專利名稱：切向流過濾設(shè)備和白細胞富集方法
有關(guān)申請本申請要求美國臨時專利申請序列號60/390,730的優(yōu)先權(quán)，該申請于2002年6月19日提出，此處引用全文作為參考。
背景技術(shù)：
在研究和治療當(dāng)中經(jīng)常需要使用富集了白細胞的血細胞群。白細胞的一般來源包括全部外周血、白細胞去除術(shù)或單采血液成分術(shù)產(chǎn)物，或者是其他較少見的來源，例如臍帶血。白細胞的富集可以通過幾條途徑完成。一般方法包括密度等級梯度(比如FICOLL-HYPAQUE、硅膠等等)、洗脫、離心、通過低滲沖擊裂解紅細胞以及這些方法的各種組合。這些方法每個都具有缺點，其中之一就是富集步驟之后需要進行費力的洗滌過程。
細胞一般在富集后經(jīng)過重復(fù)的步驟洗滌。這些步驟通常包括將富集的細胞懸液置于離心管中，使用離心機將細胞沉淀到管底。將管從離心機取出，將上清從細胞沉淀輕輕移走。將洗滌液加入管中，重懸細胞沉淀。這些步驟一般重復(fù)2～4次。
這個洗滌過程的一個缺點是后續(xù)的重懸和離心會降低細胞活力并增加細胞裂解。通過離心洗滌的另一個缺點是細菌或其他感染劑污染細胞的機會。即使所有材料都保持無菌，重復(fù)的打開離心管、洗滌液瓶和移液管暴露于空氣中，也會導(dǎo)致污染。對于一些醫(yī)療管理機構(gòu)，污染的風(fēng)險足夠顯著到要求在細胞處理過程中僅僅使用“封閉”系統(tǒng)。
還使用過濾方法從血液中去除白細胞而保留其他血液成分供以后使用。這些方法通常將白細胞以不可回收的形式捕獲于過濾器上，但是允許其他血液成分通過過濾器并且進入收集容器中。例如，可以使用過濾器從血液中去除白細胞，從而將輸血后的同種免疫反應(yīng)發(fā)生率降至最低。去除一般使用由纏結(jié)的塑料纖維網(wǎng)制成的過濾器完成。此網(wǎng)經(jīng)常用來將白細胞捕獲于具有足夠深度的網(wǎng)狀矩陣中，使得細胞在遍及過濾器的深度被捕獲，從而防止過濾器被堵塞，這是將白細胞捕獲于一個平坦表面時可能發(fā)生的。
除了物理捕獲細胞之外，過濾器的材料和巨大的表面積也允許白細胞不可逆的粘附于其表面。這些粘附的細胞當(dāng)中有許多正是一些醫(yī)療程序所需求的。由捕獲和粘附到過濾器得到的組合產(chǎn)生了一種高效的去除白細胞的方法，用于在輸血治療之前的處理。然而，當(dāng)白細胞是需要的細胞時，這種方法并不有利。
對多種粒子分級曾有用的一種方法是切向流過濾(tangentialflow filtration)(TFF)或“交叉流”(cross-flow)過濾。TFF依賴于流體平行于多孔透水膜過濾器表面的移動。膜孔允許流體和流體中比孔小的粒子通過。另外，平行于過濾器的流體的交叉流(或“切向”流)防止了比孔大的粒子在過濾器表面的阻塞。
TFF曾用于多種材料的粗分離。對切向流過濾在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用由Genovesi綜述(J.Parenter.Aci.Technol.，3781，1983)，包括注射用消毒水的過濾、溶劑系統(tǒng)的凈化和酶從肉湯和細菌培養(yǎng)基的過濾。Marinaccio等人(WO 85/03011)報告了用于從血液中去除微粒血成分的血漿去除法方法，Robinson等人(美國專利5,423,738)描述了TFF在從血液去除血漿中的用途，從而允許血細胞和血小板回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
在另一個用途中，TFF被報告用于啤酒過濾(EP 0 208 450)，特別是去除例如酵母細胞和其他懸浮固體的微粒。Kothe等人(美國專利4,644,056)公布了TFF在從乳汁或初乳中純化免疫球蛋白中的用途，Castino(美國專利4,420,398)描述了TFF在從含有抗病毒物質(zhì)和病毒顆粒、細胞的肉湯中分離抗病毒物質(zhì)(例如干擾素)中的應(yīng)用。類似的，TFF還曾用于從細胞碎片中分離細菌酶(Quirk等人，EnzymeMicrob.Technol.，6201，1984)。另外，切向流過濾單元還在濃縮懸浮于培養(yǎng)基中的細胞中得到使用。(見例如Radlett，J.Appl.Chem.Biotechnol.，22495，1972.)最近還報告TFF用于根據(jù)大小來分離脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒(Lenk等人，美國專利5,948,441)。TFF允許脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒的形成和分離，兩者在這些粒子的異源群體中具有確定的大小范圍(如前，見Lenk等人)。
但是，盡管TFF曾被用于生物液體粗分級和諸如脂質(zhì)體的分離，但本領(lǐng)域還沒有認識到TFF在分離具有確定特征的不同活細胞群中的用途。尤其是在保持無菌、細胞活力、造血分化潛能和免疫治療細胞活性的情況下，選擇性的將白細胞群(例如單核細胞、CD34+造血干細胞和祖細胞、樹突狀祖細胞等等)與其他血細胞分離的相關(guān)聯(lián)的獨特問題沒有被解決。另外，現(xiàn)有方法還未解決其它細胞群如具有重疊大小范圍的細胞群的去除。
因此，該領(lǐng)域仍需要另外的設(shè)備和方法用于在保持無菌、細胞活力、分化潛能和免疫治療細胞活性的同時，從包括血漿、紅細胞和/或血小板在內(nèi)的其他血液成分當(dāng)中選擇性富集白細胞。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及白細胞從血液的分離和血液制劑。特別是通過使用切向流過濾設(shè)備制備富集白細胞的細胞群。提供了使用該設(shè)備制備富集的白細胞群和富集的單核細胞群、CD34+造血干細胞和前體細胞群等等的方法。使用本發(fā)明設(shè)備和方法獲得的富集白細胞和/或單核細胞等細胞群可以用來制備給予個人來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗體呈遞細胞(例如抗體呈遞樹突細胞)的組合物，制備誘導(dǎo)上皮細胞、神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞或肝細胞形成的多能干細胞(例如f-巨噬細胞(f-MΦ))組合物，制備包括富集的造血干細胞或前體細胞等的組合物。
本發(fā)明的切向流過濾設(shè)備包括去除器(remover)單元，其具有交叉流室、濾過物室和置于兩者之間的過濾器。過濾器的一側(cè)，即保留物表面，與交叉流室流體交流，另一面，即濾過物表面，與濾過物室流體交流。交叉流室有一個入口，適合將含有白細胞的血液成分樣品引入交叉流室，并與過濾器保留物表面平行。交叉流室中還提供一個出口，居中置于室中與過濾器保留物表面相對的部分。適于應(yīng)用于切向流過濾設(shè)備中的過濾器一般具有約1至約10微米的平均孔徑。在某些實施方案中，過濾器具有約3至約7微米，或者約3至約5.5微米的平均孔徑。
另外，該設(shè)備可以包括用于提供預(yù)設(shè)輸入速率的樣品進入交叉流室入口的裝置，以及控制濾過物通過過濾器、進入濾過物室的過濾速率的裝置。過濾速率控制裝置限制過濾速率使其低于過濾器的非對抗過濾速率(unopposed filtration rate)。包括血液成分的樣品可以由來源設(shè)備例如白細胞去除術(shù)設(shè)備，或含有從諸如從白細胞去除術(shù)設(shè)備收集的樣品的容器等提供。
此外，切向流過濾設(shè)備可以包括回收單元?；厥諉卧ㄒ粋€出口和一個入口，可與去除器單元的交叉流室相互連接為環(huán)狀。在本設(shè)備的這個實施方案中，交叉流室入口與回收單元出口流體交流，交叉流室出口與回收單元入口流體交流。此外回收單元可以還包括樣品入口和洗滌液入口。在某些切向流過濾設(shè)備的實施方案中，樣品入口和洗滌液入口是單一的共用入口。一般，洗滌液入口與置換液或洗滌液來源流體交流。置換液或洗滌液可以是，例如，等滲緩沖液或組織培養(yǎng)基。
回收單元樣品入口與血液成分來源流體交流。在本發(fā)明的一個實施方案中，血液成分來源是細胞處理設(shè)備。細胞處理設(shè)備可以是白細胞去除術(shù)設(shè)備或是能夠產(chǎn)生部分富集了白細胞的細胞群的設(shè)備。在一個實施例中，細胞處理設(shè)備包括具有第一端口(port)和第二端口的容器、與第一端口和第二端口流體交流的單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)、將基質(zhì)保持在容器中并且具有足以允許單核樹突細胞前體和樹突細胞通過的濾膜(screen)。該設(shè)備此外包含與第一或第二端口流體交流的排放管道，以及與第一或第二端口流體交流的收集管道，其也與切向流過濾設(shè)備回收單元樣品入口流體交流。
細胞處理設(shè)備也可以包括多個提供結(jié)合介質(zhì)、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液的流體來源。該設(shè)備可另外包括將多種流體轉(zhuǎn)運到細胞處理設(shè)備內(nèi)外的泵。也提供了溫度控制裝置，例如加熱或冷卻裝置。本發(fā)明的一個提供閉合系統(tǒng)的實施方案中，血液樣品或血產(chǎn)品制劑被提供給細胞處理設(shè)備，細胞處理設(shè)備包括能粘附單核樹突細胞前體的珠子材料。血液樣品可以和珠子材料接觸足夠長的時間來粘附單核樹突細胞前體，設(shè)備中其他細胞成分通過排放管線被洗滌掉。將洗脫緩沖液加入細胞處理設(shè)備，單核樹突細胞前體無菌通過收集管線進入回收單元的樣品入口，用于進一步富集血液樣品中的單核細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供針對白細胞對血液成分樣品富集的切向流過濾設(shè)備，該設(shè)備包括含有被過濾器分隔的交叉流室和濾過物室的去除器單元，其中交叉流室具有出口和入口，出口居中置于室上部，其中入口置于過濾器上方，引導(dǎo)流體基本平行于過濾器進入交叉流室；提供預(yù)設(shè)輸入速率的樣品通過交叉流室入口裝置；以及降低通過過濾器的過濾速率的裝置；其中過濾器具有約3至約7微米的孔徑，樣品由此在交叉流室中的保留物中富集了白細胞。此外，在另一個特定的實施方案中，過濾器具有大約3至約5.5微米的孔徑來富集CD34+白細胞的細胞群。
本發(fā)明另一個實施方案中，提供用于針對單核細胞對血液成分樣品富集的切向流過濾設(shè)備，該設(shè)備包括含有位于過濾室下方并被過濾器分隔的交叉流室，其中交叉流室具有出口和入口，出口居中置于室的較下部分，其中入口置于過濾器下方，引導(dǎo)流體基本平行于過濾器進入交叉流室；用于提供預(yù)設(shè)輸入速率的樣品通過交叉流室入口的裝置；保持通過過濾器過濾速率的裝置；其中過濾器具有約為3至約7微米的孔徑；樣品由此在交叉流室中的保留物中富集了白細胞。此外，在另一個特定的實施方案中，過濾器具有約為3至約5.5微米的孔徑，來富集CD34+白細胞的細胞群。
在本發(fā)明另一個實施方案中，提供用來富集包括血液成分的樣品的切向流過濾設(shè)備，該設(shè)備包括具有被過濾器(5)分隔的交叉流室(3)和濾過物室(4)的去除器單元(1)，交叉流室有入口(6)和出口(7)，出口在入口上方，居中置于室的上部，其中過濾器置于交叉流室入口下方并與其基本平行。該裝置此外包括用于提供預(yù)設(shè)輸入速率的樣品通過交叉流室入口的裝置；用于提供流體通過過濾器的預(yù)設(shè)過濾速率的裝置，其中預(yù)設(shè)過濾速率約為預(yù)設(shè)輸入速率的五分之一到百分之一；以及用于提供樣品中預(yù)設(shè)濃度的血細胞的裝置，其中血細胞預(yù)設(shè)濃度一般約為每毫升107至1010個細胞。一般，過濾器具有約3至約7微米的孔徑。此外，在另一個特定的實施方案中，過濾器具有約3至約5.5微米的孔徑來富集CD34+白細胞的細胞群。
本發(fā)明還提供從包含白細胞的血液成分樣品中分離白細胞的方法。這些方法中，提供步驟包括(1)引導(dǎo)樣品通過去除器單元入口進入去除器單元；(2)使樣品基本平行于過濾器進入交叉流室，過濾器具有約1至約10微米的孔徑；(3)使流體通過過濾器進行過濾；以及(4)從樣品中選擇性去除非白細胞血液成分，形成富集了白細胞的細胞群。通過白細胞去除術(shù)、密度離心、差異裂解(differentiallysis)、過濾或制備棕黃層，樣品能得到部分純化或富集，用于引導(dǎo)入去除器單元。在一個實施方案中，誘使樣品在交叉流室中以漩渦運動流動。另外，富集白細胞的細胞群能夠使用洗滌液洗滌。
在本發(fā)明方法中，從樣品中去除的非白細胞血液成分包括血漿、血小板、紅細胞等。由本發(fā)明方法得到的產(chǎn)物中的白細胞可以包括基本富集的單核細胞群。富集的細胞群可包括至少約20％的白細胞，但是一般包括至少60％或更多的白細胞。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，步驟(1)、(2)和(3)重復(fù)至少兩次，來形成富集白細胞的細胞群。富集了白細胞的細胞群可以進一步用來制備單核樹突細胞前體。在一個實施方案中，富集的細胞群可以通過一種方法產(chǎn)生，該方法包括將單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)與富集了白細胞的細胞群接觸；允許細胞群中的單核樹突細胞前體可逆的粘附到基質(zhì)上，形成包括單核樹突細胞前體和基質(zhì)的復(fù)合物；將復(fù)合物與非粘附白細胞分離，得到包括單核樹突細胞前體的復(fù)合物；培養(yǎng)單核樹突細胞前體，分化該前體形成不成熟或成熟樹突細胞。在一個特定的實施方案中，單核樹突細胞前體在培養(yǎng)前從基質(zhì)上洗脫。粘附單核樹突細胞前體的基質(zhì)可以包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。
還是在本發(fā)明另一個實施方案中，提供富集血液成分的樣品中白細胞的方法，該方法包括(1)引導(dǎo)樣品進入切向流過濾(TFF)單元，TFF單元包括交叉流室、濾過物室以及與交叉流室和濾過物室的流體交流的過濾器，過濾器具有約1至10微米的孔徑；(2)以預(yù)設(shè)的輸入速率和預(yù)設(shè)過濾速率再循環(huán)樣品通過TFF單元，預(yù)設(shè)輸入速率至少是預(yù)設(shè)過濾速率的五倍；其中預(yù)設(shè)過濾速率要低于過濾器的非對抗速率；以及(3)分離富集了白細胞的細胞群。該方法能得到基本無非白細胞成分的富集細胞群，其中非白細胞成分包括血漿、血小板和紅細胞。由此方法產(chǎn)生的富集細胞群可以包括至少約20％的白細胞，一般至少約60％或更多白細胞。該方法可另外包括從受試者收集血液，以及使用白細胞去除術(shù)、密度離心、差異裂解、過濾或制備棕黃層從血液中制備樣品。
一旦細胞群富集了白細胞，該方法可以另外包括制備可以從白細胞誘導(dǎo)的特定細胞型，例如樹突細胞前體、CD34+造血干細胞或多能干細胞(如f-巨噬細胞)等。在一個特定實施方案中，樹突細胞可以從富集的細胞群制備。在此方法中如下制備樹突細胞將單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)與富集的細胞群接觸；讓富集細胞群中樹突細胞前體可逆的與基質(zhì)粘附，形成包含單核樹突細胞前體和基質(zhì)的復(fù)合物；將復(fù)合物與非粘附白細胞分離，得到包括單核樹突細胞前體的復(fù)合物；培養(yǎng)單核樹突細胞前體，分化該前體形成不成熟或成熟樹突細胞?；|(zhì)可以包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。另外，單核樹突細胞前體可以使用促進單核細胞分化為樹突細胞的細胞因子培養(yǎng)。在一個特定的實施方案中，細胞因子為GM-CSF和IL-4。此外，樹突細胞可以成熟為成熟樹突細胞。
一旦樹突細胞前體被分離，樹突細胞可以在有益于抗原加工的條件下使用抗原培養(yǎng)，來形成負荷抗原的樹突細胞(antigen loadeddendritic cells)。然后該抗原負荷樹突細胞可以給予個體，或者將負荷抗原的樹突細胞與T細胞在體外或離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗原特異性的細胞毒T細胞形成。細胞毒T細胞可以給予需要誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答的個體，例如癌癥和細菌或病毒感染治療。
可以產(chǎn)生富集造血干細胞的細胞群。在一個實施方案中，可以提供個體干細胞動員劑，例如G-CSF、GM-CSF、AMD3100(或其他抑制CXCR-4功能的試劑)，或者高劑量或低劑量環(huán)磷酰胺等等。干細胞動員劑誘導(dǎo)釋放到外周血流中的CD34+干細胞增殖。來自個體的白細胞去除術(shù)樣品被導(dǎo)入切向流過濾(TFF)單元，TFF單元包括交叉流室、濾過物室和與交叉流室和濾過物室流體交流的過濾器，過濾器具有約3至5.5微米的孔徑；(2)以預(yù)設(shè)輸入速率和預(yù)設(shè)過濾速率再循環(huán)樣品通過TFF單元，其中預(yù)設(shè)輸入速率至少是預(yù)設(shè)過濾速率的五倍；預(yù)設(shè)過濾速率要低于過濾器的非對抗速率；以及(3)分離富集CD34+白細胞的細胞群。該方法能得到基本無非白細胞成分的富集細胞群，其中非白細胞成分包括血漿、血小板和紅細胞。由此方法產(chǎn)生的富集細胞群可以使CD34+細胞百分率增加2至5倍，從白細胞去除術(shù)材料的1％至大約5％，到富集細胞群細胞的約10至40％。
此外，按照前面描述分離的單核細胞可以在非貼壁細胞培養(yǎng)容器(例如Teflon培養(yǎng)袋)中，使用含有M-CSF的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在M-CSF中培養(yǎng)單核細胞導(dǎo)致產(chǎn)生巨大數(shù)量的CD34+細胞。按照前面描述富集了白細胞或單核細胞的細胞群也可在許多其他本領(lǐng)域公知的細胞因子和leukokines存在下培養(yǎng)，來誘導(dǎo)產(chǎn)生許多其他祖細胞類型。例如，富集白細胞和/或單核細胞的細胞群可以在VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和胎血清存在下，在纖連蛋白包被表面培養(yǎng)，棄去非粘附細胞，得到內(nèi)皮樣循環(huán)血管生成細胞(endothelial-like circulating angiogeniccells)，或者通過在EGF中培養(yǎng)使f-MΦ分化為上皮細胞、分別通過在NGF或VEGF中孵育分化成神經(jīng)元細胞和內(nèi)皮細胞、或者在HGF等存在下經(jīng)誘導(dǎo)分化成為肝細胞。
附圖概述

圖1A至1C描述從血制品樣品中分離白細胞和單核細胞的切向流過濾設(shè)備的實施方案。圖1A提供了富集白細胞的設(shè)備的實施方案，其中交叉流室在過濾室上方。圖1B描述該設(shè)備正面圖，其中，樣品在過濾器下方輸入，濾過物向上流過過濾器富集單核細胞。圖1C是圖1B所述設(shè)備的俯視圖。
圖2描述在不同條件下對白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行切向流過濾(TFF)的實例。10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物，1∶5稀釋到PBS+肝素+DNaseI的緩沖液中，使用3微米過濾器，以過濾速率15ml/min進行TFF處理。顯示了TFF后保留物(指定為“Retentate”；陰影帶)和濾過物(指定為“Filtrate”；黑色帶)中白細胞(WBC)的百分比。再循環(huán)(輸入)速率Max、10、9、8、7和6分別對應(yīng)于1680、1380、1080、870和540ml/min。
圖3描述在TFF設(shè)備中對白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF的研究結(jié)果，該設(shè)備中使用3微米過濾器，在三個不同過濾速率(11、15和19.6ml/min)下，再流通(輸入)速率為1080ml/min。顯示了保留物(陰影帶)或濾過物(指定為“Filtrate”；黑色帶)中白細胞(指定為“WBC”)百分比。
圖4描述圖1所述的研究中，對白細胞去除術(shù)產(chǎn)物樣品進行TFF的另外的結(jié)果。10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物，1∶5稀釋，使用3微米過濾器，以15ml/min過濾速率進行TFF處理。顯示TFF后保留物(陰影框)和濾過物(黑色框)中紅細胞(指定為“RBC”)百分比。再循環(huán)(輸入)速率Max、10、9、8、7和6分別對應(yīng)于1680、1380、1080、870和540ml/min。
圖5描述圖2所述的研究中，對白細胞去除術(shù)產(chǎn)物樣品進行TFF的另外結(jié)果。10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物，1∶5稀釋，使用3微米過濾器，在三個不同過濾速率(11、15和19.6ml/min)下，以1080ml/min再循環(huán)(輸入)速率進行TFF處理。顯示保留物(陰影帶)和濾過物(指定為“Filtrate”，黑色帶)中紅細胞(指定為“RBC”)百分比。
圖6描述在樣品中增加白細胞去除術(shù)材料濃度的影響的實例。50ml白細胞去除術(shù)材料。1∶5稀釋到PBS+肝素+DNase I中，使用具有3微米孔徑過濾器的設(shè)備進行TFF。以過濾速率的函數(shù)顯示保留物(指定為“Retentate”)中紅細胞(指定為“RBC”)和白細胞(指定為“WBC”)的百分比。
圖7描述隨白細胞去除術(shù)產(chǎn)物(120ml或整個單元的1/2)擴大、在3微米和5微米過濾器分離白細胞去除術(shù)產(chǎn)物的實例。再循環(huán)(輸入)速率為1680ml/min，過濾速率15ml/min。對于使用5微米過濾器進行的TFF，約80％的紅細胞(指定為“RBC”；黑色陰暗帶)從保留物中去除，而約62％的輸入白細胞(指定為“WBC”；淺色陰影帶)或多于70％的輸入單核細胞被保留。相反，使用3微米過濾器，約65％的輸入白細胞保留在保留物中，但是僅有3％的紅細胞被去除。
圖8描述放大量的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物為樣品通過約4.5微米和8微米過濾器分離白細胞去除術(shù)產(chǎn)物的比較。再循環(huán)(輸入)速率為1680ml/min，過濾速率為15ml/min。對于使用4.5微米過濾器進行的TFF，約99％的紅細胞(指定為“RBC”；黑色陰暗帶)從保留物中去除，而約90％的輸入白細胞(指定為“WBC”；淺色陰影帶)被保留。相反，使用8微米過濾器，約98％的輸入紅細胞被去除，但是僅有4％的白細胞得到保留。
圖9描述放大量的處理白細胞去除術(shù)產(chǎn)物(250ml或整個單元)，在4.5微米過濾器上分離的實例。再循環(huán)(輸入)速率為1680ml/min，過濾速率為15ml/min。對于使用4.5微米過濾器、對三個不同的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行90分鐘的TFF，80％至95％之間的紅細胞從保留物中去除，而約80％至100％的輸入單核細胞得到保留。一個白細胞去除術(shù)樣品在TFF后，化驗保留物，發(fā)現(xiàn)僅有2％的輸入血小板和3％的輸入血漿(在表1中指定為實驗7)。
特定實施方案描述本發(fā)明提供處理血液成分非均勻混合物來提供富集的白細胞群的設(shè)備和方法。在本發(fā)明的一方面，提供了通過選擇性去除非白細胞血液成分(例如血漿、血小板和/或紅細胞等)來富集白細胞的設(shè)備和方法。另一方面，提供了通過從該混合物選擇性去除非單核細胞血液成分(例如去除淋巴細胞、紅細胞、血小板等)富集單核細胞的設(shè)備和方法。
富集的白細胞群一般從包括血液成分的樣品或流體混合物中制備。此處使用的術(shù)語“血液成分”指一般出現(xiàn)在血液當(dāng)中的任何物質(zhì)，包括一般出現(xiàn)在疾病和非疾病狀態(tài)下的某種物質(zhì)。血液成分包括白細胞，并且可以包括例如淋巴細胞、單核細胞、紅細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、天然殺傷細胞(NK)、和/或血小板、可溶性或不可溶蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如酶、免疫球蛋白或免疫球蛋白-抗原復(fù)合物)、其他大分子成分(例如脂類)、或整個血液當(dāng)中可以物理分離、不考慮其精確分子或細胞修飾的其他任何部分(比如包括血漿或血清)。
在實施本發(fā)明方法前，樣品或流體混合物可以部分富集白細胞。術(shù)語“白細胞(leukocyte)”與“白細胞(white blood cells)”(“WBC”)可以交替使用。這些術(shù)語包括單核無顆粒白細胞(包括例如單核細胞。樹突細胞前體和淋巴細胞)以及具有節(jié)段核和細胞質(zhì)顆粒的多形核粒細胞(包括嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞)。“單核細胞”指一類髓樣白細胞(myeloid leukocyte)，通常比淋巴細胞大，具有卵形或腎形細胞核，一般含有溶酶體顆粒并且一般表達CD14。
在本發(fā)明的某個方面，淋巴細胞從白細胞中分離。“淋巴細胞”指衍生于淋巴祖細胞的細胞，包括B-淋巴細胞、T-淋巴細胞和天然殺傷(NK)細胞。術(shù)語“小淋巴細胞”指直徑約7-8微米的淋巴細胞。
此處使用的術(shù)語“白細胞群”指包括白細胞的任何細胞群。白細胞群可以包括廣泛范圍的白細胞亞型或特定亞型，例如，單核細胞和\或單核樹突前體細胞。術(shù)語“富集(名詞)”、“富集(動詞)”和“富集的”意為使用本設(shè)備對血液成分混合物的處理、或按照本發(fā)明方法得到細胞群，與其他血液成分相比，該細胞群比最初的混合物(例如，在富集前)具有更高的活性白細胞百分比。此處使用的術(shù)語“活性”指能夠在適宜培養(yǎng)條件下分化的白細胞。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備利用切向流過濾富集白細胞群。術(shù)語“切向流過濾”和“交叉流過濾”可以交替使用，指從流體混合物分離懸浮粒子(例如細胞)，包括從流體混合物非均勻粒子混合物中分離具有確定特征(例如要求的粒度范圍)的粒子。將流體混合物(例如樣品流體)在樣品室中基本平行或者垂直于過濾器(例如，過濾器表面面向樣品流體)傳遞或循環(huán)，一般在正壓下，使用包括濃縮粒子或白細胞的流體混合物，持續(xù)切線流過膜表面，使粒子得到分離。
通常，決定哪些粒子從“濾過物”(即通過過濾器的流體部分)中去除、哪些粒子保留在“保留物”中，依賴于多種因素。這些因素包括，例如，過濾器孔徑、輸入速率、過濾速率、流體混合物中粒子濃度、溫度和流體混合物粘度。此處所用的“孔徑”指過濾器中孔的平均大小?！拜斎胨俾省敝笜悠?例如流體混合物)被引導(dǎo)進入容納過濾器的室的速率。當(dāng)樣品多次再循環(huán)經(jīng)過過濾器(例如本發(fā)明的裝置中的過濾器)時，輸入速率也指“再循環(huán)速率”?！敖徊媪鳌敝噶黧w混合穿物過過濾器基本平行(即在任何方向平行于過濾器表面)的流動?！敖徊媪魉俾省敝笜悠坊蛄黧w混合物越過并基本平行于過濾器的流動速率；流體混合物的交叉流速率通常依賴于多種參數(shù)，包括例如輸入速率、過濾器容納室的大小和形狀?！斑^濾速率”指流體混合物經(jīng)過過濾器的流速。對于根據(jù)本發(fā)明方法和設(shè)備的過濾速率，一般低于非對抗(例如空心管，open tube)過濾速率?！拜敵鏊俾省敝笍慕徊媪魇胰コ黧w混合物的速率，不同于流經(jīng)過濾器的流體混合物(即濾過物)。輸出速率通常等于輸入速率減去過濾速率。
此處使用的術(shù)語“過濾器”指由任何具有許多小孔的材料或材料的組合制成的物品，允許越過其進行交叉流的樣品或流體混合物中一種或多種成分(例如血液成分)通過小孔，從而將這些成分(例如非白細胞)與其他成分(例如白細胞)分離。盡管可以使用更大或更小的面積，過濾器表面可以是任何適宜的面積，例如，直徑約42到145mm。在某些實施方案中，一個TFF設(shè)備僅使用一個過濾器。在其他實施方案中，TFF設(shè)備可以使用額外的過濾器。
本發(fā)明中TFF設(shè)備一般使用的過濾器可以從大范圍的有機聚合體過濾器中選擇。這些過濾器包括但是不限于尼龍、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸/硝酸纖維素、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酯、聚丙烯和聚酰胺的微孔膜。也可以使用其他過濾器(例如陶瓷過濾器和金屬過濾器)?？梢允褂糜H水性和疏水性的、帶電荷和不帶電荷的過濾器。在某些申請中，可以優(yōu)選親水性過濾器。
本發(fā)明的過濾器一般包括大量分布于過濾器區(qū)域的小孔。在某些實施方案中，過濾器孔徑具有小的變化。例如，孔徑變異度約為±20％，或在約+0至20％之內(nèi)。在一個典型的實施方案中，使用“核孔”或“徑跡蝕刻(track etched)”過濾器(例如Poretics聚乙烯或聚碳酸酯徑跡蝕刻濾膜(Osmonics，Minnetonka，MN))。這些過濾器一般具有嚴格控制材料中孔徑的光滑表面。這類過濾器一般通過將一片無孔塑料暴露于具有足夠穿透塑料片的能量的放射性粒子源中而制備。暴露于化學(xué)溶劑或蝕刻試劑中，“軌跡”直徑于是增大?？椎拇笮】梢酝ㄟ^軌跡蝕刻條件而控制。
本發(fā)明利用血液中多種細胞型之間的差異富集白細胞(例如單核細胞、樹突細胞前體等等)。這些差異可以包括，例如，在大小、形狀和/或可塑性的差異。人類血液中細胞的大小和可塑性一般隨細胞型而變化。紅細胞一般為雙凹碟形、無核，大直徑(major diameter)測量約為7微米，相對可變形。多形核白細胞一般為類球形，也約為7微米，但是不如紅細胞可變形。單個核細胞中，淋巴細胞一般為7至10微米，單核細胞通常在10至15微米范圍內(nèi)。
在多種實施方案中，選擇過濾器孔徑來富集白細胞，和/或?qū)ρ撼煞诌M行分級從而富集白細胞。例如，在某些實施方案中，標稱直徑為10至15微米的單核細胞，以及標稱直徑為7微米的紅細胞，可以由使用孔徑約5至5.5微米的過濾器的TFF分離。在一個特定的實施方案中，4.5微米過濾器成功的被用于將單核細胞與白細胞去除術(shù)樣品中其他細胞成分分離。
在其他實施方案中，過濾器孔徑可在約1至10微米范圍內(nèi)，或者約3至8微米、或3至5微米?？讖皆诩s3微米范圍內(nèi)的過濾器可以保留大多數(shù)白細胞，對于從自細胞中去除紅細胞的作用效率較低。相反，孔徑在約8微米范圍內(nèi)的過濾器去除紅細胞的作用可以更有效，但是增加了白細胞在濾過物中的丟失。約為3至5.5微米的過濾孔徑可以用來富集CD34+造血干細胞。
從其他血液細胞成分中富集白細胞也可受到輸入速率、過濾速率和/或樣品或流體混合物中細胞濃度的影響。例如，紅細胞比白細胞更容易變形，因此更容易通過孔徑比紅細胞大直徑小的過濾器(例如小于7微米)。在一個特定的實施例中，可以使用孔徑約5微米的過濾器將紅細胞從白細胞中分離。在其他實施方案中，過濾器孔徑減小到約3微米，細胞濃度(如前)升高來有效的從白細胞中分離紅細胞。
白細胞從其他血液細胞成分中的富集也可受到在同樣輸入速率或再循環(huán)速率下，維持過濾速率低于非對抗(如空心管)過濾速率的影響。在其他實施方案中，白細胞在濾過物中的損失可以通過維持輸入或再循環(huán)速率高于過濾速率而得到降低。在示范實施方案中，輸入或再循環(huán)速率可以是過濾速率的至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
用于使用TFF進行細胞分級的、包括多種血液成分樣品或流體混合物，可以從多種來源獲得，可包括處理過程中多個階段的血制品流體混合物。例如，血源可以是人類或非人類。另外，流體混合物可以是例如全血、全血的多種稀釋物，或者經(jīng)過諸如去除血漿或其他血液成分處理的全血或血液稀釋物。因而，流體混合物可以包括例如至少已經(jīng)部分富集了白細胞的血細胞群。
血液成分或白細胞群，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。這些方法一般包括采集肝素化血液、單采血液成分術(shù)或白細胞去除術(shù)、制備棕黃層、rosetting、離心、密度梯度離心(例如FICOLL-HYPAQUE、PERCOLL、蔗糖等)、非白細胞差異裂解和過濾等等。白細胞群還可以通過從個體采集血液、除去纖維蛋白來去除血小板、以及裂解大部分紅細胞來制備。白細胞群還可以選擇經(jīng)例如PERCOLL梯度離心來富集單核細胞。
包括血液成分的流體混合物可以根據(jù)需要任選稀釋或濃縮。例如，在某些實施方案中，血液成分被稀釋為1∶2、1∶5、1∶10或其他任何適宜的稀釋度。血液成分可以稀釋到諸如等滲緩沖液(例如PBS或HEPES緩沖鹽溶液)、組織培養(yǎng)基等等中。一般，進行TFF處理的血液成分樣品具有每毫升約106至108個細胞的細胞濃度。
根據(jù)富集的白細胞群的使用需要，血細胞群可以從多種類型的個體獲得。個體可以是健康個體。作為選擇，血細胞可以從需要免疫刺激的個體(例如癌癥患者或者免疫刺激對其有益的其他患者)獲得。同樣，血細胞可以從自身免疫失調(diào)的患者(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、狼瘡和多發(fā)性硬化等等)這類需要免疫抑制的受試者獲得。血細胞群也可以從HLA匹配的健康個體獲得，給予需要免疫刺激的HLA匹配的患者。血細胞群同樣可以從給以干細胞動員劑的個體采集，例如GM-CSF、G-CSF和AMD3100(或其他已知CXCR-4功能的試劑)，或者低/高劑量環(huán)磷酰胺等等(Deliliers等，Leuk.Lymphoma 431957，2002)。個體可以是將要接受富集的細胞群的患者、親屬或者HLA匹配個體。
在某些實施方案中，富集白細胞群可以從保留物中收集，而其他血液成分則進入到濾過物中。例如，為了富集白細胞群(例如，包括單核細胞和淋巴細胞)，諸如血漿、血小板和/或紅細胞其他血液成分可以選擇性去除到濾過物中。在另一個實施方案中，淋巴細胞或小淋巴細胞可以選擇性去除，進入濾過物。
如圖1A至1C中所述的根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備一般包括交叉流室(3)和濾過物室(4)。過濾器(5)定位與二者之間，一個表面與交叉流室流體交流(保留物表面)，另一表面同濾過物室流體交流(濾過物表面)。交叉流室、濾過物室和過濾器組成去除器單元(1)。在一個實施方案中，交叉流室一般具有約55ml的容積，濾過物室具有約25ml的容積。過濾器直徑一般與交叉流室直徑基本相同。在某些證明本發(fā)明效用的實施方案中，過濾器直徑約為140至143mm。
流體混合物經(jīng)流體入口(6)進入交叉流室(3)，入口一般置于過濾器保留物表面附近，以致流體混合物(例如樣品)基本平行于過濾器保留物表面進入交叉流室。一般，流體經(jīng)流體出口(7)從交叉流室(3)去除，流體出口通常置于交叉流室垂直于過濾器保留物表面的部分。在某些示范實施方案中，交叉流室入口(6)直徑約為7mm至8mm，交叉流室出口(7)直徑約為8mm至10mm。濾過物經(jīng)出口(8)去除到濾過物室中(4)。
一般，流體混合物以足夠的輸入速率被引導(dǎo)進入交叉流室中，以致越過過濾器表面(保留物表面)的流體混合物的交叉流具有足夠高的速率，在過濾器接觸表面(例如界面層)逐漸將流體與細胞瓦解并反混合(back-mix)。此處所用的“界面層”，指在過濾器保留物面上、或者與之毗鄰的流體層，一般通過流過過濾器的流體留下。界面層的瓦解通過阻止過濾器接觸表面的物質(zhì)與過濾器結(jié)合或形成可阻礙有效過濾的停滯而有利于有效過濾。然而，流體混合物的輸入速率通常并不足以引起大量的白細胞的裂解。
在某些實施方案中，流體混合物被泵入交叉流室(3)，使血液成分通過過濾器的保留物表面。用于驅(qū)動流體交叉流通過過濾器的泵稱為“交叉流泵”或“再循環(huán)泵”(14)。交叉流泵可以包括與交叉流室(3)流體交流的任何泵設(shè)備，其足以將流體流引導(dǎo)進入室中并以特定的輸入速率通過過濾器，而不會引起細胞的基本損傷(例如細胞裂解)。適于在本發(fā)明中使用的交叉流泵可以包括例如蠕動泵、活塞泵、膜片泵或滾子泵。在例如需要將TFF設(shè)備保持為“封閉”系統(tǒng)的一部分時，可以使用蠕動泵。
流體混合物一般以超過過濾速率的輸入速率被泵入交叉流室(3)。在一個示范實施方案中，輸入速率約為1680ml/分鐘，過濾速率約為15ml/分鐘。在另一個示范實施方案中，輸入速率約為1600至1800ml/分鐘，過濾速率約為10至20ml/分鐘。非白細胞物質(zhì)(例如紅細胞、免疫復(fù)合物和蛋白質(zhì)等)通過過濾器(5)進入過濾物室中(4)。
如前文所討論，過濾速率一般低于非對抗(如空心管，open tube)速率。過濾速率是可以控制的，例如通過減小或限制濾過物室出口大小、利用第二個泵裝置(例如過濾泵)來限制液流等等方法。
另一個示范實施方案中，引導(dǎo)流體混合物進入設(shè)備在液體內(nèi)產(chǎn)生渦流。例如，通過引導(dǎo)流體混合物以約為過濾速率的5倍或10倍至100倍的輸入速率，基本平行于圓形過濾器進入圓柱形交叉流室，可以實現(xiàn)這一點。流過的液流通過出口(7)去除，出口(7)位于與過濾器垂直的圓柱形室內(nèi)，一般臨近于過濾器表面中央。這樣的布局導(dǎo)致液流漩渦進入過濾器中央。液流一般不湍急或達到引起白細胞基本裂解的高速。如前文所討論，液流也可以“凈化”過濾器表面，防止界面層的結(jié)合或阻滯。校準輸入速率使其大于(例如，至少約5倍)過濾速率，由此富集了白細胞的細胞群可有至少約20％或至少40％或更多白細胞。
另一個示范實施方案中，保留物被再循環(huán)來提高分離效率。例如，包括血液成分的流體混合物可被引導(dǎo)進入交叉流室，然后保留物可以通過交叉流室中的流體出口(7)撤入另一室中，例如最初提供液體的室(“回收單元”；(2))?；厥諉卧械牧黧w混合物然后可以再次引導(dǎo)進入交叉流單元。通過將回收單元(2)與去除器單元(1)連接成“環(huán)形”，可以實現(xiàn)流體混合物持續(xù)的再循環(huán)和過濾。作為選擇，保留物可以通過交叉流室(3)中的流體出口(7)撤出，直接再循環(huán)進入交叉流入口(即不用經(jīng)過回收單元或另一個室)。流體混合物通過交叉流室可以持續(xù)任意適宜的時間。在某些實施方案中，流體混合物可以再循環(huán)5至60分鐘或更久，以達到要求的白細胞純度或豐度。
在另一個實施方案中，可以通過加入緩沖液、洗滌溶液或其他溶液(統(tǒng)稱為“置換液”)來調(diào)節(jié)流體混合物的體積。例如，可以在回收單元(例如通過一個溶液入口(13))中、在去除器單元中、在泵上(14)、在延伸至或延伸自去除器單元的管中，或在其他任何方便的位置，將洗滌溶液與流體混合物組合。保留物中的細胞于是可在同一操作中富集并洗滌。一般，洗滌溶液與細胞等滲。適宜的緩沖液和洗滌溶液可包括多種緩沖液(例如磷酸緩沖液(PBS)或HEPES緩沖鹽溶液)、組織培養(yǎng)基等。
在某個實施方案中，細胞群在封閉的無菌系統(tǒng)中得到富集的白細胞細胞群。此處所用的術(shù)語“封閉的無菌系統(tǒng)”或“封閉系統(tǒng)”指將暴露于未經(jīng)消毒、周圍環(huán)境、流通空氣或其他未經(jīng)消毒條件的機會降至最低或消除的系統(tǒng)。用來富集細胞群的封閉系統(tǒng)通常排除在頂端開放的管中進行離心、開放空氣中轉(zhuǎn)移細胞、在組織培養(yǎng)板或未封閉瓶中培養(yǎng)細胞等。包括例如任何細胞容器、孵化器、組織培養(yǎng)容器或其他用于細胞處理的裝置(見下文)在內(nèi)的整個過濾系統(tǒng)可以維持為一個“封閉”系統(tǒng)。在一個典型的實施方案中，封閉系統(tǒng)允許白細胞的無菌富集，并且可以任選從起初的收集容器轉(zhuǎn)移到可封閉的組織培養(yǎng)容器，而不暴露于未經(jīng)消毒的空氣。在封閉系統(tǒng)中一般使用蠕動泵(圖1A和1C；(15))裝置。
本發(fā)明的另一方面，經(jīng)過從混合物中選擇性去除非白細胞血液成分(包括例如血漿、血小板、紅細胞等)，血液成分的非均勻混合物基本富集了白細胞。此處使用的術(shù)語“基本富集的”意為經(jīng)過根據(jù)要求的許多循環(huán)的再循環(huán)后，從保留物中回收的細胞群包括至少約20％、至少約40％、或者至少約60％的所需細胞型(例如白細胞)。在其他實施方案中，血液成分的非均勻混合物得以富集白細胞，以形成基本不含非白細胞血液成分的富集的白細胞群。此處所用的術(shù)語“基本不含”意為富集白細胞的細胞群包括至少50％的白細胞。
在本發(fā)明此方面的一個示范實施方案中，TFF設(shè)備包括容積約為55ml的交叉流室(3)和容積約為25ml的濾過物室(4)。該裝置另外包括如下孔徑約為1至10微米、或約為2至8微米，或3至5微米的過濾器；約為1600至1800ml/min的輸入速率；約為12至17ml/min的過濾速率，以及直徑約為142mm的過濾器。初始流體混合物一般具有至少約每毫升107個細胞(例如白細胞或其他細胞)的細胞濃度。
在本發(fā)明的另一方面，經(jīng)過從混合物中選擇性去除非單核細胞血液成分(例如從混合物中去除淋巴細胞)，血液成分的非均勻混合物基本富集了單核細胞。此處使用的術(shù)語“選擇性去除”、“被選擇性去除的”和“選擇性去除”指優(yōu)先去除一種細胞型、并富集另一種細胞型。在此方面的一個示范實施方案中，TFF設(shè)備包括容積約為55ml的交叉流室(3)和容積約為25ml的濾過物室(4)。此外，該裝置包括如下孔徑約為1至10微米、或約為2至8微米，或3至5微米的過濾器；約為1600至1800ml/min的輸入速率；約為12至17ml/min的過濾速率，以及直徑約為142mm的過濾器。初始流體混合物一般具有至少約每毫升107個細胞(例如單核細胞或其他細胞)的細胞濃度。在這個實施方案中，該設(shè)備以相反方式(inverted manner)操作。
富集細胞群的培養(yǎng)、擴增和分化如上所述富集白細胞細胞群后，可任選的培養(yǎng)白細胞來保持細胞活力、增加細胞數(shù)量和/或?qū)⒓毎只癁榱硪粋€細胞型。適宜的組織培養(yǎng)容器包括例如組織培養(yǎng)瓶、袋、板和生物反應(yīng)器(包括發(fā)酵罐)等。
在一個示范實施方案中，富集的白細胞群可以在封閉、無菌系統(tǒng)(例如生物反應(yīng)器、組織培養(yǎng)袋等)中培養(yǎng)。此封閉系統(tǒng)可以具有一個入口和/或出口用于對流體(例如組織培養(yǎng)基、洗滌緩沖液)、氣體、細胞等的可控制的、無菌引入或去除。
在另一個示范實施方案中，富集的白細胞群可以轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中。此生物反應(yīng)器可以裝備合適的入口和/或出口，來引入細胞、消毒氣體(例如氧氣、二氧化碳和/或空氣)、組織培養(yǎng)基等。生物反應(yīng)器還可具有溫度控制手段。生物反應(yīng)器一般在約37℃運行。生物反應(yīng)器還可具有攪拌生物反應(yīng)器中細胞或培養(yǎng)基的裝置。攪拌裝置可以包括例如漿或旋轉(zhuǎn)過濾器(也可以起培養(yǎng)基出口的作用)。
在更多一個示范實施方案中，富集的白細胞群可以轉(zhuǎn)移到諸如組織培養(yǎng)袋這樣的封閉系統(tǒng)中。適宜的組織培養(yǎng)袋包括例如STERICELL培養(yǎng)容器(Nexell Therapeutics Inc.)或TEFLON培養(yǎng)袋(AmericanFluoroseal Corp.)。此封閉系統(tǒng)可以具有任何適宜的大小和體積，以使技術(shù)人員滿意。盡管更大或更小的體積是可能的并且在本發(fā)明范圍內(nèi)，適宜的體積包括，例如，從約0.01升至約5升，或約0.01升至0.05升。
根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案中，富集白細胞的細胞群(例如，包括單核細胞、單核樹突細胞前體、CD34+造血干細胞或其他前體細胞)可以任選地被培養(yǎng)，并且通過加入合適誘導(dǎo)劑而分化，來獲得特定細胞型的細胞，包括例如未成熟或成熟樹突細胞、f-巨噬細胞、CD34+造血干細胞或前體細胞、或者其他前體細胞。適宜的組織培養(yǎng)基包括，例如，AIM-V、RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15TM等。組織培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加氨基酸、維生素、細胞因子(例如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白介素4(IL-4)、二價陽離子等)，促進細胞向諸如未成熟樹突細胞的分化。典型的細胞因子組合是GM-CSF和IL-4各約500U/ml。
富集的白細胞群可以被培養(yǎng)任意適宜的時間。在某些實施方案中，細胞分化為未成熟樹突細胞的適宜的培養(yǎng)時間可以約為4至7天。從前體細胞向未成熟樹突細胞的分化，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法監(jiān)測，例如存在或缺乏細胞表面標志(例如CD14-、CD11c+、CD831o、HLA-DR+)。未成熟樹突細胞也可以在適宜的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)來擴增細胞群，和/或?qū)⑽闯墒鞓渫患毎３衷谟米鬟M一步分化或抗原攝入、加工和呈遞的狀態(tài)。例如，未成熟樹突細胞可以在GM-CSF和IL-4存在下得以維持。
在某些實施方案中，優(yōu)選未成熟樹突細胞用于最佳抗原呈遞，因為他們保持了加工新抗原的能力(見例如Koch等，J.Immunol.15593-100，1995)。相反，曾暴露于適宜的成熟劑、并且曾經(jīng)加工抗原的成熟樹突細胞(例如CD14-、CD11c+、CD83+、CD86+、HLA-DR+)，典型地丟失了有效加工新抗原的能力。
在培養(yǎng)過程中，未成熟樹突細胞可以任選暴露于預(yù)先確定的抗原。適宜的預(yù)先確定抗原可包括呈遞給T細胞的任何抗原(例如活化、刺激增殖、誘導(dǎo)無反應(yīng)性等)。在一個實施方案中，將未成熟樹突細胞在腫瘤相關(guān)抗原存在下培養(yǎng)，這類抗原例如前列腺特異性膜抗原(PSMA)(用于腫瘤免疫治療和/或腫瘤生長抑制)。其他抗原可以包括，例如，細菌和病毒抗原、腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原(例如腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞膜制劑、從腫瘤分離的抗原、融合蛋白、脂質(zhì)體等)、以及任何其他抗原。接觸抗原后，可以將細胞培養(yǎng)任何適宜的時間，以允許抗原攝入和加工、擴增抗原特異性樹突細胞群等等。未成熟樹突細胞也能夠成熟為在MHC分子情況下呈遞抗原的成熟樹突細胞。這樣的成熟可以例如通過在成熟因子，如細胞因子(例如TNF-α)、細菌產(chǎn)物(例如BCG)等存在下培養(yǎng)得以完成。
本發(fā)明另外一個方面，血液成分的非均勻混合物被基本富集了單核樹突細胞前體細胞。如上文所述，白細胞或單核細胞細胞群得到富集后，單核樹突細胞前體(例如來自外周血之類)可以通過選擇性粘附到基質(zhì)上(例如單核樹突細胞前體結(jié)合基質(zhì))而從富集的細胞群中分離。這樣的基質(zhì)可以通過例如組織培養(yǎng)皿或瓶提供。作為選擇，可以使用具有高表面積/體積比的基質(zhì)，例如微?；蚶w維性基質(zhì)(如2002年7月25日提出的PCT/US02/23865中所公開，此處引用其中公開內(nèi)容作為參考)。單核樹突細胞前體可以是粘附到基質(zhì)上、形成單核樹突細胞前體與基質(zhì)復(fù)合物的單核細胞，而其他白細胞保持未結(jié)合狀態(tài)(“非粘附的”)。結(jié)合的白細胞于是與未結(jié)合白細胞分離，在基質(zhì)上形成富集了單核樹突細胞前體的細胞群。單核樹突細胞前體可以在基質(zhì)上得到培養(yǎng)和分化，或者從基質(zhì)上洗脫繼而分別培養(yǎng)和分化，來獲得未成熟和/或成熟的抗原呈遞樹突細胞。根據(jù)這個方面，單核樹突細胞前體可選地被分離并在封閉的無菌系統(tǒng)中分化。
根據(jù)另一個方面，暴露于預(yù)先確定的抗原的樹突細胞可以用于在體外或體內(nèi)激活針對該抗原的T細胞。暴露于抗原來激活T細胞后，樹突細胞任選可以立即使用。作為選擇，在暴露于抗原和T細胞之前，樹突細胞可以在細胞因子組合物(例如GM-CSF和IL-4)存在下維持。在一個特定的實施方案中，人類樹突細胞被用于在體內(nèi)或體外刺激人T細胞。
T細胞或T細胞亞群可以從多種淋巴組織中獲得。這類組織包括但是不限于脾臟、淋巴結(jié)和外周血。T細胞純化可以通過諸如正選或負選實現(xiàn)，正選或負選包括但是不限于使用針對CD2、CD3、CD4、CD5和/或CD8的抗體。
T細胞可以作為混合T細胞群或者純化的T細胞亞群與暴露于預(yù)設(shè)抗原的樹突細胞共培養(yǎng)。例如，純化的CD8+T細胞可以與暴露于抗原的樹突細胞共培養(yǎng)，來引起抗原特異性的CTL。在某些實施方案中，早期去除CD4+T細胞，可以防止CD4+細胞在CD4+和CD8+T細胞混合培養(yǎng)中的過度生長。作為選擇，CD4+和CD8+T細胞的混合群可以與樹突細胞共培養(yǎng)，來引發(fā)包括細胞毒性和TH免疫應(yīng)答的抗原特異性反應(yīng)。
這種經(jīng)過刺激的T細胞可任選再輸入到受試者體內(nèi)(見例如，Riddle和Greenberg，J.Antimicrobial Chemotherapy 4535-43，2000；Correale等，J.Neuroimmunology 107130-39，2000；此處引用其中公開內(nèi)容作為參考)。例如，未成熟樹突細胞可以與抗原(例如PSMA)接觸并成熟，形成成熟樹突細胞。T細胞可以從受試者分離，離體與成熟樹突細胞接觸，然后再次給予該受試者。例如，可以每周或每兩周給予受試者劑量約為1×107至5×109的CD8+T細胞，持續(xù)1-4個月或更久。作為選擇，成熟樹突細胞可以直接給予受試者。一般，病人每次給予約1×107個樹突細胞。
一般，來自經(jīng)過干細胞動員劑處理的供體的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物，包括約約1％至5％的細胞，約5％至20％粒細胞，約40％至60％左右淋巴細胞，約10％-約25％單核細胞，帶有顯著數(shù)量的紅細胞和血小板。使用本發(fā)明中帶有約3至約5.5微米孔徑的過濾器的TFF裝置，得到富集的白細胞群，其包括約60％至70％單核細胞，幾乎沒有粒細胞，約10％淋巴細胞和約10％至40％CD34+細胞。該富集的白細胞群能夠如下文所述使用。
在其他實施方案中，本發(fā)明方法用于獲得除單核細胞或單核細胞前體之外的其他細胞亞群。例如，富集白細胞的細胞群可以作為造血干細胞來源用于諸如同種異體或自體移植。在特定的實施方案中，富集白細胞群可以在交叉流分離程序后進一步富集干細胞。從外周血白細胞來源富集造血干細胞的方法為本領(lǐng)域公知，并且適于用于按照此處描述所分離的富集的白細胞群。例如，富集的白細胞群可以使用例如免疫磁分離技術(shù)(見例如Rowley等，Bone Marrow Transplant.211253，1998；Denning-Kendall等，Br.J.Haematol.105780，1999)進一步富集CD34+細胞。另外，為了進一步提高干細胞產(chǎn)量，富集了單核細胞繼而按照本發(fā)明描述進行TFF的細胞群，可以在例如存在約50ng/ml M-CSF的含有胚胎血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以產(chǎn)生CD34+細胞。培養(yǎng)必須在非貼壁細胞培養(yǎng)容器中進行，例如TEFLON培養(yǎng)袋。此外，外周血供體可以在采集外周血和使用TFF分離白細胞之前進行干細胞動員。提高干細胞收獲效率的多種動員劑為本領(lǐng)域公知。例如，供體可以使用GM-CSF、G-CSF、AMD3100(或其他抑制CXCR-4功能的試劑)，和/或化學(xué)治療動員劑，例如高劑量或低劑量環(huán)磷酰胺處理(見例如Deliliers et al.，Leuk.Lymphoma，431957，2002)。血液供體可以是接受移植的患者、近親或HLA匹配個體等。
在另一個實施方案中，本發(fā)明方法也用于獲得非干細胞亞群，例如富集祖細胞的細胞群(例如造血或內(nèi)皮祖細胞)或分泌目的因子(例如造血或血管生長因子)的細胞。例如，通過共表達VEGFR-2和AC133(還有VE-鈣粘著蛋白和E-選擇蛋白)，可以將循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(CEPs)識別為循環(huán)CD34+細胞的一個亞群(見例如Peichev等，Blood95952，2000)。使用例如針對VEGFR-2和AC133抗體的免疫磁分離技術(shù)可以對富集白細胞的細胞群進一步富集CEP。而且，在TFF前可以使用細胞因子例如VEGF動員CEP(見例如Gill等，Circ Res.，88167，2001)。另外，在其他實施方案中，在纖聯(lián)蛋白包被的表面，使用例如VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和FBS培養(yǎng)富集的白細胞群，然后棄去非粘附細胞，獲得內(nèi)皮樣循環(huán)生血管細胞(CACs，其分泌例如VEGF、HGF、G-CSF和GM-CSF)(見例如Rehman等，Circulation 1071164，2003)。
另外，富集的白細胞群可以被培養(yǎng)來誘導(dǎo)多能祖細胞或干細胞增殖。例如，CD34+干細胞可以通過使用造血生長因子(例如IL-1、IL-3、IL-6和干細胞因子(SCF)的組合物)、粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)和G-CSF培養(yǎng)，而得以增殖(見例如Sun等，Haematologica 88561，2003)。作為選擇，例如，富集的單核細胞群可以使用諸如M-CSF、LIF和/或IL-6處理，來獲得多能“f-巨噬細胞”(f-MΦ)，這種細胞在形態(tài)學(xué)上類似成纖維細胞，而不像標準巨噬細胞，展示高水平CD34(見Zhao等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 1002426，2003)。祖細胞或干細胞可以繼而使用多種細胞因子和生長因子處理，來誘導(dǎo)向造血或非造血系的分化。
在其他實施方案中，富集白細胞的細胞群可以在適宜誘導(dǎo)分化的條件下培養(yǎng)(例如，祖細胞的分化或更多分化的細胞型(例如單核細胞或單核細胞衍生的樹突細胞)的轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)。(此處使用的“轉(zhuǎn)分化”指分化細胞的表型調(diào)制過程，一般不需要細胞分裂使分化細胞由此分化成為形態(tài)學(xué)和/或功能不同的細胞群)。例如，除分化為樹突細胞外，依賴培養(yǎng)條件，單核細胞可以轉(zhuǎn)化為其他造血或非造血細胞型，包括例如巨噬細胞、破骨細胞和內(nèi)皮樣細胞(見例如Becker等，J.Immunol.1393703，1987；Nicholson等，ClinSci.99133，2000；Havemann等，Novel Angiogenic MechanismsRole of Circulating Progenitor Endothelial Cells 47-57(NicanorI.Moldovan eds.，2003))。在一個實施方案中，在纖連蛋白包被的表面，使用VEGF、bFGF、IGF-1、氫化可的松和FCS培養(yǎng)，富集的單核細胞或單核細胞衍生的樹突細胞得以轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮樣細胞(Havemann等，見前文)。同樣，在誘導(dǎo)相對未分化的細胞亞群(例如多能祖細胞和干細胞)分化為造血或非造血系的條件下，富集的白細胞群可以使用多種細胞因子或生長因子中的任何進行培養(yǎng)。例如，單核細胞衍生的多能干細胞(f-MΦ)，分別經(jīng)例如LPS、IL-2、EGF、NGF、VEGF、或HGF處理，可以被誘導(dǎo)分化為標準巨噬細胞、T淋巴細胞、上皮細胞、神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞、或肝實質(zhì)細胞(Zhao等，見前文)。這些分化可以在如前文所述的細胞擴增之前或之后誘導(dǎo)。
下面的實施例僅被提供作為本發(fā)明多方面的說明，不應(yīng)以任何方式分析為對本發(fā)明的限制。
實施例1具有環(huán)形構(gòu)型的去除器單元和回收單元的TFF設(shè)備本發(fā)明的一個實施方案包括切向流過濾設(shè)備的一個結(jié)構(gòu)在一個環(huán)形結(jié)構(gòu)中有去除器單元(1)和回收單元(2)(圖1A)。去除器單元包括由微孔過濾器(5)分隔為兩個室(交叉流室(3)和濾過物室(4))的構(gòu)架(housing)，微孔過濾器(直徑142mm)孔徑約為1至約10微米。交叉流室包括流體入口(6)和流體出口(7)。濾過物室包括濾過物出口(8)?；厥諉卧ㄒ粋€含有回流入口(10)、回流出口(11)、樣品入口(12)和溶液入口(13)的構(gòu)架(9)。在某些實施方案中，樣品入口和溶液入口是同一個入口，但可以是分離的。樣品(例如血液、血液制劑、或制備的白細胞群)由樣品入口(12)引導(dǎo)進入回收單元，并在再循環(huán)泵(14)的作用下、經(jīng)過回流出口(11)移回去除器單元。樣品經(jīng)過流體入口(6)被引導(dǎo)進入去除器單元，并流過微孔膜(5)，使流體的移動指向過濾方向的切線方向。流體入口(6)通常定位于與過濾器半徑垂直的方向。相關(guān)的入口、過濾和出口速率引起渦流，渦流中心將血液制劑中沒有通過過濾器的成分汲取到流體出口(7)并回到回收單元(2)。流體在回收單元和去除器單元之間的流動由再循環(huán)泵(14)控制。濾過物從去除器單元的去除由濾過物泵(15)控制。
實施例2TFF后白細胞的保留——再循環(huán)速率和過濾速率對保留效率的影響在此實施例中，使用實施例1中描述的、提供直徑142mm的聚酯膜的TFF裝置富集白細胞得以證明。白細胞去除術(shù)產(chǎn)物的樣品在多種條件下的設(shè)備中進行TFF，并對白細胞的選擇性保留進行評價。在一組研究中，使用3微米過濾器，以15ml/min的過濾速率(持續(xù)17分鐘)、在多種再循環(huán)(輸入)速率下(例如1680、1380、1080、870和540ml/min)，對10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF。通常，大部分白細胞被保留于保留物中(即濾過物中的白細胞少于10％)，除非再循環(huán)速率低于1080ml/min(圖2；注相應(yīng)的指定為Max、10、9、8、7和6的實際再循環(huán)速率分別為1680、1380、1080、870和540ml/min)。
在另一組研究中，使用3微米過濾器，以1080ml/min的再循環(huán)(輸入)速率，在3種不同的過濾速率下(11、15和19.6ml/min)，在實施例1的TFF設(shè)備中，對10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF。每次研究收集濾過物約250ml。19.6ml/min或11ml/min的過濾速率基本都不比15ml/min的過濾速率更有利于白細胞的保留(圖3)。
實施例3從白細胞去除術(shù)產(chǎn)物中選擇性去除紅細胞在這個實施例中，說明了紅細胞的選擇性去除，以及再循環(huán)速率、過濾速率和樣品濃度對使用實施例1中TFF設(shè)備的分離效率的影響。白細胞去除術(shù)產(chǎn)物的樣品在實施例2中建立的條件下進行TFF，并對紅細胞的選擇性去除進行評價。如實施例2，使用3微米過濾器，以15ml/min的過濾速率(持續(xù)17分鐘)、在各種再循環(huán)(輸入)速率下(例如1680、1380、1080、870和540ml/min)，對10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF。已經(jīng)確定，通常，降低再循環(huán)速率促進更多紅細胞進入濾過物中(圖4；注相應(yīng)的指定為Max、10、9、8、7和6的實際再循環(huán)速率分別為1680、1380、1080、870和540ml/min)?？梢姳M管降低再循環(huán)速率確實增加紅細胞從保留物中去除，但在低于1080ml/min的再循環(huán)速率下，保留物中白細胞的產(chǎn)量減少(圖4)。
同實施例2，使用3微米過濾器，以1080ml/min的再循環(huán)(輸入)速率，在三種不同的過濾速率下(11、15和19.6ml/min)，在同樣的TFF設(shè)備中，對10ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF。每次研究收集濾過物約250ml。19.6ml/min或11ml/min的過濾速率基本都不比15ml/min過濾速率更有利于紅細胞的選擇性去除(圖5)。19.6ml/min的過濾速率比15ml/min更多的減少了保留物中的紅細胞，但是如實施例2所見，15ml/min的過濾速率在保留物中得到更高產(chǎn)量的白細胞(圖3)。
關(guān)于圖6，增加樣品中白細胞去除術(shù)材料濃度的效果也得到研究。1∶5稀釋于PBS+肝素+DNaseI的白細胞去除術(shù)材料50ml，使用具有3微米孔徑過濾器的裝置進行TFF。如果過濾速率約15ml/min或19.6ml/min，保留物中紅細胞(指定為“RBC”)百分率接近相同，約為輸入的100％。然而，如果白細胞去除術(shù)產(chǎn)物50mL以1∶2稀釋于同樣的緩沖液，僅僅40％的輸入紅細胞保留于保留物中，顯示負荷更高的樣品濃度，也可以促進紅細胞與白細胞(指定為“WBC”)的分離。
實施例4從白細胞去除術(shù)產(chǎn)物中選擇性去除紅細胞——孔徑對去除紅細胞的影響為了確認實施例1中所述的TFF裝置的實施方案在成比例放大時將相似的進行，比較120ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物(整個單位的1/2)在過濾器孔徑為3微米和4.5微米的設(shè)備中進行的TFF。再循環(huán)(輸入)速率為1680ml/min，過濾速率為15ml/min。關(guān)于圖7，對于使用4.5微米過濾器進行的TFF，約80％的紅細胞(指定為“RBC”；黑色陰暗帶)從保留物中去除，而約62％的輸入白細胞(指定為“WBC”；淺色陰影帶)，或者多于70％的輸入單核細胞得以保留。相反，使用3微米過濾器，約65％的輸入白細胞在保留物中得以保留，但是僅有3％的紅細胞被去除。
關(guān)于圖8，比較45ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物在過濾器孔徑為4.5微米和8微米的設(shè)備中進行的TFF。再循環(huán)(輸入)速率為1680ml/min，過濾速率為15ml/min，時間為60分鐘。對于使用4.5微米過濾器進行的TFF，約99％的紅細胞(指定為“RBC”；黑色陰暗帶)從保留物中去除，而約90％的輸入白細胞(指定為“WBC”；淺色陰影帶)得以保留。對于8微米過濾器，約98％的輸入紅細胞被去除，但是僅有4％的白細胞得以保留，顯示使用4.5微米過濾器與更大的8微米孔徑過濾器，促進了相同的紅細胞的去除，但是獲得了更佳的白細胞(指定為“WBC”)保留。
實施例5選擇性富集白細胞并去除血小板和血漿本實施例在實施例1中所述的設(shè)備中，在多種條件下對白細胞去除術(shù)產(chǎn)物樣品進行TFF，并對血小板和血漿的去除進行評價。關(guān)于表1，實驗1至6，使用4.5微米或8微米孔徑過濾器對45ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物進行TFF，再循環(huán)速率(輸入速率)為1690或1880ml/min，過濾速率為15ml/min。過濾進行所示的60或90分鐘。TFF后，測定保留物的白細胞、血小板和血漿。在所有試驗中，不依賴于孔徑(4.5微米或8微米)、再循環(huán)(輸入)速率(1690或1880ml/min)和時間(60分鐘或90分鐘)，92％-約100％的輸入血小板以及約97％至約99％的輸入血漿被從保留物中去除。對于實驗7，使用4.5微米孔徑、1690ml/min再循環(huán)(輸入)速率、15ml/min過濾速率，對全部白細胞去除術(shù)產(chǎn)物(250ml)進行為期90分鐘TFF。TFF后，測定保留物，發(fā)現(xiàn)具有約84％的輸入白細胞，但是僅有2％的輸入血小板和3％的輸入血漿。
表1過濾器孔徑對保留PBMC的影響
這些實驗顯示，對于多樣的孔徑(4.5微米或者8微米)、再循環(huán)(輸入)速率(1690或1880ml/min)、白細胞去除術(shù)樣品體積(45ml-250ml)以及時間(60分鐘至90分鐘)，TFF去除了大部分血小板和血漿。
實施例6從全白細胞去除術(shù)產(chǎn)物中選擇性富集白細胞為了確認按比例擴大至更大樣品時此TFF實施方案將可重現(xiàn)地進行，對250ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物(完整單位)使用指定為5×設(shè)備的TFF設(shè)備，使用4.5微米孔徑過濾器、1680ml/min的再循環(huán)速率以及15ml/min過濾速率，并且與較低的輸入體積進行比較。關(guān)于圖9，對三個不同的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物在不同的天數(shù)執(zhí)行TFF90分鐘。80％至95％之間的紅細胞得以從保留物中去除，但是約80％至約100％的輸入單核細胞得以保留。對于圖9中實驗1，在TFF后，也測定保留物并發(fā)現(xiàn)僅有約2％的輸入血小板和3％的輸入血漿(指定為表1中實驗7)。這些數(shù)據(jù)證明TFF可以重現(xiàn)的富集白細胞，并且優(yōu)先從保留物中去除紅細胞、血小板和血漿。
實施例7選擇性富集單核細胞血液制劑的TFF設(shè)備除富集白細胞之外，也測定了使用TFF設(shè)備從血液制劑中選擇性富集單核細胞。該設(shè)備的這個特定實施方案包括一個反向(“IV型”)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被設(shè)計通過更改越過膜的引力方向來改變流體動力學(xué)(圖1C)。使用4.5微米孔徑過濾器、1680ml/min的再循環(huán)(輸入)速率、15ml/min過濾速率，對235ml白細胞去除術(shù)產(chǎn)物得以進行TFF 90分鐘。經(jīng)過60分鐘的TFF后，為了增加有效的濾過物，無效體積減少到120ml。測定輸入物、保留物和濾過物每個的細胞含量。盡管輸入物具有32％單核細胞和65％淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)保留物具有約71％的單核細胞和相對22％淋巴細胞。濾過物包含1.5％的單核細胞和相對83％淋巴細胞(見表2)。
表2.使用IV型(反轉(zhuǎn))TFF構(gòu)造富集單核細胞
實施例8從TFF分離的細胞中產(chǎn)生樹突細胞在本實施例中，使用TFF分離純化的細胞群在用于從單核樹突前體細胞成熟為樹突細胞的標準條件下培養(yǎng)。使用TFF分離的細胞群約含58.6％單核細胞、22％淋巴細胞以及12.5％粒細胞。此細胞混合物被引導(dǎo)進入組織培養(yǎng)袋X-Vivol5培養(yǎng)基以及IL-4和GM-CSF各500U中。5天后，約50％的細胞被收獲、對DC標志物染色并且使用流式細胞術(shù)分析。其他約50％的細胞暴露于成熟試劑、BCG(2.8×105pfu/ml)和IFNγ(1000U/ml)。24小時后，也收獲那些細胞并且以同樣的方式分析。表3顯示了這些分析的結(jié)果。提供的數(shù)值代表樹突細胞中陽性細胞即對大細胞分選(gating)后的百分率。
表3.未成熟和成熟樹突細胞的細胞表面標志檢測
1這些標志顯示，成熟后陽性細胞的平均熒光強度(MFI)顯著升高根據(jù)流式細胞術(shù)分析的前向光散射和側(cè)向散射參數(shù)，確定了未成熟樹突細胞群包含約71％活DC、21％淋巴細胞和7％其他細胞(主要為未知起源的死細胞)。成熟樹突細胞群包含61％活DC、21％淋巴細胞和15％其他細胞。這些結(jié)果證實，使用使樹突細胞成熟的標準培養(yǎng)條件，可以將由TFF直接從白細胞去除術(shù)材料純化的單核細胞有效的轉(zhuǎn)變成為DC。
實施例8在玻璃珠上分離單核細胞根據(jù)前面的任何實施例，通過TFF分離富集的白細胞群。在TFF過程中，用含1％熱滅活自體同源血漿的AIM-V培養(yǎng)基(Gibco-LifeScience)(結(jié)合介質(zhì)(media))取代緩沖液。玻璃珠(20克)經(jīng)過在結(jié)合介質(zhì)中洗滌2次而制備，繼而置于60ml玻璃注射器中，保持珠子形成柱床。(作為選擇，可以使用Plastic Plus微載體珠(來自SoloHill Engineering，Inc.經(jīng)過處理的苯乙烯共聚物珠子)，或者HilleX microcarrier beads(來自SoloHill Engineering，Inc.的苯乙烯共聚物珠子))。結(jié)合介質(zhì)隨后通過重力流動從柱床干燥。將從TFF富集的白細胞群施加于柱上，收集任何流過液。加入結(jié)合介質(zhì)來提供柱床上的液體薄層。帶有細胞的柱子在37℃溫育30分鐘。
溫育后，打開柱子端口，收集流過液。柱床然后用結(jié)合介質(zhì)洗滌6次(35ml/次)，結(jié)合介質(zhì)通過柱子端口被多次給予和去除，來使珠子的溫和重懸。這些洗滌后使用磷酸鹽緩沖液(“PBS”)洗滌兩次。對所有的洗滌以及最初的流過液進行細胞計數(shù)，并使用前向和側(cè)向散射FACS分析對細胞計數(shù)進行分析，來測定單核細胞百分率。完成洗滌后，使用PBS/0.4％EDTA(w/v)將結(jié)合的單核細胞從珠子上洗脫，繼之以再一次PBS洗滌。在這些級分中獲得的細胞采用與洗滌得到的細胞同樣的方式分析。合并富含單核細胞的級分。
實施例9從玻璃珠洗脫的單核細胞向樹突細胞的分化單核細胞用30ml的PBS洗滌2次，重懸于培養(yǎng)基中(含有500UGM-CSF/ml和500U白介素-4/ml的X-VIVO 15(BiowhittakerCorp.))。一部分(2/3)細胞懸液然后轉(zhuǎn)移入旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(Synthecon)中，在含有5％CO2的潮濕環(huán)境中，于37℃培養(yǎng)6天。培養(yǎng)后，根據(jù)細胞大小、粒度和細胞表面標志，細胞群包括70％未成熟樹突細胞。
實施例10使用前列腺特異性抗原激活來成熟樹突細胞如前面的實施例所述，從前列腺癌患者分離單核細胞。單核細胞于組織培養(yǎng)袋中在添加GM-CSF和白介素-4(各500U/ml)的X-VIVO 15組織培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)6天。然后得到的未成熟樹突細胞暴露于加入培養(yǎng)基中的前列腺特異性抗原(PSMA)(按照U.S.Patent No.5,788,963所述分離)。然后使用成熟劑將未成熟樹突細胞分化形成成熟樹突細胞。將成熟(活化的)樹突細胞加入到T細胞增殖實驗。T細胞培養(yǎng)在補充5％CO2的37℃潮濕孵育器中孵育5天，然后加入1μCi3H-胸苷/微孔板孔。孵育24小時后，細胞在半自動細胞收獲儀(Skatron，Stevina，Va.)中收獲，測定收集細胞的放射活性。T細胞增殖通過測量平均3H-TdR摻入評定。
實施例11培養(yǎng)的成熟樹突細胞呈遞抗原的能力為了評價培養(yǎng)的成熟樹突細胞向來自同一個患者的自身T細胞呈遞抗原并刺激自身T細胞的能力，如上所述進行T細胞增殖實驗(實施例10)。在這些實驗中，破傷風(fēng)類毒素被選用為代表抗原，來測定患者的記憶T細胞是否可以在體外被激活。與患者樹突細胞和破傷風(fēng)類毒素培養(yǎng)的自身T細胞將以顯著高于基礎(chǔ)(缺乏樹突細胞)的水平、以及顯著高于與成熟(活化的)樹突細胞且沒有破傷風(fēng)類毒素(即顯示自身混合淋巴細胞反應(yīng))的水平增殖。因此，破傷風(fēng)類毒素通過樹突細胞的呈遞有利于T細胞增殖。
實施例12刺激自體T細胞對前列腺癌特異的成熟(活化的)樹突細胞被用于刺激前列腺癌患者的自身T細胞。通常按照U.S.Patent No.5,788,963(此處引用其公開內(nèi)容作為參考)所述，在T細胞增殖實驗中，使用轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞系LNCaP細胞的粗細胞裂解液作為代表性前列腺癌抗原。當(dāng)成熟活化樹突細胞和LNCaP裂解液都包括在T細胞培養(yǎng)中的時候，觀察到3HTdR摻入顯著增加。
實施例13將刺激過的自體T細胞給予受試者從受試者通過白細胞去除術(shù)制備T細胞。將T細胞與成熟活化樹突細胞接觸。樹突細胞與轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞系LNCaP細胞的粗細胞裂解液接觸后成熟。在接觸后培養(yǎng)并擴增T細胞和樹突細胞。擴增的活化T細胞以每劑約107至5×109個細胞的劑量給予受試者。
實施例14單核細胞向CD34+干細胞的轉(zhuǎn)化外周血中CD34+細胞的百分率極低，范圍約0.01％至約0.1％。CD34+細胞被公認為成功的造血功能移植所必須的細胞型。單核細胞可以使用上文所述的設(shè)備以及方法從外周血分離，產(chǎn)生1-2×109單核細胞。這些細胞然后可以在含有50ng/ml M-CSF的含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，來產(chǎn)生CD34+細胞。培養(yǎng)必須在非粘附環(huán)境中進行，例如TEFLON培養(yǎng)袋。在標準聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)不會發(fā)育為CD34+細胞。對培養(yǎng)中的大細胞分析顯示，于大的粒度范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)CD34+細胞。
表4.M-CSF培養(yǎng)后CD34在單核細胞的表達
使用此方法制備的CD34+細胞可以用于移植，來重建受者骨髓，或者可以進一步在其他細胞因子存在下培養(yǎng)，來產(chǎn)生內(nèi)皮細胞用于治療，例如心肌梗塞等。
此處提供的實施例意在舉例說明但不是限制本申請的發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其他變化對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)是顯而易見的，并包括在附加權(quán)利要求中。所有出版物、專利、專利申請和其他參考書目在此列出，并同樣在此引用作為參考。
權(quán)利要求
1.用于制備富集白細胞的細胞群的切向流過濾設(shè)備，包括具有交叉流室、濾過物室以及置于其間的過濾器的去除器單元，過濾器與交叉流室和濾過物室流體交流；交叉流室具有一個入口和一個出口，安置入口來引導(dǎo)包括白細胞的血液成分樣品進入交叉流室并且平行于過濾器表面；出口居中置于交叉流室與過濾器表面相對的一部分；過濾器具有為約1至10微米范圍的平均孔徑；以使通過過濾器的樣品流針對白細胞富集血液成分樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，另外包括對交叉流室入口提供預(yù)設(shè)輸入速率的樣品的裝置；控制濾過物通過過濾器進入濾過物室的過濾速率的裝置；并且其中過濾速率控制裝置限制過濾速率低于過濾器非對抗過濾速率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，其中過濾器孔徑為約3微米至約7微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，其中過濾器孔徑為約3微米至約5.5微米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，另外包括與交叉流室入口流體交流的血液成分來源。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的設(shè)備，其中血液成分來源為白細胞去除術(shù)設(shè)備。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，另外包括包括入口和出口的回收單元，交叉流室和回收單元相互連接成環(huán)形，其中交叉流室入口與回收單元出口流體交流，交叉流室出口與回收單元入口流體交流。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的設(shè)備，其中回收單元另外包括樣品入口和洗滌入口。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，另外包括與洗滌入口流體交流的置換液來源。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的設(shè)備，其中置換液為等滲緩沖液或組織培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，其中交叉流室為圓柱形，出口位于過濾器中央對面，并與過濾器表面垂直。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的設(shè)備，另外包括與去除器單元流體交流的細胞處理設(shè)備。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的設(shè)備，其中細胞處理設(shè)備包括珠子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的設(shè)備，其中細胞處理設(shè)備包括富集白細胞的細胞群的培養(yǎng)裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的設(shè)備，其中培養(yǎng)裝置包括具有第一端口和第二端口的容器；單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)，該基質(zhì)與該第一端口和該第二端口流體交流；將基質(zhì)保持在容器中的濾膜，該濾膜具有足夠允許單核樹突細胞前體和樹突細胞通過的孔徑；與第一端口流體交流的排放管道；與第一端口流體交流的收集管道。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，另外包括與第一端口或第二端口流體交流的多個流體來源。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，另外包括適于無菌接受單核細胞前體的可封閉的組織培養(yǎng)容器。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的設(shè)備，其中可封閉的組織培養(yǎng)容器為組織培養(yǎng)袋、瓶或生物反應(yīng)器。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，其中流體來源包括結(jié)合介質(zhì)、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，另外包括與多個流體來源和第一端口流體交流的泵。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，另外包括將基質(zhì)保持在預(yù)設(shè)溫度的溫度控制裝置。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的設(shè)備，其中的溫度控制裝置為加熱器。
23.用于針對白細胞富集血液成分樣品的切向流設(shè)備，包括包括被過濾器(5)分隔的交叉流室(3)和濾過物室(4)的去除器單元，其中交叉流室(3)具有入口(6)和出口(7)，該出口居中置于該室的上部，并且其中入口置于過濾器上方，引導(dǎo)流體與過濾器基本平行的進入交叉流室；提供預(yù)設(shè)輸入速率(14)的樣品通過交叉流室入口的裝置；以及降低通過過濾器的過濾速率(15)的裝置；其中的過濾器具有約3微米至約7微米的孔徑；以及樣品由此在交叉流室內(nèi)保留物中富集白細胞。
24.針對白細胞富集包含血液成分的樣品的切向流設(shè)備，包括具有被過濾器(5)分隔的交叉流室(3)和濾過物室(4)的去除器單元(1)，該交叉流室具有入口(6)和出口(7)，該出口位于入口上方，并居中置于室的上部，并且其中該過濾器置于交叉流室入口下方并與其基本平行；提供預(yù)設(shè)輸入速率(14)的樣品通過交叉流室入口的裝置；提供預(yù)設(shè)過濾速率(15)的流體通過過濾器的裝置，其中的預(yù)設(shè)過濾速率約為預(yù)設(shè)輸入速率的約五分之一至約百分之一；以及提供樣品中預(yù)設(shè)濃度的血細胞的裝置，其中的血細胞預(yù)設(shè)濃度為約每毫升107至約1010個細胞；其中過濾器具有孔徑約為3微米至約7微米的孔；以及樣品由此在交叉流室內(nèi)保留物中富集白細胞。
25.從來自受試者的包含白細胞的血液成分樣品中分離白細胞的方法，該方法包括(1)引導(dǎo)樣品經(jīng)去除器單元入口進入去除器單元；(2)將樣品進行基本平行過濾器的交叉流處理，過濾器孔徑為約1至約10微米；(3)將流體通過過濾器過濾；以及(4)從樣品中選擇性去除非白細胞血液成分，形成富集白細胞的細胞群。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，另外包括通過白細胞去除術(shù)、密度離心、差異裂解、過濾或制備棕黃層從受試者制備樣品，引導(dǎo)入去除器單元。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中非白細胞血液成分包括血漿和血小板。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中非白細胞血液成分包括紅細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中白細胞包括單核細胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，另外包括重復(fù)步驟(1)、(2)和(3)至少兩次，以形成富集白細胞的細胞群。
31.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中富集的細胞群包括至少約20％的白細胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中富集的細胞群包括至少約60％的白細胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，另外包括引起交叉流室中樣品的渦旋運動。
34.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，另外包括使用洗滌溶液洗滌富集白細胞的細胞群。
35.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，另外包括從富集白細胞的細胞群中制備單核樹突細胞前體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中單核樹突細胞前體的分離包括將單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)與富集白細胞的細胞群接觸；允許細胞群中的單核樹突細胞前體可逆的粘附到基質(zhì)上，形成包括單核樹突細胞前體和基質(zhì)的復(fù)合物；將復(fù)合物與非粘附白細胞分離，獲得包括單核樹突細胞前體的復(fù)合物；以及培養(yǎng)該單核樹突細胞前體使之分化形成未成熟或成熟樹突細胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中單核樹突細胞前體在培養(yǎng)前從基質(zhì)上洗脫。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中單核樹突細胞前體在基質(zhì)上被培養(yǎng)。
39.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中基質(zhì)包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。
40.針對白細胞富集血液成分樣品的方法，包括(1)引導(dǎo)樣品進入切向流過濾(TFF)單元，該TFF單元包括交叉流室、濾過物室和與交叉流室和濾過物室流體交流的過濾器，該過濾器具有約為1至約10微米的孔徑；(2)將該樣品以預(yù)設(shè)輸入速率和預(yù)設(shè)過濾速率通過TFF單元再循環(huán)，該預(yù)設(shè)輸入速率至少是預(yù)設(shè)過濾速率的五倍；其中的預(yù)設(shè)過濾速率低于過濾器的非對抗過濾速率；以及(3)分離富集白細胞的細胞群。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中富集的細胞群基本不含非白細胞血液成分。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，另外包括從受試者采集血液，并使用白細胞去除術(shù)、密度離心、差異裂解、過濾或制備棕黃層來制備樣品。
43.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中非白細胞血液成分包括血漿和血小板。
44.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中非白細胞血液成分包括紅細胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中白細胞包括單核細胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中富集白細胞的細胞群包括至少20％的白細胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中富集白細胞的細胞群包括至少60％的白細胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中樣品在交叉流室中以渦旋運動流動。
49.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，另外包括使用洗滌溶液洗滌富集的細胞群。
50.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，另外包括從富集的細胞群中制備樹突細胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中樹突細胞的制備通過將單核樹突細胞前體粘附基質(zhì)與富集的細胞群接觸；允許富集細胞群中的單核樹突細胞前體可逆的粘附到基質(zhì)上，形成包括單核樹突細胞祖細胞和基質(zhì)的復(fù)合物；將復(fù)合物與非粘附白細胞分離，獲得包括單核樹突細胞前體的復(fù)合物；以及培養(yǎng)單核樹突細胞前體使之分化形成未成熟或成熟樹突細胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。
53.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，另外包括分離未成熟或成熟樹突細胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中單核細胞使用促進單核細胞分化成為樹突細胞的細胞因子培養(yǎng)。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中細胞因子為GM-CSF、GM-CSF和IL-4。
56.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中樹突細胞被成熟為成熟樹突細胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中樹突細胞在有益于加工抗原、形成負荷抗原的樹突細胞的條件下，使用抗原培養(yǎng)。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，另外包括將負荷抗原的樹突細胞給予個體的步驟。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中負荷抗原的樹突細胞使用成熟試劑培養(yǎng)使細胞成熟為成熟抗原呈遞樹突細胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中過濾器具有約3至約5.5微米的孔徑。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中白細胞包括CD34+細胞。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中血液成分樣品來自經(jīng)至少一種干細胞動員劑處理的供體。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中干細胞動員劑為G-CSF或環(huán)磷酰胺。
64.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，另外包括針對CD34+細胞富集白細胞。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中針對CD34+細胞富集白細胞包括使用綴合于磁珠的抗-CD34抗體。
66.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，另外包括離體擴增CD34+細胞。
67.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，另外包括從富集白細胞的細胞群中制備單核細胞衍生的多能干細胞。
68.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，另外包括誘導(dǎo)祖細胞或干細胞的分化。
69.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，另外包括誘導(dǎo)分化細胞的轉(zhuǎn)分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了切向流過濾設(shè)備，以及通過去除非白細胞血液成分富集白細胞血液成分非均勻混合物的方法。在特定的實施方案中，本設(shè)備可以提供富集單核細胞的組合物。一個實施方案包括一個具有交叉流室(3)的去除器單元(1)，該室被微孔性過濾器(5)與濾過物室(4)分隔開來，去除單元還有一個切向流入口(6)、一個富集白細胞的流體的流體出口(7)和一個濾過物出口(8)。
文檔編號C12N5/06GK1713951SQ03817779
公開日2005年12月28日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者M·L·博希, P·C·哈里斯, S·J·莫納漢, A·特納, A·L·博因頓, P·A·洛奇 申請人:西北生物治療藥物公司