專利名稱：Cmp－n－乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為糖鏈合成的重要原料的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的改良制造方法。
背景技術(shù)：
近年來，有關(guān)糖鏈結(jié)構(gòu)與功能的研究快速進步，具有生理活性的寡聚糖、糖脂、糖蛋白等醫(yī)藥品或者作為功能性材料的用途開發(fā)，令人注目。其中，末端含有N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的含唾液酸的糖鏈，是具有細胞粘著、作為病毒感染時的受體等重要功能的糖鏈。
含唾液酸的糖鏈，通常通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化作用而合成。唾液酸轉(zhuǎn)移酶是將CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)作為糖的供體、使唾液酸轉(zhuǎn)移至糖鏈等受體的酶。
然而，用作糖的供體的CMP-NeuAc，現(xiàn)在的狀況是價格非常貴，并且其數(shù)量也只能供給試劑水平的小量。
CMP-NeuAc的制造方法，已知有以胞苷-5′-三磷酸(CTP)和NeuAc作為底物，用CMP-NeuAc合成酶催化合成的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，44，59-67(1995))，但作為原料的CTP和NeuAc價格昂貴，用它們作為直接原料合成的CMP-NeuAc也只能成為高價的試劑。
最近，小泉等開發(fā)了將能把乳清酸轉(zhuǎn)變成尿苷-5′-三磷酸(UTP)的產(chǎn)氨棒桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)菌體、將生產(chǎn)催化UTP轉(zhuǎn)化成CTP的反應(yīng)的CTP合成酶的重組大腸桿菌和生產(chǎn)CMP-NeuAc合成酶的重組大腸桿菌組合，以乳清酸和NeuAc作原料合成CMP-NeuAc的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，257-261(2000))。該方法是不使用高價的CTP的方法，但由于必須調(diào)制多種菌體等工序繁雜，同時其實施必須準備大型設(shè)備，且仍用高價的NeuAc作為原料，很難說是實用的方法。
另一方面，關(guān)于NeuAc的制造方法，已知有從微生物回收唾液酸多聚體，即多聚乙酰神經(jīng)氨酸、將其化學(xué)分解而回收的方法，但最近開發(fā)了利用酶的方法。
利用酶的方法，據(jù)報道有(1)用NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶，從N-乙酰苷露糖胺(Man NAc)制造的方法(J.Am.Chem.Soc.，110，6481(1988)、J.Am.Chem.Soc.，110，7159(1988)、日本特許公開公報平10-4961號)、(2)在堿性條件下，將N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)轉(zhuǎn)化成N-乙醇甘露糖胺(Man NAc)，而使NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶作用于它制造NeuAc的方法(日本特許公開公報平5-211884號，Biotechnology and Bioengineering，Vol.66，No.2(1999)，EnzymeMicrob.Technol.，Vol.20(1997))，(3)使用催化GlcNAc轉(zhuǎn)化成Man NAc的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)2-表異構(gòu)酶和NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶，從Glc NAc制造的方法(WO 95/26399，日本特許公開公報平3-180190號，日本特許公開公報2001-136982號)。
然而，存在下列問題(1)的方法中原料Man NAc價昂，(2)的方法雖是用廉價的Glc NAc作原料的方法，但從GlcNAc和Man NAc的混合物精制ManNAc的工序繁雜。而如下所示，(3)的方法中所用的GlcNAc 2-表異構(gòu)酶需要ATP，所以要添加高價的ATP，或者用微生物從ATP的前體腺嘌呤生成ATP，很難說這一方法使人滿意。
<(3)的方法>
ATP或其前體 丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸↓ ↓Glc NAc→Man NAc→NeuAc(a) (b)(a)GlcNAc 2-表異構(gòu)酶(b)NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者探討用大腸桿菌菌體內(nèi)的酶以Glc NAc作為底物合成NeuAc，幾乎未能合成GlcNAc，而由于GlcNAc轉(zhuǎn)化成GlcNAc-6-磷酸(Glc NAc-6P)，試圖構(gòu)成下列途徑由GlcNAc合成NeuAc的體系。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如增強Glc NAc-6P 2-表異構(gòu)酶(EC 5.1.3.9)和NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶的活性，便能高收率地生成NeuAc，且該合成體系不需要高價的ATP。
(c) (1) (c) (2)或(3)Glc NAc→Glc NAc 6-磷酸→Man NAc 6-磷酸→Man NAc→NeuAc(d)丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸(c)菌體反應(yīng)(1)GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶(2)NeuAc裂合酶(3)NeuAc合成酶其次，對于用于進行CMP-NeuAc合成反應(yīng)的CTP合成體系，用種種微生物探討以廉價的CMP作原料的微生物轉(zhuǎn)化成CTP的體系與上述NeuAc合成體系的組合。于是發(fā)現(xiàn)，利用大腸桿菌等酵母以外的微生物時只能合成少量CMP-NeuAc，而如用酵母菌體可高收率地合成CMP-NeuAc。特別是NeuAc合成酶反應(yīng)所需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，可利用酵母菌體內(nèi)的該物質(zhì)，不需要重新加至反應(yīng)體系中這一新優(yōu)點，完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明涉及CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征是，在含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、丙酮糖和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)、N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(CMP-NeuAc裂合酶)和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAC合成酶)，進行反應(yīng)。
本發(fā)明還涉及CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征是，在含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NeuAc合成酶)和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，進行反應(yīng)。
具體實施例方式
模式地表示本發(fā)明的CMP-NeuAc合成反應(yīng)途徑，是以下的(A)采用NeuAc裂合酶的方法和(B)采用NeuAc合成酶的方法。此外，(B)的反應(yīng)體系需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)由酵母和大腸桿菌的菌體(代謝)反應(yīng)自培養(yǎng)基中的葡萄糖合成、供給，因此反應(yīng)體系中不必加入磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。
(A)利用NeuAc裂合酶的方法 (B)利用NeuAc合成酶的方法 上述模式圖(A)和(B)中的記號表示以下意義(1)GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶(2)NeuAc裂合酶(3)CMP-NeuAc合成酶(4)NeuAc合成酶(1)酶等的調(diào)制加入上述(A)和(B)的反應(yīng)體系中的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)，是指具有催化上述(1)的Glc NAc-6-磷酸轉(zhuǎn)化為ManNAc-6-磷酸的反應(yīng)的活性的酶；加入上述(A)的反應(yīng)體系中的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)，是指具有催化上述(2)的底物的Man NAc與丙酮酸合成NeuAc的反應(yīng)的活性的酶；加入上述(B)的反應(yīng)體系中的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NeuAc合成酶)，是指具有催化上述(4)的底物MaNAc和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成NeuAc的反應(yīng)的活性的酶；加入上述(A)和(B)的反應(yīng)體系中的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，是指具有催化上述(3)的底物NeuAc和CTP合成CMP-NeuAc的反應(yīng)的活性的酶。
作為具有這些酶活性的材料，可以列舉具有該活性的細胞(包括轉(zhuǎn)化體)或其處理物，從調(diào)制的簡便性等考慮，較好是使用來自微生物的材料。來自微生物的Glc NAc-6P 2-表異構(gòu)酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶和CMP-NeuAc合成酶都是公知的酶，可按常法調(diào)制。
而作為增強該酶活性的手段，較好是采用利用將該酶基因組(J.Bacteriol.，181，47-54，1999；J.Bacteriol.，181，4526-4532，1999；Nucleic Acids.Res.，13，8843-8852，1985；Agric.Biol.Chem.，50，2155-2158，1986；FEMS Microbiol.Lett.，75，161-166，1992；J.Biol.Chem.，271，15373-15380，1996；J.Biol.Chem.，264，14769-14774，1989；J.Bacteriol.，177，312-319，1995；Mol.Microbiol.，35，1120-1134，2000)克隆，使其在菌體內(nèi)大量表達的微生物的、所謂重組DNA技術(shù)。
在本發(fā)明中還可使用使兩個以上基因共表達而得到的菌體或其處理物，特別合適使用Glc NAc-6P 2-表異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的各自酶活性分別得到增強的轉(zhuǎn)化體，或使GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的各自酶活性分別得到增強的轉(zhuǎn)化體，但并不限于此。
基因的克隆、利用克隆的DNA片斷的表達載體的調(diào)制、用表達載體調(diào)制具目標酶活性的酶蛋白等，都是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的技術(shù)，具體可根據(jù)例如《Molecular Cloning》(Maniatis等編，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York(1982)所記載的方法進行。
例如，可以根據(jù)所報道的堿基序列合成探針，利用微生物的染色體DNA克隆含有將具有目標酶活性的酶蛋白編碼的遺傳因子的DNA片斷。用于克隆的宿主沒有特別限制，從操作性和簡單性出發(fā)用大腸桿菌較好。
為構(gòu)建克隆化基因的高表達體系，例如應(yīng)用Maxam-Gilbert(DNA測序)法(Methods in Enzymology，65，499(1980))或雙脫氧鏈終止(DNA測序)法(Methodsin Enzymology，101，20(1983))等，對克隆化后的DNA片斷的堿基序列進行解析，確定該基因的編碼區(qū)，制備在其上游根據(jù)宿主微生物連結(jié)有表達的控制信號(轉(zhuǎn)錄開始和翻譯開始信號)的重組表達載體，使該基因在菌體中可能表達。
作為載體，可使用各種質(zhì)粒載體、噬菌體載體等，但希望使用在大腸桿菌菌體內(nèi)可能復(fù)制、有適當?shù)哪退幮詷擞浐吞囟ǖ南拗泼该盖凶↑c、在菌體內(nèi)拷貝數(shù)高的質(zhì)粒載體。具體可列舉pBR322(Gene，2，95(1975))、pUC18、pUC19(Gene，33，103(1985))等。
用制作的重組載體使大腸桿菌轉(zhuǎn)化。宿主大腸桿菌可使用例如重組DNA實驗使用的K12株、C600菌株、JM105菌株、JM109菌株(Gene，33，103-119(1985))等。為了減少合成NeuAc以外的丙酮酸代謝，也可使用引入與丙酸代謝相關(guān)的lip基因發(fā)生變異等的大腸桿菌(例如W1485 lip 2(ATCC 25645))作為宿主。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法已有多種方法報導(dǎo)，可通過低溫下以氯化鈣處理、將質(zhì)粒導(dǎo)入菌體內(nèi)的方法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))等使大腸桿菌轉(zhuǎn)化。
使所得轉(zhuǎn)化體在該微生物可能增殖的培養(yǎng)基中增殖，再誘導(dǎo)克隆化的有目標酶活性的蛋白質(zhì)表達，進行培養(yǎng)直到該酶蛋白在菌體內(nèi)大量蓄積。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可用含有碳源、氮源等該微生物增殖必需的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基按常法進行。例如，可使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％食鹽)或2YT培養(yǎng)基(1.6％胰化蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％食鹽)等大腸桿菌的培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，于30～50℃的培養(yǎng)溫度，根據(jù)需要通氣攪拌，培養(yǎng)10-50小時左右。而在使用質(zhì)粒作為載體的場合，為防止培養(yǎng)中質(zhì)粒的脫落，可在培養(yǎng)液中加適量適當?shù)目股?根據(jù)質(zhì)粒的耐藥標記，用氨芐西林、卡那霉素等)等藥物進行培養(yǎng)。
作為有目標酶活性的菌體，可舉出從如上方法獲得的培養(yǎng)液用離心分離、膜分離等固液分離手段回收的菌體。也可利用將回收的菌體按機械破壞(用旋轉(zhuǎn)攪切機、弗氏壓碎器、勻漿器、乳缽等)、冷凍-融化、自體消化、干燥(用冷凍干燥、風干等)、酶處理(用溶菌酶等)、超聲處理、化學(xué)處理(用酸、堿處理等)等的一般處理法處理得到的處理物，或?qū)哂心繕嗣富钚缘慕M分進行通常的酶精制手段(鹽析處理、等電沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種色譜處理等)從該菌體處理物得到的粗酶或精制酶，作為菌體處理物。
其次，作為用于使CMP轉(zhuǎn)化成CTP的酵母，可用市售的面包酵母或酒酵母，在可省略菌體制造的過程上是極有利的。而且，可能利用酵母活菌體、酵母干燥菌體的任一種形式，但從反應(yīng)收率、處理的難易等點來考慮，使用干燥的酵母菌體較好。
(2)CMP-NeuAc的合成CMP-NeuAc合成反應(yīng)中使用的Glc NAc、丙酮酸和CMP有市售，可使用其市售品。使用濃度可在例如各為1～5000mM、較好為10～1000mM的范圍內(nèi)適當設(shè)定。
(使用NeuAc裂合酶的方法)CMP-NeuAc的合成反應(yīng)，可在含Glc NAc、CMP和丙酮酸的反應(yīng)體系中，加入GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶、NeuAc裂合酶和CMP-NeuAc合成酶(分別為每1ml反應(yīng)液0.2mg以上，較好是2～100mg)、干燥酵母1～20％(w/v)，于50℃以下，較好在15～40℃，根據(jù)需要攪拌反應(yīng)1～150小時左右而實行。
而在上述反應(yīng)中，在含Glc NAc和丙酮酸的反應(yīng)體系中，加入Glc NAc-6P2-表異構(gòu)酶和NeuAc裂合酶，于50℃以下，較好在15～40℃反應(yīng)1～50小時左右，合成NeuAc，然后加入CMP、酵母菌體和CMP-NeuAc合成酶，反應(yīng)約5～50小時合成CMP-NeuAc，這樣進行二階段反應(yīng)，可使CMP-NeuAc的合成收率提高。但也可以在NeuAc合成時先在反應(yīng)體系中添加CMP。
(使用NeuAc合成酶的方法)CMP-NeuAc的合成反應(yīng)，可在含GlcNAc和CMP的反應(yīng)體系中，加入GlcNac-6P 2-表異構(gòu)酶、NeuAc合成酶和CMP-NeuAc合成酶(每1ml反應(yīng)液中分別在0.2mg以上，較好為2～100mg)、干燥酵母1～20％(w/v)，于50℃以下，較好在15～40℃，根據(jù)需要攪拌反應(yīng)1～150小時左右而實行。
上述任一CMP-NeuAc合成體系中，較好是都根據(jù)需要加入無機磷酸、鎂和能源。
作為無機磷酸，可直接使用磷酸鉀等，但較好是以磷酸緩沖液的形式使用。使用濃度，例如可在1～1000mM、較好是10～400mM的范圍內(nèi)適當設(shè)定。而使用磷酸緩沖液的形式時，緩沖液的pH可在5～10的范圍內(nèi)適當設(shè)定。
作為鎂，可使用硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機酸的鎂鹽、檸檬酸鎂等有機酸的鎂鹽，其使用濃度可在1～1000mM的范圍內(nèi)適當設(shè)定。
作為能源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類，醋酸、檸檬酸等有機酸，其使用濃度可在1～5000mM、較好在10～1000mM的范圍內(nèi)適當設(shè)定。
這樣所得的CMP-NeuAc，可用糖核苷酸通常的分離精制手段(離子交換色譜、吸附色譜、鹽析、親和色譜等)進行分離精制。
實施例以下，列舉實施例，對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明絲毫不受其限制。而實施例中DNA的調(diào)制，用限制酶酶切、用T4 DNA連接酶連接DNA以及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化完全按《Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Second Edition》(Sambrook等編，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989))進行。而限制酶、Ampli Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶，來自于寶バイオ(株)。
此外，反應(yīng)液中CMP-Meu Ac的定量用HPLC進行。具體說，分離用YMC公司制的ODS-HS 302柱，洗脫劑用1mm四丁基銨硫酸鹽、50mM醋酸鎂溶液。而NeuAc等糖的定量用HPLC按HPAE-PAD法進行。具體說，分離、檢出，用ダイオネケス公司制的CarboPac PA1柱、ED40，洗脫劑用A液(0.1N NaOH)和B液(0.1N NaOH，0.5M醋酸鈉)，通過A液-B液的梯度進行。
實施例1(1)編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的nanA基因的克隆以流感嗜血菌(H.influenzae)Rd株的染色體DNA(ATCC 51907d)作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，用PCR法擴增流感嗜血菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(ana A)基因。
引物(A)5′-CACCATGGCGAAGATATTGCCGCTCAAACTA-3′(序列號1)引物(B)5′-CCGAATTCATTTATGACAAAAATTTCGCTTTCAAG-3′(序列號2)用PCR使nanA基因擴增，是在反應(yīng)液100gL(50mM氯化鉀、10mM鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA熱循環(huán)儀熱變化(94℃、1分鐘)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)25次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2倍體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文獻(上述Molecular Cloning)方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于1.2kb的DNA片斷。用限制酶NcoI和EcoRI酶切該DNA，用T4 DNA連接酶與同樣以限制酶NcoI和EcoRI消化的質(zhì)粒pTrc 99a(得自Pharmacia Biotech.公司)連接。用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株(ATCC53323)轉(zhuǎn)化，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrcnanA。pTrcnan A是在pTrc 99A的trc啟動子下游的NcoI-EcoRI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的nanA基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(2)編碼GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶的nanE基因的克隆以流感嗜血菌Rd株的染色體DNA作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，用PCR法擴增流感嗜血菌的GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶(nanE)基因。
引物(C)5′-GGTCTAGATTTAAATGAGGGGTGTTATATGT-3′(序列號3)引物(D)5′-TCGTCGACTTATCTTGCAGATTTCACTGAATTAGCAAACCA-3′(序列號4)用PCR使nanE基因擴增，是在反應(yīng)液100μL(50mM氯化鉀、10mM鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.1μg的模板DNA、引物DNA(C)(D)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA熱循環(huán)儀熱變性(94℃、1分鐘)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)25次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2倍體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文獻(上述Molecular Cloning)方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于720b的DNA片斷。用限制酶XbaI和SalI酶切該DNA，用T4 DNA連接酶與同樣以限制酶XbaI和SalI消化的質(zhì)粒pTrc99A連接。用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrc-nanE。PTrc-nanE是在pTrc99A的trc啟動子下游的XbaI-SalI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的nanE基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(3)nanA、nanE基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建將上述(1)所得的pTrcnan A質(zhì)粒用限制酶NcoI、EcoRI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收含nan A基因的NcoI-EcoRI片斷。用T4 DNA連接酶將它與同樣以NcoI、EcoRI消化的上述(2)所得的pTrc-nanE質(zhì)粒連接。用該連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，從所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrcAE。pTtrcAE是在pTrc 99A的trc啟動子下游的NcoI-SalI酶切部位插入含有流感嗜血菌的nanA、nanE基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(4)NeuAc的合成使上述(3)構(gòu)建的質(zhì)粒pTrc AE保持在大腸桿菌W1485 lip2(ATCC 25645)中，將其接種于含100μg/ml的氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基500ml中，于37℃振蕩培養(yǎng)。在菌體數(shù)達到1×108個/ml時，加入β-D-硫代半乳吡喃糖異丙苷(IPTG)到培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液的最終濃度為0.2mM，再繼續(xù)于37℃振蕩培養(yǎng)26小時。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離(9000×g、10分鐘)回收25ml的一份培養(yǎng)液中的菌體50mg，在其中加入含100mM的Glc NAc、20mM氯化鎂、50mM葡萄糖、300mM丙酮酸鈉、0.5％(v/v)二甲苯的200mM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)5ml，于28℃攪拌反應(yīng)。于14、24小時后加入110mg的丙酮酸鈉，在48小時時將反應(yīng)液于100℃熱處理5分鐘，使反應(yīng)停止。所得反應(yīng)液以糖分析用的HPLC(HPAE-PADダィォネクス公司)進行分析，確認有43.7mM的NeuAc生成。
而用對照菌株(保持pTrc 99A質(zhì)粒的大腸桿菌W1485 lip 2)進行同樣的反應(yīng)，未能檢出NeuAc生成(生成0.5mM以下)。
(5)編碼CMP-NeuAc合成酶的neuA基因的克隆以流感嗜血菌Rd株的染色體DNA作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，用PCR法擴增流感嗜血菌的CMP-NeuAc合成酶(neu A)基因。
引物(E)5′-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3′(序列號5)引物(F)5′-AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC-3′
(序列號6)用PCR使neuA基因擴增，是在反應(yīng)液100μL(500mM的氯化鉀、10mM的鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM的氯化鎂、0.001％明膠、模板DNA0.1μg、引物DNA(E)(F)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer CetusInstrument公司制的DNA熱循環(huán)儀熱變性(94℃、1分鐘)、退火(55℃、1.5分鐘)聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)25次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文獻(上述Molecular Cloning)方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于720b的DNA片斷。用限制酶NcoI和PstI酶切該DNA，用T4DNA連接酶與同樣以限制酶NcoI和PstI消化的質(zhì)粒pTrc 99A連接。用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrcsia BNP。pTrcsia BNP是在pTrc99A的trc啟動子下游的NcoI-PstI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的neu A基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(6)CMP-NeuAc合成酶的調(diào)制將保持質(zhì)粒pTrcsia BNP的大腸桿菌JM109菌株，接種于含100μg/ml的氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基100ml中，于37℃振蕩培養(yǎng)。在達到4×108個/ml時，在培養(yǎng)液中添加IPTG使最終濃度為0.25mM，再于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離(9000×g，10分鐘)回收菌體，懸浮于5ml緩沖液(100mM的鹽酸Tris(pH7.8)、10mM的MgCl2)。進行超聲波處理，使菌體破碎，再經(jīng)離心分離(20000×g，10分鐘)除去菌體殘片。
以這樣所得的上清組分作為酶液，將測定該酶液中的CMP-NeuAc合成酶活性的結(jié)果與對照菌株(保持pTrc 99A的大腸桿菌K-12株JM109)一起表示于下述表1。此外，本發(fā)明中CMP-NeuAc合成酶活性的單位數(shù)，是用以下所述方法測定和算出的自5′-CMP和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成CMP-NeuAc的合成活性。
(CMP-NeuAc合成酶活性的測定和單位計算法)在50mM的鹽酸Tris緩沖液(pH8.0)、20mM的氯化鎂、5mM的CTP和10mM的N-乙酰神經(jīng)氨酸中，加入CMP-NeuAc合成酶，于37℃反應(yīng)5分鐘。并用保持pTrc 99A的大腸桿菌JM109菌株的菌體破碎液代替CMP-NeuAc合成酶，進行同樣的反應(yīng)，將其作為對照。
在反應(yīng)液中加入2倍量的70％乙醇，使反應(yīng)停止，將其稀釋后用HPLC進行分析。分離采用YMC公司制的HS-302柱，以50mM醋酸鎂和1mM四丁基銨水溶液的混合液作洗脫液。由HPLC分析結(jié)果算出反應(yīng)液中的CMP-NeuAc的量，將37℃時1分鐘內(nèi)合成1μmol的CMP-NeuAc的活性作為1單位，算出CMP-NeuAc合成酶活性。
表1

(7)CMP-NeuAc的合成在大腸桿菌K-12株ME8417(FERM BP-6847平成11年8月18日，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣っくば市東1丁目1番地1，中央第6(郵政編碼305-8566))中保持上述(3)構(gòu)建的質(zhì)粒pTrc AE，將其接種于含100μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基500ml中，于37℃振蕩培養(yǎng)。在菌體數(shù)達到4×108個/ml時，在培養(yǎng)液中加入IPTG。使最終濃度為0.2mM，再于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8.5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離(9,000×g，10分鐘)回收25ml的一份培養(yǎng)液中的菌體50mg，在其中加入含50mM的CMP、100mM的Glc NAc、20mM氯化鎂、50mM葡萄糖、250mM丙酮酸鈉、0.5％(v/v)二甲苯的200mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)5ml，于28℃進行攪拌反應(yīng)。
反應(yīng)開始24小時后，加入干燥面包酵母(オリエンタル酵母公司制)250mg、上述(6)調(diào)制的CMP-NeuAc合成酶(3.4單位/ml反應(yīng)液)及1M氯化鎂溶液100μl，總共反應(yīng)62小時。另于反應(yīng)開始14小時后加入110mg丙酮酸鈉，24、38小時后分別加入110mg丙酮酸鈉、180mg葡萄糖，48小時后加入55mg丙酮酸鈉、180mg葡萄糖。
用HPLC對反應(yīng)上清液進行分析，發(fā)現(xiàn)生成21.4mM的CMP-NeuAc。
比較例1
(1)編碼CMP激酶的cmk基因的克隆以齊藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)調(diào)制的大腸桿菌JM109株的染色體DNA作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，以PCR法使大腸桿菌的CMP激酶(cmk)基因擴增。
引物(G)5′-TTGAATTCTAAGGAGATAAAGATGACGGCAATT-3′(序列號7)引物(H)5′-TTGAGCTCTGCAAATTCGGTCGCTTATGCG-3′(序列號8)用PCR使cmk基因擴增，是在反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、模板0.1μg、引物DNA(G)(H)各0.2μg、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA熱循環(huán)儀進行熱變性(94℃、1分鐘)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)25次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2倍體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文獻(上述Molecular Cloning)方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于720b的DNA片斷。用限制酶EcoRI和SacI酶切該DNA，用T4 DNA連接酶與同樣以限制酶EcoRI和SacI消化的質(zhì)粒pTrc 99A連接。用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrc CMKAB。PTrcCMKAB是在pTrc99A的trc啟動子下游的EcoRI-SacI酶切部位，插入含有大腸桿菌的cmk基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(2)cmk、neuA基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建將實施例1所得的pTrcsia BNP質(zhì)粒用限制酶NcoI、EcoRI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收含neuA基因的NcoI-EcoRI片斷。將它與同樣以NcoI、EcoRI消化的上述比較例(1)的pTrc CMKAB質(zhì)粒用T4連接。用該連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，從所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrc SBCK。PTrcSBCK是在pTrc 99A的trc啟動子下游的NcoI-SacI酶切部位插入含流感嗜血菌的neu A基因和大腸桿菌的cmk基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(3)CMP-NeuAc的合成在實施例1調(diào)制的大腸桿菌ME 8417/pTrc AE的25ml的一份培養(yǎng)液的集菌體50mg中，加入含100mM GlcNAc、20mM氯化鎂、50mM葡萄糖、250mM丙酮酸鈉、0.5％(v/v)二甲苯的200mM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)2.5ml，于28℃攪拌反應(yīng)24小時。
在保持上述(2)構(gòu)建的質(zhì)粒pTrc SBCK的大腸桿菌ME 8417株的25ml的一份培養(yǎng)液的菌體50mg中加入含100mM CMP、20mM氯化鎂、250mM丙酮酸鈉的200mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)2.5ml后，進行超聲波處理。
反應(yīng)開始24小時后，添加上述超過處理液2.5ml，再于28℃進行攪拌反應(yīng)。另于反應(yīng)開始14、24小時后添加丙酮酸鈉55mg，38小時后添加110mg。
總共反應(yīng)48小時后，用HPLC分析反應(yīng)上清液，CMP-NeuAc的生成量為6.28mM。
實施例2(1)編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的neuB1基因的克隆以空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)1652株的染色體DNA作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，用PCR法擴增N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(neuB1)基因。
引物(I)5′-TACGATTATTTTCCTGATGCTC-3′(序列號9)引物(J)5′-TCTCCAAGCTGCATTAAACGCC-3′(序列號10)用PCR使neu B1基因擴增，是在反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA熱循環(huán)進行熱變性(94℃，1分鐘)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)30次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2倍體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文獻(上述Molecular Cloning)方法經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于2.2kb的DNA片斷。以該DNA片斷作模板，按常法合成以下所示的2種引物DNA，再次用PCR法擴增空腸彎曲桿菌的neu B1基因。
引物(K)5′-AAGGATCCTCTAGTGAGGCTTATGGAA-3′(序列號11)引物(L)5′-GTCTGCAGATTTAATCTTAGAATAATCAGCCC-3′(序列號12)用PCR使neu B1基因擴增，是在反應(yīng)液100μl(50mM氯化鉀、10mM鹽酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001％明膠、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5單位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA熱循環(huán)儀進行熱變性(94℃，1分鐘)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步驟反復(fù)25次而進行。
基因擴增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液處理反應(yīng)液，水溶性組分中加入2倍體積的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，精制相當于1.2kb的DNA片斷。用限制酶BanHI和PstI酶切該DNA，用T4 DNA連接酶與同樣以限制酶BanHI和PstI消化的質(zhì)粒pTrc99A(得自PharmaciaBiotech公司)連接。用連接反應(yīng)液使大腸桿菌JM109株轉(zhuǎn)化，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrcneu B1。pTrcneu B1是在pTrc 99A的trc啟動子下游的BanHI-PstI酶切部位，插入含有空腸彎曲桿菌的neu B1基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒(FERM BP-8248平成14年6月25日，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣っくば市東1丁目1番地，中央第6(郵政編碼305-8566))。
(2)nanE、neu B1基因共表達質(zhì)粒的構(gòu)建將上述(1)所得的pTrcneu B1質(zhì)粒用限制酶BanHI酶切后，用T4 DNA聚合酶將酶切面補平。將其用限制酶PstI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收含neu B1基因的(BamH I)-PstI片斷。然后用限制酶SalI酶切實施例1的(2)得到的pTrcnanE質(zhì)粒后，用T4 DNA聚合酶將酶切面補平，再用限制酶PstI酶切。用T4 DNA連接酶將其與如上所得的含neu B1基因的(BamH I)-Pst I片斷連接。用該連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，由所得的氨芐西林耐藥性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrc NENB。PTrc NENB是在pTrc 99A的trc啟動子下游的XbaI-PstI酶切部位插入含有流感嗜血菌的nanE基因和空腸彎曲桿菌的neu B1基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷的質(zhì)粒。
(3)CMP-NeuAc的合成在保持上述(2)構(gòu)建的質(zhì)粒pTrc NENB的大腸桿菌MC1061株(ATCC53338)的培養(yǎng)菌體50mg中，加入含50mM CMP、100mM Glc NAc、30mM氯化鎂、200mM葡萄糖、100mM的丙酮酸鈉、0.5％(v/v)二甲苯、4％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母公司制)和實施例1的(6)調(diào)制的CMP-NeuAc合成酶(1.7單位/ml反應(yīng)液)的175mM的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)5ml，于28℃攪拌反應(yīng)72小時。并在反應(yīng)開始14、24、38、48、62小時后分別添加180mg葡萄糖。
用HPLC分析反應(yīng)上清液，發(fā)現(xiàn)有25.6mM的CMP-NeuAc生成。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的利用NeuAc裂合酶的方法，不需要高價的ATP，首次使利用廉價的GlcNAc、CMP和丙酮酸有效地制造CMP-NeuAc變?yōu)榭赡?，作為CMP-NeuAc的大量合成法是極有意義的方法。
而本發(fā)明的利用NeuAc合成酶的方法，不需要高價的ATP，反應(yīng)體系必需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)通過酵母和大腸桿菌的菌體(代謝)反應(yīng)從葡萄糖合成、供給，所以反應(yīng)體系中不必添加磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，首次使利用廉價的GlcNAc和CMP有效地制造CMP-NeuAc變?yōu)榭赡?，作為CMP-NeuAc的大量合成法是極有意義的方法。
特別是，在不需要本發(fā)明的利用NeuAc裂合酶的方法時所用的2階段反應(yīng)這點上，本發(fā)明的利用NeuAc合成酶的方法是更簡便的優(yōu)良方法。
序列表<110>雅瑪山公司<120>胞苷-5’-一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法<130>A02-0095<140>
<141>
<150>JP2002-208987<151>2002-07-18<160>12<170>專利，2.1版本<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于nanA基因擴增的引物<400>1caccatggcg aagatattgc cgctcaaact a 31
<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于nanA基因擴增的引物<400>2ccgaattcat ttatgacaaa aatttcgctt tcaag 35<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于nanE基因擴增的引物<400>3ggtctagatt taaatgaggg gtgttatatg t 31<210>4<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于nanE基因擴增的引物<400>4
tcgtcgactt atcttgcaga tttcactgaa ttagcaaacc a 41<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于neuA基因擴增的引物<400>5tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于neuA基因擴增的引物<400>6aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc28<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于cmk基因擴增的引物
<400>7ttgaattcta aggagataaa gatgacggca att33<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于cmk基因擴增的引物<400>8ttgagctctg caaattcggt cgcttatgcg30<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于neuB1基因擴增的引物<400>9tacgattatt ttcctgatgc tc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于neuB1基因擴增的引物<400>10tctccaagct gcattaaacg cc 22<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于neuB1基因擴增的引物<400>11aaggatcctc tagtgaggct tatggaa 27<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于neuB1基因擴增的引物<400>12gtctgcagat ttaatcttag aataatcagc cc 3權(quán)利要求
1.CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征為，在含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、丙酮酸和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)、N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，進行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征為，在N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和丙酮酸的反應(yīng)體系中，添加N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)和N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)，合成N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)，然后在此反應(yīng)體系中加入胞苷-5′-一磷酸(CMP)、酵母菌體和胞苷-5′-一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征為，使用細胞(包括轉(zhuǎn)化體)或其處理物，作為GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶、NeuAc裂合酶和CMP-NeuAc合成酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征為，使用GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶和NeuAc裂合酶的活性分別得到增強的轉(zhuǎn)化體和具有CMP-NeuAc合成酶活性的菌體處理物。
5.CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征為，在含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶)、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NeuAc合成酶)和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，進行反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征為，使用細胞(包括轉(zhuǎn)化體)或其處理物，作為GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶、NeuAc合成酶和CMP-NeuAc合成酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征為，使用GlcNAc-6P 2-表異構(gòu)酶和NeuAc合成酶的活性分別得到增強的轉(zhuǎn)化體和具有CMP-NeuAc合成酶活性的菌體處理物。
全文摘要
本發(fā)明涉及CMP－N－乙酰神經(jīng)氨酸(CMP－NeuAc)的制造方法，其特征為在含有N－乙酰葡糖胺(GlcNAc)、丙酮酸和胞苷5′－一磷酸(CMP)的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、N－乙酰葡糖胺－6－磷酸－2－表異構(gòu)酶(GlcNAc－6P2－表異構(gòu)酶)、N－乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)及CMP－N－乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP－NeuAc合成酶)進行反應(yīng)。本發(fā)明還涉及CMP－NeuAc的制造方法，其特征為在含GlcNAc和CMP的反應(yīng)體系中，加入酵母菌體、GlcNAc－6P2－表異構(gòu)酶、NeuAc合成酶和CMP－NeuAc合成酶進行反應(yīng)。
文檔編號C12N9/90GK1668756SQ03817070
公開日2005年9月14日 申請日期2003年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者野口利忠, 浜本智樹 申請人:雅瑪山醬油株式會社