專利名稱：利用來自博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶的偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由酶操縱的偶聯(lián)反應(yīng)體系，該偶聯(lián)反應(yīng)體系的與眾不同之處為其在雙相的溶劑混合物中起作用。具體而言，本發(fā)明涉及一種反應(yīng)體系，它包括有機化合物的輔因子依賴性酶促轉(zhuǎn)化以及在同一體系中利用來源于博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)(或基于它們的突變體)的甲酸脫氫酶的酶輔因子的再生。
用生物催化方法對具有光學(xué)活性的有機化合物(例如乙醇和氨基酸)的分離變得越來越重要。偶聯(lián)使用兩種可進(jìn)行輔因子再生的脫氫酶已經(jīng)證實是大規(guī)模工業(yè)化合成這些化合物的一種方法(DE 197 53 350)。
圖示1 在三甲基丙酮酸被還原性氨基化為L-假亮氨酸的過程中，用來源于博伊丁假絲酵母的NAD依賴性甲酸脫氫酶原位再生NADH(Bommarius et al.Tetrahedron Asymmetry1995，6，2851-2888)。
與大量的合成的含金屬催化劑比較，有效應(yīng)用于水性介質(zhì)的生物催化劑除它們的催化特性以及有效性以外，還具有的其它優(yōu)點是可以避免使用含金屬的添加材料，特別是含有重金屬并因此有毒的添加材料。此外，例如在不對稱還原作用的過程中，也可以避免使用昂貴及可能有害的還原劑，例如硼烷。
然而，在微溶于水的底物的轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)了難題。對于微溶于水的產(chǎn)物也存在著同樣的難題。特別是在根據(jù)上述觀點制備具有光學(xué)活性的醇上便存在這一難題，因為所需的作為原料化合物的酮比圖示1中所采用的α-酮酸有著顯著更低的溶解度。
原則上一個可能的解決方法是用一種醇脫氫酶和一種甲酸脫氫酶在一種極性有機溶劑或其水溶液中實施生物催化還原。在這種情況中，酶和底物兩者以及任選地產(chǎn)物都應(yīng)當(dāng)是可溶的。然而，直接出現(xiàn)有機溶劑的一個常見缺點在于，在這些條件下通常發(fā)生酶活性的相當(dāng)大的減低(見，例如，Anderson et al.，Biot.echnol.Bioeng.1998，57，79-86)。特別是，來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶是至今在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中所采用的并且是商品化可獲得的唯一一種NADH再生酶，遺憾的是它對有機溶劑有著高敏感性(EP 1 211 316)。在使用DMSO、環(huán)丁砜、MTBE、丙酮、異丙醇和乙醇等有機溶劑成分的對比例1中也顯示了這一點，每種溶劑的補給量只有10％體積(見圖1)。
為解決這個問題的各種已知的方法都考慮到要穩(wěn)定有機溶劑中的來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶，例如通過以表面活性物質(zhì)的形式附加使用表面活性劑進(jìn)行反應(yīng)。但這種方法的缺點是，反應(yīng)的速度被降低近40倍(！)，并且會出現(xiàn)對甲酸脫氫酶的抑制(B.Orlich et al.，Biotechnol.Bioeng.1999，65，357-362.)。作者另外注意到，因為醇脫氫酶的低穩(wěn)定性，微乳狀液條件下的還原方法是不經(jīng)濟(jì)的。在EP 340 744中所描述的方法原則上也具有相同的缺點，其中在存在水相和/或有機相的情況下將易溶中間相(lyotropic mesophases)選為反應(yīng)位點。
實現(xiàn)生物催化反應(yīng)的另一種基本可能性包括在有機溶劑中應(yīng)用固定化酶或在由水和易混于水的有機溶劑組成的均質(zhì)溶液中應(yīng)用酶。然而將這些有機溶劑與酶發(fā)生直接接觸的技術(shù)僅在少數(shù)的酶類獲得成功，特別是水解酶。例如，在DE 44 36 149中提及“只有少數(shù)屬于水解酶類的酶耐受有機溶劑(易混于水的或與非易混于水的)的直接存在”。盡管在此期間已知有其它酶類的一些其它實例(包括醇腈酶和來源于酵母的FDH)，但DE 44 36 149中的陳述對大多數(shù)酶而言仍是正確的。例如，來源于博伊丁假絲酵母的FDH能否有效固定化是未知的。另外，與固定化本身相關(guān)的是固定化步驟及固定化材料所帶來的額外費用。
因此，工業(yè)上已經(jīng)發(fā)展了新的方法以避免因有機溶劑的存在而引起的酶失活或變性的危險。例如，DE 44 36 149描述了一種方法，其中通過產(chǎn)物可通透性膜將產(chǎn)物從反應(yīng)溶液提取到有機溶劑中，特別是通過一種疏水性膜。然而，與攪拌罐反應(yīng)器中的標(biāo)準(zhǔn)方法比較，本發(fā)明無疑在技術(shù)上有著更多的要求；另外，所需的有機膜也是增加額外費用的因素。另外，本方法只適合于連續(xù)運作。而且，一個缺點是用這個方法得到的時空產(chǎn)率相對較低。例如，在乙酰苯的還原過程中，所得到的時空產(chǎn)率只有88g/(L*d)(S.Rissom etal.，TetrahedronAsymmetry1999，10，923-928)。關(guān)于這一點，要注意到乙酰苯本身是相當(dāng)好的水溶性酮，而絕大多數(shù)類似的取代乙酰苯的酮以及相關(guān)的酮具有顯著更低的可溶性，因此常見的疏水性酮的時空產(chǎn)率應(yīng)當(dāng)是明顯更低的。盡管存在這些相當(dāng)大的缺點，但是該方法至今還被認(rèn)為是用單個酶不對稱生物催化還原弱可溶性酮的優(yōu)選方法(也見A.Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，IndustrialBiotransformations，Wiley-VCH Verlag，Weinheim，2000，pp.103-106)。
綜上所述，因此可以注意到現(xiàn)在還不知道有方法可以有助于避免上面羅列的缺點，以及容許利用“直接”存在于有機溶劑中的來源于博伊丁假絲酵母(或基于它們的突變體)的甲酸脫氫酶以工業(yè)化規(guī)模酶促制備微溶于水的底物。
因此本發(fā)明的目的是說明一種可能性，具體為如何能夠充分有效地使得微溶于水的有機化合物進(jìn)行偶聯(lián)的輔因子依賴性酶促轉(zhuǎn)化，以便在有利于經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的條件下實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的工業(yè)化規(guī)模的應(yīng)用。特別的，一個目的是這種方法應(yīng)當(dāng)適合用于微溶于水的酮的還原并且應(yīng)當(dāng)容許使用“直接”存在于有機溶液中的來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶(即沒有被疏水性膜隔離)。
這個目的是以權(quán)利要求書中所定義的方式而實現(xiàn)的。權(quán)利要求1到8涉及一種根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行操縱的反應(yīng)體系。權(quán)利要求9保護(hù)一種裝置。權(quán)利要求10涉及一種根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行操縱的方法，而權(quán)利要求11和12涉及根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系的優(yōu)選用途。
本發(fā)明能夠提供這樣一種偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系，其包含，在一種水相與液態(tài)有機相直接接觸的雙相溶劑體系中，用醇脫氫酶對有機化合物進(jìn)行NADH依賴性酶促轉(zhuǎn)化以及用來源于博伊丁假絲酵母或其突變體的甲酸脫氫酶進(jìn)行NADH的酶促再生，基于這一點，獲得了對上述目的的解決方案，尤其是以令人驚訝的、決無可預(yù)計的、且根據(jù)本發(fā)明是特別有利的一種方式獲得了該解決方案。與從本領(lǐng)域的現(xiàn)狀所能推定出的觀點不同，令人驚奇地是，盡管存在有機溶劑，但仍能夠進(jìn)行該偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系，且不存在由該溶劑所造成的其中一種酶的活性的減低，特別是來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶的活性的減低，且該反應(yīng)體系的時空產(chǎn)率足以滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。也可以采用來源于博伊丁假絲酵母生物體本身的FDH或相同生物體的進(jìn)一步發(fā)展的重組突變體的FDH(DE197 53 350)。特別有利的是使用具有C23S/C262A氨基酸取代的突變體。與之相關(guān)的特別令人驚訝的事實是，盡管已經(jīng)觀察到博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶具有與有機溶劑相關(guān)的高度不穩(wěn)定性(見實施例部分的對比例1)，但在這些條件下它也可以被十分有效地使用。
在反應(yīng)體系中所使用的有機溶劑是用來與存在的水相形成如上述所解釋的兩個分離相。在這個要求的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域人員原則上可以自由地選擇有機溶劑。然而，如果所選定的有機相的溶劑具有盡可能低的在水中的溶解度(logP值≥3、優(yōu)選的≥3.1、更優(yōu)選的≥3.2等)，已經(jīng)被證實是有利的。既然有機溶劑同時也用來吸納微溶于水的離析物，那么所述的溶劑具有對所使用的有機化合物的盡可能高的溶解度也是重要的。
在反應(yīng)體系中可以優(yōu)選地采用的這種類型的有機溶劑是在給定的反應(yīng)條件下為液態(tài)的芳香族或脂肪族烴。特別的，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷以及它們的側(cè)鏈異構(gòu)體也是十分特別優(yōu)選的。也可以使用鹵代烴(CHCl3、CH2Cl2、氯苯等)。可以考慮使用芳香烴、甲苯、二甲苯或苯。
可以任意選擇有機溶劑與水部分的數(shù)量比例。所使用的有機溶劑的相對于總體積的量是5-80vol％、優(yōu)選的10-60vol％、特別優(yōu)選的50vol％左右。
根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)狀所用的方法，為了增加酶促轉(zhuǎn)化，需向酶反應(yīng)混合物中添加表面活性劑，其中在反應(yīng)過程中的相變被最小化，與此不同的是，本發(fā)明證實，使用根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系，在體系中不含表面活性劑時，可相當(dāng)成功地進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化。
文章中的名詞“表面活性劑”被理解為指的是所有那些能夠建立膠束結(jié)構(gòu)或能夠減低液-液相分界上的表面張力的物質(zhì)。
如已說明的那樣，在反應(yīng)體系中所使用的底物的濃度應(yīng)當(dāng)是從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)有利于完成轉(zhuǎn)化的濃度。因此，反應(yīng)開始前的有利的有機化合物的濃度應(yīng)當(dāng)是每升總體積溶劑(＝有機溶劑和水部分的總和)＞25mM、優(yōu)選＞100mM、特別優(yōu)選＞200mM、以及十分特別優(yōu)選＞500mM。濃度的上限是由確保反應(yīng)的可行性所自然地決定的；特別的，在每種情況下都應(yīng)當(dāng)達(dá)到反應(yīng)混合物的可攪拌性。然而，反應(yīng)也可以優(yōu)選在超過底物或產(chǎn)物的飽和度限度的濃度情況下進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，為了將酮基轉(zhuǎn)化為醇基的目的，本領(lǐng)域人員可以在所有被考慮的酶反應(yīng)中采用所具體提及的偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系。然而，優(yōu)選設(shè)定的是氧化還原酶反應(yīng)。本方法適合于使用任何類型的醇脫氫酶。根據(jù)本發(fā)明所使用的醇脫氫酶優(yōu)選地來源于生物體紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(S-ADH)或高加索酸奶乳桿菌(Lactobacilluskefir)(R-ADH)(ADH derived from R.erythropolisJ.Peters，T.Zelinski，M.-R.Kula，Purification and characterization of a novel carbonyl reductasesilated from Rhodococcus erythropolis，J.Biotechnol.1994，33，283-292)(ADN derived from Lactabacillus kefirC.W.Bradshaw，W.Hummel，C.-H.Wong，Lactobacillus kefir Alcohol DehydrogenaseA Useful Catalyst forSynthesis，J.Org.Chem.1992，57，1532-1536.)。
在下一個進(jìn)展中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化有機化合物的裝置，它包括根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系。利于被采用的裝置是例如可以被分批操縱或連續(xù)操縱的攪拌罐或攪拌罐級聯(lián)、或膜反應(yīng)器。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，名詞“膜反應(yīng)器”被理解為指的是任何反應(yīng)容器，其中催化劑被密封于反應(yīng)器中而小分子物質(zhì)能被添加到反應(yīng)器或能與之分離。同時，膜可以被直接地插入到反應(yīng)槽中或可以被安裝在外面的獨立的過濾組件中，其中反應(yīng)溶液連續(xù)或間斷地流經(jīng)過濾組件而存留物被循環(huán)回到反應(yīng)器內(nèi)。在WO 98/22415和在Wandrey et al.in Jahrbuch 1998，Verfahrenstechnik and Chemieingenieurwesen，VDI p 151ff.；Wandrey et al.in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，Vol.2，VCH 1996，p 832ff.；Kragl et al.，Angew.Chem.1996，6，684 f中描述了適宜的實施方案。除操縱的分批和半連續(xù)模式外，在該裝置中還可進(jìn)行連續(xù)模式的操縱，這可根據(jù)需要以交叉流過濾模式(圖4)或死端式過濾的形式(圖3)而實現(xiàn)。在本領(lǐng)域的現(xiàn)狀中原則上描述了這兩種方法的變更方法(Engineering Processes for Bioseparations，Ed.L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey etal.，Tetrahedron Asymmetry 1999，10，923-928)。
發(fā)明的下一個進(jìn)展是關(guān)于一種通過應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系對有機化合物進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化的方法。方法優(yōu)選的是涉及制備富含對映體的有機化合物優(yōu)選是手性醇的方法。本領(lǐng)域人員根據(jù)已描述的反應(yīng)體系以及下面的實施例能完成方法的設(shè)計。在給定的界限條件下，合理地設(shè)定酶促轉(zhuǎn)化的其它已知的條件。
本發(fā)明的下一個方面也是關(guān)于根據(jù)本方面的反應(yīng)體系在有機化合物的酶促轉(zhuǎn)化或有機化合物優(yōu)選是醇的鑒定或分析的方法中的用途。在進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系被如上所述用于制備富含對映體的有機化合物(優(yōu)選是醇)的方法中。
令人驚訝的是，來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶(FDH)具有與雙相溶劑體系相關(guān)的非常好的穩(wěn)定性。根據(jù)關(guān)于來源于博伊丁假絲酵母的FDH在各種溶劑體系中的長時間穩(wěn)定性的試驗可以說明這一點。根據(jù)本發(fā)明的對比例1以及本發(fā)明的實施例2，在這些試驗中，選擇相應(yīng)的對應(yīng)于總體積的10％和20％的有機溶劑的比例。與水溶性的有機溶劑相反(見對比例1)，它導(dǎo)致來源于博伊丁假絲酵母的FDH衍生物的快速失活，在雙相體系中，特別是當(dāng)使用前述的烴成分例如正己烷時，甚至在數(shù)天后仍能觀察到來源于博伊丁假絲酵母(在這些實施例中所用的是雙重突變形式)的甲酸脫氫酶的出眾的穩(wěn)定性特性。例如，酶活性在丙酮或DMSO中在24小時內(nèi)相應(yīng)地減少35％或66％，然而在20vol％的己烷中，甚至在3天后仍能看到90％的酶活性。正己烷的結(jié)果(實施例2)圖解地表示于圖1中并列于表3中。在圖1和表1中同樣記錄了其它有機溶劑的對比例。
根據(jù)本發(fā)明，在已經(jīng)描述的方法中也可以采用不易混于水的并因此與水形成雙相的其它有機溶劑。例如，用有機溶劑的比例為20％的正庚烷的有機溶劑成分也可能獲得非常高的穩(wěn)定性。在這種情況下，27小時后的穩(wěn)定性為出眾的99.8％(見實施例3和表4)。因此它的活性以完全令人驚異的方式仍顯著地高于純水溶液中的活性，說明在使用雙相體系中，來源于博伊丁假絲酵母的FDH具有意料不到的穩(wěn)定性(也見實驗部分，
此外，注意到在使用具有更高的有機溶劑的體積比例的雙相體系的情況時，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系可以成功地完成酶促轉(zhuǎn)化。用更高溶劑比例的正庚烷所進(jìn)行的試驗證實了這一點(見實施例3，表4)。對于60％有機溶劑體積比例的正庚烷，同樣可以保持長時間的高活性，清楚地顯示27小時后的殘留活性為82.8％。在圖2圖解地說明了與不同體積比例的有機溶劑相關(guān)的長時間穩(wěn)定性的有關(guān)結(jié)果(根據(jù)實施例3，表4)。
根據(jù)醇脫氫酶/NADH/FDH/甲酸體系所提供的實施例可以說明本發(fā)明。通過該反應(yīng)體系可以從相應(yīng)的酮開始不對稱地合成醇。
圖示2 實驗實施例 (S)-1-(對氯苯基)乙醇 (S)-1-苯氧基丙烷-2-醇(R)-2-氯-1-(間氯苯基)乙醇(見實施例4)(見實施例5) (見實施例6)69％轉(zhuǎn)化率， ＞95％轉(zhuǎn)化率， 77％轉(zhuǎn)化率，＞99％對映選擇性 ＞99.8％對映選擇性 ＞99.2％對映選擇性反應(yīng)混合物的處理通過MtBE的萃取以及通過蒸發(fā)而濃縮有機相而實現(xiàn)。用這個方法在裝置中以非常簡單的方式得到相應(yīng)的醇，產(chǎn)率為69％以及對映選擇性為99％(實施例4)。
但是用其它酮作為原材料也能獲得出色的對映選擇性。例如在這些反應(yīng)條件下，苯氧基丙酮經(jīng)還原生成了對映純度的產(chǎn)物，經(jīng)定量為＞99.8％ee(實施例5)。
但是，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)體系也適用于空間要求的酮。以α，m-二氯乙酰苯為例以示例的方式證實了這一點。該酮在甲基和在芳香環(huán)上都被氯原子取代。在雙相體系中的生物催化還原生成了所需的產(chǎn)物2-氯-1-(間氯苯基)乙醇，也有出眾的對映選擇性＞99.2％(實施例6)。其轉(zhuǎn)化率為77％左右。
這些高的轉(zhuǎn)化率及對映選擇性是令人驚奇的，原因是常常觀察到因為有機溶劑的存在不僅降低了酶活性(伴有低轉(zhuǎn)化率)也改變了酶的立體特異性的特性(伴有對映選擇性的降低)。
然而在本文中，提高底物濃度的試驗結(jié)果證實是特別地令人驚奇。這些試驗采用了對氯乙酰苯作為示范底物。如果在上述的試驗中，10mM的底物濃度(這個底物濃度對應(yīng)于本領(lǐng)域現(xiàn)有試驗中的濃度)獲得69％的轉(zhuǎn)化率(實施例4)，那么，與普遍的觀點即由于抑制作用等原因提高底物濃度只會使得產(chǎn)量減低相反，提高底物濃度能增加這類反應(yīng)的產(chǎn)量，現(xiàn)在從20mM濃度開始，可獲得更高的轉(zhuǎn)化率75％(40mM)以及74％(100mM)(實施例7、8；圖示3；圖5)。
圖示3 因此這個方法也特別適合用于對高底物濃度的酮的酶促還原。
本方法的一個主要優(yōu)點是它的簡便性。例如，不包括復(fù)雜的工藝步驟，可以在分批反應(yīng)器中和連續(xù)地實施本方法。同樣，與較早的方法不同，不需要分離水性介質(zhì)與有機介質(zhì)的特殊膜。在這個方法中也不需要在一些以往方法中所需添加的表面活性劑。另一個主要的優(yōu)點在于，首次使得在技術(shù)上意義重大的＞25mM的底物濃度條件下進(jìn)行具有光學(xué)活性的醇的酶促制備成為可能。從本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法中不能得到這些優(yōu)點。
名詞“富含對映體”指定的是在混合物中一種光學(xué)對映體對另一種光學(xué)對映體的比例要大于50％。
對于存在有一個立體中心的情況，所描繪的結(jié)構(gòu)涉及兩種可能的對映體，對于分子中多于一個立體中心的情況，所描繪的結(jié)構(gòu)涉及所有的可能的非對映立體異構(gòu)體，對于一種非對映立體異構(gòu)體，包括所討論的化合物的可能的兩種對映體。
生物體博伊丁假絲酵母保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC 32195，并且是公眾可獲得的。
根據(jù)本發(fā)明，“偶聯(lián)酶促體系”這一表述被理解為指的是有機化合物的酶促轉(zhuǎn)化的發(fā)生伴有輔因子的消耗，并且輔因子被第二種酶體系(這里是來源于博伊丁假絲酵母或它們的突變體的FDH)原位再生。因此，這減少了昂貴的輔因子的使用。
本申請所公開的內(nèi)容一并包括在本文中已經(jīng)被提及的本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)。


圖3顯示了具有死端式過濾的膜反應(yīng)器。通過泵2將底物1轉(zhuǎn)移到含有膜5的反應(yīng)器槽3中。除溶劑外，位于攪拌器驅(qū)動的反應(yīng)器槽中的還有催化劑4、產(chǎn)物6和未轉(zhuǎn)化的底物1。低分子產(chǎn)物6主要通過膜5濾出。
圖4顯示了具有交叉流過濾的膜反應(yīng)器。這里通過泵8將底物7轉(zhuǎn)移到被攪拌的也包含溶劑、催化劑9和產(chǎn)物14的反應(yīng)器槽中。通過泵16驅(qū)動溶劑流經(jīng)任選地存在的熱交換器12到達(dá)交叉流過濾比色皿15。這里低分子產(chǎn)物被膜13分開。隨后高分子催化劑9隨溶劑流動一起被轉(zhuǎn)運回到反應(yīng)器10內(nèi)，任選地再次經(jīng)過熱交換器12，任選地經(jīng)過閥11。
實驗部分實施例1(應(yīng)用來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的FDH活性的對比例)稱量2.72g(0.8mol/L)甲酸鈉和1.14g(0.1mol/L)磷酸氫二鉀三水化物，并溶解于40mL去離子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相應(yīng)的稀釋液將溶液的pH值調(diào)至8.2。然后將溶液轉(zhuǎn)移到50mL量瓶內(nèi)并用去離子H2O將其完全注滿。與這些分開進(jìn)行的是，稱量71.7mg(4mmol/L)NAD+三水化物并溶解于約20mL去離子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相應(yīng)的稀釋液將溶液的pH值調(diào)至8.2。然后將溶液轉(zhuǎn)移到25mL量瓶內(nèi)并用去離子H2O將其完全注滿。隨后，在每種情況中，將500μl底物溶液以及NADH溶液混合于被用于測定的1cm比色皿中。在加入10μl酶溶液后，其中使用的溶劑是含有10％有機溶劑的水溶液(見表)，進(jìn)行短時間的搖晃，將比色皿置于光度計中，并開始記錄數(shù)據(jù)。在開始測定之前首先直接加入酶溶液。通過光度測定NAD+形成NADH的反應(yīng)，確定特定時間段后的來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的活性。在溫度為30℃、340nm波長下進(jìn)行光度測定，測定時間為15分鐘。在下面的表1和表2中顯示了結(jié)果。
表1.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為溶劑和時間的函數(shù)。

表2.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為溶劑和時間的函數(shù)。

實施例2(來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH活性的測定)根據(jù)實施例1的說明進(jìn)行活性的測定，將己烷用作有機溶劑成分。
結(jié)果列于下面的表3中。
表3.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為己烷和時間的函數(shù)。

實施例3(來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH活性的測定)根據(jù)實施例1的說明進(jìn)行活性的測定，將正庚烷用作有機溶劑成分。結(jié)果列于下面的表4中。以百分比的形式給出評估，且在每種情況中每個底物濃度的結(jié)果都是相對于被定義為100％的初始活性的結(jié)果。
表4.來源于博伊丁假絲酵母(雙重突變體C23S/C262A)的FDH的酶活性單位U/mL，表示為庚烷和時間的函數(shù)。

實施例4(對氯乙酰苯的轉(zhuǎn)化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達(dá)于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應(yīng)混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進(jìn)行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉(zhuǎn)化率69％對映選擇性＞99％ee實施例5(苯氧基丙酮的轉(zhuǎn)化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達(dá)于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為苯氧基丙酮(76.0mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應(yīng)混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進(jìn)行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉(zhuǎn)化率95％對映選擇性＞99.8％ee實施例6(2，3’-二氯乙酰苯的轉(zhuǎn)化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達(dá)于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為2，3’-二氯乙酰苯(102.7mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應(yīng)混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進(jìn)行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉(zhuǎn)化率77％對映選擇性＞99.2％ee實施例7(40mM的對氯乙酰苯的轉(zhuǎn)化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達(dá)于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到組成為對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的2.5mL正庚烷及10mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應(yīng)混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進(jìn)行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉(zhuǎn)化率75％實施例8(100mM的對氯乙酰苯的轉(zhuǎn)化)將10.1U醇脫氫酶(來源于紅串紅球菌)和10U甲酸脫氫酶(來源于博伊丁假絲酵母的FDH，表達(dá)于E.coli，雙重突變體C23S/C262A)添加到含有對氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸鈉(50mM)和NADH(2mM)的1mL正庚烷及4mL磷酸緩沖液的溶液中。將形成的反應(yīng)混合物在30℃下攪拌21小時。隨后用3×25mL MTBE進(jìn)行萃取操作，用硫酸鈉干燥所收集的有機相。測定在真空管中去除溶劑后所得到的粗產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(用1H-NMR光譜測定)和對映選擇性(用手性GC)。
轉(zhuǎn)化率74％
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系，包括在水相與液態(tài)有機相相接觸的一種雙相溶劑體系中，用醇脫氫酶對有機化合物進(jìn)行NADH依賴性酶促轉(zhuǎn)化，并用來源于博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)或其突變體的甲酸脫氫酶對NADH進(jìn)行酶促再生。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)體系，其特征在于，所使用的有機溶劑具有盡可能低的在水中的溶解度，而對于所使用的有機化合物來說，所述有機溶劑具有盡可能高的溶解度。
3.權(quán)利要求1或2的反應(yīng)體系，其特征在于，將在反應(yīng)條件下為液態(tài)的芳香族或脂族烴，特別是那些logP值＞3的烴，用作有機溶劑。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的反應(yīng)體系，其特征在于所述有機溶劑的量為總體積的10-60vol％。
5.前述權(quán)利要求中任一項的反應(yīng)體系，其特征在于，在反應(yīng)開始前所述有機化合物的濃度為＞25mM每升溶劑混合物，特別是＞100mM每升溶劑混合物。
6.前述權(quán)利要求中任一項的反應(yīng)體系，其特征在于，該體系不含表面活性劑。
7.前述權(quán)利要求中任一項的反應(yīng)體系，其特征在于，將來源于高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)的醇脫氫酶用作轉(zhuǎn)化所述有機化合物的酶。
8.權(quán)利要求1到6中任一項的反應(yīng)體系，其特征在于，將來源于紅串紅球菌(Phodococcus erythropolis)的醇脫氫酶用作轉(zhuǎn)化所述有機化合物的酶。
9.一種用于轉(zhuǎn)化有機化合物的裝置，包括權(quán)利要求1的反應(yīng)體系。
10.一種通過應(yīng)用權(quán)利要求1的反應(yīng)體系對有機化合物進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化的方法。
11.權(quán)利要求1的反應(yīng)體系用于有機化合物的酶促轉(zhuǎn)化或優(yōu)選地用于醇的鑒定或分析的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，用于制備富含對映體的有機化合物的方法中，優(yōu)選為用于制備富含對映體的醇的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在由有機相和水相組成的雙相體系中實施的偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系。所述體系用輔因子依賴性酶進(jìn)行操縱，所述輔因子用來源于博伊丁假絲酵母的FDH連續(xù)地酶促再生。
文檔編號C12P7/02GK1668753SQ03817328
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月20日
發(fā)明者哈拉爾德·格勒格爾, 維爾納·胡梅爾 申請人:德古薩股份公司