專(zhuān)利名稱(chēng)：膠原生物織物以及其制備和使用方法
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1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從羊膜制得的膠原膜，此處稱(chēng)為膠原生物織物。本發(fā)明的膠原生物織物具有天然的未處理的羊膜的結(jié)構(gòu)完整性，即天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化而從胎盤(pán)膜制備膠原生物織物的方法，優(yōu)選地從具有絨毛膜和羊膜的人胎盤(pán)膜制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，羊膜完全地進(jìn)行去細(xì)胞化。本發(fā)明的膠原生物織物在內(nèi)科和外科領(lǐng)域有著許多的應(yīng)用，包括例如血管的修復(fù)、血管的構(gòu)建和替換、腱和韌帶的替換、創(chuàng)傷敷裹、外科移植物、眼科用途、縫合等等。該生物織物的優(yōu)點(diǎn)部分地是由于其物理特性，例如生物機(jī)械強(qiáng)度、屈曲性、可縫合性和低免疫原性，特別是當(dāng)其來(lái)源自人胎盤(pán)時(shí)。
2.發(fā)明背景2.1羊膜解剖學(xué)和組織學(xué)胎盤(pán)囊由通過(guò)疏松結(jié)締組織密切連接的兩層膜組成。它們被稱(chēng)為羊膜層和絨毛膜層(見(jiàn)

圖1)。羊膜層是兩層膜中最里面的一層，其與圍繞胎兒的羊水接觸，而且羊膜和羊水一起形成羊膜囊。羊膜層是無(wú)血管的，其內(nèi)表面是覆蓋在基底膜上的簡(jiǎn)單的柱狀上皮細(xì)胞，并且其厚度為30-60微米。絨毛膜是囊的外層，而且其是高度細(xì)胞化的。血管樹(shù)狀結(jié)構(gòu)從胎盤(pán)開(kāi)始，并通過(guò)絨毛膜層延伸至胎盤(pán)膜。絨毛膜層通過(guò)疏松結(jié)締組織而與羊膜層分隔開(kāi)，并由此聯(lián)合在一起，這兩層的厚度為120-180微米。胎盤(pán)膜具有大量負(fù)載了粘多糖的膠原基質(zhì)，而且胎盤(pán)膜據(jù)信主要用作對(duì)于正在發(fā)育的胎兒的保護(hù)性囊。這些膜還保持了對(duì)于母體循環(huán)系統(tǒng)中存在的傳染劑和免疫劑的屏障。胎盤(pán)膜具有主動(dòng)和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。最小的分子和蛋白質(zhì)能夠自由地通過(guò)它們進(jìn)行移動(dòng)，但大的蛋白質(zhì)如IgM不能穿過(guò)基底層。
在以50-50％的比例與組織培養(yǎng)基混合的95％乙醇或者甘油中保存胎盤(pán)膜(其為動(dòng)物或人來(lái)源的)已經(jīng)用于在冷凍之前保存羊膜。這些保存劑去除了形成固縮核的胎盤(pán)組織的活力，但膠原基質(zhì)核基底膜得到了保存。有趣的是，這兩種形式的保存方法還去除了移植的膜的抗原性，和還去除了任何潛在具有毒力的試劑。保存通常在小心地將羊膜與絨毛膜分離之后完成。羊膜具有基底層和上皮細(xì)胞的一面是光亮的，而朝向絨毛膜的另一面是暗淡的。
2.1先前的羊膜的臨床應(yīng)用使用異源組織(來(lái)自其他物種的組織)而帶來(lái)人獸互傳疾病或者引起種間交叉排異反應(yīng)的可能潛在問(wèn)題已經(jīng)使得對(duì)于這些組織的期望變小了。異源移植物或者來(lái)自同一物種的不同個(gè)體的移植物繼續(xù)是人移植物材料的優(yōu)選的來(lái)源。用于移植的人供體組織的不足成為日益增加的問(wèn)題，其促進(jìn)了用于組織移植的新材料的開(kāi)發(fā)。最通常的是，這些生物天然材料的來(lái)源是不足的、難以獲得的和非常昂貴的?？墒?，來(lái)自人羊膜的膠原層具有所希望的在組織移植應(yīng)用中有用的生物機(jī)械特性。因此，羊膜是異源移植材料的良好來(lái)源。
包括羊膜和絨毛膜的胎膜已經(jīng)用于外科手術(shù)，這早在1910年就得到了證實(shí)，并且由Trelford和Trelford-Sauder于1979年進(jìn)行了回顧(見(jiàn)Trelford和Trelford-Sauder，1979，Am.J.Obstet.Gynecol.833)。在1910年，Davis第一個(gè)報(bào)道了胎膜在皮膚移植中作為外科材料的用途，例如在燒傷的和潰爛的皮膚上(Davis等人，1910，JohnsHopkins Med.J.；15307)。這些研究主要是在動(dòng)物中進(jìn)行的，而人試驗(yàn)的結(jié)果令人失望。其后，羊膜在外科手術(shù)中的用途已經(jīng)擴(kuò)大了(見(jiàn)例如，Stern等人，1913，JAMA，13973-4；Sabella等人，1913，Med.Records NY，83478-80；de Rotth等人，1940，Arch.Opthalmol.23522-5；Sorsby等人，1946，Br.J.Opthamlol.30337-45)?，F(xiàn)在其用作用于燒傷的皮膚、皮膚創(chuàng)傷和腿部慢性潰瘍的生物敷料，用作人造陰道的外科重建中的附屬組織，和用于修復(fù)臍突出(見(jiàn)例如，Trelford和Trelford-Sauder，1979，134Am.J.Obstet.Gynecol.833；Colocho等人，1974，Arch.Surg.109370-3；Faulk等人，1980，Lancet，1156；Prasad等人，1986，J.Trauma，26945-6；Subrahmanyan等人，1995，J.Plastic Surg.48477-8；Gruss等人，1978，J.Can.Med.Assoc.1181237-46；Ward等人，1984，Br.J.Plastic Surg.37191-3；Dhall，1984，J.Obstet.Gynaecol.91279-82)。其還已經(jīng)用于在腹部、頭部和骨盆的外科程序中防止組織粘連(Gharib等人，1996，Pediatr.Surg.Int.1196-9；Rennekampff等人，1994，Invest.Surg.7187-93)。在20世紀(jì)40年代，幾個(gè)作者報(bào)道了羊膜在治療多種眼表面病癥中的有益作用(見(jiàn)例如，de Rotth等人，1940，Arch.Opthalmol.23522-5；Sorsby等人，1946，Br.J.Opthalmol.30337-45；Lavery等人，1946，Trans.Opthalmol.Soc.UK，66668)。
先前已經(jīng)描述了在本領(lǐng)域中的大量嘗試，這些嘗試是為了最優(yōu)化用于移植的羊膜的制備和保存(綜述見(jiàn)例如，Dua等人，1999，Br.J.Opthalmol.83748-52(“Dua”))。各種羊膜的制備包括用鹽水和抗生素混合物進(jìn)行保存，和在有或沒(méi)有將羊膜層與絨毛膜層分離的情況下的醇脫水?？墒牵贒ua中和在上述文獻(xiàn)中所描述的所有方法仍具有這樣的缺點(diǎn)，即需要羊膜的制備和保存中的改進(jìn)來(lái)引導(dǎo)。
更近來(lái)的一段時(shí)間，已經(jīng)公開(kāi)了依賴(lài)于冷凍保存羊膜的方法，這些冷凍保存的羊膜應(yīng)用于為了矯正角膜上皮缺損所進(jìn)行的組織移植外科程序之中。見(jiàn)例如，U.S.專(zhuān)利號(hào)6,152,142和6,326,019B1(“Tseng”)。Tseng公開(kāi)了這樣的羊膜，即其置于基質(zhì)之上，且保存在Dulbecco氏修飾Eagle培養(yǎng)基和甘油的混合物之中，并于-80℃冷凍。在其制備期間的任何時(shí)候冷凍組織的過(guò)程使得Tseng羊膜變得易碎，甚至是在融解和活化步驟之后變得更加易碎。另外，融解和活化步驟增加了操作羊膜所需的時(shí)間。此外，因?yàn)楸４婧椭苽涑绦蛑械睦鋬霾襟E所引起的Tseng羊膜的易碎性，因此需要結(jié)構(gòu)支持物或背襯來(lái)確保Tseng羊膜在貯存期間的結(jié)構(gòu)完整性。這就帶來(lái)了將保存的羊膜與背襯分離開(kāi)的附加困難，該羊膜由于其易碎性而難以操作和完整地分離。因此將羊膜與背襯分離增加了膜破裂的可能性，和增加了活化羊膜所需的時(shí)間長(zhǎng)度，這一時(shí)間使得能夠在進(jìn)行外科程序之前讓活化溶液完全浸透冷凍的羊膜，從而導(dǎo)致增加了外科手術(shù)系列過(guò)程中的準(zhǔn)備時(shí)間。貯存和運(yùn)輸還由于需要-80℃冷凍而變得復(fù)雜。最后，Tseng的膜一般是不去細(xì)胞化的；因此，如此制備的羊膜通常是不透明的，而且不具有一致的結(jié)構(gòu)組成。
更近來(lái)的一段時(shí)間，Yui等人(U.S.專(zhuān)利號(hào)5,618,312(“’312專(zhuān)利”))描述了從組織膜致密層中制備膠原層。雖然所描述的材料主要是膠原，但是其由于其處理方法而太脆弱，以致需要單獨(dú)的交聯(lián)步驟來(lái)使其變得足夠結(jié)實(shí)以用于醫(yī)學(xué)用途，例如可用于縫合。在’312專(zhuān)利中描述的一種交聯(lián)方法采用高熱處理，優(yōu)選地于100-110℃，這據(jù)信對(duì)于膠原的天然構(gòu)象產(chǎn)生不利影響。Yui等人(U.S.專(zhuān)利號(hào)5,876,451)描述了類(lèi)似的來(lái)源自胎盤(pán)的膠原材料。可是，這種材料在制備期間作為去細(xì)胞化步驟的一部分而用蛋白酶進(jìn)行處理，這很可能導(dǎo)致基質(zhì)組分的天然構(gòu)象的破壞和/或瓦解；因此，結(jié)果所得的膠原不能保持其天然構(gòu)象。
因此，在本領(lǐng)域中繼續(xù)存在需要來(lái)獲得經(jīng)改良的羊膜以用于醫(yī)療、診斷和美容應(yīng)用，其具有經(jīng)改善的結(jié)構(gòu)特性。本發(fā)明提供了這樣一種含有膠原的生物織物，其不同于以前的基于膠原的生物織物而保持了天然的膠原四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的生物織物容易制備、容易使用，和其強(qiáng)度足夠用于內(nèi)科和外科目的，并提供了用于傷口愈合的優(yōu)良基質(zhì)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明部分地涉及發(fā)明者發(fā)現(xiàn)一種新型方法來(lái)從胎盤(pán)(優(yōu)選為人胎盤(pán))中制備膠原生物織物，這導(dǎo)致獲得具有改善的物理和生物物理特性的新型膠原生物織物。該制備方法優(yōu)選地包括盡量減少羊膜的操作。本發(fā)明的膠原生物織物由于其處理方法而與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的那些不同，其具有完整的天然三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了來(lái)源自胎盤(pán)的羊膜或生物織物，其具有優(yōu)良的特性，即增強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度、可縫合性和導(dǎo)致減少宿主—移植物排異的減少的免疫源性。本發(fā)明還提供了來(lái)源自胎盤(pán)的羊膜或生物織物，其能夠作為脫水的層進(jìn)行貯存，而不需冷凍或深低溫保藏。優(yōu)選地，來(lái)源自胎盤(pán)的羊膜來(lái)自人胎盤(pán)以在人患者中使用?？墒?，可以用來(lái)自多種動(dòng)物物種的胎盤(pán)而使用同樣的方法以在患病動(dòng)物中進(jìn)行獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
本發(fā)明提供了制備膠原生物織物的方法，包括提供胎盤(pán)優(yōu)選為人胎盤(pán)，分離羊膜層和絨毛膜層，和將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化，并同時(shí)保留下面的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。該方法此外還需要洗滌和干燥經(jīng)去細(xì)胞化的膜。該方法產(chǎn)生脫水的、去細(xì)胞化的生物織物，其能夠在無(wú)菌的貯存條件下于室溫保持穩(wěn)定，而且隨后進(jìn)行再水化并移植入受試者中。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，胎盤(pán)來(lái)自經(jīng)歷了剖腹產(chǎn)術(shù)分娩或者自然分娩的女性人類(lèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的常用的血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)測(cè)定來(lái)確定胎盤(pán)是否來(lái)自沒(méi)有傳染病的供體。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，胎盤(pán)經(jīng)過(guò)測(cè)試而沒(méi)有至少一種傳染病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胎盤(pán)的來(lái)源是已知的，包括供體的醫(yī)療史、血型、免疫學(xué)數(shù)據(jù)和基因型特征。雖然胎盤(pán)可以來(lái)自任何哺乳動(dòng)物，但供體優(yōu)選為女性人類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，在將羊膜和絨毛膜分離開(kāi)之前，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的常用方法來(lái)去除胎盤(pán)中的血。
根據(jù)本發(fā)明的方法將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化，這包括從羊膜上去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片，例如從羊膜的母體側(cè)和從羊膜的胎兒側(cè)。羊膜的去細(xì)胞化不應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致羊膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞或者改變生物化學(xué)組成。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行羊膜的去細(xì)胞化不會(huì)要求在制備羊膜過(guò)程中的任何一點(diǎn)上進(jìn)行冷凍或者將膜與蛋白酶進(jìn)行接觸。羊膜優(yōu)選地用含有弱去污劑的溶液進(jìn)行去細(xì)胞化，例如含有0.01-1.0％一水合脫氧膽酸鈉、非離子去污劑、Triton X-100、陰離子去污劑或十二烷基硫酸鈉或者其組合的溶液。
一旦根據(jù)本發(fā)明的方法將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化，膜就可以進(jìn)行洗滌和干燥，優(yōu)選地用低熱在真空中進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有脫水的、去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的羊膜的膠原生物織物，因此膜具有天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的羊膜的膠原生物織物，其含有膠原、彈性蛋白和纖連蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有脫水的、去細(xì)胞化的、均一的、半透明的和無(wú)基質(zhì)的羊膜的膠原生物織物，并且規(guī)定羊膜從未與蛋白酶接觸。
在一些實(shí)施方案中，生物織物此外還含有一種或多種生物分子，例如治療劑，包括抗生素、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑、傷口愈合劑、傷口封閉劑、細(xì)胞吸引劑和支架試劑等等，但并不局限于此。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用一種或多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行浸漬，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等。生物織物還可以用一種或多種小分子進(jìn)行浸漬，包括小有機(jī)分子如特殊生物化學(xué)過(guò)程的特異性抑制劑，例如膜受體抑制劑、激酶抑制劑、生長(zhǎng)抑制劑、抗癌藥物、抗生素等等，但并不局限于此。在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物在生產(chǎn)期間或者在用于外科手術(shù)的準(zhǔn)備期間用生物分子進(jìn)行浸漬，這取決于其想要的用途。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有至少兩層本發(fā)明的生物織物的層壓制品，和包括制備該層壓制品的方法。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括依賴(lài)于想要的用途而將該層壓制品定形成復(fù)雜的三維支架，包括片層、纖維、球、管，但并不局限于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備羊膜層壓制品的方法，其包括提供含有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)；分離羊膜和絨毛膜；和將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法此外還包括洗滌去細(xì)胞化的羊膜至少一次；將至少兩層去細(xì)胞化的羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品；和干燥去細(xì)胞化的羊膜層壓制品?？蛇x擇地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備羊膜層壓制品的方法包括干燥至少兩層根據(jù)本發(fā)明制備得到的羊膜，和將至少兩層羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的羊膜層可以在存在粘合劑的條件下以相互接觸的方式放置在一起，以形成羊膜層壓制品。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物所使用的粘合劑可以為任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的生物膠合劑，優(yōu)選為生物相容的膠合劑，其包括天然膠合劑如纖連蛋白、血纖蛋白以及合成的膠合劑，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜層相互進(jìn)行交聯(lián)以形成羊膜層壓制品。任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的交聯(lián)試劑和方法在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，包括化學(xué)交聯(lián)、肽交聯(lián)、UV交聯(lián)、放射交聯(lián)、纖連蛋白交聯(lián)、血纖蛋白原交聯(lián)、水凝膠交聯(lián)，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的羊膜層壓制品不含有粘合劑。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用膠原生物織物作為外科移植物。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括于在受試者(優(yōu)選為人)中進(jìn)行的外科程序之中使用外科移植物，這包括將移植物直接置于外科部位。
本發(fā)明提供了膠原生物織物、羊膜層壓制品或者進(jìn)一步含有一種或多種水凝膠組合物的三維支架，和提供了制備這些材料的方法。水凝膠組合物可以含有聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙二醇、透明質(zhì)酸以及其衍生物和類(lèi)似物，但并不局限于此。
在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步在本發(fā)明的膠原生物織物、層壓制品、三維支架或者其水凝膠組合物上移植細(xì)胞，例如干細(xì)胞、分化的成熟細(xì)胞、祖細(xì)胞等等，優(yōu)選為人細(xì)胞，從而這些細(xì)胞是均一的和匯合的。
本發(fā)明提供了高水平生產(chǎn)膠原生物織物、其層壓制品、其三維支架和其水凝膠組合物的方法，特別是商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，但并不局限于此。本發(fā)明解決了在生產(chǎn)大量的用于臨床試驗(yàn)和商業(yè)銷(xiāo)售的羊膜中的困難。
本發(fā)明包括含有本發(fā)明的膠原生物織物的組合物，其適合于藥物遞送；組織工程；泌尿?qū)W相關(guān)用途，例如尿失禁的矯正；眼的用途，例如用于治療眼表面病癥和作為眼外科移植物；血管的用途，例如血管的修復(fù)、血管的構(gòu)建和替換；心臟病學(xué)的用途，例如在構(gòu)建有病的瓣膜中作為假體裝置；神經(jīng)元相關(guān)用途，例如修復(fù)受損傷的神經(jīng)(尤其是切斷的外周神經(jīng))、作為硬腦膜的替代物和作為圍繞神經(jīng)吻合的假體；骨相關(guān)用途，例如用于處理矯形缺陷、作為骨替代物；皮膚病學(xué)的用途，例如用于治療傷口(外部的和內(nèi)部的)、急性和慢性傷口、先天性傷口和燒傷；用于處理皮膚狀況，例如皮膚損傷、老化的皮膚、皺紋、細(xì)紋、變薄、降低的皮膚彈性、粗糙的皮膚和陽(yáng)光損害的皮膚；作為創(chuàng)傷敷料；和用于治療傷口感染。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于在受試者中治療和/或預(yù)防眼相關(guān)疾病或病癥例如眼表面疾病的方法，其包括使用本發(fā)明的膠原生物織物，例如通過(guò)將生物織物作為外科移植物置于受試者的有病的角膜表面上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在受試者中處理和/或預(yù)防皮膚狀況，其包括使用本發(fā)明的生物織物，例如通過(guò)將生物織物與皮膚接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在受試者中治療創(chuàng)傷和/或燒傷，其包括將本發(fā)明的生物織物與創(chuàng)傷和/或燒傷處接觸。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在受試者(優(yōu)選為人)中矯正尿失禁的方法，其包括使用本發(fā)明的膠原生物織物作為植入物。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括向受試者遞送治療劑的方法，其包括將本發(fā)明的膠原生物織物與受試者接觸。此外本發(fā)明還包括向受試者遞送細(xì)胞，其包括例如在組織工程中在本發(fā)明的膠原生物織物或?qū)訅褐破飞弦浦不罴?xì)胞。
本發(fā)明提供了用于外科程序的并含有本發(fā)明的生物織物的外科移植物。該外科移植物可以應(yīng)用于受試者(優(yōu)選為人)的內(nèi)部或外部部位。
4.附圖簡(jiǎn)述圖1人胎盤(pán)的絨毛膜和羊膜圖2膠原生物織物的顯微照片A.處理前B.處理后圖3膠原生物織物。舉例說(shuō)明了本發(fā)明的膠原生物織物，其具有帶有綢紋圖案的均一的半透明表面。
圖4網(wǎng)架和正在那里干燥的生物織物5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了來(lái)源自哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人)的胎盤(pán)的膠原膜或生物織物。制備膠原生物織物，以在終產(chǎn)品中保持天然的膠原構(gòu)象，即天然的三級(jí)和四級(jí)構(gòu)象。除了膠原生物織物之外，本發(fā)明還提供了制造膠原生物織物的方法，和在醫(yī)學(xué)環(huán)境中使用該生物織物的方法。
本發(fā)明提供了含有脫水的、去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的羊膜的膠原生物織物，因此羊膜具有天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的膠原生物織物，其含有膠原、彈性蛋白和纖連蛋白。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的膠原生物織物的羊膜層壓制品。根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜層壓制品含有至少兩層膠原生物織物，這些膠原生物織物以相互接觸的方式放置在一起以形成羊膜層壓制品。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的膠原生物織物的三維支架，例如管。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的膠原生物織物、其層壓制品或者進(jìn)一步含有水凝膠組合物的其三維支架。
因此，本發(fā)明提供了多種形式和構(gòu)造的膠原生物織物，包括層壓制品、三維支架和水凝膠組合物，但并不局限于此。本發(fā)明提供了本發(fā)明組合物的任何醫(yī)學(xué)上有用的形式。不管特殊的形式或構(gòu)造，本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步含有一種或多種生物分子，優(yōu)選為治療劑。正如此處所詳細(xì)描述的，含有生物分子的本發(fā)明的組合物在內(nèi)科領(lǐng)域中有著許多用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在本發(fā)明的組合物上移植活細(xì)胞，從而這些細(xì)胞是均一的和匯合的。移植了細(xì)胞的本發(fā)明的組合物在內(nèi)科和牙科領(lǐng)域中有著許多用途，例如用于組織工程目的。
本發(fā)明還涉及制備膠原生物織物、其層壓制品、其三維支架或水凝膠組合物的方法。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從具有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)制備膠原生物織物的方法，包括分離羊膜層和絨毛膜層；和將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化，以致羊膜不與酶例如蛋白酶接觸。在其他實(shí)施方案中，該方法此外還需要洗滌和干燥經(jīng)去細(xì)胞化的羊膜。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從具有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)制備羊膜層壓制品的方法，包括分離羊膜層和絨毛膜層；將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化；和將至少兩層去細(xì)胞化的羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，去細(xì)胞化的羊膜在層疊之前進(jìn)行干燥。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，去細(xì)胞化的羊膜在層疊之后進(jìn)行干燥，以致于至少兩層去細(xì)胞化的羊膜相互接觸。
本發(fā)明提供了在內(nèi)科、牙科和外科環(huán)境中使用本發(fā)明的膠原生物織物、其層壓制品、其三維支架或其水凝膠組合物的方法。其實(shí)，期望本發(fā)明的組合物相對(duì)于本領(lǐng)域中已知的其他生物材料具有增強(qiáng)的治療和臨床效用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的組合物在受試者中治療和/或預(yù)防眼相關(guān)疾病或病癥的方法。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中治療和/或預(yù)防眼相關(guān)疾病或病癥的方法，其包括將生物織物置于受試者的患病的眼表面上。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的組合物在受試者(優(yōu)選為人)中處理和/或預(yù)防皮膚狀況的方法。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該方法包括將組合物與受試者的皮膚接觸。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，將組合物直接置于受試者的皮膚表面上，該皮膚表面是皮膚狀況的部位。
本發(fā)明還提供了在受試者(優(yōu)選為人)中治療創(chuàng)傷或燒傷的方法，其包括在創(chuàng)傷或燒傷的部位接觸組合物。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在外科程序中使用本發(fā)明的組合物(例如膠原生物織物、羊膜層壓制品)，例如在眼外科、心血管外科、牙周外科、神經(jīng)外科、牙外科和矯形外科。
本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的組合物來(lái)向受試者(優(yōu)選為人)遞送生物分子(優(yōu)選為治療劑)的方法。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的組合物來(lái)向受試者(優(yōu)選為人)遞送細(xì)胞的方法，其中已經(jīng)進(jìn)一步在組合物上移植了細(xì)胞。
5.1膠原生物織物本發(fā)明提供了膠原羊膜，此處稱(chēng)為膠原生物織物。本發(fā)明的膠原生物織物保持了天然的、未處理的羊膜的結(jié)構(gòu)完整性，即在其組成中保持了結(jié)構(gòu)蛋白(例如膠原、彈性蛋白或許還有纖連蛋白)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的膠原生物織物由與天然的或未處理的羊膜一樣的結(jié)構(gòu)蛋白所組成。生產(chǎn)羊膜的現(xiàn)有技術(shù)方法需要使用蛋白酶或高熱處理，因此這些膜不能在它們的組成中保持結(jié)構(gòu)蛋白的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脫水的、去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的(即無(wú)過(guò)濾背襯)羊膜，因此羊膜具有天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2A和B)。本發(fā)明的脫水的、去細(xì)胞化的羊膜是均一的(即最少至沒(méi)有細(xì)胞材料)、半透明的生物織物，其具有圖3中顯示的外觀，其具有去細(xì)胞化的基質(zhì)的左手三股螺旋α螺旋片(見(jiàn)例如，Molecular Biology of the Cell，1989，Alberts等人(編者)，Garland Publishing公司，New York，NY；此處以其整體進(jìn)行引用作為參考)。
本發(fā)明的膠原生物織物可以來(lái)源自任何哺乳動(dòng)物的羊膜，例如馬、牛、豬或狹鼻類(lèi)動(dòng)物來(lái)源，但是最優(yōu)選的是來(lái)源自人胎盤(pán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物織物在其組成中具有膠原材料的天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。
與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的那些不同，本發(fā)明的膠原生物織物以最小限度進(jìn)行操作，即本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)行至多一個(gè)化學(xué)或生物處理或者操作，例如在弱去污劑中進(jìn)行去細(xì)胞化。在此處使用時(shí)，“以最小限度進(jìn)行操作”是指在制備膠原生物織物期間的任何步驟，本發(fā)明的羊膜沒(méi)有進(jìn)行酶處理例如蛋白酶處理、高熱處理、強(qiáng)烈的化學(xué)處理、暴露于強(qiáng)去污劑或酸。作為去細(xì)胞化步驟的一部分，羊膜的蛋白酶處理會(huì)損害生物織物的結(jié)構(gòu)完整性，例如影響膠原材料的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。與此不同，在制備本發(fā)明生物織物中的羊膜的最小限度的操作導(dǎo)致獲得相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)品來(lái)說(shuō)具有增強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度的產(chǎn)品和半透明的產(chǎn)品。
本發(fā)明的去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的膠原生物織物含有膠原(包括I型、IV型和II型膠原，但并不局限于此)以及纖連蛋白和彈性蛋白。這種聯(lián)合部分地是造成根據(jù)此處描述的方法制備得到的本發(fā)明生物織物具有增強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度的原因。作為最小限度的處理和操作的結(jié)果，本發(fā)明的膠原生物織物保持了天然膜的組成。膠原是主要的脊椎動(dòng)物結(jié)構(gòu)材料，其存在于主要具有機(jī)械功能的組織中。膠原分子由三條稱(chēng)為α鏈的多肽鏈(每條的長(zhǎng)度為大約1000個(gè)氨基酸)構(gòu)成，這三條鏈如在三股繩中一樣相互纏繞在一起，從而形成規(guī)則的左手超螺旋。已經(jīng)鑒定了至少膠原的19種類(lèi)型，它們都具有同樣的三維組構(gòu)(見(jiàn)例如，Lee等人，2001，International J.of Pharmaceutics，2211-22)。
本發(fā)明的羊膜在形式、生物機(jī)械和結(jié)構(gòu)特征上比現(xiàn)有技術(shù)中所報(bào)道的和發(fā)明者已知的那些要優(yōu)良，這部分地是基于如此處所述發(fā)現(xiàn)了制備羊膜的新型方法和人胎盤(pán)的受控和充足的來(lái)源(見(jiàn)5.2節(jié))。
特別地，與一種或多種現(xiàn)有技術(shù)的羊膜相比，本發(fā)明的膠原生物織物具有一個(gè)或多個(gè)下列的特征增強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度；優(yōu)良的可縫合性；減小的免疫原性，這導(dǎo)致減小宿主一移植物排異反應(yīng)；容易貯存和運(yùn)輸，而不需冷凍或深低溫保藏；在制備之后最小限度需要操作和活化，即再水化、使用前的程序；和能夠于室溫貯存延長(zhǎng)的一段時(shí)間，而同時(shí)保持結(jié)構(gòu)和功能的完整性。表1概括了本發(fā)明的生物織物與現(xiàn)有技術(shù)中的那些相比時(shí)所得的優(yōu)點(diǎn)。
在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有脫水的、去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的絨毛膜(優(yōu)選為人絨毛膜)的膠原生物織物。期望含有絨毛膜的膠原生物織物會(huì)具有與含有羊膜的本發(fā)明膠原生物織物相當(dāng)?shù)奶匦?。本發(fā)明提供了含有絨毛膜的膠原生物織物的所有醫(yī)學(xué)有用形式，包括層壓制品、三維支架和水凝膠組合物，但并不局限于此。
表1.本發(fā)明的生物織物與傳統(tǒng)的羊膜制劑的比較
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物是半透明的，即是光學(xué)透明的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物是薄的和輕的。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，脫水的本發(fā)明的膠原生物織物為0.3-0.6mg/cm2。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物的厚度為至少30微米。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物厚度為大約10-40微米。
本發(fā)明包括使用多種構(gòu)造的本發(fā)明的膠原生物織物，例如插入物、防護(hù)物。一般地，生物織物可以定形成任何醫(yī)學(xué)上有用的形式。例如，膠原生物織物可以設(shè)定為以其整體進(jìn)行使用，即使用來(lái)自完整胎盤(pán)的膠原生物織物?？蛇x擇地，膠原生物織物可以切成條、片或卷，或者可以織成線。在另一個(gè)實(shí)施方案中，作為單厚度的片或者層壓制品的膠原生物織物可以規(guī)則的間隔進(jìn)行切割并將其張開(kāi)，例如形成網(wǎng)。
在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物是平的，例如具有沒(méi)有傾斜或彎曲的表面。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物不是完全平的，而是具有帶有微凹的表面，例如在表面上有凹陷或凹入。
在一個(gè)特殊的、優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有至少兩層本發(fā)明的膠原生物織物的層壓制品。這些層可以物理方式結(jié)合在一起，例如通過(guò)使用膠合劑、持著器，或者通過(guò)熱壓生物織物的一部分(例如這些層中的至少一個(gè)的外周)以融合這些層。因?yàn)樯锟椢镉小邦w?！?，所以生物織物可以多種方法層壓成層壓制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述層壓制品的所有層具有同樣的顆粒方向。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)層的顆粒方向相對(duì)于至少另一個(gè)層的顆粒方向旋轉(zhuǎn)了大約90度(即大約垂直)。在一個(gè)更特殊的實(shí)施方案中，所述的垂直的層彼此相鄰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的層壓制品含有至少三層膠原生物織物，其中所述至少三個(gè)層中的每一個(gè)的顆粒結(jié)構(gòu)相對(duì)于余下層中的兩個(gè)的顆粒結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)了大約60度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述層壓制品含有至少第一種材料和第二種材料，其中該第一種材料是本發(fā)明的膠原生物織物，該第二種材料是任何其他能夠與膠原生物織物形成層壓制品的物質(zhì)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，所述第二種材料是來(lái)源自除了羊膜之外的膜的片或膜。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，所述第二種材料是非天然的材料，例如聚內(nèi)酯、聚乙酸酯、塑料膜等等。在一些實(shí)施方案中，羊膜層壓制品是多層的，其含有至少6層、至少8層、至少10層、至少20層、至少80層、至少100層、至少1000層根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜。本發(fā)明的羊膜層壓制品可以含有無(wú)限數(shù)量的層。
層壓制品具有增加的結(jié)構(gòu)剛性，這使得層壓制品能夠塑造成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。這種三維結(jié)構(gòu)可以包括片、管、微球體。
膠原生物織物還可以單片或者層壓制品的形式與另一種材料聯(lián)合在一起。例如，生物織物可以與可屈曲的塑料膜、紗布、塑料片、支架、瓣膜、矯形裝置、繃帶、貼劑等等聯(lián)合即結(jié)合在一起。
膠原生物織物可以含有一種或多種不為生物織物的膠原基質(zhì)的部分的化合物或物質(zhì)。例如，膠原生物織物可以在生產(chǎn)或者外科程序準(zhǔn)備期間用生物分子進(jìn)行浸漬。這種生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素)、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑(包括銀(例如銀鹽包括硝酸銀和磺胺嘧啶銀，但并不局限于此)、元素銀、抗生素、殺菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、傷口愈合劑(例如細(xì)胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作為傷口愈合劑的透明質(zhì)酸、傷口封閉劑(例如有或沒(méi)有凝血酶的血纖蛋白)、細(xì)胞吸引劑和支架試劑(例如纖連蛋白)等等，但并不局限于此。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用至少一種生長(zhǎng)因子進(jìn)行浸漬，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等。生物織物還可以用小有機(jī)分子進(jìn)行浸漬，例如特殊生物化學(xué)過(guò)程的特異性抑制劑，如膜受體抑制劑、激酶抑制劑、生長(zhǎng)抑制劑、抗癌藥物、抗生素等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以聯(lián)合水凝膠。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何水凝膠組合物包括在本發(fā)明的之內(nèi)，例如在下列綜述中所揭示的任何水凝膠組合物Graham，1998，Med.Device Technol.9(1)18-22；Peppas等人，2000，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)27-46；Nguyen等人，2002，Biomaterials，23(22)4307-14；Henincl等人，2002，Adv.Drug Deliv.Rev 54(1)13-36；Skelhorne等人，2002，Med.Device.Technol.13(9)19-23；Schmedlen等人，2002，Biomaterials 234325-32；所有這些文獻(xiàn)在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，水凝膠組合物應(yīng)用于膠原生物織物之上，即放置于膠原生物織物的表面上。水凝膠組合物例如可以噴灑在膠原生物織物上、布滿生物織物的表面、浸泡膠原生物織物、浸洗膠原生物織物、或者包被至膠原生物織物的表面。
在本發(fā)明的方法和組合物中可用的水凝膠可以從任何本領(lǐng)域中已知的與水相互作用或者水溶性的聚合物制得，包括聚乙烯醇(PVA)、聚羥乙基異丁烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明質(zhì)酸、葡聚糖或者其衍生物和類(lèi)似物，但并不局限于此。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)一步在與水凝膠聯(lián)合之前用一種或多種生物分子進(jìn)行浸漬。在其他實(shí)施方案中，水凝膠組合物進(jìn)一步在與本發(fā)明的膠原生物織物聯(lián)合之前用一種或多種生物分子進(jìn)行浸漬。這種生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素)、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑(包括銀(例如銀鹽包括硝酸銀和磺胺嘧啶銀，但并不局限于此)、元素銀、抗生素、殺菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、傷口愈合劑(例如細(xì)胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作為傷口愈合劑的透明質(zhì)酸、傷口封閉劑(例如有或沒(méi)有凝血酶的血纖蛋白)、細(xì)胞吸引劑和支架試劑(例如纖連蛋白)等等，但并不局限于此。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物或者水凝膠組合物可以用至少一種生長(zhǎng)因子進(jìn)行浸漬，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等。優(yōu)選地，生物分子為治療劑。
在一些實(shí)施方案中，水凝膠組合物與含有本發(fā)明的生物織物的層壓制品聯(lián)合。
水凝膠/膠原生物織物組合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有用途，包括治療創(chuàng)傷、燒傷和處理皮膚狀況(例如處理瘢痕)，以及用于美容用途(例如美容外科)和作為植入物的任何用途，但并不局限于此。在一些實(shí)施方案中，水凝膠/膠原生物織物組合物局部施用于受試者，即施用在皮膚表面上，以例如用于治療創(chuàng)傷。在其他實(shí)施方案中，水凝膠/膠原生物織物組合物可以在受試者的內(nèi)部使用，例如作為植入物，以便成為體內(nèi)永久性或半永久性的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，將水凝膠組合物配制成不可生物降解的。在其他實(shí)施方案中，將水凝膠組合物配制成可生物降解的。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，將水凝膠組合物配制成可在幾天之內(nèi)降解。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，將水凝膠組合物配制成可在幾個(gè)月之內(nèi)降解。
在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的膠原生物織物上移植細(xì)胞，以致于這些細(xì)胞是均一的和匯合的。可以用于在本發(fā)明的生物織物上移植的細(xì)胞包括干細(xì)胞(優(yōu)選為人干細(xì)胞)、人分化的成熟細(xì)胞、全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞、胚胎樣干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、類(lèi)成纖維細(xì)胞，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在本發(fā)明的生物織物上移植特殊種類(lèi)的祖細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞和肌肉祖細(xì)胞，但并不局限于此。
5.2生產(chǎn)膠原生物織物的方法本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的膠原生物織物的方法。特別地，本發(fā)明包括制備膠原生物織物的方法，其包括提供含有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)；分離羊膜和絨毛膜；和將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該方法此外還需要洗滌和干燥經(jīng)去細(xì)胞化的羊膜。
優(yōu)選地，胎盤(pán)來(lái)自人胎盤(pán)以在人受試者中使用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括來(lái)自動(dòng)物物種的胎盤(pán)以在人受試者中使用。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括來(lái)自動(dòng)物物種的胎盤(pán)以在動(dòng)物受試者中進(jìn)行獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的胎盤(pán)在新生兒分娩之后盡可能快地取得。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胎盤(pán)在剖腹產(chǎn)術(shù)分娩出正常健康的嬰兒之后緊接著取得胎盤(pán)。如果在無(wú)菌的條件下收集胎盤(pán)。在一些實(shí)施方案中，胎盤(pán)在任何進(jìn)一步的處理之前從分娩的時(shí)候起貯存48小時(shí)。在其他實(shí)施方案中，胎盤(pán)在任何進(jìn)一步的處理之前從分娩的時(shí)候起貯存直至5天。
優(yōu)選地，將胎盤(pán)、臍帶和臍帶血從分娩或生育室轉(zhuǎn)移至另一個(gè)地點(diǎn)例如實(shí)驗(yàn)室以便進(jìn)一步的處理。胎盤(pán)優(yōu)選地轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的運(yùn)輸裝置中，例如無(wú)菌的袋或容器中，其可選地是隔熱的。在一些實(shí)施方案中，將胎盤(pán)于室溫貯存直至進(jìn)一步的處理。在其他實(shí)施方案中，將胎盤(pán)進(jìn)行冷藏直至進(jìn)一步的處理，即于大約2-8℃的溫度貯存。在其他實(shí)施方案中，將胎盤(pán)于進(jìn)一步處理之前在無(wú)菌條件下貯存直至5天。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，在無(wú)菌條件下操作和處理胎盤(pán)。實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選地裝備HEPA過(guò)濾系統(tǒng)(如潔凈室分級(jí)所定義的，具有1000級(jí)或更好)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在使用實(shí)驗(yàn)室之前將HEPA過(guò)濾系統(tǒng)開(kāi)啟至少1小時(shí)以便施行本發(fā)明的方法。
在某些實(shí)施方案中，去除胎盤(pán)中的血，即完全排干生育之后剩余的臍帶血。在一些實(shí)施方案中，胎盤(pán)中血的去除率為70％、80％、90％、95％、99％。
本發(fā)明包括在生育之前用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)對(duì)孕婦進(jìn)行篩選以檢查傳染病，包括HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其他已知會(huì)污染胎盤(pán)組織的病毒病原體，但并不局限于此。優(yōu)選地，用于篩選傳染病的方法遵循聯(lián)邦藥品管理局所提出的規(guī)章。孕婦可以在生育的一個(gè)月之內(nèi)進(jìn)行篩選(即取得血液樣品用于診斷目的)，優(yōu)選地在生育的兩個(gè)星期之內(nèi)，甚至更優(yōu)選地在生育的一個(gè)星期之內(nèi)，和最優(yōu)選地在生育的時(shí)候。只使用從這樣的供體中收集得到的組織來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的生物織物，即其母親經(jīng)檢測(cè)對(duì)于上面提及的病原體呈陰性或者無(wú)反應(yīng)性。優(yōu)選地，獲得胎盤(pán)膜的供體的詳細(xì)的父親以及醫(yī)療和社會(huì)歷史資料，包括例如詳細(xì)的家族史。
使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)測(cè)試來(lái)篩選供體。任何鑒定病原體的測(cè)定或診斷測(cè)試在本發(fā)明的方法的范圍之內(nèi)，但是優(yōu)選的測(cè)定為那些聯(lián)合了高精確度與高處理量能力的測(cè)定。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)對(duì)供體進(jìn)行篩選以檢查抗原和/或抗體。抗原和抗體的非限制性例子包括抗體篩選(ATY)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶篩選(ALT)；肝炎核心抗體(核酸和ELISA)；乙型肝炎表面抗原；丙型肝炎病毒抗體；HIV-1和HIV-2；HTLV-1和HTLV-2；梅毒測(cè)試(RPR)；CMV抗體測(cè)試；以及丙型肝炎和HIV測(cè)試。所使用的測(cè)定可以是基于核酸的測(cè)定或者基于ELISA的測(cè)定，這些對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
本發(fā)明此外還包括用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自新生兒臍帶的血液(見(jiàn)例如，Cotorruelo等人，2002，ClinLab.48(5-6)271-81；Maine等人，2001，Expert Rev.Mol.Diagn.，1(1)19-29；Nielsen等人，1987，J.Clin.Microbiol.25(8)1406-10；所有這些文獻(xiàn)在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自新生兒臍帶的血液以檢查細(xì)菌病原體(包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌，但并不局限于此)和真菌。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)定新生兒臍帶血的血型和Rh因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從來(lái)自新生兒臍帶的血液中獲得具有差異的CBC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從來(lái)自新生兒臍帶的血液中取得需氧細(xì)菌培養(yǎng)物。只使用從這樣的供體中收集得到的組織來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的生物織物，即其具有在正常限度內(nèi)的CBC(例如沒(méi)有顯著的離開(kāi)正常水平的異?；蚱?，經(jīng)檢測(cè)在血清學(xué)和細(xì)菌學(xué)上是陰性的，和經(jīng)檢測(cè)對(duì)于傳染病和污染呈陰性或無(wú)反應(yīng)性。
用于制備本發(fā)明的膠原生物織物的范例性方法包括下列步驟。
步驟I。本發(fā)明包括處理胎盤(pán)膜，以便(可選擇地)從胎盤(pán)中分離出臍帶，和分離羊膜和絨毛膜。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在切割胎盤(pán)膜之前將羊膜和絨毛膜進(jìn)行分離。羊膜和絨毛膜的分離優(yōu)選地從胎盤(pán)膜的邊緣開(kāi)始進(jìn)行。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用鈍器解剖來(lái)分離羊膜和絨毛膜，例如用戴著手套的手指。在將羊膜與絨毛膜和胎盤(pán)分離之后，例如用剪刀切割下臍帶殘端，并從胎盤(pán)上移開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)不撕裂組織就不可能分離羊膜和絨毛膜時(shí)，本發(fā)明包括將羊膜和絨毛膜作為一塊從胎盤(pán)上切割下來(lái)，然后將它們剝離開(kāi)。
然后優(yōu)選地將羊膜貯存于無(wú)菌鹽溶液中。在一些實(shí)施方案中，無(wú)菌鹽溶液是緩沖溶液。在一個(gè)特殊的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于貯存羊膜的無(wú)菌鹽溶液為0.9％無(wú)菌NaCl溶液。優(yōu)選地，通過(guò)于至少4℃的溫度進(jìn)行冷藏來(lái)貯存羊膜。在某些實(shí)施方案中，羊膜于至少2℃、至少6℃或者直至8℃的溫度進(jìn)行冷藏。在這一點(diǎn)上，如果將羊膜冷藏并保持覆蓋有無(wú)菌鹽水，那么羊膜可以貯存直至5天。優(yōu)選地，在程序中的下一個(gè)步驟之前將分離的羊膜從分娩的時(shí)候起冷藏至多72小時(shí)。
步驟II。一旦將羊膜與絨毛膜分離，本發(fā)明就包括將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化。本發(fā)明的方法包括任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的去細(xì)胞化方法，但規(guī)定用于將本發(fā)明的羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化的方法不包括任何冷凍羊膜的步驟。在此處使用時(shí)，去細(xì)胞化是指從本發(fā)明的羊膜上去除所有細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片(例如所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片)。羊膜的去細(xì)胞化確?；旧纤型ǔＥc羊膜的膠原基質(zhì)相聯(lián)系的細(xì)胞都被去除。本發(fā)明的羊膜的去細(xì)胞化去除了“基本上所有”與膠原基質(zhì)相聯(lián)系的細(xì)胞，其優(yōu)選地去除至少90％的細(xì)胞，更優(yōu)選地去除至少95％的細(xì)胞，和最優(yōu)選地去除至少99％的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行去細(xì)胞化的羊膜是均一地薄的即厚度為10-40微米，是光滑的(通過(guò)觸摸測(cè)定)和在外觀上是清澈的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的羊膜的去細(xì)胞化包括從羊膜的母體側(cè)去除基本上所有細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片，隨后從羊膜的胎兒側(cè)去除所有細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的羊膜的去細(xì)胞化包括物理性刮削，并聯(lián)合使用無(wú)菌溶液的漂洗。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，羊膜的物理性刮削包括使用無(wú)菌的細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮削。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，用于在去細(xì)胞化期間漂洗羊膜的無(wú)菌溶液為水溶液，即含有生理緩沖液或鹽溶液的溶液，例如0.9％NaCl溶液。
羊膜的去細(xì)胞化包括去除天然存在的細(xì)胞以及其他來(lái)自羊膜的抗原和細(xì)胞碎片，和可選擇地進(jìn)行處理以抑制新的免疫位點(diǎn)的產(chǎn)生。在對(duì)于羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化的過(guò)程中，去除天然的活細(xì)胞以及其他可能引起不利的免疫反應(yīng)的細(xì)胞和非細(xì)胞結(jié)構(gòu)或成分。根據(jù)本發(fā)明所使用的去細(xì)胞化技術(shù)不應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致羊膜的解剖學(xué)的顯著破壞，或者改變其結(jié)構(gòu)組分的生物機(jī)械特性，即膠原、彈性蛋白和還可能的纖連蛋白的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)完整性不受去細(xì)胞化的影響。明確地說(shuō)就是，羊膜的強(qiáng)烈化學(xué)處理和蛋白酶處理不在本發(fā)明的去細(xì)胞化技術(shù)的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，羊膜的去細(xì)胞化包括使用含有去污劑的溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用的去污劑包括非離子去污劑、Triton X-100、陰離子去污劑或十二烷基硫酸鈉，但并不局限于此。在本發(fā)明的方法中，去污劑可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用任何溫和的陰離子去污劑，即非腐蝕性的去污劑，其具有6-8的pH和低起泡性。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，在羊膜的去細(xì)胞化中使用0.01-1％的一水合脫氧膽酸鈉。雖然不想被特殊的作用模式所束縛，但是根據(jù)本發(fā)明的方法，羊膜的去細(xì)胞化可能裂解了細(xì)胞膜，和有助于從羊膜上去除細(xì)胞碎片?？墒牵瑧?yīng)當(dāng)采取措施來(lái)消除羊膜中的任何殘留去污劑水平，以便例如避免干擾后來(lái)在羊膜上再次移植活細(xì)胞。
根本的是在制備本發(fā)明的生物織物中限制蛋白酶的活性。添加劑如金屬離子螯合劑可形成對(duì)于許多蛋白酶來(lái)說(shuō)不利的環(huán)境，例如1，10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)。提供對(duì)于蛋白酶如膠原酶來(lái)說(shuō)不最適宜的條件可以有助于在裂解步驟期間保護(hù)羊膜組分如膠原不被降解。對(duì)于蛋白酶來(lái)說(shuō)不最適宜的條件可以通過(guò)這樣來(lái)獲得，即配制低滲裂解溶液以去除或限制溶液中可用的鈣和鋅離子的數(shù)量。許多蛋白酶在存在鈣和鋅離子的情況下是有活性的，而在沒(méi)有鈣和鋅離子的環(huán)境中失去許多它們的活性。優(yōu)選地，低滲裂解溶液會(huì)通過(guò)選擇下列條件來(lái)制備，即pH、減少鈣和鋅離子的可用性、存在金屬離子螯合劑和使用對(duì)于膠原酶特異的蛋白酶抑制劑，從而該溶液將會(huì)最佳地裂解天然存在的細(xì)胞，而同時(shí)保護(hù)下面的羊膜不會(huì)不利地被蛋白酶降解。例如，低滲裂解溶液可能包括水的緩沖溶液，其pH為5.5-8，優(yōu)選為7-8，無(wú)鈣和鋅離子，并含有金屬離子螯合劑如EDTA。此外，在用低滲裂解溶液處理羊膜期間，溫度和時(shí)間參數(shù)的控制也可以用于限制蛋白酶的活性。
優(yōu)選的是，羊膜的去細(xì)胞化處理還限制了新免疫位點(diǎn)的形成。因?yàn)槟z原的酶降解據(jù)信導(dǎo)致增加的免疫原性，所以本發(fā)明包括用酶例如核酸酶處理羊膜，這些酶在抑制細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞分裂中是有效的，它們將羊膜組分的蛋白酶解降至最低，因此保存了羊膜的下層結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的方法能夠使用的核酸酶的例子為那些在消化天然存在的細(xì)胞的DNA和RNA中有效的核酸酶，包括外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。根據(jù)本發(fā)明的方法能夠使用的核酸酶的非限制性例子包括抑制細(xì)胞活性的外切核酸酶如DNAase I(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)和RNAase A(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)，以及抑制細(xì)胞活性的內(nèi)切核酸酶如EcoR I(SIGMA ChemicalCompany，St.Louis，Mo.)和Hind III(SIGMA Chemical Company，St.Louis，Mo.)。更優(yōu)選的是，將選擇出的核酸酶在含有離子如鎂、鈣的生理緩沖溶液中應(yīng)用，這些離子對(duì)于核酸酶的活性是最適宜的。優(yōu)選地，緩沖溶液的離子濃度、處理溫度和處理時(shí)間長(zhǎng)短由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇，以確保所希望的核酸酶活性水平。緩沖液優(yōu)選地是低滲的，以促進(jìn)核酸酶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化包括下列步驟。首先，將羊膜轉(zhuǎn)移至潔凈的無(wú)菌容器中，并可選擇地用無(wú)菌水漂洗，然后用無(wú)菌紗布進(jìn)行干燥。然后將羊膜置于無(wú)菌托盤(pán)上，并且將母體側(cè)朝上。用無(wú)菌的細(xì)胞刮刀(例如，32cm，PE刀片，PS把手，NalgeNunc International)而通過(guò)從羊膜的母體側(cè)物理性地去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料來(lái)將羊膜進(jìn)行部分去細(xì)胞化。如果需要，使用無(wú)菌水來(lái)幫助去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在完成羊膜的母體側(cè)的部分去細(xì)胞化之后，將羊膜翻轉(zhuǎn)，從而將胎兒側(cè)朝上。用細(xì)胞刮刀輕輕地去除胎兒側(cè)上的所有可見(jiàn)的細(xì)胞碎片，在這過(guò)程中對(duì)于羊膜使用最小的壓力以防止撕裂。可以使用無(wú)菌水來(lái)幫助去除細(xì)胞和碎片。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將去細(xì)胞化的羊膜在進(jìn)一步處理之前置于無(wú)菌容器中，該容器充滿了無(wú)菌生理溶液例如無(wú)菌0.9％NaCl溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法，羊膜的下一步處理步驟應(yīng)當(dāng)不遲于將羊膜置于無(wú)菌生理溶液中之后2-3小時(shí)開(kāi)始施行。在一個(gè)特殊實(shí)施方案中，當(dāng)步驟III緊接著步驟II施行時(shí)，不需要將羊膜置于含有無(wú)菌溶液的容器中。
在清潔過(guò)程期間，羊膜可以用例如無(wú)菌解剖刀進(jìn)行切割，從而對(duì)其進(jìn)行形狀修整以便更易清潔，或者去除不能清潔的區(qū)域。
步驟III。在去細(xì)胞化之后，洗滌羊膜以確保去除可能包括細(xì)胞蛋白質(zhì)、細(xì)胞脂類(lèi)和細(xì)胞核酸在內(nèi)的細(xì)胞碎片，以及去除任何細(xì)胞外碎片如細(xì)胞外可溶性蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和蛋白聚糖。雖然不想被任何作用機(jī)制所束縛，但是去除這種細(xì)胞和細(xì)胞外碎片減少了羊膜的免疫原性。
一旦將本發(fā)明的羊膜進(jìn)行了去細(xì)胞化，就進(jìn)一步洗滌羊膜以便有效地達(dá)到從羊膜的兩側(cè)完全地去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片。該溶液優(yōu)選為配制成可有效地裂解天然存在的組織細(xì)胞的低滲或低離子強(qiáng)度水溶液。這種低滲水溶液可以為去離子水或者低滲水緩沖溶液。此外，低滲水緩沖溶液優(yōu)選地含有添加劑，這些添加劑提供了對(duì)于蛋白酶的活性不最適宜的條件，例如可能由于細(xì)胞裂解而釋放出的膠原酶。
優(yōu)選地，將羊膜在去污劑中輕輕地?fù)u動(dòng)，例如在搖動(dòng)平臺(tái)上，從而幫助去細(xì)胞化。在某些實(shí)施方案中，將羊膜搖動(dòng)至少15分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘或者直至120分鐘。在去污劑去細(xì)胞化之后，羊膜可以再次如上所述進(jìn)行物理性去細(xì)胞化；當(dāng)需要時(shí)可以重復(fù)物理性和去污劑去細(xì)胞化步驟，只要保持羊膜的完整性，直至沒(méi)有剩下可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，羊膜的洗滌包括下列步驟將去細(xì)胞化的羊膜置于無(wú)菌容器中，然后用去細(xì)胞化溶液以足夠覆蓋羊膜的數(shù)量充滿容器；然后將含有羊膜和去細(xì)胞化溶液的容器置于搖動(dòng)平臺(tái)上(例如100型，VWR Scientific Products Corp.，P.O.Box 640169，Pittsburgh，PA 15264-0169)。然后將去細(xì)胞化溶液中的羊膜在搖動(dòng)平臺(tái)上搖動(dòng)15-120分鐘。在搖動(dòng)步驟之后，將羊膜從容器中取出，并置于充滿無(wú)菌溶液如0.9％NaCl溶液的潔凈的無(wú)菌托盤(pán)中。使用新的無(wú)菌細(xì)胞刮刀來(lái)去除殘留的去細(xì)胞化溶液，并從羊膜的兩側(cè)去除任何剩余的細(xì)胞材料。該步驟可以按需要重復(fù)多次，以便從羊膜的兩側(cè)去除所有可見(jiàn)的殘留細(xì)胞材料。
在某些實(shí)施方案中，羊膜在去細(xì)胞化步驟之后緊接著(即在30分鐘內(nèi))進(jìn)行干燥。可選擇地，當(dāng)不是立即進(jìn)行進(jìn)一步的處理時(shí)，羊膜可以在干燥之前冷藏直至28天，例如貯存于2-8℃的溫度。當(dāng)去細(xì)胞化的羊膜的貯存時(shí)間超過(guò)3天但少于28天時(shí)，覆蓋羊膜的無(wú)菌溶液優(yōu)選地定時(shí)進(jìn)行更換，例如每1-3天更換一次。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)羊膜在洗滌之后未進(jìn)行冷藏時(shí)，將羊膜在開(kāi)始施行制備的步驟IV之前洗滌至少3次。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)羊膜已經(jīng)進(jìn)行了冷藏和無(wú)菌溶液已經(jīng)更換過(guò)1次時(shí)，將羊膜在開(kāi)始施行制備的步驟IV之前洗滌至少2次。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)羊膜已經(jīng)進(jìn)行了冷藏和無(wú)菌溶液已經(jīng)更換過(guò)2次或更多次時(shí)，將羊膜在開(kāi)始施行制備的步驟IV之前洗滌至少1次。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，去細(xì)胞化的羊膜在無(wú)菌條件下貯存，并且不施行進(jìn)一步的處理，即沒(méi)有干燥。在開(kāi)始施行步驟IV之前，根本的是評(píng)估所有的細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)測(cè)試以確保所有的測(cè)試是陰性的。
步驟IV。本發(fā)明的方法的最后一個(gè)步驟包括干燥本發(fā)明的去細(xì)胞化的羊膜，從而生產(chǎn)膠原生物織物?？梢允褂萌魏慰筛稍镅蚰亩a(chǎn)生平且干的膠原片的方法?？墒牵蚰?yōu)選地在真空中干燥。
在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，對(duì)于干燥本發(fā)明的去細(xì)胞化的羊膜的范例性方法包括下列步驟裝配去細(xì)胞化的羊膜以便干燥。從無(wú)菌溶液中取出去細(xì)胞化的羊膜，并輕輕地?cái)D壓出過(guò)量的液體。然后例如在托盤(pán)上將去細(xì)胞化的羊膜輕輕地進(jìn)行伸展直至其變平，在這過(guò)程中胎兒側(cè)朝下。然后將去細(xì)胞化的羊膜翻轉(zhuǎn)，從而胎兒側(cè)朝上，并置于干燥架上，優(yōu)選為塑料網(wǎng)狀干燥架(例如Quick CountPlastic Canvas，Uniek，Inc.，Waunakee，WI)。在其他實(shí)施方案中，干燥架可以為耐高壓加熱的不銹鋼網(wǎng)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，大約0.5cm的羊膜與干燥架的邊緣重疊。在某些實(shí)施方案中，將伸展至干燥架之外的重疊的羊膜包裹住架的頂部，例如用夾子或止血鉗。一旦將羊膜置于干燥架上，就將無(wú)菌紗布置于熱干燥器(凝膠干燥器)(例如583型，Bio-RadLaboratories，200Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547)的干燥平臺(tái)上，從而覆蓋住比置于塑料網(wǎng)狀干燥架上的羊膜稍大的區(qū)域。優(yōu)選地，紗布層的總厚度不超過(guò)一個(gè)折疊成4×4的紗布的厚度?？梢允褂萌魏芜m合于干燥片樣材料的熱干燥裝置。將干燥架置于干燥平臺(tái)上的紗布之上，從而塑料架的邊緣伸出紗布邊緣之外，優(yōu)選地伸出0.1-1.0cm，更優(yōu)選地伸出0.5-1.0cm。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，將具有羊膜的干燥架置于無(wú)菌紗布之上，并且羊膜的胎兒側(cè)朝上。在一些實(shí)施方案中，將另一個(gè)塑料架網(wǎng)置于羊膜之上。網(wǎng)架和在其中干燥的膜的圖像顯示在圖4中。在另一些實(shí)施方案中，將薄塑料片(例如SW 182、透明的PVC、AEP Industries Inc.，SouthHackensack，NJ 07606)或生物相容的硅氧烷置于膜覆蓋的網(wǎng)上，從而片正好延伸至所有邊緣之外。在該實(shí)施方案中，第二個(gè)網(wǎng)架是不需要的。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，將羊膜置于一個(gè)或多個(gè)無(wú)菌Tyvek材料片(例如用于醫(yī)學(xué)包裝的Tyvek片，Dupont Tyvek，P.O.Box80705，Wilmington，DE 19880-0705)上，可選擇地用一個(gè)Tyvek片置于膜上(在放置塑料膜之前)。該可選擇的方法將會(huì)產(chǎn)生更光滑形式的生物織物(即沒(méi)有順著和垂直于材料的軸的不同纖維密集區(qū)域的圖案)，這種生物織物可能對(duì)于某些應(yīng)用是有利的，例如如此處所述用作用于細(xì)胞擴(kuò)展的基質(zhì)。
羊膜的干燥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在真空中加熱干燥本發(fā)明的羊膜。雖然真空中的干燥可以在大約0℃-大約60℃的任何溫度來(lái)完成，但是羊膜優(yōu)選地于大約35℃-大約50℃進(jìn)行干燥，最優(yōu)選為大約50℃。應(yīng)當(dāng)注意，將會(huì)預(yù)期到膠原在50℃以上的溫度有一些降解。干燥溫度優(yōu)選地進(jìn)行設(shè)置，并通過(guò)使用采用擴(kuò)展性探針的經(jīng)校準(zhǔn)的數(shù)字溫度計(jì)來(lái)進(jìn)行校驗(yàn)。優(yōu)選地，將真空壓力設(shè)置為大約-22英寸Hg。繼續(xù)干燥步驟，直至例如用水分分析儀測(cè)得羊膜的膠原基質(zhì)含有低于3-12％的水。為了達(dá)到這一點(diǎn)，羊膜可以進(jìn)行加熱-真空干燥例如大約60分鐘，從而獲得脫水的羊膜。在一些實(shí)施方案中，將羊膜干燥大約30分鐘-2小時(shí)，優(yōu)選為大約60分鐘。雖然不想被任何作用機(jī)制所束縛，但是據(jù)信低熱環(huán)境聯(lián)合真空壓力使得羊膜能夠達(dá)到脫水的狀態(tài)而不會(huì)讓膠原變性。
在根據(jù)本發(fā)明完成干燥過(guò)程之后，在真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)的情況下將羊膜冷卻大約2分鐘。
羊膜的包裝和貯存。一旦如所述將羊膜根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行干燥，就將膜輕輕地提離干燥架?！疤崞稹蹦た梢园ㄏ铝胁襟E當(dāng)泵仍然在運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，將塑料膜從邊角開(kāi)始輕輕地從羊膜上去除，同時(shí)壓住羊膜；將帶有羊膜的框架提離干燥平臺(tái)，然后置于切割板上，并讓羊膜一側(cè)朝上；進(jìn)行切割，沿著離框架邊緣1-2mm的邊緣進(jìn)行切割；然后將羊膜剝離框架；和切開(kāi)成由其隨后的用途所決定的合適大小。優(yōu)選地，在這一階段的羊膜的操作通過(guò)使用無(wú)菌手套來(lái)進(jìn)行。
將羊膜置于無(wú)菌容器如揭片袋中，并密封。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的生物織物可以于室溫貯存延長(zhǎng)的一段時(shí)間。
在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備含有絨毛膜的膠原生物織物的方法。期望上述方法將可應(yīng)用于制備含有絨毛膜的生物織物的方法。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備膠原生物織物的方法，其包括提供含有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)；分離羊膜和絨毛膜；和將絨毛膜進(jìn)行去細(xì)胞化。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該方法此外還需要洗滌和干燥去細(xì)胞化的絨毛膜。
5.2.1制備三維支架和層壓制品的方法本發(fā)明提供了制備含有本發(fā)明膠原生物織物的三維支架、三維構(gòu)造和層壓制品的方法。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備羊膜層壓制品的方法，其包括提供含有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)，優(yōu)選為人胎盤(pán)；用此處公開(kāi)的方法分離羊膜和絨毛膜；用此處公開(kāi)的方法將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化；用此處公開(kāi)的方法洗滌去細(xì)胞化的羊膜至少一次；將至少兩層去細(xì)胞化的羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品；和用此處公開(kāi)的方法干燥羊膜層壓制品。
可選擇地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備羊膜層壓制品的方法包括，干燥至少兩層根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜，和將至少兩層羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的羊膜層可以在存在粘合劑的條件下以相互接觸的方式放置在一起，從而形成羊膜層壓制品。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物所使用的粘合劑可以為任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的生物膠合劑，優(yōu)選為生物相容的膠合劑，其包括天然膠合劑如纖連蛋白、血纖蛋白以及合成的膠合劑，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜層相互進(jìn)行交聯(lián)以形成羊膜層壓制品。任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的交聯(lián)試劑和方法在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，包括化學(xué)交聯(lián)、肽交聯(lián)、UV交聯(lián)、放射交聯(lián)、纖連蛋白交聯(lián)、血纖蛋白原交聯(lián)、水凝膠交聯(lián)，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的羊膜層壓制品不含有粘合劑。
5.3膠原生物織物的貯存和操作本發(fā)明包括將本發(fā)明的膠原生物織物作為脫水的片狀物于室溫(例如25℃)進(jìn)行貯存。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以于至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃或至少29℃的溫度進(jìn)行貯存。優(yōu)選地，本發(fā)明的膠原生物織物不進(jìn)行冷藏。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以于大約2-8℃的溫度進(jìn)行冷藏。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以于任何上面確定的溫度貯存延長(zhǎng)的一段時(shí)間。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物織物在無(wú)菌和非氧化條件下進(jìn)行貯存。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的生物織物可以于任何指定的溫度貯存12個(gè)月或更長(zhǎng)，而生物化學(xué)或結(jié)構(gòu)完整性沒(méi)有變化(例如沒(méi)有降解)，并且膠原生物織物的生物化學(xué)或生物物理學(xué)特性沒(méi)有任何改變。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的生物織物可以貯存幾年，而生物化學(xué)或結(jié)構(gòu)完整性沒(méi)有變化(例如沒(méi)有降解)，并且膠原生物織物的生物化學(xué)或生物物理學(xué)特性沒(méi)有任何改變。期望根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的本發(fā)明的生物織物會(huì)無(wú)限期地保持著。生物織物可以貯存在任何適合于長(zhǎng)期貯存的容器中。優(yōu)選地，本發(fā)明的膠原生物織物貯存在無(wú)菌的雙揭片袋包裝中。
本發(fā)明包括在其干燥狀態(tài)操作本發(fā)明的膠原生物織物。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，將膠原生物織物在使用之前進(jìn)行修整，例如在用作外科移植物之前。本發(fā)明包括任何與其用途相適應(yīng)的本發(fā)明生物織物的維數(shù)，這是由本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)確定的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括為1×2cm、2×3cm、4×4cm、5×5cm或6×8cm的膠原生物織物。可以將本發(fā)明的生物織物切割成任何所需的大小，該大小位于羊膜的大小的限制之內(nèi)。
本發(fā)明的膠原生物織物的表面方向可以通過(guò)肉眼來(lái)鑒定。本發(fā)明的膠原生物織物具有“網(wǎng)格”圖案，這使得本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠用肉眼來(lái)鑒定母體和胎兒側(cè)的表面。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物的表面方向在放大的條件下進(jìn)行鑒定。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，膠原生物織物的胎兒側(cè)可以通過(guò)其凹陷的即下凹的網(wǎng)格圖案來(lái)進(jìn)行鑒定。相反地，母體側(cè)可以通過(guò)其凸起的即升高的網(wǎng)格圖案來(lái)進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的膠原生物織物需要最少的使用之前的準(zhǔn)備時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可在5分鐘或更少時(shí)間之內(nèi)、在10分鐘或更少時(shí)間之內(nèi)、在15分鐘或更少時(shí)間之內(nèi)準(zhǔn)備好進(jìn)行使用。本發(fā)明的膠原生物織物在使用例如用作外科移植物之前的準(zhǔn)備時(shí)間包括通過(guò)再水化來(lái)活化脫水的膠原生物織物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物當(dāng)在外科部位上時(shí)進(jìn)行水化。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物在皿中于無(wú)菌條件下進(jìn)行水化。本發(fā)明包括用無(wú)菌生理緩沖液來(lái)水化本發(fā)明的膠原生物織物。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用無(wú)菌鹽溶液如0.9％無(wú)菌NaCl溶液來(lái)水化本發(fā)明的膠原生物織物。在一些實(shí)施方案中，無(wú)菌鹽溶液是緩沖液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物的水化需要至少2分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘或至少20分鐘。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物的水化在5分鐘之內(nèi)完成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物的水化在10分鐘之內(nèi)完成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物的水化不需要超過(guò)10分鐘。
一旦將本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)行水化以便使用例如用作外科移植物，根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的測(cè)定，其相對(duì)于本領(lǐng)域中的羊膜具有增強(qiáng)的可縫合性。本發(fā)明的膠原生物織物不像本領(lǐng)域中的羊膜一樣容易撕裂，其也不像本領(lǐng)域中的羊膜一樣易碎。本發(fā)明包括能夠有效地縫合的膠原生物織物。
5.3.1滅菌本發(fā)明的生物織物的滅菌優(yōu)選地使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法通過(guò)電子束輻射來(lái)進(jìn)行，例如Gorham，D.Byrom(編者)，1991，Biomaterials，Stockton Press，New York，55-122。任何足夠殺死至少99.9％的細(xì)菌或其他潛在污染生物的輻射劑量在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用至少18-25kGy的劑量來(lái)完成本發(fā)明的生物織物的最終滅菌?？墒?，本發(fā)明的生物織物的滅菌不包括在抗生素或甘油中的貯存。
5.4使用本發(fā)明的膠原生物織物的方法本發(fā)明的膠原生物織物在內(nèi)科和外科領(lǐng)域有著許多的應(yīng)用，這部分地是由于其與本領(lǐng)域中所使用的傳統(tǒng)膜相比的物理特性，例如生物機(jī)械強(qiáng)度、屈曲性、可縫合性和低免疫原性。例如期望本發(fā)明的膠原生物織物對(duì)于在現(xiàn)有技術(shù)的膜上的引導(dǎo)性組織再生具有增強(qiáng)的治療效用，這些膜例如為合成的不可再吸收性PTFE膜如Goretex？；合成的可再吸收性膜，其由乙交酯和丙交酯共聚物所形成；WO-88/08305、DE-2631909、U.S.專(zhuān)利號(hào)5,837,278中所公開(kāi)的膜。
制備本發(fā)明的膠原生物織物的方法確保保留了生物織物的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，因此使得該生物織物對(duì)于其在內(nèi)科和外科領(lǐng)域中的想要的用途來(lái)說(shuō)是理想的。正如下面詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了這樣的膠原生物織物，即該膠原生物織物的物理特性使得其適合于在多種內(nèi)科和牙科應(yīng)用中使用，包括血管修復(fù)、子宮修復(fù)、腱的替換、角膜的替換、人造皮膚、牙周病的治療和傷口愈合，但并不局限于此。依賴(lài)于其想要的用途，本發(fā)明包括使用膠原生物織物作為二維的膜，例如可以制作形成管狀容器的膜；作為三維的支架，例如植入物；或者作為一維的纖維。
5.4.1使用本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)行治療的方法5.4.1.1處理皮膚狀況的方法人皮膚是表皮和真皮的復(fù)合材料。表皮的上面部分是角質(zhì)層，其是皮膚最硬的一層，以及是受周?chē)h(huán)境影響最大的一層。在角質(zhì)層的下面是表皮的內(nèi)部。在表皮的下面是乳突狀真皮，其由相對(duì)疏松的結(jié)締組織組成，這些結(jié)締組織決定了皮膚的微起伏。位于乳突狀真皮之下的網(wǎng)狀真皮是有間隙地組織在一起的緊密結(jié)締組織。網(wǎng)狀真皮還與粗糙的皺紋有關(guān)。在真皮之下是皮下層。
皮膚的主要功能包括保護(hù)、排泄、分泌、吸收、溫度調(diào)節(jié)、色素形成、蓄積、感官知覺(jué)和免疫過(guò)程的調(diào)節(jié)。這些功能不利地受到由于老化和過(guò)度陽(yáng)光暴露所引起的皮膚結(jié)構(gòu)變化的影響。與皮膚老化相關(guān)的生理性變化包括屏障功能的削弱和降低的表皮細(xì)胞的更新率，例如見(jiàn)Cerimele，D.等人，1990，Br.J.Dermatol.，122Suppl.35，13-20頁(yè)。現(xiàn)有技術(shù)中的方法和組合物對(duì)于改善皮膚狀況例如改善皮膚的彈性和柔軟性或者去除皺紋取得了有限的成功。
本發(fā)明的膠原生物織物具有醫(yī)療以及美容的應(yīng)用。本發(fā)明的膠原生物織物在處理皮膚狀況中具有臨床和治療效用，包括皮膚損傷、老化的皮膚、皺紋、細(xì)紋、變薄、降低的皮膚彈性、粗糙的皮膚、先天的和變性的皮膚狀況、VII型膠原缺乏以及陽(yáng)光損害的皮膚。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以用作用于皮膚狀況如痤瘡瘢痕、眉間溝、切除性瘢痕或者任何其他本領(lǐng)域中已知的軟組織缺損的皮下植入物。本發(fā)明的膠原生物織物在處理與皮膚老化相關(guān)的變化中具有臨床和治療效用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物對(duì)于改善皮膚皺紋和/或其他狀況如皮膚彈性和柔軟性具有效用。本發(fā)明的膠原生物織物可以用作用于處理皮膚狀況的植入物、層壓制品或三維卷縮的形式。期望本發(fā)明的膠原生物織物相對(duì)于本領(lǐng)域中已知用于處理這種皮膚狀況的方法例如U.S.專(zhuān)利號(hào)5,972,999、5,418,875、5,332,579、5,198,465具有增強(qiáng)的臨床效用，這部分地是由于其穩(wěn)定性，這可能提供了更長(zhǎng)的持續(xù)效應(yīng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)一步用一種或多種本領(lǐng)域中已知用于處理皮膚狀況的試劑來(lái)加以補(bǔ)充。這種試劑的例子包括維生素、礦物質(zhì)、基于兒茶素的制劑、N-乙酰葡糖胺和葡糖胺(見(jiàn)例如，Neldner，1993，Amer.Acad.Derm.Annl.Mtg.Wash.DC.；Lubell 1996，Cosmetic Dermatol，9(7)58-60；Swaine等人，1995，J.Am.Board of Family Practice，8(3)206-16；Shan等人，1994，Kidney International，46(2)388-95；所有這些文獻(xiàn)在此處以其整體進(jìn)行引用作為參考)，但并不局限于此。
本發(fā)明的膠原生物織物可以用任何可用于處理皮膚狀況的生物分子進(jìn)行浸漬，包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素)、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑(包括銀(例如銀鹽包括硝酸銀和磺胺嘧啶銀，但并不局限于此)、元素銀、抗生素、殺菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、傷口愈合劑(例如細(xì)胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作為傷口愈合劑的透明質(zhì)酸、傷口封閉劑(例如有或沒(méi)有凝血酶的血纖蛋白)、細(xì)胞吸引劑和支架試劑(例如纖連蛋白)等等，但并不局限于此。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用至少一種生長(zhǎng)因子進(jìn)行浸漬，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等。生物織物還可以用小分子進(jìn)行浸漬，例如小有機(jī)分子如特殊生物化學(xué)過(guò)程的特異性抑制劑，如膜受體抑制劑、激酶抑制劑、生長(zhǎng)抑制劑、抗癌藥物、抗生素等等。
5.4.1.2創(chuàng)傷和燒傷與本領(lǐng)域中已知的其他生物材料例如U.S.專(zhuān)利號(hào)3,157,524、4,320,201、3,800,792、4,837,285、5,116,620中所描述的那些相比，期望本發(fā)明的膠原生物織物作為用于促進(jìn)硬組織和/或軟組織修復(fù)的創(chuàng)傷敷料具有增強(qiáng)的臨床效用，這部分地是由于其物理特性。因?yàn)楸景l(fā)明的膠原生物織物保持了膠原的天然四級(jí)結(jié)構(gòu)，所以其造成增強(qiáng)了組織通過(guò)細(xì)胞遷移而向內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)膠原基質(zhì)的間隙中。本發(fā)明的生物織物使得細(xì)胞能夠粘附在膠原基質(zhì)上，并生長(zhǎng)進(jìn)膠原基質(zhì)中，和使得細(xì)胞能夠合成它們的大分子。細(xì)胞由此產(chǎn)生出能夠讓新組織生長(zhǎng)的新的基質(zhì)。這種細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有在其他已知的膠原形式例如纖維、毛狀物和可溶性膠原上觀察到。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過(guò)將本發(fā)明的膠原生物織物直接置于受試者的創(chuàng)傷部位的皮膚上即角質(zhì)層上來(lái)治療創(chuàng)傷，因此例如用粘合帶覆蓋傷口。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的膠原生物織物作為植入物例如作為皮下植入物來(lái)治療創(chuàng)傷。
本發(fā)明包括通過(guò)添加能夠促進(jìn)組織向內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)本發(fā)明的膠原生物織物中的大分子來(lái)增加傷口愈合率。這種大分子包括透明質(zhì)酸、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖(見(jiàn)例如，Doillon等人(1987)Biomaterials 8195-200；以及Doillon和Silver(1986)Biomaterials 73-8)，但并不局限于此。
本發(fā)明此外還包括在此處描述的本發(fā)明的膠原生物織物中摻入藥理活性試劑以便如在5.4.2.7節(jié)中用于將藥物遞送給皮膚，和摻入任何上述的生物分子，藥理活性試劑包括血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血管生成因子、抗生素、抗真菌劑、殺精劑、激素、酶、酶抑制劑，但并不局限于此。藥理活性試劑優(yōu)選地以生理有效劑量進(jìn)行提供。
在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步于應(yīng)用于創(chuàng)傷部位之前在膠原生物織物上移植活細(xì)胞，包括異源干細(xì)胞、干細(xì)胞和自身成熟細(xì)胞，但并不局限于此。
本發(fā)明的膠原生物織物對(duì)于治療傷口感染是特別有用的，例如隨后出現(xiàn)外科或外傷性傷口的貫穿的傷口感染。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，膠原生物織物用治療有效劑量的用于治療傷口感染的試劑進(jìn)行浸漬，包括抗生素、抗微生物劑和抗菌劑，但并不局限于此。本發(fā)明的膠原生物織物在治療由任何本領(lǐng)域中已知的微生物所引起的傷口感染之中具有臨床和治療效用，例如源自人體內(nèi)的感染傷口的微生物，這是一個(gè)已知的病原生物庫(kù)，或者源自環(huán)境來(lái)源的感染傷口的微生物。其在傷口中的生長(zhǎng)可以被本發(fā)明的方法和組合物所減少或防止的微生物的非限制性例子為金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(St.epidermis)、β-溶血性鏈球菌(Streptococcus)、大腸桿菌(E.coli)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)物種和假單胞菌屬(Pseudomonas)物種，和在厭氧細(xì)菌中為韋氏梭菌(Clostridiumwelchii)或(tartium)，它們是造成氣性壞疽的原因，主要是在深的外傷性傷口中。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物用于創(chuàng)傷治療，包括表皮傷口、皮膚傷口、慢性傷口、急性傷口、外部傷口、內(nèi)部傷口(例如膠原生物織物可以在外科手術(shù)期間包裹在吻合部位的周?chē)员惴乐寡獜目p合線中滲漏出來(lái)，和防止身體與縫合材料形成粘連)、先天性傷口(例如營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥)，但并不局限于此。特別地，膠原生物織物在治療壓力性潰瘍(例如褥瘡性潰瘍)中具有增強(qiáng)的效用。壓力性潰瘍常常出現(xiàn)在長(zhǎng)期臥床休息的患者中，例如四肢癱瘓患者和截癱患者，他們由于局部壓力的影響而遭受皮膚損失。結(jié)果造成的壓力性潰瘍表現(xiàn)出真皮糜爛以及表皮和皮膚附屬物的損失。
本發(fā)明的膠原生物織物還可以用于治療燒傷，包括一度燒傷、二度燒傷(部分厚度燒傷)、三度燒傷(完全厚度燒傷)、燒傷傷口的感染、切除的和未切除的燒傷傷口的感染、移植傷口的感染、供體部位的感染、先前移植的或愈合的燒傷傷口或者皮膚移植供體部位的上皮損失以及燒傷傷口膿皰病，但并不局限于此。
5.4.1.3組織工程本發(fā)明包括使用本發(fā)明的膠原生物織物作為用于運(yùn)送培養(yǎng)皮膚細(xì)胞的載體，例如作為對(duì)于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的支持物。在某些實(shí)施方案中，為了在生物織物上移植細(xì)胞以形成組織和/或類(lèi)器官(即在表面外觀或結(jié)構(gòu)上與身體的任何器官或腺體類(lèi)似)，在生物織物上再次移植這種新細(xì)胞的過(guò)程期間，生物織物可以用細(xì)胞粘著因子進(jìn)行處理以增強(qiáng)細(xì)胞與生物織物的附著。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞附著程度是通過(guò)用血清處理羊膜來(lái)增加的，例如人血清或胎牛血清。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞附著程度是通過(guò)用纖連蛋白處理羊膜來(lái)增加的。
本發(fā)明的膠原生物織物可以用于引導(dǎo)性組織再生技術(shù)，例如再生或替換有病的或受損的組織。本發(fā)明包括本發(fā)明的生物織物的使用，即將生物織物直接植入于治療部位，或者形成假體裝置。本發(fā)明的膠原生物織物在任何情況下都是特別有用的，例如在外科手術(shù)尤其是口部或牙科外科手術(shù)之后(在5.4.2.2節(jié)中有更詳細(xì)的描述)，其中有望獲得提高的傷口愈合和/或真皮替換。本發(fā)明的膠原生物織物在引導(dǎo)性組織再生中的效用部分地是由于其能夠提供這樣的條件，即這些條件防止了其他組織向內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)需要再生的區(qū)域中。
例如，在由于腐爛或疾病而去除了牙根的實(shí)質(zhì)部分的地方，希望出現(xiàn)健康的骨的再生以替換去除的骨組織?？墒?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于去除了骨而留下的空腔很快被結(jié)締組織充滿，而且這種結(jié)締組織的向內(nèi)生長(zhǎng)有效地防止了骨再生。為了防止這種向內(nèi)生長(zhǎng)，可以將本發(fā)明的膠原生物織物通過(guò)外科手術(shù)插入從而環(huán)繞在傷口空腔的邊緣。生物織物防止或阻止傷口空腔被不想要的細(xì)胞類(lèi)型侵入，因此能夠讓首選的細(xì)胞生長(zhǎng)入空腔中，由此愈合了傷口。
在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物用作用于眼表面重建的移植物，例如在患有Stevens Johnson綜合征、化學(xué)灼傷之后的繼發(fā)性邊緣干細(xì)胞缺乏的受試者中，或者在具有化學(xué)灼傷和/或熱灼傷的受試者中。期望本發(fā)明的生物織物例如通過(guò)促進(jìn)上皮形成而具有增強(qiáng)的臨床效用。期望本發(fā)明的生物織物相對(duì)于在本領(lǐng)域中用于組織工程目的的羊膜具有增強(qiáng)的臨床效用，見(jiàn)例如，Gomes等人，2003，Opthalmology，119166-73；Ti等人，2001，Opthalmology，1081209-1217；Meller等人，2000，Opthalmology，107980-9；Gris等人，2002，Opthalmology，109508-12；Koizumi等人，2000，Invest.Opthal.and Visual Science，412506-13；Pires等人，1999，Arch.Opthalmol.1171291-7；Tseng等人.，1998，Arch.Opthalmol.116431-441；Heiligenhaus等人，2001，Invest.Opthal.andVisual Science 421969-74；Anderson等人，2001，Br.J.Opthalmol.85567-75。
本發(fā)明包括在膠原生物織物上移植活細(xì)胞，包括成熟組織細(xì)胞、自身細(xì)胞和干細(xì)胞，但并不局限于此。在本發(fā)明的方法中使用的干細(xì)胞可以為全能細(xì)胞、多能細(xì)胞或分化的組織特異性細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中使用的干細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得。優(yōu)選地，根據(jù)于2002年2月13日提交的U.S.申請(qǐng)?zhí)?0/74,976中所公開(kāi)的方法來(lái)收集干細(xì)胞，在此處引用該文獻(xiàn)作為參考。
本發(fā)明包括將本發(fā)明的膠原生物織物(例如三維支架)用于形成生物工程改造的組織和類(lèi)器官，包括血管、心臟瓣膜、肝、胰腺和韌帶，但并不局限于此。雖然不想被任何作用機(jī)制所束縛，但是本發(fā)明的生物織物作為生物工程改造的組織的效用部分地是由于其在促進(jìn)血液凝固中的止血特性。本發(fā)明的生物織物對(duì)于血管假體和作為血管外科中的移植物是特別有用的。本發(fā)明的生物織物可以例如用作在血管外科程序期間環(huán)繞在血管(或者血管與移植物)吻合部位上的覆蓋物，以防止血從縫合線中滲漏出來(lái)，和防止身體與縫合材料形成粘連。
5.4.2在外科程序中使用膠原生物織物的方法本發(fā)明包括使用本發(fā)明的膠原生物織物作為外科移植物。本發(fā)明包括含有本發(fā)明的膠原生物織物或其層壓制品的外科移植物。本發(fā)明此外還包括制備和使用外科移植物的方法。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在外科程序中使用外科移植物的方法，從而將外科移植物直接應(yīng)用于受試者的外科部位，例如內(nèi)部部位或外部部位。在一些實(shí)施方案中，在外科程序期間使用膠原生物織物作為外科移植物，這在下面會(huì)更詳細(xì)地進(jìn)行公開(kāi)，以便例如防止血從縫合線中滲漏出來(lái)，和防止身體與縫合材料形成粘連。在其他實(shí)施方案中，外科移植物用作吻合部位上的覆蓋物，例如在GI外科手術(shù)期間GI管道的吻合部位，以便防止腸液和膽汁從縫合線中滲漏出來(lái)，和防止身體與縫合材料形成粘連。
本發(fā)明包括使用生物織物作為覆蓋燒傷或經(jīng)過(guò)外科手術(shù)的皮膚傷口的移植物或敷料；防止在所有腹膜內(nèi)外科手術(shù)中或者在其他于覆蓋腹部、胸腔和心包的漿膜面上的重建中出現(xiàn)粘連；重建襯在口腔和鼻腔、呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道內(nèi)的所有粘膜面；作為支持腦外科中的硬腦膜修復(fù)的基質(zhì)；作為促進(jìn)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)再生的基質(zhì)；和重建軟組織以防止在關(guān)節(jié)或腱修復(fù)中的粘連。
本發(fā)明包括用一種或多種生物分子浸漬本發(fā)明的外科移植物，優(yōu)選為治療劑，這取決于特殊的想要的外科用途。這種生物分子包括抗生素(例如克林霉素、二甲胺四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素)、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑(包括銀(例如銀鹽包括硝酸銀和磺胺嘧啶銀，但并不局限于此)、元素銀、抗生素、殺菌的酶(例如溶菌酶)，但并不局限于此)、傷口愈合劑(例如細(xì)胞因子包括PDGF、TGF，但并不局限于此；胸腺素)、作為傷口愈合劑的透明質(zhì)酸、傷口封閉劑(例如有或沒(méi)有凝血酶的血纖蛋白)、細(xì)胞吸引劑和支架試劑(例如纖連蛋白)等等，但并不局限于此。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用至少一種生長(zhǎng)因子進(jìn)行浸漬，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等等。生物織物還可以用小有機(jī)分子進(jìn)行浸漬，例如特殊生物化學(xué)過(guò)程的特異性抑制劑，如膜受體抑制劑、激酶抑制劑、生長(zhǎng)抑制劑、抗癌藥物、抗生素等等。
本發(fā)明此外還包括在本發(fā)明的外科移植物上移植活細(xì)胞，包括干細(xì)胞、全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞、胚胎樣干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、類(lèi)成纖維細(xì)胞，但并不局限于此。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在本發(fā)明的外科移植物上移植特殊種類(lèi)的祖細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞和肌肉祖細(xì)胞，但并不局限于此。
5.4.2.1眼科學(xué)本發(fā)明的膠原生物織物在治療眼相關(guān)疾病或病癥中具有臨床和治療效用。本發(fā)明的膠原生物織物對(duì)于治療和/或預(yù)防眼表面疾病是特別有用的，包括角膜潰瘍/穿孔、大泡性角膜病變、眼部皮樣囊腫/腫瘤、原發(fā)性翼狀胬肉、持續(xù)性角膜上皮缺損、急性和慢性堿灼傷、熱灼傷、無(wú)虹膜、特應(yīng)性角膜炎、特發(fā)性邊緣干細(xì)胞缺乏、角膜翳、新血管生成、類(lèi)風(fēng)濕性角膜融化、眼瘢痕性類(lèi)天皰瘡、滲漏性濾過(guò)性水泡、暴露的Ahmed瓣膜管、具有隨后的瞼球粘連的沙雷氏菌(Serratia)蜂窩組織炎、急性和慢性Stevenson Johnson綜合征，但并不局限于此。本發(fā)明的膠原生物織物在下列應(yīng)用中是特別有效的，即促進(jìn)具有潰瘍的持續(xù)性角膜上皮缺損的愈合；促進(jìn)上皮形成；促進(jìn)上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的生長(zhǎng)；減輕炎癥和疼痛、抑制血管生成和瘢疤形成；上皮表型的恢復(fù)；和作為在翼狀胬肉的“裸露鞏膜”消除期間的結(jié)膜自體移植物的可選擇替代的基質(zhì)。
本發(fā)明包括用本發(fā)明的膠原生物織物進(jìn)行移植以治療癥狀性大泡性角膜病變，優(yōu)選是在人中，最優(yōu)選是在具有差的視力的人中。期望本發(fā)明的生物織物相對(duì)于本領(lǐng)域中用于治療癥狀性大泡性角膜病變(明確地說(shuō)就是結(jié)膜瓣構(gòu)建)的其他標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)說(shuō)具有增強(qiáng)的治療和臨床效用。相對(duì)于本領(lǐng)域中用于治療癥狀性大泡性角膜病變(明確地說(shuō)就是結(jié)膜瓣構(gòu)建)的其他標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)說(shuō)，用本發(fā)明的生物織物進(jìn)行移植的優(yōu)點(diǎn)包括減輕疼痛、容易實(shí)施、美容上更加能夠接受的外觀以及減少并發(fā)癥如上瞼下垂和邊緣干細(xì)胞缺乏，但并不局限于此。本發(fā)明的膠原生物織物提供了改良的結(jié)膜瓣的可選擇替代物以促進(jìn)具有潰瘍的角膜上皮缺損的愈合；改進(jìn)的用于對(duì)于瞼球粘連消散的結(jié)膜表面重建的方法；改進(jìn)的用于從結(jié)膜或角膜表面外科去除腫瘤、損傷或瘢痕組織的方法；改進(jìn)的用于通過(guò)矯正皰疹的滲漏而進(jìn)行青光眼外科手術(shù)的方法；在翼狀胬肉的“裸露鞏膜”消除期間的結(jié)膜自體移植物的可選擇替代的改良基質(zhì)；和用于防止帶狀角膜病變的復(fù)發(fā)。
本發(fā)明還提供了生物織物用作眼外科移植物的用途。本發(fā)明包括移植物的制備，這些移植物含有進(jìn)一步含有一種或多種治療劑的本發(fā)明的生物織物，當(dāng)給予受體時(shí)可以將這些治療劑遞送給受體。治療劑的例子包括匹魯卡品、紅霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、妥布拉霉素、奈替米星、硫酸多粘菌素B、三甲氧芐二氨嘧啶、兩性霉素B、抗癌劑、抗生素、環(huán)孢菌素等等，但并不局限于此。
本發(fā)明的膠原生物織物還在減少由于受激準(zhǔn)分子激光器光折射/治療角膜切除術(shù)所引起的角膜模糊中具有效用。
用于眼科程序的本發(fā)明的膠原生物織物可以多種構(gòu)造進(jìn)行提供，包括插入物、防護(hù)物、顆粒、凝膠、含水注射劑、海棉狀物、薄膜，但并不局限于此。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的用于眼科移植物的常規(guī)外科技術(shù)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
使用本發(fā)明的膠原生物織物作為眼外科移植物的范例性方案可以包括下列步驟去除有病的角膜和/或結(jié)膜組織；在無(wú)菌條件下提供根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的外科移植物，并通過(guò)自由的技術(shù)進(jìn)行修整以覆蓋角膜上皮或裸露的鞏膜。通過(guò)縫合將移植物錨定于裸露的鞏膜與結(jié)膜的連接處；進(jìn)行主要的縫合；然后使用中斷的縫合來(lái)形成移植物表面上的張力平均分布；以致于避免在移植物與受體鞏膜或角膜之間出現(xiàn)任何空隙。在移植物和宿主的連接處，移植物的游離邊緣必須保持在受體結(jié)膜之下，以允許宿主上皮于與供體組織的連接點(diǎn)處在基底層上滑動(dòng)，否則移植物會(huì)被受體擠壓出來(lái)。
5.4.2.2牙科本發(fā)明的膠原生物織物在牙科學(xué)中具有特別的效用，例如牙周外科、用于牙周組織再生的引導(dǎo)性組織再生、引導(dǎo)性骨再生和牙根覆蓋。本發(fā)明包括使用本發(fā)明的膠原生物織物來(lái)促進(jìn)牙周骨內(nèi)缺損的再生，包括匹配性兩側(cè)牙周缺損、齒間骨內(nèi)缺損、3層壁深的骨內(nèi)缺損、2層壁深的骨內(nèi)缺損以及骨內(nèi)缺損2和3，但并不局限于此。期望本發(fā)明的膠原生物織物相對(duì)于本領(lǐng)域中已知的其他技術(shù)來(lái)說(shuō)在治療牙周骨內(nèi)缺損中具有增強(qiáng)的治療效用和提高的臨床參數(shù)，本領(lǐng)域中已知的其他技術(shù)例如為使用交聯(lián)的膠原膜，例如在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些，即Quteish等人，1992，J.Clin.Periodontol.19(7)476-84；Chung等人，1990，J.Periodontol.61(12)732-6；Mattson等人，1995，J.Periodontol.66(7)635-45；Benque等人，1997，J.Clin.Periodontol.24(8)544-9；Mattson等人，1999，J.Periodontol.70(5)510-7。通過(guò)使用本發(fā)明的膠原生物織物而得到改善的參數(shù)的例子包括斑塊和齒齦指數(shù)評(píng)分、探測(cè)袋深度、探測(cè)附著深度以及分叉牽涉和骨缺損的分類(lèi)，這些對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，但并不局限于此。
本發(fā)明還包括在治療II類(lèi)分叉缺損中使用本發(fā)明的生物織物，包括兩側(cè)缺損、成對(duì)的口腔II類(lèi)下頜臼齒分叉缺損和兩側(cè)下頜分叉缺損，但并不局限于此。本發(fā)明的膠原生物織物在治療II類(lèi)分叉缺損中的效用可以部分地用其能夠再生出在分叉缺損中喪失的牙周組織的能力來(lái)解釋。期望本發(fā)明的生物織物相對(duì)于本領(lǐng)域中用于治療II類(lèi)分叉缺損的膠原膜來(lái)說(shuō)具有增強(qiáng)的治療和臨床效用，本領(lǐng)域中用于治療II類(lèi)分叉缺損的膠原膜例如為在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些，即Paul等人，1992，Int.J.Periodontics Restorative Dent.12123-31；Wang等人，1994，J.Periodontol.651029-36；Blumenthal，1993，J.Periodontol.64925-33；Black等人，1994，J.Periodontol.54598-604；Yukna等人，1995，J.Periodontol.67650-7。
本發(fā)明此外還包括在牙根覆蓋程序中使用本發(fā)明的生物織物。本發(fā)明的生物織物在牙根覆蓋中的效用可以解釋為這是部分地由于其能夠基于引導(dǎo)性組織再生的原理而替換喪失的、損傷的或有病的牙齦組織。由于上面說(shuō)到的原因，期望本發(fā)明的生物織物與本領(lǐng)域中傳統(tǒng)用于牙根覆蓋的膠原膜相比具有增強(qiáng)的臨床效用，本領(lǐng)域中傳統(tǒng)用于牙根覆蓋的膠原膜例如為在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些，即Shieh等人，1997，J.Periodontol.68770-8；Zahedi等人，1998，J.Periodontol.69975-81；Ozcan等人，1997，J.Marmara Univ.Dent.Fa.2588-98；Wang等人，1997，J.Dent.Res.78(Spec Issue)119(Abstr.106)。
本發(fā)明此外還包括在患有牙周病的受試者中使用膠原生物織物，包括牙周炎和牙齦炎，但并不局限于此。本發(fā)明的生物織物還具有附加于刮治和根面平整程序的臨床效用。本發(fā)明包括用本發(fā)明的膠原生物織物治療患有牙周病的受試者。使用本發(fā)明的膠原生物織物在受試者中治療牙周病的范例性方法包括將優(yōu)選地用抗生素如葡萄糖酸氯己定浸潰的膠原生物織物插入受試者中的一個(gè)或多個(gè)牙周袋中，例如插入大于或等于5mm。膠原生物織物優(yōu)選地是可生物降解的。
在牙科學(xué)中使用的本發(fā)明的膠原生物織物取決于待治療的牙科病癥的類(lèi)型而可以用一種或多種生物分子進(jìn)行浸漬。本領(lǐng)域中已知用于治療牙科病癥的任何生物分子包括在本發(fā)明的方法和組合物之內(nèi)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，在治療伴隨有感染的牙科病癥中使用的膠原生物織物可以用一種或多種抗生素進(jìn)行浸漬，包括強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、葡萄糖酸氯己定和二甲胺四環(huán)素，但并不局限于此。
5.4.2.3神經(jīng)學(xué)本發(fā)明的膠原生物織物還用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)特別是修復(fù)切斷的外周神經(jīng)，以及用于神經(jīng)外科程序。本發(fā)明包括例如在硬腦膜替換和在外周神經(jīng)修復(fù)中使用膠原生物織物。由于上面提及的原因，本發(fā)明的膠原生物織物與本領(lǐng)域中使用的其他方法相比在用作硬腦膜替代物時(shí)或者在神經(jīng)修復(fù)中具有增強(qiáng)的臨床效用，本領(lǐng)域中使用的其他方法例如為Berger等人，1970，Acta.Neurochir.23141；Ducker等人，1968，Mil.Med.133298；U.S.專(zhuān)利號(hào)4,778,467；4,883,618；3,961,805；5,354,305。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以用作環(huán)繞神經(jīng)吻合的假體，例如其可以用于包裹外周神經(jīng)吻合。本發(fā)明的膠原生物織物在神經(jīng)修復(fù)中有特別的效用，這例如是通過(guò)這樣的過(guò)程來(lái)完成的，即促進(jìn)穿過(guò)修復(fù)區(qū)域的縱向結(jié)締組織框架的形成，因此引起鞘細(xì)胞和軸突再生的縱向式樣。
外周神經(jīng)的修復(fù)在稱(chēng)為nerorraphy(Jennings等人，1955，Surgery206)的程序中通常通過(guò)使用縫合來(lái)進(jìn)行?？墒?，該方法只獲得了有限的成功，因?yàn)榭p合切斷的神經(jīng)的方法是困難的。因此，本發(fā)明的膠原生物織物為神經(jīng)修復(fù)的無(wú)縫合方法提供了另一種選擇，由此例如將神經(jīng)末端裝入含有本發(fā)明的生物織物的管狀假體裝置中，因此將切斷的末端靠得很近以便再生。
5.4.2.4泌尿?qū)W本發(fā)明的膠原生物織物在矯正尿失禁中具有特別的效用。尿失禁是由于尿道不能在儲(chǔ)尿期間保持關(guān)閉而造成的。該原因可以是外在的，例如尿道和膀胱頸的差的解剖學(xué)支持導(dǎo)致失禁，和對(duì)于骨盆底重懸作出響應(yīng)。尿道失效可選擇地也可以是內(nèi)在的，即弱的尿道功能。在傳統(tǒng)上，尿失禁通過(guò)使用膨脹劑如膠原、脂肪、硅氧烷來(lái)矯正(見(jiàn)綜述Lightner，2002，Current Opinionin Urology，12(4)333-8)。本發(fā)明的膠原生物織物相對(duì)于本領(lǐng)域中所述膨脹劑來(lái)說(shuō)具有增強(qiáng)的效用，即增強(qiáng)了自控能力。此外，本發(fā)明的膠原生物織物還具有增強(qiáng)的治療效用，例如減少局部的并發(fā)癥、減少尿道感染、無(wú)宿主反應(yīng)、可靠的耐久性和更高的安全性。
本發(fā)明的膠原生物織物在矯正尿失禁中的效用部分地是由于此處描述的膠原生物織物獨(dú)特的物理特性，特別是其無(wú)免疫原性。在一些實(shí)施方案，將膠原生物織物用作植入物，例如尿道植入物。雖然不想被任何特殊的理論所束縛，但是本發(fā)明的膠原生物織物可能通過(guò)增加尿道閉合壓力和對(duì)于尿液被動(dòng)流出的抗性而具有增強(qiáng)的治療效用。
5.4.2.5矯形學(xué)本發(fā)明的膠原生物織物可以在矯形外科程序中使用。在某些實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用于矯形缺陷，例如后天或先天缺陷。由于外傷或者骨腫瘤的外科恢復(fù)引起的局部缺陷的重建是矯形外科或頜面外科中的主要問(wèn)題。通常地，已經(jīng)使用了合成的骨替代物或膠原膜，這部分是由于它們的誘導(dǎo)骨生成的活性(見(jiàn)例如，Rao等人，1995，J.Biomater.Sci.Polymer Edn.7(7)623-45)?？墒?，常見(jiàn)的問(wèn)題是由于植入的材料造成的全身性感染?？墒?，本發(fā)明的膠原生物織物比本領(lǐng)域中所使用的材料是有利的，這特別是由于其作為用于矯形缺陷的骨替代物的低免疫原性。在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物可以用作用于重建腱、韌帶和軟骨的假體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的膠原生物織物可以用作作為骨替代物的假體。
5.4.2.6心血管外科本發(fā)明的膠原生物織物可以在心血管外科程序中使用，例如用作假體以用于構(gòu)建大和小血管；用于修復(fù)先天性血管畸形和有病的瓣膜。
本發(fā)明的生物織物特別可用作血管外科中的移植物，例如靜脈或動(dòng)脈移植物。生物織物在血管外科中的效用部分地是由于其無(wú)毒性；無(wú)免疫原性；穩(wěn)定性；容易操作；抗凝血酶原的特性；最小的血管壁移植孔隙度；在多種大小的可用性；材料的再生產(chǎn)性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物織物可以用作瓣膜替代物。
5.4.2.7藥物遞送本發(fā)明的膠原生物織物可以用作用于藥物例如治療劑的可控遞送的藥物遞送載體。在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物遞送一種或多種治療劑給受試者，優(yōu)選為人。包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的治療劑為蛋白質(zhì)、肽、多糖、多糖綴合物、基于遺傳的疫苗、減毒活疫苗、完整的細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中使用的藥物的非限制性例子為抗生素、抗癌劑、抗菌劑、抗病毒劑、疫苗、麻醉劑、鎮(zhèn)痛藥、抗哮喘劑、抗炎劑、抗抑郁劑、抗關(guān)節(jié)炎劑、抗糖尿病劑、抗精神病藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激劑、激素、免疫抑制劑、肌肉松弛劑、前列腺素。
膠原生物織物可以用作用于向受試者優(yōu)選為人可控遞送一種或多種小分子的遞送載體。在一些實(shí)施方案中，膠原生物織物遞送一種或多種小分子給受試者，優(yōu)選為人。在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“小分子”和類(lèi)似的術(shù)語(yǔ)包括肽、肽模擬物、氨基酸、氨基酸類(lèi)似物、多核苷酸、多核苷酸類(lèi)似物、核苷酸、核苷酸類(lèi)似物、具有低于大約10,000克/摩爾的分子量的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物(即包括雜有機(jī)化合物和有機(jī)金屬化合物)、具有低于大約5,000克/摩爾的分子量的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、具有低于大約1,000克/摩爾的分子量的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、具有低于大約500克/摩爾的分子量的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、具有低于大約100克/摩爾的分子量的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，以及這樣的化合物的鹽、酯和其他藥物上可接受的形式，但并不局限于此。還包括了這樣的化合物的鹽、酯和其他藥物上可接受的形式。
在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于本領(lǐng)域中已知的其他藥物遞送系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的膠原生物織物用作用于藥物遞送的載體導(dǎo)致藥物的增強(qiáng)的吸收；改善的藥物動(dòng)力學(xué)特性；和藥物的全身性分布。改善的藥物動(dòng)力學(xué)表示，當(dāng)例如用標(biāo)準(zhǔn)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量時(shí)獲得了藥物動(dòng)力學(xué)特性的增強(qiáng)，例如達(dá)到最大血漿濃度的時(shí)間(Tmax)；最大血漿濃度的數(shù)量(Cmax)；引起可檢測(cè)的血液或血漿濃度的時(shí)間(Tlag)。增強(qiáng)的吸收表示，當(dāng)用這樣的參數(shù)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，藥物的吸收得到了改善。藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)量按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。
6.實(shí)施例6.1生產(chǎn)膠原生物織物的方法材料下面的材料用于制備膠原生物織物。
材料/設(shè)備·分娩記錄的復(fù)本·材料/家族健康史/知情同意的復(fù)本·來(lái)源條形碼標(biāo)記(供體ID號(hào))·收集#(將連續(xù)的號(hào)分配給收入的材料)·組織處理記錄(文件ID#ANT-19F)；保留每個(gè)批號(hào)的處理的詳細(xì)記錄·人胎盤(pán)(在處理開(kāi)始時(shí)小于48小時(shí)的存放時(shí)間)·無(wú)菌的外科夾子/止血鉗·無(wú)菌的剪刀·無(wú)菌的解剖刀·無(wú)菌的細(xì)胞刮刀(Nalgene NUNC Int.R0896)·無(wú)菌的紗布(非無(wú)菌的PSS 4416，滅菌)·無(wú)菌的漂洗不銹鋼托盤(pán)·消毒的處理不銹鋼托盤(pán)·消毒的塑料箱·無(wú)菌0.9％NaCl溶液(Baxter 2F7124)·無(wú)菌水(Milli Q plus 09195或Baxter 2F7113)·無(wú)菌的樣品容器(VWR 15704-014)·個(gè)人防護(hù)設(shè)備(包括無(wú)菌的或非無(wú)菌的手套)·具有證明書(shū)的潔凈室·事先制備的去細(xì)胞化溶液(D-細(xì)胞)；0.01-1％一水合脫氧膽酸鈉·消毒的箱·搖動(dòng)平臺(tái)(VWR 100型)
·記時(shí)器(VWR 21376890)·消毒的塑料架網(wǎng)·PVC包裹膜·真空泵(Schuco-Vac 5711-130)·凝膠干燥器(即熱干燥器；BioRad 583型)·消毒的不銹鋼切割板·用于包裝的袋·無(wú)菌的不銹鋼尺(General Tools MFG.Co 1201)·可追蹤的數(shù)字溫度計(jì)(61161-364型，Control公司)·Accu-Seal自動(dòng)密封器(Accu-Seal，630-1B6型)在生育時(shí)對(duì)孕婦進(jìn)行篩選以檢查傳染病，例如HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和其他病毒，以及其他會(huì)污染待收集的胎盤(pán)組織的病原體。只使用從這樣的供體中收集得到的組織來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的膠原生物織物，即其母親經(jīng)檢測(cè)對(duì)于上面提及的病原體呈陰性或者無(wú)反應(yīng)性。
在正常生育之后，胎盤(pán)、臍帶和臍帶血自然地從收縮的子宮中排出。在生育之后收集胎盤(pán)、臍帶和臍帶血。將這些材料轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，在那兒它們?cè)诰哂蠬EPA過(guò)濾系統(tǒng)的潔凈室中于無(wú)菌條件下進(jìn)行處理，HEPA過(guò)濾系統(tǒng)在處理之前開(kāi)啟至少1小時(shí)。在操作產(chǎn)品時(shí)總是戴上手套(無(wú)菌的或非無(wú)菌的，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候)。一旦可以實(shí)施的時(shí)候就處置掉所有的羊膜/絨毛膜的未使用(多余)部分和在組織處理期間產(chǎn)生的污染液體。
步驟I用無(wú)菌的Steri-Wrap片設(shè)置出一個(gè)無(wú)菌場(chǎng)地，并將下列用于處理的器械和附件放置在該場(chǎng)地上。
·無(wú)菌的托盤(pán)包·無(wú)菌的細(xì)胞刮刀·無(wú)菌的解剖刀·消毒的處理托盤(pán)在處理記錄中記錄下無(wú)菌包ID#。
從轉(zhuǎn)移容器中取出胎盤(pán)，并置于消毒的不銹鋼托盤(pán)上。用外科夾子和剪刀從胎盤(pán)上剪下大約2英寸的臍帶。將臍帶置于單獨(dú)的無(wú)菌容器中以用于進(jìn)一步的處理。容器用組織ID條形碼進(jìn)行標(biāo)記；和鑒定材料和貯存溶液的存在(例如介質(zhì)的類(lèi)型)。在一些情況下，如果不需要用于其他計(jì)劃，則丟棄臍帶。
從胎盤(pán)膜的邊緣開(kāi)始，通過(guò)使用手指的鈍器解剖來(lái)分離羊膜和絨毛膜。這一操作在切割膜之前進(jìn)行。
在將羊膜與絨毛膜和胎盤(pán)的整個(gè)表面分離之后，用剪刀環(huán)繞臍帶殘端切割羊膜，并將羊膜與胎盤(pán)分開(kāi)。在一些情況下，如果不撕裂組織就不可能分離羊膜和絨毛膜，將羊膜和絨毛膜作為一塊從胎盤(pán)上切割下來(lái)，然后將它們剝離開(kāi)。
將絨毛膜置于單獨(dú)的樣品容器中，以便用于其他計(jì)劃。容器用組織ID條形碼進(jìn)行標(biāo)記，鑒定材料和貯存溶液的存在(例如介質(zhì)的類(lèi)型)，標(biāo)上首字母縮寫(xiě)和標(biāo)上日期。
如果羊膜片仍然粘附在胎盤(pán)上，將其從胎盤(pán)上剝離，并用剪刀環(huán)繞臍帶切割下來(lái)。將胎盤(pán)放回轉(zhuǎn)移容器中以用于其他計(jì)劃。
在組織處理記錄中記錄下適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。
羊膜用無(wú)菌0.9％NaCl溶液保持在托盤(pán)中。優(yōu)選地，在處理的下一個(gè)步驟之前，將羊膜從分娩的時(shí)候起通過(guò)冷藏貯存最多72小時(shí)。
步驟II從樣品容器中一次取出一片羊膜，并置于消毒的不銹鋼托盤(pán)上。將其他片置于單獨(dú)的注滿無(wú)菌水的無(wú)菌不銹鋼托盤(pán)中，直至準(zhǔn)備對(duì)它們進(jìn)行清潔。從處理托盤(pán)上移去多余的羊膜片，并置于單獨(dú)的注滿無(wú)菌水的漂洗不銹鋼托盤(pán)中。
如果被血液、母體或胎兒液體/材料嚴(yán)重污染，則用無(wú)菌水漂洗羊膜，并在需要時(shí)更換無(wú)菌水。
將羊膜置于處理托盤(pán)上，并保持母體側(cè)朝上。用無(wú)菌的細(xì)胞刮刀從羊膜的母體側(cè)小心地去除盡可能多的可見(jiàn)污染物和細(xì)胞材料。(注意對(duì)于該步驟應(yīng)當(dāng)使用最小的壓力以防止撕裂膜)。使用無(wú)菌水來(lái)幫助去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。羊膜進(jìn)一步在單獨(dú)的無(wú)菌不銹鋼漂洗托盤(pán)中用無(wú)菌水漂洗。
將羊膜翻轉(zhuǎn)從而將胎兒側(cè)朝上，并將其放回處理托盤(pán)上，然后用無(wú)菌水漂洗。用細(xì)胞刮刀輕輕地去除可見(jiàn)的細(xì)胞材料和碎片(注意對(duì)于該步驟應(yīng)當(dāng)使用最小的壓力以防止撕裂膜)。使用無(wú)菌水來(lái)幫助去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
在單獨(dú)的無(wú)菌漂洗托盤(pán)中于兩個(gè)清潔循環(huán)之間用無(wú)菌水漂洗羊膜。以按需要一樣多的次數(shù)(清潔循環(huán)數(shù))來(lái)清潔組織，以便從膜的兩側(cè)去除大部分(如果不是全部)可見(jiàn)的細(xì)胞材料和碎片。在兩次漂洗之間更換漂洗托盤(pán)中的無(wú)菌水。
在每次清潔循環(huán)之后用無(wú)菌水漂洗處理托盤(pán)。
所有其他的羊膜片以同樣的方式進(jìn)行處理，并置于同一個(gè)容器中。貼上組織ID條形碼，鑒定材料和貯存溶液的存在(例如介質(zhì)的類(lèi)型)，加上首字母縮寫(xiě)和日期。
在組織處理記錄中記錄下適當(dāng)?shù)男畔⒑腿掌凇?br> 步驟III從漂洗托盤(pán)中(或者從貯存容器中)取出羊膜，用手指輕輕地?cái)D壓出過(guò)量的液體，并將膜置于無(wú)菌樣品容器中。容器用D-細(xì)胞溶液裝滿至150ml標(biāo)線，并保證覆蓋住所有的羊膜和關(guān)閉了容器。
將容器置于搖動(dòng)平臺(tái)上的箱中。開(kāi)啟搖動(dòng)平臺(tái)，并讓膜于設(shè)置#6在D-細(xì)胞溶液中搖動(dòng)至少15分鐘和至多120分鐘。
以步驟I中同樣的方式用新的無(wú)菌設(shè)備和消毒的托盤(pán)設(shè)置出一個(gè)新的無(wú)菌場(chǎng)地。在處理記錄中記錄下無(wú)菌包ID#。
在完成搖動(dòng)之后，關(guān)閉搖動(dòng)平臺(tái)，并從容器中取出膜。將膜置于新的不銹鋼處理托盤(pán)中，加入無(wú)菌0.9％NaCl溶液以覆蓋托盤(pán)的底部。
用新的無(wú)菌細(xì)胞刮刀從組織的兩側(cè)去除殘留的D-細(xì)胞和細(xì)胞材料(如果有的話)。該步驟以按需要一樣多的次數(shù)進(jìn)行重復(fù)以便從兩側(cè)的整個(gè)表面上去除盡可能多的可見(jiàn)的殘留細(xì)胞材料。于兩個(gè)清潔循環(huán)之間在單獨(dú)的漂洗托盤(pán)中用無(wú)菌0.9％NaCl溶液漂洗膜。在兩次漂洗之間更換漂洗托盤(pán)中的無(wú)菌0.9％NaCl溶液。
在最后的清潔循環(huán)完成之后，膜用無(wú)菌0.9％NaCl溶液進(jìn)行漂洗，并置于新的注滿無(wú)菌0.9％NaCl溶液的無(wú)菌樣品容器中。
所有余下的羊膜片以完全一樣的方式進(jìn)行處理。
當(dāng)所有羊膜片都進(jìn)行了處理并置于含有無(wú)菌0.9％NaCl溶液的容器中時(shí)，將容器置于搖動(dòng)平臺(tái)上的箱中，以便于設(shè)置#6搖動(dòng)至少5分鐘。在搖動(dòng)完成之后，從樣品容器中取出膜，更換容器中的無(wú)菌0.9％NaCl溶液，和將膜放回樣品容器中。
樣品容器用組織ID條形碼和檢疫標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。鑒定材料和貯存溶液的存在(例如介質(zhì)的類(lèi)型)，標(biāo)上首字母縮寫(xiě)和標(biāo)上日期。將樣品容器置于潔凈的拉鏈鎖袋中，并置于冰箱(2-8℃)中。
在組織處理記錄中記錄下所有適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。
當(dāng)血清學(xué)結(jié)果顯示可用時(shí)，在檢疫標(biāo)簽之上放上適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽(血清學(xué)陰性或僅供研究使用)，并將那些容器與經(jīng)檢驗(yàn)的分開(kāi)。
步驟IV在用步驟IV進(jìn)行處理之前，檢查組織狀態(tài)檢驗(yàn)以確保所有可應(yīng)用的檢測(cè)結(jié)果都是陰性的。
以步驟II和III中同樣的方式用無(wú)菌的Steri-Wrap片設(shè)置出一個(gè)無(wú)菌場(chǎng)地，并放置好所有無(wú)菌和消毒的器械和附件。
從冰箱中取出膜，并置于新的無(wú)菌不銹鋼處理托盤(pán)中。加入無(wú)菌0.9％NaCl溶液以覆蓋托盤(pán)的底部。
用新的無(wú)菌細(xì)胞刮刀輕輕地去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和碎片(如果有的話)(注意對(duì)于該步驟應(yīng)當(dāng)使用最小的壓力以防止撕裂膜)。使用無(wú)菌0.9％NaCl溶液來(lái)幫助去除細(xì)胞和碎片。
在單獨(dú)的注滿無(wú)菌0.9％NaCl溶液的無(wú)菌不銹鋼漂洗托盤(pán)中漂洗膜。在兩次清潔循環(huán)之間更換0.9％NaCl溶液。將膜置于新的無(wú)菌樣品容器中，容器用新鮮的無(wú)菌0.9％NaCl溶液注滿，并置于搖動(dòng)平臺(tái)上以便于設(shè)置#6搖動(dòng)至少5分鐘。
前述步驟重復(fù)3次，并在每次搖動(dòng)之間更換無(wú)菌0.9％NaCl溶液。在組織處理記錄中記錄下適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。
從樣品容器中一次取出一片膜，用手指輕輕地?cái)D壓出過(guò)量的液體，并將膜置于無(wú)菌處理托盤(pán)上。輕輕地將膜進(jìn)行伸展直至其變平；并保證其胎兒側(cè)朝下。
框架通過(guò)用無(wú)菌剪刀切割消毒的塑料片來(lái)制備?？蚣艿拇笮?yīng)當(dāng)在每個(gè)方向上比膜部分小大約0.5cm。在注滿無(wú)菌0.9％NaCl溶液的漂洗托盤(pán)中漂洗框架。
將框架置于稍微伸展的膜表面上，并輕輕地在上面進(jìn)行按壓。必要的是將塑料框架的光滑的一側(cè)朝向組織。
用解剖刀環(huán)繞框架切割膜，并保留大約0.5cm伸展至框架邊緣之外。多余的膜放回樣品容器中。
用夾子或鑷子將伸展至框架之外的膜邊緣包裹住框架的邊緣，并暫時(shí)放在同一個(gè)托盤(pán)中備用。
下一片膜以同樣的方式進(jìn)行處理。重要的是，將要進(jìn)行干燥的總區(qū)域不要超過(guò)300cm2/熱干燥器。在“架開(kāi)”這一片膜的同時(shí)，未上架的片應(yīng)當(dāng)保持在容器中的無(wú)菌0.9％NaCl溶液中。
設(shè)置干燥器的干燥溫度，并使用采用擴(kuò)展性探針的經(jīng)校準(zhǔn)的數(shù)字溫度計(jì)來(lái)進(jìn)行校驗(yàn)。將干燥溫度設(shè)置于50℃。在組織處理記錄中記錄下數(shù)據(jù)。
開(kāi)啟真空泵。
將無(wú)菌紗布置于熱干燥器的干燥平臺(tái)上，覆蓋住比架開(kāi)的膜的區(qū)域稍大的區(qū)域。重要的是確保紗布層的總厚度不超過(guò)一個(gè)折疊成4×4的紗布的厚度。
將一片塑料架網(wǎng)置于紗布之上。塑料網(wǎng)的邊緣應(yīng)當(dāng)伸展出紗布邊緣大約0.5-1.0cm。
將架開(kāi)的膜輕輕地提起，并置于位于塑料網(wǎng)之上的熱干燥器平臺(tái)上，同時(shí)保持膜一側(cè)朝上。重復(fù)該步驟直至將最大數(shù)量的膜(不超過(guò)300cm2)置于熱干燥平臺(tái)上。(注意羊膜的胎兒側(cè)朝上)。
將一片PVC包裹膜切割成足夠的大小以覆蓋熱干燥器的整個(gè)干燥平臺(tái)還加上額外的腳。
在真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)的同時(shí)，用塑料膜輕輕地覆蓋熱干燥器的整個(gè)干燥平臺(tái)，并在兩側(cè)讓1/2的腳伸展出干燥平臺(tái)邊緣之外。要注意的是，膜緊緊地拉在膜和框架片之上(即其被真空“吸進(jìn)去了”)，而且沒(méi)有漏氣和在組織區(qū)域上沒(méi)有起皺紋。隨后關(guān)閉蓋子。
將真空泵設(shè)置為大約-22英寸Hg的真空。在2-3分鐘的干燥循環(huán)之后記錄泵表的數(shù)值。將膜進(jìn)行熱-真空干燥大約60分鐘。干燥過(guò)程中大約15-30分鐘，在熱干燥器中放置上一層新的無(wú)菌紗布。紗布層的總厚度一定不能超過(guò)一個(gè)折疊成4×4的紗布的厚度。
在改變之后，要注意的是，塑料膜緊緊地拉在膜和框架片之上，而且沒(méi)有漏氣和在膜區(qū)域上沒(méi)有起皺紋。
真空密封的完整性通過(guò)檢查泵壓?jiǎn)斡?jì)量表而定時(shí)進(jìn)行檢查。在完成干燥處理之后，打開(kāi)熱干燥器，在泵運(yùn)轉(zhuǎn)的同時(shí)讓膜冷卻大約2分鐘。
用無(wú)菌的Steri-Wrap和位于其下的消毒的不銹鋼切割板設(shè)置出一個(gè)新的無(wú)菌場(chǎng)地。在這一點(diǎn)上使用無(wú)菌的手套。在泵仍在運(yùn)轉(zhuǎn)的同時(shí)，從邊角上開(kāi)始輕輕地從膜片上去除塑料膜，并用戴著手套的手壓住膜片。將框架與膜一起輕輕地提離干燥平臺(tái)，并置于位于消毒的不銹鋼切割板之上的無(wú)菌場(chǎng)地上，同時(shí)讓膜一側(cè)朝上。用解剖刀通過(guò)沿著離框架邊緣1-2mm的邊緣形成切口而對(duì)膜片進(jìn)行切割。用戴著手套(無(wú)菌手套)的手將膜保持在原處。通過(guò)將膜片緩慢地剝離而將其輕輕地提離框架，然后置于切割板之上的無(wú)菌場(chǎng)地上。
用解剖刀或鋒利的剪刀將膜片切割成指定尺寸的片段。在包裝之前，在無(wú)菌的場(chǎng)地上切割所有的片并進(jìn)行妥善保管。用一只手(無(wú)菌的)將單片的膜置于內(nèi)部的揭片袋包裝中，同時(shí)用另一只手(非無(wú)菌的)拿住袋子。要注意的是不要用“無(wú)菌的”手接觸袋子。在將所有的片置于內(nèi)袋中之后，將它們密封。在袋子外部的指定區(qū)域中貼上具有適當(dāng)?shù)男畔?例如部分#、批#等等)的標(biāo)簽。所有的膜片以同樣的方式進(jìn)行處理。將經(jīng)標(biāo)記和密封的揭片袋包放置于防水的拉鏈鎖袋中進(jìn)行貯存，直至準(zhǔn)備將它們運(yùn)送到滅菌設(shè)備或分配器中。在組織處理記錄中記錄下所有適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)。
6.2膠原生物織物的水化/可縫合性的評(píng)價(jià)為了獲得關(guān)于本發(fā)明生物織物的外科操作、水化期和可縫合性的定性和定量的反饋，將根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的羊膜樣品提供給四位富有經(jīng)驗(yàn)的、非常知名的眼表面外科醫(yī)生以進(jìn)行評(píng)價(jià)。樣品由外科醫(yī)生通過(guò)下列方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，即在豬眼試樣上施行組織移植以確定本發(fā)明生物織物的外科操作特性和可縫合性。
每個(gè)外科醫(yī)生可能使用下列的方法(1)將生物織物在干燥的狀況下進(jìn)行切割以適合豬眼的單個(gè)象限；(2)將切割出的生物織物置于豬眼的表面上；(3)在豬眼上用無(wú)菌的鹽溶液將生物織物進(jìn)行水化而讓移植物進(jìn)行活化即再水化，其水化期時(shí)間為2、5、10和20分鐘；(4)將生物織物通過(guò)幾個(gè)9-0Vicryl縫合咬合而縫合到豬眼的上皮上；和(5)外科醫(yī)生作出關(guān)于經(jīng)水化的羊膜的組織品質(zhì)、一致性和可縫合性的定性評(píng)注。
等同方案不是要用此處描述的特殊實(shí)施方案來(lái)限制本發(fā)明的范圍。事實(shí)上，從前面的描述和附圖中，除了所述的那些之外的本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。這種修飾將會(huì)落在附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
此處引用了多種出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，它們的公開(kāi)內(nèi)容以其整體進(jìn)行引用作為參考。
權(quán)利要求
1.從具有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)制備膠原生物織物的方法，包括(a)分離羊膜和絨毛膜；和(b)將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化，以致羊膜不與酶接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括洗滌和干燥去細(xì)胞化的羊膜。
3.權(quán)利要求1的方法，其中胎盤(pán)為人胎盤(pán)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中胎盤(pán)來(lái)自經(jīng)歷了剖腹產(chǎn)術(shù)分娩或者自然分娩的女性人類(lèi)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該方法另外包括確定胎盤(pán)膜來(lái)自已經(jīng)檢測(cè)了至少一種傳染病的供體的步驟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中供體為女性人類(lèi)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中胎盤(pán)在生育的48小時(shí)之內(nèi)提供。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該方法另外包括在步驟(a)之后和步驟(b)之前將羊膜貯存直至72小時(shí)的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述貯存包括將在步驟(a)中獲得的羊膜冷藏直至5天。
10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中的羊膜的去細(xì)胞化包括從羊膜上去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片。
11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中的羊膜的去細(xì)胞化包括從羊膜的母體側(cè)和羊膜的胎兒側(cè)去除所有可見(jiàn)的細(xì)胞材料和細(xì)胞碎片。
12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中的羊膜的去細(xì)胞化包括物理性刮削所述的膜。
13.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中的羊膜的去細(xì)胞化包括用含有去污劑的溶液將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化。
14.權(quán)利要求13的方法，其中含有去污劑的溶液為含有0.01-1.0％一水合脫氧膽酸鈉的溶液。
15.權(quán)利要求13的方法，其中在含有去污劑的溶液中的去污劑選自非離子去污劑、Triton X-100、陰離子去污劑和十二烷基硫酸鈉或者其組合。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述的物理性刮削包括用細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮削。
17.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中的羊膜的去細(xì)胞化在無(wú)菌溶液中進(jìn)行。
18.權(quán)利要求2的方法，其中羊膜的洗滌在無(wú)菌溶液中進(jìn)行。
19.權(quán)利要求2的方法，其中去細(xì)胞化的羊膜的干燥于大約35℃-大約50℃的溫度進(jìn)行。
20.從具有羊膜和絨毛膜的胎盤(pán)制備羊膜層壓制品的方法，其包括(a)分離羊膜和絨毛膜；(b)將羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化；和(c)將至少兩層去細(xì)胞化的羊膜以相互接觸的方式層疊在一起，從而形成羊膜層壓制品。
21.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(b)之后和步驟(c)之前洗滌去細(xì)胞化的羊膜至少一次。
22.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)一步包括干燥去細(xì)胞化的羊膜層壓制品。
23.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)一步包括將至少兩層所述的羊膜層壓制品裝配成復(fù)雜的三維支架。
24.含有脫水的、去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的羊膜的膠原生物織物，其中所述的羊膜具有天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。
25.去細(xì)胞化的且無(wú)基質(zhì)的膠原生物織物，其含有膠原、彈性蛋白和纖連蛋白。
26.用權(quán)利要求1的方法制備得到的膠原生物織物。
27.權(quán)利要求24的膠原生物織物，其中羊膜為人羊膜。
28.權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物，其中生物織物的厚度為大約10-40微米。
29.權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物，其中生物織物進(jìn)一步用一種或多種生物分子進(jìn)行浸漬。
30.權(quán)利要求29的膠原生物織物，其中生物分子選自抗生素、激素、生長(zhǎng)因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、疼痛藥物、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染劑、傷口愈合劑、傷口封閉劑、細(xì)胞吸引劑和支架試劑。
31.權(quán)利要求29的膠原生物織物，其中生物織物進(jìn)一步用一種或多種小分子進(jìn)行浸漬。
32.權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物，其中進(jìn)一步在生物織物上移植細(xì)胞，從而所述細(xì)胞是均一的和匯合的。
33.權(quán)利要求32的膠原生物織物，其中細(xì)胞為人干細(xì)胞或人分化的成熟細(xì)胞。
34.權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物，其進(jìn)一步含有一種或多種治療劑。
35.權(quán)利要求34的膠原生物織物，其中所述的治療劑選自激素、多肽、抗生素、抗真菌劑和酶。
36.權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物，其進(jìn)一步含有一種或多種水凝膠組合物。
37.權(quán)利要求36的膠原生物織物，其中水凝膠組合物含有選自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、葡聚糖和其衍生物或類(lèi)似物的聚合物。
38.含有權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的三維支架。
39.權(quán)利要求38的三維支架，其中支架為管。
40.權(quán)利要求38的三維支架，其進(jìn)一步含有一種或多種水凝膠組合物。
41.權(quán)利要求40的三維支架，其中水凝膠組合物含有選自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、葡聚糖和其衍生物或類(lèi)似物的聚合物。
42.用權(quán)利要求20的方法產(chǎn)生出的羊膜層壓制品。
43.含有至少兩層權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的羊膜層壓制品。
44.含有權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的羊膜層壓制品。
45.權(quán)利要求42-44中任何一項(xiàng)的羊膜層壓制品，其進(jìn)一步含有一種或多種水凝膠組合物。
46.權(quán)利要求45的羊膜層壓制品，其中水凝膠組合物含有選自聚乙烯醇、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、葡聚糖和其衍生物或類(lèi)似物的聚合物。
47.含有權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的外科移植物。
48.在外科程序中使用權(quán)利要求47的外科移植物的方法，其中所述的外科移植物直接應(yīng)用于受試者的外科部位。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的外科部位選自眼、皮膚、腹部的漿膜面、胸腔的漿膜面、漿膜心包、口腔的粘膜面、鼻腔的粘膜面、呼吸道的表面、胃腸道的表面、泌尿生殖道的表面。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述的外科移植物應(yīng)用于受試者身體的內(nèi)部部位。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述的外科移植物應(yīng)用于受試者身體的外部部位。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述的受試者為人。
53.在受試者中治療和/或預(yù)防眼病的方法，其包括將權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物置于受試者的患病的眼表面上。
54.權(quán)利要求53的方法，其中眼病選自潰瘍/穿孔、大泡性角膜病變、眼部皮樣囊腫/腫瘤、原發(fā)性翼狀胬肉、持續(xù)性角膜上皮缺損、急性和慢性堿灼傷、熱灼傷、無(wú)虹膜、特應(yīng)性角膜炎、特發(fā)性邊緣干細(xì)胞缺乏、角膜翳、新血管生成、類(lèi)風(fēng)濕性角膜融化、眼瘢痕性類(lèi)天皰瘡、滲漏性濾過(guò)性水泡、暴露的Ahmed瓣膜管、具有隨后的瞼球粘連的沙雷氏菌蜂窩組織炎、急性和慢性Stevenson Johnson綜合征。
55.在外科程序中使用權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的方法，其中外科程序選自眼外科、心血管外科、牙周外科、神經(jīng)外科、牙外科和矯形外科。
56.在受試者中矯正尿失禁之中使用權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的方法。
57.將治療劑遞送給受試者的方法，其包括使權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物與受試者接觸。
58.權(quán)利要求56或57的方法，其中受試者為人。
59.權(quán)利要求57的方法，其中治療劑選自抗生素、抗癌劑、抗菌劑、抗病毒劑、疫苗、麻醉劑、鎮(zhèn)痛藥、抗哮喘劑、抗炎劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑、抗精神病藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激劑、激素、免疫抑制劑、肌肉松弛劑、前列腺素。
60.使用權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物的方法，其中膠原生物織物的制備時(shí)間包括膠原生物織物的水化。
61.權(quán)利要求60的方法，其中生物織物的水化包括用無(wú)菌鹽溶液進(jìn)行水化。
62.權(quán)利要求60的方法，其中生物織物在使用之前水化至少2分鐘。
63.使用羊膜層壓制品的方法，其進(jìn)一步包括在層壓制品上移植活細(xì)胞。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述的活細(xì)胞選自成熟組織細(xì)胞和干細(xì)胞。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述的干細(xì)胞為全能性的。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述的干細(xì)胞為多能性的。
67.權(quán)利要求64的方法，其中所述的干細(xì)胞為組織特異性的。
68.在受試者中處理或預(yù)防皮膚狀況的方法，其包括使權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物與所述的皮膚狀況接觸。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述的皮膚狀況選自皮膚損傷、皺紋、細(xì)紋、皮膚變薄、降低的皮膚彈性、粗糙的皮膚、痤瘡瘢痕、眉間溝、切除性瘢痕、軟組織缺損、先天的皮膚狀況、變性的皮膚狀況、VII型膠原缺乏和陽(yáng)光損害的皮膚。
70.權(quán)利要求68的方法，其進(jìn)一步包括向受試者施用一種或多種治療劑以處理皮膚狀況。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述的一種或多種治療劑選自維生素、礦物質(zhì)、基于兒茶素的制劑和葡糖胺。
72.在受試者中治療傷口的方法，其包括使權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物與所述的傷口接觸。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述的傷口選自表皮傷口、皮膚傷口、壓力性潰瘍、慢性傷口、急性傷口、外部傷口、內(nèi)部傷口、先天性傷口、燒傷傷口、外科傷口和傷口感染。
74.在受試者中治療燒傷的方法，其包括使權(quán)利要求24-26中任何一項(xiàng)的膠原生物織物與所述的燒傷接觸。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述的燒傷選自一度燒傷、二度燒傷、三度燒傷、感染的燒傷傷口和燒傷傷口膿皰病。
76.權(quán)利要求68、72或74的方法，其中受試者為人。
全文摘要
本發(fā)明涉及從羊膜制得的膠原膜，此處稱(chēng)為膠原生物織物。本發(fā)明的膠原生物織物具有天然的未處理的羊膜的結(jié)構(gòu)完整性，即天然的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)羊膜進(jìn)行去細(xì)胞化而從胎盤(pán)膜制備膠原生物織物的方法，優(yōu)選地從具有絨毛膜和羊膜的人胎盤(pán)膜制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，羊膜完全地進(jìn)行去細(xì)胞化。本發(fā)明的膠原生物織物在內(nèi)科和外科領(lǐng)域有著許多的應(yīng)用，包括例如血管修復(fù)、血管的構(gòu)建和替換、腱和韌帶的替換、創(chuàng)傷敷裹、外科移植物、眼科用途、縫合等等。該生物織物的優(yōu)點(diǎn)部分地是由于其物理特性，例如生物機(jī)械強(qiáng)度、屈曲性、可縫合性和低免疫原性，特別是當(dāng)其來(lái)源自人胎盤(pán)時(shí)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1791331SQ03812096
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者R·J·哈里里, A·M·卡普魯諾維斯基, P·A·墨菲 申請(qǐng)人:人類(lèi)起源公司