專利名稱：防止或降低飲料混濁的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過添加內(nèi)切蛋白酶而防止或降低飲料混濁(haze)的方法，以及根據(jù)本發(fā)明方法獲得的新飲料。本發(fā)明也涉及新的內(nèi)切蛋白酶。
混濁是飲料工業(yè)中的公知現(xiàn)象?；鞚崂缈纱嬖谟谄【?、葡萄酒和果汁中?；鞚嵝纬煽梢猿霈F(xiàn)在釀造過程中的不同階段。在T.Nagodawithana和G.Reed編輯的“Enzymes in foodprocessing″，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449中，已經(jīng)建議啤酒中的混濁是啤酒蛋白質(zhì)和多酚原矢車菊素(polyphenolic procyanidins)相互作用的結(jié)果。它解釋道，在啤酒中混濁經(jīng)常在啤酒的冷卻過程中形成。啤酒經(jīng)常在冷卻的條件下發(fā)酵和熟化。為了獲得澄清效果，啤酒經(jīng)常在冷卻條件下過濾。盡管存在這一過濾步驟，啤酒在包裝并賣給消費(fèi)者飲用前再次冷卻，從而變成霧狀。最終，即使啤酒沒有或不再冷卻時(shí)，也會形成混濁，并出現(xiàn)沉淀物?；鞚嵝纬墒遣幌胍?，因?yàn)橛苫鞚嵝纬伤鶎?dǎo)致的霧狀與由微生物污染所導(dǎo)致的霧狀是類似的，而后者是不想要的，特別是對于清啤酒(brightbeers)來說。
在″Industrial Enzymology″，第2版，Chapter 2.6，p.124-125中，描述了啤酒中的混濁是由麥芽中的高分子量大麥醇溶蛋白組分交聯(lián)引起的，所述大麥醇溶蛋白組分含有高比例的疏水性氨基酸，其與主要由原花色素和兒茶素(類黃酮)組成的多酚類結(jié)合。據(jù)描述，少量的糖類和痕量的礦物離子也參與了混濁形成以及氧化，其中氧化在多酚類的聚合產(chǎn)生不可逆混濁中扮演了重要角色。它建議，冷卻時(shí)，多酚類緩慢地與蛋白質(zhì)結(jié)合形成冷混濁，但在加熱時(shí)又重新溶解。然而，最終，隨著多酚類的聚合和尺寸的增加，它們在室溫下變成不溶，進(jìn)而形成不可逆的或永久的混濁。
在一些其它的出版物中，已經(jīng)建議混濁在例如啤酒、葡萄酒和果汁、咖啡和茶中的形成是蛋白質(zhì)和多酚之間相互作用的結(jié)果。(K.J.Siebert等人，J.Agric.Food Chem.44(1996)1997-2005和K.J.Siebert等人，J.Agric.Food Chem.44(1996)80-85，K.J.Siebert，J.Agric.Food Chem.47(1999)353-362).自從L.Wallerstein在1911年的發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)知道減少啤酒中冷卻混濁形成(chill haze formation)的一個(gè)方法是向啤酒中添加木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶是番木瓜果的提取物，具有蛋白水解活性。在T.Nagodawithana和G.Reed編輯的″Enzymes in foodprocessing″，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449中，木瓜蛋白酶被描述為遠(yuǎn)比任何其它酶更能有效防止啤酒的冷混濁。但是，木瓜蛋白酶發(fā)揮作用的確切機(jī)制還沒有確定(″Enzymes in food processing″，由T.Nagodawithana和G.Reed編輯，第三版，Academic press Inc.，San Diego，Chapter V，p.448-449).
但是，使用木瓜蛋白酶的一個(gè)不利之處在于它對泡沫具有不利的影響。蛋白質(zhì)是啤酒中形成泡沫所必需的。但是，木瓜蛋白酶通過其蛋白水解活性，不利地影響了酒頭泡沫(head foam)的穩(wěn)定性。
葡萄酒中混濁的形成在例如T.Nagodawithana和G.Reed編輯的″Enzymes in food processing″，第三版，Academic pressInc.，San Diego，Chapter 16，p.425中進(jìn)行了討論，其中描述道在葡萄酒儲藏過程中葡萄蛋白質(zhì)導(dǎo)致了混濁的形成。如果葡萄酒在裝瓶之后形成沉淀，則該葡萄酒對消費(fèi)者將缺少吸引力，這將影響銷售。為了防止沉淀，使用了例如皂土。盡管皂土和其它吸附劑能夠成功地除去蛋白質(zhì)，但其是非選擇性的，也會從葡萄酒中除去其它所需的化合物，這常常影響葡萄酒的感官特性。此外，使用皂土?xí)?dǎo)致葡萄酒的大量損失，并且使得除去含有皂土的廢物比較困難。
盡管其機(jī)制還未很好了解，但是假設(shè)木瓜蛋白酶的加入水解了啤酒中的蛋白質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)-多酚混濁不形成，或者形成的程度變小。皂土在葡萄酒中的使用也是基于類似的原因通過吸收蛋白質(zhì)，其防止了蛋白質(zhì)-多酚混濁和沉淀的形成。但是，除了除去蛋白質(zhì)外，也可以通過除去多酚來減少或防止混濁形成。用于從飲料中除去多酚的典型例子是聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。最近認(rèn)識到多酚是重要的抗氧化劑。
由于抗氧化劑所帶來的所有有益效果，從飲料中除去多酚的選擇并不是防止混濁形成的最吸引人的方法。
由于所有已知的用于防止或除去混濁的方法都具有缺陷，因此仍然需要一種新的方法來防止或降低飲料的混濁。
本發(fā)明的目的是提供一種防止或降低飲料混濁的方法。
出乎意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一目的可以通過提供一種防止或降低飲料混濁的方法來實(shí)現(xiàn)，在該方法中，將具有酸性pH最佳值的內(nèi)切蛋白酶加入到飲料中。優(yōu)選地，該內(nèi)切蛋白酶是具有脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶活性和/或羥脯氨酰特異性活性和/或丙氨酸特異性活性的分離的內(nèi)切蛋白酶。
在本發(fā)明框架中，術(shù)語“飲料”包括處于所有制備階段的飲料。因此，飲料并不僅僅指即可用于消費(fèi)的飲料，而且也指用于制備該飲料的任何組合物。例如，在啤酒制備中所用的麥芽汁也包含在此處所用的術(shù)語“飲料”中。此外，在飲料制備過程中向不是或不完全是液體的組合物中添加脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶也落在本發(fā)明方法的范圍中。在啤酒釀造開始時(shí)加入到醪液中的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶是此類組合物的一個(gè)例子。
脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶(Endo-Pro)是這樣一種優(yōu)選純化的內(nèi)切蛋白酶，其在蛋白質(zhì)或肽在其鏈中含有脯氨酰殘基之處或其附近切割該蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，使用在蛋白質(zhì)或肽中含有脯氨酰殘基之處切割該蛋白質(zhì)或肽的內(nèi)切蛋白酶。
術(shù)語Endo-Pro、脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶、脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶、脯氨酸特異性內(nèi)肽酶和具有脯氨酰特異性活性的肽或者類似表達(dá)方式都是可以互換使用的。
羥脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶(Endo-Hydroxy-Pro)是這樣一種優(yōu)選純化的內(nèi)切蛋白酶，其在蛋白質(zhì)或肽在其鏈中含有羥脯氨酰殘基之處或其附近切割該蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，使用在蛋白質(zhì)或肽中含有羥脯氨酰殘基之處切割該蛋白質(zhì)或肽的羥脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶(Endo-Ala)被定義為這樣一種優(yōu)選純化的內(nèi)切蛋白酶，其在蛋白質(zhì)或肽在其鏈中含有丙氨酸殘基之處或其附近切割該蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用在蛋白質(zhì)或肽含有丙氨酸殘基之處切割該蛋白質(zhì)或肽的丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。
具有脯氨酰特異性活性的內(nèi)切蛋白酶是已知的(E.C.3.4.21.26).但是在飲料中使用脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶或者甚至羥脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來防止或降低混濁則還從來未被描述或建議過。
術(shù)語肽和蛋白質(zhì)在此處可互換使用。同樣，術(shù)語″混濁″和″霧狀″也可互換使用。
在本發(fā)明更優(yōu)選的方法中，使用了在脯氨酰殘基C-末端切割的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。在脯氨酰殘基NH2-末端切割的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶描述于例如出版物Nature，15 January 1998，Vol.391，p.301-304。
通過用脯氨酰特異性和/或羥脯氨酰特異性和/或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶聯(lián)合輔助酶(auxiliary enzyme)進(jìn)行處理，可以在飲料中進(jìn)一步降低混濁。
在某些條件下和在某些飲料中，在單獨(dú)用Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala處理所降低的混濁程度基礎(chǔ)上，需要進(jìn)一步降低混濁。在這種情況下，在Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala處理之前、之中或之后加入輔助蛋白水解酶是有益的。這類輔助酶可以是內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶，例如三肽酶(tripeptidylpeptidase)和/或羧肽酶和/或肽基二肽酶(peptidyl-dipeptidase)。
這一附加處理的目的是增加Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala處理后殘留肽的溶解性和/或進(jìn)一步降低殘留多肽與多酚的相互作用。
該目的通過以下方式實(shí)現(xiàn)向該飲料中加入能除去Endo-Pro處理后所殘留肽的羧基末端脯氨酸殘基的外切蛋白酶，例如三肽酶和/或羧肽酶和/或肽基二肽酶?；蛘?，用內(nèi)切蛋白酶與此類外切蛋白酶聯(lián)用，可以使Endo-Pro處理后所殘留肽進(jìn)一步溶解。特別適用于該目的的是那些能夠切割在甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的N-或C-末端肽鍵的酶。
對合成的顯色肽FA-Pro或FA Pro-Pro具有活性的羧肽酶作為輔助酶是特別有用的。
具有上述特異性的輔助性內(nèi)切蛋白水解酶可以商購獲得，或者用本領(lǐng)域已知的方法篩選，例如借助于合成的顯色肽，如Z-A-A-A-pNA，其中pNA＝對硝基苯胺，Z＝芐氧基羰基，A＝氨基酸甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
對合成的顯色肽例如FA-Leu-Pro或FA-Phe-Pro(其中FA＝呋喃基丙烯酰)具有活性的輔助性肽基二肽酶特別有用。
用輔助酶的處理優(yōu)選不應(yīng)對飲料的味道、質(zhì)地或口感產(chǎn)生不利影響。優(yōu)選地，這些輔助酶具有酸性pH最佳值，或者在酸性條件下具有活性，優(yōu)選低于、等于pH6.0、5.0、4.5或4.0，或者在其附近，甚至更優(yōu)選低于、等于pH3.0或者在其附近。
在大多數(shù)啤酒的生產(chǎn)中，在加入(輔助性)蛋白水解酶時(shí)需要特別小心，不要破壞啤酒形成泡沫的能力。
在傳統(tǒng)的啤酒釀造過程中，谷類被磨碎和搗碎，將所得的醪液過濾得到麥芽汁。該麥芽汁接著被蒸煮，使所有殘余酶活性失活，接著用于支持酵母生長。在酵母生長和過濾后，啤酒得到擴(kuò)增(lagered)。據(jù)描述，在該擴(kuò)增階段，可以向飲料中加入木瓜蛋白酶(collupuline)以防止混濁形成。但是，木瓜蛋白酶破壞了啤酒的泡沫形成能力。
負(fù)責(zé)啤酒泡沫的是一種稱為LTP1(Lipid Transfer Protein)的蛋白質(zhì)，其是一種10kDa的大麥蛋白質(zhì)，具有非常堅(jiān)固的三維結(jié)構(gòu)，以致于在醪液形成階段中通常存在的蛋白酶不能水解該分子。但是，在麥芽汁蒸煮階段，LTP1去折疊，從而使得它對酶切割敏感。為了在泡沫形成中具有活性，LTP1需要具有某一特定最小尺寸?，F(xiàn)在認(rèn)為在擴(kuò)增期間(即麥芽汁蒸煮后)與Collupuline的孵育破壞了LTP1，進(jìn)而破壞了啤酒的泡沫形成能力。
在醪液形成階段或擴(kuò)增階段中使用酸性內(nèi)切蛋白酶，特別是Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro和/或Endo-Ala降低了混濁形成，但是沒有破壞或嚴(yán)重影響LTP1，因此此類酶的使用不會對泡沫形成產(chǎn)生不利影響。
而且，Endo-Pro消化產(chǎn)生的肽的羧基末端脯氨酸殘基的去除進(jìn)一步降低了啤酒的混濁。在這方面，當(dāng)聯(lián)合使用分離自黃單胞菌屬的脯氨酸特異性羧肽酶和Endo-Pro時(shí)，獲得了特別好的結(jié)果。此外，肽基二肽酶A(EC 3.4.15.1)也可成功地獲得該效果。
乳汁凝結(jié)酶例如Fromase也特別適合作為輔助酶與Endo-Pro聯(lián)用以防止或降低混濁。Fromase非常適合于此目的，因?yàn)樗挥绊慙PT1，因此保留了啤酒的泡沫形成能力。
Fromase是獲自Rhizomucor miehei的商業(yè)產(chǎn)品(DSM FoodSpecialities)，用于干酪生產(chǎn)。Fromase是所謂的天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)。這些酶的特征在于具有非常低的pH最佳值，并且非常明顯地偏向于切割大體積、疏水性氨基酸殘基例如Phe-Phe、Phe-Tyr和Leu-Tyr之間的肽鍵。其它天冬氨酸蛋白酶是胃蛋白酶、組織蛋白酶和各種來自不同真菌的酸性蛋白酶。
通過用輔助酶聯(lián)合Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro或Endo-Ala水解的附加處理也可以在葡萄酒中進(jìn)一步降低混濁。
一種稱為幾丁質(zhì)酶的蛋白質(zhì)已知是葡萄酒中產(chǎn)生混濁的主要原因。該幾丁質(zhì)酶源于葡萄，并且富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸殘基。由于葡萄酒具有非常低的pH，我們試圖用酸性內(nèi)切蛋白酶的復(fù)雜混合物來水解該幾丁質(zhì)酶。加入高濃度的稱為AP 50.000的產(chǎn)品(來自Shin Nihon，Japan)對葡萄酒中的混濁形成沒有影響。這一發(fā)現(xiàn)與Ferreira等人的結(jié)論相符(Trends in FoodScience & Technology 12(2002)230-239)，F(xiàn)erreira等人認(rèn)為基于蛋白水解葡萄酒蛋白質(zhì)的所有策略在實(shí)踐中被證明都是不成功的，并且可能是無效的。
在實(shí)施例7中描述了葡萄酒(白的和紅的)與本發(fā)明酶制劑的孵育。通過使用輔助酶，例如除去羧基末端脯氨酸殘基的外肽酶和/或特異于甘氨酸的內(nèi)切蛋白酶可以進(jìn)一步降低葡萄酒的混濁。
在葡萄酒中(或任何其它具有低pH值的飲料)使用Endo-Pro的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)中所用的Endo-Pro也能夠在酸性條件下切割丙氨酸殘基后面的肽鍵以及在羥脯氨酸殘基處切割。(實(shí)施例13).
為了對飲料中的混濁進(jìn)行定量，經(jīng)常使用濁度計(jì)。在濁度計(jì)中，測量了相對于入射光方向以預(yù)定角度散射的光的數(shù)量。濁度測量非常適合于測量蛋白質(zhì)-多酚相互作用所形成的混濁。
多酚被定義為具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即該化學(xué)結(jié)構(gòu)具有至少兩個(gè)被至少一個(gè)羥基基團(tuán)取代的芳香環(huán)，或具有至少一個(gè)被至少兩個(gè)羥基基團(tuán)取代的芳香環(huán)。
多酚的例子是單寧酸和類黃酮，包括例如兒茶酚、黃酮醇和花青素。
脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶的活性依賴于pH值，這一點(diǎn)對于酶活性來說是典型的。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，將內(nèi)切蛋白酶加入到飲料中，其中該內(nèi)切蛋白酶在與其所加入的飲料pH相應(yīng)的pH處具有最大脯氨酰特異性活性。優(yōu)選的飲料是含有蛋白質(zhì)的飲料。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該飲料含有蛋白質(zhì)和多酚。優(yōu)選的飲料是pH值低于7的飲料。
本發(fā)明方法有利地應(yīng)用于啤酒、葡萄酒和果汁。它也可有利地應(yīng)用于啤酒和葡萄酒之外的酒精飲料。
此處所用的術(shù)語“啤酒”至少包括從未發(fā)芽的谷類制備的醪液、發(fā)芽的谷類制備的所有醪液以及從發(fā)芽和未發(fā)芽谷類混合物制備的所有醪液制備的啤酒。術(shù)語“啤酒”也包括具有添加劑的啤酒以及具有任何可能的醇含量的啤酒。
果汁可以是獲自例如紅莓、草莓、蘋果、梨、西紅柿、柑橘、蔬菜等的果汁。
在本發(fā)明方法中，加入到飲料中的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的量可以變化較大。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照飲料中每克蛋白質(zhì)加入至少150毫單位的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性，該活性是通過用Z-Gly-Pro-pNA作為底物的活性測量方法確定的。
更優(yōu)選地，向飲料中加入至少500毫單位的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，最優(yōu)選地，加入至少1單位的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。
所加入脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的最大數(shù)量是無法具體描述的。該最大數(shù)量例如依賴于混濁防止或降低的程度、飲料的組成、飲料的pH值以及內(nèi)切蛋白酶具有最大活性時(shí)的pH值。
在飲料的制備過程中，可以在不同階段加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
在啤酒的制備過程中，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶有利地加至醪液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶Endo-Pro加至發(fā)酵后的啤酒中。在啤酒制備過程中，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶可以有利地在醪液形成或熟化步驟中加入。最優(yōu)選的是，在蒸煮步驟之后將酶加入到麥芽汁中。
在葡萄酒的制備過程中，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶優(yōu)選加入到發(fā)酵后的葡萄酒中。在葡萄酒生產(chǎn)過程中，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶也可以有利的在醇發(fā)酵或蘋果乳酸發(fā)酵后加入。但是，酶也可以加至澄清地葡萄汁中，即在醇發(fā)酵步驟之前加入。
在制備果汁的過程中，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶優(yōu)選在浸漬或脫膠過程中加入。
由于混濁通常在酸性飲料例如啤酒、葡萄酒和果汁中形成，因此優(yōu)選使用在低于7的pH值處具有脯氨酰特異性活性的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。更優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中使用在低于pH7.0或6.0處具有脯氨酰特異性最大活性的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。最優(yōu)選的是最佳pH為pH5.0或以下的內(nèi)切蛋白酶。
本發(fā)明提供了最佳pH為大約pH5.0或在4.0和5.0之間的具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的分離多肽，其選自下列(a)其氨基酸序列與SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7具有至少40％的總氨基酸序列同一性的多肽或其片段；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸與下列雜交(i)核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDD NO3或SEQ IDNO6，或者其在60優(yōu)選100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％同一性的片段，更優(yōu)選在200個(gè)核苷酸上具有至少90％同一性的片段，或者(ii)與(i)的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。
也提供了編碼脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶Endo-Pro的核酸分子。
本發(fā)明也涉及具有脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶活性的純化或分離的多肽。優(yōu)選的是在pH值低于7處具有最大活性的純化的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
本發(fā)明提供了分離的多肽，其具有根據(jù)SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7的氨基酸序列，或者具有通過在合適的宿主中表達(dá)多核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO6而可獲得的氨基酸序列。此外，包含上述多肽的功能等價(jià)物的肽或多肽也在本發(fā)明范圍中。上述多肽一同包含于術(shù)語“本發(fā)明的多肽”中。
術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義的(這一點(diǎn)是公認(rèn)的)，當(dāng)上下文需要表示具有至少兩個(gè)肽鍵連接的氨基酸的鏈時(shí)，這兩個(gè)術(shù)語可以互換使用。單詞“多肽”在此處用于指含有超過七個(gè)氨基酸殘基的鏈。所有寡肽和多肽公式或序列在此處都是從左至右并且從氨基末端至羧基末端的方向書寫。此處所用的氨基酸的單字母編號是本領(lǐng)域中公知的，并且可參見Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
“分離的”或“純化的”多肽或蛋白質(zhì)是與其天然環(huán)境分開的多肽或蛋白質(zhì)。例如，為本發(fā)明目的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，另外，通過任何合適的技術(shù)已經(jīng)基本純化的天然或重組多肽也被認(rèn)為是分離的，所述合適的技術(shù)例如為將酶從細(xì)胞物質(zhì)中分離的簡單超濾步驟或者Smith和Johnson，Gene 6731-40(1988)中所公開的一步純化方法。
本發(fā)明的多肽可以通過公知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述公知方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜(″HPLC″)進(jìn)行純化。
本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成程序的產(chǎn)物和通過重組方法從原核或真核宿主中產(chǎn)生的產(chǎn)物，該宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。依賴于在重組生產(chǎn)程序中所用的宿主，本發(fā)明多肽可以糖基化，也可以不糖基化。
此外，本發(fā)明的多肽也可以包含經(jīng)修飾的起始甲硫氨酸殘基，在某些情況下，這是宿主介導(dǎo)的過程造成的結(jié)果。
本發(fā)明的有利實(shí)施方案涉及具有Endo-Pro活性的純化或分離的多肽。這種純化或分離的多肽可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)了根據(jù)本發(fā)明的生物，例如攜帶本發(fā)明多核苷酸的黑曲霉菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何從此類培養(yǎng)基的上清液中獲得至少部分純化的酶。在最基本的方法中，生產(chǎn)細(xì)胞通過離心從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。接著用濾器對所得液體進(jìn)行過濾，然后進(jìn)行超濾，從而獲得每毫升含有1-50個(gè)酶單位的酶溶液。在理想條件下，所述酶可以就這樣使用，即無需進(jìn)一步純化。如果需要，可以通過噴霧干燥或通過降低酶溶液的水活性(如添加多元醇或防腐劑)來穩(wěn)定酶，進(jìn)而改進(jìn)酶的儲存穩(wěn)定性。
特別有利的純化方法如下。在將細(xì)胞培養(yǎng)于合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中后，通過離心使細(xì)胞與培養(yǎng)上清液分離。上清液看起來是混濁的。留在上清液中的較大顆粒接著用0，5％Dicalite或者優(yōu)選1.0％Dicalite過濾除去，以防止堵塞下一步驟中所用的濾器。接著使用微生物減少過濾法(germ reduction filtration)以減少溶液中的微生物量。但是，濾液仍不是澄清的。接著使用分子量截止值為10kD的Millipore濾器以進(jìn)一步降低溶液中水、鹽和糖含量。在濾器上施加1巴的壓力。所獲得的典型產(chǎn)率是50-92％，基于發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的單位相對于純化的超濾液中獲得的單位。超濾液中酶的典型濃度導(dǎo)致脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶活性介于4-10U/ml。
通過下列任一方法獲得了進(jìn)一步純化使用Akta Explorer在24ml Q-sepharose FF柱(床高12cm/直徑1.6cm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化。10ml UF-濃縮液在緩沖液A中稀釋10倍，并施加于柱上。以20 CV中0-50％B的梯度洗脫蛋白質(zhì)。緩沖液A為20mM NaAc pH5.1。緩沖液B為20mM NaAc+1M NaCl pH5.1。流速為5ml/min.
根據(jù)操作說明W-0894.A使用Akta純化器在500mlQ-sepharose FF柱(床高23.5cm/直徑5cm)上進(jìn)行純化。200ml UF-濃縮液在緩沖液A中稀釋10倍，并施加于柱上。以20CV中0-40％B的梯度洗脫蛋白質(zhì)。緩沖液A為20mM NaAc pH5.1。緩沖液B為20mM NaAc+1M NaCl pH5.1。流速為10ml/min。人工收集級分。
所獲得的產(chǎn)物在HPSEC上顯示單一峰，并且在SDS PAGE和IEF中顯示為單一條帶。因此可以得出結(jié)論，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶可以使用Q-sepharose FF而純化至均一狀態(tài)。估計(jì)的純度超過90％，并且對Z-gly-Pro-pNA的特異性活性至少為0.094U/mg。
本發(fā)明的多肽可以是分離形式。應(yīng)理解的是，所述多肽可以與不干擾多肽預(yù)定目的的載體或稀釋劑混合，但仍被認(rèn)為是分離的。
本發(fā)明的多肽也可以以更加基本上純化的形式存在，在該情況下，它通常在制劑中包含該多肽，其中，該制劑中的超過70％的蛋白質(zhì)，例如超過80％、90％、95％、98％或99％的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽也可以以脫離它們的天然細(xì)胞環(huán)境的形式提供。因此，它們可以如上所述被基本分離或純化，或者位于它們天然不出現(xiàn)的細(xì)胞中，例如其它真菌物種、動物、植物或細(xì)菌的細(xì)胞。
有利地，在本發(fā)明方法中使用分離或純化的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明，分離或純化的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶優(yōu)選在每克蛋白質(zhì)材料中具有至少10單位的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性。這些單位應(yīng)該按照“方法部分”所述用合成肽Z-Gly-Pro-pNA在37℃和pH5進(jìn)行測量。
脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶廣泛發(fā)現(xiàn)于動物和植物中，但它們在微生物中的存在似乎是有限的。至今，已經(jīng)在曲霉屬(EP 0 522428)、產(chǎn)黃菌屬(EP 0 967 285)和氣單胞菌屬(J.Biochem.113，790-796)、黃單胞菌屬和類細(xì)菌物種中鑒定了脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。與來自絕大多數(shù)這些生物的脯氨酸特異性酶(在pH8附近具有活性)相反，本發(fā)明的酶在酸性pH具有最佳活性，一些甚至在pH5附近或以下具有最佳pH。本發(fā)明的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可以從上述任一微生物物種中分離，特別是從曲霉屬物種。優(yōu)選地，酸性脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶Endo-Pro從黑曲霉(Aspergillus niger)菌株分離。更優(yōu)選地，脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶從經(jīng)過改造而過度表達(dá)編碼脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因的黑曲霉宿主中分離，盡管其它宿主例如大腸桿菌也是合適的表達(dá)載體。例如，在大腸桿菌(除了其它的)中克隆和過表達(dá)來自產(chǎn)黃菌屬的脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶已經(jīng)使得某些脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可以以純的形式獲得。這種過度生產(chǎn)型構(gòu)建體的例子在World Journal of Microbiology & Biotechnology，Vol 11，pp 209-212中提供。黑曲霉宿主優(yōu)選用于產(chǎn)生非重組型自身構(gòu)建體，該構(gòu)建體使用黑曲霉啟動子來驅(qū)動編碼黑曲霉脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基因表達(dá)。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其氨基酸序列與氨基酸SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7(即所述多肽)具有至少約40％、優(yōu)選至少約50％、優(yōu)選至少約60％、優(yōu)選至少約65％、優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、甚至更優(yōu)選至少約90％、更加優(yōu)選至少約95％并且最優(yōu)選至少約97％的氨基酸序列同一性總程度，并且該多肽具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性。
為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度通過BLAST P蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Research 253389-3402)來確定，并且使用矩陣Blosum 62，預(yù)期閾值為10。
本發(fā)明的多肽可以包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQIDNO7中所列的氨基酸序列，或者基本同源的序列，或者上述任一序列的具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的片段。通常，SEQ IDNO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示的天然出現(xiàn)的氨基酸序列是優(yōu)選的。
本發(fā)明的多肽也可以包含多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的天然出現(xiàn)的變體或物種同源物。
變體是天然出現(xiàn)于例如真菌、細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞中的多肽，變體具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性以及與SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7基本類似的序列。術(shù)語“變體”指與SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶具有相同的基本特征或基本生物學(xué)功能的多肽，并且包括等位基因變體。優(yōu)選地，變體多肽與SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO7的多肽至少具有相同的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性水平。變體包括與SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEO ID NO7多肽來自于同一菌株或者同一屬或物種的不同菌株的等位基因變體。
類似地，本發(fā)明蛋白質(zhì)的物種同源物是具有相似序列的等價(jià)蛋白，其是脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶，并且天然出現(xiàn)于另一曲霉屬物種中。
使用此處描述的用于分離SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7多肽的程序，并且對合適的細(xì)胞源(如細(xì)菌、酵母、真菌或植物細(xì)胞)進(jìn)行這些程序可以分離變體和物種同源物。也可以使用本發(fā)明的探針篩選從酵母、細(xì)菌、真菌或植物細(xì)胞制備的文庫，以獲得表達(dá)多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7的變體或物種同源物的克隆。這些克隆可以通過傳統(tǒng)的技術(shù)操作而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，接著用本身已知的重組或合成技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。
也可以對多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7和變體及物種同源物的序列進(jìn)行修飾以提供本發(fā)明的多肽。也可以進(jìn)行例如1、2或3到10、20或30個(gè)取代的氨基酸取代。也可以進(jìn)行同樣數(shù)目的缺失或插入。這些改變可以在對多肽功能至關(guān)重要的區(qū)域外進(jìn)行，因?yàn)檫@樣修飾的多肽將保留其脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性。
本發(fā)明多肽包括上述全長多肽和其變體的片段，包括SEQ IDNO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7所示序列的片段。此類片段通常會保留脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性。片段長度可以是至少5O、100或200個(gè)氨基酸，或者可以是比SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示全長氨基酸序列短所述數(shù)目的氨基酸。
如果需要，本發(fā)明的多肽可以通過合成方法生產(chǎn)，盡管通常它們將按如下所述的重組方法生產(chǎn)。
可以對合成多肽進(jìn)行修飾，例如添加組氨酸殘基或T7標(biāo)簽以利于它們的鑒定或純化，或者添加信號序列以促進(jìn)它們分泌至細(xì)胞外。
因此，變體序列可以包含那些來自于曲霉屬中除分離出多肽SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的菌株之外的其它菌株的序列。通過尋找脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性并如上所述進(jìn)行克隆和測序而從其它曲霉屬菌株中鑒定變體。變體可以在蛋白質(zhì)序列中缺失、修飾或添加單個(gè)氨基酸或者氨基酸組，只要該肽保留SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基本生物學(xué)功能。
例如，可以進(jìn)行1、2或3至10、20或30個(gè)取代的氨基酸取代。經(jīng)修飾的多肽通常將保留脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性?？梢赃M(jìn)行保守取代；這樣的取代在本領(lǐng)域中是公知的。優(yōu)選地，取代不影響多肽的折疊或活性。
更短的多肽序列在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，長度至少為50個(gè)氨基酸或至多為60、70、80、100、150或200個(gè)氨基酸的肽也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍中，只要它顯示SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的基本生物學(xué)功能。具體地，但不是排他性地，本發(fā)明的這一方面包括所述蛋白質(zhì)是全長蛋白質(zhì)序列的片段的情況。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性，并且被在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下、更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件下和最優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與下列序列雜交或能夠雜交的多核苷酸編碼(I)核酸序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6，或者至少包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的C-末端部分但不包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6全部序列或具有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3或SEQ ID NO6不同堿基的核酸片段；或者(ii)與SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6互補(bǔ)的核酸片段。
術(shù)語“能夠雜交”意思是本發(fā)明的目標(biāo)多肽能與用作探針的核酸(例如，SEQ.ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6所示的序列，或其片段，或SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互補(bǔ)序列)以顯著高于背景的水平進(jìn)行雜交。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的多核苷酸，以及與其互補(bǔ)的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因組DNA、合成DNA或cDNA。優(yōu)選地，該核苷酸序列為DNA，最優(yōu)選為基因組DNA序列。典型地，本發(fā)明的多核苷酸包含連續(xù)的核苷酸序列，所述連續(xù)的核苷酸序列能夠在選擇性條件下與SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的編碼序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列雜交。此類核苷酸可以按照本領(lǐng)域熟知的方法合成。
本發(fā)明的多核苷酸能夠以顯著高于背景的水平與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEO ID NO6的編碼序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列雜交。例如由于其它c(diǎn)DNA存在于cDNA文庫中，因此可能出現(xiàn)背景雜交。由本發(fā)明多肽與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的編碼序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列之間的相互作用產(chǎn)生的信號強(qiáng)度一般是其它多核苷酸和SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQID NO6的編碼序列之間相互作用的至少10倍、優(yōu)選至少20倍、更優(yōu)選至少50倍和甚至更優(yōu)選至少100倍。相互作用的強(qiáng)度例如可以通過放射性標(biāo)記探針(如用32p)來測量。使用低嚴(yán)謹(jǐn)性條件(0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約40℃)、中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件(例如，0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約50℃)或高嚴(yán)謹(jǐn)性條件(例如，0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約60℃)一般可以獲得選擇性雜交。
修飾本發(fā)明的多核苷酸可以包含DNA或RNA。它們可以是單鏈或雙鏈。它們也可以是在它們中包含合成或修飾的核苷酸的多核苷酸(包括肽核酸)。對多核苷酸的許多不同類型的修飾是本領(lǐng)域中已知的。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架以及在分子的3′和/或5′末端添加丫啶或聚賴氨酸鏈。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)理解的是此處所述的多核苷酸可以用任何本領(lǐng)域中的方法進(jìn)行修飾。
應(yīng)理解的是，技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行核苷酸取代，而不影響由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽序列，從而反映本發(fā)明多肽想要在其中表達(dá)的任何特定宿主生物的密碼子利用情況。
可以對SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQID NO6的編碼序列進(jìn)行核苷酸取代，例如1、2、或3至10、25、50或100個(gè)取代。SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的核苷酸可以替換性地或附加性地修飾如下一個(gè)或多個(gè)插入和/或缺失和/或在一個(gè)或兩個(gè)末端延伸。經(jīng)修飾的多核苷酸通常編碼具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的多肽。也可以進(jìn)行簡并性取代，和/或進(jìn)行如下取代當(dāng)經(jīng)修飾的序列被翻譯后(例如參照對下面多肽的討論)，該取代產(chǎn)生保守性氨基酸取代。
同源物能與DNA編碼序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互補(bǔ)序列選擇性雜交的核苷酸序列也在本發(fā)明范圍中，并且在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的至少60個(gè)連續(xù)核苷酸區(qū)域，優(yōu)選至少100個(gè)，更優(yōu)選至少200個(gè)，或最優(yōu)選在全長區(qū)域中通常與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6編碼序列具有至少50％或60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。類似地，編碼活性脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶并且能與DNA編碼序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的互補(bǔ)序列的片段進(jìn)行選擇性雜交的核苷酸也在本發(fā)明范圍中。本發(fā)明也包括核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的C-末端片段，其在60個(gè)核苷酸，優(yōu)選100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％的同一性，更優(yōu)選在200個(gè)核苷酸上具有至少90％的同一性。
上述同一性程度和最小尺寸的任何組合可以用來定義本發(fā)明的多核苷酸，其中更嚴(yán)格的組合(即在更長的長度上具有更高的同一性)是優(yōu)選的。因此，例如在60個(gè)核苷酸，優(yōu)選100個(gè)核苷酸上具有至少80％或90％同一性的多核苷酸形成了本發(fā)明的一個(gè)方面，正如在200個(gè)核苷酸上具有至少90％同一性的多核苷酸一樣。
UWGCG Package提供了用于計(jì)算同一性的BESTFIT程序(例如以其默認(rèn)設(shè)置使用)。
PILEUP和BLASTN算法也可以用于計(jì)算序列同一性或比對序列(例如用它們的默認(rèn)設(shè)置來鑒定等價(jià)或相應(yīng)序列)。
用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過National Center forBiotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)而公共地獲得。該算法包括通過在查詢序列中鑒定長度為W的短字串而首先鑒定高分值序列對(HSPs)，其中所述長度為W的短字串當(dāng)與數(shù)據(jù)庫中序列的相同長度的字串比對時(shí)，滿足一些正的閾值T或與其匹配。T是指相鄰字串閾值。這些起始相鄰字串結(jié)果作為種子開始搜索，以尋找包含它們的HSPs。這些字串結(jié)果沿著每一序列在兩個(gè)方向延伸，只要累計(jì)比對值是增加的。當(dāng)下列情況出現(xiàn)時(shí)，所述字串結(jié)果在每一方向的延伸停止累積比對值從其所獲得的最大值降低了數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)值殘基比對的累積，累積分值變成零或零以下；或者到達(dá)了任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下列作為默認(rèn)值字串長度(W)為11、BLOSUM62分值矩陣比對(B)為50、期望值(E)為10、M＝5、N＝4，以及雙鏈比對。
BLAST算法對兩條序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由BLAST算法所提供的一種相似性量度為最小概率總和(the smallest sumprobability)(P(N))，它提供了兩條核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)匹配的概率指標(biāo)。例如，一條序列被認(rèn)為與另一條序列是相似的，如果第一條序列和第二條序列對比的最小概率總和小于大約1、優(yōu)選小于大約0.1、更優(yōu)選小于大約0.01、最優(yōu)選小于大約0.001。
引物和探針本發(fā)明的多核苷酸包括引物，并且可以用作引物，例如作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，作為交替擴(kuò)增反應(yīng)(alternativeamplification reaction)的引物，或者作為探針，例如通過傳統(tǒng)方法用放射性或非放射性標(biāo)記標(biāo)記的顯示標(biāo)記，或者該多核苷酸可以克隆入載體中。此類引物、探針和其它片段的長度至少為15個(gè)核苷酸，例如至少20、25、30或40個(gè)核苷酸。它們的長度一般至多為40、50、60、70、100、150、200或300個(gè)核苷酸，或者進(jìn)一步至多為僅比編碼序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3或SEQ ID NO6短幾個(gè)核苷酸(例如5或10個(gè)核苷酸)。
通常，引物將通過合成方法生產(chǎn)，包括所需核酸序列一次一個(gè)核苷酸的逐步制備法。使用自動化方案完成這些的技術(shù)在本領(lǐng)域中是很容易獲得的。更長的多核苷酸一般通過重組方法生產(chǎn)，例如用PCR克隆技術(shù)。這將包括制備引物對(一般為大約15-30個(gè)核苷酸)以擴(kuò)增所要克隆的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的所需區(qū)域；使引物與獲自酵母、細(xì)菌、植物、原核或真菌細(xì)胞(優(yōu)選曲霉屬菌株)的mRNA、cDNA或基因組DNA接觸；在適合擴(kuò)增所需區(qū)域的條件下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分離所擴(kuò)增的片段(例如在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)和回收所擴(kuò)增的DNA。引物可以設(shè)計(jì)成含有合適的限制性酶識別位點(diǎn)，從而所擴(kuò)增DNA可以克隆入合適的克隆載體。
這種技術(shù)可以用來獲得此處所述的編碼脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的多核苷酸的全長或部分。內(nèi)含子、啟動子和尾隨區(qū)域也在本發(fā)明范圍中，并且可以用相似方法從真菌、酵母、細(xì)菌、植物或原核細(xì)胞的基因組DNA起始而獲得(例如，通過重組方法、PCR或克隆技術(shù))。
多核苷酸或引物可以帶有顯示標(biāo)記(revealing label).合適的標(biāo)記包括放射性同位素例如32P或35S、酶標(biāo)記或其它蛋白標(biāo)記例如生物素。此類標(biāo)記可以添加到本發(fā)明的多核苷酸或引物上，并且可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢測。
標(biāo)記或未標(biāo)記的多核苷酸或引物(或其片段)可以用于基于核酸的測試法中，以在真菌樣品中檢測或測序脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或其變體。此類測試法通常包括使被懷疑含有目的DNA的真菌樣品和含有本發(fā)明多核苷酸或引物的探針在雜交條件下接觸，以及檢測樣品中探針和核酸所形成的任何雙鏈?？梢允褂美鏟CR之類的技術(shù)來完成檢測，或者將探針固定在固體支持體上，除去樣品中未與探針雜交的任何核酸，接著檢測與探針雜交的任何核酸，從而完成檢測?；蛘撸瑯悠泛怂峥梢怨潭ㄓ诠腆w支持體上，使探針雜交，然后檢測除去任何未結(jié)合探針之后結(jié)合到這種支持體上的探針的量。
本發(fā)明的探針可以以測試試劑盒的形式包裝在容器中。在這種試劑盒中，探針可以結(jié)合在固體支持體上，當(dāng)該試劑盒所用的檢測形式需要這種結(jié)合時(shí)。
該試劑盒也可以含有用于處理所要檢測的樣品和使探針與樣品中核酸雜交的合適試劑、對照試劑、說明書等。本發(fā)明探針和多核苷酸也可以用于微檢測法(microassay)中。
優(yōu)選地，本發(fā)明多核苷酸和多肽獲自同一生物，例如真菌，特別是曲霉屬真菌。
本發(fā)明也包括序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的變體，其編碼具有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性的多肽。變體可以通過添加、取代和/或缺失來形成。編碼序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的此類變體因此可以編碼能在脯氨酸的羧基末端側(cè)消化多肽鏈的多肽。
生產(chǎn)多核苷酸與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6不具有100％同一性但落在本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸可以用很多方法獲得。因此，此處所述的脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶序列的變體可以通過例如探測基因組DNA文庫而獲得，其中所述文庫從大量生物中制備，例如那些已討論作為本發(fā)明多肽來源的生物。此外，也可以獲得脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的其它真菌、植物或原核同源物，并且此類同源物或其片段通常能與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6雜交。此類序列可以通過檢測來自其它物種的cDNA文庫或基因組DNA文庫，并且通過在低、中等至高嚴(yán)謹(jǐn)性條件(如前面所述)下用包含SEQ ID.1全長或部分的探針檢測這樣的文庫而獲得?？梢杂冒琒EQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的全長或部分的核酸探針探測來自其它物種的cDNA或基因組文庫，例如那些已描述作為本發(fā)明多肽來源的生物。
也可以使用簡并PCR來獲得物種同源物，其中使用了針對在變體和同源物中編碼保守氨基酸序列的目標(biāo)序列的引物。該引物可以含有一個(gè)或多個(gè)簡并位置，并且在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下使用，所述嚴(yán)謹(jǐn)性條件低于那些用針對已知序列的單序列引物克隆序列的嚴(yán)謹(jǐn)性條件。
或者，可以通過對脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶序列或其變體進(jìn)行定點(diǎn)誘變來獲得此類多核苷酸。當(dāng)例如需要對序列進(jìn)行沉默密碼子改變，以根據(jù)所述多核苷酸序列需要在其中表達(dá)的特定宿主細(xì)胞來優(yōu)化密碼子偏好時(shí)，這可能是有用的。也可以進(jìn)行其它序列改變，以引入限制性酶識別位點(diǎn)，或改變該多核苷酸所編碼多肽的特性或功能。
本發(fā)明包括雙鏈多核苷酸，其含有本發(fā)明多核苷酸以及其互補(bǔ)序列。
本發(fā)明也提供編碼上述本發(fā)明多肽的多核苷酸。由于此類多核苷酸可以用作重組生產(chǎn)本發(fā)明多肽的序列，因此不需要它們能夠與序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ IDNO6雜交，盡管能夠雜交通常更好?；蛘?，如果需要可以按如上所述對此類多核苷酸進(jìn)行標(biāo)記、使用和制造。
重組多核苷酸本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明多核苷酸的載體，包括克隆和表達(dá)載體，在另一方面提供了在合適的宿主細(xì)胞中生長、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染此類載體的方法，例如在能夠表達(dá)本發(fā)明多肽或由本發(fā)明序列編碼的多肽的條件下。也提供了包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞，其中多核苷酸相對于該宿主細(xì)胞基因組是異源的。通常相對于宿主細(xì)胞而言的術(shù)語“異源的”是指該多核苷酸在該宿主細(xì)胞基因組中不是天然出現(xiàn)的，或者該多肽不是由該細(xì)胞天然生產(chǎn)的。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，例如克魯維氏酵母屬或糖酵母屬的酵母細(xì)胞，或者絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬的。
本發(fā)明多核苷酸可以整合入復(fù)制型重組載體中，例如克隆或表達(dá)載體。該載體可以用于在兼容的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過下列方法制備本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明多核苷酸引入復(fù)制型載體中，將該載體引入兼容的宿主細(xì)胞中，以及在使載體復(fù)制的條件下生長該宿主細(xì)胞?？梢詮脑撍拗骷?xì)胞中回收該載體。合適的宿主細(xì)胞與表達(dá)載體描述如下。
載體插入了本發(fā)明表達(dá)盒的載體可以是任何能方便地進(jìn)行重組DNA程序的載體，并且載體的選擇經(jīng)常取決于它所要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制型載體，即以染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣的，當(dāng)其導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，被整合入宿主細(xì)胞基因組中，并與它已經(jīng)整合入的染色體一起復(fù)制。
優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明多核苷酸位于載體中時(shí)，其有效地連接于能夠使宿主表達(dá)該編碼序列的調(diào)控序列上，即該載體是表達(dá)載體。術(shù)語“有效地連接”是指一種并列方式，其中所述組分之間的相互關(guān)系允許它們以預(yù)定方式發(fā)揮作用。與編碼序列有效地連接的調(diào)控序列例如啟動子、增強(qiáng)子或其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號是這樣定位的，從而使得在與所述控制序列兼容的條件下能表達(dá)該編碼序列。
例如在質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體的情況下，所述載體可以具有復(fù)制起點(diǎn)，可選地具有用于表達(dá)該多核苷酸的啟動子以及可選擇地該啟動子的增強(qiáng)子和/或調(diào)節(jié)子。也可以存在終止子序列，例如聚腺苷酸化序列。該載體也可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒的情況下為氨芐青霉素抗性基因，或者在哺乳動物載體的情況下為新霉素抗性基因。載體也可以在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA，或者也可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
編碼多肽的DNA序列優(yōu)選作為表達(dá)構(gòu)建體的一部分導(dǎo)入合適的宿主中，在所述表達(dá)構(gòu)建體中，該DNA序列有效地連接于能夠指導(dǎo)DNA序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)信號上。對于用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主，存在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)化方法。該表達(dá)構(gòu)建體可以作為帶有選擇性標(biāo)記的載體的一部分轉(zhuǎn)化該宿主，或者該表達(dá)載體作為分離的分子與帶有選擇性標(biāo)記的分子共轉(zhuǎn)化。該載體可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因。
優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括但不限于那些能夠彌補(bǔ)宿主細(xì)胞的缺陷或提供對藥物抗性的標(biāo)記。它們包括例如能夠用于轉(zhuǎn)化大多數(shù)絲狀真菌和酵母的通用標(biāo)記基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或來自構(gòu)巢曲霉、米曲霉或黑曲霉的cDNAs)，或者提供對抗生素抗性的基因，例如G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素、phleomycin或苯菌靈(benA)抗性。或者也可以使用特異性選擇標(biāo)記，例如需要相應(yīng)突變宿主菌株的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，例如URA3(來自啤酒糖酵母或來自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA(來自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)、argB(來自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體后將選擇標(biāo)記從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中刪除，以獲得能夠生產(chǎn)不具有選擇標(biāo)記基因的多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
其它標(biāo)記包括ATP合成酶亞基9(oliC)、乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶(pvrA)、細(xì)菌G418抗性基因(在酵母中有用，但在絲狀真菌中無用)、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)、新霉素抗性基因(芽孢桿菌)和大腸桿菌uidA基因——編碼葡糖苷酸酶(GUS)。也可以在體外使用載體，例如用于生產(chǎn)RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
對于大多數(shù)絲狀真菌和酵母，優(yōu)選將表達(dá)構(gòu)建體整合入宿主細(xì)胞的基因組中以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。然而，對于某些酵母，也可以使用合適的染色體外載體系統(tǒng)，其中可以整合表達(dá)構(gòu)建體以獲得穩(wěn)定和高水平的表達(dá)。它們的例子包括分別來自糖酵母屬和克魯維氏酵母屬的2um、CEN和pKD1質(zhì)粒的載體，或者含有AMA序列(例如來自曲霉屬的AMA1)的載體。當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體整合入宿主細(xì)胞基因組時(shí)，該構(gòu)建體或者隨機(jī)整合入基因組的座位中，或者用同源重組整合入預(yù)定的目標(biāo)座位，在后一種情況下，目標(biāo)座位優(yōu)選含有高度表達(dá)的基因。高度表達(dá)的基因是這樣的基因，其mRNA可以占總細(xì)胞mRNA的至少0.01％(w/w)，例如在誘導(dǎo)條件下，或者是這樣的基因，其基因產(chǎn)物可以占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的至少0.2％(w/w)，或者在分泌型基因產(chǎn)物的情況下，其可以以至少0.05g/l的水平分泌。
用于給定宿主細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體通常含有下列元件，它們相對于編碼第一方面的多肽的序列的編碼鏈從5′-末端到3′-末端互相有效地順次連接(1)能夠指導(dǎo)編碼多肽的DNA序列在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子序列；(2)優(yōu)選地，5′-非翻譯區(qū)(前導(dǎo)序列)；(3)可選擇地，能夠指導(dǎo)多肽從給定宿主細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基的信號序列；(4)編碼成熟形式以及優(yōu)選活性形式多肽的DNA序列；以及優(yōu)選(5)在編碼多肽的DNA下游能夠終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(終止子)。
在編碼多肽的DNA序列的下游，表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選含有3′非翻譯區(qū)，該非翻譯區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)稱為終止子的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。終止子的起始點(diǎn)是較不重要的。例如該終止子可以是編碼多肽的DNA序列天然具有的。但是，優(yōu)選在酵母宿主細(xì)胞中使用酵母終止子，在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用絲狀真菌終止子。更優(yōu)選地，該終止子相對于編碼多肽的DNA序列在其中表達(dá)的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。
可以通過選擇異源調(diào)控區(qū)域(例如啟動子、信號序列和中止子區(qū)域)來增強(qiáng)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)，其中所述調(diào)控區(qū)域用于使目的蛋白在所選擇的表達(dá)宿主中增強(qiáng)表達(dá)和分泌水平(如果需要)，和/或提供對本發(fā)明多肽表達(dá)的可誘導(dǎo)的控制。
除了本發(fā)明多肽的編碼基因天然所具有的啟動子外，也可以使用其它啟動子來指導(dǎo)本發(fā)明多肽的表達(dá)。可以根據(jù)在所需表達(dá)宿主中指導(dǎo)本發(fā)明多肽表達(dá)的效率來選擇啟動子。
可以選擇與表達(dá)載體設(shè)計(jì)時(shí)所針對的宿主細(xì)胞兼容的啟動子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)節(jié)信號。例如可以使用原核啟動子，特別是適合用于大腸桿菌菌株的那些。當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明多肽時(shí)，也可以使用哺乳動物啟動子。也可以使用組織特異性啟動子，例如肝細(xì)胞特異性啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復(fù)序列(MMLV LTR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人類巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子、單純皰疹病毒啟動子或腺病毒啟動子。
合適的酵母啟動子包括啤酒糖酵母GAL4和ADH啟動子，以及S.pombe nmt1和adh啟動子。哺乳動物啟動子包括金屬硫蛋白啟動子，其能應(yīng)激于重金屬如鎘而被誘導(dǎo)。也可以使用病毒啟動子，例如SV40大T抗原啟動子或腺病毒啟動子。所有這些啟動子在本領(lǐng)域中都是很容易就能得到的。
也可以使用哺乳動物啟動子，例如β-肌動蛋白啟動子。組織特異性啟動子，特別是內(nèi)皮或神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子(例如DDAHI和DDAHII啟動子)是特別優(yōu)選的。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復(fù)序列(MMLV LTR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、SV40啟動子、人類巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動子、腺病毒、HSV啟動子(例如HSV IE啟動子)或HPV啟動子，特別是HPV上游調(diào)控區(qū)(URR)。病毒啟動子在本領(lǐng)域中是很容易獲得的。
可以使用大量能在本發(fā)明宿主中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子。優(yōu)選地，啟動子序列源自前面所定義的高度表達(dá)的基因。啟動子優(yōu)選所源自的和/或包含于優(yōu)選的預(yù)定目標(biāo)座位以整合表達(dá)構(gòu)建體的優(yōu)選高度表達(dá)的基因例子包括但不限于編碼糖酵解酶例如磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH)的基因，以及編碼淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、cellobiohydrolases、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高度表達(dá)的基因的具體例子包括例如來自克魯維氏酵母屬物種的LAC4基因、分別來自漢遜氏酵母和畢赤氏酵母的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、來自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉TAKA-淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉gpdA基因和T.reesei的cellobiohydrolase基因。
優(yōu)選用于真菌表達(dá)宿主中的強(qiáng)組成型和/或誘導(dǎo)型啟動子例子是那些從下列真菌基因獲得的木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶亞基9(oliC)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、淀粉酶(amy)、淀粉葡萄苷酶(來自glaA基因的AG)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子。
可以使用的強(qiáng)酵母啟動子例子包括那些可以從醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油激酶和磷酸丙酮異構(gòu)酶的基因獲得的啟動子。
可以使用的強(qiáng)細(xì)菌啟動子包括淀粉酶和SPo2啟動子以及來自胞外蛋白酶基因的啟動子。
可以使用的適合植物細(xì)胞的啟動子包括napaline合酶(nos)、章魚堿合酶(ocs)、甘露堿合酶(mas)、核酮糖小亞基(rubiscossu)、組蛋白、水稻肌動蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)35S和19S以及circovirus啟動子。該載體也可以進(jìn)一步包含位于所述多核苷酸側(cè)翼的序列，從而產(chǎn)生含有同源于真核基因組序列優(yōu)選哺乳動物基因組序列或病毒基因組序列的RNA。這將允許通過同源重組將本發(fā)明多核苷酸導(dǎo)入真核細(xì)胞或病毒的基因組中。特別的，包含表達(dá)盒(側(cè)翼為病毒序列)的質(zhì)粒載體可以用于制備適合將本發(fā)明多核苷酸送遞入哺乳動物細(xì)胞的病毒載體。其它合適的病毒載體的例子包括單純皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和HPV病毒(例如HPV-16或HPV-18)。使用這些病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒可以用于將產(chǎn)生反義RNA的多核苷酸穩(wěn)定整合入宿主基因組中。相反，復(fù)制缺陷型腺病毒載體保留在染色體外，因此允許瞬時(shí)表達(dá)。
該載體可以含有反義方向的本發(fā)明多核苷酸，以生產(chǎn)反義RNA。如果需要，這可以用于降低多肽表達(dá)水平。
宿主細(xì)胞和表達(dá)在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明多肽的方法，包括在適合于由載體表達(dá)多肽編碼序列的條件下培養(yǎng)被如上所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及回收所表達(dá)的多肽。本發(fā)明多核苷酸可以整合入復(fù)制型重組載體中，例如表達(dá)載體。該載體可以用于在兼容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下制備本發(fā)明多核苷酸的方法將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入復(fù)制型載體，將該載體導(dǎo)入兼容的宿主細(xì)胞，以及在使載體復(fù)制的條件下生長該宿主細(xì)胞。也可以從該宿主細(xì)胞中回收該載體。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌例如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞系和其它真核細(xì)胞系，例如昆蟲細(xì)胞如Sf9細(xì)胞和(例如絲狀)真菌細(xì)胞。
優(yōu)選地，多肽以分泌蛋白的形式生產(chǎn)，在這種情況下，在表達(dá)構(gòu)建體中編碼成熟形式多肽的DNA序列有效地連接于編碼信號序列的DNA序列上。當(dāng)編碼分泌蛋白的基因在野生型菌株中具有信號序列時(shí)，優(yōu)選所使用的信號序列是編碼多肽的DNA序列天然所具有的(與其同源)。或者，該信號序列相對于編碼多肽的DNA序列是外來的(異源的)，在這種情況下，該信號序列優(yōu)選內(nèi)源于該DNA序列所要在其中表達(dá)的宿主細(xì)胞。適合于酵母細(xì)胞的合適信號序列的例子為來自酵母MFalpha基因的信號序列。類似地，適合于絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適信號序列是例如來自絲狀真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如黑曲霉glaA基因)的信號序列。該信號序列可以與淀粉葡糖苷酶(也稱為葡糖淀粉酶)本身組合使用，以及與其它啟動子組合使用。在本發(fā)明中也可以使用雜合信號序列。
優(yōu)選的異源分泌前導(dǎo)序列是那些源自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24個(gè)氨基酸的形式，例如來自曲霉屬)、MFa1pha基因(酵母，例如糖酵母和克魯維氏酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌)的前導(dǎo)序列。
載體可以轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如上所述的合適宿主細(xì)胞，以提供本發(fā)明多肽的表達(dá)。
該方法可以包括在適合表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)被如上所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及可選擇地回收所表達(dá)的多肽。
本發(fā)明的另一方面因此提供了含有本發(fā)明多核苷酸或載體或者被其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，該多核苷酸攜帶于允許該多核苷酸復(fù)制和表達(dá)的載體中。選擇與所述載體兼容的細(xì)胞，例如可以是原核(如細(xì)菌)或真核真菌、酵母或植物細(xì)胞。
本發(fā)明包括通過重組表達(dá)編碼多肽的DNA序列來生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法。為了該目的，本發(fā)明DNA序列可以用于基因擴(kuò)增和/或表達(dá)信號(如啟動子、分泌信號序列)交換，以允許在合適的同源或異源宿主細(xì)胞中經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)多肽。在此處，同源宿主細(xì)胞被定義為與所述DNA序列所源自的物種屬于同一物種或者為同一物種的變體的宿主細(xì)胞。
合適的宿主細(xì)胞優(yōu)選為原核微生物例如細(xì)菌，或更優(yōu)選為真核生物，例如真菌，如酵母或絲狀真菌，或者植物細(xì)胞。通常，酵母細(xì)胞比絲狀真菌細(xì)胞更優(yōu)選，因?yàn)樗鼈兏子诓僮?。但是，一些蛋白或者不容易從酵母中分泌，或者在某些情況下不能被正確加工(例如在酵母中過度糖基化)。在這些情況下，應(yīng)該選擇絲狀真菌宿主生物。
來自芽孢桿菌屬的細(xì)菌十分適合作為異源宿主，因?yàn)樗鼈兡軌驅(qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。其它適合作為宿主的細(xì)菌是那些來自鏈霉菌屬和假單胞菌屬的。用于表達(dá)編碼多肽的DNA序列的優(yōu)選酵母宿主細(xì)胞是糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、Yarrowia或裂殖糖酵母屬之一的。更優(yōu)選地，酵母宿主細(xì)胞選自物種啤酒糖酵母、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)(也稱為Kluyveromyces marxianus var.lactis)、多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastors)、Yarrowia lipolytica和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
但是，用于表達(dá)編碼多肽的DNA序列的最優(yōu)選的宿主是絲狀真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞選自曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬、Disporotrichum、青霉屬、支頂孢屬、鏈孢霉屬、熱子囊菌屬、Myceliophtora、孢子絲菌屬、草根霉屬和踝節(jié)菌屬。更優(yōu)選地，絲狀真菌宿主細(xì)胞是物種Aspergillus oyzae、醬油曲霉(Aspergillus sojae)或構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)或者是來自黑曲霉組的物種(由Raper和Fennel定義，The GenusAspergillus，The Williams & Wilkins Company，Baltimore，pp293-344，1965)。這些包括但不限于黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、構(gòu)巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和無花果曲霉(Aspergillus ficuum)以及物種Trichoderma reesei、和谷鐮孢(Fusarium graminearum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielavia terrestris。
本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選表達(dá)宿主的例子是真菌，例如曲霉屬物種(特別是描述于EP-A-184,438和EP-A-284,603中的那些)和木霉屬物種；細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬物種(特別是描述于EP-A-134,048和EP-A-253,455中的那些)，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，假單胞菌屬物種；和酵母，例如克魯維氏酵母屬物種(特別是描述于EP-A-096,430中的那些，例如乳克魯維氏酵母，以及描述于EP-A-301,670中的)和糖酵母屬物種，例如啤酒糖酵母。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞，因此本發(fā)明延伸至轉(zhuǎn)基因生物，例如含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明細(xì)胞的植物或其部分。該細(xì)胞可以異源地表達(dá)本發(fā)明多肽，或異源地含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因(或基因修飾的)植物因此可以在其基因組中插入(通常為穩(wěn)定的)編碼本發(fā)明多肽的序列。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以使用已知的技術(shù)完成，例如使用來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti或Ri質(zhì)粒。該質(zhì)粒(或載體)因此可以含有感染植物所必需的序列，并且也可以使用Ti和/或Ri質(zhì)粒的衍生物。
該宿主細(xì)胞可以過表達(dá)該多肽，并且操縱過表達(dá)的技術(shù)是已知的，并可以用在本發(fā)明中。宿主因此可以具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝的多核苷酸。
或者，也可以直接感染植物的部分，例如葉、根或莖。在該技術(shù)中，可以在待感染的植物上制造傷口，例如用刀片切割植物、用針刺植物或用研磨劑摩擦植物。然后該傷口用農(nóng)桿菌接種。該植物或植物部分接著可以生長在合適的培養(yǎng)基中，并發(fā)育成成熟植株?？梢允褂靡阎募夹g(shù)使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成基因修飾的植物，例如通過用抗生素篩選轉(zhuǎn)化的根，并將該根亞培養(yǎng)于含有合適營養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及重組生產(chǎn)本發(fā)明也包括已經(jīng)修飾以表達(dá)脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶或其變體的細(xì)胞。此類細(xì)胞包括瞬時(shí)或優(yōu)選穩(wěn)定修飾的高等真核細(xì)胞系，例如哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，低等真核細(xì)胞，例如酵母和絲狀真菌細(xì)胞或原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。
也可以使本發(fā)明多肽瞬時(shí)表達(dá)于細(xì)胞系中或膜上，例如在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。經(jīng)過修飾以表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的此類系統(tǒng)也在本發(fā)明范圍中。
根據(jù)本發(fā)明，可以在傳統(tǒng)營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)轉(zhuǎn)化了一種或多種本發(fā)明多核苷酸的微生物表達(dá)宿主，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽的生產(chǎn)。
可以使用本領(lǐng)域已知的程序來培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞。對于每一啟動子和宿主細(xì)胞組合，能夠表達(dá)編碼多肽的DNA序列的培養(yǎng)條件是可以獲得的。在達(dá)到所需的細(xì)胞密度或多肽效價(jià)后，停止培養(yǎng)，并用已知程序回收多肽。
發(fā)酵培養(yǎng)基可以包含已知的培養(yǎng)基，所述已知的培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)、有機(jī)氮源(例如酵母提取物、麥芽膏、蛋白胨等)和無機(jī)營養(yǎng)源(例如磷酸、鎂、鉀、鋅、鐵等)?？蛇x擇地，可以包括誘導(dǎo)物(取決于所用的表達(dá)構(gòu)建體)，或在隨后加入。
合適培養(yǎng)基的選擇可以基于表達(dá)宿主的選擇和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)控需要。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如果需要，該培養(yǎng)基可以含有附加組分，所述附加組分更有利于轉(zhuǎn)化的表達(dá)宿主(相對于其它潛在的污染微生物)。
發(fā)酵可以進(jìn)行0.5-30天。發(fā)酵可以是分批式、連續(xù)式或分批補(bǔ)料式，在0-45℃的合適溫度以及例如2-10的pH值下進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵條件包括20-37℃的溫度和/或3-9的pH值。通?；谒x表達(dá)宿主和待表達(dá)蛋白質(zhì)來選擇合適的條件。
如果需要，在發(fā)酵后，可以用離心或過濾方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去細(xì)胞。在發(fā)酵停止后或細(xì)胞除去后，可以回收本發(fā)明多肽，如果需要，用傳統(tǒng)方法純化和分離。本發(fā)明脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可以從真菌菌絲體中純化，或者從該脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶被培養(yǎng)的真菌細(xì)胞所釋放到的培養(yǎng)基中回收。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽從真菌、優(yōu)選從曲霉屬、最優(yōu)選從黑曲霉中獲得。
修飾本發(fā)明多肽可以進(jìn)行化學(xué)修飾，例如翻譯后修飾。例如，它們可以糖基化(一次或多次)或者含有修飾的氨基酸殘基。它們也可以修飾如下添加組氨酸殘基以幫助它們的純化或者添加信號序列以促進(jìn)從細(xì)胞分泌。該多肽也可以含有氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基、至多約20-25個(gè)殘基的小的連接肽、 或促進(jìn)純化的小的延伸，例如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明多肽可以用顯示標(biāo)記來標(biāo)記。該顯示標(biāo)記可以是任何允許檢測多肽的合適標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括放射性同位素，例如125I、35S，酶、抗體、多核苷酸和連接體如生物素。
可以對多肽進(jìn)行修飾以包含非天然氨基酸或增加多肽穩(wěn)定性。當(dāng)通過合成方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)或肽時(shí)，此類氨基酸可以在生產(chǎn)過程中引入。也可以在合成或重組生產(chǎn)以后修飾蛋白質(zhì)或肽。
也可以用D-氨基酸來生產(chǎn)本發(fā)明多肽。在這種情況下，氨基酸將以C至N的方向連接成反向序列。這樣生產(chǎn)此類蛋白質(zhì)或肽在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
許多側(cè)鏈修飾是本領(lǐng)域中已知的，并且可以在本發(fā)明蛋白質(zhì)或肽的側(cè)鏈上進(jìn)行。此類修飾包括，例如與醛反應(yīng)，接著用NaBH4還原，從而通過還原性烷基化而對氨基酸進(jìn)行修飾，或用甲基乙酰亞氨酸(methylacetimidate)進(jìn)行脒化(amidination)，或用乙酸酐進(jìn)行酰化。
本發(fā)明提供的序列也可以用作起始材料以構(gòu)建“第二代”酶?！暗诙备彼崽禺愋缘鞍酌甘怯谜T變技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變)經(jīng)過改變的脯氨酸特異性蛋白酶，其具有不同于野生型脯氨酸特異性蛋白酶或重組型脯氨酸特異性蛋白酶(如本發(fā)明生產(chǎn)的那些)的特性。例如可以對它們的溫度或pH最佳值、特異性活性、底物親和性或熱穩(wěn)定性進(jìn)行改變，以更好地適用于特定方法。
可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序(如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變)鑒定對脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性至關(guān)重要并因此優(yōu)選進(jìn)行取代的氨基酸。在丙氨酸掃描誘變技術(shù)中，在分子的每個(gè)殘基處引入突變，并對所得分子的生物活性(例如脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性)進(jìn)行檢測，以鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也可以通過分析晶體結(jié)構(gòu)來確定酶-底物相互作用位點(diǎn)，其中所述晶體結(jié)構(gòu)是用核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光-親和標(biāo)記之類的技術(shù)測定的。
使用酵母和絲狀真菌宿主細(xì)胞預(yù)期能提供這樣的翻譯后修飾(例如蛋白水解加工、肉豆蔻基化(myristilation)、糖基化、截短以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，它們對于賦予本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物最優(yōu)的生物活性可能是必需的。
制劑本發(fā)明多肽可以是分離形式。應(yīng)理解的是該多肽也可以與不干擾多肽預(yù)定目的的載體或稀釋劑混合，而仍被認(rèn)為是分離的。
本發(fā)明多肽也可以是基本純化的形式，在這種情況下，通常在制劑中含有多肽，并且在該制劑中超過70％，例如超過80％、90％、95％、98％或99％的蛋白質(zhì)是本發(fā)明多肽。
本發(fā)明多肽也可以以在它們天然細(xì)胞環(huán)境外的形式提供。因此，它們可以是如上所述基本分離或純化的，或者位于它們天然情況下不出現(xiàn)的細(xì)胞中，例如其它真菌物種、動物、植物或細(xì)菌的細(xì)胞中。而且，本發(fā)明多肽也可以以固定化的形式使用，從而可以處理大量含蛋白質(zhì)的液體。
選擇合適支持體材料的方法和合適的固定化方法已經(jīng)大量描述于文獻(xiàn)中，例如″Immobilization of Enzymes and Cells″(ed.Gordon F.Bickerstaff；ISBN 0-89603-386-4)。
本發(fā)明也涉及使用脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶制備飲料。脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶優(yōu)選用于制備啤酒、葡萄酒或果汁。根據(jù)本發(fā)明方法通過添加本發(fā)明脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶，降低或防止了混濁。通過添加這些脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶，得到了新的飲料。因此，本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法獲得的飲料。這些飲料包括例如用本發(fā)明方法獲得的啤酒、葡萄酒和果汁。
用本發(fā)明方法獲得的飲料的優(yōu)點(diǎn)在于這些飲料具有高含量的抗氧化劑。多酚是抗氧化劑。啤酒一般用除去多酚的物質(zhì)進(jìn)行處理以防止混濁形成，結(jié)果所獲得的啤酒具有低的抗氧化劑活性。用除去多酚的物質(zhì)處理的其它飲料也是如此。用本發(fā)明方法獲得的啤酒具有更高的內(nèi)源抗氧化劑活性。由于抗氧化劑是促進(jìn)健康的成分，因此用本發(fā)明方法獲得的飲料將被認(rèn)為比用除去多酚的物質(zhì)(如PVPP)處理而制備的同一類型的飲料更健康。
本發(fā)明方法另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它防止了發(fā)酵和高濃啤酒調(diào)節(jié)過程中的疏水多肽的損失。在啤酒生產(chǎn)的醪液形成階段中疏水多肽提取的改進(jìn)因此導(dǎo)致了更高的產(chǎn)率和改進(jìn)的啤酒頭穩(wěn)定性。(Brey等人；Journal of the Institute of Brewing，Vol.108，No.4，424-433，2002)。已知脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可以降低肽的疏水性，從而改進(jìn)它們的水溶性并減少它們的澀味(WO02/45523)。事實(shí)上，我們在實(shí)施例15中證明了使用Endo-Pro酶后獲得了更高的蛋白質(zhì)水平和改進(jìn)的啤酒頭穩(wěn)定性。脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶可選擇地與本發(fā)明所述的輔助性蛋白酶組合使用因此是有利的。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于用本發(fā)明方法獲得的果汁不退色或比除去多酚后獲得的果汁不易退色。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的葡萄酒和果汁相比于用皂土或類似化合物的方法獲得的飲料具有改進(jìn)的香味和滋味，這是因?yàn)樵硗敛粌H除去了蛋白質(zhì)，也除去了產(chǎn)生香味和/或滋味的組分。
實(shí)施例實(shí)施例1材料脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶(Endo-Pro′s)黑曲霉G306于2001年9月10日保藏于CBS(CBS109712)。黑曲霉G306含有編碼本發(fā)明脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶的基因?？色@自該生物的基因或cDNA可以用已知的方法在任何黑曲霉宿主中克隆和表達(dá)。
使用了下列樣品1)在對啤酒的實(shí)驗(yàn)中使用了″Endo-ProA″，其為脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。該樣品是超濾濃縮液，在超濾發(fā)酵培養(yǎng)基后獲得，所述發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵含有脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶編碼基因的黑曲霉菌株后獲得。Endo-ProA樣品的脯氨酰特異性活性為5.06U/ml，按照方法部分所述測定。基于純度大于90％的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶樣品的特異性活性，估計(jì)所述蛋白質(zhì)濃度為50g/l。
2)在對葡萄酒的實(shí)驗(yàn)中使用了″Endo-Pro B″，其為脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。該樣品在柱純化后獲得，具有的活性為6.0U/ml。
木瓜蛋白酶在用木瓜蛋白酶的實(shí)驗(yàn)中使用了Collupulin，其為可商購獲自DSM的液體木瓜蛋白酶制劑?；钚詾?280NF/mg。一個(gè)單位的NF定義為在pH6.0每小時(shí)催化酪蛋白水解生成1微克當(dāng)量可溶酪氨酸所需的木瓜蛋白酶活性的數(shù)量。測量木瓜蛋白酶樣品中蛋白濃度為119g/l(Lowry)。
聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)所用的PVPP是可商購獲得的非水溶性PVPP，名稱為′Polyclar AT″。
啤酒在對啤酒進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)中使用了來自″Les TroisBrasseurs″(Lille，法國)的麥芽啤酒(pilsener型)。該啤酒的醇百分比為5.2％(v/v)，pH為4.4。之所以選擇這一特定的啤酒是因?yàn)樵诶鋮s時(shí)，該啤酒相對于其它商購獲得的啤酒具有更大數(shù)量的混濁。用Lowry氏方法測定該啤酒的蛋白濃度為0.9g/l。
白葡萄酒不經(jīng)過任何蛋白質(zhì)除去處理，而使用從白色Sauvignon葡萄制備的白葡萄酒。用所選擇的來自Lallemand的酵母VL3在葡萄酒制備過程中進(jìn)行醇發(fā)酵。該葡萄酒的酒學(xué)分析得出下列結(jié)果
實(shí)施例2方法測定酶活性的分光光度法為了測量脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性，使用了在0.1M檸檬酸/0.2M磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0，含有40％二噁烷)中制備的2mM N-芐酯基-甘氨酸-脯氨酸-對硝基苯胺(Z-Gly-Pro-pNA；分子量426.43；Bachem，Switserland)溶液的底物溶液。
向1mL的緩沖液(pH5.0)中加入250ul底物溶液，接著加入100ul的酶溶液(較大或較小體積量的酶溶液應(yīng)該用緩沖液補(bǔ)償)。反應(yīng)混合物在37℃下孵育，通過在410nm測量吸收增加來監(jiān)控pNA的釋放。
一個(gè)單位被定義為在上述反應(yīng)條件下在1分鐘內(nèi)從Z-Gly-Pro-pNA中釋放1umol pNA所需的酶活性，其中使用了8,800M-1的摩爾消光系數(shù)(E)。
使用上述程序在pH5.0和37℃下在合成生色底物Z-Gly-Gly-pNA上測量分離自Flavourzyme 1000 L(NOVO，Denmark)的甘氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的活性。一個(gè)單位的甘氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶被定義為pH5.0和37℃下在1分鐘內(nèi)從Z-Gly-Gly-pNA釋放1微摩爾pNA所需的酶的數(shù)量。
使用氨基酸分析儀通過測量從合成肽Z-Pro-Pro(Bachem，Switserland)釋放的脯氨酸殘基數(shù)量來測量來自黃單胞菌屬物種的脯氨酸特異性羧肽酶活性。一個(gè)單位被定義為pH7.0和37℃下在1小時(shí)內(nèi)從Z-Pro-Pro釋放1微摩爾脯氨酸所需的酶的數(shù)量。
冷卻混濁測量(根據(jù)Lucien Chapon的醇/低溫測試)根據(jù)操作說明書，用濁度計(jì)(″Tannometer″，Pfeuffer Gmbh，Kitzingen，Germany)測量混濁。在冷的啤酒中，可以出現(xiàn)不可逆的混濁，這是由沉淀的多酚-蛋白復(fù)合體造成的。添加多余的醇加速了這些混濁的形成。在″冷卻混濁測試″中，該現(xiàn)象被用于定量所存在的多酚-蛋白復(fù)合體。為了對Tannometer進(jìn)行校正，按照描述的制備了formazine標(biāo)準(zhǔn)溶液(Jean de Clerk，″Coursde Brasseries″2nd Edition，Vol 2，1963，pp.595-596，Universitéde Louvain，Belgium)。所用的啤酒混濁單位是ECB，其是European Brewery Convention所推薦的濁度單位。所述對啤酒的冷卻混濁測試也可以用不含醇的啤酒或麥芽汁(改進(jìn)自the Operating Instruction Guide of the Tannometer)進(jìn)行。在這些情況下，也將乙醇添加到樣品中，其所添加的量足以在樣品中達(dá)到10％(v/v)的醇含量。將乙醇添加到所有麥芽汁樣品中以達(dá)到10％(v/v)，接著每一樣品在30分鐘內(nèi)冷卻至-8℃。接著在濁度計(jì)中快速測量所形成的混濁(濁度，單位為EBC)，其中該濁度計(jì)的測量室的溫度也為-8℃。
根據(jù)European Brewery Convention的″熱混濁″測量法所述″熱混濁測量法″是European Brewery Convention在序號9.30下推薦的啤酒混濁測量方案。已經(jīng)證明，在升高的溫度下啤酒儲存相對短的時(shí)間將會產(chǎn)生混濁，其混濁程度類似于同一啤酒在室溫下長期儲存所產(chǎn)生的混濁。該″熱混濁″測試如下進(jìn)行在0℃的冷卻浴中將啤酒冷卻過夜，并在早上讀取初始濁度，接著將啤酒放在60℃的浴中48小時(shí)(不攪拌)，將啤酒冷卻并保持在0℃過夜，最后在0℃測量濁度。
對于葡萄酒和果汁進(jìn)行加熱混濁測試如K.J.Siebert所述(K.J.Siebert等人，J.Agric.FoodChem.44(1996))，飲料如葡萄酒或果汁中的混濁可以通過加熱測試來誘導(dǎo)。所形成的混濁量主要是飲料中混濁-活性蛋白和多酚含量的函數(shù)。在加熱測試中，在80℃加熱30分鐘之前和之后用濁度計(jì)測量樣品(例如葡萄酒或果汁)的濁度。在測量濁度之前，在冷水中將加熱的樣品冷卻下來，直至達(dá)到22-25℃的溫度。在葡萄酒實(shí)驗(yàn)中(見實(shí)施例7)，用NTU-formazine標(biāo)準(zhǔn)溶液校正濁度計(jì)，對于果汁實(shí)驗(yàn)(見實(shí)施例8)，NTU濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液購自Reagecon，Ireland。NTU＝濁度單位。
對照實(shí)驗(yàn)1.進(jìn)行了空白實(shí)驗(yàn)，其中在孵育過程中未加入外源蛋白。
2.進(jìn)行了這樣的實(shí)驗(yàn)，其中使用了在孵育前用大量PVPP(1000g/hl)處理過的啤酒。該實(shí)驗(yàn)允許確定由冷卻混濁測試誘導(dǎo)并歸因于多酚-蛋白沉淀的平均混濁量，因?yàn)镻VPP從啤酒中除去了多酚，因此干擾了混濁形成。
3.進(jìn)行了這樣的實(shí)驗(yàn)，其中將外源蛋白(分別為脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶或木瓜蛋白酶)加至于40℃孵育1小時(shí)后冷卻至0℃的啤酒中。在混濁測量之前，在0℃孵育15分鐘。由于所述酶和木瓜蛋白酶在0℃沒有活性或基本沒有活性，因此這些實(shí)驗(yàn)允許區(qū)分酶活性效果和非酶蛋白質(zhì)的效果。
LC/MS分析用HPLC表征三個(gè)合成肽，其中所述HPLC使用P4000泵(ThermoquestTM，Breda，the Netherlands)，并裝備有LCQ離子阱質(zhì)譜儀(ThermoquestTM，Breda，the Netherlands)，所述三個(gè)肽用150*1mm PEPMAP C18 300A(LC Packings，Amsterdam，The Netherlands)柱分離，其中用0.1％溶于Milli Q水的甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和0.1％溶于乙腈的甲酸(溶液B)梯度洗脫。使用″scan dependent″MS/MS算法獲得單個(gè)肽的詳細(xì)信息，其中所述算法是離子阱質(zhì)譜儀的特征性算法。通過將用MS/MS獲得的不同肽的實(shí)驗(yàn)肽序列與理論序列信息進(jìn)行比較，檢查了針對羥脯氨酸和丙氨酸的內(nèi)切蛋白酶特異性。
實(shí)施例3添加脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶對啤酒中混濁形成的影響向蛋白含量為0.9g/l除去碳酸的麥芽啤酒(Les TroisBrasseurs)中加入各種數(shù)量的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶(″Endo-Pro A″，見材料部分)。進(jìn)行了兩個(gè)系列的混濁測量。在第一個(gè)系列中，在冷卻混濁測試前，啤酒-Endo-Pro A組合物在40℃孵育1小時(shí)。在40℃孵育后，并且即將進(jìn)行冷卻混濁測試前，將乙醇加入該啤酒-Endo-Pro A組合物中，其所加入的量足以使醇含量增加至6％(V/V)。在第二個(gè)系列中，將不含Endo-Pro A的啤酒在40℃孵育1小時(shí)，接著冷卻到0℃。在0℃下，加入Endo-ProA，所得組合物在0℃孵育15分鐘。即將進(jìn)行冷卻混濁測試前，將乙醇加入該啤酒-Endo-Pro A組合物中，其所加入的量足以使醇含量增加至6％(v/v)。
表1顯示了加入的Endo-Pro A量，以及相對于不加Endo-ProA時(shí)所測得的混濁的混濁減少百分比。所加Endo-Pro A的量變化范圍很大，從小于1％的所加外源蛋白到大于10％(相對于啤酒中存在的蛋白量)。
表1.向啤酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶對在40℃孵育1小時(shí)后混濁量的影響
*″所加外源酶的百分比″反映了所加的Endo-Pro A″-酶量，以加入該酶前啤酒中所存在總蛋白量的百分比來表示。
表2.向啤酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶對在0℃孵育15分鐘后混濁量的影響
表1清楚地表明在冷卻前于蛋白酶具有活性的溫度下向啤酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶后，冷卻時(shí)所形成的混濁量減少。表2表明當(dāng)脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶在較低溫度下(在該溫度下，該蛋白酶不具有活性或基本不具有活性)加入至啤酒中后，會有一些效果，但該效果相對于在蛋白酶具有活性的溫度下加入蛋白酶所得到的效果來說是非常小的。
實(shí)施例4添加木瓜蛋白酶對啤酒中混濁形成的影響向蛋白含量為0.9g/l的除去碳酸的麥芽啤酒(Les TroisBrasseur)中加入各種數(shù)量的木瓜蛋白酶(0到100g/hl)。進(jìn)行了兩個(gè)系列的冷卻混濁測量。對于第一個(gè)系列，在冷卻混濁測試前，啤酒-木瓜蛋白酶組合物在40℃孵育1小時(shí)。在進(jìn)行冷卻混濁測試前，將乙醇加入所孵育的樣品中以達(dá)到6％醇(v/v/)。在第二個(gè)系列中，將啤酒樣品在40℃孵育1小時(shí)，接著冷卻到0℃。接著加入木瓜蛋白酶，該樣品在0℃孵育15分鐘。表3顯示了加入的木瓜蛋白酶量，以及相對于不加木瓜蛋白酶時(shí)所測得的混濁的混濁減少百分比。
表3木瓜蛋白酶對在40℃孵育1小時(shí)后啤酒中形成的混濁量的影響
(1)3g/hl是所推薦的最大劑量。
表4.木瓜蛋白酶對在0℃孵育15分鐘后混濁量的影響
表3的結(jié)果表明了木瓜蛋白酶對冷卻時(shí)啤酒中形成的混濁量的影響。清楚的是，當(dāng)木瓜蛋白酶加入的量為3g/hl和更高時(shí)，木瓜蛋白酶對混濁的影響趨于平穩(wěn)。很明顯，用木瓜蛋白酶不可能獲得與用脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶獲得的同樣的混濁減少量。
實(shí)施例5加入PVPP對啤酒中混濁形成的影響在啤酒-脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶實(shí)驗(yàn)和啤酒-蛋白酶實(shí)驗(yàn)兩者中，都通過在孵育前向啤酒中加入大量PVPP(1000g/hl)而進(jìn)行了對照實(shí)驗(yàn)。在混合15分鐘后，過濾除去PVPP(沒有加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶或木瓜蛋白酶)。在兩個(gè)對照中，冷卻混濁測試中幾乎沒有形成混濁。由于已知PVPP從飲料中除去多酚，因此這些對照實(shí)驗(yàn)表明多酚參與了啤酒的混濁形成。為了測量PVPP對啤酒混濁穩(wěn)定性的影響，向除去碳酸的啤酒中加入不同量的PVPP，并且在混合15分鐘后過濾除去。在加入PVPP前，啤酒在40℃孵育1小時(shí)。
表5顯示了加入不同量的PVPP對冷卻時(shí)啤酒中存在的混濁數(shù)量的影響。沒有加入Endo-Pro A或木瓜蛋白酶。
表5.PVPP對冷卻時(shí)啤酒中存在的混濁量的影響
在釀酒廠中使用的最大劑量為30g/hl。
表3表明在40℃下孵育1小時(shí)后加入3g木瓜蛋白酶/hl啤酒(啤酒工業(yè)中所推薦的最大劑量)誘導(dǎo)混濁減少了幾乎36％。在加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶的情況下，在40℃孵育1小時(shí)后加入1％(相對于啤酒中存在的蛋白質(zhì)量)脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶誘導(dǎo)啤酒冷混濁減少了38％(見表1)。在釀酒廠中，PVPP的加入量通常不會超過30g/hl。由于PVPP以所述量加入時(shí)減少了大約2o％的混濁，因此可以得出結(jié)論，木瓜蛋白酶和脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶是比PVPP更好的混濁抑制劑。
實(shí)施例6在100％麥芽醪液中加入Endo-Pro A以及100％麥芽汁中混濁的減少目的是要確定向100％麥芽醪液中加入Endo-Pro A是否會導(dǎo)致最終麥芽汁中混濁減少。
每一醪液形成實(shí)驗(yàn)都以25g磨碎的麥芽和100ml水混合開始。接著將醪液加熱到50℃，在加入一定量的″Endo-Pro A″后，根據(jù)逐步加熱程序?qū)Ⅴ惨杭訜嶂了膫€(gè)逐次增高的溫度。表6顯示了醪液形成溫度情況。在醪液形成整個(gè)過程中，醪液在200rpm下攪拌。在醪液形成末期，醪液保持在室溫，并加入水以補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水。接著，醪液在紙上過濾，以將麥芽汁(液體)和固體分離。
表6.醪液漿形成時(shí)的溫度情況
分別向醪液中加入0、200和500ul的Endo-Pro A。進(jìn)行了對照實(shí)驗(yàn)，其中使用了在90℃加熱15分鐘而失活的500ul的Endo-Pro A。于冷卻混濁測試之后在室溫下測量麥芽汁的混濁。根據(jù)Chapon的醇/低溫測試(冷卻混濁測試-Pfeuffer Operatinginstructions)進(jìn)行了麥芽汁冷卻測試，其中如Chapon對不含醇的啤酒所推薦的，加入乙醇至樣品中達(dá)到10％(v/v)。
表7在100％麥芽醪液中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶對產(chǎn)生的100％麥芽汁中混濁形成量的影響(冷卻混濁測試后)
EBCEuropean Brewery Convention推薦的濁度單位。
表7的結(jié)果清楚地表明，當(dāng)脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶加入至麥芽醪液中時(shí)，所得的麥芽汁在冷卻時(shí)比不加脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶所制備的麥芽汁產(chǎn)生更少的混濁。
為了研究Endo-Pro A的影響，在麥芽汁上進(jìn)行了冷卻混濁測試。發(fā)現(xiàn)加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶減少了麥芽汁的冷卻混濁。即使在加入少量的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶后，也能觀察到冷卻混濁測試中形成的混濁減少了。當(dāng)酶在加入至醪液之前失活時(shí)，其穩(wěn)定效果完全消失，即所形成的混濁量不再減少。通過加入脯氨酰特異性酶誘導(dǎo)的混濁減少是非常重要的。在實(shí)施例中，獲得了最多82％的混濁減少量。
為了比較在麥芽汁(malt worts)和大麥麥芽汁(barleyworts)加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶的效果，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，其中將不同量的Endo-Pro A加入到大麥醪液中。pH值在麥芽汁中為5.6，在大麥麥芽汁中為6.1。用大麥麥芽汁混濁測試獲得的結(jié)果表明，如同前面對麥芽汁所觀察到的，用脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶處理大麥麥芽汁誘導(dǎo)了重要的大麥麥芽汁冷卻混濁減少。用脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶處理麥芽醪液和大麥醪液都產(chǎn)生了高度穩(wěn)定的麥芽汁，但是在麥芽汁中的效果強(qiáng)于在大麥麥芽汁中的效果。事實(shí)上，在醪液中加入200ul的Endo-Pro A在大麥麥芽汁中誘導(dǎo)了大約59％的混濁減少，而在麥芽汁中誘導(dǎo)了超過70％的混濁減少。用500ul Endo-Pro A進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，在麥芽汁中進(jìn)一步減少了混濁，減少量直至82％，而在大麥麥芽汁中相對于200ulEndo-Pro A沒有進(jìn)一步減少混濁。出乎意料地，向大麥醪液中加入Endo-Pro A產(chǎn)生了澄清地過濾后麥芽汁，而未用Endo-Pro處理的醪液產(chǎn)生了霧狀的過濾后麥芽汁(大麥醪液過濾在室溫下進(jìn)行，麥芽汁的濁度在室溫下測定，其中不加乙醇)。無論在大麥醪液中加多少脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶，都能夠觀察到該效果。
實(shí)施例7葡萄酒中的混濁減少向含有590ml白葡萄酒(“材料”部分下所述的葡萄酒)的燒瓶中加入不同劑量的(0、30、60、150ul)具有6.0U/ml特異活性的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶(Endo-Pro B)，并于室溫(22-25℃)下在氮?dú)庵蟹跤?9天。在0、6、8、12和19天后，用“方法”部分下所述的加熱測試法測量葡萄酒混濁穩(wěn)定性。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表8。在表8中，葡萄酒混濁以濁度單位(NTU)表示。ΔNTU＝加熱后葡萄酒樣品中測得的NTU表示的濁度-加熱前葡萄酒樣品中測得的NTU表示的濁度。根據(jù)公式(1.48×ΔNTU)+2，計(jì)算穩(wěn)定葡萄酒中的蛋白質(zhì)所需的皂土量。如已知的，當(dāng)葡萄酒不易于形成混濁時(shí)，只需較少的皂土即可防止混濁形成。
表8.向白葡萄酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶對加熱葡萄酒后形成混濁的數(shù)量的影響
表8的結(jié)果顯示，在加熱前向白葡萄酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶減少了加熱后葡萄酒中形成的混濁。在室溫孵育6天后，觀察到了該效果。事實(shí)上，加入150ul的Endo-Pro B使混濁減少達(dá)到了39％，而加入30ul或60ul的Endo-Pro B，達(dá)到大約12％。12天后，不管使用多少量的脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶，混濁減少達(dá)到了46％，并在19天后超過了70％。因此，很清楚，脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶可以用來避免或減少穩(wěn)定葡萄酒以防止混濁形成所需的皂土數(shù)量。
實(shí)施例8草莓汁中的混濁減少如下制備草莓果汁使草莓解凍并壓碎，接著在90℃下漂白(加熱)以破壞所有內(nèi)源酶，例如多酚氧化酶，并使蛋白質(zhì)變性。將壓碎的草莓冷卻至50℃，在50℃下用600g/t的Rapidase BEsuper(DSM的商業(yè)酶產(chǎn)品，F(xiàn)rance)浸泡30分鐘，并在氣體加壓機(jī)中加壓。為了除去變性蛋白質(zhì)，所得混合物在8000rpm下離心，并過濾。收集草莓汁。酸化的醇測試是陰性的，這證實(shí)該草莓汁不含膠質(zhì)。該草莓汁的pH值為3.3。
Endo-Pro A/草莓汁孵育向100ml草莓汁中加入不同體積(0、5、10、20ul)的Endo-Pro A(5.06U/ml)，在50℃下孵育60分鐘。進(jìn)行了兩個(gè)對照實(shí)驗(yàn)(i)一個(gè)加入20ul失活的Endo-Pro A(在80℃下孵育30分鐘)；和(ii)在第二個(gè)對照中，向20ml預(yù)先在50℃孵育1小時(shí)的草莓汁中加入200mg的PVPP。在室溫下混合15分鐘后，離心除去PVPP。
果汁加熱測試在將果汁在80℃下加熱30分鐘之前以及之后，測量果汁的混濁。在測量混濁之前，將加熱的果汁用冷水冷卻下來。
在預(yù)先用Reagecon(Ireland)的NTU濁度標(biāo)準(zhǔn)校正的濁度計(jì)中測量濁度。
-油墨組的制備-實(shí)施例11中，除了把實(shí)施例1、6、7、8的各記錄用油墨的表面活性劑改成含氟表面活性劑(FT-110(ネオス公司制)以外，其他與實(shí)施例11同樣地制備實(shí)施例12的油墨組。
對制得的實(shí)施例10～12及比較例7～8的各油墨組進(jìn)行以下的評價(jià)。把結(jié)果示于表3。
<圖像品質(zhì)(色邊界滲色)評價(jià)>
使用前述噴墨(IJ)打印機(jī)IPSiO Jet 300(株式會社リコ-制)，作為評價(jià)用紙使用普通紙。打印文字圖像，按以下標(biāo)準(zhǔn)對其文字滲色、色邊界滲色進(jìn)行評價(jià)?！颉瓫]有觀察到滲色的狀態(tài)○…基本上沒有觀察到滲色的狀態(tài)△…觀察到有若干滲色的狀態(tài)×…觀察到滲色明顯的狀態(tài)表3
由表3的結(jié)果看出，不含表面活性劑及浸透劑的至少任何一種的比較例7～8的油墨組，對紙的浸透性差，即使?jié)舛雀咭惨诐B色，尤其是高速進(jìn)行印字的場合，由于滲色故圖像品質(zhì)降低。
相反，實(shí)施例10～12的油墨組，尤其是實(shí)施例10及11的油墨組，不產(chǎn)生文字滲色及色邊界滲色，表明具有高品位的圖像品質(zhì)。
以下，對實(shí)施例4、5、8的各記錄用油墨，及實(shí)施例12的油墨組中的藍(lán)油墨進(jìn)行以下的評價(jià)。把結(jié)果示于表4。
<噴出穩(wěn)定性評價(jià)(連續(xù)噴出穩(wěn)定性)>
從黃單胞菌中分離所需的羧肽酶被證明是一項(xiàng)困難的任務(wù)，因?yàn)閁S 5,693,503所述的純化方法在我們手中是不成功的，因此必須開發(fā)一種全新的純化方案。在許多測試的方案中，下面的方案產(chǎn)生了基本純化的酶。
從1升培養(yǎng)液開始，離心收集細(xì)胞，用水洗滌一次，接著通過0℃的超聲處理破碎細(xì)胞。
在20000rpm下離心20分鐘除去細(xì)胞碎片，在同樣條件下再次離心所得的上清液。接著向上清液中加入硫酸銨達(dá)到40％飽和度。低速離心后，收集上清液，再加入硫酸銨達(dá)到80％飽和度。用低速離心收集新形成的沉淀，在pH7.0和4℃下，充分透析，加樣至用0.05摩爾/升tris-HCl(pH8.0)平衡的桿菌肽-Sepharose柱上(J.Appl.Biochem.，1983 pp420-428)。用補(bǔ)充了1摩爾/升NaCl和10％(v/v)異丙醇的平衡緩沖液洗脫結(jié)合在柱上的材料。如材料和方法部分所述，通過與合成底物Z-Pro-Pro孵育來鑒定含有所需酶活性的級分。含有活性的級分接著加樣至用0.025摩爾/升Tris-HCl(pH8.5)平衡的MonoQ柱上。在這些條件下，酶結(jié)合到柱上，并用NaCl濃度梯度洗脫。收集活性級分，透析，并如上所述在Mono Q柱上再次進(jìn)行層析。在37℃下于Z-Pro-Pro上測量最終濃縮物的活性，pH7.0時(shí)為0.5單位/ml，pH5.5時(shí)為0.09單位/ml。在50℃和pH5.5下孵育2-3小時(shí)后，該酶保留了大約50％的活性。該制劑用于實(shí)施例11所述的測試中。
只有從Xanthomonas campestris pv campestris中分離的酶在酸性條件下顯示活性。從X.rubrilineans分離的類似羧肽酶在pH5.5不顯示活性，因此較不適合于所預(yù)期的用途。
實(shí)施例10從米曲霉中分離甘氨酸切割型內(nèi)切蛋白酶已經(jīng)在番木瓜提取物中鑒定了能切割富含甘氨酸殘基的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶(甘氨酰內(nèi)肽酶，EC 3.4.22.25)。但是，該酶對于所預(yù)期的應(yīng)用具有幾個(gè)不利之處，因?yàn)槠渚哂邢鄬Ω叩?近中性)pH最佳值，并且如果以純化形式生產(chǎn)則成本較高。因此在潛在食品級微生物中鑒定酸穩(wěn)定的、甘氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶能提供許多優(yōu)點(diǎn)。為了該目的，我們已經(jīng)篩選了大量商業(yè)可獲得的食品級酶制劑。
如上所述，該篩選用合成生色肽Z-Gly-Gly-pNA在pH4.0下進(jìn)行。檢測了六種不同的酶制劑，只有Flavourzyme 1000L(來自米曲霉的HPN 00011；NOVO，Denmark)顯示出一些針對所使用合成底物的活性。為了分離具有這一活性的酶，必須測試大量不同的純化方案。下面方案被證明是成功的。
首先，通過充分透析除去了Flavourzyme材料中存在的多余的低分子量成分。在透析過程中，甘氨酸特異性活性降低至其初始值的約50％。所得透析過的液體進(jìn)一步洗滌，并用Amicon PM-10超濾裝置濃縮。向所得液體濃縮液中加入硫酸銨至50％，離心后向上清液中加入更多的硫酸銨以達(dá)到飽和水平的75％。然后用低速離心收集獲得的沉淀，透析，使用PM-10裝置再次濃縮所得的液體。將濃縮液加樣于Sephadex G-100凝膠過濾柱中，收集活性級分。如材料和方法部分所述，在pH4.0下用Z-Gly-Gly-pNA測定每一級分中的活性。所收集的級分然后進(jìn)行離子交換層析，在用0.05摩爾/升乙酸鈉(pH5.0)平衡的HITrap Q上進(jìn)行，并用含有1M NaCl的相同緩沖液洗脫。如上所述，通過在pH5.0下與Z-Gly-Gly-pNA孵育來鑒定活性級分，合并級分，并用PM-10裝置濃縮。如果在pH5.0下測量，最終濃縮液含有0.008單位/ml。該溶液用于進(jìn)行實(shí)施例11所述的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例11用所選擇的輔助蛋白酶處理后100％麥芽汁的混濁穩(wěn)定性改進(jìn)了本實(shí)施例證明了Endo-ProA處理結(jié)合所選擇的輔助蛋白酶處理可以進(jìn)一步改進(jìn)Endo-ProA的抗混濁效果。它用實(shí)例證明了當(dāng)與Endo-ProA組合使用時(shí)，來自野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)的脯氨酸特異性羧肽酶(″CarboxyPro″)或來自米曲霉的甘氨酸切割型內(nèi)切蛋白酶(″EndoGly″)進(jìn)一步顯著降低了混濁形成。本實(shí)施例著眼于100％麥芽汁中的混濁減少效果。
為了制備麥芽汁，將50g磨碎的麥芽與200ml水混合，并加熱到50℃。加入0或150ul的Endo-Pro酶濃縮液，醪液經(jīng)歷表10中所述的逐步加熱方案。在這一過程中，醪液在200rpm下攪拌。最后，將醪液冷卻到室溫，加入水以補(bǔ)充任何蒸發(fā)的水。最后，在紙上過濾醪液，以將固體和麥芽汁(液體)分離。如此獲得的麥芽汁被用于測試輔助酶的效果，其中用PVPP的效果作為參照。
表10.醪液形成溫度方案
由于PVPP對多酚具有高的親和力，因此在工業(yè)中廣泛用于除去多酚-蛋白質(zhì)凝聚造成的啤酒混濁。為了確定CarboxyPro或EndoGly是否和PVPP一樣也具有混濁降低效果，將未用Endo-Pro處理的麥芽汁在50℃下與100ul CarboxyPro或20ul EndoGly孵育120分鐘，接著根據(jù)材料和方法部分所述的程序測量形成的混濁的穩(wěn)定性。作為參照，未用Endo-Pro處理的醪液在過濾之前與PVPP在室溫孵育15分鐘，接著進(jìn)行測量。所得結(jié)果示于表11中。
表11PVPP、CarboxyPro和EndoGly對未用Endo-Pro處理的100％麥芽汁的冷卻混濁的影響
EBCEuropean Brewery Convention推薦的濁度單位根據(jù)表11所示的結(jié)果，與CarboxyPro和EndoGly孵育都產(chǎn)生了冷卻時(shí)具有較少混濁的麥芽汁。但是，該結(jié)果也清楚顯示加入PVPP的效果更好。
進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，其中使用了在醪液形成階段用Endo-Pro預(yù)處理的麥芽汁。在該實(shí)驗(yàn)中，向該麥芽汁中加入輔助蛋白酶，即每10毫升麥芽汁加入0、100或500微升的EndoGly或0、20或100微升的CarboxyPro。在50℃下所有樣品孵育120分鐘，接著進(jìn)行冷卻混濁測試。結(jié)果示于表12中。
表12用Endo-Pro A處理100％麥芽汁，接著與各種量的CarboxyPro或EndoGly孵育所獲得的麥芽汁冷卻混濁結(jié)果
EBCEuropean Brewery Convention推薦的濁度單位根據(jù)表12中所示的結(jié)果，Endo-Pro預(yù)處理與CarboxyPro或EndoGly處理的組合對麥芽汁的混濁穩(wěn)定性具有顯著效果。依賴于所加輔助蛋白酶的濃度，其獲得的結(jié)果優(yōu)于用PVPP在未用Endo-Pro處理的麥芽汁中所得的結(jié)果(表11)。
最后進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以測試所觀察到的酶效果是否是非酶促假相或特異性蛋白水解作用造成的結(jié)果。為了該目的，向Endo-Pro處理過的麥芽汁中加入100ul CarboxyPro或20ul EndoGly。為了防止所有輔助酶的酶活性，在測量所形成的麥芽汁冷卻混濁之前，將含有這些酶的麥芽汁在0℃保持15分鐘(即與PVPP的孵育時(shí)間可比)。將用各種量PVPP處理并接著過濾的麥芽汁用作參照。
表13Endo-Pro處理的100％麥芽汁在0℃下與CarboxyPro或EndoGly孵育或者在室溫與PVPP孵育的效果
EBCEuropean Brewery Convention推薦的濁度單位表13中的數(shù)據(jù)顯示如果在0℃下孵育，CarboxyPro和EndoGly都沒有效果，這提示它們的蛋白水解活性是表11和12中所觀察到的混濁穩(wěn)定性的直接原因。PVPP只有有限的效果(混濁減少僅為17.3％，而在表11的條件下混濁減少為46.8％)。這一觀察結(jié)果再次證實(shí)Endo-Pro孵育對所存在的可沉淀多酚-蛋白質(zhì)總量的影響通過防止多酚-蛋白質(zhì)凝聚的形成，使用PVPP已幾乎成為多余的。
實(shí)施例12Endo-Pro A也具有Endo-Hydroxy-Pro和Endo-Ala活性研究了Endo-Pro A對羥脯氨酸和丙氨酸是否也具有內(nèi)切蛋白酶特異性。因此合成了三個(gè)覆蓋αs1-酪蛋白B的合成肽，并具有一些修飾。所述肽為·0139-59，SEKTTMPLW，原始αsl-酪蛋白C末端，M＝1091.5·0139-60，SEKTTMJLW，J為羥脯氨酸，M＝1107.5·0139-61，SEKTTMALW，用丙氨酸取代脯氨酸，M＝1065.5為了分析此類復(fù)雜的肽，使用了稱為掃描依賴性MS/MS的混合物。在該方法中，每一掃描由三個(gè)部分組成，定義如下1完全掃描分析，2放大掃描分析以確定在完全掃描質(zhì)量范圍中最強(qiáng)離子的電荷狀態(tài)，3對完全掃描質(zhì)量范圍中最強(qiáng)離子進(jìn)行MS/MS獲得氨基酸序列信息。
所有三個(gè)肽以75-100ug/l的濃度溶于0.1％甲酸中，并用梯度洗脫在LC/MS和LC/MS/MS模式中檢查它們的純度。通過氨基酸序列的總覆蓋，所有三個(gè)肽在LC/MS模式和LC/MS/MS模式中可以通過它們質(zhì)子化或雙重質(zhì)子化的分子來鑒定。
在分析前，用Endo-ProA處理的合成肽稀釋50倍。對于處理后形成的肽的LC/MS分析，梯度必須稍加調(diào)整。如果Endo-ProA確實(shí)具有羥脯氨酸特異性，則該肽應(yīng)該被切割成下列部分SEKTTMP和LW，各自在m/z 793.4和318.1具有質(zhì)子化的分子。SEKTTMJ和LW，各自在m/z 809.4和318.1具有質(zhì)子化的分子。
在Endo-Pro處理的肽的離子色譜中確實(shí)觀察到了這兩個(gè)所預(yù)測的肽質(zhì)量，在LC/MS/MS模式中檢查表明具有正確的氨基酸序列。
通過在離子色譜中觀察到m/z 767.4的SEKTTMA和m/z 318.1的LW，表明第三個(gè)合成肽也具有相同的模式。Endo-Pro優(yōu)先在P、J和A的C末端切割，但是短1、2或3個(gè)氨基酸的肽也能觀察到，并能用LC/MS/MS清楚地鑒定。但是這些百分比都低于6％。表14中給出了對上述的總結(jié)。
表14用Endo-Pro A處理后所有三個(gè)合成肽所形成的肽。通過它們的質(zhì)子化分子和MS/MS特征檢查了氨基酸序列。
結(jié)論除了優(yōu)先切割脯氨酸外，Endo-Pro A確實(shí)還能在羥脯氨酸和丙氨酸的羧基末端側(cè)切割它們。
實(shí)施例13Endo-Pro的pH最佳值將根據(jù)SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的DNA序列表達(dá)于黑曲霉iso 502。這分別產(chǎn)生根據(jù)SEQ ID NO5和SEQ ID NO4的多肽。這些多肽將分別稱為Endo-Pro RUS和Endo-Pro GAM。兩種酶非常相似，但在一些生物學(xué)方面不同。Endo-Pro RUS具有更高的特異活性，并且在除去啤酒混濁方面更有活性。
1)Endo-Pro的pH最佳值用試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白和Roche的指導(dǎo)(″Universal ProteaseSubstrate″；Cat.No 1 080 733)測量了Endo-Pro的蛋白水解活性。通過用蛋白酶處理，試鹵靈標(biāo)記的肽被釋放，其不能與三氯乙酸形成形成沉淀。因此Endo-Pro酶在給定溫度或pH值下的活性越大，則在574nm的光吸收越高。pH范圍為pH4.5-4.8-5.0-5.5-6.0-7.0-8.0。對pH7和8使用了0.1MTris/HCl緩沖液。對更低pH值，使用了0.1M Hac緩沖液。所述緩沖液含有0.02M CaCl2。
反應(yīng)在37℃下進(jìn)行30分鐘，獲得的數(shù)據(jù)提供于表15中。將Endo-ProRUS(6U/mL)和Endo-ProGAM(大約4U/mL)稀釋至0.5U/mL。在孵育混合物中加10uL樣品，并用孵育緩沖液補(bǔ)足體積。
根據(jù)表15中所示的結(jié)果，所述酶的pH最佳值為約pH5.5。但是，后來很清楚的是，在低于pH5.5的pH值處，試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白開始沉淀，因此在低于這一pH值處，獲得了不可靠的結(jié)果。為了對此進(jìn)行校正，在所述的各種pH條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，但是使用Z-Gly-Pro-pNA而不是試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白作為生色底物。用Z-Gly-Pro-pNA和410nm處的光吸收獲得的數(shù)據(jù)(cf實(shí)施例2)清楚顯示兩種Endo-Pro酶在pH4.5附近都具有活性峰。
2)Endo-Pro酶的溫度穩(wěn)定性通過將兩種Endo-Pro酶在pH5.0下加熱至40-50-55和60℃之一，測量了這兩種酶的溫度穩(wěn)定性。在0.5-1-2-5和20小時(shí)后取樣品，并將Endo-ProRUS和Endo-ProGAM活性稀釋至大約0.5U/mL。然后在含有Z-Gly-Pro-pNA(cf實(shí)施例2)的孵育混合物中加入10uL樣品，如實(shí)施例2所述測量殘余酶活性。在參照中，用孵育緩沖液補(bǔ)足10微升體積。未經(jīng)熱處理的酶的Z-Gly-Pro-pNA切割活性作為值100％。
從表16的結(jié)果可以清楚地看出兩種Endo-Pro酶都具有優(yōu)良的溫度穩(wěn)定性。
表15Endo-Pro酶的pH最佳值
表16 Endo-Pro酶的溫度穩(wěn)定性
實(shí)施例14在啤酒發(fā)酵和擴(kuò)增條件下的混濁減少在前面的實(shí)施例中，我們已經(jīng)證明了在室溫(cf實(shí)施例7)和升高的溫度下，酶促防止混濁作用的效果。在本實(shí)施例中我們證明了該酶促Endo-Pro方法的通用性，這是通過證明該脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在遠(yuǎn)離其最優(yōu)條件的情況下也能有效防止混濁形成來表明的。為了該目的，我們已經(jīng)測試了在啤酒發(fā)酵前(因此該酶可以在12℃作用12天)或在啤酒擴(kuò)增前(因此該酶可以在4℃下作用10天)加入Endo-Pro酶后，該酶是否能防止啤酒中混濁形成。
為了測試啤酒發(fā)酵過程中的該酶促混濁防止效果，我們已經(jīng)使用了新制備的含有約4％乙醇的100％麥芽啤酒，所述啤酒經(jīng)過了膜過濾，但沒有經(jīng)過任何旨在除去混濁形成成分的處理。這一“未穩(wěn)定化的”啤酒被除去碳酸，接著加入各種濃度的Endo-Pro酶(見表17)。該混合物接著在12℃孵育10天以盡可能地模擬工業(yè)啤酒發(fā)酵。
為了測試擴(kuò)增條件下的酶促混濁防止效果，使用了完全相同的起始材料和相同濃度的Endo-Pro酶，但是這一次混合物在4℃下孵育10天。
在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在每百公升啤酒中使用了20、30和50g劑量的PVPP((Polyclar AT/水不溶)作為參照(在紙過濾前于室溫?cái)嚢?5分鐘)。
在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，于每百公升中加入了1、2和3克劑量的木瓜蛋白酶(液態(tài)DSM Collupulin；批次號010604，最終活性為5480NFU/mg)。
根據(jù)實(shí)施例2所述，測量所有樣品中的混濁形成。
表17發(fā)酵過程中的酶促混濁防止作用
表18擴(kuò)增過程中的酶促混濁防止作用
從所得數(shù)據(jù)可以清楚地看出，在該方法的發(fā)酵和擴(kuò)增階段都可以實(shí)現(xiàn)酶促混濁清除。相當(dāng)令人驚奇的是，酶促Endo-Pro方法比木瓜蛋白酶或PVPP能更好地抑制啤酒冷卻混濁，并與在對抗熱混濁形成中每百公升加入30克PVPP的效果一樣好。
實(shí)施例15酶促混濁減少及其對啤酒泡沫穩(wěn)定性和多酚(抗氧化劑)水平的影響用蛋白水解酶來減少啤酒中混濁形成的一個(gè)缺點(diǎn)是它們對啤酒泡沫穩(wěn)定性的消極影響。由于過度的蛋白水解降解，谷類蛋白不能形成穩(wěn)定的泡沫。在本實(shí)施例中，我們證明了，可能由于Endo-Pro具有高的選擇性，Endo-Pro酶對啤酒泡沫穩(wěn)定性沒有不利影響。Endo-Pro孵育的一個(gè)重要副作用是所得啤酒具有增高的多酚水平，因此對氧化具有增高的、天然的保護(hù)作用。
在本實(shí)施例中，在四個(gè)都使用100％麥芽的不同先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)了啤酒。在兩個(gè)先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，于醪液形成階段加入了2個(gè)濃度的Endo-Pro酶。在另兩個(gè)先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，沒有加入酶，但這些啤酒用PVPP處理以模擬除去形成混濁的化合物的傳統(tǒng)方法。
用下面的方案來生產(chǎn)啤酒。對于每一測試進(jìn)行一次釀造(6kg麥芽，18升水)。醪液形成在50℃下進(jìn)行20分鐘，50℃-64℃下進(jìn)行10分鐘，64℃下進(jìn)行20分鐘，64℃-74℃下進(jìn)行8分鐘，最后在74℃下進(jìn)行30分鐘。使用醪液濾器進(jìn)行過濾，接著用熱水洗滌。煮沸90分鐘，接著加入啤酒花。在第一次發(fā)酵中使用干的遲延酵母(Dry lager yeast)(每毫升麥芽汁用7.5 106個(gè)細(xì)胞)，在12℃進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間依賴于濃度的降低，但持續(xù)大約10天。于0℃至少7天內(nèi)，啤酒熟化。最后將啤酒用膜過濾并裝瓶。
表19啤酒泡沫穩(wěn)定性和多酚水平
初始、真正和表觀提取物EBC 9-4方法；表觀稀薄化；醇EBC9-4方法；頭保留值Ross & Clark方法；總蛋白Kjeldahl方法；多酚EBC 9-11方法。
所得結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的酶促混濁減少方法對啤酒泡沫絕對沒有負(fù)作用，并且與用PVPP穩(wěn)定的啤酒相比增加了啤酒中總的多酚含量。后一觀察結(jié)果強(qiáng)烈表明用Endo-Pro酶處理的啤酒具有增強(qiáng)的天然抗氧化劑能力。
按照布達(dá)佩斯條約為專利程序目的而進(jìn)行的微生物保藏INTERNATIONAL FORM 1 Wbere Rule 6.4(d) applies，such date is the date on which the status of Lnternationaldaocsitarv authority was acquired.
序列表<110>DSM NV<120>防止或降低飲料混濁的改進(jìn)方法<130>
<140>
<141>
<150>
<151>
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<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1581<212>DNA<2l3>黑曲霉<400>1atgcgtgcct tctccgctgt cgctgctgcg gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctgtctctc ggccagcctc gagtaaatcg 120gctgcgacca cgggcgaggc ttactttgag cagctgctgg accatcataa tccggagaag 180ggcacctttt cccagaggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240gtcgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300gggactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgagcac 360cgctactggg gtgattcttc tccttatgag gtgctcaatg ccgaaactct tcagtacctc 420acactggacc aagccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtgaa gctgcaattc 480gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540agtggtgcct tgacggcttg gaccgaatct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600gccactagtg ctcctgtgga ggctatctac gactattggc aatactttta ccccatccag 660caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720attggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggtctggga 780gctgttgagc attttgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcaa 840gacaacgact ttgccacggg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aagctacggc 1020tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccccatc 1080tacaccgata cctccgtagg caatgccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac 1140
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1.一種防止或降低飲料中的混濁的方法，其中向該飲料中加入脯氨酸特異性和/或羥脯氨酰特異性和/或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)切蛋白酶是基本分離的形式。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，其中所加的內(nèi)切蛋白酶在與其所加至的飲料的pH值相應(yīng)的pH值處具有最大的特異活性。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料含有蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料含有多酚。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料的pH值處于或低于7.0、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或3.0。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中對于飲料中的每克蛋白質(zhì)向飲料中加入至少150毫單位的特異性內(nèi)切蛋白酶活性，所述活性通過用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作為底物的活性測量法來確定。
8.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中對于飲料中的每克蛋白質(zhì)向飲料中加入至少500毫單位的特異性內(nèi)切蛋白酶活性，所述活性通過用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作為底物的活性測量法來確定。
9.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中對于飲料中的每克蛋白質(zhì)向飲料中加入至少1單位的特異性內(nèi)切蛋白酶活性，所述活性通過用Z-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-hydroxy-pro-pNA或Z-Gly-Ala-pNA作為底物的活性測量法來確定。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料是用于啤酒生產(chǎn)的液體。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料是用于葡萄酒生產(chǎn)的液體。
12.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述飲料是用于果汁生產(chǎn)的液體。
13.權(quán)利要求10的方法，其中向醪液中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
14.權(quán)利要求10的方法，其中在混濁形成前向啤酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
15.權(quán)利要求10的方法，其中在混濁形成后向已發(fā)酵的啤酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
16.權(quán)利要求11的方法，其中向已發(fā)酵的葡萄酒中加入脯氨酰特異性內(nèi)切蛋白酶。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中向所述飲料中加入輔助酶以進(jìn)一步降低或防止混濁形成。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述輔助蛋白質(zhì)是純化的外切蛋白酶或內(nèi)切蛋白酶。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述外切蛋白酶是脯氨酸特異性羧肽酶。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述脯氨酸特異性羧肽酶可從黃單胞菌屬中獲得。
21.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述輔助性內(nèi)切蛋白酶是甘氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶和/或天冬氨酸蛋白酶。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述天冬氨酸蛋白酶是Fromase。
23.一種分離的多肽，其具有脯氨酰特異性和/或羥脯氨酰特異性和/或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性，并具有酸性pH最佳值。
24.權(quán)利要求23的多肽，其中所述pH最佳值在pH5.5或pH5.5附近。
25.權(quán)利要求23或24的特異性內(nèi)切蛋白酶在制備飲料中的用途。
26.純化的脯氨酰特異性和/或羥脯氨酰特異性和/或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶在制備啤酒、葡萄酒或果汁中的用途。
27.通過權(quán)利要求1-22和/或25-26中任一項(xiàng)的方法可獲得的飲料。
28.用權(quán)利要求10的方法可獲得的啤酒。
29.用權(quán)利要求11的方法可獲得的葡萄酒。
30.用權(quán)利要求12的方法可獲得的果汁。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過添加脯氨酰特異性和/或丙氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶來防止或降低飲料混濁的方法，以及根據(jù)本發(fā)明方法獲得的新飲料。本發(fā)明也涉及新的內(nèi)切蛋白酶。本發(fā)明也涉及上述方法，其中輔助酶與所述特異性內(nèi)切蛋白酶聯(lián)合使用。提供了基因組DNA、cDNA和蛋白序列的序列信息。
文檔編號C12N9/48GK1659271SQ03813228
公開日2005年8月24日 申請日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者L·伊登斯, M·洛普茲 申請人:Dsm Ip資產(chǎn)有限公司