專利名稱：葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶(PQQGDH)的制備、以及在葡萄糖定量中的使用。
背景技術：
血中葡萄糖濃度是糖尿病的重要標志。另外在使用微生物的發(fā)酵生產中，為了監(jiān)測工序，對葡萄糖濃度進行定量。以往，葡萄糖是通過使用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的酶法定量的。而在使用GOD的方法中為了要對伴隨著葡萄糖氧化反應的同時產生的過氧化氫進行定量，需要向分析系統(tǒng)中添加過氧化氫酶或過氧化物酶。G6PDH可以用于根據(jù)分光學手法的葡萄糖定量中，但一定要向反應體系中添加輔酶NAD(P)。
因此，作為取代到目前為止一直用于葡萄糖酶定量方法的酶的新酶，PQQGDH的應用引人注目。PQQGDH是以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶，催化使葡萄糖氧化生成葡萄糖酸內酯的反應。
已知PQQGDH中存在著膜結合性酶和水溶性酶。膜結合性PQQGDH是分子量約87kDa的信號肽蛋白質，廣泛存在于各種革蘭氏陰性菌中。例如，請參照AM.Cleton Jansen et al.，J.Bacteriol.(1990)172，6308-6315。而水溶性PQQGDH確認存在于乙酸鈣不動桿菌的幾個菌株中(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，其結構基因已被克隆，氨基酸序列已闡明(Mol.Gen.Genet.(1989)，217430-436)。來自A.calcoaceticus的水溶性PQQGDH是分子量約50kDa的均二聚物。與其他的PQQ酶在蛋白質的一級結構上基本沒有同源性。
最近，報告了來自乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)的水溶性PQQGDH的X線晶體結構解析的結果，闡明了以活性中心為首的該酶的高級結構。(A.Oubrie etal.，J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)；A.Oubrie et al.，The EMBOJournal，18(19)5187-5194(1999)；A.Oubrie et al.PNAS，96(21)，11787-11791(1999))。通過這些論文，闡明了水溶性PQQGDH是由6個W-基元構成的βプロペラ蛋白質。
由于PQQGDH對葡萄糖具有高的氧化活性，以及PQQGDH是結合輔酶型的酶，不需要氧作為電子受體，有望在以葡萄糖傳感器的識別元件為代表的分析領域中應用。然而，存在著PQQGDH對葡萄糖的選擇性低的問題。
因此，本發(fā)明的目的是提供對葡萄糖的選擇性高的改進型水溶性PQQGDH。

發(fā)明內容
本發(fā)明人對水溶性PQQGDH進行基因工程學改進，提高他對葡萄糖的選擇性，進行了開發(fā)可應用于臨床檢查和食品分析等的改進型PQQGDH的銳意研究，結果通過在水溶性PQQGDH的特點區(qū)域導入氨基酸突變，成功地獲得了對葡萄糖選擇性高的酶。
即，本發(fā)明提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶中，天然水溶性葡萄糖脫氫酶的1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換，而且與上述天然的水溶性葡萄糖脫氫酶比較，對葡萄糖具有高的選擇性的改進型葡萄糖脫氫酶。本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶與天然的水溶性葡萄糖脫氫酶比較，對葡萄糖有高的選擇性。優(yōu)選本發(fā)明的改進型PQQGDH，與對葡萄糖的反應性相比，對乳糖或麥芽糖的反應性比野生型酶低。更優(yōu)選當以對葡萄糖的反應性作為100％時，對乳糖或麥芽糖的活性在50％以下，更優(yōu)選在40％以下更好，進一步優(yōu)選在30％以下。
在本發(fā)明的一種方式中，本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶中，來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域或其他菌種中的同等區(qū)域中的1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基(即與天然存在的PQQ葡萄糖脫氫酶中的對應氨基酸殘基不同的氨基酸殘基)置換。在本說明書中，氨基酸的位置是以起始蛋氨酸作為1編號的。
在本說明書中使用氨基酸殘基的位置或區(qū)域時，「同等」這一用語表示在結構上類似，但不是同一蛋白的2種以上蛋白質中，某個氨基酸殘基或區(qū)域具有等價的生物學或生物化學功能。例如認為來自乙酸鈣不動桿菌以外生物的水溶性PQQGDH中存在與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域，氨基酸序列類似性高的區(qū)域，而且合理地認為從蛋白質的二級結構看，該區(qū)域在該蛋白質中起到同樣作用時，該區(qū)域稱為「與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域同等的區(qū)域」。另外，該區(qū)域的第7位氨基酸殘基稱為「與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第192位殘基同等位置的氨基酸殘基」。
優(yōu)選的本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶，來自乙酸鈣不動桿菌的PQQGDH的第192位的谷氨酰胺殘基或193位的亮氨酸殘基或其他種類的的同等位置的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。
在本發(fā)明的另一種方式中，提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換的改進型葡萄糖脫氫酶。優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。
在本發(fā)明的另一種方式中，提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基和第167位的天冬氨酸殘基同時被其他氨基酸殘基置換的改進型葡萄糖脫氫酶。優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。另外優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列第167位的天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換，而且第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。
在本發(fā)明的另一種方式中，提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被其他氨基酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換的葡萄糖脫氫酶。優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換。另外優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列第167位的天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被蘇氨酸殘基置換。
在本發(fā)明的另一種方式中，提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換的改進型葡萄糖脫氫酶。優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換，而第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。另外優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被蘇氨酸殘基置換。
在本發(fā)明的另一種方式中，提供在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列1表示的氨基酸序列第193位亮氨酸殘基被其他氨基酸殘基置換的改進型葡萄糖脫氫酶。優(yōu)選是序列編號1的氨基酸序列第193位亮氨酸殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、蛋氨酸殘基、色氨酸殘基或賴氨酸殘基置換。
在另一觀點中，本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶含有序列Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu(式中，Xaa1、Xaa2是任意的天然氨基酸殘基，但是當Xaa1是Gln時，Xaa2不是Leu)。優(yōu)選Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asp，Xaa2是Ala或Gly。
本發(fā)明另外提供編碼上述改進型葡萄糖脫氫酶的基因、含有該基因的載體和含有該基因的轉化體，以及含有本發(fā)明改進型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖分析試劑盒和葡萄糖傳感器。
本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶的酶蛋白對葡萄糖表現(xiàn)出很高的選擇性，而且對葡萄糖具有高的氧化活性，所有可以應用于葡萄糖的高選擇性而且高靈敏度的測定中。
附圖的簡單說明

圖1表示用于做成編碼本發(fā)明改進型PQQGDH的突變基因的質粒pGB2的構造。
圖2表示用于做成編碼本發(fā)明的改進型PQQGDH的突變基因的方法。
圖3表示本發(fā)明的改進型PQQGDH的活性與底物濃度關系的曲線。
具體實施例方式
改進型PQQGDH的結構在本發(fā)明的優(yōu)選改進型葡萄糖脫氫酶中，在來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域或其他種類中的同等區(qū)域中，1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。本發(fā)明的改進型PQQGDH優(yōu)選是序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基或甘氨酸殘基置換，或第193位亮氨酸被丙氨酸殘基、蛋氨酸殘基、甘氨酸殘基、色氨酸殘基或賴氨酸置換。
在另外的方式中，本發(fā)明的改進型PQQGDH除了上述置換之外，序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基同時被其他氨基酸殘基，優(yōu)選是被谷氨酸置換。另外本發(fā)明的改進型PQQGDH除了上述置換之外，優(yōu)選是第452位天冬酰胺殘基同時被其他氨基酸殘基，特別優(yōu)選是被蘇氨酸殘基置換。有關第167位天冬氨酸殘基和第452位天冬酰胺殘基參與PQQGDH對底物的識別和結合分別在特開2001-346587和特開2001-197888中有報道。然而，一般來說，通過對存在于不同結構域的氨基酸殘基同時導入突變，關于底物的選擇性或酶活性怎樣變化完全不能預測。有時酶活性會完全喪失。因此，在本發(fā)明中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過同時導入這些突變，葡萄糖的選擇性得到提高。
在另一觀點中，本發(fā)明的改進型葡萄糖脫氫酶含有序列Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu(式中，Xaa1、Xaa2是任意的天然氨基酸殘基，但是當Xaa1是Gln時，Xaa2不是Leu)優(yōu)選Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asn，Xaa2是Ala或Gly。
改進型PQQGDH的制造方法序列編號2規(guī)定了編碼來自天然的乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的基因序列。編碼本發(fā)明的改進型PQQGDH的基因可以通過在編碼天然的水溶性PQQGDH的基因中，將編碼要置換的氨基酸殘基的堿基序列置換為編碼所期望的氨基酸殘基的堿基序列構建。用于這樣定點突變的堿基序列置換的各種方法在該技術領域中都了解，例如Sambrook等人“Molecular Cloning；A Laboratory Manual”，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York報道的方法。
將這樣獲得的突變基因插入基因表達用載體(例如質粒)，用他轉化適當?shù)乃拗?例如大腸菌)。在該技術領域已知有用于使外源蛋白表達的很多載體、宿主系，作為宿主可以使用細菌、酵母、培養(yǎng)細胞等各種宿主。
在本發(fā)明的改進型PQQGDH中，只要是具有所期望的葡萄糖脫氫酶活性，也可以進一步缺失或置換其他的一部分氨基酸殘基，或附加其他的氨基酸殘基。用于這樣的定點突變的堿基序列置換的各種方法在該技術領域已為人們所熟悉。
另外，本領域技術人員對于來自其他細菌的水溶性PQQGDH也可以將蛋白質的一級結構進行比對，或以該酶的一級結構為基礎預測的二級結構進行比對，可以容易識別與來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域同等的區(qū)域，根據(jù)本發(fā)明，通過將該區(qū)域的氨基酸殘基用其他氨基酸殘基置換，可以獲得葡萄糖選擇性提高的改進型葡萄糖脫氫酶。這些改進型葡萄糖脫氫酶也包括在本發(fā)明的范圍內。
對上述得到的表達改進型PQQGDH的轉化體進行培養(yǎng)，通過離心分離等從培養(yǎng)液中回收菌體后，將菌體用French擠壓機等破碎，或通過滲透壓變化將胞質酶釋放到培養(yǎng)基中。然后經超離心分離，可以得到含有PQQGDH的水溶性級分?；蛘咄ㄟ^使用適當?shù)乃拗鬏d體系，也可以將表達的PQQGDH分泌到培養(yǎng)液中。將得到的的水溶性級分通過離子交換層析、親和層析、HPLC等純化，制備本發(fā)明的改進型PQQGDH。
酶活性的測定方法本發(fā)明的PQQGDH具有以PQQ作為輔酶，催化葡萄糖氧化、生成葡萄糖酸內酯反應的作用。酶活性的測定可以通過利用氧化還原色素的呈色反應對PQQGDH催化葡萄糖氧化同時被還原的PQQ的量進行定量。作為呈色試劑，例如可以使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚吲哚酚)、鐵氰化鉀、二茂(合)鐵等。
對葡萄糖的選擇性本發(fā)明PQQGDH對葡萄糖的選擇性，作為底物使用2-脫氧-D-葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、3-o-甲基-D-葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖和麥芽糖等各種糖，象上述那樣測定酶活性，通過研究相對于以葡萄糖為底物時活性的相對活性，進行評價。
本發(fā)明的改進型PQQGDH與野生型酶比較，對葡萄糖的選擇性高。特別是與對麥芽糖的反應性比較，對葡萄糖的反應性高。因此，使用本改進型酶做成的分析試劑盒或酶傳感器具有在葡萄糖測定中選擇性高、而且即使有各種糖存在的樣品中也可以高靈敏度地檢測葡萄糖的優(yōu)點。
葡萄糖分析試劑盒另外，本發(fā)明的特征在于提供含有改進型PQQGDH的葡萄糖分析試劑盒。本發(fā)明的葡萄糖分析試劑盒含有至少分析1次所足夠量的改進型PQQGDH。典型的試劑盒不僅含有本發(fā)明的改進型PQQGDH，而且含有分析所必要的緩沖液、介質、用于制作標準曲線的葡萄糖標準溶液以及使用的指針。本發(fā)明的改進型PQQGDH可以有各種形式，例如凍結干燥的試藥，或者合適的保存溶液中的溶液。優(yōu)選的本發(fā)明的改進型PQQGDH可以以全酶(ホロ)的形式提供，以脫輔基(apo)酶的形式提供，也可以使用時全酶化。
葡萄糖傳感器本發(fā)明另一個特征是使用本發(fā)明的改進型PQQGDH的葡萄糖傳感器。作為電極使用碳電極、金電極、白金電極等，將本發(fā)明的酶固定在上述電極上。作為固定方法，有使用交聯(lián)試劑的方法、封入到高分子基質(matrix)中的方法、用透析膜包被的方法、光交聯(lián)性聚合物、導電性聚合物、氧化還原聚合物等，或者與二茂(合)鐵或其衍生物為代表的電子傳遞體一起固定在聚合物中或吸附固定于電極上，也可以將他們組合使用。本發(fā)明的改進型PQQGDH優(yōu)選是以全酶形式固定于電極上，也可以以脫輔基酶形式固定，將PQQ作為另外的一層或在溶液中提供。典型的是使用戊二醛將本發(fā)明的改進型PQQGDH固定在碳電極上后，用含有氨基的試劑進行處理，對戊二醛進行封閉(blocking)。
葡萄糖濃度的測定可以象以下那樣進行。將緩沖液加到恒溫杯中，加PQQ和CaCl2、以及傳遞體，維持在一定溫度。作為傳遞體可以使用鐵氰化鉀、吩嗪硫酸甲酯等。作為作用電極使用固定了本發(fā)明的改進型PQQGDH的電極，使用對電極(例如白金電極)和參此電極(例如Ag/AgCl電極)。向碳電極外加一定的電壓，電流恒定后，加含有葡萄糖的樣品，測定電流的增加。根據(jù)通過標準濃度葡萄糖溶液制作的標準曲線，可以計算樣品中的葡萄糖濃度。
在本說明書中，明確引用的所有專利和參考文獻的內容全部作為本說明書的一部分在這里引用。另外，本申請具有的優(yōu)先權的基礎的申請日本專利申請2003-71760以及2002-196177號說明書和圖記載的內容全部作為本說明書的一部分在這里引用。
以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體說明，但本發(fā)明并不限定于實施例1改進型酶PQQGDH基因的構建以序列編號2所示的來自乙酸鈣不動桿菌的PQQGDH的結構基因為基礎，導入突變。質粒pGB2是將編碼來自乙酸鈣不動桿菌的PQQGDH的結構基因插入到載體pTrc99A(フアルマシア公司生產)的多克隆部位的質粒(圖1)。按照常規(guī)方法通過定點突變法將編碼第192的谷氨酰胺殘基或193的亮氨酸殘基的堿基序列分別置換為編碼丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、蛋氨酸殘基、色氨酸殘基或賴氨酸殘基的堿基序列。另外，將編碼第167的天冬氨酸殘基或第452的天冬酰胺殘基的堿基序列分別置換為編碼谷氨酸殘基或甘氨酸殘基的堿基序列。定點突變使用質粒pGB2，按圖2所示的方法進行。表1給出了突變中使用的合成寡核苷酸靶引物的序列。為了做成具有2處突變的突變體，同時使用2種寡核苷酸靶引物，與上述同樣導入突變。
表1

將含有編碼來自乙酸鈣不動桿菌的PQQGDH的基因的一部分的KpnI-Hind III片段整合到載體質粒pKF18k(寶酒造(株))，以他作為模板。將該模板50fmol和寶酒造(株)生產Mutan(登錄商標)-ExpressKm試劑盒所附帶的選擇引物5pmol、磷酸化的靶引物50pmol與總量(20μl)的1/10量的同試劑盒的退火緩沖液一起混合，于100℃下進行3分鐘熱處理使質粒變性，形成單鏈。選擇引物是用于使處于pKF18k的卡那霉素抗性基因上的雙重琥珀型突變恢復的引物。將該引物置于冰上5分鐘，使引物退火。向該引物中加3μl的同試劑盒延伸緩沖液、1μl的T4 DNA連接酶、1μl的T4 DNA聚合酶和5μl的滅菌水，合成互補鏈。用該互補鏈轉化DNA的錯配修復能力缺損株E.coli BMH71-18mutS，振蕩培養(yǎng)過夜，使質粒擴增。
然后用從培養(yǎng)中提取的質粒轉化E.coli MV1184，從他們的菌落中提取質粒。然后對這些質粒進行測序，確認目的突變的導入。用這些片段替換質粒pGB2上的編碼野生型PQQGDH的基因的Kpn I-HindIII片段，構建改進型PQQGDH的基因。
實施例2改進型酶的制備將編碼野生型或改進型PQQGDH的基因插入到E.coli用的表達載體pTrc99A(Phamarsham公司生產)的多酶切位點，用構建的質粒轉化E.coli DH5α株。使用坂口燒瓶在450ml的L培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素50μg/ml、氯霉素30μg/ml)中對轉化體于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，接種到含有1mMCaCl2、500μMPQQ的71的L培養(yǎng)基。培養(yǎng)開始后約3小時，添加終濃度為0.3mM的異丙基硫代半乳糖苷，然后再培養(yǎng)1.5小時。經離心分離(5000×g、10分鐘、4℃)從培養(yǎng)液中回收菌體，將該菌體用0.85％NaCl溶液洗2次。收集的菌體用Freeh擠壓機破碎，經離心分離(10000×g、15分鐘、4℃)將未破碎的菌體除去。對上清進行超離心分離(160500×g(40000r.p.m)、90分鐘、4℃)，得到水溶性級分。將該級分作為粗純化酶標準品用于以下實施例。
實施例3酶活性的測定將實施例2得到的的野生型和各個改進型PQQGDH的粗純化酶標準品分別在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，進行1小時以上全酶化。按照每份187μl將他分裝，加3μl的活性試劑(6mMDCIP48μl，600mMPMS 8μl，10mM磷酸緩沖液pH7.0 16μl)和各個濃度的D-葡萄糖溶液10μl，測定酶活性。
酶活性的測定在室溫下于10mM MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0)中使用PMS(吩嗪硫酸甲酯)-DCIP(2，6-二氯酚吲哚酚)，用分光光度計追蹤DCIP的600nm的吸光度變化，將該吸光度的減少速度作為酶反應的反應速度。此時，將在1分鐘內還原1μmol DCIP的酶活性作為1個單位。另外，DCIP在pH7.0的摩爾吸光系數(shù)定為16.3mM-1。
從底物濃度對酶活性的曲線求Km。結果如表2所示。
表2

實施例4底物特異性的評價就各個改進型酶的粗純化酶標準品研究底物特異性。將實施例2得到的的野生型和各個改進型PQQGDH的粗純化酶標準品分別在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，進行1小時以上全酶化。按照每份187μl將他分裝，加3μl的活性試劑(含6mM DCIP，600mM PMS，10mM磷酸緩沖液pH7.0)和底物。作為底物加400mM的葡萄糖或其他糖使終濃度為20mM或100mM，于室溫下溫育30分鐘，與實施例3同樣測定酶活性。將以葡萄糖為底物時的活性作為100％，用相對于該值的相對活性表示活性值。結果如表3-6所示。
表3

表4

表5

表6

另外，表7-8給出了使用包含雙重突變的本發(fā)明的改進型酶，測定酶活性的結果。本發(fā)明的改進型酶無論哪一個與對麥芽糖的反應性進行比較，對葡萄糖都表現(xiàn)出高的反應性。
表7

表8

實施例5與底物濃度的關系對本發(fā)明的改進型PQQGDH的活性與底物的關系進行研究。對各個改進型酶在有1μMPQQ、1mM CaCl2存在下，進行1小時以上全酶化，于各種濃度的葡萄糖和5μMPQQ、10mM CaCl2存在下測定酶活性。方法根據(jù)實施例3所述的酶活性測定方法，以DCIP的600nm的吸光度的變化作為指標。結果如圖3所示。本發(fā)明的改進型PQQGDH與野生型相比，在高葡萄糖濃度下飽和。另外，無論哪一個直到葡萄糖濃度200mM也沒有看到底物抑制，Ksi在200mM以上。
實施例6酶的純化將實施例2得到的野生型和Gln192Asp粗純化酶分別吸附到用10mM磷酸緩沖液pH7.0平衡的陽離子交換層析用充填柱TSKgel CM-TOYOPEARL 650M(東曹株式會社)。將該柱用750ml的10mM磷酸緩沖液pH7.0清洗后，用含有0-0.2M NaCl的10mM磷酸緩沖液pH7.0將酶洗脫下來。洗脫以5ml/min流速進行?；厥蘸蠫DH活性的級分，用10mM MOPS-NaOH緩沖液(pH7.0)透析過夜。這樣純化后得到電泳均一的改進型PQQGDH蛋白質。對得到的純化酶標準品測定對各個底物的酶活性。結果如表9-10所示。
表9

表10

實施例7酶傳感器的制作和評價向5單位的Gln192Ala改進型酶加碳糊20mg，使其冷凍干燥。將他們充分混合后，只填充到已填充了碳糊約40mg的碳糊電極表面，在濾紙上研磨。將該電極于含有1％的戊二醛的10mM MOPS緩沖液(pH7.0)中在室溫下處理30分鐘后，在含有20mM賴氨酸的10mM MOPS緩沖液(pH7.0)中于室溫下處理20分鐘，使戊二醛封閉。在室溫下于10mM MOPS緩沖液(pH7.0)中對該電極處理1小時以上，使其平衡。將電極保存在4℃。
使用制作的酶傳感器進行葡萄糖濃度的測定。使用固定了本發(fā)明的改進型PQQGDH的酶傳感器，可以在0.1mM-5mM范圍進行葡萄糖的定量。
本發(fā)明的改進型水溶性PQQGDH由于對葡萄糖的選擇性高，可用作血中葡萄糖測定用傳感器的元件。
序列表<110>Sode，Koji<120>葡萄糖脫氫酶<130>psd9010WO<150>JP 2003-71760<151>2003-03-17<150>JP 2002-196177<151>2002-07-04<160>19<210>1<211>454<212>PRT<213>乙酸鈣不動桿菌<400>1Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125
Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys yal Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Va1 Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335Thr Cys Gly Glu Mer Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile
370 375 380Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450<210>2<211>1612<212>DNA<213>乙酸鈣不動桿菌<400>2agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900
acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612<210>3<211>8<212>PRT<213>乙酸鈣不動桿菌<220>
<222>4<223>Xaa是任何氨基酸殘基<222>5<223>Xaa是任何氨基酸殘基<400>3Gly Arg Asn Xaa Xaa Ala Tyr Leu<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>4ataagcaagc gggttacgc cc 22
<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>5caaataagca agcccgttac gcccttg 27<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>6caaataagca gcctggttac g 21<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>點突變的引物<400>7gaacaaataa gcaccctggt tacgccc 27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>8
cctgactgat gttcttttga tgaagg 26<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>9catctttttg gacagttccg gcagtat 27<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>10caaataagca agcaggttac gcccttg 27<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>11caaataagca agaaagttac gcccttg 27<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物
<400>12caaataagca aggctgttac gcccttg 27<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>13caaataagca aggttgttac gcccttg 27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>14caaataagca agatcgttac gcccttg 27<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>15caaataagca agttcgttac gcccttg 27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>16caaataagca agtttgttac gcccttg 27<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>17gaacaaataa gccatctggt tacgccc 27<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>18gaacaaataa gctttctggt tacgccc 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>點突變的引物<400>19gaacaaataa gcccactggt tacgccc 2權利要求
1.改進型葡萄糖脫氫酶，在以吡咯并喹啉醌為輔酶的水溶性葡萄糖脫氫酶中，天然水溶性葡萄糖脫氫酶的1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換，而且與上述天然的水溶性葡萄糖脫氫酶比較，對葡萄糖具有高的選擇性。
2.改進型葡萄糖脫氫酶，在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，在來自乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域或其他種的同等區(qū)域中的1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。
3.改進型葡萄糖脫氫酶，在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第192位谷氨酰胺殘基或其他種中同等位置的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。
4.改進型葡萄糖脫氫酶，在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。
5.權利要求4所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。
6.改進型葡萄糖脫氫酶，其特征是在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基和第167位的天冬氨酸殘基同時被其他氨基酸殘基置換。
7.權利要求6所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被其他氨基酸殘基置換，而且第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。
8.權利要求6所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換，而且第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換。
9.改進型葡萄糖脫氫酶，其中在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列的第167位天冬氨酸殘基被其他氨基酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。
10.權利要求9所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。
11.權利要求9所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第167位天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被蘇氨酸殘基置換。
12.改進型葡萄糖脫氫酶，其中在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列的第192位谷氨酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。
13.權利要求12所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基置換。
14.權利要求12所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列第192位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基、亮氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、絲氨酸殘基、或天冬氨酸殘基置換，而且第452位天冬酰胺殘基被蘇氨酸殘基置換。
15.改進型葡萄糖脫氫酶，其特征是在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第193位亮氨酸殘基或其他種中同等位置的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。
16.改進型葡萄糖脫氫酶，其特征是在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，序列編號1表示的氨基酸序列第193位亮氨酸殘基被其他氨基酸殘基置換。
17.權利要求16所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中序列編號1表示的氨基酸序列的第193位亮氨酸殘基被丙氨酸殘基、甘氨酸殘基、蛋氨酸殘基、色氨酸殘基或賴氨酸殘基置換。
18.改進型葡萄糖脫氫酶，其特征是在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中含有序列Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu式中，Xaa1、Xaa2是任意天然氨基酸殘基，但是當Xaa1是Gln時，Xaa2不是Leu。
19.權利要求18所述的改進型葡萄糖脫氫酶，其中Xaa1是Ala、Gly、Glu、Leu、Phe、Ser或Asp，Xaa2是Ala或Gly。
20.編碼權利要求1-19任一項所述的改進型葡萄糖脫氫酶的基因。
21.含有權利要求20所述的基因的載體。
22.含有權利要求20所述的基因的轉化體。
23.權利要求22所述轉化體，其中權利要求20所述的基因整合在主染色體中。
24.含有權利要求1-19任一項所述的改進型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖分析試劑盒。
25.含有權利要求1-19任一項所述的改進型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖傳感器。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進型葡萄糖脫氫酶，其特征是在以吡咯并喹啉醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶中，在來自乙酸鈣不動桿菌的水溶性PQQGDH的第186位殘基至第206位殘基的區(qū)域或其他種類中的同等區(qū)域中的1個或1個以上的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基置換。另外本發(fā)明提供編碼上述改進型葡萄糖脫氫酶的基因、含有該基因的載體和含有該基因的轉化體，以及含有本發(fā)明改進型葡萄糖脫氫酶的葡萄糖分析試劑盒和葡萄糖傳感器。
文檔編號C12Q1/00GK1671839SQ03817880
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月2日 優(yōu)先權日2002年7月4日
發(fā)明者早出廣司 申請人:早出廣司