專利名稱：La1－乳桿菌屬菌株的基因組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及約翰遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)菌株DNA序列、特別是其基因組序列用于闡明微生物與其定居的宿主的相互作用并且還用于闡明由該菌株表現(xiàn)出的益生特性的基礎(chǔ)的用途。本發(fā)明也涉及分別檢測乳桿菌屬(Lactobacilli)及相關(guān)種的核酸或多肽的方法。提供包含La1的核苷酸序列和/或多肽序列的數(shù)據(jù)載體。
乳酸細(xì)菌，也就是在其(發(fā)酵)活力中產(chǎn)生乳酸的微生物，長期為人們所知，包括例如乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、雙歧桿菌屬(Bifdobacterium)和小球菌屬(Pediococcus)等。這些細(xì)菌通常分別顯著存在于牛奶和牛奶加工廠中，可使工廠生存或衰落，并且是人類和動(dòng)物腸內(nèi)微生物菌群的代表乳酸細(xì)菌已用作食品保鮮劑，有益于降低pH，并且在其發(fā)酵活力中產(chǎn)生的產(chǎn)物可以抑制例如酸敗菌的生長。另外，乳酸細(xì)菌也已用于制造多種不同的食品如奶酪、酸奶和其它的來源于牛奶的發(fā)酵奶制品。
近來，乳酸細(xì)菌備受關(guān)注，其中已發(fā)現(xiàn)某些菌株表現(xiàn)出對(duì)人和動(dòng)物吸收方面頗有價(jià)值的特性。具體地講，已發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的特別菌株以可行的和活的形式穿過胃腸道，而沒有在胃腸上部，特別在胃中的低pH優(yōu)勢的沖擊下被摧毀。此外，發(fā)現(xiàn)它們能定居于腸黏膜，并假設(shè)其可暫時(shí)或持久的存在于腸中，給生物體的健康帶來眾多的積極效應(yīng)。這些菌株通常稱為益生菌。
歐洲專利(EP)第0768375號(hào)公開了這樣一株特殊的雙歧桿菌屬菌株，它能植入腸內(nèi)微生物菌群中。據(jù)報(bào)道，該雙歧桿菌菌株協(xié)助免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)能競爭性地排除病原細(xì)菌附著到腸細(xì)胞，因而支持維護(hù)個(gè)體健康。
除雙歧桿菌外，已發(fā)現(xiàn)乳桿菌的某些菌株具有對(duì)人類有益的特性，如預(yù)防病原性細(xì)菌的腸定居或阻止輪狀病毒的感染。具體地講，PCT/EP02/00958公開了這樣一株具有兩方面所述特性的菌株。
在最近的幾年中，食品工業(yè)界已在產(chǎn)品中應(yīng)用這類菌株，如牛奶飲料或發(fā)酵的酸乳制品。這些產(chǎn)品和/或細(xì)菌菌株的臨床研究證實(shí)了這樣的概念，即這類細(xì)菌是體內(nèi)健康品質(zhì)提升的原因，并且甚至可用于抵抗疾病如潰瘍。具體地講，已證實(shí)乳桿菌屬的一株約翰遜氏乳桿菌能夠抵抗公認(rèn)的人類潰瘍的病因螺桿菌。
由于乳酸細(xì)菌的具體菌株可提供這些頗有價(jià)值的特性，因此，本領(lǐng)域中強(qiáng)烈希望能闡明這些健康提升特性的分子基礎(chǔ)。具體地講，確定產(chǎn)生這些效應(yīng)的一種或多種物質(zhì)將有重大意義。為此目的，需要有更詳細(xì)地研究這些微生物的工具，以闡明益生菌特性的分子原理，如與宿主的相互作用、穿過(生存于)腸內(nèi)不同的環(huán)境條件的現(xiàn)象、及具有依附腸黏膜的能力和最終地參與增強(qiáng)免疫系統(tǒng)和抵御病原體的能力，這些信息將能更好的理解這些機(jī)制。
因此，本發(fā)明的問題是提供細(xì)菌菌株的大致數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表現(xiàn)出的特性有益于人類和/或動(dòng)物。
通過提供組成益生菌菌株約翰遜氏乳桿菌La1的DNA序列，已解決上述問題。
一方面，本發(fā)明涉及乳酸細(xì)菌約翰遜氏乳桿菌La1基因組核苷酸序列的應(yīng)用，該基因組具有SEQ.ID.No.1序列、其部分或與其同源的序列，以闡明細(xì)菌和宿主、優(yōu)選乳酸細(xì)菌和宿主、更優(yōu)選乳桿菌和宿主之間的相互作用，特別是確定這類菌株的益生特性的決定因素。
在本申請(qǐng)上下文中，術(shù)語基因組或基因組序列應(yīng)理解為是指約翰遜氏乳桿菌的染色體序列。術(shù)語核苷酸序列、多核苷酸或核酸應(yīng)指定為雙鏈DNA、單鏈DNA或所述不同長度的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括長約5-200個(gè)、優(yōu)選10-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，同源核苷酸序列理解為是指與SEQ ID.No.1序列(或其選擇的部分)的百分同一性至少為90％、優(yōu)選至少為95％、更優(yōu)選至少為96％、甚至更優(yōu)選至少為98％的核苷酸序列。所述同源序列可包含例如對(duì)應(yīng)于屬于乳桿菌、更優(yōu)選屬于約翰遜氏乳桿菌的基因組序列或其片段的序列，以及對(duì)應(yīng)于屬于相關(guān)種的細(xì)菌基因組序列或其代表性片段的序列。在本發(fā)明中，術(shù)語種和屬可互換使用。
因此，這些同源序列可對(duì)應(yīng)于相同種內(nèi)或種間的與突變相關(guān)的變異，并可具體對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)核苷酸的截短、置換、缺失和/或添加。所述同源序列也可編碼對(duì)該科、種或變異體特異性的遺傳密碼的簡并性或遺傳密碼的偏愛相關(guān)的變異，所述變異可能存在于乳桿菌屬中。
可利用多種本領(lǐng)域已知的序列比較算法和程序中任一種來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和/或核酸序列同源性。這些算法和程序包括但決不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(參見例如Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8)2444-2448；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410；Thompson等，1994，Nucleic Acids Res.22(2)4673-4680；Higgins等，1996，MethodsEnzymol.266383-402；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410；Altschul等，1993，Nature Genetics 3266-272).
在一個(gè)具體的優(yōu)選的實(shí)施方案中，運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的the BasicLocal Alignment Search Tool(“BLAST”)來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和/或核酸序列同源性(參見上文)。具體地講，運(yùn)用四種特殊的BLAST程序執(zhí)行下列任務(wù)(1)BLASTP將氨基酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
(2)BLASTN將核苷酸查詢序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
(3)BLASTX將所有讀框中翻譯的核苷酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
(4)TBLASTN將蛋白質(zhì)查詢序列與所有讀框中動(dòng)態(tài)翻譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
在這些代表性片段中，優(yōu)選那些能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下同本發(fā)明公開的核苷酸序列雜交的片段。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交表示所選擇的溫度和離子強(qiáng)度條件可允許維持兩個(gè)互補(bǔ)的DNA片段間的雜交。通過優(yōu)選65℃雜交溫度并在SSC緩沖液條件下，如1xSSC相當(dāng)于0.15MNaCl和0.05M檸檬酸鈉，可以達(dá)到這樣的高嚴(yán)謹(jǐn)條件。洗滌步驟可以例如如下2xSSC，0.1％SDS室溫下洗滌，接著用1xSSC，0.1％SDS；0.5xSSC，0.1％SDS；0.1xSSC，0.1％SDS在68℃洗滌三次，每次15分鐘。
通過定向測序法，對(duì)克隆的插入序列進(jìn)行自動(dòng)熒光測序后，依靠軟件拼接這些核苷酸片段(插入)序列，已經(jīng)對(duì)約翰遜氏乳桿菌La1菌株的基因組進(jìn)行了測序，獲得了核苷酸序列SEQ.ID.NO.1。針對(duì)這個(gè)目標(biāo)，可產(chǎn)生基因組的片段，連接到合適的載體中進(jìn)行擴(kuò)增和繁殖，并且對(duì)相應(yīng)的片段進(jìn)行測序。借助于適當(dāng)?shù)能浖?，可推測其重疊區(qū)核苷酸序列和片段的最終排列，用于測序的克隆也包括10000bp以上的BAC克隆片段，可用于提供較大規(guī)模的拼接構(gòu)架。由于一些重復(fù)區(qū)的存在，提供正確的拼接極其困難。特別包括如IS元件的重復(fù)區(qū)、核糖體操縱子和特別是編碼兩種大細(xì)胞表面蛋白的基因，其包含100和200間幾乎完美的10個(gè)氨基酸的重復(fù)。在這種情況下，由于現(xiàn)有的DNA測序技術(shù)不能在單次測定中覆蓋該區(qū)域，因而不能確定這些區(qū)域的準(zhǔn)確序列。內(nèi)測序引物排斥在外，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨騼?nèi)的多個(gè)位點(diǎn)引發(fā)反應(yīng)。同樣，這兩個(gè)基因的相對(duì)方位、它們長的和非常高的序列相似性，使得它們成為宿主重組的潛在靶點(diǎn)。當(dāng)用PCR以恰當(dāng)?shù)囊镒C實(shí)本文的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)時(shí)，基因組非?？赡苁怯上嚓P(guān)的復(fù)制起始和終止位置所示的重組產(chǎn)物。核糖體操縱子重復(fù)所遇到的第二個(gè)問題是存在6個(gè)操縱子，但僅確定了4個(gè)位點(diǎn)，并且它們額外位點(diǎn)的位置的準(zhǔn)確位點(diǎn)是難于確定的。最終，IS元件中的兩個(gè)呈現(xiàn)出多拷貝，并依賴其相關(guān)的方位，它們可能是宿主重組的靶點(diǎn)。這一推論已獲確定，通過研究IS元件的側(cè)翼序列，特別是染色體靶序列的轉(zhuǎn)座重復(fù)，因此，每一個(gè)IS元件應(yīng)是由同樣的直接重復(fù)側(cè)面相接。我們已鑒定了兩個(gè)IS元件，其中由于宿主在IS元件內(nèi)的重組，該直接重復(fù)已經(jīng)轉(zhuǎn)換。這產(chǎn)生大約600000bp的倒置，這點(diǎn)已由PCR及特異性引物獲得確認(rèn)。該IS元件特異性重組可能是一動(dòng)態(tài)事件，其發(fā)生于生長培養(yǎng)中，導(dǎo)致一主要種加上一小的重組的基因組(可見為模糊的PCR帶)。最終，我們通過位點(diǎn)特異性重組酶的恒定切割，獲得了原噬菌體L771(大約40000bp)。我們已開發(fā)出定量PCR技術(shù)檢測每一種變異體的存在和測定其相關(guān)的豐度。至今尚未制備出純培養(yǎng)物。SEQ.ID.No.1所示的核酸序列的特別優(yōu)選的片段是1-54596、56070-77430、81302-308537、309588-342757、378458-389217、389779-404510、405561-501116、503873-558194、563262-696518、697569-721736、722787-756845、761682-860446、860723-865550、867260-867490、868541-1448288、1463851-1526077、1527278-1552024、1563147-1809115、1810166-1858190、1863258-1872871、1877939-1930430、1932063-1983043，每個(gè)片段都基于SEQ ID.No.1的編號(hào)。
也可利用本發(fā)明制備多肽，通過利用源自SEQ.ID.NO.1的可讀框的知識(shí)，以及依照熟知的技術(shù)，表達(dá)所需的多肽。在此考慮下，可選擇對(duì)應(yīng)于一個(gè)可讀框的核酸，并且插入到表達(dá)載體中。然后，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞能在適當(dāng)?shù)臈l件下，將可讀框轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。
源自如SEQ.ID.NO.1所示的基因組序列的核酸分子，可以容易地通過利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，特異性擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的序列獲得。由于本文提供了序列信息，技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)和合成任何合適的核苷酸引物，并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目標(biāo)片段。因此，本發(fā)明也包含選自序列SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列，該序列能用作擴(kuò)增核酸序列的引物。當(dāng)然也可以使用其它的擴(kuò)增靶核酸的技術(shù)，如TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng))技術(shù)、3SR(自動(dòng)維持序列復(fù)制)技術(shù)、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù)、SDA(鏈置換擴(kuò)增)技術(shù)或TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)技術(shù)等。
(聚)核苷酸可作為探針，以及在擴(kuò)增或修飾核酸技術(shù)中作為探針，例如LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)、RCR(修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)、CPR(循環(huán)探針反應(yīng))技術(shù)，或者也可使用Q-β-復(fù)制酶擴(kuò)增技術(shù)。
因此，本發(fā)明既設(shè)想了雜交(檢測)探針又設(shè)想了檢測本發(fā)明的核苷酸序列(靶核苷酸)的引物。在靶核苷酸為RNA分子時(shí)，例如mRNA，所述mRNA可以直接檢測或者在檢測前轉(zhuǎn)換成cDNA。
或者，為了獲得SEQ.ID.NO.1所示的核酸片段，約翰遜氏乳桿菌基因組DNA可用所選的限制性酶消化，通過如電泳或另外的合適分離技術(shù)分離片段。這類技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且尤其公開于Sambrook等，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，1992中。通過分離約翰遜氏乳桿菌La1的基因組DNA，并執(zhí)行必要的步驟，可容易獲得這樣的片段。
一個(gè)可選擇的方式是，當(dāng)核酸的長度不是太大時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，也可以化學(xué)合成獲得該核酸。
修飾核苷酸序列應(yīng)理解為是指根據(jù)技術(shù)人員熟知的誘變等技術(shù)獲得的并表現(xiàn)出相對(duì)于正常序列的修飾如多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和/或啟動(dòng)子序列的突變、尤其導(dǎo)致所述多肽的表達(dá)水平的改變或復(fù)制循環(huán)的調(diào)節(jié)的任何核苷酸序列。修飾核苷酸序列也可理解為是指編碼如下定義的修飾多肽的任何核苷酸序列。
在對(duì)約翰遜氏乳桿菌基因組的研究中，用所得可能基于同已知蛋白質(zhì)的同源性的多肽的功能注釋，可確定以下的可讀框。
表1
*互補(bǔ)＝在反向鏈上*aa＝氨基酸對(duì)應(yīng)于各種多肽的ORF在前面的表1中列出，并以它們?cè)赟EQ.ID.NO.1所示的基因組序列中的位置表示。
所述可讀框通過同源性分析以及通過潛在的ORF起始位點(diǎn)分析鑒定出來。人們知道，每一鑒定的ORF包含這樣的核苷酸序列其跨越從緊接3′碼子到前述的ORF終止子的連續(xù)核苷酸序列，以及經(jīng)由5′密碼子到ORF核苷酸序列中SEQ.ID.NO.1符合讀框的下一個(gè)終止密碼子。
表1也描述了比較每一個(gè)ORF編碼的多肽的序列同數(shù)據(jù)庫中存在的序列的同源性搜索結(jié)果。
可利用本申請(qǐng)公開的序列信息來選擇目標(biāo)多核苷酸，即包含編碼已知或未知的、推定的多肽的可讀框的核酸以及可用所選多核苷酸轉(zhuǎn)化微生物的核酸?？捎萌缡熘馁|(zhì)粒、噬菌體載體(轉(zhuǎn)染)或F-載體(接合)作為轉(zhuǎn)化載體?？杀磉_(dá)導(dǎo)入所選微生物中的核酸，并且其生物學(xué)功能可照原樣利用(如果其功能已知的話)，或者在表達(dá)迄今未知的多肽時(shí)加以闡明。所選微生物可以是乳桿菌本身或是其它熟知的微生物例如細(xì)菌、如大腸桿菌、鏈球菌或酵母、昆蟲細(xì)胞或者甚至動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
人們知道，多肽可以如所述表達(dá)或以融合多肽形式表達(dá)。技術(shù)人員照本宣科按技術(shù)進(jìn)行連接，并且在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的融合多肽。
根據(jù)本發(fā)明，也可設(shè)計(jì)新的克隆和/或表達(dá)本發(fā)明核酸序列的重組載體。該載體包含使核苷酸序列在給定的宿主細(xì)胞中表達(dá)和/或分泌的必要元件，像啟動(dòng)子、起始信號(hào)和翻譯終止信號(hào)，以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。例如，蛋白或多肽的表達(dá)可由本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制。示例性的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子區(qū)、勞氏肉瘤病毒3′長末端重復(fù)中所包含的啟動(dòng)子、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，或者，對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)，為β內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。
載體應(yīng)能在宿主細(xì)胞中保持穩(wěn)定，并且任選擁有特別信號(hào)，以指導(dǎo)已翻譯蛋白的分泌。這些不同的元件根據(jù)所用的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。為獲得這種效果，可將本發(fā)明的核苷酸序列插入到所選宿主中的自主復(fù)制載體中，或插入到所選宿主的整合載體中，例如酵母人工染色體、質(zhì)?；虿《据d體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，任何將DNA片段插入載體的標(biāo)準(zhǔn)方法，均可用于構(gòu)建表達(dá)載體，該載體包含一個(gè)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白質(zhì)編碼序列組成的嵌合基因。這些方法包括體外DNA重組和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組體(遺傳重組)。
載體可用于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯SEQ.ID.NO.1中的核酸，并分別產(chǎn)生RNA或反義RNA。只要能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的轉(zhuǎn)錄物，這種載體可保持附加性或變成染色體整合性的。
本發(fā)明的反義核酸包含與SEQ.ID.NO.1中的多核苷酸序列的RNA轉(zhuǎn)錄物至少部分互補(bǔ)的序列，即具有足夠互補(bǔ)性的序列，能與RNA雜交，形成穩(wěn)定的雙鏈體。就雙鏈反義核酸序列而論，可測試雙鏈DNA的單鏈，或者測試三鏈體的形成。
根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞也可依照本文描述，用核酸或載體轉(zhuǎn)化獲得。可將上述的核酸序列或載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，并隨后在轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的核苷酸序列能夠復(fù)制和/或表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述細(xì)胞，從而獲得這些細(xì)胞。
所述宿主細(xì)胞可從真核或原核系統(tǒng)例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞及植物細(xì)胞中選出。在本發(fā)明中，細(xì)胞應(yīng)理解為包含高等生物系統(tǒng)。例如動(dòng)物、整株植物或其部分。此外，可選擇一宿主細(xì)胞株，能調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或者以所需的特別方式，修飾和加工基因產(chǎn)物。
優(yōu)選表達(dá)本發(fā)明蛋白的宿主細(xì)胞由原核細(xì)胞如革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽性細(xì)菌組成。依照本發(fā)明，更優(yōu)選的宿主細(xì)胞是屬于乳桿菌科的細(xì)菌，更優(yōu)選屬于約翰遜氏乳桿菌或選自與乳桿菌相關(guān)的微生物。
依照本發(fā)明，可方便地將轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為模型，并可用于研究、鑒定和/或選擇能產(chǎn)生由本發(fā)明乳桿菌屬菌株帶來的任何有益效果的化合物的方法中。
此外，本發(fā)明能合成由具體列于表1中的約翰遜氏乳桿菌的ORF編碼的多肽。在本發(fā)明說明書中，術(shù)語多肽、肽和蛋白質(zhì)可互換使用。此外，本發(fā)明也能實(shí)現(xiàn)制備該多肽的方法，通過重組體即包含步驟(a)依照本發(fā)明，在適當(dāng)?shù)臈l件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞制備多核苷酸編碼的多肽；和(b)從培養(yǎng)物中回收多肽。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，也可利用組合化學(xué)獲得上述多肽，其中所述多肽，在它們于模式系統(tǒng)中測試前，在一些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，使得能選擇最具活性的或表現(xiàn)出所需的特性的化合物。
在本文中，化學(xué)合成具有的優(yōu)勢是能夠利用非天然氨基酸或非肽鍵。因此，為了例如延長本發(fā)明多肽的生命期，最好使用非天然氨基酸，例如D型氨基酸，或者使用氨基酸類似物，優(yōu)選使用含硫型氨基酸。
最終，本發(fā)明的多肽結(jié)構(gòu)，其同源型或修飾型，以及相應(yīng)片段可整合到該多肽型和其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中。因此，為了在體內(nèi)環(huán)境中保護(hù)該多肽，最好提供在N末端和C末端賦予抵抗蛋白酶降解的化合物。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，依照本發(fā)明和由以上方法制備的不同多肽，可視為宿主動(dòng)物免疫系統(tǒng)的抗原，所以可制備抗所述多肽的抗體。這些抗體可用于檢測混合物中的目標(biāo)多肽，或在種屬上檢測樣品中的乳桿菌屬菌株。另外，它們可用作研究工具，例如制備抗細(xì)胞表面表位的抗體，及測定細(xì)菌細(xì)胞壁上阻斷某些多肽的效果。
另一方面，本發(fā)明也提供了一種用于檢測和/或鑒定生物樣品中的乳桿菌屬、優(yōu)選約翰遜氏乳桿菌的方法。該方法可以包括本領(lǐng)域已知的一些技術(shù)，如PCR或簡單地與適當(dāng)探針雜交的技術(shù)。或者，針對(duì)乳桿菌屬、優(yōu)選約翰遜氏乳桿菌的細(xì)胞壁表位產(chǎn)生的抗體可用于所述目的。人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，也可反過來使用上述方法，使待測樣品與乳桿菌屬的多肽在能夠形成免疫復(fù)合物的條件下接觸，可以測定抗乳桿菌屬抗體的存在。
本發(fā)明所能獲得的多肽和抗體以及本文描述的核苷酸序列可用于體外和/或體內(nèi)方法，以檢測和/或鑒定可能含有它們的生物樣品(生物組織或體液)中的屬于乳桿菌的細(xì)菌。這些取決于本文描述的多肽、抗體和核苷酸序列特異性的而且將會(huì)使用的方法，可檢測和/或鑒定屬于乳桿菌細(xì)菌變異株以及能通過本發(fā)明所選的多肽、抗體和核苷酸序列檢測的相關(guān)微生物。也可以例如通過選擇對(duì)乳桿菌科有特異性的多肽、抗體和/或核苷酸序列，而選擇出能夠檢測該科的任何細(xì)菌的本發(fā)明的多肽、抗體和核苷酸序列將會(huì)是有利的。
涉及本文SEQ ID.NO.1的序列列于所附序列表中，所附序列表被認(rèn)為是本發(fā)明說明書的一部分。
本發(fā)明也包括以共價(jià)或非共價(jià)固定在固相載體上的本發(fā)明核苷酸序列或多肽。在第一種情況下，所述載體通過特異性雜交捕獲從待測生物樣品中獲得的靶核酸。必要時(shí)，將所述固相載體與樣品分開，然后通過用易檢測的元素標(biāo)記的第二探針(稱為檢測探針)，檢測捕獲探針與靶核酸間形成的雜交復(fù)合物。
這樣的載體可采用所謂DNA陣列或DNA芯片的形式，眾多的分子探針精確組合或排列在固相載體上，可進(jìn)行基因測序，對(duì)其中包含的突變和基因表達(dá)進(jìn)行研究，并且其顯示的普遍重要性在于其非常小的尺寸及在分析數(shù)量方面的高容量。
這些陣列/芯片的功能是基于分子探針，主要是基于附著于通常為幾平方厘米或者所需的稍大尺寸的載體上的寡核苷酸。為進(jìn)行分析，用排列于載體預(yù)定位置的探針包被該載體(DNA陣列/芯片)。而使包含待分析靶核酸片段的樣品，例如已預(yù)先標(biāo)記的DNA或RNA或cDNA隨后與所述DNA陣列/芯片接觸，通過雜交形成雙鏈體。在洗滌步驟后，通過分析芯片表面由連接到靶上的標(biāo)記發(fā)出的信號(hào)，可定位有效雜交。通過適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)處理，通過分析所得的雜交指紋結(jié)果，可獲得如基因表達(dá)、樣品中的特異性片段、序列測定和突變存在等信息。
在DNA芯片上聚積或原位合成的本發(fā)明探針與待分析樣品間的雜交，可以通過如熒光、放射性或通過電子檢測等測定。
本發(fā)明的核苷酸序列可用于DNA陣列/芯片，對(duì)乳桿菌基因的表達(dá)進(jìn)行分析。該分析基于DNA陣列/芯片上選擇的特異性探針來鑒定指定的基因。與芯片雜交前，標(biāo)記被分析的靶序列。在洗滌后，用進(jìn)行至少一式二份的雜交，檢測和定量標(biāo)記的化合物。對(duì)比分析獲得的相同的探針與不同的樣品和/或不同的探針與相同的樣品的信號(hào)強(qiáng)度，決定源自所述樣品的RNA的差別轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的DNA陣列/芯片也可包含其它微生物特異性核苷酸探針，其可進(jìn)行系列測試，可快速鑒定樣品中微生物的存在。
如上詳述的DNA芯片的原理，也可用于制備蛋白質(zhì)芯片，其載體上在DNA的位置包被有本發(fā)明的多肽或抗體等，或其陣列。這些蛋白質(zhì)芯片可分析在包被有如蛋白質(zhì)的載體上，通過表面等離子體共振(SPR)，由親和性捕獲靶分析物所誘導(dǎo)的生物分子相互作用(BIA)。本發(fā)明的多肽或抗體，能特異性結(jié)合源自待分析樣品中的抗體或多肽，因此，可以用于檢測和/或鑒定樣品中蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片中。
本發(fā)明也涉及一種其上已記錄一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明核苷酸序列和/或多肽序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。該介質(zhì)也可包含取自本發(fā)明的額外信息，例如已知序列的類似物等和/或其它微生物核苷酸序列和/或多肽序列的相關(guān)信息，以促進(jìn)所獲得結(jié)果的比較分析和開發(fā)。優(yōu)選的介質(zhì)為例如磁性介質(zhì)、光學(xué)介質(zhì)、電介質(zhì)和混合介質(zhì)，例如軟盤、CD-ROM或盒式記錄磁帶等。
本發(fā)明也涉及一種試劑盒或其系列，用于檢測和/或鑒定屬于約翰遜氏乳桿菌的細(xì)菌或相關(guān)微生物，該試劑盒包含本發(fā)明的多肽、用于組成免疫學(xué)或特殊反應(yīng)介質(zhì)的試劑、用于檢測本發(fā)明的多肽和可能存在于生物樣品中的抗體間免疫學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物的試劑，這些試劑可能帶有標(biāo)記，或進(jìn)而能由標(biāo)記的試劑識(shí)別，更具體地講，在本發(fā)明的多肽未被標(biāo)記時(shí)，一個(gè)不含本發(fā)明多肽識(shí)別的抗體的參比生物樣品(陰性對(duì)照)，一個(gè)含有預(yù)定量的由本發(fā)明多肽識(shí)別的抗體的參比生物樣品(陽性對(duì)照)。
本發(fā)明也涉及一種試劑盒或其系列，所述試劑盒或其系列用于檢測和/或鑒定屬于約翰遜氏乳桿菌的細(xì)菌或相關(guān)微生物，或者用于檢測和/或鑒定微生物，其中所述試劑盒包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片。
權(quán)利要求
1.SEQ ID.No.1所示的DNA序列或其部分或與其同源的序列在闡明宿主和細(xì)菌之間的相互作用中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述相互作用基于細(xì)菌菌株的益生特性，優(yōu)選基于刺激免疫系統(tǒng)、基于抗病原特性和/或抗病毒特性。
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的用途，其中所述序列是SEQ.ID.No.1的片段，所述片段選自以下根據(jù)SEQ ID.No.1編號(hào)的核苷酸1-54596、56070-77430、81302-308537、309588-342757、378458-389217、389779-404510、405561-501116、503873-558194、563262-696518、697569-721736、722787-756845、761682-860446、860723-865550、867260-867490、868541-1448288、1463851-1526077、1527278-1552024、1563147-1809115、1810166-1858190、1863258-1872871、1877939-1930430、1932063-1983043。
4.一種用于檢測、鑒定和/或選擇生物樣品中的乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株、優(yōu)選約翰遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)的方法，所述方法包括(a)在聚合酶和核苷酸存在下，在允許核苷酸延伸的條件下，使所述樣品與源自SEQ.ID.No.1所示的多核苷酸序列的核苷酸序列接觸；和(b)檢測所述樣品中存在延伸產(chǎn)物，其中檢測到引物延伸產(chǎn)物說明所述樣品中存在乳桿菌屬菌株。
5.一種用于檢測、鑒定和/或選擇生物樣品中的乳桿菌屬菌株、優(yōu)選約翰遜氏乳桿菌的方法，所述方法包括(a)在允許互補(bǔ)堿基對(duì)雜交的條件下，使所述樣品與源自SEQ ID.No.1所示的多核苷酸序列的核苷酸序列接觸；和(b)檢測所述樣品中存在雜交復(fù)合物，其中檢測到雜交復(fù)合物說明所述樣品中存在乳桿菌屬菌株。
6.一種用于檢測、鑒定和/或選擇生物樣品中的乳桿菌屬菌株、優(yōu)選約翰遜氏乳桿菌的方法，所述方法包括(a)在適合免疫復(fù)合物形成的條件下，使所述樣品與針對(duì)源自SEQ ID.No.1的多肽產(chǎn)生的抗體接觸；和(b)檢測所述樣品中存在免疫復(fù)合物，其中檢測到免疫復(fù)合物說明所述樣品中存在乳桿菌屬菌株。
7.一種用于檢測、鑒定和/或選擇生物樣品中的抗乳桿菌多肽抗體的方法，所述方法包括(a)在適合免疫復(fù)合物形成的條件下，使所述樣品與依照權(quán)利要求4或5產(chǎn)生的多肽接觸；和(b)檢測所述樣品中存在免疫復(fù)合物，其中檢測到免疫復(fù)合物說明所述樣品中存在乳桿菌多肽。
8.一種含有一個(gè)多核苷酸陣列的DNA陣列/芯片，所述DNA陣列/芯片包含至少一種源自SEQ ID.No.1的多核苷酸。
9.一種含有一個(gè)多肽陣列的蛋白質(zhì)陣列/芯片，所述蛋白質(zhì)陣列/芯片包含至少一種可通過表達(dá)由源自SEQ ID.No.1的可讀框所示的多肽獲得的多肽。
10.一種含有一個(gè)抗體陣列的抗體芯片，所述抗體芯片包含至少一種針對(duì)可通過表達(dá)SEQ ID.No.1中的可讀框獲得的多肽的抗體。
11.一種篩選試驗(yàn)，所述篩選試驗(yàn)包括(a)使試驗(yàn)化合物與SEQ ID.No.1所示的多核苷酸或其部分接觸；和(b)檢測是否發(fā)生結(jié)合。
12.一種篩選試驗(yàn)，所述篩選試驗(yàn)包括(a)使試驗(yàn)化合物與可通過表達(dá)源自SEQ ID.No.1的可讀框獲得的多肽接觸；和(b)檢測是否發(fā)生結(jié)合。
13.一種篩選試驗(yàn)，所述篩選試驗(yàn)包括(a)使試驗(yàn)化合物與針對(duì)可通過表達(dá)源自SEQ ID.No.1的可讀框獲得的多肽產(chǎn)生的抗體接觸；和(b)檢測是否發(fā)生結(jié)合。
14.一種試劑盒，所述試劑盒包含SEQ.ID.No.1所示的多核苷酸、其部分。
15.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述多核苷酸是引物或探針，并且其中所述試劑盒任選包含聚合酶和脫氧核苷酸三磷酸。
16.一種試劑盒，所述試劑盒包含針對(duì)可通過表達(dá)SEQ ID.No.1中的可讀框獲得的多肽產(chǎn)生的抗體。
17.一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其上已記錄SEQ ID.No.1所示的核酸序列或其部分或源自SEQ ID.No.1所示的核苷酸序列的多肽序列。
18.權(quán)利要求17的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述介質(zhì)選自(a)軟盤；(b)硬盤；(c)隨機(jī)存儲(chǔ)器(RAM)；(d)只讀存儲(chǔ)器(ROM)；和(e)CD-ROM。
19.一種用于鑒定約翰遜氏乳桿菌基因組片段的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)，所述基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)包括下列單元(a)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置，所述裝置包含SEQ ID.No.1所示的核酸序列；(b)搜索裝置，所述裝置用于比較靶序列同步驟(a)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置的核苷酸序列，以鑒定同源序列；和(c)檢索裝置，所述裝置用于獲得所述步驟(b)的同源序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及約翰遜氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)菌株DNA序列、特別是其基因組序列用于闡明微生物與其定居的宿主的相互作用并且還用于闡明由該菌株表現(xiàn)出的益生特性的基礎(chǔ)的用途。另外，本發(fā)明也涉及分別檢測乳桿菌屬(Lactobacilli)及相關(guān)種的核酸或多肽的方法。提供包含Lal的核苷酸序列和/或多肽序列的數(shù)據(jù)載體。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1659280SQ03812820
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月9日
發(fā)明者R·D·普里德穆爾, B·莫萊特, F·阿里戈尼, J·赫爾曼斯 申請(qǐng)人:雀巢制品公司