專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)含硫精細化學品的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸的新方法，該方法利用其中表達編碼S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)(E.C.2.5.1.6)突變體的核苷酸序列的細菌；涉及編碼這些突變體的核苷酸序列，涉及用其轉(zhuǎn)化的重組微生物，并且涉及具有修飾酶活性的新metK突變體。
背景技術：
在細胞中，通過天然代謝過程產(chǎn)生含硫精細化學品，例如甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、生物素、硫胺素和硫辛酸，這些含硫精細化學品被應用在多種工業(yè)領域中，包括食品、飼料、化妝品和制藥工業(yè)中。統(tǒng)稱為“含硫精細化學品”的這些物質(zhì)包括有機酸、蛋白原(proteinogenic)和非蛋白原性氨基酸、維生素和輔因子。這些物質(zhì)最方便地通過培養(yǎng)細菌工業(yè)化規(guī)模地生產(chǎn)，其中已經(jīng)培育了用于生產(chǎn)和分泌大量所述期望物質(zhì)的所述細菌。特別適于該目的的生物體是革蘭氏陽性、非致病性棒桿菌。
已知可以通過發(fā)酵棒桿菌，特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)株系生產(chǎn)氨基酸。由于高度的重要性，這些生產(chǎn)方法被不斷改進。關于生產(chǎn)方法的改進可以涉及發(fā)酵技術方面，諸如，攪拌和氧供應，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，諸如，發(fā)酵期間的糖濃度，或者例如通過離子交換層析的下游處理，或者微生物本身的固有性能參數(shù)。
株系篩選產(chǎn)生了一系列突變體株系，所述突變體株系選擇性地產(chǎn)生這一系列含硫精細化學品中的一組期望化合物。在特定分子生產(chǎn)方面，適用于改進這些微生物性能參數(shù)的方法是突變體的誘變、篩選和選擇。然而，這種方法是費時并且困難的方法。以該方法，可以獲得例如對抗代謝物諸如，甲硫氨酸類似物α-甲基甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-庚烯酸、硒甲硫氨酸、甲硫氨酸磺酰亞胺、methoxine或1-氨基環(huán)己烷甲酸具有抗性，或者在重要調(diào)節(jié)性代謝物方面是營養(yǎng)缺陷型，并且產(chǎn)生含硫精細化品諸如，L-甲硫氨酸的株系。
重組DNA技術方法也已經(jīng)使用一些年用于對生產(chǎn)L氨基酸的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)株系實施株系改進，其中擴增各氨基酸生物合成基因，并且研究對氨基酸產(chǎn)生的作用。
JP-A-06-020809公開了來源于黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(一種棒桿菌細菌)基因編碼S-腺苷甲硫氨酸的核苷酸序列。相應的氨基酸序列包含412個氨基酸。在大量其它棒桿菌相應酶中是保守的位置24和94中，該蛋白質(zhì)均為半胱氨酸殘基。公開的氨基酸序列在殘基137和154之間有特征性序列片段。其中沒有描述突變體的產(chǎn)生和它們在含硫精細化學品發(fā)酵生產(chǎn)中的用途。
WO-A-01/00843公開了來源于谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的metK基因，其編碼具有407個氨基酸的蛋白質(zhì)，并且有如SEQ ID NO16中所示的序列。
通常，精細化學品發(fā)酵生產(chǎn)的改進與改進的物質(zhì)流動和產(chǎn)量相關。防止或減少對合成中重要的酶的中間體抑制或終產(chǎn)物抑制是重要的。防止或減少碳流朝向不期望的產(chǎn)物或副產(chǎn)物方向分流也同樣是有利的。
可以研究代謝物對代謝酶的酶促活性的影響。這種酶的例子可以是微生物代謝中的metA、metB、metC、MetY、metH、metE、metF和其它酶。甲硫氨酸的一種重要代謝物是S-腺苷甲硫氨酸，其由此也是一重要的分流。
然而，S-腺苷甲硫氨酸同時也是甲硫氨酸生物合成的至關重要調(diào)節(jié)物。例如，已知S-腺苷甲硫氨酸抑制大腸桿菌(E.coli)中L-甲硫氨酸的生物合成。在這個系統(tǒng)中，S-腺苷甲硫氨酸做為阻遏物metJ的輔阻遏物(Weissbach，H.Brot.N.(1991)Mol Microbiol.5(7)，1593-1597)。
同時，S-腺苷甲硫氨酸的合成是對期望目的產(chǎn)物L-甲硫氨酸的一個重要分流。因此，因為下面幾種原因，即a)增加形成的L-甲硫氨酸的量；b)減少對甲硫氨酸生物合成基因的抑制，和c)減少對甲硫氨酸生物合成酶的反饋抑制，所以可能期望減少S-腺苷甲硫氨酸的形成量。
metK基因缺失將是防止S-腺苷甲硫氨酸形成的最簡單方法。然而，在Wei，Y和Newman，E.B.(2002)Mol Microbiol.43(6)，1651-1656中，metK基因被描述為必需基因，因此對本領域技術人員而言其看起來反而像改進含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)的起點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供改進的發(fā)酵生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸的新方法，和其所需要的手段。
意外地，已發(fā)現(xiàn)通過提供含硫精細化學品的如下發(fā)酵生產(chǎn)方法可以達到該目的，該方法包括在棒桿菌中表達metK核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有修飾的活性的S-腺苷甲硫氨酸合酶突變體，優(yōu)選地與野生型酶比較突變體的活性降低。例如，S-腺苷甲硫氨酸合酶突變體可以來源于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，并且在谷氨酸棒狀桿菌中的測定表明其活性小于野生型酶。
本發(fā)明第一主題涉及至少一種含硫精細化學品的發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法包括下面的步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生期望的含硫精細化學品的棒桿菌細菌培養(yǎng)物，該棒桿菌表達至少一種核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有修飾的S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)活性的蛋白質(zhì)；b)在培養(yǎng)基和/或細菌細胞中富集含硫精細化學品，和c)分離含硫精細化學品，優(yōu)選地，該含硫精細化學品包含L-甲硫氨酸。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，與未突變的野生型比較，該突變的棒桿菌還有改進的metY活性和/或增加的L-甲硫氨酸量(例如，用g/l發(fā)酵液表示)。
本發(fā)明方法中尤其可以使用的metK編碼序列是編碼具有降低的metK活性的蛋白質(zhì)的編碼核苷酸序列，其中置換了野生型蛋白質(zhì)的至少一個半胱氨酸殘基。
優(yōu)選地，metK編碼序列是編碼具有metK活性的蛋白質(zhì)的編碼核苷酸序列，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO23中所示的下面氨基酸子序列G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V其中X1和X2相互獨立地表示任何氨基酸；且X3表示除了Cys以外的氨基酸。
特別優(yōu)選的是這樣一種以上定義的方法，即，該方法中metK編碼序列編碼具有metK活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID NO22中所示從Vall到Ala407的氨基酸序列或與此序列同源并且代表功能性等價蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明所用的metK編碼序列包含如SEQ ID NO21中所示的編碼序列或與其同源并且編碼具有metK活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
metK編碼序列優(yōu)選地是能在棒桿菌中復制或穩(wěn)定地整合到染色體中的DNA或RNA。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，通過下面的步驟實施本發(fā)明的方法a)利用已經(jīng)被質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細菌株系，其中該載體帶有處于調(diào)節(jié)序列控制下的至少一個拷貝的metK編碼序列，或b)利用metK編碼序列已經(jīng)整合到細菌染色體中的菌株。
特別優(yōu)選的是上述株系，其中還例如通過野生型酶編碼序列的缺失已經(jīng)移除所有或一些metK野生型酶活性。
而且，可能期望發(fā)酵這樣一種細菌，即該細菌中還增強了期望的含硫精細化學品生物合成途徑的至少一種其它基因和/或至少部分地去除了減少期望的含硫精細化學品形成的至少一種代謝途徑。
這就是為什么根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施方式，發(fā)酵同時超表達選自下面基因中至少一種基因的棒桿菌的原因1)基因lysC，其編碼天冬氨酸激酶，2)基因asd，其編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶，3)基因gap，其編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，4)基因pgk，其編碼3-磷酸甘油酸激酶，5)基因pyc，其編碼丙酮酸羧化酶，6)基因tpi，其編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶，7)基因metA，其編碼高絲氨酸O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，8)基因metB，其編碼胱硫醚-γ合酶，9)基因metC，其編碼胱硫醚-γ裂合酶，10)基因metH，其編碼甲硫氨酸合酶，11)基因glyA，其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，12)基因metY，其編碼O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶，13)基因metF，其編碼亞甲基四氫葉酸還原酶，14)基因serC，其編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，15)基因serB，其編碼磷酸絲氨酸磷酸酶，16)基因cysE，其編碼絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶，17)基因cysK，其編碼半胱氨酸合酶，18)基因hom，其編碼高絲氨酸脫氫酶。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施方式，發(fā)酵其中同時突變了選自上述1)到18)的至少一種基因的棒桿菌，這種突變使得相應蛋白質(zhì)的活性與未突變蛋白質(zhì)比較受代謝物影響的程度較低，或者不受代謝物影響，并且優(yōu)選地本發(fā)明精細化學品的生產(chǎn)不受到不利的影響，或者這種突變可以增加蛋白質(zhì)的酶比活性。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施方式，發(fā)酵其中特別是通過降低相應基因的表達速率而同時減弱了至少一種選自下述的基因的棒桿菌
19)基因thrB，其編碼高絲氨酸激酶；20)基因ilvA，其編碼蘇氨酸脫水酶；21)基因thrC，其編碼蘇氨酸合酶；22)基因ddh，其編碼內(nèi)消旋二氨基庚二酸D脫氫酶；23)基因pck，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶；24)基因pgi，其編碼葡萄糖-6-磷酸-6異構(gòu)酶；25)基因poxB，其編碼丙酮酸氧化酶；26)基因dapA，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶；27)基因dapB，其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶，和28)基因lysA，其編碼二氨基吡啶甲酸脫羧酶。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施方式，發(fā)酵其中同時突變了上述19)到28)中至少一種基因的棒桿菌，這種突變使得部分或全部降低了相應蛋白質(zhì)的酶活性。
本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的微生物是谷氨酸棒狀桿菌物種的微生物。
本發(fā)明也涉及從發(fā)酵液生產(chǎn)含L-甲硫氨酸的動物飼料添加劑的方法，該方法包括下面的步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸的微生物，優(yōu)選地，所述微生物具有上述定義的降低的metK活性；b)從含L-甲硫氨酸的發(fā)酵液除去水；c)除去發(fā)酵期間形成的0到100％重量的生物量；和d)干燥從b)和/或c)獲得的發(fā)酵液，以獲得期望的粉末或顆粒形式的動物飼料添加劑。
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其編碼以上定義的具有降低的metK活性的多肽，并且涉及這些多核苷酸編碼的具有降低活性的metK突變體。
而且，本發(fā)明涉及表達上述突變metK基因的重組棒桿菌，特別是不再表達metK野生型酶的重組棒桿菌。
與相應的野生型株系比較，優(yōu)選的重組棒桿菌顯示至少一種下面的性狀
a)更低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸效價；b)更低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸合酶濃度，或c)根據(jù)S-腺苷甲硫氨酸形成速率測定的更低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性，另外，如果適當?shù)脑?，還顯示至少一種下面的性狀d)改進的metY活性或e)增加的L-甲硫氨酸量。
發(fā)明內(nèi)容a)一般術語術語具有“S-腺苷甲硫氨酸合酶”生物活性的蛋白質(zhì)，也縮寫為metK(E.C.2.5.1.6)，指能將L-甲硫氨酸和ATP轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸的蛋白質(zhì)。本領域技術人員熟悉metK蛋白質(zhì)的其它詳細內(nèi)容。通過酶測定法可以測定metK酶活性，可以在Markham，G.D.等(1983)Methods inEnzymology 94219-222中發(fā)現(xiàn)該測定法的方案。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，術語“含硫精細化學品”包括含有至少一個共價結(jié)合的硫原子并可以通過本發(fā)明發(fā)酵方法獲得的任何化學化合物。非限制性的例子是甲硫氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸，半胱氨酸，特別是甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸。
本發(fā)明范圍內(nèi)，術語“L-甲硫氨酸”，“甲硫氨酸”，“高半胱氨酸”和“S-腺苷甲硫氨酸”也包括相應的鹽，例如鹽酸甲硫氨酸或硫酸甲硫氨酸。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸(RNA)和多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)，它們可以呈現(xiàn)未修飾的RNA或DNA或者修飾的RNA或DNA形式。
根據(jù)本發(fā)明，“多肽”應理解為意指包含通過肽鍵連接的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
術語“代謝物”指在生物體代謝中做為中間體或終產(chǎn)物出現(xiàn)的化學化合物，該化學化合物除了做為化學構(gòu)件的特性外，其還可能發(fā)揮對酶和它們催化活性的調(diào)節(jié)作用。從文獻中已知這種代謝物可以對酶活性具有抑制和刺激作用(Biochemistry，Stryer，Lubert，1995 W.H.Freeman &Company，New York，New York)。文獻也描述了在生物體中，可以通過諸如利用UV輻射、電離輻射或誘變物質(zhì)突變基因組DNA和隨后篩選特定表型的方法來產(chǎn)生代謝物的影響作用被改變的酶(Sahm H.，EggelingL.，de Graaf A.A.Biological Chemistry 381(9-10)899-910，2000EikmannsBJ.，Eggeling L.，Sahm H.Antonie van Leeuwenhoek.64145-63，1993-94)。也可以通過靶向方法獲得這些修飾的特性。在本發(fā)明上下文中，本領域技術人員也知道特異地修飾酶基因中編碼蛋白質(zhì)的DNA的特異性核苷酸，使得由表達的DNA序列產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有特定的新特征。例如，這可以改變代謝物對未修飾的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。而且，可以影響酶活性，以降低對底物的反應速率或改變底物親和性。
在本發(fā)明上下文中，術語“表達”或“增強”或“超表達”描述了微生物中一種或多種由所述DNA編碼的酶的細胞內(nèi)活性的產(chǎn)生或增加。為此，可以，例如，將基因引入到生物體中，用另一種基因置換存在的基因，增加一種或多種基因的拷貝數(shù)，利用強啟動子或利用編碼具有高活性的所述酶的基因；如果合適，可以聯(lián)合使用這些措施。
在本發(fā)明上下文中，術語“減弱”和“降低”描述了微生物體中由所述DNA編碼的一種或多種酶的細胞內(nèi)活性的減弱或降低。為此，可以，例如缺失生物體中的基因，用另一種基因置換存在的基因，減少一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)，利用弱啟動子或利用編碼具有低活性的相應酶的基因；如果適當，可以聯(lián)合使用這些措施。
通過與諸如，來源于谷氨酸棒狀桿菌野生型ATCC13032的天然S-腺苷甲硫氨酸合酶活性比較，可以測定本發(fā)明S-腺苷甲硫氨酸合酶突變體或其功能等價物的“降低的活性”。為此，適宜通過轉(zhuǎn)化將在谷氨酸棒狀桿菌中復制并帶有S-腺苷甲硫氨酸合酶突變體基因的質(zhì)粒引入到例如谷氨酸棒狀桿菌野生型ATCC13032中。而且此外，將表達野生型酶S-腺苷甲硫氨酸合酶的適宜質(zhì)粒引入到谷氨酸棒狀桿菌野生型ATCC13032中。所獲得的谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在相同OD600的對數(shù)生長期收獲。此后，按照已知的方法，從2種轉(zhuǎn)化體的收集細胞制備蛋白質(zhì)提取物。然后利用Markham，G.D.等(1983)Methods in Enzymology94219-222的方法，在S-腺苷甲硫氨酸合酶試驗中使用(蛋白質(zhì)鑒定后)相同量的這些蛋白質(zhì)提取物。在閃爍計數(shù)儀中測定形成的S-腺苷甲硫氨酸的放射性?？紤]放射性L-甲硫氨酸的比活性和所使用的蛋白質(zhì)量，可以從每單位時間摻入的放射性的增加測定S-腺苷甲硫氨酸形成的速率。它具有單位——μmol S-腺苷甲硫氨酸/min*mg蛋白質(zhì)?？梢员容^野生型酶和突變酶之間的該速率。從具有S-腺苷甲硫氨酸合酶活性的其它野生型酶開始，通過相同的原理也可以產(chǎn)生本發(fā)明中有用的突變體。
根據(jù)本發(fā)明，“降低的活性”尤其指突變體的比活性降低到野生型活性的大約1到90％，優(yōu)選地3到70％，諸如，5到10％的殘余活性。
b)本發(fā)明的metK蛋白質(zhì)本發(fā)明的多核苷酸序列編碼上述具有修飾的，特別是降低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，通過置換革蘭氏陽性和/或陰性細菌，或者特別是棒桿菌的metK氨基酸序列中的一個或多個保守性半胱氨酸殘基來獲得本發(fā)明中所用的突變體。利用序列比對可以容易地鑒定保守性半胱氨酸殘基。細菌S-腺苷甲硫氨酸合酶中保守性Cys的非限制性例子是在多種細菌中發(fā)現(xiàn)的谷氨酸棒狀桿菌酶的Cys24和Cys94。
在本發(fā)明優(yōu)選的一組突變體中，用除了Cys以外的氨基酸，優(yōu)選地丙氨酸置換(根據(jù)谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032 metK的)Cys24和/或Cys94，由此以上述方式降低酶活性。
本發(fā)明范圍中具體公開的多肽的“功能性等價物”或類似物是與這些具體公開的多肽不同，但是仍舊保留了期望的生物活性諸如，底物特異性的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，“功能性等價物”可以理解為尤其意指在至少一個上述序列位置中具有不同于具體提到的氨基酸的另一個氨基酸，但同時仍保留至少一種上述生物學活性的突變體。因此，“功能性等價物”包括可以通過一個或多個氨基酸添加，置換，缺失和/或倒位獲得的突變體，上述的序列修飾可以發(fā)生于任何序列位置，條件是它們產(chǎn)生具有本發(fā)明特征模式的突變體。特別地，當突變體和未修飾多肽之間反應性模式在質(zhì)上一致時，即，例如當以不同速率轉(zhuǎn)化相同的底物時，也存在功能性等價物。
自然地，“功能性等價物”也包括可以從其它生物體獲得的多肽和天然出現(xiàn)的變異體。例如，通過序列可以鑒定同源序列區(qū)的范圍，并且可以依據(jù)本發(fā)明的特定目的確定等價酶。
同樣地，“功能性等價物”包括片段，優(yōu)選地具有例如期望的生物學功能的本發(fā)明多肽的單獨結(jié)構(gòu)域或序列基序。
而且，“功能性等價物”也指融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)具有通過功能性N-或C-末端連接的一個上述多肽序列或來源于其的功能性等價物和至少另一個功能性不同的異源序列(所謂功能性連接即，融合蛋白質(zhì)的各部分彼此不對對方的功能造成顯著不利影響)。這種異源序列的非限制性例子是例如信號肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受體或受體配體。
本發(fā)明中還包括這樣的“功能性等價物”，其是具體公開的蛋白質(zhì)的同系物。這些同系物與一個具體公開的序列具有至少20％，30％，或例如40％，50％，優(yōu)選地至少約60％，65％，70％或75％，特別是至少85％，諸如90％，95％或99％同源性，其中利用Pearson和Lipman的算法(Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448)計算該同源性。
特別優(yōu)選的突變體和功能性類似物是含有上述定義的特征性子序列G(F/Y)(D/S)x1x2(S/T)x3(G/A)V的突變體和功能性類似物，其中x3是通過突變引入的除了Cys以外的氨基酸，特別是丙氨酸。x3對應于谷氨酸棒狀桿菌metK野生型序列(SEQID NO16)的Cys94。優(yōu)選地，x2表示Ala、Glu、Asp、Asn或Arg，并且優(yōu)選地x1表示Gly、Cys、Ser或Ala。
通過誘變，例如通過點突變或蛋白質(zhì)截短可以產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的同系物。本發(fā)明上下文中所用術語“同系物”指可以作為蛋白質(zhì)活性的激動劑或拮抗劑的蛋白質(zhì)變異體形式。
通過篩選突變體，例如截短突變體的組合文庫可以鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的同系物。諸如，通過酶促連接合成的寡核苷酸的混合物，通過在核酸水平上的組合誘變可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)變異體的多樣化文庫?，F(xiàn)有多種方法可以用于從簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在同系物文庫。在DNA合成儀中可以化學合成簡并基因序列，然后可以將合成的基因連接到適合的表達載體中。一套簡并基因的使用使得可以在一個混合物中提供編碼期望的一套潛在蛋白質(zhì)序列的所有序列。簡并寡核苷酸的合成方法是本領域技術人員已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等，(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11477)。
蛋白質(zhì)密碼子片段文庫也可以用于產(chǎn)生多樣性蛋白質(zhì)片段群以篩選和隨后選擇本發(fā)明蛋白質(zhì)的同系物。在一個實施方式中，通過在每個分子大約僅發(fā)生一次切割的條件下，用核酸酶處理編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，復性DNA從而形成可以包含來自不同切割產(chǎn)物的有義/反義對的雙鏈DNA，通過用S1核酸酶處理，從新形成的雙鏈體除去單鏈片段，并且將由此得到的片段文庫連接到表達載體中，從而產(chǎn)生編碼序列片段文庫。該方法能夠產(chǎn)生編碼各種大小的本發(fā)明蛋白質(zhì)的N-端，C-端和內(nèi)部片段的表達文庫。
大量的基因誘變技術是本領域已知的Coco，WM等2001，DNA改組方法用于產(chǎn)生高度重組的基因和進化酶，Nature Biotechnol.19354-359DE 19953854；Leung DW等，1989，利用改進的聚合酶鏈式反應隨機誘變規(guī)定的DNA片段的方法，Technique 111-15；Stemmer WPC1994，通過隨機片段化和重組裝進行DNA改組用于分子進化的體外重組，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9110747-10751；和US 5811238。這些方法可以用于產(chǎn)生本發(fā)明中使用的突變體。
用于篩選通過點突變或截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物和從cDNA文庫篩選具有選定特征的基因產(chǎn)物的大量技術是本領域已知的?？梢赃m應性修改這些技術以快速篩選通過本發(fā)明同系物的組合誘變產(chǎn)生的基因文庫。最常使用的適于高流通量分析以篩選大基因文庫的技術包括將基因文庫克隆到可復制的表達載體中，用由此獲得的載體文庫轉(zhuǎn)化適合的細胞，和在一定條件下表達組合基因，其中在所述條件下期望活性的缺失簡化了產(chǎn)物已獲得檢測的基因的編碼載體的分離。增加文庫中功能性突變體頻率的遞歸總體誘變(Recursive ensemble mutagenesis，REM)技術可以與鑒定同系物的篩選測定法聯(lián)合使用(Arkin和Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等，(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
c)本發(fā)明多核苷酸同樣地，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明metK酶的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列諸如，cDNA和mRNA)和其功能性等價物，尤其是，例如可以利用合成的核苷酸類似物獲得的功能性等價物。
本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性片段的分離的核酸分子，涉及例如可以用做雜交探針或引物以鑒定或擴增本發(fā)明編碼核酸的核酸片段。
而且，本發(fā)明的核酸分子可以包含基因編碼區(qū)的3’-和/或5’-末端非翻譯序列。
從核酸分子天然來源中存在的其它核酸分子中分離出的該核酸分子為“分離的”核酸分子，并且，如果通過重組技術制備該核酸分子，該核酸分子還可以不帶有其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者，如果化學合成該核酸分子，該核酸分子不帶有化學前體或其它化學藥品。
本發(fā)明還包括與具體描述的核苷酸序列或其片段互補的核酸分子。
利用本發(fā)明的核苷酸序列可以產(chǎn)生用于鑒定和/或克隆其它細胞類型和生物體中的同源序列的探針和引物。這種探針或引物通常包含在嚴格條件下與本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應反義鏈中至少大約12個，優(yōu)選地至少大約25個，例如大約40，50或75個連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)。
本發(fā)明的其它核酸序列可以來源于SEQ ID NO21，并且通過單個或幾個核苷酸的添加、置換、插入或缺失而與其不同，但仍繼續(xù)編碼具有期望特征模式的多肽。它們可以是與上述序列在至少大約50％，55％，60％，65％，70％，80％或90％，優(yōu)選地至少大約95％，96％，97％，98％或99％的序列位置相同的多核苷酸。
本發(fā)明也包括包含所謂沉默突變的核酸序列，或根據(jù)具體的生物體來源或宿主生物體的密碼子使用與具體提到的序列比較被修飾的核酸序列，本發(fā)明同樣包括天然出現(xiàn)的變異體諸如，等位基因變異體。本發(fā)明的另一個主題是通過保守性核苷酸置換可以獲得的序列(即，用相同電荷、大小、極性和/或溶解度的氨基酸置換所述的氨基酸)。
本發(fā)明的另一個主題是由于序列多態(tài)性來源于具體公開的核酸的分子。這些遺傳多態(tài)性可以因天然變異而存在于群體中的個體之間。這些天然變異通常在基因核苷酸序列中產(chǎn)生1到5％的差異。
本發(fā)明還包括與上述編碼序列雜交或與其互補的核酸序列。當篩選基因組或cDNA文庫時可以發(fā)現(xiàn)這些多核苷酸，并且如果適當，可以通過PCR方法用適合的引物從中擴增這些多核苷酸，并且隨后例如利用適合的探針分離它們。另一種可能方案是用本發(fā)明多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化適合的微生物，擴增微生物并由此擴增多核苷酸，和隨后分離這些多核苷酸。而且，也可以化學合成本發(fā)明的多核苷酸。
能與多核苷酸“雜交”的特征應理解為意指在嚴格條件下，多核苷酸或寡核苷酸結(jié)合實質(zhì)上互補的序列的能力，而在這些條件下，非互補序列之間不會發(fā)生非特異性結(jié)合。為此，序列應該顯示70-100％，優(yōu)選地90-100％互補性?；パa序列能相互特異性結(jié)合的特征可以用于例如Northern或Southern印跡技術中，或者用于PCR或RT-PCR中的引物雜交中。通常，利用30個堿基對長度的寡核苷酸。嚴格條件理解為意指例如，在Northern印跡技術中，在50-70℃，優(yōu)選地60-65℃的溫度，利用洗滌溶液，優(yōu)選地具有0.1％SDS的0.1×SSC緩沖液(20×SSC3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核苷酸。如上所述，只有顯示高度互補性的這些核酸分子才保持相互結(jié)合。嚴格條件的設定是本領域技術人員已知的，并且例如在Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述了嚴格條件的設定。
d)metK編碼基因和其它基因的分離根據(jù)本質(zhì)上已知的方法，可以分離編碼酶S-腺苷甲硫氨酸合酶(EC2.5.1.6)的metK基因。
為了分離其它生物體的metK基因或其它基因，第一步是在大腸桿菌(E.coli)中建立這種生物體的基因文庫。在通常已知的教科書和參考書中詳細描述了基因文庫的建立?？梢蕴岬降睦邮荳innacker的教科書Geneand Klone，Eine Einführung in die Gentechnologie[基因和克隆，遺傳工程入門](Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)，或者Sambrook等的參考書Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。一個熟知的基因文庫是大腸桿菌(E.coli)K-12株系W3110的文庫，其由Kohara等(Cell 50，495-508(198))在λ載體中建立。
粘粒，諸如粘粒載體SuperCos I(WahI等，(1987)，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 842160-2164)，還有質(zhì)粒諸如p BR322(Bolivar；Life Sciences，25，807-818(1979))或者pUC9(Vieira等，1982，Gene，19259-268)可以用于在大腸桿菌中建立基因文庫。特別適合作為宿主的大腸桿菌株系是限制性缺陷和重組缺陷的大腸桿菌株系。一個例子是株系DH5αmcr，Grant等(Proceedings of the National Academy ofSciences USA，87(1990)4645-4649)已經(jīng)描述了該株系。在粘粒幫助下克隆的長DNA片段又可以被亞克隆到適于測序的常規(guī)載體中，并隨后如例如Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，745463-5467，1997)所述進行測序。
然后可以用已知的算法或序列分析程序諸如，Staden(Nucleic AcidsResearch(1986)14，217-232)程序，Marck(Nucleic Acids Research(1988)16，1829-1836)程序或者Butler的GCG程序(Methods of BiochemicalAnalysis(1998)39，74-97)，研究所獲的DNA序列。
在特別是Boehringer Mannheim GmbH的參考書“The DIG SystemUsers Guide for Filter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)和Liebl等的參考書(International Journal of Systematic Bacteriology(1991)41255-260)中，本領域技術人員可以找到通過雜交方法鑒定DNA序列的方案。在特別是參考書GaitOligonucleotide synthesisA PracticalApproach(IRL Press，Oxford，UK，1984)中及在Newton和GrahamPRC(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中，本領域技術人員可以找到利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA序列的方法。
此外，還已知蛋白質(zhì)的N和/或C末端修飾不會顯著影響蛋白質(zhì)的功能；實際上，它們甚至能起到穩(wěn)定作用。在特別是Ben-Bassat等(1987)Journal of Bacteriology 169751-757中，在O’Regan等，(1989)Gene77237-251中，在Sahin-Toth等(1994)Protein Sciences 3240-247中，在Hochuli等(1988)Biotechnology 61321-1325中和在已知的遺傳和分子生物學教科書中，本領域技術人員可找到關于該主題的信息。
e)本發(fā)明所用的宿主細胞優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的宿主細胞是棒桿菌細菌，其中通過至少一種下面的特征可以檢測該棒桿菌降低的metK活性。
a)與野生型株系比較，降低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸效價；b)降低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸合酶濃度(基于總蛋白質(zhì)的更少的S-腺苷甲硫氨酸合酶)，或c)降低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸合酶活性(基于S-腺苷甲硫氨酸合酶蛋白質(zhì)含量的更少的S-腺苷甲硫氨酸合酶酶活性)。
本領域技術人員用簡單的方法，如果適當?shù)脑?，結(jié)合考慮上述描述，可以測定所有這些特征。
特別地，本發(fā)明還涉及做為宿主細胞的微生物，特別是含有載體的棒桿菌(所述載體特別是具有至少一個本發(fā)明所定義的metK基因的穿梭載體或質(zhì)粒載體)，或者是表達具有降低活性的本發(fā)明metK基因的棒桿菌。
這些微生物能從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇產(chǎn)生含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸。優(yōu)選地，它們是棒桿菌，特別是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的棒桿菌。在棒狀桿菌屬中，必需特別提到物種谷氨酸棒狀桿菌，在本專業(yè)領域中已知其能產(chǎn)生L-氨基酸。
必需提到的適合的棒桿菌株系實例是棒狀桿菌屬的棒桿菌，特別是物種谷氨酸棒狀桿菌，諸如谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032，醋谷棒狀桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806，嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870，Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965，或者短桿菌屬(Brevibacterium)的棒桿菌，諸如黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和擴展短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020，或者同樣產(chǎn)生期望的精細化學品或其前體的來源于上述菌株的株系，諸如谷氨酸棒狀桿菌KFCC 10065，谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21608，(KFCC＝韓國培養(yǎng)物保藏中心聯(lián)盟(korean Federation of CultureCollection)；ATCC＝美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。
f)進行本發(fā)明的發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)棒桿菌表達本發(fā)明metK基因后可以以有利的方式產(chǎn)生含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸。
本領域技術人員可以單獨或聯(lián)合采用各種方法，以降低酶，例如S-腺苷甲硫氨酸合酶metK的活性或數(shù)量。通過降低編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄頻率可以降低所述蛋白質(zhì)的濃度。本領域技術人員通過修飾或置換編碼基因的啟動子區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點可以達到該目的。在編碼區(qū)的下游，本領域技術人員可以修飾終止子或插入引起轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性降低的序列。這些減少mRNA壽命的方法可以減少相應蛋白質(zhì)的表達和由此降低它們的濃度。
在表達的酶的水平，融合序列可能導致增加的分解速率，因此同樣引起降低的蛋白質(zhì)濃度。而且，本領域技術人員通過對編碼基因進行定向或非定向誘變，可以修飾活性、底物親和性和底物特異性。通過在相應基因中的突變使得酶反應的反應速率一定程度地或完全地降低，也可以影響酶活性。這種突變的例子是本領域技術人員已知的(Motoyama H.Yano H.Terasaki Y.Anazawa H.Applied & Enviromental Microbiology.673064-70，2001，Eikmanns BJ.Eggeling L.Sahm H.Antonie vanLeeuwenhoek.64145-63，1993-94)。蛋白質(zhì)的突變體也可能導致酶復合物的降低或受阻的同源或異源多聚化，由此進一步削弱酶學特性。
用這種方法修飾的基因可以存在于質(zhì)粒中或者優(yōu)選地整合到染色體中。而未用這種方法修飾的原始基因仍舊可以存在，但是優(yōu)選地用修飾的基因?qū)⑵渲脫Q。
為了降低棒桿菌中所測量的酶，例如S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)的活性，表達編碼功能性等價物的基因，諸如人工產(chǎn)生的突變體或來源于其它生物體的天然同系物，可能就足夠。原始基因也可以存在，但是優(yōu)選地用修飾的或同源的基因?qū)⑵渲脫Q。
當通過發(fā)酵方法在棒桿菌中生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸時，還可能有利的是，不僅表達本發(fā)明的metK基因，而且增強參與所述生物合成途徑，半胱氨酸代謝途徑，天冬氨酸半醛合成，糖酵解，糖回補，磷酸戊糖代謝，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一種或多種酶。
因此，可以增強一種或多種下面的基因用于生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸-基因lysC，其編碼天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，-基因asd，其編碼天冬氨酸半醛(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.282)，-基因gap，其編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因pgk，其編碼3-磷酸甘油酸激酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因pyc，其編碼丙酮酸羧化酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因tpi，其編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因metA，其編碼高絲氨酸O-乙?；D(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.725)，-基因metB，其編碼胱硫醚-γ合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，-基因metC，其編碼胱硫醚-γ裂合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3061)，-基因mett，其編碼甲硫氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1663)，-基因glyA，其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.1110)，-基因metY，其編碼O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.726)，-基因metF，其編碼亞甲基四氫葉酸還原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2379)，-基因serC，其編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.928)，-基因serB，其編碼磷酸絲氨酸磷酸酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.334，DNA-SEQ NO.467，DNA-SEQ NO.2767)，-基因cysE，其編碼絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2818)，-基因cysK，其編碼半胱氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2817)，-基因hom，其編碼高絲氨酸脫氫酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)。
因此，為了在棒桿菌中生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸，同時突變至少一種下面的基因使得相應的蛋白質(zhì)與未突變蛋白質(zhì)比較很少受與它們活性相關的代謝物的影響，或者根本不受影響，或者使得相應蛋白質(zhì)的比活性增強，這將可能是有利的-基因lysC，其編碼天冬氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.281)，-基因pyc，其編碼丙酮酸羧化酶(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，-基因metA，其編碼高絲氨酸O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.725)，-基因metB，其編碼胱硫醚-γ合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3491)，-基因metC，其編碼胱硫醚-γ裂合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3061)，-基因metH，其編碼甲硫氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1663)，-基因glyA，其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.1110)，-基因metY，其編碼O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.726)，-基因metF，其編碼亞甲基四氫葉酸還原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2379)，-基因serC，其編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.928)，-基因serB，其編碼磷酸絲氨酸磷酸酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.334，DNA-SEQ NO.467，DNA-SEQ NO.2767)，-基因cysE，其編碼絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.2818)，-基因cysK，其編碼半胱氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2817)，-基因hom，其編碼高絲氨酸脫氫酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.1306)。
此外，為了生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸，還可能有利的是，除表達本發(fā)明的一種metK基因外還減弱一種或多種下面的基因，特別是降低或關閉它們的表達-基因thrB，其編碼高絲氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，-基因ilvA，其編碼蘇氨酸脫水酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，-基因thrC，其編碼蘇氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，-基因ddh，其編碼內(nèi)消旋二氨基庚二酸D脫氫酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3494)，-基因pck，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3157)，-基因pgi，其編碼葡萄糖-6-磷酸-6異構(gòu)酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.950)，
-基因poxB，其編碼丙酮酸氧化酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，-基因dapA，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3476)，-基因dapB，其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3477)，-基因lysA，其編碼二氨基吡啶甲酸脫羧酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3451)。
而且，為了生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸，在棒桿菌中除了表達一種本發(fā)明的metK基因，同時還突變至少一種下面的基因使得相應蛋白質(zhì)的酶活性降低到一定程度或完全降低，這可能也是有利的-基因thrB，其編碼高絲氨酸激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3453)，-基因ilvA，其編碼蘇氨酸脫水酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2328)，-基因thrC，其編碼蘇氨酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3486)，-基因ddh，其編碼內(nèi)消旋二氨基庚二酸D脫氫酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3494)，-基因pck，其編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3157)，-基因pgi，其編碼葡萄糖-6-磷酸-6異構(gòu)酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.950)，-基因poxB，其編碼丙酮酸氧化酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.2873)，-基因dapA，其編碼二氫吡啶二羧酸合酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQNO.3476)，-基因dapB，其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3477)，-基因lysA，其編碼二氨基吡啶甲酸脫羧酶(EP 1 108 790 A2；DNA-SEQ NO.3451)。
此外，為了生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸，也可能有利的是，除了表達本發(fā)明metK基因以外還消除不期望的次級反應(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，inOverproductionof Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，Academic Press，London，UK，1982)。
本領域技術人員可以單獨或聯(lián)合采用各種方法以獲得超表達。因此，可以增加所述基因的拷貝數(shù)，或者可以突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點。引入到結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒可以以相同的方式起作用。此外，誘導型啟動子可以增加發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸期間的表達。通過延長mRNA壽命的方法也可以提高表達。
而且，通過防止酶蛋白質(zhì)的降解也可以增加酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或者可以在染色體中整合和擴增。做為可替代的方案，通過修飾培養(yǎng)基組成和發(fā)酵方法也可以獲得相關基因的超表達。
有關這方面的信息，本領域技術人員可以在特別是Martin等，(Biotechnology 5，137-146(1987))中，Guerrero等，(Gene 138，35-41(1994))中，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1998))中，Eikmanns等，(Gene 102，93-98(1991))中，EP 0472869中，US 4,601,893中，Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991))中，Remscheid等，(Applied andEnviromental Microbiology 60，126-132(1994))中，LaBarre等，(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))中，WO 96/15246中，Malumbres等(Gene134，15-24(1993))中，JP-A-10-229891中，Jensen和Hammer(Biotechnologyand Bioengineering 58，191-195(1998))中，Makrides(MicrobiologicalReviews 60512-538(1996)中和已知的遺傳和分子生物學教科書中找到。
因此，本發(fā)明也涉及包含處于調(diào)節(jié)核酸序列遺傳控制下編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的表達構(gòu)建體，并且涉及包含至少一種這樣的表達構(gòu)建體的載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的這種構(gòu)建體包含目的編碼序列5’上游的啟動子和3’下游的終止序列，和如果適當，其它常規(guī)調(diào)節(jié)元件，在每種情況下，它們都可操作地連接編碼序列?！翱刹僮鞯剡B接”理解為意指啟動子、編碼序列、終止子和如果適當，其它調(diào)節(jié)元件的順序排列，此排列使得一旦編碼序列表達，每個調(diào)節(jié)元件都能完成它們預期的功能。能夠可操作地連接的序列的例子是激活序列和增強子等。其它的調(diào)節(jié)元件包括選擇性標記、擴增信號、復制起點等。例如，在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述了適宜的調(diào)節(jié)序列。
除了人工調(diào)節(jié)序列外，天然調(diào)節(jié)序列仍然可以存在于實際結(jié)構(gòu)基因的上游。如果適當，可以通過基因修飾除去該天然調(diào)節(jié)，由此可以增加或降低基因表達。然而，基因構(gòu)建體在結(jié)構(gòu)上也可以更簡單，即，在結(jié)構(gòu)基因前不插入其它的調(diào)節(jié)信號，并且不除去天然啟動子及其調(diào)節(jié)作用?？商娲姆桨福梢酝蛔兲烊徽{(diào)節(jié)序列，使其不再產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，由此增加或降低基因表達。在基因構(gòu)建體中可以存在一個或多個拷貝的目的核酸序列。
有用的啟動子的例子是來源于谷氨酸棒狀桿菌的啟動子ddh，amy，lysC，dapA，lysA，及革蘭氏陽性啟動子SPO2(參見《枯草芽孢桿菌其近親》(Bacillus Subtilis and its closest Relatives)，Sonenshein，AbrahamL.，Hoch，James A.，Losick，Richard；ASM Press，District of Columbia，Washington and Patek M.Eikmanns BJ.Patek J.Sahm H.Microbiology.142 1297-309，1996)，或者可以有利地用在革蘭氏陰性細菌中的cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，laclq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，I-PR或I-PL啟動子。還優(yōu)選的是使用誘導型啟動子諸如，光誘導型，和特別是溫度誘導型啟動子，諸如PrPI啟動子。原則上，可以使用所有天然啟動子和它們的調(diào)節(jié)序列。此外，有利地，可以使用合成的啟動子。
上述調(diào)節(jié)序列旨在允許定向表達核酸序列和蛋白質(zhì)。根據(jù)宿主生物體，這意味著例如，基因僅在誘導后表達或超表達，或者它立即表達和/或超表述。
在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列或因子對表達有不利作用，因此降低表達。因此，可以在轉(zhuǎn)錄水平通過利用弱轉(zhuǎn)錄信號諸如啟動子和/或增強子實現(xiàn)表達消減。但是，也可以例如通過降低mRNA的穩(wěn)定性實現(xiàn)翻譯的消減。
在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選地，調(diào)節(jié)序列或因子對表達有積極作用，因此增加或降低表達。因此，可以有利地在轉(zhuǎn)錄水平通過利用強轉(zhuǎn)錄信號諸如啟動子和/或增強子實現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的增強作用。但是，也可以例如通過增加mRNA的穩(wěn)定性實現(xiàn)翻譯的增強。
通過融合適合的啟動子、適合的SD(shine-Dalgarno)序列和metK核苷酸序列及適合的終止信號可以產(chǎn)生表達盒。例如，在Current Protocolsin Molecular Biology，1993，John Wiley & Sons，Incorporated，New York，PCR Method，Gelfand，David H.，Innis，Michael A.，Sinsky，John J.1999，Academic Press，Incorporated，California，San Diego，PCR CloningProtocols，Methods in Molecular Biology Ser.，192卷，第二版，HumanaPress，New Jersey，Totowa，T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中，和在T.J.Shihavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)中，和在Ausubel，F(xiàn).M.等Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，and Wiley Interscience(1987)中描述的常規(guī)重組和克隆技術可以用于該目的。
為了在適合的宿主生物體中表達，有利地，將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入到宿主特異性載體中，該宿主特異性載體將使基因在宿主中最佳表達。載體是本領域技術人員熟知的，并且可以例如在“克隆載體”(Pouwels P.H.等編輯，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。除了質(zhì)粒外，載體也應理解為意指本領域技術人員熟知的所有其它載體，諸如，噬菌體、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和線性或環(huán)狀DNA。這些載體可以在宿主生物體中自主復制或者隨染色體復制。
例如，可以利用游離型質(zhì)粒，表達本發(fā)明的metK基因。適合的質(zhì)粒是在棒桿菌中復制的質(zhì)粒。大量已知的質(zhì)粒載體諸如，pZ1(Menkel等，Applied and Enviromental Microbiology (1989)64549-554)，pEKEx1(Eikmanns等，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene 10769-74(1991))是以隱蔽性質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1為基礎。同樣可以使用其它質(zhì)粒載體諸如，pCLiK5MSC，SEQ ID NO9，或基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的質(zhì)粒。
其它適合的質(zhì)粒載體是借助于其可以通過整合到染色體中實施基因擴增方法的質(zhì)粒載體，關于此基因擴增方法可以參見，例如Remscheid等(Applied and Enviromental Microbiology 60126-132(1994))所述用于復制或擴增hom-thrB操縱子的方法。在該方法中，將完整基因克隆到能在宿主(通常是大腸桿菌)中復制，但不能在谷氨酸棒狀桿菌中復制的質(zhì)粒載體中。適合的載體是，例如pSUP301(Sirnon等，Bio/Technology1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))，Bernard等，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))，pEM1(Schrumpf等，1991，Journal of Bacteriology 1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，Gene 41337-342)。同樣可以使用其它質(zhì)粒載體諸如，pCLiK5MSC integrativ sacB，SEQ ID NO12。
隨后，可以通過轉(zhuǎn)化，將含有待擴增基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到期望的谷氨酸棒狀桿菌株系中。例如，Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS Microbiological Letters123，343-347(1994))描述了轉(zhuǎn)化方法。
通過分批方法，補料分批方法或重復的補料分批方法可以連續(xù)或不連續(xù)地培養(yǎng)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物，以生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸。在Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Engineering 1.Introduction to Bioprocess Technology](GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科書中或在Storhas(Bioreaktorenand periphere Einrichtungen[生物反應器和外圍設備](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科書中可以發(fā)現(xiàn)關于已知培養(yǎng)方法的概述。
要使用的培養(yǎng)基必需適宜滿足目的株系的需要。在美國細菌學協(xié)會的指南“Manual of Methods für General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中可以找到用于各種微生物的培養(yǎng)基的描述。
本發(fā)明可以使用的這些培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和/或微量元素。
優(yōu)選的碳源是糖諸如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。也可以通過復雜化合物諸如糖蜜或糖精煉的其它副產(chǎn)品向培養(yǎng)基添加糖。添加各種碳源的混合物也可能是有利的。其它可能的碳源是油類和脂肪諸如，大豆油、向日葵油、花生油和椰油，脂肪酸諸如，棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸，醇類諸如，甘油、甲醇或乙醇，和有機酸諸如，醋酸或乳酸。
氮源通常是有機或無機氮化合物或包含這些化合物的物質(zhì)。氮源的例子包括氨氣或銨鹽諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復雜氮源諸如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其它氮源?？梢詥为毣蜃鰹榛旌衔锸褂眠@些氮源。
培養(yǎng)基中可以存在的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。
無機含硫化合物諸如，硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物，及有機硫化合物諸如硫醇和巰基類化合物也可以用做硫源以生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是甲硫氨酸。
磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽可以用做磷源。
螯合劑可以添加到培養(yǎng)基中以將金屬離子維持在溶液中。特別適合的螯合劑包括二羥基酚類，諸如兒茶酚或原兒茶酸，或有機酸諸如檸檬酸。
通常地，本發(fā)明使用的發(fā)酵培養(yǎng)基也包含其它生長因子諸如維生素或生長促進劑，包括例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽常常從復雜培養(yǎng)基組分諸如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等獲得。而且，可以向培養(yǎng)基添加適合的前體。培養(yǎng)基中化合物的確切組成很大程度上取決于具體的實驗，并且應根據(jù)每種情況單獨確定。在教科書“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編輯，IRL Press(1997)，53-73頁，ISBN 019 963577 3)中可以發(fā)現(xiàn)關于培養(yǎng)基最優(yōu)化的信息。也可以從商業(yè)來源獲得生長培養(yǎng)基，諸如Standard 1(Merck)或BHI(腦心浸液，DIFCO)等。
通過加熱(在121℃，1.5巴下20分鐘)或通過過濾滅菌對培養(yǎng)基的所有組分滅菌。所述組分可以一起進行滅菌，或者如果適當可以單獨進行滅菌。所有的培養(yǎng)基組分可以在發(fā)酵開始時就存在，或者可以按需要連續(xù)或分批地添加。
通常地，培養(yǎng)溫度是15℃至45℃，優(yōu)選地25℃到40℃之間，在實驗中培養(yǎng)溫度可以保持恒定或者可以變化。培養(yǎng)基的pH應該在5到8.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選約7.0。在發(fā)酵期間，通過添加堿性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物諸如磷酸或硫酸可以控制發(fā)酵的pH。可以使用消泡劑諸如，脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫形成。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基添加適合的選擇性作用物質(zhì)諸如，抗生素。為了維持需氧條件，可以將氧氣或含氧氣體混合物，例如周圍的空氣通入培養(yǎng)物中。通常地，培養(yǎng)溫度是20℃到45℃之間，優(yōu)選地25℃到40℃之間。連續(xù)進行發(fā)酵直到形成最大量的期望產(chǎn)物。通常地，在10小時到160小時內(nèi)達到該目的。
以此方式獲得的發(fā)酵液，尤其是含有L-甲硫氨酸的發(fā)酵液通常含有7.5-25％重量的干生物量。
此外，有利的是至少在發(fā)酵末期，但特別是在發(fā)酵期的至少30％后在糖限制條件下進行發(fā)酵。這意味著在該時間期間，發(fā)酵培養(yǎng)基中可利用的糖的濃度維持在或降低到≥0到3g/l。
然后進一步處理發(fā)酵液。根據(jù)需要，可以通過分離方法諸如，離心、過濾、傾析或這些方法的聯(lián)合，從發(fā)酵液中除去所有或一些生物量，或者將該生物量完全留在所述發(fā)酵液中。
隨后，可以利用已知的方法，諸如，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜蒸發(fā)器，通過反滲透，或通過納米過濾稠化或濃縮該發(fā)酵液。然后，可以通過冷凍干燥，噴霧干燥、噴霧制?；蛲ㄟ^其它方法后處理該濃縮的發(fā)酵液。
然而，還可以進一步純化該含硫精細化學品，特別是L-甲硫氨酸。為此，除去生物量后，利用適合的樹脂，對含有產(chǎn)物的發(fā)酵液進行層析，在層析樹脂上將留下所有或部分期望的產(chǎn)物或雜質(zhì)。如果必要，可以利用相同或其它的層析樹脂重復這些層析步驟。本領域技術人員熟悉適宜的層析樹脂的選擇和它們最有效的用途?？梢酝ㄟ^過濾或超過濾濃縮純化的產(chǎn)物，并且在產(chǎn)物最穩(wěn)定的溫度下進行貯藏。
可以通過現(xiàn)有技術測定分離的化合物的身份和純度。這些技術包括高效液相層析法(HPLC)、光譜法、染色法、薄層層析法、NIRS、酶測定法或微生物學測定法。在Patek等，(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等，(1996)Biotekhnologiya 11 27-32；和Schmidt等，(1998)Bioprocess Engineer.1967-70；Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry(1996)A27卷，VCHWeinheim，89-90頁，521-540頁，540-547頁，559-566頁，575-581頁，581-587頁；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等，(1987)Applications of HPLC in Biochemistry，《LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology》，17卷中概述了這些分析方法。
以下非限制性實施例更詳細地描述了本發(fā)明。


圖1顯示分別利用野生型酶和C94A突變體進行放射性metK測定的結(jié)果。
實施例實施例1pCLiK5MCS的構(gòu)建首先，通過聚合酶鏈式反應(PCR)使用寡核苷酸引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2擴增載體pBR322的氨芐青霉素抗性和復制起點。
SEQ ID NO15’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’SEQ ID NO25’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’除了與pBR322互補的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO1還以5’-3’方向含有限制性核酸酶SmaI、BamHI、NheI和AscI的切割位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO2以5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI、XhoI、NotI和DraI的切割位點。根據(jù)標準方法如Innis等的方法(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagen，La Jolla，USA)進行PCR反應。使用GFXTMPCR、DNA和凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化所得大小約為2.1kb的DNA片段。使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將DNA片段的鈍端相互連接，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stragagen，La Jolla，USA)中。通過涂含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik1。
從用作PCR反應的模板的質(zhì)粒pWLT1(Liebl等，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4擴增卡那霉素抗性盒。
SEQ ID NO35’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’SEQ ID NO45’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’除了與pWLT1互補的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO3還以5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI、SmaI、BamHI、NheI的切割位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO4以5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶AscI和NheI的切割位點。根據(jù)標準方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)進行PCR反應。使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化所得大小約為1.3kb的DNA片段。DNA片段用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI和AscI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化。載體pCLiK1同樣用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和AscI切割并使用堿性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書去磷酸化。在濃度0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書分離線性化載體(約2.1kb)。使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將切割的PCR片段連接到載體片段上，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通過涂含有氨芐青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik2。
載體pCLiK2用限制性內(nèi)切核酸酶DraI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割。在濃度0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書分離到約2.3kb載體片段。該載體片段使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書重新連接，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通過涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
各單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik3。
從用作PCR反應的模板的質(zhì)粒pWLQ2(Liebl等，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6擴增pHM1519的復制起點。
SEQ ID NO55’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’SEQ ID NO65’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’除了與pWLQ2互補的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ IDNO6還含有限制性內(nèi)切核酸酶NotI的切割位點。根據(jù)標準方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)進行PCR反應。使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化所得大小約為2.7kb的DNA片段。DNA片段用限制性內(nèi)切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化。載體pCLiK3同樣用限制性核酸內(nèi)切酶NotI切割并使用堿性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行去磷酸化。在濃度0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書分離線性化載體(約2.3kb)。使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將切割的PCR片段連接到此載體片段上，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，USA)中，通過涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik5。
通過混合兩條合成的基本互補的含有限制性內(nèi)切核酸酶SwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaI和SmaI的切割位點的寡核苷酸SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，通過將它們一起加熱到95℃然后緩慢冷卻得到雙鏈DNA片段，從而用多克隆位點(MCS)延伸pCLik5。
SEQ ID NO75’-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
SEQ ID NO85’-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’載體pCLiK5用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和BamHI(New EnglandBiolabs，Beverly，USA)切割并使用堿性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行去磷酸化。在濃度0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書分離線性化載體(約5.0kb)。使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將合成的雙鏈DNA片段連接到此載體片段上，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，LaJolla，USA)中，通過涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik5MCS。
根據(jù)Sanger等(1977)Proceedings of the National Acedemy of SciencesUSA 745463-5467進行測序反應。將測序反應物通過ABI Prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)分級分離并分析。
所得質(zhì)粒pCLiK5MCS被列為SEQ ID NO9。
實施例2pCLik5MCS integrativ sacB的構(gòu)建從作為PCR反應模板的質(zhì)粒pK19mob(Schfer等，Gene 145，69-73(1994))開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO10和SEQ ID NO11擴增枯草芽孢桿菌sacB基因。
SEQ ID NO105’-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3’
SEQ ID NO115’-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3’除了與pK19mobsac互補的序列，寡核苷酸引物SEQ ID NO10和SEQ ID NO11還含有限制性核酸內(nèi)切酶NotI的切割位點。根據(jù)標準方法如Innis等的方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990))使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)進行PCR反應。使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化所得大小約為1.9kb的DNA片段。DNA片段用限制性內(nèi)切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，USA)切割，之后再次使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書純化。
載體pCLiK5MCS同樣用限制性核酸內(nèi)切酶NotI切割并使用堿性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行去磷酸化。在濃度0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳后，使用GFXTMPCR、DNA和凝膠帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書分離大小約2.4kb的載體片段。使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics，Mannheim)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書將切割的PCR片段連接到此載體片段上，并根據(jù)標準方法，如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港，(1989))中描述的方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL-1Blue(Stratgagene，La Jolla，USA)中，通過涂含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂選擇攜帶質(zhì)粒的細胞(Lennox，1955，Virology，1190)。
單克隆的質(zhì)粒DNA使用Qiaprep spin miniprep試劑盒(Qiagen，Hilden)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書進行分離并通過限制性消化檢查。以這種方法得到的質(zhì)粒被稱為pCLik5MCS integrativ sacB。
根據(jù)Sanger等(1977)Proceedings of the National Acedemy of ScienceSUSA 745463-5467進行測序反應。將測序反應物通過ABI Prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)分級分離并分析。
所得質(zhì)粒pCLik5MCS integrativ sacB被列為SEQ ID NO12。
實施例3從谷氨酸棒狀桿菌分離和克隆metK基因利用Tauch等，(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等，(1994)Microbiology 1401817-1828的方法，制備谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032染色體DNA。從Groβmann等(2000)FEMS Microbiology Letters 19399-103的metK序列開始合成下面的寡核苷酸引物SEQ ID NO135’-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGACCTCCTCAT-3’和SEQ ID NO145’-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGTAACCCCA-3’利用如Innis等，(1990)PCR Protocols.A Guide to Method andApplications，Academic Press所述的標準方法，利用上述寡核苷酸引物和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)從谷氨酸棒狀桿菌基因組DNA擴增1640堿基對DNA片段。
用限制酶MluI和SmaI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割該片段(該片段中通過PCR寡核苷酸引物已經(jīng)引入了所述的MIuI和SmaI)，并且通過凝膠電泳分離。隨后，利用GFXTMPCR，DNA和凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)，從瓊脂糖分離DNA片段。
用限制酶SmaI和MluI同樣地切割載體pCLiK5MCS，即SEQ IDNO9，并且用堿性磷酸酶I(Roche Diagnostics，Mannheim)根據(jù)制造商的說明書去磷酸化。用T4 DNA連接酶連接載體和DNA片段(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)，并且根據(jù)Sambrook等，(1989)Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor中所描述的標準方法將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1 Blue(Stratagene)中。
用來源于Quiagen的方法和材料制備質(zhì)粒DNA。根據(jù)Sanger等，(1997)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 745463-5467進行測序反應。通過ABI Prism 377裝置(PE Applied Biosystem，Weiterstadt)分離和評估測序反應物。
由此得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKwt列為SEQ ID NO15。
實施例4谷氨酸棒狀桿菌metK基因的誘變利用QuickChange試劑盒(Stratagene)，根據(jù)制造商的說明書進行谷氨酸棒狀桿菌metK基因的定向誘變。在質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKwt，即SEQ ID NO15中進行該誘變。合成下面的寡核苷酸引物以將SEQ IDNO16中的半胱氨酸94置換為丙氨酸94SEQ ID NO175’-GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3’和SEQ ID NO185’-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3’這些寡核苷酸引物的使用在SEQ ID NO15位置1056(G置換C)和1057(C置換A)中產(chǎn)生了核苷酸的置換。轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒制備后，通過測序反應證實metK基因中所得到的氨基酸置換Cys94Ala。質(zhì)粒命名為pCLiK5MCS/metKC94A，并且列為SEQ ID NO19。
實施例5SAM合酶(metK)試驗在30℃，在BHI/葡萄糖培養(yǎng)基(37g/l制備的腦心浸液培養(yǎng)基，Difco，10mM(NH4)2SO4，4％葡萄糖)中培養(yǎng)已經(jīng)用質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKwt(SEQ ID NO15)或用質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌株系直到20的OD600。在4℃，離心沉淀細胞，用冷的生理鹽水沖洗沉淀。再次離心后，在4℃，在1ml裂解緩沖液(50mMTris pH7.5，10mM MgCl2，50mM KCl，1mM DTT)中重懸浮0.25g濕細胞沉淀。在旋轉(zhuǎn)設定值是6.0下，在Hybaid的Ribolyser中在Hybaid的藍色Ribolyser管中裂解細菌懸浮液3次，每次30秒。通過以13 000rpm，在Eppendorf離心機中離心45分鐘澄清該裂解液，用水以1∶10稀釋該上清液。通過Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254方法測定蛋白質(zhì)含量。
用具有下面改變的Markham，G.D.等，(1983)Methods in Enzymology94219-222方法測定SAM合酶的酶活性對于100μg所述蛋白質(zhì)裂解液，制備100μl反應混合物，該反應混合物包含100mM Tris pH8.0，100mM KCl，20mM MgCl2，1.2mM L-甲硫氨酸，10mM ATP，1μl35S-L-甲硫氨酸(相當于15.15μCi)(AmershamSJ204，比活性1Ci/μmol)，添加水到100μl，之后在37℃溫育。0，5，10，20，30和60分鐘后，移出10μl等份的反應混合物，在冰上用20μl 50mM EDTA終止反應。
將30μl終止的反應物置放在磷酸纖維素濾器(Pierce，No.29520)上，并且在Eppendorf離心機上以6000rpm旋轉(zhuǎn)離心1分鐘。用500μl 75mM磷酸洗濾器2次，然后將其放到含有閃爍液的計數(shù)管中。在閃爍計數(shù)儀(Beckman)中測定形成的S-腺苷甲硫氨酸的放射性。
數(shù)據(jù)顯示在所附圖1中。
考慮到放射性L-甲硫氨酸的比活性和所使用的蛋白質(zhì)量，可以從每單位時間摻入的放射性的增加測定S-腺苷甲硫氨酸形成的速率。它的單位是μmol S-腺苷甲硫氨酸/mim*mg蛋白質(zhì)?？梢员容^野生型酶和突變酶之間的該速率。
實施例6
谷氨酸棒狀桿菌中細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸效價的測定為了測定已經(jīng)用pCLiK5MCS/metKwt(SEQ ID NO15)或用質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒狀桿菌株系中細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸的效價，利用下面的方法。在三氯醋酸中重懸浮用冰冷生理鹽水沖洗過的如實施例5中所述獲得的細胞沉淀(200μl TCA/0.1g濕沉淀)。放置在冰上5分鐘后，在4℃和13 000rpm，在Eppendorf離心機上澄清該懸浮液5分鐘。通過HPLC方法(lonospher 5C陽離子交換柱，注射體積10μl，流動相70％體積/體積0.2M甲酸銨pH 0.4，30％體積/體積的甲醇；UV測定260nm；40℃；保留時間8.5分鐘)測定上清液中S-腺苷甲硫氨酸含量。
表1S-腺苷甲硫氨酸效價

實施例7用metK C94A置換谷氨酸棒狀桿菌中metKwt基因為了用突變體metK C94A進行谷氨酸棒狀桿菌KFCC10065中metK野生型基因的等位基因置換，首先將SEQ ID NO19的metK C94A序列克隆到pCLiK5MCS integrativ sacB(SEQ ID NO12)中。為此，用限制內(nèi)切核酸酶BglII和XhoI(NEB，Schwalbach)切割質(zhì)粒pCLiK5MCS/metKC94A(SEQ ID NO19)。如實施例3中所述純化由此得到的1962bp堿基對片段。用BglII和XhoI同樣地切割載體pCLiK5MCSintegrativ sacB，并且如實施例3中所述純化。如實施例3所述，連接載體和片段，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1 Blue中。純化質(zhì)粒，并且測序后證實該質(zhì)粒。由此得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS integrativ sacB/metK C94A列為SEQ ID NO20。
如Liebl等(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，通過電穿孔將質(zhì)粒pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒狀桿菌KFCC10065中。在DE 10046870中描述了該方法的修改。通過Sambrook等(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor所述的Southern印跡和雜交的標準方法證實各轉(zhuǎn)化體的metK基因座的染色體安排。由此確保轉(zhuǎn)化體是通過同源重組在metK基因座整合了轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。在無抗生素的培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)這種菌落后，將這些轉(zhuǎn)化體涂到蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基平板上(10％蔗糖)，并且在30℃溫育24小時。
因為存在于載體pCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A中的sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物，所以只有通過在野生型metK基因和突變的metKC94A基因之間進行二次同源重組缺失sacB基因的那些菌落才能生長。當發(fā)生同源重組時，野生型基因或突變的基因可以與sacB基因一起缺失。如果sacB基因與野生型基因一起被移除，那么就產(chǎn)生了突變轉(zhuǎn)化體。
挑取生長的菌落，制備它們的基因組DNA，通過2種方法分析metK基因。首先，利用實施例4中所述2個核苷酸的置換。利用在其3’末端能區(qū)分兩個等位基因的特異性PCR寡核苷酸引物和第二個metK特異性寡核苷酸引物，產(chǎn)生診斷性PCR片段。其次，用結(jié)合突變上游或下游的PCR寡核苷酸引物PCR擴增后，測序約100個轉(zhuǎn)化體的metK基因座。獲得幾個突變的metK克隆。一個這樣的克隆被命名為KFCC10065metKC94A。突變體C94A的氨基酸序列對應于SEQ ID NO22。
實施例8利用株系KFCC10065metKC94A生產(chǎn)甲硫氨酸在30℃，在含有BHI培養(yǎng)基(Difco)的瓊脂平板上培養(yǎng)實施例6中產(chǎn)生的株系KFCC10065metKC94A兩天。在鹽水中懸浮生長于瓊脂平板的細胞，并且以1.5 OD 600nm轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基II。培養(yǎng)基II的組分如下
培養(yǎng)基IIA0.6g/lKH2PO40.4g//l MgSO4·7H2O25g/l (NH4)2SO440g/l 粗糖60g/l 糖蜜用NH4OH將制備的培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.8，并且在120℃滅菌30分鐘。
培養(yǎng)基IIB0.3mg/l 硫胺素·HCl1mg/l 生物素2mg/l FeSO42mg/l MnSO40.1mg/l 維生素B12單獨制備培養(yǎng)基IIB，過濾滅菌，并且添加到培養(yǎng)基IIA中。兩個組分IIA和IIB一起形成了培養(yǎng)基II。
在含有0.5g無菌CaCO3的100ml錐形瓶中，用上述株系的細胞接種10ml培養(yǎng)基II(＝IIA+B)，并且在30℃，以200rpm，在定軌搖床上溫育72小時。
利用來源于Agilent的氨基酸測定方法，在Agilent 1100 Series LCSystem HPLC上測定培養(yǎng)液中形成的甲硫氨酸。用鄰苯二醛在上柱前衍生化以允許定量形成的氨基酸，而在Hypersil AA柱(Agilent)上分離氨基酸混合物。
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>發(fā)酵生產(chǎn)含硫精細化學品的方法<130>M/43138<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52<210>2<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga47<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38
<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34<210>7<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位點<400>7tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt 60tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc 120tctagacccg ggatttaaat 140<210>8<211>140<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位點<400>8gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga 60tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc 120aggcctctcg agatttaaat 140<210>9<211>5091<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒<400>9tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120ctagacccgg gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 240gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 300gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 360aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 420cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 480gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 540gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 600ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 660gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 720actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960ctcgcgccag ccgaaccgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc1020gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct1080ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct1140acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac1200ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc1260tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag1320atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg1380ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgctagcg1440gcgcgccggc cggcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc1500aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga1560gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca1620ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg1680ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt1740
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<223>質(zhì)粒<400>20tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gcaggtgagg taaccccaaa 60agaggtaaaa cccgcgccac cgacttttca ggagcgggga cgcgggtttt tgccatgaat 120ccgaagatac tacatcagat ttttaggcca acttgagggc tgcgcgaagt tcatcaacgc 180ggtcgatagc ctcccaagga aggtccaaat cagtgcgacc aaagtggccg taggcagcag 240tgtcagcgta gatcggacga agcagatcaa gctcacggat aattgctgct ggacgcaggt 300caaagacctc caacacggca gcctgaatct gctcgtcgct caggccttcc ttgttggtgt 360caaaggtttc aacgtaaagt ccgactggct ttgcgcgtcc aatggcgtat gcaacctgaa 420cttcagcgcg atcagcaagg cctgctgcca cgatgttctt tgctacccaa cgcatggcgt 480atgcagcaga gcggtccacc ttgcttggat ccttaccgga gaatgctcca ccaccatggc 540gagccatgcc accgtaggta tccacgatga tcttgcggcc ggtcagaccc gcatcaccca 600tggggccacc cagaatgaag gaacctgaag ggttgatcaa cacggtgatc tcaccggttg 660ccagatcctc aatgcctgcg tctttgatta cccaatcaat gacgtgttcg cgcagttggg 720tttccaacca tgcacggtca acttctgggt cgtgctgggt ggagatgaca acggtatcca 780ggtggctagg gcggtcttgc gcatcgtatg cgaaggtgac ctgggttttt ccgtctggac 840gcaggtgagg aacgatgccc tctttacgaa cctgggtcag acgacgtgac agtcggtgcg 900ccaacgcgat aggaagaggc atgtactctt cggtttcgtt ggtggcgtag ccgaacatca 960ggccctggtc gccagcacct gcgcggtcgt cttcttcaac gtcgccgttg gtgcgggctt1020cgtcggagtt atccacgccg tcagcgattt cctgggactg ctcaccgatg gatactgaga1080cgccagcggt gcgtccgtcg aatccaacct cagaggagtt gaatccgatt tcgatgagct1140tgttgcggac taattgaggg atctctacgt aagcgctggt acggacctcg ccaacaacat1200ggacgattcc ggtggtgacc acagtttcca ctgcgacgcg cgactgcgga tctttttcga1260gcagcgcgtc caaaatggta tcggaaatag catcacatat tttgtctgga tgtccctcag1320ttacagattc actggtgaac aaacggacgg cggttggctg agccacaaat acccttcttt1380cgaagaagtt gagaataaat agtcttaaat acaaaaaacc aatatagacc aagctgtcta1440aaactgcaat gtcagtggtc tagctggatt tttctagact tcgcgatacg ccagtgccgc1500gtcccaaatt tgcgcagcaa cctcgatttt gctgccgtgc tccacatcga ctaccccacc1560gtgagcatcc aaaatccagc cctcattgtg cttttgccca aacactttgc ccatgcccac1620ctcattacac atgaggaggt cgcagccctt cttcccggga tttaaatcgc tagcgggctg1680ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa1740tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc1800
ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc1860ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat1920ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg1980atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg2040ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc2100cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg2160tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt2220tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg2280cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat2340catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca2400ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca2460ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa2520ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa2580tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc2640ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga2700atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc2760cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac2820caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg2880ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc2940atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca3000cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc3060gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg3120gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa3180ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga3240cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag3300ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct3360taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg3420ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc3480ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt3540aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta3600tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac3660
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ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac ccgcgcgatt tacttttcga5580cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct attttcctct tttgtttgat5640agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga actaaaaaat ctatctgttt5700cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg gcataaagtt gcctttttaa5760tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa taatagtgaa cggcaggtat5820atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa atc 5863<210>21<211>1224<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1224)<223>
<400>21gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act 48Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg 96Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act144Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc192Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc240Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc gct ggc gtc288Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val85 90 95tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat336Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc384Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125
gca ggt gct ggc gac cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa 432Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140acc gaa gag tac atg cct ctt cct atc gcg ttg gcg cac cga ctg tca 480Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160cgt cgt ctg acc cag gtt cgt aaa gag ggc atc gtt cct cac ctg cgt 528Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175cca gac gga aaa acc cag gtc acc ttc gca tac gat gcg caa gac cgc 576Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190cct agc cac ctg gat acc gtt gtc atc tcc acc cag cac gac cca gaa 624Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205gtt gac cgt gca tgg ttg gaa acc caa ctg cgc gaa cac gtc att gat 672Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220tgg gta atc aaa gac gca ggc att gag gat ctg gca acc ggt gag atc 720Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240acc gtg ttg atc aac cct tca ggt tcc ttc att ctg ggt ggc ccc atg 768Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255ggt gat gcg ggt ctg acc ggc cgc aag atc atc gtg gat acc tac ggt 816Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270ggc atg gct cgc cat ggt ggt gga gca ttc tcc ggt aag gat cca agc 864Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285aag gtg gac cgc tct gct gca tac gcc atg cgt tgg gta gca aag aac 912Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300atc gtg gca gca ggc ctt gct gat cgc gct gaa gtt cag gtt gca tac 960Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320gcc att gga cgc gca aag cca gtc gga ctt tac gtt gaa acc ttt gac1008Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335acc aac aag gaa ggc ctg agc gac gag cag att cag gct gcc gtg ttg1056Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350gag gtc ttt gac ctg cgt cca gca gca att atc cgt gag ctt gat ctg1104Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365ctt cgt ccg atc tac gct gac act gct gcc tac ggc cac ttt ggt cgc1152Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg
370 375 380act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt1200Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400cgc gca gcc ctc aag ttg gcc taa1224Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405<210>22<211>407<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒<400>22Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr1 5 10 15Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu20 25 30Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr35 40 45Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser50 55 60Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile65 70 75 80Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val85 90 95Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp100 105 110Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg115 120 125Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu130 135 140Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser145 150 155 160
Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg165 170 175Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg180 185 190Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu195 200 205Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp210 215 220Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile225 230 235 240Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met245 250 255Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly260 265 270Gly Met Ala Arg His G1y Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser275 280 285Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn290 295 300Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr305 310 315 320Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp325 330 335Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu340 345 350Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu355 360 365Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg370 375 380Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu385 390 395 400Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala405
<210>23<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>可變部分序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa＝Phe或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝Asp或Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>Xaa＝任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>Xaa＝除Cys外的任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>Xaa＝Ser或Thr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>Xaa＝Gly或Ala<400>23Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val1 權(quán)利要求
1.發(fā)酵生產(chǎn)至少一種含硫精細化學品的方法，該方法包括下面的步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生期望含硫精細化學品的棒桿菌細菌培養(yǎng)物，該棒桿菌表達至少一種編碼具有修飾的S-腺苷甲硫氨酸合酶(metK)活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；b)在培養(yǎng)基和/或細菌細胞中富集含硫精細化學品，和c)分離含硫精細化學品。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該含硫精細化學品包括L-甲硫氨酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使用與未突變的野生型比較，其metK活性降低的突變的棒桿菌細菌。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中突變的棒桿菌與未突變的野生型比較還具有改進的metY活性和/或增加的L-甲硫氨酸量。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中metK編碼序列是編碼具有降低的metK活性的蛋白質(zhì)的編碼核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)中置換了野生型蛋白質(zhì)的至少一個半胱氨酸殘基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中metK編碼序列是編碼具有metK活性的蛋白質(zhì)的編碼核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)具有下面的氨基酸子序列G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V其中X1和X2相互獨立地表示任何氨基酸；且X3表示除了Cys以外的氨基酸。
7.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中metK編碼序列編碼具有metK活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID NO22中所示從Val1到Ala407的氨基酸序列或與之同源并且代表功能性等價蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
8.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中metK編碼序列是能在棒桿菌細菌中復制或穩(wěn)定地整合到染色體中的DNA，或RNA。
9.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中a)利用已經(jīng)被質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細菌株系，其中該載體帶有處于調(diào)節(jié)序列控制下的至少一個拷貝的突變metK序列，或b)利用突變的metK序列已經(jīng)整合到細菌染色體中的株系。
10.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中發(fā)酵所述細菌，在該細菌中此外還增強了期望的含硫精細化學品的生物合成途徑中的至少另一種基因。
11.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中發(fā)酵所述細菌，在該細菌中至少一種減少期望的含硫精細化學品形成的代謝途徑被至少部分地關閉。
12.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中發(fā)酵棒桿菌，在該棒桿菌中同時超表達至少一種選自下面的基因a)編碼天冬氨酸激酶的基因lysC，b)編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的基因asd，c)編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因gap，d)編碼3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk，e)編碼丙酮酸羧化酶的基因pyc，f)編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因tpi，g)編碼高絲氨酸O-乙?；D(zhuǎn)移酶的基因metA，h)編碼胱硫醚-γ合酶的基因metB，i)編碼胱硫醚-γ裂合酶的基因metC，j)編碼甲硫氨酸合酶的基因metH，k)編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的基因glyA，l)編碼O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶的基因metY，m)編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的基因metF，n)編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因serC，o)編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的基因serB，p)編碼絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因cysE，q)編碼半胱氨酸合酶的基因cysK，r)編碼高絲氨酸脫氫酶的基因hom；和/或同時突變上述基因中的至少一種基因，這種突變使得相應蛋白質(zhì)的活性與未突變蛋白質(zhì)比較受代謝物影響的程度較低或者不受代謝物的影響，或者這種突變增加蛋白質(zhì)的比活性。
13.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中發(fā)酵棒桿菌細菌，在該棒桿菌中同時減弱至少一種選自下面的基因a)編碼高絲氨酸激酶的基因thrB；b)編碼蘇氨酸脫水酶的基因ilvA；c)編碼蘇氨酸合酶的基因thrC；d)編碼內(nèi)消旋二氨基庚二酸D脫氫酶的基因ddh；e)編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的基因pck；f)編碼葡萄糖-6-磷酸-6異構(gòu)酶的基因pgi；g)編碼丙酮酸氧化酶的基因poxB；h)編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因dapA；i)編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的基因dapB，和j)編碼二氨基吡啶甲酸脫羧酶的基因lysA；和/或在該棒桿菌中同時突變這些基因中的至少一種基因使得部分或全部地降低相應蛋白質(zhì)的酶活性。
14.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中使用谷氨酸棒狀桿菌微生物物種。
15.從發(fā)酵液生產(chǎn)含L-甲硫氨酸的動物飼料添加劑的方法，該方法包括下面的步驟a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)和發(fā)酵前述任一權(quán)利要求所述的生產(chǎn)L-甲硫氨酸的微生物，b)從含L-甲硫氨酸的發(fā)酵液除去水；c)除去發(fā)酵期間形成的0到100％重量的生物量；和d)干燥從b)和/或c)獲得的發(fā)酵液，以獲得期望的粉末或顆粒形式的動物飼料添加劑。
16.如權(quán)利要求5到7任一所述的編碼具有降低的metK活性的多肽的分離的多核苷酸。
17.由權(quán)利要求16所述的多核苷酸編碼的具有降低活性的metK突變體。
18.表達突變的metK基因的重組棒桿菌細菌，其中該突變的metK基因包含如權(quán)利要求5到7任一所述的多核苷酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的重組棒桿菌細菌，其不再表達metK野生型酶。
20.如權(quán)利要求19所述的重組棒桿菌細菌，與相應的野生型株系比較，其具有至少一種下面的性狀a)更低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸效價；b)更低的細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸合酶濃度，或c)根據(jù)S-腺苷甲硫氨酸形成速率測定的更低的S-腺苷甲硫氨酸合酶活性，并且，如果適當?shù)脑挘溥€具有至少一種下面的性狀d)改進的metY活性或e)增加的L-甲硫氨酸的量。
21.表達構(gòu)建體，其含有在調(diào)節(jié)核苷酸序列控制下的權(quán)利要求5到7任一所述的metK突變體編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用細菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)含硫精細化學品，特別是L－甲硫氨酸的方法，在該細菌中表達編碼S－腺苷甲硫氨酸合酶(metK)基因的核苷酸序列。
文檔編號C12P13/12GK1656229SQ03811767
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月23日
發(fā)明者H·施羅德, B·克勒格爾, O·策爾德爾, C·克洛普羅格, S·哈夫納 申請人:巴斯福股份公司