專利名稱：醛脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種名為醛脫氫酶的新型酶(在下文中稱作SNDH III)，該酶負責(zé)在中性pH時將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)換為L-抗壞血酸(在下文中稱作維生素C)，以及在堿性pH時將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)換為2-酮-L-古洛糖酸(在下文中稱作2-KGA)。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生該酶的方法，以及提供利用該酶直接從如L-山梨糖酮的醛糖中產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的方法。
維生素C是人類非常重要且不可缺少的營養(yǎng)素之一。已廣泛研究了在多種生物體內(nèi)產(chǎn)生維生素C的代謝途徑。然而，并無有關(guān)涉及直接將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)換成維生素C的純化酶的報道。因此，本發(fā)明的酶對用維生素C新型生產(chǎn)方法代替當(dāng)前的如Reichstein方法(Helvetica Chimica Acta 17311(1934))是非常有用的。
本發(fā)明提供了具有以下物理化學(xué)特性的純化醛脫氫酶a)分子量為190,000±15,000Da(由兩個α亞單位和一個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)或分子量為250,000±20,000Da(由兩個α亞單位和兩個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)，其中α亞單位的分子量為75,000±3,000Da，且β亞單位的分子量為55,000±2,000Da；b)底物特異性對醛化合物具有活性；c)輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)和血紅素c；d)最適pH從約6.5到約8.0(對于從L-山梨糖酮生成維生素C)或約9.0(對于從L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸鹽和疊氮化鈉。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及分子量為190,000±15,000Da的具有如上所述物理化學(xué)特性的醛脫氫酶。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及分子量為250,000±20,000Da的具有如上所述物理化學(xué)特性的醛脫氫酶。
本發(fā)明SNDH III的來源并不是挑剔性的。因此本發(fā)明的SNDH III可例如通過下述方法產(chǎn)生通過從能夠產(chǎn)生具有上述特性的醛脫氫酶的葡糖桿菌(Gluconobacter)或其它微生物中分離，或通過重組或化學(xué)合成產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一目標是提供用于產(chǎn)生上述SNDH III的方法，其包括在需氧條件下于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生具有以上提及特性的醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物、破碎微生物細胞以及從微生物破碎細胞的無細胞提取物中分離醛脫氫酶。
在本發(fā)明的一個方面中，用于產(chǎn)生如上所述SNDH III的方法是通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生具有以上提及特性的醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物而得以進行，其中反應(yīng)是在pH從約4.5到約9.0，溫度從約20℃到約50℃的條件下進行。這樣產(chǎn)生的SNDH III對于維生素C和2-KGA的生產(chǎn)是有用的。
本發(fā)明的進一步目標是提供用于從醛糖產(chǎn)生其相應(yīng)的羧酸和/或其內(nèi)酯的方法，其包括用具有上面提及特性的純化SNDH III或用在電子受體存在下能生產(chǎn)具有上面提及特性的醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取液接觸醛。
術(shù)語“醛糖”意指在除羰基碳原子外的所有碳原子上均帶有羥基的醛。
此處應(yīng)用的醛糖包括但不限于L-山梨糖酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖及D-木糖。
優(yōu)選的內(nèi)酯為維生素C，優(yōu)選的羧酸為2-KGA，且優(yōu)選的醛糖為L-山梨糖酮。
在一個實施方案中，從醛糖產(chǎn)生其相應(yīng)的羧酸和/或其內(nèi)酯的方法包括用具有以上提及特性的純化SNDH III或用從如上定義的屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取物接觸醛，其中所述SNDH III的分子量為190,000±15,000Da。
在一個實施方案中，從醛糖產(chǎn)生其相應(yīng)的羧酸和/或其內(nèi)酯的方法包括用具有以上提及特性的純化SNDH III或從如上定義的屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取物接觸醛，其中所述SNDH III的分子量為250,000±20,000Da。
在一個方面中，本發(fā)明著力于從醛糖產(chǎn)生其相應(yīng)的羧酸和/或其內(nèi)酯的方法，包括用具有以上提及特性的純化SNDH III或用從屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取物接觸醛，所述微生物屬于能夠生產(chǎn)具有以上提及特性的醛脫氫酶的葡糖桿菌屬，其中的反應(yīng)在pH從約4.5到約9.0且溫度從約20℃到約50℃的條件下進行。在生產(chǎn)維生素C的情形時，反應(yīng)優(yōu)選地是在pH約為6.5至約8.0的條件下進行。在生產(chǎn)2-KGA的情形時，反應(yīng)優(yōu)選地是在pH約為9.0的條件下進行。
本發(fā)明也描述了具有以上提及特性的純化醛脫氫酶在用于從醛糖生產(chǎn)其相應(yīng)羧酸和/或其內(nèi)酯方法中的用途，其包含用所述純化醛脫氫酶或用從微生物中制備的無細胞提取物接觸醛，前述微生物屬于在電子受體存在條件下能夠產(chǎn)生所述醛脫氫酶的葡糖桿菌屬。
根據(jù)下文中提及的實施例制備的SNDH III的純化樣本的理化特性如下1)酶活性在電子受體存在下，本發(fā)明的SNDH III根據(jù)以下反應(yīng)方程催化L-山梨糖酮氧化為維生素C和/或2-KGAL-山梨糖酮+電子受體→維生素C和/或2-KGA+還原的電子受體SNDH III不以氧作為電子受體。這可以通過使用氧作為可能的電子受體時，SNDH III未能將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)換為維生素C和/或2-KGA而得以證實。此外，在反應(yīng)混和物中用溶解的氧探針進行檢測時，未能檢測到氧消耗。另外，NAD和NADP不是適宜的電子受體。但是，其它常規(guī)電子受體可以與本發(fā)明的SNDH III一起應(yīng)用。優(yōu)選的電子受體為2，6-二氯酚靛酚(DCIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、鐵氰化物和細胞色素c。至少對于某些待轉(zhuǎn)換成其相應(yīng)酸的醛底物而言，不必存在最少量的電子受體。但是，可被氧化的底物量依賴于特定電子受體的量和其電子接受特性。
按以下步驟進行酶試驗
a)確定將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)換成每一產(chǎn)物-維生素C或2-KGA的酶活性的試驗在終體積為100μl水中，反應(yīng)混和物的組成為1.0mM PMS、25mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、1.0μM PQQ、1.0mM CaCl2、50mM L-山梨糖酮以及酶溶液，在試驗開始前即時制備前述反應(yīng)混和物。除非另作說明，反應(yīng)條件均為30℃下進行60分鐘。應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)在波長264nm下檢測作為酶活性指標的維生素C的量，所述HPLC系統(tǒng)由UV探測器(TOSOH UV8000；TOSOH Co.，Kyobashi 3-2-4，Chuo-ku，日本東京)、雙泵(TOSOH CCPE；TOSOH Co.)、積分儀(Shimadzu C-R6A；Shimadzu Co.，Kuwahara-cho 1，Nishinokyo，Chukyo-ku，日本京都)和柱子(YMC-Pack聚胺II；YMC，Inc.，3233 Burnt Mill Drive Wilimington，NC28403，USA)組成。應(yīng)用上述的HPLC檢測作為酶活性另一指標的2-KGA生成量。對于每種產(chǎn)物，一個單位的酶活性定義為在反應(yīng)混和物中分別生成1mg維生素C和2-KGA所需的酶量。
b)SNDH III的光度分析在終體積為100μl水中，反應(yīng)混和物的組成為0.1mM DCIP、1.0mMPMS、50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、1.0μM PQQ、2-100mM底物(L-山梨糖酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖等)以及酶溶液。在試驗前即時制備前述反應(yīng)混和物。在25℃下用L-山梨糖酮起始反應(yīng)，且以600nm處的DCIP初始還原速率檢測酶活性。一個單位酶活性定義為每分鐘催化還原1μmolDCIP的酶量。pH7.0時的DCIP消光系數(shù)為14.2mM-1。對照比色皿含有除L-山梨糖酮外的所有上述成份。
應(yīng)用Protein Assay CBB Solution(Nacalai tesque，Inc.日本京都)測試蛋白質(zhì)濃度。
2)底物特異性通過用與上面1b)下所述的除了用100mM磷酸鉀(pH7.5)或100mMTris-HCl(pH9.0)作為緩沖液外相同的酶分析法檢測酶底物特異性。在pH7.5和pH9.0時，SNDH III對D-葡糖醛酮(2mM)、D-葡萄糖(100mM)和D-木糖(100mM)的相對活性高于對L-山梨糖酮(2mM)的相對活性。但在pH7.5和pH9.0時，對L-山梨糖(100mM)、D-山梨醇(100mM)和L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯(100mM)的相對活性低于對L-山梨糖酮相對活性的1％。結(jié)果見表1A。
表1A純化SNDH III的底物特異性
表1B表1A中顯示的底物氧化的還原產(chǎn)物
3)最適pH通過用與上面1a)下所述的除應(yīng)用多種pH值和濃度為100mM的緩沖液外相同的分析法檢測SNDH III的反應(yīng)速度和反應(yīng)混和物的pH值間的相互關(guān)系。
本發(fā)明的SNDH III在從約pH6.5到約pH8.0時顯示出產(chǎn)生維生素C的相對高活性，且在約pH9.0時顯示出產(chǎn)生2-KGA的高活性。
4)溫度的影響通過用與上面1a)下所述的除應(yīng)用多種溫度外相同分析法檢測溫度對于酶反應(yīng)的影響。在生成維生素C和2-KGA時，酶反應(yīng)在高達至少50℃時能穩(wěn)定地進行。
5)金屬離子和抑制劑的影響通過用與上面1b)下所述相同的試驗方法測定金屬離子和抑制劑對酶的L-山梨糖酮脫氫酶活性的影響。將每一化合物溶液攪拌入基礎(chǔ)反應(yīng)混和物中，并加入本發(fā)明的SNDH III開始反應(yīng)。結(jié)果見表2。
表2抑制劑和金屬對純化SNDH III的活性的影響
除EDTA、NaN3和一碘乙酸鹽的濃度為5.0mM之外，加入反應(yīng)混和物中的每一化合物濃度均為1.0mM。
如表3所示，Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和Mg2+抑制酶活性。加入的5mM一碘乙酸鹽強烈抑制酶活性。加入的5mM疊氮化鈉微弱抑制酶活性。
6)分子量應(yīng)用大小排阻凝膠柱(TSK-gel G3000 SWXL；TOSOH Co.，Akasaka1-7-7，Minato-ku，日本東京)測定SNDH III的分子量。柱層析上，酶顯示有與約190,000±15,000Da和約250,000±20,000Da的表觀分子量對應(yīng)的兩個峰。應(yīng)用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后周CBB-染色對2％SDS處理的純化SNDH III進行分析時，結(jié)果顯示SNDH III由兩種不同的亞單位組成，其分子量分別為75,000±3,000(α亞單位)和55,000±2,000Da(β亞單位)。這表明SNDH III包含兩個α和一個β亞單位或兩個α和兩個β亞單位的兩種亞單位結(jié)構(gòu)，其中α亞單位的分子量為75,000±3,000Da且β亞單位的分子量為55,000±2,000Da。
SNDH III的三聚體和四聚體形式均具有活性。
7)輔基50μl 100mM NaH2PO4-HCl(pH約1.0)的純化SNDH III(0.1mg)加入等體積的甲醇并充分混合。離心樣本，去除沉淀物。產(chǎn)生的上清液用于輔基分析。萃取液的吸收光譜與PQQ的真實樣本(Mitsubishi Gas Chemical，日本)基本相同。發(fā)現(xiàn)其吸收峰位于251和348nm處。此外，通過應(yīng)用反相柱(YMC-Pack Pro C18 AS-312；YMC Co.，Ltd)在波長313nm處進行的HPLC分析顯示，帶有甲醇的SNDH III的萃取液與真實PQQ具有相同的保留時間。
通過還原光譜減氧化光譜而產(chǎn)生的差異光譜嘗試進行純化SNDH III的血紅素c的檢測，所述差異光譜通過UV-VIS自記分光光度計(ShimadzuUV-2200；Shimadzu Co.)進行。SNDH III以50μg/ml的濃度懸浮于50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，并制備連二亞硫酸鹽還原型和過硫酸銨氧化型的SNDH III以進行差異光譜的測定。光譜在552和523nm處給出差異最大值。
這些結(jié)果強烈提示SNDH III具有用作輔基的PQQ和血紅素c。
8)底物濃度的影響測定從1mM到8mM的多種濃度L-山梨糖酮的氧化反應(yīng)速度以確定L-山梨糖酮的Km值。當(dāng)DCIP用作該反應(yīng)的電子受體時，基于反應(yīng)速度的雙倒數(shù)作圖法計算得出pH為7.5和9.0時的米氏常數(shù)分別為6.5mM和16.8mM。
9)純化步驟如離子交換柱層析、疏水柱層析、鹽析和透析的已知純化方法的任意組合實現(xiàn)SNDH III的純化。
可通過在需氧條件下用液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)適宜的微生物、破碎微生物細胞并從微生物破碎細胞的無細胞提取物中分離并純化醛脫氫酶來制備本發(fā)明提供的SNDH III。
用于本發(fā)明方法的微生物為能夠產(chǎn)生如在此前定義的醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物。
優(yōu)選菌株是氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的菌株是氧化葡糖桿菌DSM 4025，根據(jù)布達佩斯條約，于1987年3月17日保藏于德意志微生物保藏中心(德國)，保藏號為DSM No.4025。保藏者為中華人民共和國北京三里河路52號，中國科學(xué)院微生物所東方科學(xué)儀器進出口公司。有效保藏者為該研究所，其地址全稱是中華人民共和國，北京，海淀中關(guān)村，中國科學(xué)院微生物所，100080。
此外，菌株的傳代培養(yǎng)菌也保藏于日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST)，也是基于布達佩斯條約，在1992年3月30日保藏，保藏號為氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)。保藏者是日本羅氏K.K.(NipponRoche K.K.)，位于日本東京，港區(qū)，芝2丁目6-1。該傳代培養(yǎng)菌也最優(yōu)選地用于本發(fā)明。
因而，本發(fā)明的一個目標是提供此前定義的醛脫氫酶，其源自具有氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)菌株、它的傳代培養(yǎng)物或突變體的鑒定特性的氧化葡糖桿菌。
可以通過如紫外或X射線照射或如氮芥或通過N-甲基-n′-硝基-N-亞硝基胍的化學(xué)誘變劑處理細胞而獲得氧化葡糖桿菌DSM 4025(FERMBP-3812)的突變體或?qū)儆谄咸菞U菌屬并具有氧化葡糖桿菌DSM 4025(FERM BP-3812)鑒別特性的微生物。
可應(yīng)用微生物的任意類型如靜止細胞、丙酮處理的細胞、冷凍干燥細胞、固定細胞等直接作用于底物。在可采用任意本身已知的與通過通風(fēng)微生物培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的方法，且特別優(yōu)選攪拌深層發(fā)酵罐。用于進行反應(yīng)的優(yōu)選細胞濃度范圍為從約0.01g濕細胞/ml到0.7g濕細胞/ml，更優(yōu)選地為從0.03g濕細胞/ml到0.5g濕細胞/ml。
微生物“氧化葡糖桿菌”也包括具有相同理化特性的該物種的同物異名或基原異名，其由原核生物命名法的國際編碼所定義。
氧化葡糖桿菌No.4025(FERM BP-3812)的特性如下a)由山梨糖生成2-KGA；b)將乙醇氧化成乙酸；c)將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸；d)多元醇的生酮作用；e)在pH4和pH5的甘露醇肉湯(培養(yǎng)24小時)中生長菌膜和環(huán)，且在pH4.5的葡萄糖肉湯內(nèi)生長菌膜；f)將甘油不充分氧化成二羥丙酮；g)由山梨醇和葡糖二酸但不由葡萄糖、果糖、葡糖酸、甘露醇或2-酮-D-葡糖酸生成2-酮-D-葡糖二酸；h)多態(tài)，明顯無鞭毛；i)從果糖生產(chǎn)褐色素；j)當(dāng)在巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)或其細胞提取物存在條件下進行共培養(yǎng)時，生長良好；k)鏈霉素敏感。
在通氣條件下，可在補充以適當(dāng)營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物?？稍趐H從約4.0到約9.0，更優(yōu)選地從約6.0到約8.0條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間根據(jù)所應(yīng)用的pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而有所不同，且優(yōu)選地為約1到5天。進行培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范圍為從約13℃到約36℃，更優(yōu)選地從約18℃到約33℃。高達約50℃的溫度也可適于微生物的培養(yǎng)。
培養(yǎng)基通常需含有可同化的碳源和可消化的氮源營養(yǎng)物，所述碳源營養(yǎng)物如甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、赤蘚醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選地為D-山梨醇、D-甘露醇和甘油，所述氮源營養(yǎng)物如有機物，如蛋白胨、酵母抽提物、發(fā)面酵母、尿素、氨基酸和玉米漿。多種無機物如硝酸鹽和銨鹽也可用作氮源。此外，培養(yǎng)基通常含有無機鹽，如硫酸鎂、磷酸鉀和碳酸鈣。
以下簡要描述了培養(yǎng)后從微生物中分離并純化SNDH III的一個實施方案(1)通過離心或過濾從肉湯液體培養(yǎng)基中收集細胞；(2)用水、生理鹽水或具有適宜pH的緩沖液洗滌收集的細胞；(3)將洗滌的細胞懸浮于緩沖液中，并用勻漿器、超聲儀或法式壓濾儀破碎或通過溶菌酶等處理以形成破碎細胞的溶液。
(4)從破碎細胞的無細胞提取物中，更優(yōu)選地從微生物的可溶級分中分離并純化SNDH III。
可以通過任意的常規(guī)技術(shù)，包括但不限于離心，從破碎的細胞中獲得無細胞提取物。
本發(fā)明提供的SNDH III可用作由L-山梨糖酮生成維生素C和/或2-KGA的催化劑。可在如DCIP和PMS等的電子受體存在條件下于如磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液等的溶液中以pH值約4.5到約9.0產(chǎn)生維生素C和2-KGA。生產(chǎn)維生素C時，若pH設(shè)置為從約6.5到約8.0且溫度設(shè)置為從約20℃到約40℃，通?？色@得最佳結(jié)果。生產(chǎn)2-KGA時，若pH設(shè)置為約9.0且溫度設(shè)置為從約20℃到約50℃，通?？色@得最佳結(jié)果。
反應(yīng)混合物中L-山梨糖酮的濃度依賴于其它反應(yīng)條件而變化，但通常為約0.5～50g/l，最優(yōu)選地從約1g/l到約30g/l。
反應(yīng)中，也可在具有適當(dāng)載體的固定狀態(tài)下應(yīng)用SNDH III。可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)通常已知的固定酶的任何方法。例如，可將酶直接固定于具有一種或多種官能團的樹脂的膜、微粒等上，或可通過具有一種或多種官能團的如戊二醛的橋聯(lián)化合物將酶固定于樹脂上。
除此之外，培養(yǎng)的細胞也可用于從醛糖生產(chǎn)其相應(yīng)羧酸和/或其內(nèi)酯，特別是用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C。在與上述L-山梨糖酮轉(zhuǎn)變成2-KGA和/或維生素C相同的條件下，包括底物濃度，從其它醛糖生產(chǎn)其相應(yīng)羧酸和/或其內(nèi)酯。
以下實施例進一步闡明本發(fā)明。
實施例1SNDH III的制備除非另作說明，所有操作均在8℃進行，且緩沖液為0.05M磷酸鉀(pH7.0)。
(1)氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的培養(yǎng)在瓊脂平板上于27℃培養(yǎng)氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERMBP-3812)4天，所述瓊脂平板含有5.0％D-甘露醇、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米漿、5.0％發(fā)面酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3和2.0％瓊脂。將一鉑環(huán)細胞接種于500ml錐形燒瓶內(nèi)的50ml種子培養(yǎng)基中，并在180轉(zhuǎn)/分鐘的旋轉(zhuǎn)搖床上30℃培養(yǎng)一天，所述種子培養(yǎng)基含有2％L-山梨糖、0.2％酵母抽提物、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米漿、0.5％尿素和1.5％CaCO3。由此制備的種子培養(yǎng)物用于接種30升廣口瓶發(fā)酵罐中的15升培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有8.0％L-山梨糖、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、3.0％玉米漿、0.4％酵母抽提物和0.15％消泡劑。發(fā)酵參數(shù)為30℃的溫度、800轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速率和0.5vvm(空氣體積/培養(yǎng)基體積/分鐘)的通風(fēng)。發(fā)酵期間，用氫氧化鈉將pH維持在7.0。培養(yǎng)48小時后，通過連續(xù)離心收集經(jīng)兩套發(fā)酵罐獲得的30升含有氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的培養(yǎng)肉湯?；厥蘸屑毎某恋韷K，并懸浮于適當(dāng)體積的鹽水中。2,500轉(zhuǎn)/分鐘(1,000xg)離心懸浮物后，回收含有微紅色的細胞上清液以移除源自玉米漿和酵母抽提物的不溶物，所述不溶物為培養(yǎng)基成分。然后以8,000轉(zhuǎn)/分鐘(10,000xg)離心上清液以獲得細胞沉淀快。結(jié)果，從30升肉湯中獲得123g氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)濕細胞。
(2)胞質(zhì)溶膠級分的制備將濕細胞(64.2g)懸浮于280ml緩沖液中，并通過法式細胞壓濾儀壓濾。離心以移除完整細胞后，將上清液稱為無細胞提取物，并于100,000xg離心無細胞提取物60分鐘。產(chǎn)生的上清液(227ml)稱為氧化葡糖桿菌DSMNo.4025(FERM BP-3812)的可溶級分。用緩沖液透析該級分后，將濃度為0.107單位/mg蛋白質(zhì)的具有從L-山梨糖酮產(chǎn)生維生素C特異活性的105ml透析級分，用于下一純化步驟。
(3)二乙氨乙基(DEAE)纖維素柱層析將透析液(150ml)裝于經(jīng)緩沖液平衡的DEAE-纖維素柱(WhatmanDE-52，3×50cm；Whatman BioSystems Ltd.，Springfield MIII，JamesWhatman Way，Maidstone，Kent，U.K.)上，并用緩沖液洗滌以洗脫較小的蛋白質(zhì)。然后，將結(jié)合于樹脂上的蛋白質(zhì)用0.28、0.32、0.36M NaCl緩沖液逐步洗脫。0.36M NaCl洗脫出主要的酶活性。收集活性級分(143ml)。
(4)羧甲基纖維素柱層析用超濾器(Centriprep-10，Amicon；Amicon Inc.Cherry Hill Drive，Beverly，MA01915，U.S.A.)過濾濃縮來自上一步驟的活性部分(127ml)。用緩沖液透析濃縮樣本(28ml)后，將透析級分(31ml)中的28ml裝于用緩沖液平衡的羧甲基纖維素柱(Whatman CM-52，3×23cm；WhatmanBioSystems Ltd.)上。收集通過柱子而沒有結(jié)合在樹脂上的蛋白質(zhì)。
(5)Q-瓊脂糖凝膠柱層析(第一步)用超濾器(Centriprep-10)過濾濃縮收集的活性級分(43ml)。將源自上一步的濃縮活性級分(10ml)的一部分(9.5ml)裝在經(jīng)緩沖液平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含0.3M NaCl的緩沖液洗柱子后，將0.3到0.6M的NaCl以線性梯度加到緩沖液中。NaCl濃度為0.55～0.57M范圍內(nèi)洗脫出活性級分。
(6)Q-瓊脂糖凝膠柱層析(第二步)用超濾器(Centriprep-10)過濾濃縮上一步收集的活性級分(22ml)。然后用緩沖液透析濃縮樣本(3.0ml)。將透析樣本(3.5ml)裝于經(jīng)緩沖液平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含0.35M NaCl的緩沖液洗柱子后，將0.35到0.7M的NaCl以線性梯度加入到緩沖液中。在NaCl濃度為0.51～0.53M范圍內(nèi)洗脫出活性級分。
(7)凝膠過濾柱層析將上一步收集的活性級分(20ml)用超濾器過濾以進行濃縮和脫鹽。將濃縮脫鹽(低于0.1M NaCl)樣本(2.0ml)的一部分(1.5ml)裝在含有經(jīng)0.1M NaCl緩沖液平衡的Sephacryl S-300 High Resolution柱(Pharmacia，1.5×120cm)上。用緩沖液透析并收集活性級分(12ml)。
(8)疏水柱層析用超濾器(Centriprep-10)過濾濃縮上一步的透析活性級分。將濃縮樣本(1.75ml)中的一部分(1.5ml)加到等體積(1.5ml)的含3M硫酸銨的緩沖液中(終濃度1.5M)。離心(15,000xg)樣本后，將上清液裝在經(jīng)含有1.5M硫酸銨的緩沖液平衡的RESOURCE ISO柱(Pharmacia，1.0ml)上。用含有1.5M硫酸銨的緩沖液洗滌柱子后，用含有從1.5到0.75M線性梯度硫酸銨的緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。在從1.15到1.13M硫酸銨的濃度范圍內(nèi)洗脫出對應(yīng)于SNDH III的活性級分。應(yīng)用透析杯(Dialysis-cupMWCO 8000，Daiichi pure chemicals，Nihonbashi 3-13-5，Chuo-ku，日本東京)以緩沖液透析活性級分。然后，收集級分并存儲于-20℃。
酶純化步驟的總結(jié)見表3。
表3來自氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的SNDH III的純化
酶的一個單位*定義為在以上提及的1a)中所述的反應(yīng)混和物中每小時生產(chǎn)1mg維生素C所需的酶量。
(9)分離酶的純化應(yīng)用用于產(chǎn)生維生素C時，比活度為34.5單位/mg蛋白質(zhì)，且用于產(chǎn)生2-KGA時，比活度為7.82單位/mg蛋白質(zhì)的純化酶進行以下的分析通過高效液相色譜對天然SNDH III的分子量進行評估，其中所述色譜應(yīng)用280nm且流速為1.5ml/分鐘的經(jīng)含有0.3M NaCl的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的大小排阻凝膠柱(TSK凝膠G3000 SWXL柱，7.8×300mm)。應(yīng)用維生素B12(1.35kDa)、肌球蛋白(17kDa)、卵清蛋白(44kDa)、γ-球蛋白(158kDa)和甲狀腺球蛋白(670kDa)作為分子量標準。純化的SNDHIII顯示出分子量分別為190,000±15,000Da和250,000±20,000Da的兩個峰。
根據(jù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，SNDH III由兩種亞單位組成，其中之一的分子量為75,000±3,000Da，且另一個的分子量為55,000±2,000Da。
(10)反應(yīng)產(chǎn)物鑒定將溶于100μl緩沖液中的含有純化SNDH III(1.21μg)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反應(yīng)混和物，在30℃下培養(yǎng)1小時。用薄層色譜法(硅膠60F254，MERCK，64271達姆施特塔，德國)和HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。從酶反應(yīng)中獲得兩種產(chǎn)物，即維生素C和2-KGA。分析維生素C時，通過HPLC系統(tǒng)上的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，Inc.)對樣本進行測試。分析2-KGA時，通過HPLC系統(tǒng)上的C-18柱(YMC-Pack Pro C18，YMC，Inc.)對樣本進行測試。
實施例2pH對應(yīng)用SNDH III從L-山梨糖酮生成維生素C或2-KGA的影響檢測pH對酶反應(yīng)的影響。將溶于100μl緩沖液(100mM)中的含有純化SNDH III(607ng)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反應(yīng)混和物，在30℃下溫育1小時。反應(yīng)產(chǎn)物通過HPLC進行分析。結(jié)果見表4。
表4pH對應(yīng)用SNDH III從L-山梨糖酮生成維生素C或2-KGA的影響
實施例3溫度對應(yīng)用SNDH III從L-山梨糖酮生成維生素C或2-KGA的影響檢測溫度對酶活性的影響。將溶于100μl 25mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的含純化的SNDH III(607ng)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反應(yīng)混合物，在多種溫度(20-60℃)下溫育1小時。反應(yīng)產(chǎn)物通過HPLC進行分析。結(jié)果見表5。
表5溫度對應(yīng)用SNDH III從L-山梨糖酮生成維生素C或2-KGA的影響
權(quán)利要求
1.具有如下物理化學(xué)特性的經(jīng)純化醛脫氫酶a)分子量為190,000±15,000Da(由兩個α亞單位和一個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)或分子量為250,000±20,000Da(由兩個α亞單位和兩個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)，其中α亞單位的分子量為75,000±3,000Da，且β亞單位的分子量為55,000±2,000Da；b)底物特異性對醛化合物具有活性；c)輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)和血紅素c；d)最適pH從約6.5到約8.0(對于從L-山梨糖酮生成維生素C)或約9.0(對于從L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸鹽和疊氮化鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的醛脫氫酶，其源自能夠產(chǎn)生所述醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的醛脫氫酶，其中微生物為具有菌株氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的鑒定特性的氧化葡糖桿菌、其傳代培養(yǎng)物或突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的醛脫氫酶，其中微生物是氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)、其傳代培養(yǎng)物或突變體。
5.用于產(chǎn)生具有如下物理化學(xué)特性的醛脫氫酶的方法a)分子量為190,000±15,000Da(由兩個α亞單位和一個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)或分子量為250,000±20,000Da(由兩個α亞單位和兩個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)，其中α亞單位的分子量為75,000±3,000Da，且β亞單位的分子量為55,000±2,000Da；b)底物特異性對醛化合物具有活性；c)輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)和血紅素c；d)最適pH從約6.5到約8.0(對于從L-山梨糖酮生成維生素C)或約9.0(對于從L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸鹽和疊氮化鈉，所述方法包括在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中于通氣條件下培養(yǎng)能產(chǎn)生具有上述特性醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物、破碎微生物細胞以及從破碎的微生物細胞的無細胞提取物中分離并純化醛脫氫酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中反應(yīng)是在pH約4.5到約9.0且溫度約20℃到約50℃的條件下進行。
7.用于從醛糖生成其相應(yīng)羧酸和/或其內(nèi)酯的方法，其包括用醛與具有以下物理化學(xué)特性的經(jīng)純化醛脫氫酶接觸a)分子量為190,000±15,000Da(由兩個α亞單位和一個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)或分子量為250,000±20,000Da(由兩個α亞單位和兩個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)組成)，其中α亞單位的分子量為75,000±3,000Da，且β亞單位的分子量為55,000±2,000Da；b)底物特異性對醛化合物具有活性；c)輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)和血紅素c；d)最適pH從約6.5到約8.0(對于從L-山梨糖酮生成維生素C)或約9.0(對于從L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸鹽和疊氮化鈉，或?qū)⑷┡c在電子受體存在下能夠產(chǎn)生具有上述特性的醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取物接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5到7中任意一項所述的方法，其中微生物為具有菌株氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)鑒定特性的氧化葡糖桿菌、其傳代培養(yǎng)物或突變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中微生物為氧化葡糖桿菌DSM No.4025(FERM BP-3812)、其傳代培養(yǎng)物或突變體。
10.權(quán)利要求7的方法，其中內(nèi)酯為維生素C，羧酸為2-酮-L-古洛糖酸，且醛糖為L-山梨糖酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求7到10中任意一項所述的方法，其中用于產(chǎn)生維生素C和2-酮-L-古洛糖酸的反應(yīng)分別是在從約4.5到約9.0的pH值和從約20℃到約50℃的溫度下進行。
12.根據(jù)權(quán)利要求7到11中任意一項所述的方法，其中用于產(chǎn)生維生素C的反應(yīng)是在從約6.5到約8.0的pH值下進行，且用于產(chǎn)生2-酮-L-古洛糖酸的反應(yīng)是在pH值約為9.0的條件下進行，且用于這兩種生產(chǎn)方法的溫度均為從約20℃到約50℃。
13.權(quán)利要求1的經(jīng)純化醛脫氫酶的用途，用于從醛糖產(chǎn)生其相應(yīng)羧酸和/或其內(nèi)酯的方法中，所述方法包括用所述純化醛脫氫酶或在電子受體存在下能夠產(chǎn)生所述醛脫氫酶的屬于葡糖桿菌屬的微生物中制備的無細胞提取物接觸醛。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有以下物理化學(xué)特性的新型醛脫氫酶分子量為190,000±15,000Da，所述分子包含兩個α亞單位和一個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)，或分子量為250,000±20,000Da，所述分子包含兩個α亞單位和兩個β亞單位的亞單位結(jié)構(gòu)，其中α亞單位分子量為75,000±3,000Da，且β亞單位分子量為55,000±2,000Da；對L－山梨糖酮、D－葡糖醛酮、D－葡萄糖和D－木糖有脫氫酶活；利用吡咯并喹啉醌和血紅素c作為輔因子；對于從L－山梨糖酮產(chǎn)生維生素C，最適pH為從約6.5到約8.0，且對于從L－山梨糖酮產(chǎn)生2－酮－L－古洛糖酸，最適pH為約9.0；并受Co
文檔編號C12P17/04GK1659275SQ03813023
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者達雄星野, 宮崎太郎, 杉澤昭秀 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)有限公司