專(zhuān)利名稱(chēng)：角黃素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微生物制備角黃素或含有角黃素的類(lèi)胡蘿卜素混合物的方法，該角黃素可用作飼料添加劑、食品添加劑等的天然紅色素。
背景技術(shù)：
作為一種改善蛋黃、肉類(lèi)和家禽例如雞的皮膚色澤的方法，在動(dòng)物飼料中添加角黃素已在全球廣泛使用。角黃素也用于動(dòng)物飼料工業(yè)，以改善肉類(lèi)的色澤或海產(chǎn)品如鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、紅海魚(yú)或蝦的皮膚色澤，并且在食品工業(yè)中也可用作食品或飲料的著色劑。
已知某些種類(lèi)的蘑菇(Botanical Gazette，112，228-232，1950)、魚(yú)類(lèi)和甲殼綱動(dòng)物中含有角黃素。已知的產(chǎn)角黃素微生物的實(shí)例為那些屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物(Applied and EnvironmentalMicrobiology，55(10)，2505，1989)，屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物(日本專(zhuān)利(未審查的申請(qǐng))公告第2-138996號(hào))，屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物(日本專(zhuān)利(未審查的申請(qǐng))公告第6-343482號(hào))和屬于一新種屬的E-396菌株(日本專(zhuān)利(未審查的申請(qǐng))公告第2001-95500號(hào))。作為化學(xué)合成方法，已知的有β-胡蘿卜素的氧化(J.Amer.Chem.Soc.，78，1427，1956)和由3-氧代-C15鏻鹽合成(Pure Appl.Chem.，51，875，1979)。

發(fā)明內(nèi)容
然而，前面提及的化學(xué)合成角黃素的方法要使用有機(jī)溶劑。因此，這個(gè)方法在安全性及現(xiàn)在優(yōu)選天然產(chǎn)物的年代是有疑問(wèn)的。常規(guī)的微生物培養(yǎng)也存在產(chǎn)率低和從天然產(chǎn)物中提取成本較高的問(wèn)題。
關(guān)于E-396菌株，已知它是產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素化合物微生物，其安全性已經(jīng)確定，制備高濃度的含蝦青素的類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法已有報(bào)導(dǎo)。然而，角黃素占產(chǎn)生的總類(lèi)胡蘿卜素的比率較低。
作為角黃素的替代物，從紅辣椒植物中提取出的辣椒紅可用于改善雞蛋黃的色澤。由于辣椒紅對(duì)熱、光等條件非常不穩(wěn)定，以及紅辣椒的生長(zhǎng)明顯地受到天氣的影響，所以它很難提供穩(wěn)定工業(yè)水平的辣椒紅。
因此，需要十分安全并以低價(jià)格穩(wěn)定地提供角黃素的制備方法。
針對(duì)前述問(wèn)題的解決方案的廣泛而深入的研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)使產(chǎn)蝦青素微生物發(fā)生突變，可以容易地獲得其中角黃素比例相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量高的微生物，因而完成了本發(fā)明。
準(zhǔn)確地講，本發(fā)明提供了下列方法。
(1)制備角黃素的方法，所述方法包括下述步驟誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素微生物發(fā)生突變，其中對(duì)應(yīng)于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源；通過(guò)篩選角黃素的產(chǎn)率(質(zhì)量百分比)相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量比親本菌株高的突變株，獲得產(chǎn)角黃素的微生物；以及從產(chǎn)角黃素微生物的培養(yǎng)物中回收角黃素或含角黃素的類(lèi)胡蘿卜素化合物。
(2)依照上述(1)的方法，其中產(chǎn)角黃素微生物的角黃素產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的質(zhì)量百分比至少為40％。
(3)依照上述(1)的方法，其中產(chǎn)角黃素微生物所產(chǎn)生的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮(asteroidenone)、阿東玉紅(adonirubin)、阿東黃素(adonixanthin)和蝦青素等，每一種的產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的質(zhì)量百分比小于20％。
(4)依照上述(1)-(3)中任一項(xiàng)的方法，其中所述產(chǎn)蝦青素微生物選自E-396菌株(已于1993年4月27日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)稱(chēng)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心；日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)，(the National Institute of Bioscience and Human Technology(theInternational Patent Organism Depository of the National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology；AIST Tsukuba Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan，保藏號(hào)FERM BP-4283)及其突變株，以及A-581-1菌株(已于1994年5月20日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)稱(chēng)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心；日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)，保藏號(hào)FERM BP-4671)及其突變株。
本發(fā)明以下作更詳細(xì)地描述。
依照本發(fā)明的方法，產(chǎn)蝦青素微生物用作突變的親本菌株。此類(lèi)微生物的實(shí)例是產(chǎn)蝦青素微生物，其中對(duì)應(yīng)于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源。鑒于例如DNA核苷酸測(cè)序的錯(cuò)誤頻率，本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本同源的”代表98％或更高的同源性。
其序列與以上序列基本同源的產(chǎn)蝦青素微生物的具體實(shí)例包括E-396菌株(FERM BP-4283)、A-581-1菌株(FERM BP-4671)、通過(guò)突變或改進(jìn)E-396或A-581-1菌株獲得的多種突變株及其相關(guān)菌種。如SEQ ID NO1所示的DNA核苷酸序列對(duì)應(yīng)于E-396菌株的核糖體RNA，而如SEQ ID NO2所示的DNA核苷酸序列對(duì)應(yīng)于A(yíng)-581-1菌株的核糖體RNA。E-396菌株和A-581-1菌株間的16S核糖體RNA核苷酸序列的同源性為99.4％，這表明它們?yōu)榫o密相關(guān)的菌株。因此，這些菌株形成一組產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素細(xì)菌。依照本發(fā)明方法，用于突變的親本菌株定義為產(chǎn)蝦青素微生物，即E-396菌株、A-581-1菌株、E-396菌株或A-581-1菌株的突變株及其相關(guān)菌種，其中對(duì)應(yīng)于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的同源性為98％或更高。
本發(fā)明將E-396菌株作為產(chǎn)蝦青素微生物的范例進(jìn)行描述。該菌株為本發(fā)明人最新分離并已于1993年4月27日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)稱(chēng)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心)，保藏號(hào)FERM BP-4283。另一微生物的更具體的實(shí)例是A-581-1菌株。該菌株為本發(fā)明人最新分離并已于1994年5月20日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)稱(chēng)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心)，保藏號(hào)FERM BP-4671。
在本發(fā)明中，對(duì)使產(chǎn)蝦青素微生物發(fā)生突變的方法并無(wú)具體限制，只要所述方法可以誘導(dǎo)突變即可?？衫玫姆椒ǖ膶?shí)例包括利用突變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)的化學(xué)方法、利用如紫外照射或X-射線(xiàn)照射的物理方法和利用基因重組或轉(zhuǎn)座子的生物學(xué)方法。這種突變可以進(jìn)行一次?；蛘?，突變可進(jìn)行兩次或更多次，如通過(guò)該突變制備產(chǎn)蝦青素微生物的突變株，由該突變株進(jìn)一步突變，直至獲得最終突變株。
在本發(fā)明中，角黃素的產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量顯著高的突變株可通過(guò)使產(chǎn)蝦青素微生物發(fā)生突變，并分析突變株的培養(yǎng)液中的類(lèi)胡蘿卜素化合物，從突變株中篩選獲得。
例如，該培養(yǎng)方法按下列方式進(jìn)行。具體地講，培養(yǎng)在培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基含有產(chǎn)角黃素微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素化合物必需的組分。培養(yǎng)方法可以是用試管、燒瓶等進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或通過(guò)通氣攪拌培養(yǎng)。只要可分離并檢測(cè)出類(lèi)胡蘿卜素化合物，從而可用任何方法對(duì)類(lèi)胡蘿卜素化合物進(jìn)行分析。例如，可利用高效液相層析、薄層層析或紙層析。
在本發(fā)明中，可以篩選角黃素的比率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量高的突變株，獲得產(chǎn)角黃素微生物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)胡蘿卜素總量”代表類(lèi)胡蘿卜素化合物如蝦青素、角黃素、阿東黃素、β-胡蘿卜素、海膽酮、玉米黃素、β-隱黃素、3-羥基海膽酮、海星酮或阿東玉紅等的總量。
產(chǎn)蝦青素微生物如E-396菌株同時(shí)產(chǎn)生多種類(lèi)胡蘿卜素化合物如蝦青素、角黃素、阿東黃素、β-胡蘿卜素、海膽酮、玉米黃素、β-隱黃素、3-羥基海膽酮、海星酮或阿東玉紅等。因此，角黃素相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量的比率較低，它通常為2％到20％。
本發(fā)明中篩選到的突變株在產(chǎn)蝦青素微生物中誘導(dǎo)突變，且角黃素相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量的產(chǎn)率特別高。作為最低的角黃素比率的篩選標(biāo)準(zhǔn)條件是該比率比其親本菌株進(jìn)行產(chǎn)角黃素突變前的高?；陬?lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量，可以篩選產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素優(yōu)選含有至少40％(質(zhì)量)角黃素，更優(yōu)選含有至少60％(質(zhì)量)角黃素的突變株。
推斷蝦青素的生物合成如下。酮酶和羥化酶修飾β-胡蘿卜素兩端的6元環(huán)。如果該羥化酶完全缺失，則推斷僅可產(chǎn)生β-胡蘿卜素、海膽酮和角黃素，而β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等，因需要羥化酶，所以不會(huì)產(chǎn)生。如果該羥化酶缺失不完全，則推斷相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等的比率降低了。因此，作為另一種從突變株中篩選產(chǎn)角黃素微生物的有效方法，可基于相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等比率較低的現(xiàn)象進(jìn)行篩選?？苫诿恳换衔锵鄬?duì)于總類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量比率優(yōu)選低于20％，更優(yōu)選低于10％的現(xiàn)象進(jìn)行篩選。
在本發(fā)明中，只要產(chǎn)生角黃素，培養(yǎng)產(chǎn)角黃素微生物并回收角黃素或含角黃素的類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法可以是任何方法。可利用的方法的實(shí)例如下。具體地講，培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽且必要時(shí)含有產(chǎn)角黃素微生物生長(zhǎng)所需的特殊營(yíng)養(yǎng)需要(例如維生素、氨基酸或核酸)。碳源的實(shí)例包括糖類(lèi)如葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麥芽糖；有機(jī)酸如乙酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋(píng)果酸和丙二酸；和醇類(lèi)如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和異丁醇。加入碳源的量因種類(lèi)而變化，通常為每升培養(yǎng)基1-100克，優(yōu)選為2-50克。氮源的實(shí)例包括硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、氨水和尿素。這些可以單獨(dú)使用或聯(lián)合兩個(gè)或兩個(gè)以上使用。加入氮源的量因種類(lèi)而變化，通常為每升培養(yǎng)基0.1-20克，優(yōu)選為1-10克。無(wú)機(jī)鹽的實(shí)例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸錳、氯化錳、硫酸鋅、氯化鋅、硫酸銅、氯化鈣、碳酸鈣和碳酸鈉。這些可以單獨(dú)使用或聯(lián)合兩個(gè)或兩個(gè)以上使用。加入無(wú)機(jī)鹽的量因種類(lèi)而變化，通常為每升培養(yǎng)基0.1毫克到10克。特殊的營(yíng)養(yǎng)需要的實(shí)例包括維生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉膏、麥芽汁、玉米漿、干酵母、大豆餅、大豆油、橄欖油、玉米油和亞麻子油。這些可以單獨(dú)使用或聯(lián)合兩個(gè)或兩個(gè)以上使用。加入的特殊營(yíng)養(yǎng)需要的量因種類(lèi)而變化，通常為每升培養(yǎng)基0.01毫克到100克。培養(yǎng)基的pH調(diào)整到介于2和12之間，優(yōu)選介于6和9之間。振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)可在10℃到70℃，優(yōu)選在20℃到35℃間進(jìn)行，通常進(jìn)行1-20天，優(yōu)選為2-9天。
隨后，除去從如此獲得的培養(yǎng)液中的水分。為獲得含角黃素的物質(zhì)而應(yīng)除去培養(yǎng)液中水分的量根據(jù)條件如培養(yǎng)液中的色素成分而變化。通常，首先進(jìn)行過(guò)濾，如果應(yīng)進(jìn)一步除去水分，則使沉淀物脫水?？赏ㄟ^(guò)通常使用的方法如過(guò)濾或離心法進(jìn)行過(guò)濾。如果將沉淀進(jìn)行脫水除去水分，則沉淀中的類(lèi)胡蘿卜素化合物應(yīng)該增加。脫水方法的實(shí)例包括通常的噴霧干燥、滾筒干燥和冷凍干燥。
如此獲得的含角黃素的微生物的培養(yǎng)物沉淀可用作所述的含色素的飼料添加劑。如果通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的角黃素和類(lèi)胡蘿卜素化合物用作飼料等的著色劑，可以添加抗氧化劑如丁基羥基甲苯、乙氧基喹或維生素E等保護(hù)角黃素和類(lèi)胡蘿卜素化合物免于降解。此外，其表面可用明膠等包衣。
本說(shuō)明書(shū)包括公開(kāi)于日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2002-112240號(hào)說(shuō)明書(shū)中的部分或全部?jī)?nèi)容，這是本發(fā)明優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)。
實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式在下文參考實(shí)施例，更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但并不限于此。
讓E-396菌株(FERM BP-4283，角黃素的質(zhì)量百分比產(chǎn)率7.4％)在28℃靜置30分鐘并用150mg/L的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)進(jìn)行突變。將具有如表1所示成份的培養(yǎng)基(6ml)置入試管(內(nèi)徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養(yǎng)基。將經(jīng)過(guò)菌落分離的400個(gè)突變株中的每一個(gè)用接種環(huán)接種至試管培養(yǎng)基上，并且在28℃進(jìn)行往復(fù)式振蕩培養(yǎng)(300轉(zhuǎn)/分鐘)達(dá)4天。隨后，將該培養(yǎng)物離心，并且用高效液相層析分析所得細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素化合物。結(jié)果，獲得一株其角黃素的產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的質(zhì)量百分比為60％或更高的菌株，該菌株中類(lèi)胡蘿卜素化合物的分析結(jié)果示于表2中。
表1

表2
用NTG突變E-396菌株(FERM BP-4283)，篩選深紅色菌落，獲得增強(qiáng)的蝦青素生產(chǎn)力變異株Y-1071(角黃素的質(zhì)量百分比產(chǎn)率6.5％)。該Y-1071進(jìn)一步用NTG突變。將具有如表1所示成份的培養(yǎng)基(6ml)置入試管(內(nèi)徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養(yǎng)基。將經(jīng)過(guò)菌落分離的1000個(gè)突變株中的每一個(gè)用接種環(huán)接種至試管培養(yǎng)基上，并且在28℃進(jìn)行往復(fù)式振蕩培養(yǎng)(300轉(zhuǎn)/分鐘)達(dá)4天。隨后，將該培養(yǎng)物離心，并且用高效液相層析分析所得細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素化合物。結(jié)果，獲得兩株其中每一株的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素的產(chǎn)率相對(duì)于其產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素總量的質(zhì)量百分比小于10％的菌株，這兩個(gè)菌株中類(lèi)胡蘿卜素化合物的分析結(jié)果示于表3和表4中。
表3

表4
通過(guò)利用紫外燈的紫外光照射，可突變A-581-1菌株(FERM BP-4671，角黃素的質(zhì)量百分比產(chǎn)率5.3％)。將具有如表1所示成份的培養(yǎng)基(6ml)置入試管(內(nèi)徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養(yǎng)基。將經(jīng)過(guò)菌落分離的300個(gè)突變株中的每一個(gè)用接種環(huán)接種至試管培養(yǎng)基上，并且在28℃進(jìn)行往復(fù)式振蕩培養(yǎng)(300轉(zhuǎn)/分鐘)達(dá)4天。隨后，將該培養(yǎng)物離心，并且用高效液相層析分析所得細(xì)胞的類(lèi)胡蘿卜素化合物。結(jié)果，獲得一株其中角黃素的產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總量的質(zhì)量百分比為60％或更高的菌株，該菌株中類(lèi)胡蘿卜素化合物的分析結(jié)果示于表5中。
表5

本文引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了一種制備角黃素的方法，該方法廉價(jià)、可穩(wěn)定供給并十分安全。
序列表<110>新日本石油株式會(huì)社(Nippon Oil Corporation)<120>角黃素的制備方法<130>PH-1759<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1452<212>DNA<213>未知<220>
<223>未知生物體的描述E-396<400>1agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440
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<223>未知生物體的描述A-581-1<400>2tagagtttga tcctggctca gaacgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60cgagaccttc gggtctagcg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgtg cccttctcta 120cggaatagcc ccgggaaact gggagtaata ccgtatacgc cctttggggg aaagatttat 180cggagaagga tcggcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaacggct caccaagccg 240acgatccata gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg atctagccat 360gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac 420ggtaccagca gaagaagccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg 480gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggactgg aaagtcagag 540gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg cctttgaaac tatcagtctg gagttcgaga 600gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt 660ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagacgt cggcaagcat 780gcttgtcggt gtcacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catggcagga ccgctggaga gattcagctt 960tctcgtaaga gacctgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020ttcggttaag tccggcaacg agcgcaaccc acgtccctag ttgccagcat tcagttgggc 1080actctatgga aactgccggt gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg ttaatcccca 1200aaagccatct cagttcggat tgtcctctgc aactcgaggg catgaagttg gaatcgctag 1260taatcgcgga acagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320acaccatggg agttggttct acccgacgac gctgcgctaa cccttcgggg aggcaggcgg 1380ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagcca142權(quán)利要求
1.一種制備角黃素的方法，所述方法包括下述步驟誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素微生物發(fā)生突變，其中對(duì)應(yīng)于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源；通過(guò)篩選角黃素的質(zhì)量百分比產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量比親本菌株高的突變株，獲得產(chǎn)角黃素的微生物；以及從產(chǎn)角黃素微生物的培養(yǎng)物中回收角黃素或含角黃素的類(lèi)胡蘿卜素混合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)角黃素微生物的角黃素產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的質(zhì)量百分比至少為40％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)角黃素微生物所產(chǎn)生的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等，每一種的產(chǎn)率相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的質(zhì)量百分比小于20％。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述產(chǎn)蝦青素微生物選自E-396菌株(FERM BP-4283)及其突變株和A-581-1菌株(FERM BP-4671)及其突變株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備角黃素的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素微生物對(duì)應(yīng)于16S核糖體RNA的DNA堿基序列發(fā)生突變，所述DNA堿基序列與SEQ ID NO1所示的堿基序列基本同源；篩選如此產(chǎn)生的角黃素相對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的比率(質(zhì)量百分比)比親本菌株高的突變株；培養(yǎng)所獲得的產(chǎn)角黃素菌株；以及從如此獲得的培養(yǎng)基中回收角黃素或含角黃素的類(lèi)胡蘿卜素混合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1659279SQ0381346
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日
發(fā)明者平澤和明, 坪倉(cāng)章, 水田美能 申請(qǐng)人:新日本石油株式會(huì)社