專利名稱：提取自螺旋藻的新的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的硫脂、其制備方法,含有其的組合物及其作為hiv病 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從螺旋藻中提取的新的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的硫脂、獲得所述硫脂的方法、含有所述硫脂的組合物、所述硫脂作為人類免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2的抑制物的用途和含有所述硫脂的生物體。
背景技術(shù)：
糖脂廣泛分布于真核生物和原核生物中，并與其中的類囊體的膜相關(guān)。在藍(lán)細(xì)菌中，糖脂通常與異形細(xì)胞壁相關(guān)(1)。藍(lán)細(xì)菌例如螺旋藻含有四種類型的膜脂三種糖脂(兩種半乳糖脂和一種硫脂)和一種磷脂(磷脂酰甘油)。
一些研究結(jié)果顯示，這類糖脂具有抗炎、抗腫瘤或抗病毒活性(2)。Gustafson等人(3)已經(jīng)研究了從微藻類賴氏鞘絲藻(Lyngbyalagerheimil)和纖細(xì)席藻(Phormidium tenue)中提取得到的硫脂對HIV-1的抗病毒活性。該研究結(jié)果顯示，在四唑?qū)嶒?yàn)中純原核生物來源的硫脂具有抑制HIV-1的活性，并且在與合胞體形成及人淋巴細(xì)胞系蛋白質(zhì)P24相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中也具有所述活性。
最近Loya等人(4)指出，來自于偽枝藻屬(Scytonema sp.)、Oscillatoria trichoides、Oscillatoria raoi、沼澤顫藻(Oscillatoria limnetica)和纖細(xì)席藻的原核硫脂是HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的強(qiáng)效抑制物，所述逆轉(zhuǎn)錄酶被認(rèn)為是HIV生命周期中的關(guān)鍵酶。
逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，其具有DNA(脫氧核糖核酸)聚合酶和RNase-H(核糖核酸酶H)兩種酶活性。所述兩種酶活性負(fù)責(zé)將病毒基因組DNA轉(zhuǎn)變?yōu)樵《镜碾p鏈DNA。然后，后者從細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)入宿主細(xì)胞的核內(nèi)，進(jìn)而被整合入細(xì)胞的DNA中。抑制所述逆轉(zhuǎn)錄酶兩個催化功能能夠防止在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生病毒，因此該酶是尋找AIDS(獲得性免疫功能喪失綜合癥)治療方法的主要目標(biāo)之一。
在尋找AIDS治療方法的過程中，還對病毒感染的其他必需步驟的抑制也進(jìn)行了許多嘗試，所述步驟為-病毒與被感染細(xì)胞結(jié)合；-病毒膜與被感染細(xì)胞融合；-在整合酶的輔助下，原病毒DNA整合入宿主細(xì)胞的DNA中；-在病毒蛋白酶的作用下，病毒蛋白質(zhì)重塑而產(chǎn)生新的病毒。
為了盡可能控制感染的發(fā)展而對聯(lián)合用藥進(jìn)行了研究。
存在如下兩種類型的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物1)AZT(疊氮胸苷)型核苷抑制物ddI(雙脫氧肌苷)、ddC(雙脫氧胞苷)、3TC(雙脫氧硫代胞苷)、d4T(雙氫雙脫氧胸苷)、abacarir；2)非核苷抑制物硫脂和其他分子(奈韋拉平、依法韋侖等)。
被描述為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物的硫脂是從微藻類賴氏鞘絲藻和纖細(xì)席藻中提取得到的原核硫脂，其能夠抑制HIV-1的細(xì)胞病變效應(yīng)(3)，所述硫脂組合物在專利WO 91/02521中有所描述，C18/C16和C16/C16原核硫脂由Loya S.等人從Oscillatoria raoi、O.trichoides、沼澤顫藻、偽枝藻屬和纖細(xì)席藻中得到(21)。
硫脂也是螺旋藻的組分，而螺旋藻是對營養(yǎng)不良的兒童具有特殊營養(yǎng)價(jià)值的藍(lán)綠微藻類。螺旋藻富含具有營養(yǎng)價(jià)值和生物醫(yī)學(xué)價(jià)值的化合物，例如必需氨基酸、維生素(A、B12、E)或必需多元不飽和脂肪酸，其主要生長于干旱地帶許多熱帶湖的含鈉的水中。
所述微藻類屬于藍(lán)藻門(Phyllum cyanophyta)，藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostocales)，顫藻科(Oscillatoriaceae)，螺旋藻屬(Spirulina)或節(jié)旋藻屬(Arthrospira)。
也存在不同種的藻類，尤其是鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)和極大螺旋藻(Spirulina maxima)(Bourrelly P.，1970年，Les algues bleuesou cyanophycées(藍(lán)藻)，見《Les Algues d’eau douce(淡水藻類)》第三卷，N.Boubée出版)。
共同申請人在專利FR 2 768 744中描述了混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻的方法，該方法用來產(chǎn)生富含Ω-6-多元不飽和脂肪酸和/或硫脂的生物體。所述方法包括至少一個在亞油酸銨存在的條件下培養(yǎng)螺旋藻的步驟。

發(fā)明內(nèi)容
在從事研究的過程中，共同申請人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以從在油酸銨或棕櫚酸銨存在的條件下培養(yǎng)的螺旋藻的提取物中，分離得到原核型和真核型硫脂，所述硫脂具有更好的HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物活性。
在藍(lán)細(xì)菌類中，具體而言是在螺旋藻中，脂類(半乳糖脂、磷脂和硫脂)甘油骨架上脂肪酸的典型分布分別與1位和2位碳上酯化的C18和C16脂肪酸相對應(yīng)。這種分布形成了稱為“原核的”C18/C16和C16/16分子的特征，這些分子或多或少存在不飽和性。
在下文中，“原核型硫脂”(或“原核硫脂”)可理解為如分子式(I)所示的硫脂 其中，R1是C18不飽和脂肪酸基或者是C16飽和或不飽和脂肪酸基，R2是C16飽和或不飽和脂肪酸基；“真核型硫脂”(或“真核硫脂”)可理解為上述分子式所示的硫脂，其中R1和R2是相同的或者不同的C18不飽和脂肪酸，即C18/C18硫脂。
“飽和脂肪酸基”可理解為不含有雙鍵的烴鏈。
“不飽和脂肪酸基”可理解為含有一個或一個以上雙鍵的烴鏈，優(yōu)選含有1、2或3個雙鍵。
令人驚訝的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在螺旋藻培養(yǎng)基中補(bǔ)加油酸銨或棕櫚酸銨能夠改變總硫脂的組成，并增加如上所定義的真核型和原核型硫脂，從而提高硫脂對HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性，所述硫脂從補(bǔ)加的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的螺旋藻中提取得到。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種新的培養(yǎng)螺旋藻的方法，其中，在培養(yǎng)基中補(bǔ)加了油酸銨或棕櫚酸銨形式的外源性脂肪酸，以選擇性地增加特定種類的硫脂分子。
所述生物體被用于提取脂質(zhì)，然后各類脂質(zhì)被分離以收獲總硫脂，得到的總硫脂再被分成不同種類的硫脂分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述硫脂、含有所述硫脂的組合物、所述硫脂作為HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制物的用途及其在制備治療AIDS的藥物中的用途。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法可應(yīng)用于目前所有的螺旋藻株，尤其是那些在前引用的出版物中所描述的螺旋藻。所用的螺旋藻例如可選自以下藻株-鈍頂螺旋藻PCC 8005(Institut Pasteur，巴黎)-極大螺旋藻和特斯科科螺旋藻(Spirulina texcoco)(特斯科科，墨西哥)-Spirulina crater(Laboratoire La Roquette，法國)-螺旋藻8818(ENS，巴黎)螺旋藻在補(bǔ)加有亞油酸銨的培養(yǎng)基中生長得非常良好。螺旋藻吸收亞油酸銨形式的外源性亞油酸，以在其脂質(zhì)中合成γ-亞油酸，所述脂質(zhì)例如單半乳糖二?；视?MGDG)、二半乳糖二?；视?DGDG)、硫代異鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特定的培養(yǎng)條件有可能獲得特別富含能夠抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的硫脂的螺旋藻生物體，所述特定的培養(yǎng)條件即在優(yōu)選的溫度和光照條件下補(bǔ)加油酸銨或棕櫚酸銨。
所述螺旋藻生物體可在罐內(nèi)或無菌的光生物反應(yīng)器中生成。其中所用的合適的罐和光生物反應(yīng)器為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面涉及螺旋藻的混合營養(yǎng)培養(yǎng)方法，該方法用于產(chǎn)生富含能夠抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的硫脂的生物體，該方法包括至少一個在油酸銨或棕櫚酸銨存在的條件下培養(yǎng)螺旋藻的步驟。
在優(yōu)選的情況下，補(bǔ)加入培養(yǎng)基的油酸銨或棕櫚酸銨的濃度為35-75μmol/l(微摩爾每升)。
在有利的情況下，存在油酸銨或棕櫚酸銨的培養(yǎng)步驟中的溫度為20-30℃。在優(yōu)選的情況下，所述步驟中的光照條件為100-125μE/m2/s，且進(jìn)行8-12小時白光和16-12小時黑暗的24小時交替光照循環(huán)，其中優(yōu)選為12小時白光和12小時黑暗。
特別有利的用于產(chǎn)生富含能夠抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的硫脂的螺旋藻生物體的培養(yǎng)條件包括-每小時每升培養(yǎng)基中鼓入含1％(體積比)CO2的25-60L(升)空氣；-生長期間培養(yǎng)基的pH維持在8.5-10.5，優(yōu)選為9-10，以避免被不能在很強(qiáng)堿性的培養(yǎng)基中生長的其他微生物的污染。
-維持適合螺旋藻生長期間所需的最低濃度的碳酸氫根、磷酸根和硝酸根離子。
在一個有利的方面，所述方法包括如下步驟-在培養(yǎng)基中補(bǔ)加油酸銨或棕櫚酸銨，光照強(qiáng)度為75-100μE/m2/s，且進(jìn)行約8-12小時白光和約16-12小時黑暗的24小時交替光照循環(huán)，優(yōu)選為約12小時白光和約12小時黑暗，溫度維持在約30℃，維持上述條件48小時；-然后在24℃、光照強(qiáng)度為100-125μE/m2/s的條件下繼續(xù)維持48-72小時，且進(jìn)行約8-12小時白光和約16-12小時黑暗的24小時交替光照循環(huán)，優(yōu)選為約12小時白光和約12小時黑暗。
-然后在22℃、光照強(qiáng)度為100-125μE/m2/s的條件下繼續(xù)維持72-96小時，所述光照也可以在20℃維持達(dá)168小時(即7天)，且進(jìn)行約8-12小時白光和約16-12小時黑暗的24小時交替光照循環(huán)，優(yōu)選為約12小時白光和約12小時黑暗；可以選擇性地在補(bǔ)加油酸銨或棕櫚酸銨后的24-48小時內(nèi)，以每小時每升培養(yǎng)基25L的速率鼓入含1％CO2的空氣，在之后的48-96小時內(nèi)再以每小時每升培養(yǎng)基40-60L的速率鼓入含1％CO2的空氣。
本發(fā)明的最后的一個方面進(jìn)一步涉及富含硫脂的螺旋藻生物體，其中含有占總脂質(zhì)的至少40重量％的硫脂，所述硫脂具有抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。
所述包含在生物體中的硫脂為原核硫脂或真核硫脂。
在優(yōu)選的情況下，所述磷脂具有分子式(I)的結(jié)構(gòu) 其中，-R1是油?；?，R2是棕櫚?；?R1是亞油?；琑2是棕櫚?；?，或-R1是棕櫚酰基，R2是棕櫚?；?，或-R1是γ-亞麻?；琑2是棕櫚?；?，或-R1是γ-亞麻?；?，R2是棕櫚油?；?，或-R1是棕櫚油?；?，R2是棕櫚?；?。
根據(jù)以上定義的術(shù)語，這些硫脂是分子式(I)的硫脂，其中R1和R2的定義如下

其他有利的硫脂是分子式(I)的真核硫脂，其中R1是C18不飽和脂肪酸基，R2是C18不飽和脂肪酸基，所述基團(tuán)可以是相同的，也可以是不同的。
其中，有利的硫脂是那些符合分子式(I)的硫脂，其中-R1是油酰基，R2是亞油酰基，或-R1是亞油酰基，R2是油?；?R1是亞油?；?，R2是亞油?；?R1是油?；琑2是油?；?。
所述真核硫脂具有分子式(I)的結(jié)構(gòu)，其中R1和R2的定義如下

本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有如上定義的真核硫脂和/或原核硫脂的混合物，所述混合物也被稱為“總硫脂”。
在有利的情況下，通過不同種類硫脂分子的提取、分離和純化步驟，所述硫脂從上文所述的富含硫脂的螺旋藻生物體中分離出來，這也代表了本發(fā)明的另一個方面。
所述脂類化合物可以通過例如一些溶劑提取而得到，所述溶劑例如甲醇和氯仿。可以使用為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的技術(shù)來進(jìn)行分離操作，所述技術(shù)例如薄層色譜法或高效液相色譜法。優(yōu)選使用高效液相色譜法來分離各種不同種類的硫脂分子。
本發(fā)明的另一個方面涉及上文定義的分子式(I)的硫脂。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述硫脂或者上述富含原核和真核硫脂的螺旋藻生物體的提取物作為HIV-1或HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有所述硫脂以及藥用載體的藥物組合物，還涉及所述硫脂或富含硫脂的螺旋藻生物體的提取物在制備用于預(yù)防或治療AIDS的藥物中的用途。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例通過下列實(shí)施例來說明本發(fā)明，但這并非意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在外源性脂肪酸(油酸銨或棕櫚酸銨)存在的條件下培養(yǎng)螺旋藻，以產(chǎn)生富含硫脂的生物體。
所使用的螺旋藻株為鈍頂螺旋藻PC 8005(Institut Pasteur，法國巴黎)。
在油酸銨或棕櫚酸銨存在的條件下，在光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)富含硫脂的螺旋藻的方法a)鈍頂螺旋藻的繁殖如專利FR 2 767 744中的實(shí)施例3.1中所描述的方法，對該藻株進(jìn)行繁殖。
b)如專利FR 2 768 744中的實(shí)施例3.2)a)中所描述的步驟，在第一個光生物反應(yīng)器(容量為7L)中制備5L培養(yǎng)物。
c)從第一個光生物反應(yīng)器中取出4L培養(yǎng)物，然后用4L新鮮的Zarrouk無菌培養(yǎng)基(組成成分在專利FR 2 768 744中給出)補(bǔ)充所述光生物反應(yīng)器，以繼續(xù)制備另一批培養(yǎng)物。作為接種物，在無菌條件下將取出的4L培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入第二個7L的光生物反應(yīng)器中，之后的5-7天中在培養(yǎng)基中補(bǔ)加入35-75μmol/L的油酸銨或棕櫚酸銨，并以如下條件培養(yǎng)c.1)第一個步驟，其包含2個連續(xù)階段-階段1培養(yǎng)物在30℃、光照強(qiáng)度為75-100μE/m2/s的條件下維持48小時。在此期間，24小時的光照循環(huán)設(shè)置為約8-12小時白光/16-12小時黑暗。此外，必需降低鼓入含1％CO2空氣的速率，以每小時每升培養(yǎng)物25-35L空氣的速率維持24-48小時。振蕩速率維持在100-150mm(轉(zhuǎn)每分)。
-階段2將培養(yǎng)物在24℃和100-125μE/m2/s的更強(qiáng)的光照強(qiáng)度的條件下維持48小時。24小時光照循環(huán)為約8-12小時白光/16-12小時黑暗。增加鼓入含1％CO2空氣的速率，以每小時每升培養(yǎng)物40-50L含1％CO2空氣的速率維持48-72小時。振蕩速率維持在約100-150rpm。
c.2)在第二個步驟中，培養(yǎng)溫度降至20-22℃，光照強(qiáng)度為100-125μE/m2/s。24小時光照循環(huán)為約12小時白光/12小時黑暗，持續(xù)72-96小時直到收獲生物體。pH維持在約9-10.5，以使螺旋藻細(xì)胞中硫脂的合成最優(yōu)化。以每小時每升培養(yǎng)物50-60L的速率鼓入含1％CO2的空氣。振蕩速率維持在約100-150rpm。根據(jù)培養(yǎng)的藻株和使用的光生物反應(yīng)器的類型的不同，第二個步驟的持續(xù)時間可有變化。
d)采用以下方法收獲富含硫脂的生物體在20-24℃、光照強(qiáng)度為30-50μE/m2/s的條件下，在傾析器中培養(yǎng)螺旋藻24-48小時，以去除上清。生物體沉淀在傾析器底部，再通過過濾或者5000rpm離心15分鐘將其收獲，然后在24℃條件下用10g/L(克每升)的NaCl(氯化鈉)溶液漂洗。通過5000rpm離心15分鐘再次收獲所述生物體，然后在凍干或霧化前以20-24℃的條件用蒸餾水或軟水漂洗3次。
e)結(jié)果根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的螺旋藻中的總脂質(zhì)的比例約為干重的6.7-7.2％。所述培養(yǎng)物的產(chǎn)率達(dá)1.6-2.1g干重/L。提高初始細(xì)胞的濃度，可以減少培養(yǎng)時間并且增加產(chǎn)率(2.2-2.6g/L)。
e.1)在油酸銨、亞油酸銨或棕櫚酸銨(重量百分比)存在的條件下，所培養(yǎng)的螺旋藻的脂質(zhì)組成獲得硫脂的比例約為總脂質(zhì)的38-41.5％，如表1所示。
表1.

1單半乳糖二?；视?二半乳糖二酰基甘油3磷脂酰甘油4硫代異鼠李糖二?；视?無添加劑上述結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中加入油酸銨或棕櫚酸銨時，硫代異鼠李糖二酰基甘油形式的硫脂的比例顯著增加了。
e.2)在沒有添加劑或者在油酸銨或棕櫚酸銨存在的情況下，培養(yǎng)的鈍頂螺旋藻PC 8005中的硫脂的總脂肪酸組成和脂肪酸組成(表2和表3)。
所述硫脂具有如下分子式
其中，R1和R2的定義如下R1R2γC18:3(γ-亞麻酰) C16:0(棕櫚酰)C18:2(亞油酰) C16:0(棕櫚酰)C18:1(油酰)C16:0(棕櫚酰)C16:1(棕櫚油酰)C16:0(棕櫚酰)相應(yīng)于所述R1和R2定義的分子式如下 表2.總脂肪酸組成(重量百分比)*

*標(biāo)準(zhǔn)差≤0.3結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中加入油酸銨顯著增加了C18總脂肪酸的含量，并降低了C16總脂肪酸的含量。
加入棕櫚酸銨導(dǎo)致C16總脂肪酸含量的輕度增加(6％)和C18總脂肪酸含量的降低。
表3.硫脂的脂肪酸組成(重量百分比)*

*標(biāo)準(zhǔn)差≤0.4上述結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中加入油酸銨顯著增加了硫脂中C18脂肪酸的含量，降低了C16脂肪酸的含量。
加入棕櫚酸銨則具有相反的作用。
這表明，在油酸鹽存在的條件下，螺旋藻優(yōu)先使用該外源性脂肪酸合成真核(C18/C18)硫脂，而在棕櫚酸銨存在的條件下，原核(C16/C16)硫脂的合成增加。
實(shí)施例2提取、分離和純化所述種類的硫脂分子2.1.采用TLC(薄層色譜)或HPLC(高效液相色譜)提取和分離所述種類的脂質(zhì)2.1.1.提取采用Bligh和Dyer(1959年)的方法，使用甲醇和氯仿來提取所述脂質(zhì)(5)。吸出氯仿相，在氮?dú)庵懈稍锖筠D(zhuǎn)入一定量的氯仿或苯/乙醇(4∶1，體積比)中。
2.1.2.分離a)采用TLC方法在氮?dú)庵袑⑺隹傊|(zhì)提取物置于0.25mm厚的硅膠板(SilicagelG60，Merck)上。在一個密封槽內(nèi)進(jìn)行單向遷移，該槽內(nèi)含有氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/雙蒸水(50∶20∶10∶10∶5，體積比)的混合物(6)。通過噴霧蒸餾水顯現(xiàn)斑點(diǎn)，而脂質(zhì)對照通過噴霧櫻草黃溶液(10mg櫻草黃溶于10ml 80％的丙酮水溶液)顯現(xiàn)，并在UV(紫外線)下觀察。收集上述斑點(diǎn)，然后將其回收至含有氯仿/甲醇/水(2∶1∶0.5，體積比)的混合物的試管中。所述樣品在-20℃放置24小時，然后收集每只試管中的脂質(zhì)成分(氯仿相)，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上或者氮?dú)庵姓舭l(fā)干燥。最后，將所述各種脂質(zhì)重溶于已知體積的氯仿中，以分析其分子種類。
b)采用HPLC方法將經(jīng)Millipore膜(直徑0.5μm)過濾的所述脂質(zhì)提取物在氮?dú)庵姓舭l(fā)干燥，然后溶于100μl氯仿中。根據(jù)Demandre等人(7，8)的方法，在Waters HPLC裝置(美國馬薩諸塞州的Milford)中使用300×7.8mm的Parasil 10μm硅膠柱分離各種脂質(zhì)；其中首先使用溶劑A洗脫所述脂質(zhì)提取物2分鐘，溶劑A包含異丙醇和己烷(4∶3，體積比)的混合物。然后用兩種溶劑的混合物洗脫所述脂質(zhì)20分鐘，所述兩種溶劑的混合物符合以100％溶劑A開始和100％溶劑B結(jié)束的線性梯度，其中溶劑B包含異丙醇/己烷/H2O(水)(8∶6∶1.5，體積比)。最后以每分鐘2ml的速度用溶劑B洗脫上述硅膠柱20分鐘。收集在205nm(納米)處檢測到的脂質(zhì)。采用薄層色譜方法對所述脂質(zhì)進(jìn)行鑒定，該方法根據(jù)Lepage方法(6)而使用了對照(MGDG、DGDG、SQDG和PG)和特定試劑，所述特定試劑包括用于半乳糖脂的α-萘酚和硫酸及用于磷脂的Zinzadze試劑(9)。
為了用于HIV實(shí)驗(yàn)，所述各種脂質(zhì)可重溶于乙醇。
2.1.3.脂肪酸和脂質(zhì)的檢測將挖出的硅膠板上的脂質(zhì)斑點(diǎn)用于其脂肪酸的甲基化。將總脂質(zhì)提取物的脂肪酸或者經(jīng)TLC分離的各種脂質(zhì)的脂肪酸進(jìn)行甲基化，該TLC分離采用C17:0為內(nèi)標(biāo)(十七烷酸)。然后在樣品中加入3ml甲醇/硫酸(97.5∶2.5，體積比)(10)。在75℃的密封試管中放置40分鐘后立即冷卻所述樣品，然后用2ml己烷和1ml雙蒸水萃取甲酯。
所述甲酯在惠普(Hewlett Packard)氣相色譜儀上分析。通過與C17:0內(nèi)標(biāo)比較，計(jì)算出每種脂肪酸的含量。
2.2.通過HPLC分離不同種類的硫脂分子2.2.1.通過HPLC分離各種硫脂分子在反相柱中將由TLC或HPLC得到的硫脂分離成各種分子。所使用的固定相是ODS(十八烷基硅膠)5μm相(在4.6×250mm的Altex或Spherisorb柱中)或者是Bondapak C18 10μm相(在3.9×300mm的Waters柱中)，前者用含有20mM(毫摩爾每升)氯化膽堿的溶劑洗脫，該溶劑為甲醇/乙腈/H2O(90.5∶2.5∶4，體積比)組合物，后者用含有20mM氯化膽堿的溶劑洗脫，該溶劑由甲醇/乙腈/H2O(90.5∶2.5∶7，體積比)的混合物組成。所述溶劑的流速為1.5ml/分鐘。所述各種硫脂分子被分離開，并同時在205nm處檢測。采用GC(氣相色譜)分析所述各種硫脂分子的脂肪酸，使這些分子得以識別和定量(7)。
2.2.2.鑒定各種原核和真核硫脂分子通過分析硫脂分子的甘油上脂肪酸的位置來鑒定各種硫脂分子。
挖出用TLC或HPLC分離開的硫脂，并用雙蒸水濕潤。所述硫脂用甲醇/氯仿(1∶2，體積比)的混合物萃取三次，然后用純甲醇萃取一次。在氮?dú)庵袑⒃摿蛑腿∥锔稍铩?br> 此處所用的方法如Fischer等人(1973年)(14)所述將20ml TritonX-100(100mg Triton X-100溶于2ml氯仿)和100μl氯仿加入到上述干燥樣品中。然后把1ml 0.04M(摩爾每升)Tris-HCl緩沖液(pH＝7.5)和20μl來自少根根霉(Rhizopus arrhizus)的脂肪酶Al(50,000U/ml(單位每毫升)，Boehringer)加入到裝有所述再次干燥樣品的試管中。在Vortex上劇烈振蕩1-2分鐘后，將試管在30℃輕柔搖動的水浴中放置30-60分鐘，以分析硫脂和磷脂(對于半乳糖脂則放置20-30分鐘)。脂肪酶A1僅水解甘油分子1位上的酯基。加入15μl 1.8N(當(dāng)量)的乙酸或異丙醇，在冰浴中終止反應(yīng)。在氮?dú)庵姓舭l(fā)掉溶劑，再將3ml氯仿/甲醇(1∶1，體積比)加入到水解后的樣品中。將所述水解后的樣品劇烈振蕩，然后以400g(相對離心力)離心10分鐘，取上清進(jìn)行TLC分析。該上清含有脂肪酶A1的水解產(chǎn)物(游離脂肪酸和2-?；?lyso SQDG)，用Lepage溶劑(6)在薄層硅膠(Silicagel G60，Merck)上將該產(chǎn)物分離，Lepage溶劑包含氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/H2O(50∶20∶10∶10∶5，體積比)的混合物。用于硫脂衍生物的溶劑是氯仿/甲醇/乙酸/H2O(65∶35∶4∶4，體積比)的混合物。在遷移后，用櫻草黃溶液顯現(xiàn)來自甘油分子1位的游離脂肪酸和2-?；?lyso SQDG，挖出所述斑點(diǎn)，然后將其在1％甲醇鈉(0.2ml)和甲醇/1.1N鹽酸(0.2ml)(或甲醇/硫酸(97.5∶2.5))存在的條件下進(jìn)行甲基化，再用氣相色譜分析之。
2.3.各種原核(C18/C16)和真核(C18/C18)硫脂分子的純化可以用Seppaks硅筒(silica cartridge)分離中性脂質(zhì)、半乳糖脂、磷脂和硫脂。
用氯仿移除中性脂質(zhì)，然后分別用二氯甲烷/甲醇(93∶7，體積比)的混合物和甲醇分離出半乳糖脂和磷脂。在使用所述溶劑系統(tǒng)后，硫脂以稀釋的形式存在于磷脂成分(甲醇)中。然后在MAXISIL 5μm SI柱(150×10mm)(Phenomenex，加里弗尼亞州的Torrance)上采用正相HPLC方法從磷脂成分中(甲醇成分)分離出硫脂。
移動相是流速為1.5ml/分鐘的庚烷/異丙醇/0.001M KCl(氯化鉀)(40∶52∶8，體積比)的混合物。在208nm處檢測發(fā)現(xiàn)了硫脂峰(在稀釋25分鐘后)。最后，在每次操作后用100％異丙醇清洗柱子，并用100％庚烷重平衡(15)。
上述操作的結(jié)果顯示在表4中。
表4.各種硫脂分子的組成(總硫脂重量的百分比)

*未檢測上述結(jié)果顯示，根據(jù)培養(yǎng)基中的補(bǔ)加物的不同，各種硫脂分子的組成是不同的。事實(shí)上，當(dāng)在培養(yǎng)基中補(bǔ)加油酸銨時，在總C18/C16與總C18/C18的比率中，C18/C16(原核)硫脂的比例降低，而C18/C18(真核)硫脂的比例顯著增加。
實(shí)施例3通過螺旋藻中各種硫脂分子抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶3.1.實(shí)驗(yàn)方法3.1.1.酶本研究中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶是重組酶，其表達(dá)于E.coli(大腸桿菌)中，且從細(xì)菌提取物中純化得到(16)。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)質(zhì)粒源自原病毒分離物BH-10(17)，而HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)質(zhì)粒源自分離物pRod(18)。HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶分別是p.66/p.51和p.68/p.55異源二聚體。
3.1.2.酶實(shí)驗(yàn)本處所用的縮寫如下dTTP脫氧胸苷三磷酸dATP脫氧腺苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸dNTP脫氧核苷三磷酸根據(jù)Loya等人(19)的方法進(jìn)行酶實(shí)驗(yàn)。在不同濃度硫脂存在的條件下，通過監(jiān)測在三氯乙酸(TCA)中不溶的、以poly(rA)n.oligo(dT)12-18摻入[3H]dTTP的產(chǎn)物的量，來檢測DNA聚合酶的活性。通過檢測從合成底物[3H]poly(rA)n.poly(dT)n中釋放出的TCA可溶產(chǎn)物的量來檢測RNase-H的活性。該底物按Hizi等人(1991年)(20)的方法制備。在全部抑制實(shí)驗(yàn)中，在不同濃度抑制物存在或不存在的情況下，先將所述酶在30℃預(yù)孵育5分鐘。通過在37℃加入合適底物并溫育30分鐘來啟動酶促反應(yīng)。
計(jì)算相對于不存在硫脂時觀察到的(線性)反應(yīng)的起始速率的殘余酶活性。
根據(jù)作為抑制物(硫脂)濃度的函數(shù)的抑制曲線，計(jì)算得到引起抑制50％酶促活性(IC50)的抑制物濃度。
所述酶活性的定義如下(a)一個單位的DNA聚合酶活性定義為，在37℃、30分鐘的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，將1pmol(皮摩爾)dNTP催化摻入DNA產(chǎn)物中所需的酶量。
(b)一個單位的RNase-H活性定義為，在37℃、30分鐘的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，催化1pmol AMP(單磷酸腺苷)水解所需的酶量。
3.2.結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在下表5、6和7中。
表5.總硫脂對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的作用

上述結(jié)果顯示，來自于在油酸鹽存在下培養(yǎng)的螺旋藻的總硫脂，對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性顯著高于對照。
事實(shí)上，對于提取自在油酸鹽存在下培養(yǎng)的螺旋藻的總硫脂而言，低劑量即215和291.5μg/ml即可抑制90％的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性；而在未加添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的螺旋藻的劑量為332μg/ml。
所述現(xiàn)象可通過在培養(yǎng)基中補(bǔ)加其他物質(zhì)引起總硫脂組成的改變來解釋，所述改變即原核(C18/C16)硫脂含量增加和出現(xiàn)真核(C18/C18)硫脂。
表6各種硫脂分子對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶和RNase-H活性的抑制

(a)IC50和IC90分別抑制50％和90％初始酶活性的抑制物(硫脂)濃度。抑制濃度表示為μg/ml。
(b)在濃度為100μM的每種硫脂分子的抑制物存在下檢測RNase-H活性。
(c)殘余酶活性以不存在抑制物的對照活性的百分比計(jì)算。
結(jié)果顯示，各種原核分子對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶的抑制活性均強(qiáng)于除了C18:1/C18:1之外的各種真核分子，其中活性最強(qiáng)的分子種類是C18:1/C18:1、C18:1/C16:0和C18:2/C16:0。
對于HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase-H的抑制活性，活性最強(qiáng)的分子種類是C16:1/C16:0、C16:0/C16:0、C18:1/C18:1和原核種類C18:1/C16:0。
表7 各種硫脂分子對HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶活性的作用

上述結(jié)果顯示，C18:1/C16:0和C18:2/C16:0種類的硫脂分子對HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶活性也有抑制活性，其中C18:1/C18:1硫脂的抑制活性最強(qiáng)。
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1.富含硫脂的螺旋藻生物體，其特征為，所述硫脂占總脂質(zhì)的重量比例至少為40％，并且所述硫脂具有抑制HIV-1和HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的生物體，其特征為，所述硫脂具有如下分子式(I)的結(jié)構(gòu) 其中，R1和R2定義如下—R1是油?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是亞油?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是棕櫚酰基，R2是棕櫚?；?，或—R1是γ-亞麻?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是γ-亞麻?；?，R2是棕櫚油?；颉猂1是棕櫚油?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是油酰基，R2是亞油?；?，或—R1是亞油?；?，R2是油?；颉猂1是亞油?；?，R2是亞油?；?，或—R1是油酰基，R2是油酰基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物體，其特征為，所述螺旋藻選自鈍頂螺旋藻PCC 8005、極大螺旋藻、特斯科科螺旋藻(Spirulina texcoco)、Spirulina crater或螺旋藻8818。
4.混合營養(yǎng)培養(yǎng)螺旋藻的方法，該方法用于生成如權(quán)利要求1至3中任一所述的富含硫脂的生物體，該方法的特征在于，所述生成過程包括至少一個在油酸銨或棕櫚酸銨存在的條件下培養(yǎng)螺旋藻的步驟。
5.分子式(I)的原核硫脂或其混合物 其中，—R1是油?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是亞油酰基，R2是棕櫚酰基，或—R1是棕櫚?；琑2是棕櫚?；?，或—R1是γ-亞麻?；琑2是棕櫚?；颉猂1是γ-亞麻?；?，R2是棕櫚油?；?，或—R1是棕櫚油?；?，R2是棕櫚?；?br> 6.分子式(I)的真核硫脂或其混合物 其中，R1是C18不飽和脂肪酸基，R2是C18不飽和脂肪酸基，所述基團(tuán)相同或不同。
7.分子式(I)的真核硫脂或其混合物 其中，—R1是油?；琑2是亞油?；颉猂1是亞油?；琑2是油?；?，或—R1是亞油?；?，R2是亞油酰基，或—R1是油?；琑2是油?；?。
8.總硫脂，其特征為，其由權(quán)利要求5或6所述的真核和/或原核硫脂的混合物組成。
9.權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的硫脂作為HIV-1或HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制物的用途。
10.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的富含硫脂的螺旋藻生物體作為HIV-1或HIV-2逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制物的用途。
11.藥用組合物，其含有權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的硫脂和藥用載體。
12.權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的硫脂在制備預(yù)防或治療AIDS的藥物中的用途。
13.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的富含硫脂的螺旋藻生物體在制備預(yù)防或治療AIDS的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從螺旋藻中提取的新的硫脂、獲得所述硫脂的方法、含有所述硫脂的組合物及其作為HIV－1和HIV－2的抑制物的用途。本發(fā)明還涉及富含具有抑制HIV－1和HIV－2逆轉(zhuǎn)錄酶活性的硫脂的螺旋藻生物體，以及所述硫脂或富含所述硫脂的螺旋藻生物體在制備預(yù)防或治療AIDS的藥物中的用途。
文檔編號C12P11/00GK1656212SQ03812315
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月29日
發(fā)明者彭闊基, 于貝爾·迪朗-沙泰爾 申請人:彭闊基, 于貝爾·迪朗-沙泰爾