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      水解氮源的制作方法

      文檔序號:549644閱讀:902來源:國知局
      專利名稱:水解氮源的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      此項(xiàng)發(fā)明是通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一種或幾種部分預(yù)水解復(fù)合氮源的方法,以更經(jīng)濟(jì)的方式發(fā)酵生產(chǎn)所需酶。
      背景技術(shù)
      用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)有用化合物的培養(yǎng)基,其中通常含有如大豆、玉米漿、酵母提取物等傳統(tǒng)氮源。但使用這些傳統(tǒng)氮源有許多缺點(diǎn),如在加熱滅菌時(shí)粘度高、原材料改變、酶難于復(fù)性回收、產(chǎn)生有色副產(chǎn)物等。而且這些傳統(tǒng)氮源的成本昂貴,或消耗得過快。
      可以最低培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)氮源,例如WO 98/37179中所述方法就是一例,但這一方法的缺點(diǎn)是菌體生長緩慢且酶產(chǎn)量低。
      而在WO 01/05997中描述了用含有水解大豆蛋白的培養(yǎng)基生產(chǎn)破傷風(fēng)毒素,發(fā)明者在67頁中所述,將葡萄糖與剩余的培養(yǎng)基一起高壓滅菌將有利于菌體的生長和毒素的產(chǎn)生。
      發(fā)明概要發(fā)明者發(fā)現(xiàn),為了確保氨基酸/肽利于微生物菌株的快速生長和/或保證所需產(chǎn)物的高產(chǎn)量,就需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入部分預(yù)水解的復(fù)合氮源,所以我們希望保護(hù)一種工業(yè)化生產(chǎn)酶的方法,包括a)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)相關(guān)酶時(shí),發(fā)酵培養(yǎng)基中含有一種或幾種預(yù)水解的復(fù)合氮源,其中這些部分預(yù)水解的氮源應(yīng)該與任何其它碳水化合物源分開滅菌,復(fù)合氮源的預(yù)水解可通過向其加入酸和/或水解酶的方式來達(dá)到。以及
      b)從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收所需酶。
      發(fā)明詳述微生物菌種此發(fā)明中所用的微生物菌種可以是任何種屬的微生物。
      優(yōu)選可以用細(xì)菌或真菌來生產(chǎn)相關(guān)酶。
      例如,可以用某些革蘭氏陽性菌,如芽孢桿菌,如嗜堿芽胞桿菌、如解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌、緩慢芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌;或鏈霉菌屬,如淺青紫鏈霉菌、鼠灰鏈霉菌等;此外也可利用諸如大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。
      同樣也可以通過真菌獲得相關(guān)酶,如假絲酵母屬、卡氏酵母(Kluyveromyces)屬、畢赤酵母屬、糖酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia屬,例如卡爾酵母、啤酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維氏酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis等利用一些絲狀真菌也可以產(chǎn)生所需要的酶。這些絲狀真菌包括頂孢霉屬(Acremonium),曲霉菌屬,桃木屬(Aureobasidium),隱球菌屬,鐮刀菌屬,腐質(zhì)霉屬,Magnaporthe,毛霉菌屬,毀絲霉屬,Neocallimastix,脈孢菌屬,擬青霉菌屬,青霉菌屬,瘤胃真菌屬(Piromyces),裂褶菌屬,Talaromyce嗜熱子囊菌屬,梭孢殼屬,Tolypocladium屬,木霉屬等,具體地,酶可得自棘孢曲霉,泡盛曲霉,臭曲霉,日本曲霉,構(gòu)巢曲霉,黑曲霉,米曲霉,黍鐮刀菌,黃色鐮刀菌,禾谷鐮刀菌,穗枯鐮刀菌,尖孢鐮刀菌,粉紅鐮刀菌,接骨木鐮刀菌,硫色鐮刀菌,香蕉鐮刀菌,鐮孢菌,脈孢菌,米赫根毛霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉菌,木素木霉菌,康寧木霉菌,長枝木霉菌,里氏木霉菌,綠色木霉菌等。
      以上所涉及的所有菌種都可以在公共的微生物收集中心獲得,例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國微生物和細(xì)胞培植中心(DSM)、荷蘭真菌酵母收集中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)培育和收集中心,美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北部地區(qū)研究服務(wù)中心(NRRL)。
      總之,為了應(yīng)用此發(fā)明生產(chǎn)所需的酶,在這里所用的術(shù)語“從……獲取”是與所給源相關(guān)聯(lián)的,這就表示相關(guān)酶是插入了源的基因的細(xì)胞所產(chǎn)生的。
      相關(guān)酶相關(guān)的酶可能是某個(gè)肽段或某種酶。
      對本文來說首選含有5到100個(gè)氨基酸的肽段(peptide);含有10到80個(gè)氨基酸、15到60個(gè)氨基酸、15到40個(gè)氨基酸的肽段則依次更佳。
      具體來說,這種方法需要應(yīng)用到酶,特別是水解酶(酶命名法即EC3類;根據(jù)國際生物化學(xué)聯(lián)盟命名委員會推薦)。
      更為具體的說推薦以下水解酶蛋白酶適合的蛋白酶來源于包括動(dòng)物、植物或者微生物。微生物來源的蛋白酶更佳,包括經(jīng)化學(xué)修飾過或經(jīng)蛋白工程突變的蛋白酶。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或金屬酶,最好是微生物來源的堿性蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶(類胰蛋白酶trypsin-like protease)。
      蛋白酶和肽酶分別根據(jù)在細(xì)胞中的酶活性>=或<10%被定義為自我破壞性和非破壞性,細(xì)胞培養(yǎng)在無細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中,培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí),發(fā)酵過程中無細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物酸堿度和溫度值的選擇按照一定數(shù)值,這些值是發(fā)酵過程中從收獲前24小時(shí)到收獲時(shí)有代表性的酸堿度和溫度范圍。
      無細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物由肉湯經(jīng)過過濾、離心或類似程序分離而由肉湯溶液中的非溶質(zhì)(包括細(xì)胞)得到。
      堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶,特別是那些起源于芽孢桿狀菌的酶,例如枯草桿菌蛋白酶Novo,枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,枯草桿菌蛋白酶309,枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(在WO 89/06279中述及)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如豬或牛起源的)和鐮刀霉蛋白酶,在WO 89/06270和WO 94/25583中述及。
      可用的蛋白酶的例子是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中述及的變體,尤其是替換了以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
      可用的較好的商品蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(諾維信A/S),MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECTOXPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor國際公司)。
      肽酶適合的肽酶例如FLAVOURZYMETM(諾維信A/S)。
      脂肪酶脂肪酶包括來源于細(xì)菌或真菌,亦包括來源于經(jīng)化學(xué)修飾的突變體及經(jīng)蛋白質(zhì)工程改造的突變體。脂肪酶可產(chǎn)自腐質(zhì)菌屬(又名嗜熱真菌屬)如棉狀嗜熱絲孢菌或腐質(zhì)霉(EP 258 068 and EP 305 216);假單孢菌屬如產(chǎn)堿假單孢菌(WO 96/13580);類產(chǎn)堿假單孢菌如洋蔥假單孢菌(EP331 376)、斯氏假單孢菌(GB 1,372,034)、熒光假單孢菌、假單孢菌屬(WO95/06720和WO 96/27002)以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌(Dartois et al.(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)等。
      其它例子是脂肪酶變異物,例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的。
      可用的較好的商品脂肪酶有LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(諾維信A/S)。
      淀粉酶適合的淀粉酶(α和/或β)包括來源于細(xì)菌或真菌的。亦包括經(jīng)化學(xué)修飾過或經(jīng)蛋白工程突變的。例如淀粉酶有從芽孢桿菌中取得的α-淀粉酶,還有一種特殊種類的地衣芽孢桿菌,詳見GB 1,296,839。
      可用的淀粉酶的例子見于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424所描述的變體,尤其是那些替換了以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
      可用的商品淀粉酶包括DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYLLCTM、TERMAMYLSCTM、LIQUIZYME-XTM、BANTM(產(chǎn)自諾維信A/S公司),RAPIDASETM和PURASTARTM(產(chǎn)自Genencor國際有限公司)。
      纖維素酶適用于該用途的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源,包括野生型的和經(jīng)化學(xué)誘變或蛋白質(zhì)工程突體,如細(xì)菌、假單胞菌、腐質(zhì)霉(Humicola)、鐮刀菌、梭孢菌(Thielavia)、直枝頂孢霉菌等。例如US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259的Humicola insolens、Myceliophthora thermophila、Fusarium oxysporum制備的纖維素酶。
      尤為適用的纖維素酶是那些顯色優(yōu)勢的堿性或中性纖維素酶,包括專利號為EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO98/08940的纖維素酶。其它包括WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299等纖維素酶變體也很適用。
      可用的商品纖維素酶包括了諾維信A/S公司的CELLUZYMETM和CAREZYMETM,Genencor國際有限公司的CLAZINASETM和PURADAXHATM以及Kao公司的KAC-500(B)TM等產(chǎn)品。
      氧化還原酶本發(fā)明可用的氧化還原酶包括過氧化物酶,氧化酶,如漆酶、過氧化氫酶。
      其它優(yōu)選的水解酶是碳水化合物水解酶,包括諾維信A/S公司的MANNAWAYTM和果膠酸裂解酶(例如BIOPREPARATION 3000TM)。此外首選的酶類還有轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶。
      復(fù)合氮源按照本發(fā)明要求,合適的復(fù)合氮源是動(dòng)植物來源的蛋白質(zhì),尤其是那些碳水化合物含量在10%以內(nèi)的蛋白質(zhì),如果碳水化合物含量在5%甚至是3%以內(nèi)將更好。
      碳水化合物含量低的好處就在于可以避免梅拉德氏反應(yīng)(Maillardreactions)。通常在對含有伯胺基化合物和還原性碳水化合物的培養(yǎng)基經(jīng)行加熱滅菌時(shí),顏色的形成(梅拉德氏反應(yīng))極度不利于回收和/或可能抑制生長。因此在加熱滅菌時(shí)將梅拉德氏反應(yīng)“參與物”分開控制在一定的范圍內(nèi)將顯得十分重要。這就是說將諸如葡萄糖、蔗糖等簡單的碳水化合物與復(fù)合氮源分開滅菌是很有必要的,而且復(fù)合氮源最好是那些碳水化合物含量較低的蛋白質(zhì),如馬鈴薯蛋白質(zhì)、豆角蛋白質(zhì)、血液蛋白質(zhì)、魚類蛋白質(zhì)和其它動(dòng)物蛋白質(zhì)。
      然而,精通此領(lǐng)域的人必然知道在復(fù)合氮源滅菌時(shí),少量碳水化合物對酶類的回收和生長沒有大的影響。因此,在將碳水化合物和復(fù)合氮源分開滅菌時(shí),在復(fù)合氮源中可以加入少于10%的碳水化合物。
      熟悉此領(lǐng)域的人們知道加熱滅菌對有可能發(fā)生梅拉德氏反應(yīng)的培養(yǎng)基中的還原性碳水化合物數(shù)量的影響隨規(guī)模而不同。所以,是否選擇了合適的復(fù)合氮源以及合適的氮源預(yù)水解條件應(yīng)當(dāng)按照生產(chǎn)規(guī)模進(jìn)行評價(jià)。
      通常加入發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)水解的復(fù)合氮源至少應(yīng)該是凱氏定氮法(N-Kjeldahl)氮量的5%(質(zhì)量比),具體應(yīng)該是10-75%(質(zhì)量比)。
      預(yù)水解復(fù)合氮源的酶預(yù)水解是首選的技術(shù),但是這項(xiàng)發(fā)明也可以用酸水解這樣的技術(shù)來完成。
      舉例說明預(yù)水解過程的最優(yōu)方案的表現(xiàn)。
      預(yù)水解的需要程度能夠盡可能地通過正確地調(diào)整水解作用溫度,加入的蛋白酶和/或者肽酶的數(shù)量,考慮預(yù)水解發(fā)生的時(shí)間,在預(yù)水解過程中水解酶的選擇以及預(yù)水解發(fā)生時(shí)在選擇了水解酶的前提下選擇適當(dāng)pH值間隔來實(shí)現(xiàn)。
      需要的預(yù)水解程度將取決于幾個(gè)因素根據(jù)從得到高濃度和高體積產(chǎn)品生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)來看,高度濃縮的進(jìn)料培養(yǎng)基有著潛在的優(yōu)勢。因此,為了刺激生物量的形成和/或者產(chǎn)品的形成,如果有足夠數(shù)量的易利用的復(fù)合氮源——逐漸在整個(gè)發(fā)酵期間——可由接種前存在于發(fā)酵罐中的現(xiàn)成培養(yǎng)基中的不易于獲得的復(fù)合N-源制備得到,要避免加入經(jīng)過分別消毒的復(fù)合氮源到這種進(jìn)料培養(yǎng)基中。達(dá)到易利用復(fù)合氮源的持續(xù)可獲得性是進(jìn)行預(yù)水解的目標(biāo),它能根據(jù)達(dá)到的水解程度和在培養(yǎng)過程中菌株所產(chǎn)生蛋白酶和/或者肽酶數(shù)量來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
      根據(jù)取得高特定產(chǎn)品的生產(chǎn)能力——即,單個(gè)的活細(xì)胞的高產(chǎn)品生產(chǎn)速度也能應(yīng)用類似的討論。
      從取得高效產(chǎn)品的生產(chǎn)能力來看,當(dāng)產(chǎn)品是一種在單分子或者雙分子反應(yīng)中使自己失活的酶,添加培養(yǎng)基成分以免使產(chǎn)品自身失活是非常有利的。當(dāng)加入這樣的培養(yǎng)基成分到發(fā)酵肉湯中時(shí)復(fù)合氮源可以是這樣的培養(yǎng)基成分。因此,可以發(fā)現(xiàn),添加這樣的培養(yǎng)基成分到培養(yǎng)基中是非常有利的——尤其是當(dāng)該培養(yǎng)基成分水解到一定程度,可以用大型泵抽送,同時(shí)仍然保持高度的保護(hù)作用時(shí)。
      術(shù)語“可以用泵抽送的”是用來描述某種固體顆粒的懸浮態(tài)。這些固體顆粒在泵、閥門和管道系統(tǒng)中卻很少成塊狀——團(tuán)塊的存在能改變供料速度超過5%。
      如果相關(guān)的酶是一種淀粉酶,一種纖維素酶,脂肪酶,一種氧化還原酶,一種碳水解酶或者是一種無破壞性的蛋白酶或肽酶,預(yù)水解優(yōu)選引起肽鍵10-70%的破壞,更優(yōu)選的來說是在肽鍵的15-40%之間。
      如果相關(guān)的酶是一種具有自我破壞能力的蛋白酶或者肽酶,預(yù)水解優(yōu)選破壞肽鍵含量的1-20%,更易破壞的是肽鍵的2-10%。
      如果相關(guān)的酶是一種具有自我破壞能力的蛋白酶或者肽酶,作為一種復(fù)合氮源,它在利用高度水解蛋白和僅僅輕微水解蛋白的混合物時(shí)具有特殊優(yōu)勢。預(yù)水解的程度對產(chǎn)生相關(guān)的酶,加入復(fù)合氮源的數(shù)量在以上都得以表述,可以按照下列式子進(jìn)行計(jì)算[DPH(高度水解)×W(高度水解)+DPH(輕微水解)×W(輕微水解)]/[W(高度水解)+W(輕微水解)];其中DPH(高度水解)是指高度水解蛋白的預(yù)水解的程度DPH(輕微水解)是指輕微水解蛋白的預(yù)水解程度W(輕微水解)是指在介質(zhì)中輕微水解蛋白的重量W(高度水解)是指在介質(zhì)中高度水解蛋白的重量發(fā)酵此項(xiàng)發(fā)明可以用于任何符合工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵過程。例如可以滿足發(fā)酵培養(yǎng)基體積至少是50升、100升、500升、1000升甚至是5000升的不同要求。
      這些微生物菌種都可以按照現(xiàn)有的任何方法來發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基可以是由復(fù)合氮源和復(fù)合碳源混合而成的培養(yǎng)基。發(fā)酵過程可以是分批式發(fā)酵、重復(fù)分批式發(fā)酵、流加分批式發(fā)酵、重復(fù)流加式發(fā)酵或者是連續(xù)式發(fā)酵過程。
      在流加分批式發(fā)酵過程中,發(fā)酵前通常不向培養(yǎng)基中加入或只部分加入那些包含結(jié)構(gòu)和/或催化元件。在發(fā)酵反應(yīng)的過程中才加入全部或其他的包含結(jié)構(gòu)和/或催化元件。選擇進(jìn)料的化合物可以一起或分開加入。
      在重復(fù)流加分批式發(fā)酵或連續(xù)式發(fā)酵過程中,在發(fā)酵過程中另外加入全部的起始培養(yǎng)基成分。起始培養(yǎng)基可以與結(jié)構(gòu)單元進(jìn)料一起或分開加入。不同的是,在重復(fù)流加分批式發(fā)酵過程中,每隔一段時(shí)間,定期地去除含有生物量的培養(yǎng)物。而在連續(xù)式發(fā)酵過程中,以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基的同時(shí),含有生物量的培養(yǎng)物也以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出。這兩種方式都是通過在加入一定量新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)從中取出同等量的培養(yǎng)物,來保持培養(yǎng)體積的恒定。
      在此項(xiàng)發(fā)明中,可以采用流加分批式發(fā)酵、重復(fù)流加分批式發(fā)酵或連續(xù)式發(fā)酵三種方式是優(yōu)選的。
      有用化合物的回收該發(fā)明進(jìn)一步涉及到發(fā)酵肉湯的處理。發(fā)酵反應(yīng)結(jié)束后,相關(guān)酶應(yīng)當(dāng)根據(jù)各自不同的特點(diǎn)采用不同的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從發(fā)酵肉湯中回收。
      以下是幾個(gè)產(chǎn)物回收的例子,但該發(fā)明并不僅僅局限于下面所舉例子。
      例一馬鈴薯蛋白的水解OPA=51%向3.2千克馬鈴薯中加自來水至12.5升,攪拌使馬鈴薯蛋白充分懸浮。
      在混勻的同時(shí)對其加熱,溫度設(shè)定在54攝氏度。
      當(dāng)溫度達(dá)到45攝氏度時(shí),用4N的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至6.0。
      當(dāng)溫度到達(dá)50攝氏度時(shí),向其中加入80毫升的ALCALASETM2.4L FG(購自諾維信A/S公司),但在此之前一定要確保用4N的NaOH將pH值維持在6.0。
      大約5分種后,溫度升至54攝氏度。
      在加入ALCALASETM大約10分種后設(shè)定pH值由6.0至8.0。在ALCALASETM加入又26分種后,停止滴加4N的氫氧化鈉溶液,向其加入1.6千克的馬鈴薯蛋白。
      充分混勻,將馬鈴薯蛋白充分懸浮3分種,加入150毫升FLAVOURZYMETM(購自諾維信A/S公司)。
      在加入ALCALASE 20小時(shí)后,加水至總體積為16升,將這16升含有預(yù)水解蛋白的懸浮液分裝為份,每份4升,立即放置于-18攝氏度保存,此時(shí)蛋白預(yù)水解過程已停止。
      怎樣定義蛋白預(yù)水解程度(OPA)將在例四中解釋。該例假設(shè)馬鈴薯蛋白質(zhì)中干物質(zhì)含量為93%,其中蛋白質(zhì)的%含量為干物質(zhì)的80%。
      例二馬鈴薯蛋白質(zhì)的水解(OPA=2.9%)稱取2.09千克馬鈴薯蛋白加自來水至10.5升,將其攪拌使馬鈴薯蛋白能夠充分懸浮。
      混勻的同時(shí)對其加熱(溫度設(shè)定在55攝氏度)。
      當(dāng)溫度到達(dá)30攝氏度時(shí),向其加入4N的氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)到6.2。
      在溫度達(dá)到55攝氏度時(shí),向其加入58.5毫升ALCALASETM2.4LFG,并通過加入4N的氫氧化鈉溶液保持pH值在6.2不變。
      從加入ALCALASE時(shí)起,5分種后其pH設(shè)定值由6.2變?yōu)?.0。
      再經(jīng)過30分種后加入15%的磷酸溶液(H3PO4)在5分種內(nèi)將pH值由8.0降低到5.6,在加入1.575千克的馬鈴薯蛋白。
      然后立即加自來水至15升,將這些含有水解蛋白的懸浮液按每份2升分裝,儲存于-18攝氏度保存待用,此時(shí)水解過程已停止。
      蛋白預(yù)水解程度(OPA)將在例四中解釋。假設(shè)馬鈴薯蛋白質(zhì)中干物質(zhì)含量為93%,其中蛋白質(zhì)的%含量為干物質(zhì)的80%。
      例三馬鈴薯蛋白質(zhì)的水解(OPA=19.5%)稱取1.2千克馬鈴著蛋白加自來水至13升,將其混勻使馬鈴薯蛋白能夠充分懸浮。
      混勻的同時(shí)對其加熱(設(shè)定55攝氏度)。
      當(dāng)溫度到達(dá)55攝氏度時(shí),通過向其加入4N的氫氧化鈉溶液使其pH值調(diào)至7.0,加入116.6克ALCALASETM2.4L FG并不斷的向其滴加4N的氫氧化鈉溶液保持pH值在7.0不變。
      從加入ALCALASE時(shí)算起,4小時(shí)后加自來水至16升,將這些含有與水解蛋白的懸浮液按每份4升分裝,儲存于-18攝氏度保存待用,此時(shí)水解過程已停止。
      蛋白水解的程度(OPA)是怎樣定義的將在例四中解釋。假設(shè)馬鈴薯蛋白質(zhì)中干物質(zhì)含量為93%,其中蛋白質(zhì)的%含量為干物質(zhì)的80%。
      例四OPA的解析,蛋白水解程度將大約1克樣品(樣品重量W1)與4毫升0.1N的氫氧化鈉溶液混合。
      離心混合物至上清液澄清,用適當(dāng)量的去離子水稀釋上清液至V1毫升。
      時(shí)間起點(diǎn)加入3毫升OPA反應(yīng)試劑(見下),劇烈混勻。兩分鐘后(這一時(shí)間要相當(dāng)精確),測340納米下的吸光值(1cm cuvette)。
      將每個(gè)樣品都按同樣的方式平行處理兩次。
      平均吸光值應(yīng)該在對照吸光值和標(biāo)準(zhǔn)吸光值之間,否則就要根據(jù)結(jié)果重新將樣品稀釋。
      對照吸光值(blind)去離子水的吸光值標(biāo)準(zhǔn)吸光值向50毫克L-亮氨酸加入500毫升去離子水后的吸光值OPA反應(yīng)試劑稱取7.62克四硼酸二鈉,200毫克十二烷基磺酸鈉加入去離子水大約至175毫升。向4毫升96%乙醇中加入160毫克OPA,并使OPA充分溶解。然后將上述兩種溶液混合,再加入176毫克的二硫蘇糖醇(99%)并加水將最終體積調(diào)至200毫升。放置4小時(shí)后將OPA反應(yīng)試劑棄去。
      OPA(蛋白水解程度)由下面的公式計(jì)算得來((A×(ODav.,樣品-ODav.,對照)/(ODav.,標(biāo)準(zhǔn)-ODav.,對照)×(V1(ml)×100)/(W1(mg)×P))-B)×100%/(C×D)A=0.9516=亮氨酸濃度ODav.,樣品,在340納米下樣品吸光值的平均值。
      ODav.,標(biāo)準(zhǔn),亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)在340納米下吸光值的平均值ODav.,對照,去離子水在340納米下吸光值的平均值。
      V1(ml)=稀釋體積,單位為毫升W1(mg)=樣品重量,單位為毫克P=水解樣品中馬鈴薯蛋白質(zhì)含量百分?jǐn)?shù)B=0.4,對于馬鈴薯蛋白質(zhì),此數(shù)值不變C=1.0,對于馬鈴薯蛋白質(zhì),此數(shù)值不變D=9.1對于馬鈴薯蛋白質(zhì),此數(shù)值不變B、C、D對應(yīng)于不同蛋白質(zhì)的不同數(shù)值

      因此,OPA值可以很好的反應(yīng)被分析樣品中已水解肽鍵的百分含量。
      例五微生物菌種在例六、例七和例八中被用來制造蛋白酶的Af50-34是從NCIB 10309分離得到,并按照EP 0 506 780 B1中所述方法進(jìn)行遺傳學(xué)改造后的菌種。而在例六、例九和例十中被用來制造α淀粉酶的SJ5262則是來源于SJ4671,得自US 6,100,063。首先,挑選抗利福平的自發(fā)突變菌種,其中RpoB蛋白的第478的氨基酸由纈氨酸取代了原來的丙氨酸,這一菌種即SJ4671rif10,且在丹麥申請了專利,PA 2001 01972。然后,通過WO 02/00907中所述的雙同源重組的方法,將編碼一個(gè)細(xì)胞外蛋白酶的基因(其蛋白質(zhì)序列和基因序列在GeneSeqP的編號為AAE00011;WO 01/16285;EP482 879)缺失。
      例六增殖程序Af50-34菌株B3-瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨6克胃蛋白酶 4克酵母提取物3克肉類提取物1.5克一水合葡萄糖 1克瓊脂 20克加去離子水至一升,然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調(diào)至7.35,121攝氏度高溫滅菌40分鐘待用。
      等滅菌完畢,溫度降至40-50攝氏度,加入經(jīng)過濾滅菌的1摩爾每升碳酸氫鈉溶液(pH值為9,體積比為10%)和經(jīng)過121攝氏度40分鐘高溫滅菌的由去離子水配置的脫脂奶粉(質(zhì)量體積比為10%)。
      M9-緩沖溶液二水合磷酸氫二鈉8.8克磷酸二氫鉀3克氯化納4克七水合硫酸鎂0.2克加入去離子水至1升121攝氏度高溫滅菌20分鐘種子搖瓶培養(yǎng)基PRK-1大豆50克二水合磷酸氫二鈉20克加去離子水至1升,然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調(diào)至9.0,將其按每份100毫升分裝到具有兩個(gè)擋板的500毫升錐形瓶中。
      121攝氏度高溫滅菌20分鐘待用。
      將Af50-34菌種在B3瓊脂培養(yǎng)基上37攝氏度培養(yǎng)24小時(shí)后。
      用M9緩沖液充分懸浮菌體并用吸光光度計(jì)測量650納米下吸光值,取y毫升(y值由OD(650nm)×y=0.1計(jì)算得出)細(xì)胞懸浮液接種到PRK-1搖瓶中,將培養(yǎng)基放置于HT Infors Unitson旋轉(zhuǎn)式搖床以37攝氏度300轉(zhuǎn)每分鐘的速度培養(yǎng)22小時(shí)待用。
      向每個(gè)發(fā)酵罐中接種80毫升搖瓶培養(yǎng)液即可進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)。
      SJ 5262菌種LB瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨(來自酪蛋白)10克酵母提取物5克氯化鈉10克瓊脂12克添加去離子水到1升,并用氫氧化鈉或鹽酸溶液將pH值調(diào)至7(+/-0.2)。
      121攝氏度高溫滅菌20分鐘M9-緩沖溶液二水合磷酸氫二鈉8.8克磷酸二氫鉀3克氯化納4克七水合硫酸鎂0.2克加入去離子水至1升121攝氏度高溫滅菌20分鐘種子搖瓶培養(yǎng)基PRK-50大豆片(soy flakes)44克二水合磷酸氫二鈉2克加1升自來水,然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調(diào)至8.0,將其按每份100毫升分裝到具有兩個(gè)擋板的500毫升錐形瓶中。
      121攝氏度高溫滅菌60分鐘待用。
      將SJ 5262菌種在LB瓊脂斜面上37攝氏度培養(yǎng)24小時(shí)后。
      用M9緩沖液懸浮所得菌體并用吸光光度計(jì)測量650納米下吸光值,取y毫升(y值由OD(650nm)×y=0.1計(jì)算得出)細(xì)胞懸浮液接種到PRK-50培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基放置于HT Infors Unitson旋轉(zhuǎn)式搖床以37攝氏度300轉(zhuǎn)每分鐘的速度培養(yǎng)20小時(shí)待用。
      向每個(gè)發(fā)酵罐中接種80毫升,剛剛培養(yǎng)好的菌體即可進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)。
      例七用Af50-34菌種和OPA=2.9%的馬鈴薯蛋白在培養(yǎng)基中的發(fā)酵反應(yīng)發(fā)酵反應(yīng)在有4個(gè)擋板容量為2升的發(fā)酵罐中進(jìn)行,必須保證足夠的通風(fēng)率使得整個(gè)發(fā)酵罐中溶解氧的濃度保持在大約20%以上,但通風(fēng)率也不能超過2l/l/min。
      溫度控制在37攝氏度,為了防止泡沫的產(chǎn)生,一開始就要在培養(yǎng)基中加入足夠量的防沫油。通過不斷的添加15%的磷酸溶液或10%的氨水保持反應(yīng)物的pH值在8.0和7.7之間。
      生長培養(yǎng)基在接種后0.1小時(shí)即被添加,并保持下面的速度。
      距進(jìn)料開始的時(shí)間(小時(shí)) 0 10 200培養(yǎng)基添加速率(克每分鐘) 0 0.2 0.2組成(make-up)培養(yǎng)基水解的馬鈴薯蛋白(OPA=2.9%)100克磷酸二氫鉀5克二水合磷酸氫二鈉5克七水合硫酸鎂2.5克一水合硫酸錳0.02克七水合硫酸亞鐵0.08克五水合硫酸銅0.008克氯化鋅0.008克檸檬酸0.39克氯化硫銨0.05克核黃素0.004克煙酸0.03克泛酸酯鈣0.04克鹽酸吡哆醛0.008克生物素0.0015克葉酸0.004克用磷酸溶液或氨水調(diào)節(jié)pH值到8.0后,加自來水至1升向每個(gè)發(fā)酵罐中添加720毫升,121攝氏度高溫滅菌1小時(shí)。
      進(jìn)料培養(yǎng)基水解的馬鈴薯蛋白(OPA=2.9%)135克蔗糖300克加自來水至1升121攝氏度高溫滅菌1小時(shí)分別在接種后49小時(shí)、71小時(shí)從發(fā)酵罐中取少量反應(yīng)物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
      例八用Af50-34菌種和OPA=為51%的馬鈴薯蛋白在生長培養(yǎng)基中的發(fā)酵反應(yīng)。
      此發(fā)酵反應(yīng),除了進(jìn)料培養(yǎng)基中使用的是水解度為51%的馬鈴薯蛋白外,其余與例七中完全一致,當(dāng)基于得自水解物中的馬鈴薯蛋白干物質(zhì)(110g水解物/l),該數(shù)量對應(yīng)實(shí)施例7中所用的蛋白水解物的量。
      例九用SJ 5262菌種和水解度為19.5%的馬鈴薯蛋白在發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵反應(yīng)發(fā)酵反應(yīng)在有4個(gè)擋板容量為2升的發(fā)酵罐中進(jìn)行,轉(zhuǎn)速和通風(fēng)必須保證足夠的通風(fēng)率使得整個(gè)發(fā)酵罐中溶解氧的濃度保持在大約20%飽和度以上,但通風(fēng)任何時(shí)候也不能超過2l/l/min。
      溫度控制在37攝氏度,為了防止泡沫的產(chǎn)生,一開始就要在培養(yǎng)基中加入足夠量的防沫油。通過不斷的添加15%的磷酸溶液或10%的氨水保持反應(yīng)物的pH值在7.5和7.0之間。
      生長培養(yǎng)基在接種后0.1小時(shí)即被添加,隨后速度保持不變。
      距起始培養(yǎng)的時(shí)間(小時(shí)) 05200培養(yǎng)基添加速率(克每分鐘) 00.15 0.15組成培養(yǎng)基馬鈴薯蛋白水解物(OPA=19.5%)187.5克磷酸二氫鉀5克磷酸氫二鉀5克二水合磷酸氫二鈉2.5克七水合硫酸鎂2.5克硫酸銨2.5克一水合硫酸錳0.02克七水合硫酸亞鐵0.08克五水合硫酸銅0.008克氯化鋅0.008克檸檬酸0.39克加自來水至1升,向每個(gè)發(fā)酵罐中添力720毫升配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基,121攝氏度高溫滅菌1小時(shí)。
      進(jìn)料培養(yǎng)基1水合葡萄糖400克加自來水至1升121攝氏度高溫滅菌1小時(shí)分別在發(fā)酵后95小時(shí)、116小時(shí)從發(fā)酵罐中取少量反應(yīng)物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
      例十用SJ 5262菌種的發(fā)酵反應(yīng),在組成培養(yǎng)基中使用非水解的馬鈴薯蛋白此發(fā)酵反應(yīng),除了在組成培養(yǎng)基中使用的是非水解的馬鈴薯蛋白外,其余與例九中完全一致。,當(dāng)基于得自水解物/未水解物中的馬鈴薯蛋白干物質(zhì)(15g水解物/l),該數(shù)量對應(yīng)實(shí)施例9中所用的蛋白水解物的量。
      例十一通過分析計(jì)算得出發(fā)酵液中酶的活性蛋白酶滴度的測定(例七和例八)采用的是發(fā)酵學(xué)中最常用的方法,即測定反應(yīng)產(chǎn)物中酶的活力,WO 89/06279中29-31頁所述的就可以用來測定蛋白酶的活性。
      α淀粉酶滴度的測定(例九和例十)也采用的是發(fā)酵學(xué)中最常用的方法,即測定反應(yīng)產(chǎn)物中酶的活力,WO 95/26397中9-10頁所述的就可以用來測定α淀粉酶的活性。
      例十二比較分析例七例八例九例十中酶活性Af50-34菌種/蛋白酶馬鈴薯蛋白水解產(chǎn)物;進(jìn)料中OPA=2.9%(例七)在49、71小時(shí)取樣相關(guān)滴度139、130馬鈴薯蛋白水解產(chǎn)物;進(jìn)料中OPA=51%(例八)在49、71小時(shí)相對滴度100、68(所有滴度值都以例八中49小時(shí)樣品的滴度值作為標(biāo)準(zhǔn)。)SJ 5262/α淀粉酶馬鈴薯蛋白水解產(chǎn)物;組成中OPA=19.5%(例九)在95、116小時(shí)取樣相對滴度111、130馬鈴薯蛋白非水解產(chǎn)物(例十)在95、116小時(shí)取樣相對滴度100、117(所有滴度值都以例十中95小時(shí)樣品的滴度值作為標(biāo)準(zhǔn))根據(jù)上述分析可以得出在用預(yù)水解的復(fù)合氮源(馬鈴薯)來發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí),較低的預(yù)水解度有利于蛋白酶的形成。在用預(yù)水解的復(fù)合氮源(馬鈴薯)來發(fā)酵生產(chǎn)α淀粉酶時(shí),充分預(yù)水解的復(fù)合氮源也很有利于α淀粉酶活性的增加,其主要原因是預(yù)水解的復(fù)合氮源程度可以更好的被微生物吸收利用。
      權(quán)利要求
      1.一種以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)酶的方法,包括a)用含有一或多種預(yù)水解復(fù)合氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基通過微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)所需要的酶,這些復(fù)合氮源要與含碳水化合物的其他營養(yǎng)源分開滅菌。向復(fù)合氮源中添加酸類物質(zhì)或水解酶以達(dá)到所述預(yù)水解的目的;b)從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收所需酶。
      2.權(quán)利要求1中所述方法,其中的酶包括淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、氧化還原酶、carbohydrolase,和非破壞性蛋白酶或肽酶。
      3.權(quán)利要求1中所述方法,其中的酶是能自我破壞性蛋白酶或肽酶。
      4.權(quán)利要求1中所述方法,其中的微生物可選用細(xì)菌或真菌。
      5.權(quán)利要求4中所述方法,其中的細(xì)菌是芽孢桿菌。
      6.權(quán)利要求1中所述方法,其中的復(fù)合氮源是含有少于10%碳水化合物的植物來源蛋白。
      7.權(quán)利要求1中所述方法,其中的復(fù)合氮源選自馬鈴薯蛋白或豌豆蛋白。
      8.權(quán)利要求1中所述方法,其中的復(fù)合氮源是含有少于10%碳水化合物的動(dòng)物來源蛋白。
      9.權(quán)利要求1中所述方法,其中的復(fù)合氮源選自血液蛋白,魚肌肉蛋白和動(dòng)物肌肉蛋白。
      10.權(quán)利要求2中所述方法,其中的復(fù)合氮源預(yù)水解破壞10%-70%的肽鍵。
      11.權(quán)利要求3中所述方法,其中的復(fù)合氮源預(yù)水解破壞1-20%的肽鍵。
      12.權(quán)利要求1中所述方法,其中的預(yù)水解復(fù)合氮源的含量按重量計(jì)算達(dá)到加入培養(yǎng)基的全部凱氏氮總量的至少5%。
      13.權(quán)利要求1中所述方法,其中的發(fā)酵培養(yǎng)基的量至少是50升。
      14.權(quán)利要求1中所述方法,其中的發(fā)酵是重復(fù)分批式發(fā)酵、流加式發(fā)酵、重復(fù)流加式發(fā)酵或連續(xù)式發(fā)酵反應(yīng)。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)目的酶的方法,包括a)用含有一或多種部分預(yù)水解復(fù)合氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基通過微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)所需要的酶,這些部分預(yù)水解復(fù)合氮源與其他含有碳水化合物的其他營養(yǎng)源分開滅菌,所述預(yù)水解通過加入酸和/或水解酶完成;和b)從發(fā)酵培養(yǎng)液回收酶。
      文檔編號C12N9/00GK1665924SQ03815585
      公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月1日
      發(fā)明者莫根斯·沃普爾曼, 尼爾斯·班克, 索倫·邁克爾森 申請人:諾維信公司
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