II，在6000拷貝時大約20分鐘以內(nèi)可確認(rèn)擴增，對于引物組IV，在6000拷貝時大約20分鐘可確認(rèn)擴增，即使是600拷貝時大約30分鐘也可確認(rèn)擴增。
(實驗例1-2)回環(huán)引物的效果在實驗例1-1中研究的引物組中，選擇擴增的確認(rèn)需要時間短的引物組I，進行目的旨在研究使用回環(huán)引物和不使用時的靈敏度的實驗。
1)人CKRNA樣品的制備方法進行與實驗例1-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)為60000、6000、600以及0(對照)那樣的樣品。
2)引物組使用表1所示引物組I以及從引物組I中除去各個loop引物的引物組。
3)反應(yīng)液組成使用與實驗例1-1同樣的反應(yīng)液組成，對于沒有l(wèi)oop引物的組不添加loop引物。
4)RT-LAMP法向含有上述6種或4種引物的反應(yīng)液23μl中添加2μl人CK18的RNA樣品，于65℃下加溫1小時。
5)擴增的確認(rèn)與實驗例1-1同樣通過實時法測定。
6)結(jié)果圖5和圖6給出了測定結(jié)果。結(jié)果表明使用loop引物直至確認(rèn)擴增所需要的時間短。然而，即使不使用loop引物，在60000拷貝的情況下大約50分鐘也可確認(rèn)人CK18的擴增。
(實驗例1-3)對人CK18的擴增特異性研究使用引物組I進行測定時對人CK18的擴增特異性。在細胞角蛋白(CK)中除了人CK18以外，人們還知道人CK19，20等同工型，這些同工型由具有與人CK18約60％的同源性堿基序列組成。在使用上述引物組進行測定時，進行目的旨在研究能否辨別人CK19或人CK20進行檢查人CK18的實驗。
1)RNA樣品的制備方法進行與實驗例1-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)為60000的人CK18的RNA樣品。關(guān)于人CK19和人CK20的RNA也同樣制備樣品。
2)引物組使用表1所示的引物組I。
3)反應(yīng)液組成組成使用與實驗例1-1同樣的組成。
4)RT-LAMP法在與實驗例1-1同樣的條件下進行。
5)擴增的確認(rèn)與實驗例1-1同樣通過實時法進行測定。
6)結(jié)果結(jié)果如第7圖所示。結(jié)果表明，如果使用引物組I，人CK18RNA可擴增，但人CK19RNA以及人CK20RNA完全不能擴增，確認(rèn)引物組I對人CK18具有特異性。
(實驗例2-1)人CK19檢測用引物組(A組)的效果使用從實施例2-2所示的A組中選擇的引物組，進行目的旨在研究通過RT-LAMP法對人CK19進行測定時的擴增樣式。
1)引物組(A組)對于由FIPFA-401，RIPRA-401，F(xiàn)3F3-401以及R3R3-401各個引物構(gòu)成的引物組，以及再將各種loop引物L(fēng)PF-401和LPR-401、LPF-401和LPR-402、LPF-401和LPR-403、或LPF-401和LPR-404組合使用的引物組進行研究。
2)人CK19RNA樣品的制備方法通過使用以人CK19的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物進行RT-PCR，從來自KATOIII(胃癌細胞)的總RNA分離人CK19cDNA。使用體外的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Riboprobe in vitro transcription system(Promega公司生產(chǎn)))由克隆到pBluescript(STRATAGENE公司生產(chǎn)質(zhì)粒)的人CK19cDNA合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過260nm的吸光度測定算出得到的原液的RNA濃度，以該值為基礎(chǔ)用50ng/μl酵母RNA(Amibon公司生產(chǎn))使人CK19的RNA拷貝數(shù)稀釋調(diào)整到60000、6000、600以及0(對照)，作為模板。
3)反應(yīng)液組成使用與實驗例1-1同樣的組成。對于沒有l(wèi)oop引物的組不添加loop引物。
4)RT-LAMP法向上述引物中不含有l(wèi)oop引物的4種、或含有l(wèi)oop引物的6種引物的反應(yīng)液23μl中添加人CK19的RNA樣品2μl，于65℃下加溫1小時。
5)擴增的確認(rèn)與實驗例1-1同樣通過實時法進行測定。
6)圖8～12給出了不使用loop引物的引物組、以及使用各種loop引物的引物組的結(jié)果。結(jié)果表明不使用loop引物時，直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間約在試驗開始后40分鐘。另外就象圖9～12所示的那樣，在加了loop引物的系統(tǒng)中大約在10至20分鐘內(nèi)就可確認(rèn)擴增。
(實驗例2-2)人CK19檢測用引物組(C組)的效果使用從實施例2-2所示的C組中選擇的引物組，進行目的旨在研究通過RT-LAMP法對人CK19進行測定時的擴增模式。
1)引物組(C組)對于由FIPFA-1101，RIPRA-1101，F(xiàn)3F3-1101以及R3R3-1101各個引物構(gòu)成的引物組，以及再將各種loop引物L(fēng)PF-1101與LPR-1101、LPF-1101與LPR-1102、LPF-1101與LPR-1103、LPF-1101與LPR-1104、LPF-1102與LPR-1101、或LPF-1103與LPR-1101組合使用的引物組進行研究。
2)人CK19RNA樣品的制備方法進行與實驗例2-1同樣操作，將拷貝數(shù)制備成60000、6000、600、60以及0(對照)，作為模板。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例2-1同樣的手法進行。
6)結(jié)果圖13～19給出了不使用loop引物的引物組、以及使用各種loop引物的引物組的結(jié)果。結(jié)果表明不使用loop引物時，直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間約在試驗開始后30分鐘(圖13)。而在加了loop引物的系統(tǒng)中，LPF-1101與LPR-1101(圖14)、LPF-1101與LPR-1102(圖15)、LPF-1101與LPR-1104(圖17)、LPF-1102與LPR-1101(圖18)、或LPF-1103與LPR-1101(圖19)組合大約在20分鐘內(nèi)就可以確認(rèn)擴增。
(實驗例2-3)人CK19檢測用引物組(D組)的效果使用從實施例2-2所示的D組中選擇的引物組，進行目的旨在研究通過RT-LAMP法對人CK19進行測定時的擴增模式。
1)引物組(D組)對于由FIPFA-601，RIPRA-604，F(xiàn)3F3-601以及R3R3-601各個引物構(gòu)成的引物組，以及再將loop引物L(fēng)PF-601與LPR-601組合使用的引物組進行研究。
2)人CK19RNA樣品的制備方法進行與實驗例2-1同樣操作，將拷貝數(shù)制備成60000、6000、600、60以及0(對照)，作為模板。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例2-1同樣的手法進行。
6)結(jié)果圖20以及圖21給出了不使用loop引物的引物組、以及使用loop引物的引物組的結(jié)果。結(jié)果表明不使用loop引物時，直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間約70分鐘。另外，拷貝數(shù)即使為0，也發(fā)生非特異性擴增，特異性低。而在使用loop引物時，大約在20分鐘內(nèi)就可以確認(rèn)擴增，而且拷貝數(shù)為0也不發(fā)生非特異擴增。通過使用loop引物，特異性提高。
(實驗例2-4)測定靈敏度進行目的旨在研究使用從實驗例2-1～2-3所示的A、C、D各組選擇的各個引物以及從B組選擇的引物組進行測定時的人CK19RNA的測定靈敏度的實驗。
1)引物組A組FIPFA-401，RIPRA-401，F(xiàn)3F3-401以及R3R3-401，Loop引物L(fēng)PF-401，LPR-401B組FIPFA1-EK，RIPRA6-EK，F(xiàn)3F3-EK以及R3R3-EK，Loop引物L(fēng)PF1-EK，LPR2-EKC組FIPFA-1101，RIPRA-1101，F(xiàn)3F3-1101，R3R3-1101loop引物L(fēng)PF-1101，LPR-1101D組FIPFA-601，RIPRIP-604、F3F3-601，R3R3-601Loop引物L(fēng)PF-601，LPR-6012)人CK19RNA樣品的制備方法進行與實驗例2-1同樣操作，將拷貝數(shù)制備成60000、20000、6000、600、60、20以及0(對照)，作為模板。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例2-1同樣的手法進行。
6)結(jié)果結(jié)果如圖22～25所示。結(jié)果表明各個組的引物組中人CK19RNA拷貝數(shù)大的組直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間短，當(dāng)拷貝數(shù)為60000時，在15～25分鐘左右可以確認(rèn)擴增。而對于A組，拷貝數(shù)為200以上時在20～30分鐘(圖22)、對于B組，拷貝數(shù)為200以上時在15～25分鐘(圖23)、對于C組，拷貝數(shù)為600以上時在15～25分鐘(圖24)以及對于D組，拷貝數(shù)為200以上時在25～35分鐘(圖25)可確認(rèn)擴增。
(實驗例2-5)對人CK19RNA的擴增特異性研究使用實驗例2-4所示的各個引物組測定時對人CK19的擴增特異性。在細胞角蛋白(CK)中除了人CK19以外，人們還知道人CK18，20等同工型，這些同工型由具有與人CK19約60％的同源性堿基序列組成。使用上述引物組進行測定時，進行目的旨在研究能否辨別人CK18或人CK20進行檢查人CK19的實驗。
1)引物組就與實驗例2-4同樣的引物組進行研究。
2)RNA樣品的制備進行與實驗例2-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)為60000、6000、600以及0(對照)的人CK19RNA樣品。關(guān)于人CK18和人CK20的RNA也同樣制備拷貝數(shù)各為60000的樣品。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例2-1同樣的手法進行。
6)結(jié)果圖26～29給出了使用實驗例2-4所示的各個引物組的結(jié)果。結(jié)果表明，無論哪一個組的引物組都證實對人CK19RNA特異擴增，但對于人CK18RNA以及人CK20RNA確認(rèn)沒有被擴增。
(實驗例2-6)對人CK19RNA的擴增的確認(rèn)(濁度的測定)1)引物組(C組)對于由FIPFA-1101，RIPRA-1101，F(xiàn)3F3-1101、R3R3-1101以及各種loop引物L(fēng)PF-1101與LPR-1101組合使用的引物組進行研究。
2)人CK19RNA樣品的制備進行與實驗例2-1同樣操作，將拷貝數(shù)制備成100000、10000、1000以及0(對照)。
3)反應(yīng)液組成dNTPs(GIBCO公司生產(chǎn))0.4mMMgSO4 2mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol) 5mM甜菜堿(betaine)(Sigma公司生產(chǎn)) 640mM
Thermopol緩沖液(New England Biolabs)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司生產(chǎn)) 1.25UBst DNA聚合酶(New England Biolabs公司生產(chǎn))16Uタ一ジト一ル(Sigma) 1％引物FIP 40pmol，RIP 40pmol，F(xiàn)3引物5pmol， R3引物 5pmol，Loop引物(lopp F，loop R)各20pmolTris-HCl(pH8) 60mM4)RT-LAMP法通過與實驗例2-1同樣的手法進行。反應(yīng)在0.2ml的管內(nèi)于65℃下進行1.5小時。
5)擴增的確認(rèn)通過波長500nm的吸光度進行隨時間變化的測定。測定裝置使用テラメツクス公司生產(chǎn)的LA-200。
6)結(jié)果結(jié)果如圖30所示。對應(yīng)于模板拷貝數(shù)，在測定開始后11～13分鐘之間，確認(rèn)擴增開始。
(實驗例2-7)對人CK19RNA的擴增的確認(rèn)(濁度的測定)1)引物組(C組)對于由FIPFA-1101，RIPRA-1101，F(xiàn)3F3-1101、R3R3-1101以及各種loop引物L(fēng)PF-1101與LPR-1101組合使用的引物組以及加RNase抑制劑時進行研究。
2)人CK19RNA樣品的制備進行與實驗例2-1同樣操作，將拷貝數(shù)制備成100000、10000、1000以及0(對照)。
3)反應(yīng)液組成除了加25U RNase抑制劑(東洋紡公司生產(chǎn))之外，其他使用與實驗例2-6同樣的反應(yīng)組成液。
4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)象實驗例2-6那樣進行。
6)結(jié)果結(jié)果如圖31所示。對應(yīng)于模板拷貝數(shù)，在測定開始后10～12分鐘，確認(rèn)擴增開始。通過添加RNase抑制劑降低抑制擴增反應(yīng)的物質(zhì)的影響，可以將擴增的確認(rèn)所需要的時間縮短。
(實驗例3-1)進行旨在研究通過來自實施例3-2給出的各種引物的如下組合利用RT-LAMP法進行測定時，就各個引物組從開始反應(yīng)直至確認(rèn)擴增為止所需要的時間的實驗。
1)人CK20RNA樣品的制備方法通過使用以人CK20的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物進行RT-PCR，從來自KATOIII(胃癌細胞)的總RNA分離人CK20cDNA。使用體外的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Riboprobe in witro transcription system(Promega公司生產(chǎn)))由克隆到pBluescript(STRATAGENE公司生產(chǎn)質(zhì)粒)的人CK20cDNA合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過260nm的吸光度測定算出得到的原液的RNA濃度，以該值為基礎(chǔ)用50ng/μl酵母RNA(Amibon公司生產(chǎn))使人CK20的RNA拷貝數(shù)稀釋調(diào)整到600000作為模板。
2)引物組將各種引物按照(表2)的組合使用。
(表2)引物組以及直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間FIP RIP F3引物 R3引物 時間(分)KFA-5 KRA-5 KF3-5KR3-5 25KFA-5aKRA-5 KF3-5KR3-5 26KFA-5bKRA-5 KF3-5KR3-5 23
KFA-5d KRA-5 KF3-5KR3-526KFA-5e KRA-5 KF3-5KR3-525KFA-5f KRA-5 KF3-5KR3-524KFA-5KRA-5aKF3-5KR3-530KFA-5KRA-5cKF3-5KR3-535KFA-5KRA-5dKF3-5KR3-530KFA-5KRA-5eKF3-5KR3-536KFA-5KRA-5fKF3-5KR3-5403)反應(yīng)液組成使用與實驗例1-1同樣的組成，不添加loop引物。
4)RT-LAMP法向含有上述4種引物的反應(yīng)液23μl中添加2μl的人CK20的RNA樣品，于65℃下加溫1小時。
5)擴增的確認(rèn)與實驗例1-1同樣通過實時法進行測定。
6)結(jié)果通過各個引物組使反應(yīng)進行直至能夠確認(rèn)擴增為止所需要的時間如表2所示。結(jié)果在最多為40分鐘內(nèi)可確認(rèn)，幾乎所有的引物組在30分鐘以內(nèi)都可以確認(rèn)。
(實驗例3-2)進行目的旨在研究使用從實驗例3-1中研究的引物中選擇擴增確認(rèn)所需時間短的引物組，以及使用了loop引物的組合的引物組通過RT-LAMP法進行測定時的靈敏度的實驗。
1)人CK20RNA樣品的制備方法進行與實驗例3-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)分別為0、190、960、4800、24000、120000、600000的樣品。
2)引物組就以下各個組合的引物組進行研究。
引物組1FIP(KFA-5b)，RIP(KRA-5b)F3引物(KF3-5)、R3引物(KR3-5)Loop引物(K-LPF2，K-LPR1)引物組2FIP(KFA-5b)，RIP(KRA-5)F3引物(KF3-5)、R3引物(KR3-5)Loop引物(K-LPF2，K-LPR2)3)反應(yīng)液組成使用與實驗例1-1同樣的組成。
4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例3-2同樣的手法進行。
6)結(jié)果圖32給出了有關(guān)引物組1的研究結(jié)果。結(jié)果表明各個組的引物組中人CK20的RNA的模板量越多，直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間越短。而當(dāng)模板量即使為190拷貝時，在30分鐘以內(nèi)也可以確認(rèn)擴增，模板量在600000拷貝數(shù)時在10分鐘左右就可確認(rèn)DNA的擴增。使用引物組2時也獲得同樣的結(jié)果。
(實驗例3-3)對人CK20RNA的擴增特異性研究使用從實驗例3-2選擇的引物組測定時對人CK20的RNA的擴增特異性。在細胞角蛋白(CK)中除了人CK20以外，人們還知道人CK18，19等同工型，這些同工型由具有與人CK20約60％的同源性堿基序列組成。使用本發(fā)明的引物組進行測定時，進行目的旨在研究能否辨別人CK18或人CK19進行檢查的實驗。
1)RNA樣品的制備方法進行與實驗例3-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)分別為600000的人CK20的RNA樣品。對于人CK18和人CK19的RNA也同樣制備樣品。
2)引物組使用在實驗例3-2選擇的引物組1和引物組2。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例3-2同樣的手法進行。
6)結(jié)果關(guān)于引物組1的研究結(jié)果如圖33所示。在選擇的引物組中，人CK20RNA都能擴增，但人CK18RNA和人CK19RNA完全不擴增，確認(rèn)對人CK20RNA有特異性。對于引物組2也獲得了同樣的結(jié)果。
(實驗例3-4)進行目的旨在研究使用引物組時的人CK20RNA的測定靈敏度的實驗。
1)人CK20RNA樣品的制備方法進行與實驗例3-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)分別為0、190、960、4800、24000、120000、600000的樣品。
2)引物組就以下各個組合的引物組進行研究。
引物組3FIP(AFA)、RIP(ARAf)、F3引物(AF3)、R3引物(AR3)Loop引物(LPF2，LPR6)3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例3-2同樣的手法進行。
6)結(jié)果圖34給出了實驗的結(jié)果。結(jié)果表明人CK20RNA的模板量越多，直至能夠確認(rèn)擴增所需要的時間就越短。而當(dāng)模板量即使為190拷貝時，在30分鐘以內(nèi)也可以確認(rèn)DNA的擴增，模板量為在600000拷貝數(shù)時在10分鐘左右就可確認(rèn)DNA的擴增。
(實驗例3-5)進行目的旨在研究使用從實驗例3-4選擇的引物組測定時對人CK20的RNA的擴增特異性的實驗。
1)RNA樣品的制備方法進行與實驗例3-1同樣的操作，制備拷貝數(shù)為600000的人CK20的RNA樣品。對于人CK18和人CK19的RNA也同樣制備樣品。
2)引物組使用在實驗例3-4選擇的引物組(引物組3)。
3)反應(yīng)液組成、4)RT-LAMP法以及5)擴增的確認(rèn)通過與實驗例3-2同樣的手法進行。
6)結(jié)果實驗結(jié)果如圖35所示。在選擇的引物組中，人CK20RNA都能擴增，但人CK18RNA和人CK19RNA完全不擴增，確認(rèn)對人CK20有特異性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性就象以上說明的那樣，可知如果使用本發(fā)明的引物或引物組進行LAMP法，可以有效地特異地使人CK18RNA、人CK19RNA以及人CK20RNA擴增。這表明，如果使用本發(fā)明的引物，在短時間內(nèi)就可以檢測人CK18RNA、人CK19RNA以及人CK20RNA，也就可以使利用核酸擴增手段的向淋巴節(jié)的癌轉(zhuǎn)移診斷所需要的時間縮短。
序列表<110>希森美康株式會社<120>用于細胞角蛋白類檢測的核酸擴增用引物以及使用該引物的檢查方法<130>GP03-1006PCT<150>JP P2002-145689<151>2002-05-21<150>JP P2002-175271<151>2002-06-17<150>JP P2002-199759<151>2002-07-09<160>474<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1412<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1cggggtcgtc cgcaaagcct gagtcctgtc ctttctctct ccccggacag catgagcttc60accactcgct ccaccttctc caccaactac cggtccctgg gctctgtcca ggcgcccagc120tacggcgccc ggccggtcag cagcgcggcc agcgtctatg caggcgctgg gggctctggt180tcccggatct ccgtgtcccg ctccaccagc ttcaggggcg gcatggggtc cgggggcctg240gccaccggga tagccggggg tctggcagga atgggaggca tccagaacga gaaggagacc300atgcaaagcc tgaacgaccg cctggcctct tacctggaca gagtgaggag cctggagacc360gagaaccgga ggctggagag caaaatccgg gagcacttgg agaagaaggg accccaggtc420agagactgga gccattactt caagatcatc gaggacctga gggctcagat cttcgcaaat480actgtggaca atgcccgcat cgttctgcag attgacaatg cccgtcttgc tgctgatgac540
tttagagtca agtatgagac agagctggcc atgcgccagt ctgtggagaa cgacatccat600gggctccgca aggtcattga tgacaccaat atcacacgac tgcagctgga gacagagatc660gaggctctca aggaggagct gctcttcatg aagaagaacc acgaagagga agtaaaaggc720ctacaagccc agattgccag ctctgggttg accgtggagg tagatgcccc caaatctcag780gacctcgcca agatcatggc agacatccgg gcccaatatg acgagctggc tcggaagaac840cgagaggagc tagacaagta ctggtctcag cagattgagg agagcaccac agtggtcacc900acacagtctg ctgaggttgg agctgctgag acgacgctca cagagctgag acgtacagtc960cagtccttgg agatcgacct ggactccatg agaaatctga aggccagctt ggagaacagc1020ctgagggagg tggaggcccg ctacgcccta cagatggagc agctcaacgg gatcctgctg1080caccttgagt cagagctggc acagacccgg gcagagggac agcgccaggc ccaggagtat1140gaggccctgc tgaacatcaa ggtcaagctg gaggctgaga tcgccaccta ccgccgcctg1200ctggaagatg gcgaggactt taatcttggt gatgccttgg acagcagcaa ctccatgcaa1260accatccaaa agaccaccac ccgccggata gtggatggca aagtggtgtc tgagaccaat1320gacaccaaag ttctgaggca ttaagccagc agaagcaggg taccctttgg ggagcaggag1380gccaataaaa agttcagagt tcattggatg tc 1412<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>2tgaagtaatg gctccagtct ctg23
<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>3agtaatggct ccagtctctg ac 22<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>4ttgaagtaat ggctccagtc tct 23<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>5acctggggtc ccttctt17<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>6gggtcccttc ttctccaag19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>7ggtcccttct tctccaagtg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>8gtcccttctt ctccaagtgc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>9tcccttcttc tccaagtgct 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>10cccttcttct ccaagtgctc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>11ccttcttctc caagtgctcc 20<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>12acagactggc gcatggc 17<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>13tcaatgacct tgcggagcc19
<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>14atcaatgacc ttgcggagcc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>15catcaatgac cttgcggagc 20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>16tcatcaatga ccttgcggag c 21<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>17agcctcgatc tctgtctcc 19<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>18gagctggcaa tctgggct 18<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>19agctggcaat ctgggctt 18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>20gctggcaatc tgggcttg 18<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>21ctggcaatct gggcttgtag g 21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>22tggcaatctg ggcttgtagg 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>23ggcaatctgg gcttgtaggc 20<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>24cacggtcaac ccagagc17
<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>25gatcttggcg aggtcctga 19<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>26cggatgtctg ccatgatctt g 21<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>27ccagctcgtc atattgggcc20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>28cagcagactg tgtggtgacc20<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>29gtgagcgtcg tctcagca 18<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>30gctggccttc agatttctca tg 22<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>31ccaggctcct cactctgtcc a 21<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>32tccagtctct gacctggggt c 21<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>33ctccacagac tggcgcatgg20<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>34gggcatctac ctccacggtc aa 22<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>35gaccactgtg gtgctctcct c 21
<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>36cagctccaac ctcagcagac tg 22<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>37ggtttgcatg gagttgctgc tg 22<210>38<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>38gagagcaaaa tccggga 17<210>39<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>39agagcaaaat ccgggag 17<210>40<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>40gagcaaaatc cgggagc 17<210>41<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>41aatccgggag cacttgg 17<210>42<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>42gaggctggag agcaaaa 17<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>43cgtcttgctg ctgatgac 18<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>44gtcttgctgc tgatgactt 19<210>45<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>45tagagtcaag tatgagacag agc23<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>46agagtcaagt atgagacaga gc 22
<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>47agtcaagtat gagacagagc t 21<210>48<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>48gaacgacatc catgggc17<210>49<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>49cgaggctctc aaggagg17<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>50gaggctctca aggagga17<210>51<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>51aggctctcaa ggaggag17<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>52catgaagaag aaccacgaag 20<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>53gcctacaagc ccagattg 18<210>54<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>54gttgaccgtg gaggtag 17<210>55<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>55ccccaaatct caggacc 17<210>56<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>56accgagagga gctagac 17<210>57<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>57aggagagcac cacagtg 17
<210>58<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>58gagctgagac gtacagtc18<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>59gagaccatgc aaagcctgaa 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>60gaggctggag agcaaaatcc 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>61cgtcttgctg ctgatgactt 20<210>62<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>62ggaagtaaaa ggcctacaag cc 22<210>63<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>63gaaccgagag gagctagaca a 21<210>64<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>64gtctcagcag attgaggaga g 21<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>65tggaagatgg cgaggacttt 20<210>66<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>66ctggcctctt acctgga 17<210>67<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>67aggagaccat gcaaagc 17<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>68tcttcgcaaa tactgtggac 20
<210>69<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>69cagatcttcg caaatactgt g21<210>70<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>70tcgcaaatac tgtggacaa 19<210>71<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>71caaatactgt ggacaatgcc 20<210>72<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>72cgtcttgctg ctgatgac18<210>73<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>73agtcaagtat gagacagagc t21<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>74caccaatatc acacgactgc 20<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>75catgaagaag aaccacgaag 20<210>76<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>76agaaccacga agaggaag 18<210>77<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>77gttgaccgtg gaggtag 17<210>78<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>78cccaatatga cgagctgg 18<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>79aggagctaga caagtactgg20
<210>80<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>80caagtactgg tctcagcag 19<210>81<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>81tctgctgagg ttggagc 17<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>82gaggcatcca gaacgagaag20<210>83<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>83agcctggaga ccgagaac 18<210>84<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>84aatgcccgca tcgttctg 18<210>85<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>85ggaggagctg ctcttcatg19<210>86<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>86ccgggcccaa tatgacga 18<210>87<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>87ccgagaggag ctagacaagt 20<210>88<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>88tgagatcgcc acctaccg 18<210>89<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>89gatcatcgag gacctgaggg 20<210>90<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>90cagagactgg agccattact tca 23
<210>91<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>91gactggagcc attacttcaa gatc 24<210>92<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>92actggagcca ttacttcaag atca 24<210>93<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>93ctggagccat tacttcaaga tcatc25<210>94<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>94tggagccatt acttcaagat catcg25<210>95<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>95ggagccatta cttcaagatc atcg 24<210>96<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>96gagccattac ttcaagatca tcgag25<210>97<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>97agccattact tcaagatcat cgagg25<210>98<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>98gccattactt caagatcatc gagg 24<210>99<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>99ccattacttc aagatcatcg aggac25<210>100<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>100cattacttca agatcatcga ggacc25<210>101<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>101agaacgacat ccatgggct 19
<210>102<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>102gaacgacatc catgggctc 19<210>103<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>103aacgacatcc atgggctcc 19<210>104<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>104acgacatcca tgggctcc 18<210>105<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>105catgggctcc gcaaggt 17<210>106<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>106tcacacgact gcagctgg 18<210>107<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>107caccaatatc acacgactgc ag22<210>108<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>108tatcacacga ctgcagctgg20<210>109<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>109atcacacgac tgcagctgg 19<210>110<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>110ttcatgaaga agaaccacga agag24<210>111<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>111agctctgggt tgaccgtg 18<210>112<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>112gctctgggtt gaccgtg17
<210>113<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>113ctctgggttg accgtgg 17<210>114<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>114tctgggttga ccgtgga 17<210>115<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>115ctgggttgac cgtggag 17<210>116<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>116tgggttgacc gtggagg 17<210>117<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>117ggttgaccgt ggaggtaga 19<210>118<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>118gttgaccgtg gaggtagatg c 21<210>119<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>119ttgaccgtgg aggtagatgc20<210>120<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>120tgaccgtgga ggtagatgc 19<210>121<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>121gaccgtggag gtagatgcc 19<210>122<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>122accgtggagg tagatgcc18<210>123<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>123gcccccaaat ctcaggac18
<210>124<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>124cccaatatga cgagctggct 20<210>125<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>125caagtactgg tctcagcaga ttg 23<210>126<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>126tgctgagacg acgctcac18<210>127<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>127tgagacgtac agtccagtcc20<210>128<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>128acagcctgag ggaggtg 17<210>129<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>129cgagaaccgg aggctggaga20<210>130<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>130agatcatcga ggacctgagg gc 22<210>131<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>131gacatccatg ggctccgcaa20<210>132<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>132caggacctcg ccaagatcat gg 22<210>133<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>133cacacagtct gctgaggttg ga 22<210>134<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>134gagacgacgc tcacagagct g 21
<210>135<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>135ccacccgccg gatagtggat20<210>136<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>136gtcatcagca gcaagacg 18<210>137<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>137agtcatcagc agcaagacg 19<210>138<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>138gcattgtcca cagtatttgc 20<210>139<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>139cattgtccac agtatttgcg 20<210>140<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>140attgtccaca gtatttgcga 20<210>141<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>141ttgtccacag tatttgcga 19<210>142<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>142tgtccacagt atttgcgaa 19<210>143<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>143gtccacagta tttgcgaaga20<210>144<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>144tccacagtat ttgcgaagat c 21<210>145<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>145ccacagtatt tgcgaagatc t 21
<210>146<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>146cacagtattt gcgaagatct g 21<210>147<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>147ctcctccttg agagcct 17<210>148<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>148tcctccttga gagcctc 17<210>149<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>149cctccttgag agcctcg17<210>150<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>150ctccttgaga gcctcga17<210>151<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>151ccttgagagc ctcgatc17<210>152<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>152cttgagagcc tcgatctc 18<210>153<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>153gagcctcgat ctctgtc 17<210>154<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>154agcctcgatc tctgtctc 18<210>155<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>155gcctcgatct ctgtctc 17<210>156<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>156acttcctctt cgtggttc 18
<210>157<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>157ggccttttac ttcctcttcg20<210>158<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>158tacttcctct tcgtggttc 19<210>159<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>159tacctccacg gtcaacc 17<210>160<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA
<400>160cggatgtctg ccatgatc18<210>161<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>161ggatgtctgc catgatctt 19<210>162<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>162ccagctcgtc atattggg18<210>163<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>163caatctgctg agaccagtac 20<210>164<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>164tctgctgaga ccagtactt 19<210>165<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>165ctccaacctc agcagac 17<210>166<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>166agtccaggtc gatctcc 17<210>167<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>167tggccttcag atttctcatg20
<210>168<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>168caagctggcc ttcagatt 18<210>169<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK18基因設(shè)計的DNA<400>169aaggtgcagc aggatcc 17<210>170<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>170taatggctcc agtctctgac c 21<210>171<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>171tcaatctgca gaacgatgcg20<210>172<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>172gagagcctcg atctctgtct c 21<210>173<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>173gagagcctcg atctctgtct20<210>174<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>174ttgtctagct cctctcggtt c 21<210>175<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>175ttgtctagct cctctcggtt20<210>176<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>176caggtcgatc tccaaggac t 20<210>177<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>177gctggccttc agatttctca20<210>178<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>178gctggcttaa tgcctcagaa20
<210>179<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>179agctctgtct catacttgac t 21<210>180<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>180agtcatcagc agcaagacg 19<210>181<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>181gtcatcagca gcaagacg 18<210>182<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>182ggccttttac ttcctcttcg 20<210>183<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>183acttcctctt cgtggttc 18<210>184<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>184ctggcaatct gggcttg 17<210>185<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>185gaggtcctga gatttggg 18<210>186<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>186tctagctcct ctcggttc 18<210>187<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>187caatctgctg agaccagtac 20<210>188<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>188ctccaacctc agcagac 17<210>189<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>189cagactgtgt ggtgacc 17
<210>190<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>190actgtggtgc tctcctc 17<210>191<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>191gactgtacgt ctcagctc 18<210>192<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>192ggctgttctc caagctg 17<210>193<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>193catctgtagg gcgtagcg 18<210>194<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>194catactcctg ggcctgg 17<210>195<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>195gcgaagatct gagccctca19<210>196<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>196catcagcagc aagacggg 18<210>197<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>197tgaagagcag ctcctcctt19<210>198<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>198gctctcctca atctgctgag 20<210>199<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>199gctggccttc agatttctca 20<210>200<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>200cctccctcag gctgttctc19
<210>201<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>201ccaaagggta ccctgcttc 19<210>202<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>202acctggggtc ccttctt 17<210>203<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>203gggtcccttc ttctccaag 19<210>204<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>204ggtcccttct tctccaagtg 20<210>205<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>205caagtgctcc cggattttgc 20<210>206<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>206aagtgctccc ggattttgc 19<210>207<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>207agtgctcccg gattttgct 19<210>208<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>208gtgctcccgg attttgctc 19<210>209<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>209tgctcccgga ttttgctct 19<210>210<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>210gctcccggat tttgctctc 19<210>211<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>211cagctctgtc tcatacttga ctct 24
<210>212<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>212acagactggc gcatggc 17<210>213<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>213cctcttcgtg gttcttcttc at 22<210>214<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>214cctcagcaga ctgtgtggt 19<210>215<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>215cagcagactg tgtggtgacc20<210>216<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>216cagctctgtc tcatacttga ctct 24<210>217<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>217gagctggcaa tctgggct 18<210>218<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>218tgtccaaggc atcaccaaga20<210>219<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>219gtccaaggca tcaccaagat t 21<210>220<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>220cgcaaatact gtggacaatg cc22<210>221<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>221cagatcttcg caaatactgt ggac 24<210>222<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>222gatcatcgag gacc tgaggg 20
<210>223<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>223ccaatatcac acgactgcag c 21<210>224<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>224ttgatgacac caatatcaca cgac 24<210>225<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>225tcacacgact gcagctgg 18<210>226<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>226tcgaggctct caaggagg18<210>227<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>227cccccaaatc tcaggacc18<210>228<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>228gagatcgacc tggactc 17<210>229<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>229gacaccaata tcacacgact gc 22<210>230<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>230tgacaccaat atcacacgac tgc 23<210>231<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>231acaccaatat cacacgactg ca 22<210>232<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>232ggcccaatat gacgagctgg 20<210>233<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>233tggcaaagtg gtgtctgaga 20
<210>234<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>234tgaagtaatg gctccagtct ctggagagca aaatccggga 40<210>235<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>235tgaagtaatg gctccagtct ctgagagcaa aatccgggag 40<210>236<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>236tgaagtaatg gctccagtct ctggagcaaa atccgggagc 40<210>237<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>237tgaagtaatg gctccagtct ctgaatccgg gagcacttgg 40<210>238<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>238agtaatggct ccagtctctg acgagagcaa aatccggga 39<210>239<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>239agtaatggct ccagtctctg acagagcaaa atccgggag 39<210>240<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>240agtaatggct ccagtctctg acgagcaaaa tccgggagc 39<210>241<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>241agtaatggct ccagtctctg acaatccggg agcacttgg 39<210>242<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>242ttgaagtaat ggctccagtc tctgagagca aaatccggga 40<210>243<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>243ttgaagtaat ggctccagtc tctagagcaa aatccgggag 40<210>244<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>244ttgaagtaat ggctccagtc tctgagcaaa atccgggagc 40
<210>245<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>245ttgaagtaat ggctccagtc tctaatccgg gagcacttgg 40<210>246<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>246gggtcccttc ttctccaagg aggctggaga gcaaaa 36<210>247<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>247acctggggtc ccttcttgag gctggagagc aaaa34<210>248<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>248ggtcccttct tctccaagtg gaggctggag agcaaaa37<210>249<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>249tcccttcttc tccaagtgct gaggctggag agcaaaa37<210>250<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>250ccttcttctc caagtgctcc gaggctggag agcaaaa37<210>251<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>251acagactggc gcatggccgt cttgctgctg atgac 35<210>252<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>252acagactggc gcatggcgtc ttgctgctga tgactt 36<210>253<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>253tcaatgacct tgcggagcct agagtcaagt atgagacaga gc42<210>254<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>254tcaatgacct tgcggagcca gagtcaagta tgagacagag c 41<210>255<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>255tcaatgacct tgcggagcca gtcaagtatg agacagagct 40
<210>256<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>Designed DNA based on CK18<400>330tgctgagacg acgctcacag tccaggtcga tctcc 35<210>331<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>331tgagacgtac agtccagtcc caagctggcc ttcagatt 38<210>332<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>332tgagacgtac agtccagtcc tggccttcag atttctcatg 40
<210>333<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>333acagcctgag ggaggtgaag gtgcagcagg atcc34<210>334<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>334cgagaaccgg aggctggaga taatggctcc agtctctgac c41<210>335<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>335agatcatcga ggacctgagg gctcaatctg cagaacgatg cg 42<210>336<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18
<400>336gacatccatg ggctccgcaa gagagcctcg atctctgtct c 41<210>337<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>337gacatccatg ggctccgcaa gagagcctcg atctctgtct 40<210>338<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>338caggacctcg ccaagatcat gggaaccgag aggagctaga caa 43<210>339<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>339cacacagtct gctgaggttg gacaggtcga tctccaagga ct 42<210>340<211>41<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>340gagacgacgc tcacagagct ggctggcctt cagatttctc a 41<210>341<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Designed DNA based on CK18<400>341ccacccgccg gatagtggat gctggcttaa tgcctcagaa 40<210>342<211>1360<212>DNA<213>Homo sapiens<400>342cgggggttgc tccgtccgtg ctccgcctcg ccatgacttc ctacagctat cgccagtcgt60cggccacgtc gtccttcgga ggcctgggcg gcggctccgt gcgttttggg ccgggggtcg120cttttcgcgc gcccagcatt cacgggggct ccggcggccg cggcgtatcc gtgtcctccg180cccgctttgt gtcctcgtcc tcctcggggg gctacggcgg cggctacggc ggcgtcctga240ccgcgtccga cgggctgctg gcgggcaacg agaagctaac catgcagaac ctcaacgacc300gcctggcctc ctacctggac aaggtgcgcg ccctggaggc ggccaacggc gagctagagg360tgaagatccg cgactggtac cagaagcagg ggcctgggcc ctcccgcgac tacagccact420actacacgac catccaggac ctgcgggaca agattcttgg tgccaccatt gagaactcca480ggattgtcct gcagatcgac aacgcccgtc tggctgcaga tgacttccga accaagtttg540
agacggaaca ggctctgcgc atgagcgtgg aggccgacat caacggcctg cgcagggtgc600tggatgagct gaccctggcc aggaccgacc tggagatgca gatcgaaggc ctgaaggaag660agctggccta cctgaagaag aaccatgagg aggaaatcag tacgctgagg ggccaagtgg720gaggccaggt cagtgtggag gtggattccg ctccgggcac cgatctcgcc aagatcctga780gtgacatgcg aagccaatat gaggtcatgg ccgagcagaa ccggaaggat gctgaagcct840ggttcaccag ccggactgaa gaattgaacc gggaggtcgc tggccacacg gagcagctcc900agatgagcag gtccgaggtt actgacctgc ggcgcaccct tcagggtctt gagattgagc960tgcagtcaca gctgagcatg aaagctgcct tggaagacac actggcagaa acggaggcgc 1020gctttggagc ccagctggcg catatccagg cgctgatcag cggtattgaa gcccagctgg 1080cggatgtgcg agctgatagt gagcggcaga atcaggagta ccagcggctc atggacatca 1140agtcgcggct ggagcaggag attgccacct accgcagcct gctcgaggga caggaagatc 1200actacaacaa tttgtctgcc tccaaggtcc tctgaggcag caggctctgg ggcttctgct 1260gtcctttgga gggtgtcttc tgggtagagg gatgggaagg aagggaccct tacccccggc 1320tcttctcctg acctgccaat aaaaatttat ggtccaaggg 1360<210>343<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>343tgtagtagtg gctgtagtcg cg 22<210>344<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
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<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>345ggagttctca atggtggcac ca 22<210>346<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>346ttggcccctc agcgtac 17<210>347<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>347agcggaatcc acctccac 18
<210>348<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>348aatccacctc cacactgacc 20<210>349<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>349atccacctcc acactgacc 19<210>350<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>350tccacctcca cactgacc18<210>351<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>351agctagaggt gaagatccg 19<210>352<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>352agatccgcga ctggtac 17<210>353<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>353gtgaagatcc gcgactg 17<210>354<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>354actactacac gaccatccag g21<210>355<211>17<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>355aagagctggc ctacctg 17<210>356<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>356gaggaaatca gtacgctgag 20<210>357<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>357gctaaccatg cagaacctc19<210>358<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>358tggtaccaga agcagggg 18
<210>359<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>359acctggagat gcagatcg18<210>360<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>360aagagctggc ctacctg 17<210>361<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>361agctggccta cctgaag 17<210>362<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>362gtgccaccat tgagaactcc20<210>363<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>363tgtcctgcag atcgacaacg c 21<210>364<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>364gtcctgcaga tcgacaacgc c 21<210>365<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>365aggtcagtgt ggaggtgg 18<210>366<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>366tctcgccaag atcctgagtg 20<210>367<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>367tcgccaagat cctgagtgac 20<210>368<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>368agatcctgag tgacatgcga ag 22<210>369<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>369ggttcggaag tcatctgc18
<210>370<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>370cgtctcaaac ttggttcgga 20<210>371<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>371tccgtctcaa acttggttcg 20<210>372<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>372cgcatgtcac tcaggatc 18<210>373<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>373caggcttcag catccttc 18<210>374<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>374ggtgaaccag gcttcag17<210>375<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>375gtgaaccagg cttcagc17<210>376<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>376gaaccaggct tcagcatc 18<210>377<211>17<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>377accaggcttc agcatcc 17<210>378<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>378agagcctgtt ccgtctc 17<210>379<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>379gtggaggccg acatcaac18<210>380<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>380caggcttcag catccttc18
<210>381<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>381tcggacctgc tcatctg 17<210>382<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>382tcagtaacct cggacctg18<210>383<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>383agtaacctcg gacctgc 17<210>384<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>384taacctcgga cctgctc 17<210>385<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>385aggcccctgc ttctg 15<210>386<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>386gcccctgctt ctggt 15<210>387<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>387cccctgcttc tggtacc 17<210>388<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>388cccctgcttc tggtacca18<210>389<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>389gcccctgctt ctggtacc18<210>390<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>390aggcccctgc ttctgg 16<210>391<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>391ggcccctgct tctggt 16
<210>392<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>392agaatcttgt cccgcagg 18<210>393<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>393gaatcttgtc ccgcagg17<210>394<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>394tgatttcctc ctcatggttc 20<210>395<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>395gatttcctcc tcatggttct 20<210>396<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>396tcctcctcat ggttcttct 19<210>397<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>397actgacctgg cctccca 17<210>398<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>398cctcccactt ggccc 15<210>399<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>399agatcgacaa cgcccgtc 18<210>400<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>400atcgacaacg cccgtctg 18<210>401<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>401atcgacaacg cccgt 15<210>402<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>402tcgacaacgc ccgt 14
<210>403<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>403ccgtctggct gcaga15<210>404<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>404cgtctggctg cagatga 17<210>405<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>405gtctggctgc agatgact 18<210>406<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>406tctggctgca gatgactt18<210>407<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>407tccgggcacc gatctc 16<210>408<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>408ggcaccgatc tcgcca 16<210>409<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>409gggcaccgat ctcgc 15<210>410<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>410gcaccgatct cgcca 15<210>411<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>411tcatggccga gcagaacc 18<210>412<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>412catggccgag cagaac 16<210>413<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>413tgtagtagtg gctgtagtcg cgagctagag gtgaagatcc g 41
<210>414<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>414tgtagtagtg gctgtagtcg cgagatccgc gactggtac 39<210>415<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>415tcgtgtagta gtggctgtag tcgagctaga ggtgaagatc cg 42<210>416<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>416tcgtgtagta gtggctgtag tcggtgaaga tccgcgactg40<210>417<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>417tcgtgtagta gtggctgtag tcgagatccg cgactggtac 40<210>418<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>418gtgccaccat tgagaactcc ggttcggaag tcatctgc 38<210>419<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>419ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc agg 43<210>420<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>420tgtcctgcag atcgacaacg ccgtctcaaa cttggttcgg a 41<210>421<211>41<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>421gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g 41<210>422<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>422ttggcccctc agcgtacaag agctggccta cctg 34<210>423<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>423aggtcagtgt ggaggtggcg catgtcactc aggatc36<210>424<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>424agcggaatcc acctccacga ggaaatcagt acgctgag 38
<210>425<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>425aatccacctc cacactgacc gaggaaatca gtacgctgag40<210>426<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>426atccacctcc acactgaccg aggaaatcag tacgctgag 39<210>427<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>427tccacctcca cactgaccga ggaaatcagt acgctgag 38<210>428<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA
<400>428tctcgccaag atcctgagtg caggcttcag catccttc38<210>429<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>429tctcgccaag atcctgagtg ggtgaaccag gcttcag 37<210>430<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>430tctcgccaag atcctgagtg gtgaaccagg cttcagc 37<210>431<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>431tctcgccaag atcctgagtg gaaccaggct tcagcatc38<210>432<211>37<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>432tctcgccaag atcctgagtg accaggcttc agcatcc 37<210>433<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>433tcgccaagat cctgagtgac caggcttcag catccttc 38<210>434<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK19基因設(shè)計的DNA<400>434agatcctgag tgacatgcga agcaggcttc agcatccttc40<210>435<211>1275<212>DNA<213>Homo sapiens<400>435atggatttca gtcgcagaag cttccacaga agcctgagct cctccttgca ggcccctgta60gtcagtacag tgggcatgca gcgcctcggg acgacaccca gcgtttatgg gggtgctgga120ggccggggca tccgcatctc caactccaga cacacggtga actatgggag cgatctcaca180
ggcggcgggg acctgtttgt tggcaatgag aaaatggcca tgcagaacct aaatgaccgt 240ctagcgagct acctagaaaa ggtgcggacc ctggagcagt ccaactccaa acttgaagtg 300caaatcaagc agtggtacga aaccaacgcc ccgagggctg gtcgcgacta cagtgcatat 360tacagacaaa ttgaagagct gcgaagtcag attaaggatg ctcaactgca aaatgctcgg 420tgtgtcctgc aaattgataa tgctaaactg gctgctgagg acttcagact gaagtatgag 480actgagagag gaatacgtct aacagtggaa gctgatctcc aaggcctgaa taaggtcttt 540gatgacctaa ccctacataa aacagatttg gagattcaaa ttgaagaact gaataaagac 600ctagctctcc tcaaaaagga gcatcaggag gaagtcgatg gcctacacaa gcatctgggc 660aacactgtca atgtggaggt tgatgctgct ccaggcctga accttggcgt catcatgaat 720gaaatgaggc agaagtatga agtcatggcc cagaagaacc ttcaagaggc caaagaacag 780tttgagagac agactgcagt tctgcagcaa caggtcacag tgaatactga agaattaaaa 840ggaactgagg ttcaactaac ggagctgaga cgcacctccc agagccttga gatagaactc 900cagtcccatc tcagcatgaa agagtctttg gagcacactc tagaggagac caaggcccgt 960tacagcagcc agttagccaa cctccagtcg ctgttgagct ctctggaggc ccaactgatg 1020cagattcgga gtaacatgga acgccagaac aacgaatacc atatccttct tgacataaag 1080actcgacttg aacaggaaat tgctacttac cgccgccttc tggaaggaga agacgtaaaa 1140actacagaat atcagttaag caccctggaa gagagagata taaagaaaac caggaagatt 1200aagacagtcg tgcaagaagt agtggatggc aaggtcgtgt catctgaagt caaagaggtg 1260gaagaaaata tctaa 1275<210>436<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>436ttcatgctga gatgggactg g21<210>437<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>437gctgagatgg gactggagtt c21<210>438<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>438caatttgcag gacacaccga g21<210>439<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>439gaggttcaac taacggagc 19
<210>440<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>440gttcaactaa cggagctgag 20<210>441<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>441actaacggag ctgagacg 18<210>442<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>442attgaagagc tgcgaagtc19<210>443<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA
<400>443cgactacagt gcatattaca gac 23<210>444<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>444cagcaacagg tcacagtg18<210>445<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>445ctagaggaga ccaaggccc 19<210>446<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>446tctagaggag accaaggccc 20<210>447<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>447agaccaaggc ccgttacagc 20<210>448<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>448ctgctgagga cttcagactg a21<210>449<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>449agagagctca acagcgac18<210>450<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>450tccagagagc tcaacagc18
<210>451<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>451acagcgactg gaggttg 17<210>452<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>452agctcaacag cgactgg 17<210>453<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>453cttggagatc agcttccac 19<210>454<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA
<400>454gtagggttag gtcatcaaag ac 22<210>455<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>455gcgttccatg ttactccg18<210>456<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>456gcagttgagc atccttaatc t21<210>457<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>457ctcaaggctc tgggagg 17<210>458<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>458gactgagaga ggaatacgtc 20<210>459<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>459gccagttagc caacctcc18<210>460<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>460cagttagcca acctcc 16<210>461<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>461ttcatgctga gatgggactg ggaggttcaa ctaacggagc40
<210>462<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>462ttcatgctga gatgggactg ggttcaacta acggagctga g 41<210>463<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>463ttcatgctga gatgggactg gactaacgga gctgagacg 39<210>464<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>464gctgagatgg gactggagtt cgaggttcaa ctaacggagc40<210>465<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA
<400>465gctgagatgg gactggagtt cgttcaacta acggagctga g 41<210>466<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>466gctgagatgg gactggagtt cactaacgga gctgagacg 39<210>467<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>467caatttgcag gacacaccga gattgaagag ctgcgaagtc40<210>468<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>468ctagaggaga ccaaggccca gagagctcaa cagcgac 37<210>469<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>469tctagaggag accaaggccc tccagagagc tcaacagc 38<210>470<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>470tctagaggag accaaggccc acagcgactg gaggttg 37<210>471<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>471agaccaaggc ccgttacagc agagagctca acagcgac 38<210>472<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>472agaccaaggc ccgttacagc tccagagagc tcaacagc 38
<210>473<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>473agaccaaggc ccgttacagc agctcaacag cgactgg 37<210>474<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)CK20基因設(shè)計的DNA<400>474ctgctgagga cttcagactg acttggagat cagcttccac40
權(quán)利要求
1.核酸擴增用引物，用于通過LAMP法檢測細胞角蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的核酸擴增用引物，其中細胞角蛋白是從細胞角蛋白18、細胞角蛋白19和細胞角蛋白20選出來的。
3.用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，含有從以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸1)含有由序列1表示的堿基序列的270～1375位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列1和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列2～341中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
4.用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物，由從序列66～88或179～341表示的堿基序列中的任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成。
5.權(quán)利要求3或4所述的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
6.用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列1表示的堿基序列的270～1375位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列1和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列2～341中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求6所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
8.權(quán)利要求7所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
9.權(quán)利要求6～8中任一項所述的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物中至少有2種識別序列1所示的堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
10.權(quán)利要求7～9中任一項所述的引物組，其特征是上述引物組中含有的引物識別序列1所示的堿基序列和/或其互補鏈中的至少6處區(qū)域。
11.一種引物組，其特征是含有作為由從序列234～341表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物中由分為(a)序列234～286和(b)序列287～341的(a)以及(b)中各選擇一個引物的組合。
12.一種引物組，其特征是在權(quán)利要求11的引物組中，還含有作為由從序列66～88或序列179～201表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物中由分類為(c)序列66～88和(d)序列179～201的(c)以及(d)中各選擇一個引物的組合。
13.一種引物組，其特征是在權(quán)利要求11或12的引物組中，還含有作為由從序列202～233表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物中由分類為(e)序列202～219和(f)序列220～233時的(e)以及(f)中各選擇一個引物的組合的引物。
14.由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列234、287、66和179表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列252、297、68和182表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列259、307、72和184表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列278、331、79和193表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
15.由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列234、287、66、179、203和220表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列252、297、68、182、211和223表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列259、307、72、184、212和226表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列278、331、79、193、214和228表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
16.由以下所示的1)～8)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列280、334、82和195表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列281、335、83和196表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列282、336、84和197表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列282、337、84和197表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；5)作為引物含有序列283、338、85和198表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；6)作為引物含有序列284、339、86和199表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；7)作為引物含有序列285、340、87和200表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；8)作為引物含有序列286、341、88和201表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
17.由以下所示的1)～6)中任一個構(gòu)成的用于人細胞角蛋白18檢測的核酸擴增用引物組1)作為引物含有序列282、336、84、197、216和229表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組，2)作為引物含有序列282、337、84、197、216和230表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組，3)作為引物含有序列282、337、84、197、216和231表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組，4)作為引物含有序列283、338、85、198、217和232表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組，5)作為引物含有序列286、341、88、201、218和233表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組，6)作為引物含有序列286、341、88、201、219和233表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
18.人細胞角蛋白18的核酸檢測方法，使用由權(quán)利要求3或4所述的引物選擇必需的引物，或選擇權(quán)利要求5～17任一項所述的引物。
19.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列342表示的堿基序列的270～930位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列342和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列343～432中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
20.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，由從序列357～361或378～434表示的堿基序列中任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成。
21.權(quán)利要求19或20所述的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
22.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列342表示的堿基序列的270～930位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列342和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列343～434中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
23.權(quán)利要求22所述的用于人細胞角蛋白19檢測的引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
24.權(quán)利要求22或23所述的用于人細胞角蛋白19檢測的引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
25.權(quán)利要求22～24中任一項所述的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組含有的引物中至少有2種識別序列342所示的堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
26.權(quán)利要求22～25中任一項所述的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物至少識別序列342所示的堿基序列和/或其互補鏈中的6處區(qū)域。
27.一種引物組，其特征是作為由從序列413～434表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物，包括由分為(a)序列413～417、419、422或424～427、以及(b)序列418、420、421、423或428～434的(a)以及(b)中各選擇一個引物的組合。
28.一種引物組，其特征是在權(quán)利要求27的引物組中，還包括作為由從序列357～361或序列378～384表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物中由分類為(c)序列357～361和(d)序列378～384的(c)以及(d)中各選擇一個引物的組合的引物。
29.一種引物組，其特征是在權(quán)利要求27或28選擇的各個引物的組合中，還包括作為由從序列385～412表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物中由分類為(e)序列385～398和(f)序列399～412時的(e)以及(f)中各選擇一個引物的組合的引物組。
30.一種引物組，其中作為由各個序列所示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物包括以下所示的1)～4)的任一個組合1)從分類為(a)序列413～417、(b)序列418、(c)序列357、(d)序列379的各個分類選擇一個引物的組合；2)從分類為(a)序列419、(b)序列420～421、(c)序列358、(d)序列379的各個分類選擇一個引物的組合；3)從分類為(a)序列422、(b)序列423、(c)序列359、(d)序列380的各個分類選擇一個引物的組合；4)從分類為(a)序列424～427、(b)序列428～434、(c)序列360～361、(d)序列381～384的各個分類選擇一個引物的組合。
31.一種引物組，其中作為由各個序列所示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，包括以下所示的1)～4)的任一個組合1)從分類為(a)序列413～417、(b)序列418、(c)序列357、(d)序列378、(e)序列385～391、(f)序列399～402的各個分類選擇一個引物的組合；2)從分類為(a)序列419、(b)序列420～421、(c)序列358、(d)序列379、(e)序列392～393、(f)序列403～406的各個分類選擇一個引物的組合；3)從分類為(a)序列422、(b)序列423、(c)序列359、(d)序列380、(e)序列394～396、(f)序列403～409的各個分類選擇一個引物的組合；4)從分類為(a)序列424～427、(b)序列428～434、(c)序列360～361、(d)序列381～384、(e)序列397～398、(f)序列411～412的各個分類選擇一個引物的組合。
32.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，由以下所示的1)～3)中任一個構(gòu)成1)作為引物含有序列413、418、357和378表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列419、421、358和379表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列424、431、360和381表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
33.用于人細胞角蛋白19檢測的核酸擴增用引物組，由以下所示的1)～4)中任一個構(gòu)成1)作為引物含有序列413、418、357、378、385和402表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列419、421、358、379、392和404表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列422、423、359、380、394和407表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列424、431、360、381、397和411表示的堿基序列的寡核苷酸的引物組。
34.核酸檢測方法，使用從權(quán)利要求19或20所述的引物選擇必需的引物，或選擇權(quán)利要求21～33任一項所述的引物組。
35.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸1)含有由序列435表示的堿基序列的340～490位或495～1050位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列435和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列436～460中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
36.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，由從序列443、444或454～474表示的堿基序列中的任一個選擇出來的寡核苷酸構(gòu)成。
37.權(quán)利要求35或36所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
38.用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構(gòu)成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有由序列435表示的堿基序列的340～1050位區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的序列435和/或其互補鏈的至少5個以上連續(xù)堿基的寡核苷酸；2)由序列436至460中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴(yán)格條件下可以與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有在上述1)～4)所述的寡核苷酸中置換、缺失、插入或附加1至數(shù)個堿基的被變異的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
39.權(quán)利要求38所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其中核酸擴增手段是LAMP法。
40.權(quán)利要求39所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
41.權(quán)利要求38～40中任一項所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組含有的引物中至少有2種識別序列435所示的堿基序列和/或其互補鏈中的各2處區(qū)域。
42.權(quán)利要求38～41中任一項所述的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物至少識別序列435所示的堿基序列和/或其互補鏈中的6處區(qū)域。
43.一種引物組，其特征是作為由從序列461～466以及468～473表示的堿基序列的寡核苷酸構(gòu)成的用于人細胞角蛋白20檢測的核酸擴增用引物，包括由分類為(a)序列461～466和(b)序列468～473的各分類中選擇一個引物的組合。
44.一種用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中在權(quán)利要求43項中選擇的各引物的組合中，作為引物還包括序列444以及序列455所示的堿基序列的寡核苷酸。
45.一種用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中在權(quán)利要求43或44所述的引物組中，作為引物還包括序列457和/或459或460所示的堿基序列的寡核苷酸。
46.一種用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中作為引物含有序列443、454、467以及474所示的堿基序列的寡核苷酸。
47.一種用于人細胞角蛋白20檢測的引物組，其中作為引物除了包括序列443、454、467以及474所示的堿基序列的寡核苷酸之外，還包括序列456和/或458所示的堿基序列的寡核苷酸。
48.一種核酸檢測方法，使用從權(quán)利要求35或36所述的引物選擇的必需的引物，或從權(quán)利要求37～47任一項選擇的引物組。
49.權(quán)利要求18、34或48所述的核酸檢測方法，其中核酸檢測方法是LAMP法。
50.在權(quán)利要求18、34、48或49所述的核酸檢測方法中使用的試劑。
51.在權(quán)利要求18、34、48或49所述的核酸檢測方法中使用的試劑盒。
52.一種使用權(quán)利要求18、34、48或49所述的核酸檢測方法的核酸檢測系統(tǒng)。
全文摘要
目的是提供在用于人細胞角蛋白檢測的基因擴增反應(yīng)中使用的新的核酸擴增用引物。構(gòu)建含有由從序列1表示的堿基序列的270～1375位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的，例如由序列2～341中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物。另外，構(gòu)建含有由從序列342表示的堿基序列的270～930位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的，例如由序列343～434中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物。另外，構(gòu)建含有從序列435表示的堿基序列的340～490位或495～1050位的區(qū)域及其互補鏈的區(qū)域選擇的，例如由序列436～474中任一個表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的引物。
文檔編號C12Q1/68GK1656235SQ0381144
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月21日
發(fā)明者多田幸代, 赤井保正, 井邨泰之, 阿部滋樹, 峰川晴美 申請人:希森美康株式會社