修飾的admts4分子及其使用方法

文檔序號：450877閱讀：929來源：國知局

專利名稱：修飾的admts4分子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及修飾的聚集蛋白聚糖酶，編碼這種酶的核苷酸和制備這些酶的方法。本發(fā)明進一步涉及該修飾的聚集蛋白聚糖酶的抑制劑以及其抗體的開發(fā)。該抑制劑和抗體可以有效治療各種聚集蛋白聚糖酶相關(guān)病癥，包括骨關(guān)節(jié)炎。
背景技術(shù)：
聚集蛋白聚糖是關(guān)節(jié)軟骨主要的胞外成分。它是一種負責給軟骨提供壓縮性和彈性的機械性能的蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖的損失牽連關(guān)節(jié)疾病如骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨的退化。
聚集蛋白聚糖含有兩個N末端球形結(jié)構(gòu)域，G1和G2，被蛋白水解敏感性球間結(jié)構(gòu)域分隔開，隨后是糖胺聚糖附著區(qū)域和C末端球形結(jié)構(gòu)域，G3。在聚集蛋白聚糖的球間結(jié)構(gòu)域內(nèi)已經(jīng)鑒定了至少兩個酶切割位點。已經(jīng)觀察到聚集蛋白聚糖的球間結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個酶切割位點(asn341-phe342)被幾種已知金屬蛋白酶切割。在聚集蛋白聚糖內(nèi)的第二個聚集蛋白聚糖切割位點(glu373-ala374)斷裂是由于聚集蛋白聚糖酶活性。因此該切割位點(glu373-ala374)稱作聚集蛋白聚糖酶切割位點。
近年來已經(jīng)克隆了很多聚集蛋白聚糖酶。這些酶屬于稱作“ADAMTS”的鋅金屬蛋白酶的亞家族，ADAMTS是一種含血小板反應(yīng)蛋白I型基序的解聯(lián)蛋白樣金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域(ADisintegrin-likeAndMetalloprotease domain withThromboSpondin type I motifs)的縮寫。現(xiàn)在ADAMTS家族由基于它們共同結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)彼此相關(guān)的19個成員組成。典型的ADAMTS蛋白含有前蛋白序列末端上游弗林蛋白酶切割位點中的典型信號序列、在家族成員中非常保守的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、功能相關(guān)性仍未知的解聯(lián)蛋白樣基序和至少一個血小板反應(yīng)蛋白I型(TSP1)結(jié)構(gòu)域。ADAMTS家族成員在它們含有的TSP-1數(shù)量上不同，可以從1至15的范圍(Cal等.，2002；Somerville等.，2003)。ADAMTS序列最多變的區(qū)域是位于含有10個結(jié)構(gòu)保守半胱氨酸殘基的富含半胱氨酸區(qū)域下游的“間隔”結(jié)構(gòu)域。ADAMTS蛋白通過間隔結(jié)構(gòu)域和TSP-1基序內(nèi)的相互作用能夠與胞外基質(zhì)成分結(jié)合(Kunoand Matsushima，1998；Tortorella等.，2000)。
ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)由IL-1刺激的軟骨合成(Tortorella，等.，Science，2841664-1666，1999)并與退形性關(guān)節(jié)疾病如骨關(guān)節(jié)炎過程中聚集蛋白聚糖降解有關(guān)(Abbaszade等.，JBiol Chem，27423443-23450，1999)。ADAMTS4也參與腦部富含的hyaluranan結(jié)合(BEHAB)/brevican-一種在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中戲劇性增加的蛋白的切割(Matthews等.，J.Biol.Chem.27522695-22703，2000)。因此通過抑制ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性可能使骨關(guān)節(jié)炎和任何其它ADAMTS4相關(guān)疾病好轉(zhuǎn)。然而，對ADAMTS4作用的研究被純化的ADAMTS4蛋白的不穩(wěn)定性所阻礙。
發(fā)明概述本發(fā)明基于對全長弗林蛋白酶加工的ADAMTS4分子能夠接受自身催化C末端截短的觀察。自身消化ADAMTS4分子顯示出結(jié)合硫酸化糖胺聚糖(GAGs)的親和力顯著降低，但是保留了聚集蛋白聚糖酶活性。進一步研究顯示具有修飾的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的ADAMTS分子可能有酶活性，同時與天然酶相比具有提高的穩(wěn)定性。例如，發(fā)現(xiàn)具有截短間隔結(jié)構(gòu)域或無間隔結(jié)構(gòu)域的修飾ADAMTS4有生物活性并且比它們的全長蛋白更穩(wěn)定。修飾的ADAMTS蛋白可以大量表達和分離，因此允許進一步的蛋白特性研究，如結(jié)晶學和酶動力學研究。該純化、穩(wěn)定的蛋白也將促進制備抗ADAMTS的抗體和ADAMTS酶的抑制劑的開發(fā)。
本發(fā)明的一個方面涉及修飾的ADAMTS4(mTS4)蛋白；編碼mTS4蛋白的核苷酸序列；和制備mTS4蛋白的方法。優(yōu)選，本發(fā)明的mTS4蛋白比相應(yīng)的全長蛋白更穩(wěn)定和可以以更高水平表達。更優(yōu)選，本發(fā)明的mTS4蛋白更穩(wěn)定并具有生物學活性。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有生物學活性的分離的mTS4蛋白?？梢杂脴藴手亟MDNA技術(shù)或用弗林蛋白酶對全長ADAMTS4分子的自身消化制備mTS4蛋白。該實施方案特別包括具有SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27和46-49中所述的氨基酸序列的mTS4蛋白，以及其變異體和片段。這些蛋白可以用于例如ADAMTS4酶的特性研究、制備抗ADAMTS4的抗體，和篩選ADAMTS4抑制劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了無生物學活性，但是比天然蛋白更穩(wěn)定的分離的mTS4蛋白。該實施方案特別包括具有SEQ ID NOS29，31，32，40和50-53中所述的氨基酸序列的mTS4蛋白，以及其變異體和片段。這些蛋白可以用于例如結(jié)晶學研究。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含ADAMTS4部分和非ADAMTS4部分的分離的mTS4蛋白。mTS4蛋白的非ADAMTS4部分可以用作標記以促進免疫識別或蛋白純化，或作為增加分泌的信號序列。含非ADAMTS4的mTS4蛋白可以用于例如在受試者中產(chǎn)生抗mTS4抗體，純化ADAMTS4配體，和鑒定篩選試驗中抑制ADAMTS4蛋白與ADAMTS4底物相互作用的分子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的特征是編碼本發(fā)明mTS4蛋白的核酸分子。該實施方案特別包括包含編碼多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，該多肽包含選自SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27，29，31，32，40和46-53的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明mTS4蛋白的核酸分子的載體。這些載體可以用于制備本發(fā)明mTS4蛋白的新方法。
本發(fā)明的另一個方面涉及抗mTS4抗體，mTS4抑制劑，和使用抗mTS4抗體或mTS4抑制劑治療聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明的mTS4蛋白用于治療聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病如骨關(guān)節(jié)炎的聚集蛋白聚糖酶抑制劑和聚集蛋白聚糖酶的抗體的開發(fā)。該實施方案特別包括鑒定和開發(fā)阻斷酶活性的聚集蛋白聚糖酶抑制劑的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制聚集蛋白聚糖酶活性的藥物組合物，其中該組合物包含本發(fā)明的抗mTS4抗體和/或mTS4抑制劑，和藥用載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制哺乳動物的聚集蛋白聚糖酶活性的方法，包括給該哺乳動物施用有效量的包含本發(fā)明抗mTS4抗體和/或mTS4抑制劑的藥物組合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療罹患以聚集蛋白聚糖降解為特征的病癥的患者或預(yù)防這種病癥的方法。這些方法需要給需要這種治療的患者施用有效量的包含本發(fā)明抗mTS4抗體和/或mTS4抑制劑的藥物組合物。
本文的另外方面將在說明書中部分陳述，部分由說明書可以顯而易見，和/或可以從實施本發(fā)明中學到。本發(fā)明在權(quán)利要求中陳述和部分指出，和公開內(nèi)容不應(yīng)解釋為限制權(quán)利要求的范圍。下列的詳細說明包括本發(fā)明各種實施方案的示例性陳述，它們不限制要求保護的本發(fā)明。附圖組成本說明書的一部分，并且連同說明書用于闡明實施方案并且不限制本發(fā)明。

圖1是顯示自身消化的ADAMTS4同工型(圖A)和切割位點(圖B)的圖。
圖2是顯示修飾的mTS4分子的各種實施方案的圖(構(gòu)建體B-I)。
發(fā)明詳述I.定義為了更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。另外的定義在詳述全文中描述。
術(shù)語“聚集蛋白聚糖酶活性”是指因聚集蛋白聚糖酶結(jié)合聚集蛋白聚糖而打斷或啟動的至少一個細胞過程。通常，聚集蛋白聚糖酶活性是指在glu373-ala374對聚集蛋白聚糖的蛋白水解切割。聚集蛋白聚糖酶活性包括但不限于聚集蛋白聚糖酶與聚集蛋白聚糖結(jié)合，和聚集蛋白聚糖被聚集蛋白聚糖酶切割。聚集蛋白聚糖酶活性也可以包括由本發(fā)明的修飾的聚集蛋白聚糖酶結(jié)合或切割聚集蛋白聚糖產(chǎn)生的生物學反應(yīng)。
如這里使用的術(shù)語“修飾的聚集蛋白聚糖酶”是指通過與天然聚集蛋白聚糖酶相比至少一個氨基酸的置換、插入、缺失或修飾而改變的聚集蛋白聚糖酶。本發(fā)明修飾的聚集蛋白聚糖酶可以具有比相應(yīng)天然聚集蛋白聚糖酶分子更大的穩(wěn)定性。本發(fā)明修飾的聚集蛋白聚糖酶還可以在體內(nèi)和體外以比相應(yīng)天然聚集蛋白聚糖酶蛋白更高的水平表達。如果修飾的聚集蛋白聚糖酶保留至少一種前段中定義的聚集蛋白聚糖酶活性，那么它具有“生物學活性”。修飾的聚集蛋白聚糖酶也可以含有多個改變，如蛋白不同部分的氨基酸置換、修飾、插入和缺失。
如這里使用的術(shù)語“穩(wěn)定性”一般是指蛋白降解速度降低，由此增加其半衰期、穩(wěn)定性和/或表達水平。幾種因素影響蛋白在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性，例如，pH、鹽濃度、溫度、蛋白降解，例如通過蛋白酶、金屬離子、蛋白自身催化、疏水性等。使蛋白更穩(wěn)定的條件通常包括維持蛋白比正常更長的時間處于折疊構(gòu)象的條件，由此維持更長時間的生物學活性。蛋白穩(wěn)定性增加通常增加其半衰期和表達水平，由此使得大量純化蛋白用于治療目的和開發(fā)抑制劑成為可能。
下列分部中進一步詳細描述本發(fā)明的各個方面。這里指出的專利和科學文獻建立了本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的知識。這里引用的出版的美國專利、允許的申請、公開的申請(美國和外國)和參考文獻，包括GenBank數(shù)據(jù)庫序列引入這里作為參考，其程度如同具體和單獨指出每篇文獻引入作為參考。
II、修飾的ADAMTS4(mTS4)分子及其實用性位于人染色體1的1q21-q23位點的人ADAMTS4基因編碼837個氨基酸的前蛋白(pro-protein)(SEQ ID NO1)。該蛋白含有N末端前肽(氨基酸殘基1-212)、金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基213-436)、解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基437-519)、TSP-1基序(氨基酸殘基520-576)、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基577-685)和間隔(氨基酸殘基686-837)。不象ADAMTS家族的其它蛋白，ADAMTS4蛋白完全缺乏C末端TSP-1基序。
ADAMTS4前蛋白的N末端前肽可以被弗林蛋白酶或轉(zhuǎn)運高爾基體內(nèi)相關(guān)的前蛋白轉(zhuǎn)換酶切割，導致缺乏前蛋白區(qū)域的成熟酶釋放。弗林蛋白酶處理的ADAMTS4具有酶活性并且正常稱作“全長”ADAMTS4酶。
ADAMTS4負責聚集蛋白聚糖-一種軟骨的主要蛋白聚糖的降解，和brevican-一種腦部特異性胞外基質(zhì)蛋白的降解。ADAMTS4對聚集蛋白聚糖和brevican的降解提示這種酶在關(guān)節(jié)疾病、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能和可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的關(guān)鍵作用。
ADAMTS4酶活性抑制可以預(yù)防聚集蛋白聚糖損失和改善與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的軟骨退化。然而，開發(fā)ADAMTS4抑制劑的努力被一種事實阻礙-由于通常該酶的表達水平低和穩(wěn)定性差，難于大量分離和純化ADAMTS4蛋白。因此，為了研究ADAMTS4在疾病狀態(tài)中的作用，以及開發(fā)治療涉及聚集蛋白聚糖切割的疾病的療法和組合物，需要鑒定新形式的ADAMTS4和進一步開發(fā)大量分離和純化ADAMTS4蛋白的方法。修飾的ADAMTS4分子可能具有切割聚集蛋白聚糖的生物學活性并可以以比它們的全長副本更高的水平表達。它們可以用于篩選ADAMTS4和其它聚集蛋白聚糖酶的抑制劑，和開發(fā)ADAMTS4的抗體。通過酶動力學和結(jié)晶學研究，更穩(wěn)定的mTS4分子也允許ADAMTS4蛋白的更好生物化學和生物物理特性。
如以下使用的本發(fā)明的修飾的ADAMTS4(mTS4)分子包括分離的多肽和分離的多核苷酸。
分離的多肽本發(fā)明的一個方面涉及分離的mTS4蛋白。在一個實施方案中，mTS4蛋白具有聚集蛋白聚糖酶活性并可以用于篩選聚集蛋白聚糖酶抑制劑。在另一個實施方案中，mTS4蛋白用于開發(fā)聚集蛋白聚糖酶的抗體。
可以使用標準分子生物學和細胞生物學技術(shù)制備經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。通過篩選ADAMTS4片段的組合文庫可以鑒定具有聚集蛋白聚糖酶活性的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。ADAMTS4編碼序列片段的文庫可以用于產(chǎn)生多變的ADAMTS4片段，進行修飾的ADAMTS4的篩選和隨后選擇。在一個實施方案中，在每個分子僅發(fā)生大約一個缺口的條件下，用核酸酶處理ADAMTS4編碼序列的雙鏈PCR片段，雙鏈DNA變性，DNA復(fù)性形成雙鏈DNA，它可以包括來自不同缺口產(chǎn)物的正義/反義對，用S1核酸酶處理從再形成的雙螺旋中除去單鏈部分，并將所產(chǎn)生片段文庫連接到表達載體，可以產(chǎn)生編碼序列片段文庫。通過這個方法可以得到表達文庫，它編碼各種大小的ADAMTS4蛋白的N末端、C末端和內(nèi)部片段。
本領(lǐng)域已知用于篩選由截短產(chǎn)生的組合文庫的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫得到具有選擇性性能的基因產(chǎn)物的幾種技術(shù)。服從于篩選大基因文庫的高流通量分析的最廣泛使用技術(shù)典型地包括將基因文庫克隆到可復(fù)制表達載體中，用所產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)化適當細胞，和在期望活性的檢測促進編碼其產(chǎn)物被檢測的基因的載體條件下表達重組基因。遞推集團誘變(REM)-一種增加文庫中功能性突變體頻數(shù)的技術(shù)，可以與篩選試驗聯(lián)合鑒定mTS4突變體(DeLagrave等.，ProteinEngineering，6327-331，1993)。
也可以用合成方法，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)產(chǎn)生具有小于大約100個氨基酸，和通常小于大約50個氨基酸的ADAMTS4蛋白的部分。例如，可以使用任何市場上可得到的固相技術(shù)合成這種多肽，如Merrifield固相合成法，其中氨基酸順序添加到生長的氨基酸鏈。
本發(fā)明也提供了mTS4融合蛋白。mTS4融合蛋白含有彼此符合讀框融合的ADAMTS4相關(guān)多肽和非ADAMTS4多肽。ADAMTS4相關(guān)多肽對應(yīng)于經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白或其變異體的全部或部分。
可以采用肽接頭序列通過足以確保每個多肽折疊為其二級和三級結(jié)構(gòu)的距離將ADAMTS4相關(guān)多肽和非ADAMTS4多肽成分分隔開來。使用本領(lǐng)域熟知的標準技術(shù)將這種肽接頭序列引入融合蛋白。可以基于下列因素選擇合適的肽接頭序列(1)它們采用靈活延伸構(gòu)象的能力；(2)它們不能采用可以與ADAMTS4相關(guān)多肽和非ADAMTS4多肽上的功能性表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；和(3)缺乏可能與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水和帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有g(shù)ly、asn和ser殘基。其它接近中性氨基酸，如thr和ala，也可以用在接頭序列中?？梢杂行в米鹘宇^的氨基酸序列是本領(lǐng)域熟知的。接頭序列通常長度可以從1至大約50個氨基酸。當ADAMTS4相關(guān)多肽和非ADAMTS4多肽具有可以用于分離功能性結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)域時，不需要接頭序列。
mTS4蛋白可以含有肽標記以促進mTS4蛋白的鑒定和/或純化。該標記肽是很好鑒定的肽(如Poly-His、標記-表位、鏈球菌-標記、c-myc表位、HA-標記)或小蛋白(細菌谷胱苷肽s-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白等)的短片。標記序列可以位于蛋白序列的任何位置。優(yōu)選，標記序列位于蛋白C末端或插在蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)之間。標記序列通常與靶基因一起克隆并作為融合蛋白的一部分表達。通常，已經(jīng)可利用這些融合-標記的抗體來監(jiān)測融合蛋白表達和純化。因此，融合-標記用作通用標記，很象二級抗體。很多標記具有它們自身的特性。Poly-His融合蛋白(6×His)可結(jié)合鎳-瓊脂糖凝膠或鎳-HRP。GST融合蛋白可結(jié)合谷胱苷肽-瓊脂糖凝膠。因此，僅一個親核層析步驟可以達到高程度的融合蛋白純化。融合蛋白的純度可以由標記-抗體追蹤。通常，融合蛋白直接注射給動物產(chǎn)生抗體。隨后可以用酶處理除去有些融合標記產(chǎn)生無標記的重組蛋白。
優(yōu)選，用標準重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明的mTS4融合蛋白。用常規(guī)技術(shù)包括自動DNA合成儀可以合成融和基因?？晒┻x擇地，可以使用在兩個連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補突出端的固定引物實施基因片段的PCR擴增，該基因片段可以隨后退火并再次擴增產(chǎn)生嵌合基因序列。而且，很多表達載體可以從市場上獲得，它們已經(jīng)編碼了融合部分(如GST多肽)。ADAMTS4相關(guān)多肽可以克隆進入這種表達載體，使得融合部分符合讀框地連接ADAMTS4相關(guān)多肽。
信號序列可以用來促進本發(fā)明的mTS4或mTS4融合蛋白的分泌和分離。信號序列典型的特征是通常在一個或多個切割事件中從分泌過程中的成熟蛋白切割的疏水氨基酸核心。這種信號肽含有允許通過分泌途徑從成熟蛋白切割信號序列的加工位點。
本發(fā)明進一步包括經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的片段和變異體。已知例如很多保守氨基酸置換可能不顯著改變蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，因此也保留了生物學性能。例如，認識到保守氨基酸置換可以在具有堿性側(cè)鏈的氨基酸中進行，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；在具有酸性側(cè)鏈的氨基酸中進行，如天冬氨酸和谷氨酸；在具有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸中進行，如天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；和在具有非極性側(cè)鏈的氨基酸中進行，如丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。因此，原始mTS4蛋白的這些修飾和缺失可以用作原始mTS4蛋白的生物學活性替代物。通過兩種蛋白(原始蛋白和變異體)接受實施例所述的生物學活性試驗，可以容易確定給定的mTS4變異體或mTS4融合蛋白是否保留了原始蛋白的生物學活性。
象氨基酸的置換也可以基于親水性進行，尤其是生物學功能等同的多肽或多肽片段有意用于免疫實施方案時。以下引入作為參考的美國專利4,554,101陳述了多肽的最大局部平均親水性，由于由其相鄰氨基酸親水性控制，因此與其免疫原性和抗原性有關(guān)，即與多肽的生物學性能有關(guān)。應(yīng)理解一個氨基酸可以取代具有類似親水性值并仍獲得生物學等同物，和尤其獲得是免疫學等同多肽的另一個氨基酸。
在一個實施方案中，活性位點突變可以導入mTS4分子來有意阻斷<p>表6

表7

表8

表9

實施例4(吸附和溶出試驗)
在某些實施方案中，保守氨基酸置換也包括非天然存在的氨基酸殘基，它們典型地通過化學肽合成引入，而不是通過生物系統(tǒng)合成。
這里描述的聚集蛋白聚糖酶蛋白序列的其它具體突變包括糖基化位點的修飾。這些修飾可以包括O-連接或N-連接的糖基化位點。例如，糖基化的缺乏或僅部分糖基化由天冬酰胺連接的糖基化識別位點的氨基酸置換或缺失造成。天冬酰胺連接的糖基化識別位點包含適當細胞糖基化酶特異性識別的三肽序列。這些三肽序列是天冬酰胺-X-蘇氨酸或天冬氨酸-X-絲氨酸，其中X通常是任何氨基酸。糖基化識別位點的第一個或第三個氨基酸位置之一或二者的各種氨基酸置換或缺失(和/或第二個位置的氨基酸缺失)導致修飾的三肽序列的非糖基化。另外，聚集蛋白聚糖酶相關(guān)蛋白的細菌表達也將導致非糖基化蛋白產(chǎn)生，即使糖基化位點保持未被修飾。
分離的多核核酸本發(fā)明的另一個方面涉及編碼mTS4蛋白的分離的多核苷酸。可以使用標準分子生物學技術(shù)和這里提供的序列信息以及本領(lǐng)域已知的序列信息來制備包含mTS4分子的核苷酸序列的多核苷酸分子?？梢允褂胏DNA、mRNA或可供選擇地，使用基因組DNA作為模板，和適當?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標準PCR擴增技術(shù)來擴增天然或修飾的ADAMTS4基因序列。如此擴增的多核苷酸可以克隆進入適當載體并用DNA技術(shù)分析來描述特性。此外，可以用標準合成技術(shù)制備與天然或修飾的ADAMTS4序列對應(yīng)的寡核苷酸，如使用自動DNA合成儀。在一個實施方案中，mTS4序列可以包括修飾的Kozak序列以提高翻譯效率。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，由于遺傳密碼簡并性的原因，存在編碼相同多肽的很多多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體中的一些與原始多核苷酸具有很小的序列同源性。然而，由于密碼子使用差異而變化的多核苷酸包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明也涉及編碼mTS4蛋白變異體的多核苷酸。通過將一個或多個核苷酸置換、添加或缺失導入多核苷酸的核苷酸序列，使得一個或多個氨基酸置換、添加或缺失被導入編碼的蛋白，可以產(chǎn)生編碼mTS4蛋白變異體的分離的多核苷酸分子。這種技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。用標準技術(shù)也可以將突變導入mTS4蛋白，如定點誘變和PCR介導的誘變?？晒┻x擇地，突變可以連同mTS4蛋白編碼序列的全部或部分一起隨機導入，如通過飽和誘變，和可以篩選所產(chǎn)生突變體的生物學活性以鑒定能夠抑制野生型蛋白活性的突變體(顯性失活突變體)。誘變后，編碼的蛋白可以重組表達并且可以確定該蛋白的活性。
可以進一步修飾多核苷酸以增加體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谠?’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2-o-甲基而不是磷酸二酯酶鍵；和/或內(nèi)含非常規(guī)堿如肌苷、辨苷(queosine)和wybutosine，以及乙酰基、甲基、硫基和其它的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的修飾形式。
III、表達載體本發(fā)明的另一個方面包括用于表達mTS4蛋白的方法的載體。優(yōu)選，本發(fā)明的載體含有上述編碼mTS4或mTSr4活性位點突變體的DNA序列。載體可以含有允許本發(fā)明經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白表達的適當表達控制序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的載體是包含編碼mTS4的多核苷酸的表達載體，它是適合在宿主細胞中表達多核苷酸的形式。該載體通常具有一個或多個調(diào)節(jié)序列，根據(jù)待進行表達使用的宿主細胞來選擇，它可操作地連接待表達的多核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會到表達載體的設(shè)計可以根據(jù)這種因素如所選擇的待轉(zhuǎn)化宿主細胞、期望的蛋白表達水平等等。本發(fā)明的表達載體可以導入宿主細胞，由此產(chǎn)生這里所述的多核苷酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
可以設(shè)計用于在原核或真核細胞中表達mTS4的本發(fā)明的表達載體。例如，mTS4可以在細菌細胞如大腸桿菌、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達?？晒┻x擇地，該表達載體可以在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
蛋白在原核細胞中的表達最常在大腸桿菌中，用含有指導融合或非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的載體來實施。融合載體將很多氨基酸添加到其中編碼的蛋白，通常添加到重組蛋白的氨基末端。這種融合載體典型地起著三個目的1)增加重組蛋白的表達；2)增加重組蛋白的溶解度；和3)通過用作親合純化中的配體來輔助重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白的接頭導入蛋白水解切割位點，使該重組蛋白能夠隨后與融合部分分離，純化融合蛋白。這種酶和它們的同族識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Piscataway，NJ)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們將GST、MBP或蛋白A分別與靶重組蛋白融合。
合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc和pETlld。PTrc載體的靶基因表達依靠從雜交trp-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄宿主RNA聚合酶。pET11d載體的靶基因表達依靠由共表達病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介導的從T7 gn10-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄。這個病毒聚合酶由含有l(wèi)acUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7 gn1基因的定居噬菌體的BL21(DE3)或HSLE174(DE3)宿主菌種提供。
增加重組蛋白在大腸桿菌中表達的一個策略是在蛋白水解切割能力受損的宿主細菌中表達該蛋白。另一個策略是改變待插入表達載體的多核苷酸的多核苷酸序列，使得每個氨基酸的各個密碼子是大腸桿菌中優(yōu)先利用的密碼子?？梢杂脴藴蔇NA合成技術(shù)實施本發(fā)明多核苷酸序列的這種改變。
在另一個實施方案中，mTS4表達載體是酵母表達載體。在啤酒酵母中表達的載體實例包括pYepSecl、pMFa、pJRY88、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ (InvitrogenCorp，San Diego，CA)。
可供選擇地，mTS4可以在昆蟲細胞中表達，使用桿狀病毒表達載體?？衫糜糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(如Sf9細胞)中表達蛋白的表達桿狀病毒表達載體包括pAc系列和pVL系列。
仍在另一個實施方案中，mTS4在哺乳動物細胞中表達，使用哺乳動物表達載體。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8、pMT2PC和pHTop。當在哺乳動物細胞中使用時，表達載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，普遍使用的啟動子得自多形瘤、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40。可供選擇地，表達載體的控制功能可以由天然ADAMTS4啟動子或組織特異性調(diào)節(jié)元件提供。
本發(fā)明進一步提供了將多核苷酸傳遞到細胞、組織或哺乳動物進行表達的基因傳遞載體。例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以在基因傳遞載體中局部或全身給予。這些構(gòu)建體可以利用體內(nèi)或非體內(nèi)形式的病毒或非病毒載體方法?？梢允褂脙?nèi)源性哺乳動物或異源啟動子誘導編碼序列的表達。編碼序列在體內(nèi)的表達可以是組成型或調(diào)節(jié)型。本發(fā)明包括能夠表達預(yù)想的多核苷酸的基因傳遞載體。該基因傳遞載體優(yōu)選病毒載體，和更優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒或甲病毒載體。病毒載體也可以是星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒病毒載體。
本發(fā)明的mTS4構(gòu)建體傳遞給細胞不限于上面提及的病毒載體?？梢岳闷渌鼈鬟f方法和介質(zhì)，例如核酸表達載體、單獨連接或未連接滅活腺病毒的聚陽離子濃縮DNA、脂質(zhì)體、配體連接DNA、真核細胞傳遞載體、光聚合水凝膠材料沉淀、把握基因傳遞顆粒槍、電離輻射、核酸電荷中和或與細胞膜融合?？梢圆捎妙w粒介導的基因傳遞。例如，序列可以插入含有為高水平表達的常規(guī)控制序列的常規(guī)載體中，然后與合成基因傳遞分子孵育，如聚合DNA結(jié)合陽離子樣聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白，與細胞靶配體連接如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或轉(zhuǎn)鐵蛋白。也可以采用裸DNA。使用可生物降解的乳膠珠可以提高裸DNA的攝取效率。
IV.聚集蛋白聚糖酶蛋白的制備通過培養(yǎng)上述表達載體轉(zhuǎn)化或感染的細胞可以制備本發(fā)明經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白?？梢杂脴藴实鞍准兓夹g(shù)純化蛋白。純化的mTS4蛋白基本上不含與其共同產(chǎn)生的其它蛋白物質(zhì)，也不含其它污染物。通過切割聚集蛋白聚糖，回收的純化蛋白顯示出蛋白水解作用的聚集蛋白聚糖酶活性。因此，本發(fā)明的蛋白可以進一步以它們在確定降解聚集蛋白聚糖分子存在的試驗中證明具有聚集蛋白聚糖蛋白水解活性的能力為特征。這些試驗或其開發(fā)在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識范圍內(nèi)。這種試驗可以包括聚集蛋白聚糖底物接觸聚集蛋白聚糖酶分子和監(jiān)測聚集蛋白聚糖片段的產(chǎn)生(見例如Hughes等.，Biochem.J.305799-804，1995；Mercuri等，J.Bio.Chem.27432387-32395，1999)。
合適的細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。合適哺乳動物宿主細胞和轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴增、篩選、制備產(chǎn)物和純化方法的選擇是本領(lǐng)域已知的。所附實施例中描述的另一個合適的哺乳動物細胞系是猴COS-1細胞系。哺乳動物細胞系CV-1也可能合適。
細菌細胞也可以是合適的宿主。例如，各種大腸桿菌(如HB101，MC1061)在生物技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的宿主細胞。在這個方法中也可以采用各種枯草芽孢桿菌、假單胞菌、其它桿菌等等。對于在細菌細胞中表達本發(fā)明的mTS4蛋白，通常不是必需編碼聚集蛋白聚糖酶前肽的DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多酵母細胞菌種也可以用作表達本發(fā)明多肽的宿主細胞。另外，根據(jù)需要，在本發(fā)明方法中也可以利用昆蟲細胞作為宿主細胞。如見Miller等.，Genetic Engineering，8277-298(Plenum Press 1986)和其中引用的參考文獻。
用合適的純化方案使用標準蛋白純化技術(shù)可以從宿主細胞分離在宿主細胞中產(chǎn)生的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。標準純化技術(shù)包括電泳、分子、免疫學和層析技術(shù)，包括離子交換、疏水性、親和性和反向HPLC層析和層析聚焦。例如，可以使用抗mTS4抗體柱純化mTS4蛋白。超濾和滲濾技術(shù)結(jié)合蛋白濃度也有效。需要純化的程度將根據(jù)修飾ADAMTS蛋白的用途而變化。在一些情況下，無需純化。
V.抗體的產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，制備了對mTS4 ADAMTS4或其它ADAMTS4相關(guān)蛋白特異的抗體，抗mTS4抗體包括阻斷mTS4的聚集蛋白聚糖酶活性的和不能阻斷的兩種抗體。抗mTS4抗體也包括“新表位”，它是指特異性識別ADAMTS4或mTS4蛋白水解切割而暴露的新的N或C末端氨基酸序列的抗體，但是該抗體不結(jié)合原始(未切割)分子上的這種表位?？筸TS4抗體也可以有效檢測和/或純化聚集蛋白聚糖酶或相關(guān)蛋白，或抑制或阻礙聚集蛋白聚糖酶的作用。
mTS4蛋白或mTS4蛋白的抗原片段可以用作免疫原。mTS4蛋白的抗原肽包含mTS4氨基酸序列的至少8個氨基酸，并包含mTS4蛋白的表位，使得產(chǎn)生的抗該肽的抗體與mTS4蛋白形成特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選，抗原肽包含至少8個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少12個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少16個氨基酸殘基，和最優(yōu)選至少20個氨基酸殘基。
通過用免疫原免疫合適受試者(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)，mTS4免疫原(如mTS4蛋白，其片段，或mTS4融合蛋白)典型地用于制備抗體。適當免疫原制劑可以含有例如重組表達的mTS4免疫原或化學合成的mTS4免疫原。該制劑可以進一步包括佐劑，如弗氏究全或不完全佐劑，或類似免疫刺激試劑。用免疫原試劑免疫合適受試者誘導抗mTS4抗體反應(yīng)。制備、分離和使用單克隆和多克隆抗mTS4抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
因此，本發(fā)明的另一個方面涉及單克隆或多克隆抗mTS4抗體。本發(fā)明提供了結(jié)合mTS4蛋白的單克隆或多克隆抗體。
抗mTS4抗體可以用于分離mTS4蛋白或mTS4相關(guān)蛋白，采用標準技術(shù)，如親和層析或免疫沉淀?？筸TS4抗體可以促進從細胞純化mTS4蛋白或mTS4相關(guān)蛋白，如全長ADAMTS4蛋白、mTS4融合蛋白或其變異體和突變體。而且，為了估計蛋白表達的豐富度和模式，抗mTS4抗體可以用于檢測mTS4蛋白或mTS4相關(guān)蛋白。與ADAMTS4蛋白交叉反應(yīng)的抗mTS4抗體可以用于診斷性監(jiān)測組織中ADAMTS4蛋白水平，作為一部分臨床監(jiān)測程序，例如確定給定治療方案的功效?？贵w與可檢測物質(zhì)偶合(即物理連接)可以促進檢測。可檢測物質(zhì)實例包括各種酶、輔基基團、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基基團復(fù)合物實例包括鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料實例包括7-羥基香豆素、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、堿性蕊香紅、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括發(fā)光氨；生物發(fā)光材料的實例包括熒光素酶、蟲熒光素和水母發(fā)光蛋白；和合適放射性材料的實例包括125I，131I，35S和3H。
與ADAMTS4蛋白交叉反應(yīng)的抗mTS4抗體也可有效將治療劑對準ADAMTS4表達升高的細胞或組織。例如，為了將治療劑對準ADAMTS4表達升高的細胞或組織，治療劑如小分子ADAMTS4拮抗劑可以與抗修飾的ADAMTS4抗體連接。
治療劑可以直接或間接(如通過連接基團)偶合(如共價結(jié)合)合適的單克隆抗體。當它們每種都具有能夠與另一個反應(yīng)的取代基時，試劑和抗體之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個上面的親核基團，如氨基或巰基，可能能夠與另一個上面的含羰基的基團如酸酐或?；u反應(yīng)，或與含良好的離去基團(如鹵化物)的烷基反應(yīng)。
可供選擇地，可能期望通過連接基團將治療劑和抗體偶合。連接基團可以起著抗體與試劑距離間隔的作用，為了避免結(jié)合能力的干擾。連接基團也可以用于增加試劑或抗體上取代基的化學反應(yīng)性，和因此增加偶合效率。化學反應(yīng)性增加也可以促進試劑或試劑上、官能團的使用，否則將不可能。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將很明顯可以采用同種和異種官能的各種雙官能或多官有試劑(如the Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill目錄中描述的那些)作為連接基團。例如通過氨基、羧基、巰基或氧化碳水化合物殘基可以進行偶合。
當治療劑不含本發(fā)明免疫結(jié)合的抗體部分更有效的情況下，可能期望使用在內(nèi)在化到細胞的過程中或之后可切割的連接基團。已經(jīng)描述了很多不同可切割連接基團。該試劑從這些連接基團細胞內(nèi)釋放的機制包括二硫鍵還原、照射不耐光鍵、衍生氨基酸側(cè)鏈水解、血清補體介導的水解和酸催化的水解引起的切割。
可能期望一個以上試劑和抗體偶合。在一個實施方案中，多分子的試劑可以偶合一個抗體分子。在另一個實施方案中，一個以上類型的試劑可以偶合一個抗體。不管特定實施方案，與一個以上試劑免疫結(jié)合可以用各種方法進行。例如，一個以上試劑可以直接與抗體分子偶合，或可以使用提供進行連接的多位點的連接體。
VI.抑制劑的開發(fā)本發(fā)明的mTS4蛋白以用于ADAMTS4和其它聚集蛋白聚糖酶抑制劑的開發(fā)。聚集蛋白聚糖酶抑制劑可以用于治療聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病。例如，聚集蛋白聚糖破壞增加與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有關(guān)。兩個軟骨聚集蛋白聚糖酶，ADAMTS4和ADAMTS5主要負責明顯聚集蛋白聚糖代謝和組織完整性破壞之前關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疾病早期來自關(guān)節(jié)軟骨的聚集蛋白聚糖的分解代謝和損失(Caterson等.，Matrix Biol.19333-44，2000)。因此抑制ADAMTS4和ADAMTS5活性是骨關(guān)節(jié)炎的有效治療方法。
已經(jīng)進行了各種努力開發(fā)聚集蛋白聚糖酶抑制劑。金屬蛋白酶3(TIMP-3)的內(nèi)源性組織抑制劑的N末端抑制結(jié)構(gòu)域是人ADAMTS4和ADAMTS5的強烈抑制劑，K(i)值在亞納摩爾范圍(Kashiwagi等.J.Biol.Chem.27612501-12504，2001)。進一步研究顯示其它TIMPs也可以抑制ADAMTS4活性。例如，TIMP-3抑制ADAMTS4活性最有效具有7.9nM的IC(50)值，比TIMP-1(350nM)和TIMP-2(420nM)至少低44倍和比TIMP-4(2μM抑制35％)至少低250倍(Hashimoto等.，F(xiàn)EBS Lett.494192-195，2001)。
有證據(jù)表明環(huán)孢菌素A可抑制關(guān)節(jié)軟骨移植中IL-1誘導的聚集蛋白聚糖酶介導的蛋白水解代謝(Little等.，Arthritis Rheum.46124-129，2002)。特異性單克隆抗體和一些金屬蛋白酶抑制劑，包括TIMP-2和3(Rodriguez-Manzaneque等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.293501-508，2002)也可以完成ADAMTS1活性的抑制。
穩(wěn)定性和表達水平增加的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白使得可能產(chǎn)生大量聚集蛋白聚糖酶分子，為了開發(fā)聚集蛋白聚糖酶的抑制劑。因此，本發(fā)明也提供了鑒定聚集蛋白聚糖酶抑制劑的方法(這里也稱作“篩選試驗”)。這種方法典型地包括mTS4蛋白和一種或多種檢測成分之間的反應(yīng)。其它成分可以是測試化合物本身，或檢測混合物和mTS蛋白的結(jié)合伙伴的組合。
本發(fā)明的一個方面提供了篩選干擾mTS4蛋白與其結(jié)合伙伴如聚集蛋白聚糖和brevican結(jié)合的化合物的方法。在一個實施方案中，使用閃爍親近試驗。在這個試驗中，用同位素如125I標記mTS4蛋白。用鄰近放射性衰退時(即當mTS4蛋白結(jié)合其結(jié)合伙伴時)發(fā)射光的閃爍劑標記結(jié)合伙伴，光發(fā)射減少表明化合物干擾兩種蛋白的結(jié)合。
可供選擇地可以使用熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)試驗。在FRET試驗中，熒光能量供體包括一種蛋白(如mTS4蛋白)和熒光能量受體包括在第二種蛋白上(如mTS4蛋白的結(jié)合伙伴)。如果受體分子的吸收光譜與供體熒光團的發(fā)射光譜重疊，那么供體發(fā)射的熒光被受體吸收。供體分子可以是蛋白上的熒光殘基(如內(nèi)在熒光如色氨酸或酪氨酸殘基)，或與蛋白共價接合的熒光團(如熒光素異硫氰酸酯，F(xiàn)ITC)。接著用意想的上面的受體/供體光譜必要條件選擇適當?shù)墓w分子。
因此，在這個實施例中，用熒光分子(即供體熒光團)標記mTS蛋白和用淬火分子(即受體)標記其結(jié)合伙伴。當mTS4蛋白及其結(jié)合伙伴結(jié)合時，熒光發(fā)射相對于單獨mTS4蛋白將淬火或減少。類似地，可以分解mTS蛋白-伙伴復(fù)合物的相互作用的化合物將導致熒光發(fā)射增加。熒光發(fā)射增加表明該化合物干擾mTS4蛋白與其結(jié)合伙伴的結(jié)合。
在另一個實施方案中，組成聚集蛋白聚糖酶易感蛋白序列的FRET肽用作聚集蛋白聚糖酶的底物。當聚集蛋白聚糖酶切割該肽時，在相同肽上淬火劑釋放氟并產(chǎn)生熒光。判斷化合物對這個熒光的產(chǎn)生的抑制是陽性結(jié)果。
檢測兩種蛋白的結(jié)合或分開的另一個試驗是熒光極化或備向異性。在這個試驗中，用具有適當熒光活期的熒光團標記檢測的蛋白(如mTS4蛋白)。接著用垂直極化光激發(fā)蛋白樣品。接著通過確定水平和垂直急性發(fā)射光的強度來確定各向異性值。接下來，標記的蛋白(mTS4蛋白)與mTS4蛋白結(jié)合伙伴混合并再次測定備向異性。因為熒光各向異性強度與標記蛋白的旋轉(zhuǎn)自由度有關(guān)，蛋白在溶液中旋轉(zhuǎn)越快，各向異性值越小。因此，如果標記的mTS4蛋白是復(fù)合物(如mTS4蛋白-伙伴)的一部分，那么mTS4蛋白在溶液中旋轉(zhuǎn)更慢(相對于游離的未結(jié)合mTS4蛋白)和各向異性強度增加。隨后，可分開mTS4蛋白-伙伴復(fù)合物相互作用的化合物將導致各向異性降低(即標記的mTS4蛋白旋轉(zhuǎn)更快)，它表明該化合物干擾mTS4蛋白與其結(jié)合伙伴的結(jié)合。
更多常規(guī)試驗包括用同位素如125I標記mTS4蛋白-結(jié)合伙伴，與mTS4蛋白孵育，接著免疫沉淀mTS4蛋白。增加游離mTS4蛋白的化合物將降低沉淀量。為了避免使用放射性，可以用酶結(jié)合抗體代替標記mTS4蛋白-結(jié)合伙伴。
可供選擇地，mTS4蛋白-結(jié)合伙伴可以固定在試驗板表面和可以用放射性標記來標記mTS4蛋白。計數(shù)量升高將鑒定干擾mTS4蛋白和其結(jié)合伙伴的結(jié)合的化合物。
可以使用Biacore技術(shù)進一步實施結(jié)合相互作用的估計，其中mTS4蛋白或其結(jié)合伙伴結(jié)合微芯片，通過化學修飾直接結(jié)合或通過抗體-表位聯(lián)合限制(如mTS4蛋白的抗體)、針對表位標記(如His標記的)的抗體或融合蛋白(如GST)結(jié)合。接著通過在“芯片”上流動而應(yīng)用第二種蛋白并檢測信號改變。最后，通過在“芯片”上流動而應(yīng)用測試化合物并檢測信號改變。
本發(fā)明的測試化合物通常是小分子或活質(zhì)分子。小分子包括但不限于無機分子和小有機分子。活質(zhì)分子包括但不限于在哺乳動物中有生物活性的天然存在的和合成的化合物，如脂類、類固醇、多肽、多糖和多核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，測試化合物是小分子。在另一個優(yōu)選實施方案中，測試化合物是活質(zhì)分子。
本發(fā)明的測試化合物可以從任何可獲得來源而獲得，包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫。也可以用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的任何很多方法獲得測試化合物，包括生物文庫；類胨文庫(具有肽的功能性，但是具有新的非肽主鏈的分子文庫，該分子對酶降解有抗性，但是盡管如此仍保留了生物活性)；空間可尋址平行固相或溶液固相文庫；需要去褶合的合成文庫方法；“一珠一化合物”文庫方法；和使用親和層析選擇的合成文庫方法。生物文庫和類肽文庫方法限于肽文庫，而其它四個方法適用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子文庫。如這里使用的術(shù)語“結(jié)合伙伴”是指用作mTS4蛋白底物的分子，或可替換地作為具有mTS4蛋白的結(jié)合親和力的配體。
在另一個實施方案中，該試驗包括在細胞/組織接觸測試化合物之前和之后確定聚集蛋白聚糖酶在細胞或組織中的表達水平?？梢允褂脴藴始夹g(shù)如ELISA、western印跡、RT-PCR和實時PCR，在蛋白水平或RNA水平確定聚集蛋白聚糖酶表達。
本發(fā)明提供了指導高流通量篩選能夠抑制本發(fā)明mTs4蛋白活性或表達的測試化合物的方法。在一個實施方案中，高流通量篩選方法包括將測試化合物與mTS4蛋白組合并檢測測試化合物對mTS4蛋白的作用。
本領(lǐng)域熟知的各種高流通量功能性試驗可以與篩選和/或研究不同類型活化測試化合物的反應(yīng)性聯(lián)合使用。由于偶合系統(tǒng)通常很難預(yù)測，可能需要形成很多試驗來檢測廣泛范圍的偶合機制。各種基于熒光的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且能夠高流通量和超高流通量篩選活性，包括但不限于BRET或FRET(都由Packard Instrument Co.，Meriden，CT)。高敏感性篩選具有大體積和各種測試化合物的能力允許分析本發(fā)明的治療目標以進一步提供聚集蛋白聚糖酶的強效抑制劑。
通過測試化合物與本發(fā)明的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白組合并確定它們之間的結(jié)合活性，可以實施診斷分析以闡明偶合系統(tǒng)。使用細胞傳感器微生理測量儀的一般試驗也可以用于測定代謝活動，同時可以使用基于熒光的技術(shù)如FlIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)檢測鈣流量的改變。此外，TUNEL試驗可以確定調(diào)亡細胞的存在，它利用流式細胞計數(shù)法來檢測調(diào)亡期間基因組DNA切割造成的游離3-OH末端。如上提及，本領(lǐng)域熟知的各種功能性試驗可以與篩選和/或研究不同類型活化測試化合物的反應(yīng)性聯(lián)合使用。優(yōu)選，本發(fā)明的高流通量篩選試驗利用標記-游離胞質(zhì)團共振技術(shù)，如BIACORE系統(tǒng)(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)提供。當在金屬/液體交界面激發(fā)表面胞質(zhì)團波時發(fā)生游離胞質(zhì)團共振。接觸樣品引起表面反射定向光線，表面胞質(zhì)團共振引起表層折射指數(shù)改變。對于很多生物活性試劑(包括蛋白、肽、脂類和多核苷酸)而言，針對表層質(zhì)量濃度給定改變的折射指數(shù)改變是類似的，并且由于BIACORE傳感器表面可以被功能化而結(jié)合這些生物活性試劑，因此可以完成測試化合物的廣泛選擇檢測。
Peppard等.(Peppard等.，J.Biomol.Screen.8149-156，2003)最近開發(fā)了使用發(fā)光氧通道的聚集蛋白聚糖切割抑制劑的高流通量篩選試驗。該試驗利用了AlphaScreenTM技術(shù)。在這個技術(shù)中，“供體”珠和“受體”珠通過特異性生物相互作用達到接近并用激光刺激通過發(fā)光氧通道產(chǎn)生信號。篩選試驗使用聚集蛋白聚糖的碳水化合物側(cè)鏈的特異性抗體而產(chǎn)生支架結(jié)構(gòu)，由此聚集蛋白聚糖可以形成供體和受體珠之間的交聯(lián)，因此使珠接近而產(chǎn)生基于激光啟發(fā)的信號。消化的聚集蛋白聚糖將不能形成這種交聯(lián)并且不產(chǎn)生信號。消化抑制劑可被檢測為信號恢復(fù)。
聚集蛋白聚糖酶抑制劑的鑒定和開發(fā)試驗也可以包括例如聚集蛋白聚糖和抑制劑的混合物接觸mTS4蛋白，隨后測定聚集蛋白聚糖酶活性抑制的程度；例如，通過聚集蛋白聚糖酶易感位點切割產(chǎn)生的聚集蛋白聚糖片段進行檢測和測定。抑制劑可以是蛋白、肽、抗體或化學化合物。在一個實施方案中，抑制劑是結(jié)合聚集蛋白聚糖酶分子上活性位點的肽分子。例如，mTS4的活性位點突變體可以用于肽抑制劑的開發(fā)。
VII.疾病治療和診斷聚集蛋白聚糖酶抑制劑和阻斷聚集蛋白聚糖酶活性的抗體可以用于聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病的治療。認為使用本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶抑制劑或抗體可治療的各種疾病包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、癌癥、炎性關(guān)節(jié)疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、角膜潰瘍、蛋白尿癥、來自冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂的冠狀動脈血栓形成、主動脈瘤疾病、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、慢性梗阻性肺病、阿耳茨海默氏疾病、腦和造血系統(tǒng)惡性腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、帕金森氏病、偏頭痛、抑郁癥、外周神經(jīng)病變、杭廷頓氏舞蹈病、多發(fā)性硬化癥、眼血管形成、黃斑變性、主動脈瘤、心肌梗塞、自身免疫紊亂、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷后退形性軟骨損失、頭部創(chuàng)傷、dystrophobic大皰性表皮松解、脊柱損傷、急性和慢性神經(jīng)變性疾病、骨質(zhì)減少、顳下頜關(guān)節(jié)病變、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變、器官移植毒性和排斥、惡病質(zhì)、變態(tài)反應(yīng)、組織潰瘍、再狹窄、和以聚集蛋白聚糖酶活性改變或聚集蛋白聚糖酶水平改變?yōu)樘卣鞯钠渌膊　?br> 抑制聚集蛋白聚糖酶和/或降低聚集蛋白聚糖酶表達的本發(fā)明的抑制劑和抗體可以用于治療哺乳動物的包括胞外基質(zhì)降解的任何疾病。有效量的抗聚集蛋白聚糖酶抗體或聚集蛋白聚糖酶抑制劑，或二者都可以用于治療疾病，如骨關(guān)節(jié)炎，或公開的以聚集蛋白聚糖酶和聚集蛋白聚糖酶相關(guān)蛋白造成的基質(zhì)蛋白如聚集蛋白聚糖降解為特征的其它疾病。
VIII.藥物組合物本發(fā)明的另一個方面提供了包含(1)mTS4抑制劑或抗mTS4抗體和(2)藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可以用于治療以聚集蛋白聚糖酶或具有聚集蛋白聚糖酶樣活性的蛋白造成的聚集蛋白聚糖降解為特征的疾病。
如這里使用的語言“藥學上可接受的載體”是指包括與適合給予藥物的任何和所有溶劑、增溶劑、填充劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)、緩沖劑、潤滑劑、控制釋放載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、糖衣、抗菌或抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑等等。這種用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用氏本領(lǐng)域熟知的。除可想到的不適合活性化合物的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，其它的都適用于組合物。補充試劑也可以引入組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以配制得與其意欲的給藥途徑相適合。給藥途徑的實例包括腸胃外，如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、口服(如吸入)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。腸胃外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮劑可以包括下列成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)節(jié)pH，例如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制劑可以包入玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。
適合注射使用的藥物組合物包括無菌含水溶液(如果是水溶的)或分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，可注射組合物應(yīng)該無菌并且應(yīng)該是達到容易注射程度的流體。它在制備和保存條件下應(yīng)該穩(wěn)定并且應(yīng)該抵抗微生物的污染活動，如細菌和真菌。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如通過使用糖衣如卵磷脂，和在分散劑情況下通過維持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑可以維持適當?shù)牧鲃有?。微生物活動的預(yù)防可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑來完成，例如羥苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等等。在很多情況下，優(yōu)選組合物中包括等滲劑，如氯化鈉、糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇等)。通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鋁和明膠可以導致可注射組合物的吸收延長。
無菌注射液可以通過將需要量的聚集蛋白聚糖酶抑制劑或抗聚集蛋白聚糖酶抗體引入、含上面列舉成分的一種或組合的適當溶劑，如果需要，過濾滅菌來制備。通常，通過將活性化合物引入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和需要的上面列舉的其它成分的無菌載體中而制備分散體。在是制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，后者產(chǎn)生活性成分加來自其前面無菌過濾的溶液的任何另外期望成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以包入明膠膠囊或壓縮成片劑。為了口服治療給藥，活性化合物可以與賦形劑合并和以片劑、錠劑或膠囊形式使用。也可以使用用作漱口劑的流體載體制備口服組合物，其中流體載體中的組合物經(jīng)口應(yīng)用和嗖嗖揮動和咳出或吞咽?？梢园ㄋ幬镞m用的粘合劑，和/或佐劑物質(zhì)作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等等可以含有任何下列成分，或類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；分解劑如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Stertes；助流劑如二氧化硅膠體；甜味劑如蔗糖或糊精；或矯味劑如薄荷、水楊酸甲酯或甜橙矯味劑。
對于吸入給藥，化合物可以以氣霧噴霧形成傳遞，氣霧噴霧來自含有合適推進劑如二氧化碳氣體的壓縮容器或分配器，或噴霧器。
在一個實施方案中，可以含有生物活性化合物的治療部分與將保護化合物對抗其在體內(nèi)被快速消除的載體一起制備，如控制釋放制劑，包括植入和微膠囊傳遞系統(tǒng)。也可以使用生物可降解、生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙二酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這種制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。也可以從市場上購買到該物質(zhì)，如Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體懸浮劑(包括對準抗病毒抗原的單克隆抗體感染的細胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學上可接受的載體?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法來制備，例如美國專利4,522,811所述。
特別有利的是口服或腸胃外組合物配制成易于給藥和劑量均勻性的劑量單位形式。這里使用的劑量單位形式包括適合作為給予待治療受試者的單一劑量的物理離散單位；每個單位含有聯(lián)合需要的藥物載體的預(yù)計產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格標準受控并直接依賴于活性化合物的獨特特征和待達到的特定治療效果以及化合治療個體的這種活性化合物的領(lǐng)域固有限制。
藥物組合物連同給藥工具可以包括在容器、包裝或分配器中。
IX.給藥本發(fā)明包括治療罹患以聚集蛋白聚糖降解為特征的病癥的患者的方法。這些方法需要給需要這種治療的患者施用有效量的包含聚集蛋白聚糖酶抑制劑或抑制蛋白水解活性的抗聚集蛋白聚糖酶抗體的組合物。預(yù)想本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶抑制劑可以通過抑制聚集蛋白聚糖酶活性或簡單通過調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)中聚集蛋白聚糖酶水平來起作用。
本發(fā)明的抗聚集蛋白聚糖酶抗體和聚集蛋白聚糖酶抑制劑對診斷或治療人或動物中的各種醫(yī)學紊亂有效。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于相對于不被相同抗體結(jié)合的聚集蛋白聚糖酶蛋白來說，抑制或降低與聚集蛋白聚糖酶蛋白相關(guān)的至少一種活性。通常，本發(fā)明的組合物給予患者，使得抗體或它們的結(jié)合片段以范圍從1μg/kg至大約100mg/kg，大約1μg/kg至大約10mg/kg，大約1μg/kg至大約1mg/kg，大約10μg/kg至大約1mg/kg，大約10μg/kg至大約100μg/kg或大約100μg/kg至大約1mg/kg的劑量給予。抗體作為大丸劑量給予，以增大抗體給予患者后可在患者體內(nèi)循環(huán)的間隔時間。初次大丸劑量后也可以使用連續(xù)灌注。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及給予聚集蛋白聚糖酶抑制劑，如生物分子和化學化合物。抑制劑的有效量是有效降低聚集蛋白聚糖酶活性而達到期望生物結(jié)果的劑量。通常，給予抑制劑的適當治療劑量可以在例如大約1ng/kg至大約100mg/kg，大約1ng/kg至大約1μg/kg，大約1μg/kg至大約1mg/kg，或大約1mg/kg至大約100mg/kg的范圍。抑制劑可以一次劑量給予，或間隔給予，如每天一次，每周一次，或每月一次。給予聚集蛋白聚糖酶抑制劑的劑量方案可以根據(jù)例如抑制劑與其聚集蛋白聚糖酶靶的親和力、抑制劑的半衰期和患者情況的嚴重性來調(diào)整。通常，抑制劑以大丸劑量給予，以增大它們的循環(huán)水平。大丸劑量后也可以使用連續(xù)灌注。
這種化合物的毒性和治療功效可以用細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游锬Ｐ椭袠藴仕幬锍绦騺泶_定，如確定LD50(50％群體致死的劑量)和ED50(50％群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)并且它可以表示為LD50/ED50比率。通常優(yōu)選抑制大治療指數(shù)的抑制劑。
細胞培養(yǎng)試驗和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的劑量范圍。這種化合物的劑量可以處于顯示ED50并且毒性小或無的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。該劑量可以在這個范圍內(nèi)變化，根據(jù)采用的劑量形式和利用的給藥途徑。對于根據(jù)本發(fā)明使用的任何抑制劑，可以從細胞培養(yǎng)試驗初步估計治療有效量?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲苿┝恳赃_到顯示IC50的循環(huán)血漿濃度范圍(即達到癥狀最大抑制的一半的測試抗體濃度)，如細胞培養(yǎng)試驗測定?？梢詼y定血漿水平，例如用高壓液相色譜。用合適生物試驗可以監(jiān)測任何特定劑量的效果。合適生物試驗的實例包括測定聚集蛋白聚糖酶活性的試驗，如使用抗體試劑如BC-3來監(jiān)測滑膜流體中聚集蛋白聚糖新表位的存在或減少(Roberts等.，Arthritis Rheum.442586-98，2001)以及實施例7所述試驗、DNA復(fù)制試驗、基于轉(zhuǎn)錄的試驗和免疫試驗。
本發(fā)明的治療方法包括局部、全身或作為植入物或裝置局部性給予聚集蛋白聚糖酶抑制劑組合物。給予組合物的劑量方案將由照料醫(yī)師根據(jù)改變聚集蛋白聚糖蛋白活動的各種因素、病變部位、疾病嚴重性、患者年齡、性別和飲食、任何炎癥的嚴重性、給藥時間和其它臨床因素來確定。通常，全身或注射給藥以最低有效的劑量開始，并且該劑量將在預(yù)先選擇的時間過程中增加直到觀察到正效果。隨后，劑量增加將限制至產(chǎn)生相應(yīng)增加效果的水平，同時考慮可能出現(xiàn)的任何副作用。其它已知因子加到最終組合物也可以影響劑量。
通過周期性估計疾病進展監(jiān)測進展。例如可以通過X線、MRI或其它圖像形式、滑膜流體分析和/或臨床檢查來監(jiān)測進展。
X.檢測試驗和方法本發(fā)明的抑制劑和抗體可以用于檢測試驗和方法來確定樣品中聚集蛋白聚糖酶的存在與否，或它的量。本發(fā)明的抑制劑和抗體也可以用于體內(nèi)或體外檢測聚集蛋白聚糖酶蛋白。通過這些蛋白的存在或水平與疾病關(guān)聯(lián)，一個本領(lǐng)域技術(shù)人員可以診斷相關(guān)疾病或確定其嚴重性。上面列出了用當前公開的抑制劑和抗體可以診斷的疾病。
使用抗體的檢測方法是本領(lǐng)域熟知的并且包括ELISA、放射免疫測定法、免疫印跡、western印跡、免疫熒光、免疫沉淀，和其它類似技術(shù)。該抗體可以進一步提供于診斷試劑盒中，它包括這些技術(shù)中至少一個來檢測蛋白(如聚集蛋白聚糖酶蛋白)。這種試劑盒可以含有其它成分、包裝、指導或輔助聚集蛋白聚糖酶蛋白檢測的其它材料，和關(guān)于該試劑盒使用的指導。當?shù)鞍滓种苿?，例如，肽抑制劑用于這種診斷試驗時，可以采用蛋白-蛋白相互作用試驗。
當將抑制劑用于診斷目的時，最好對其進行修飾；例如，帶上配體基團(如生物素)或可檢測標記基團(如熒光基團、放射性同位素或酶)。需要時可以使用常規(guī)技術(shù)標記抗體(多克隆或單克隆)。合適的標記包括熒光團、發(fā)色團、放射活性原子、電子密集試劑、酶和具有特異性結(jié)合伙伴的配體。典型地，用酶的活性來檢測該酶。例如，通過辣根過氧化物酶將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色染料的能力可以檢測它，用分光光度計定量。其它合適結(jié)合伙伴包括生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，IgG和蛋白A，和本領(lǐng)域已知的很多受體-配體偶合。
下列實施例以表達、分離和表征ADAMTS4和mTS4蛋白的方式闡述本發(fā)明的實施。
XI.實施例實施例1全長人ADAMTS4的克隆和純化使用PCR策略克隆人ADAMTS4 cDNA。設(shè)計兩組寡核苷酸引物擴增cDNA的5’和3’一半的重疊部分。用作PCR模板的七個人多組織cDNA文庫中，僅子宮cDNA文庫產(chǎn)生了適當大小的PCR產(chǎn)物(1294bp(SEQ IDNO2)的5′-擴增物和1421bp(SEQ ID NO3)的3′-擴增物)。用EcoRI和BamHI(5’產(chǎn)物)或BamHI和NotI(3’產(chǎn)物)消化PCR擴增片段，連接到EcoRI和NotI消化的COS表達載體pED6-dpc2，并轉(zhuǎn)化ElectroMAXDH10B細胞(Invitrogen)。對ADAMTS4的克隆PCR片段進行測序，發(fā)現(xiàn)與公開的ADAMTS4 cDNA(SEQ ID NO4)的核苷酸序列(Tortorella等.，Science2841664-1666，1999)相比，具有三個沉默改變。這些改變是SEQ ID NO4的堿基對466的C變?yōu)門，堿基對2131的A變?yōu)镚，和堿基對2758的A變?yōu)镚。5’引物組是5′-AAATGGGCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCC-3′(SEQ IDNO5)(這個引物在ATG起始密碼子上游引入了8-bp尾(AAATGGGC)(SEQ ID NO6)，EcoRI位點(GAATTC)(SEQ ID NO7)，和優(yōu)化Kozak序列(CCACC)(SEQ ID NO8))和5′-TAAGAGACAGTGCCCATAGCCATTGT-3′(SEQ ID NO9)。3’引物組是5′-CTCCAAGCCATGCATCAGTTTGAATG-3′(SEQ ID NO10)和5′-GACTGACTGCGGCCGCATAGTGAGGTTATTTCCTGCCCGCC-3′(SEQ ID NO11)(這個引物在ADAMTS4的TAA終止密碼子下游引入了8-bp尾(GACTGACT)(SEQ ID NO12)和NotI位點(GCGGCCGC)(SEQ ID NO13))。
含有完整ADAMTS4編碼序列的EcoRI-NotI片段(SEQ ID NO14)亞克隆入pHTop。這個質(zhì)粒來自pED(Kaufinan等.，Nucleic AcidsRes.194485-4490，1991)，通過去除大部分腺病毒主要晚期啟動子和插入tet操縱子的六個重復(fù)(Gossen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551，1992)。穩(wěn)定表達ADAMTS4的CHO細胞系通過pHTop/ADAMTS4轉(zhuǎn)染CHO/A2細胞和在0.05μM氨甲蝶呤中選擇克隆而得到。CHO/A2細胞系來自CHO DUKXBll細胞(Urlaub等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220，1980)，通過穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)錄活化劑，tet抑制子和皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域之間融合(Gossen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551，1992)。
收獲CHO細胞條件培養(yǎng)基并用緩沖液A(20mM Tris(pH7.2)，5mMCaCl2，和10μM ZnCl2)稀釋3倍并添加到50μPoros HQ柱(PEBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)。用緩沖液B(20mM Tris(pH7.2)，50mM NaCl，5mM CaCl2和10μM ZnCl2)洗滌該柱，用含50mM至1.0M NaCl的緩沖液B線性梯度洗脫蛋白。用緩沖液C(20mM Tris(pH6.8)，50mM NaCl，5mM CaCl2和10μMZnCl2)10倍稀釋后，施用50μPoros HS柱進一步純化含ADAMTS4的部分，用10倍柱體積洗滌該柱。用含50mM至1.0M NaCl的緩沖液C線性梯度從柱中洗脫蛋白，280nm下計算的消光系數(shù)用于確定蛋白濃度，如Gill和von Hippel所概括(Gill and von Hippel，Anal.Biochem.182319-326，1989)。
實施例2用自身消化產(chǎn)生截短的ADAMTS4分子純化的重組人ADAMTS4在SDS-PAGE凝膠上遷移，主要以68kD條帶，連同少量(小于總蛋白的5％)53kD的物質(zhì)。自身催化消化在37℃實施，通過在含5mM CaCl2和0.1-1.0M NaCl的50mMTris-醋酸鹽，pH7.3中以10pg/ml至569pg/ml范圍的濃度孵育純化的ADAMTS4。通過考馬斯蘭染色，銀染，或L9026抗體的western免疫印跡分析看到自身消化產(chǎn)物。
在37℃，各種時間至多16h下孵育后，檢測ADAMTS4是68kD(ADAMTS4(p68))、53kDa(ADAMTS4(p53))和40kD(ADAMTS4(p40))同工型。使用濃度范圍從10pg/ml至569pg/ml的ADAMTS4，和鹽濃度至多達到1.0M的條件實施孵育的結(jié)果基本上等同。在相同條件下孵育ADAMTS4 ASM未產(chǎn)生可檢測的同工型，因此證實ADAMTS4的加工是自身催化(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。
實施例3自身消化的ADAMTS4同工型的氨基酸測序和質(zhì)譜分析對于N末端序列分析，在10％Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝膠上分離等份的自身消化的ADAMTS4同工型并轉(zhuǎn)移到考馬斯蘭染色的PVDF膜上。相當于ADAMTS4(p68)、ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的切除條帶在PEBiosystems 491A Pulsed-Liquid測序儀上在線使用PE-Biosystemsl40S PTH分析儀(Procise-HT)接受自動測序。
對于C末端序列分析，在Poros HQ柱上分部分離自身消化的ADAMTS4同工型。隨后用等梯度的含0.05-1.0MNaCl的25mM HEPES，pH6.8，5mM CaCl2和5pM ZnCl2洗脫Poros HQ柱，分部分離未結(jié)合的ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)。用Micromass LCT(LC-TOF-MS)分析儀(Micromass UK，Ltd，Manchester，U.K.)實施質(zhì)譜分析。使用ABI ProSorb藥筒濃縮樣品并除去鹽分。在Mayo Protein CoreFacility，Rochester，MN，ABI Procise C儀器上，使用乙內(nèi)酰硫脲衍生化學實施C末端序列分析。
圖1顯示了弗林蛋白酶處理的全長ADAMTS4成熟酶(ADAMTS4(p68))和自身消化的同工型ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的結(jié)構(gòu)的圖解表示。全長ADAMTS4成熟酶含有625個氨基酸(phe213-lys837，SEQ ID NO15，由對應(yīng)于SEQ ID NO14的648-2522位的核苷酸序列(SEQ ID NO16)編碼)。自身消化的同工型ADAMTS4(p53)含有482個氨基酸(phe213-lys694，SEQ ID NO17，由對應(yīng)于SEQID NO14的648-2093位的核苷酸序列(SEQ ID NO18)編碼)。自身消化的同工型ADAMTS4(p40)含有369個氨基酸(phe213-thr581，SEQ ID NO19，由對應(yīng)于SEQ ID NO14的64 8-1754位的核苷酸序列(SEQ ID NO20)編碼)。
ADAMTS4(p68)的序列含有Winked寡糖的非一致附著位點，并且很明顯本研究使用的重組ADAMTS4實際上是非糖基化的。因此，測定ADAMTS4(p53)的分子量52,356道爾頓(LC-TOF-MS測定)與-Phe-Arg-Lys694-OH的檢測C末端序列一致，表明Lys694-Phe695肽鍵的自身催化切割。類似地，檢測ADAMTS-4(p40)的C末端序列Ser-Ala-Leu-Thr581-OH表明在Thr581-Phe582自身催化切割，計算的Phe213-Thr581的分子量(39,757道爾頓)與LC-TOF-MS測定的分子量40,040道爾頓很好地一致。
實施例4自身催化產(chǎn)生的ADAMTS4同工型與硫酸化GSGs的親和力在非還原條件下用SDS-PAGE分離純化的ADAMTS4和自身催化的ADAMTS4同工型并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。該膜與含bHep(Calbiochem，San Diego，CA，0.05pg/ml)的含0.5M NaCl的20mM Tris，pH7.4孵育實施與生物素化的肝素(bHep)-市場上可買到的硫酸化GAG的親和雜交。對于結(jié)合競爭實驗，膜與未標記的肝素(0.5-50pg/ml)預(yù)先孵育1小時。使用牛關(guān)節(jié)軟骨D1聚集蛋白聚糖實施另外的競爭實驗，它是用如前所述的氯化銫平衡密度離心分餾的4M胍基HCl提取物制備的，并如前所述用或不用軟骨酶ABC、角蛋白酶和karatanase II處理。也使用含0.1-1.0M NaCl的10mM磷酸鈉，pH7.0的逐步梯度洗脫的肝素瓊脂糖親和柱(Amersham Pharmacia Biotech)制備ADAMTS4自身催化同工型。
親和雜交實驗揭示在0.5M NaCl存在，ADAMTS4(p68)結(jié)合生物素化的肝素，而ADAMTS4(p53)或ADAMTS4(p40)沒有觀察到這種結(jié)合。同樣，ADAMTS4 ASM C末端缺失突變體(Metl-phe575)，缺乏“間隔”結(jié)構(gòu)域，在這些條件下不結(jié)合bHep(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。自身催化ADAMTS4同工型也顯示與肝素-瓊脂糖結(jié)合減少。與在0.8M NaCl存在下從肝素-瓊脂糖柱洗脫的ADAMTS4(p68)相比，ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)分別在0.3M NaCl和0.4M NaCl洗脫。在結(jié)合競爭實驗中，與未標記肝素的親和印跡的預(yù)孵育以劑量依賴性方式阻斷bHep與ADAMTS4(p68)的結(jié)合。此外，牛聚集蛋白聚糖也阻斷bHep與ADAMTS4(p68)的結(jié)合，并且這種結(jié)合競爭依賴于聚集蛋白聚糖GAGs的存在(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。由于兩個截短同工型都保留了TSP-1基序(見圖1)，很明顯位于ADAMTS4 “間隔”結(jié)構(gòu)域內(nèi)的另外位點有助于GAG結(jié)合和與糖基化聚集蛋白聚糖的相互作用(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。
實施例5自身催化產(chǎn)生的ADAMTS4同工型的聚集蛋白聚糖酶活性用實施例7所述方法確定自身催化產(chǎn)生的ADAMTS4同工型-ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的聚集蛋白聚糖酶活性。簡言之，牛聚集蛋白聚糖與純化的ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)在37℃孵育16小時。消化產(chǎn)物用軟骨素ABC和角蛋白酶除去糖基化，SDS-PAGE分離，并用使用單克隆抗體BC-3的Western印跡觀察，該抗體特異性檢測聚集蛋白聚糖酶切割聚集蛋白聚糖球間結(jié)構(gòu)域內(nèi)的glu373-ala374肽鍵而產(chǎn)生的新表位序列37ARGXX(SEQ ID NO21)。結(jié)果表明兩個同工型都具有聚集蛋白聚糖酶活性(FlanHery等.，J.Biol. Chem.27742775-42780)。
實施例6修飾的人ADAMTS4分子的產(chǎn)生和純化圖2顯示了天然未處理的ADAMTS4分子(構(gòu)建體A)和各種修飾的人ADAMTS4分子(構(gòu)建體B-I)的圖。如構(gòu)建體A所示，未處理的ADAMTS4前蛋白(SEQ ID NO1)含有信號肽(sp)、前肽(pro)、催化結(jié)構(gòu)域、解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域、TSP-1結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和間隔結(jié)構(gòu)域。
構(gòu)建體B-D是用標準分子生物學技術(shù)產(chǎn)生的ADAMTS4構(gòu)建體。構(gòu)建體B(SEQ ID NO.22)是缺乏解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域、TSP-1結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和間隔結(jié)構(gòu)域的截短的ADAMTS4分子，但是含有His標記(HHHHHH，SEQ ID NO23)。由這個構(gòu)建體用弗林蛋白酶處理蛋白酶學上失活(SEQ ID NO46)。構(gòu)建體C(SEQ ID NO24)含有標記序列(GSAWSHPQFEK，SEQ ID NO25)和去除了大部分間隔區(qū)域的C末端缺失。構(gòu)建體D(SEQ ID NO26)是未標記的構(gòu)建體C的形式。構(gòu)建體C和D都可以在CHO細胞中表達。弗林蛋白酶處理的成熟蛋白構(gòu)建體C和D(分別是SEQ ID NOS47和48)具有聚集蛋白聚糖酶活性。
構(gòu)建體E(SEQID NO27)是在ADAMTS4的催化結(jié)構(gòu)域和解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域之間符合讀框地插入氨基酸-GSGSGDDDDK-(SEQ ID NO28)的編碼序列，連同C末端上Strep標記得到的。-GSGSG-組成易曲氨基酸間隔，DDDDK構(gòu)成高度特異性蛋白酶腸激酶的識別位點。在圖2的構(gòu)建體B獲得結(jié)果后制備這個構(gòu)建體表明去除催化結(jié)構(gòu)域之后的C末端結(jié)構(gòu)域的編碼序列產(chǎn)生失活的蛋白。適當處理(弗林蛋白酶切割前結(jié)構(gòu)域)由構(gòu)建體B得到的蛋白，但是前肽保持與催化結(jié)構(gòu)域的關(guān)聯(lián)?？赡蹸末端解聯(lián)蛋白樣、TSP-1、富含半胱氨酸和間隔結(jié)構(gòu)域的存在促進被切割前肽的催化結(jié)構(gòu)域的折疊和/或移位而產(chǎn)生活性酶。構(gòu)建體E的意圖是允許全長ADAMTS4蛋白被翻譯和折疊，依靠C末端標記(GSAWSHPQFEK，SEQ ID NO25)純化，然后用外源添加的腸激酶切割產(chǎn)生完整催化結(jié)構(gòu)域，服從活性試驗和結(jié)構(gòu)確定。
構(gòu)建體F-I是攜帶活性位點突變(ASM)的修飾的ADAMTS4分子。使用快速改變定點誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)將單個堿基對改變(1084位G變?yōu)镃)導入野生型ADAMTS4產(chǎn)生全長ASM構(gòu)建體G(SEQ ID NO29)。該核苷酸改變導致362位glu變?yōu)間ln的單個氨基酸改變(E362Q)。如實施例1所述也含有FlAG標記(VDYKDDDDK，SEQ ID NO30)的構(gòu)建體G在CHO細胞中表達和純化。E362Q突變使構(gòu)建體G成熟蛋白(SEQ ID NO50)喪失了的聚集蛋白聚糖酶活性。然而該成熟蛋白比天然ADAMTS4蛋白更穩(wěn)定。
截短的ASM構(gòu)建體H(SEQ ID NO31)和I(SEQ ID NO32)是用引入限制性位點的PCR引物由PCR擴增構(gòu)建體G的一部分產(chǎn)生的。構(gòu)建體H缺乏間隔結(jié)構(gòu)域并含有C末端FLAG表位標記。構(gòu)建體I缺乏間隔結(jié)構(gòu)域和TSP-1結(jié)構(gòu)域并含有C末端FIAG表位標記。對于構(gòu)建體H，5’引物是AglB1F5′TAAATCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCCCG 3′(SEQID NO33)。3’引物是AglB2R5′TATTATGTCTACTGGGCAGTCCTCAGTGTTGCAGGAG 3′(SEQ ID NO34)。對于構(gòu)建體I，5’引物是AglBlF5′TAAATCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCCCG 3′(SEQ ID NO33)。3’引物是AglB1R5′TATTATGTCTACAGCCTGTGGAATATTGAAGTCCTGG 3′(SEQ ID NO35)。
使用BD Biosciences BDAdvantageTM-GC2 Polymerase Mix所述的標準條件實施PCR擴增。5’末端含有獨特限制性位點EcoRI和3’末端含有AccI的擴增產(chǎn)物兩步亞克隆進入含C末端FLAG標記的pHTop。簡言之，用含限制性酶EcoRI和AccI在標準條件消化PCR產(chǎn)物。消化產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離并從凝膠上切下相當于預(yù)測大小的條帶。利用來自BioRad的Prep-A-Gene試劑盒，根據(jù)制造商的指導從凝膠上回收DNA?；厥盏腄NA正向克隆(EcoRI-AccI)進入中間載體pTAdv-FLAG，后者是兩條合成寡核苷酸Flag1 5′AATTCCTATGCTAGTGCTATCGTAGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAAG C 3′(SEQ ID NO36)和Flag2 5′GGCCGCTTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTACGATAGCACTAGCATAGG 3′(SEQ ID NO37)一起退火并正向(EcoRI-NotI)克隆進入ClontechpTAdv載體而構(gòu)建的。pTAdv-FLAG克隆載體的完整核苷酸序列如SEQID NO38中所示。
然后使用標準技術(shù)擴增證實重組質(zhì)粒的序列并用限制性酶EcoRI和NotI消化。接著如上所述凝膠純化EcoRI-NotI片段并正向克隆進入pHTop載體(SEQ ID NO39)。
在CHO/A2細胞中表達兩個構(gòu)建體，并使用抗FLAG親和凝膠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)從條件培養(yǎng)基中純化。在HiTrap蛋白G HP親和柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上純化多克隆兔抗人ADAMTS4抗血清L9026，它是用從該酶的所有結(jié)構(gòu)域得到的八個不同合成肽的免疫混合物產(chǎn)生的。在10％SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上蛋白分離后，western免疫印跡中使用1.5pg/ml濃度的抗體并用ECL試劑(Amersham PharmaciaBiotech)在Hybond硝酸纖維素膜上檢測。弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體H(SEQ ID NO51)和構(gòu)建體I(SEQ ID NO52)缺乏聚集蛋白聚糖酶活性，但是比野生型ADAMTS4蛋白更穩(wěn)定。
也構(gòu)建含插入物的全長ADAMTS4 ASM構(gòu)建體(構(gòu)建體F，SEQ ID NO40)。構(gòu)建體含有插入解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域和TSP-1基序之間的strep標記(WSHPQFEK，SEQ ID NO41)。消化構(gòu)建體F，試圖解決遇到的純化的全長ADAMTS4產(chǎn)量低的問題。證明ADAMTS4的C末端標記次佳，因為自身催化C末端處理造成標記喪失。在構(gòu)建體F中，在解聯(lián)蛋白樣和Tsp結(jié)構(gòu)域之間從內(nèi)部去除strep標記。在這個位置，富含半胱氨酸和間隔結(jié)構(gòu)域內(nèi)的任何自身催化將不釋放strep標記。
實施例7表達的聚集蛋白聚糖酶的生物活性根據(jù)下列試驗檢測表達的聚集蛋白聚糖酶蛋白的生物活性，如本發(fā)明的修飾的聚集蛋白聚糖酶。
熒光肽試驗表達蛋白與包含聚集蛋白聚糖的聚集蛋白聚糖酶切割位點的氨基酸的合成肽一起孵育。合成肽的N末端或C末端中的一個用熒光團標記，另一個末端包括猝滅劑。該肽的切割使熒光團和猝滅劑分開并引起熒光。從這個試驗確定表達的聚集蛋白聚糖酶蛋白可在聚集蛋白聚糖酶位點切割聚集蛋白聚糖，由相對熒光確定表達蛋白相對活性。
新表位western印跡表達的聚集蛋白聚糖酶蛋白與完整聚集蛋白聚糖孵育。所得樣品的幾種生物化學操作(透析、軟骨酶處理、冷凍干燥和重新組成)后，樣品在SDS-PAGE凝膠上泳動。凝膠與對聚集蛋白聚糖上的位點特異性的抗體孵育，該位點僅在聚集蛋白聚糖酶切割后暴露。凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上并用第二抗體顯影(稱作western試驗)，隨后產(chǎn)生分子量與聚集蛋白聚糖酶切割聚集蛋白聚糖產(chǎn)生產(chǎn)物相同的產(chǎn)物的條帶模式標志。這個試驗得到發(fā)現(xiàn)-表達的聚集蛋白聚糖酶蛋白在聚集蛋白聚糖酶切割位點切割天然聚集蛋白聚糖，并且也產(chǎn)生切割產(chǎn)物的分子量。條帶的相對密度可給出相對聚集蛋白聚糖酶活性的指示。
在一個實施方案中，牛關(guān)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖與純化的ADAMTS4或經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白在含100mM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris，pH7.3中，37℃孵育16小時。在軟骨酶ABC(Seikagaku America，F(xiàn)almouth，MA；1mU/μg聚集蛋白聚糖)、角蛋白酶(Seikagaku；1mU/μg聚集蛋白聚糖)和角蛋白酶II(Seikagaku；0.02mU/μg聚集蛋白聚糖)存在下，37孵育消化產(chǎn)物2小時而除去糖基化。在4-12％Bis-TrisNuPAGE SDS PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分離消化產(chǎn)物，接著電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。用單克隆抗體(Mab)AGG-C1(0.04μg/ml)或MAb BC-3(由Dr.C.Hughes和Prof.B.Caterson，Cardiff University，UK大量提供；1∶100雜交瘤培養(yǎng)上清液)的western印跡檢測免疫反應(yīng)產(chǎn)物。隨后膜與堿性磷酸酶結(jié)合的第二山羊抗小鼠IgG(Promega Corp.，Madison，WI；1∶7500)一起孵育，NBT/BCIP底物(Promega)用于使免疫反應(yīng)條帶可見。所有抗體孵育在室溫實施1小時，免疫印跡與底物在室溫孵育5-15分鐘獲得最佳顯色。
聚集蛋白聚糖ELISA表達的蛋白與以前粘附塑料孔的完整聚集蛋白聚糖孵育。洗滌該孔，然后與檢測聚集蛋白聚糖的抗體一起孵育。用第二抗體使該孔顯影。如果孔中保留原始量的聚集蛋白聚糖，那么抗體染色濃密。如果聚集蛋白聚糖被表達的聚集蛋白聚糖酶消化，那么聚集蛋白聚糖脫離板，隨后抗體對聚集蛋白聚糖包被的孔的染色減少。這個試驗表明表達蛋白是否能夠切割聚集蛋白聚糖(在蛋白中任何地方，不僅僅在聚集蛋白聚糖酶位點)，此外能夠進一步確定相對聚集蛋白聚糖切割。
簡言之，用透明質(zhì)酸(ICN)包被微量滴定板(Costar)，隨后用軟骨酶(Seikagaku Chemicals)處理的牛聚集蛋白聚糖包被。來自表達修飾的聚集蛋白聚糖酶的CHO細胞的條件培養(yǎng)基添加到聚集蛋白聚糖包被的板中。洗掉在球間結(jié)構(gòu)域內(nèi)glu373-ala374切割的聚集蛋白聚糖。用3B3單克隆抗體(ICN)，隨后是抗小鼠IgM-HRP第二抗體(Southern Biotechnology)檢測剩余的未切割聚集蛋白聚糖。用3，3″，5，5″四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BioPx Laboratories)進行最后的顯色?？晒┻x擇地，可以合成失活的前體形式的修飾聚集蛋白聚糖酶并可以用弗林蛋白酶處理產(chǎn)生成熟種。
實施例8修飾的聚集蛋白聚糖酶的表達載體的構(gòu)建本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過將編碼聚集蛋白聚糖酶的序列插入已知哺乳動物表達載體中，如pCD(Okayama等.，Mol.Cell Biol.2161-170，1982)，pJL3，pJL4(Gough等.，EMBOJ.4645-653，1985)和pMT2 CXM構(gòu)建修飾的聚集蛋白聚糖酶的表達載體。
哺乳動物表達載體pMT2 CXM是p91023(b)(Wong等.，Science228810-815，1985)的衍生物，不同于后者，因為它含有氨芐青霉素抗性基因，代替了四環(huán)素抗性基因，并進一步含有XhoI位點以插入cDNA克隆。已經(jīng)描述了pMT2 CXM的功能元件(Kaufman，等.，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA82689693，1985)包括腺病毒VA基因、包括72bp增強子的SV40復(fù)制起點、包括5’剪接位點和腺病毒晚期mRNAs上存在的大部分腺病毒三部分引導序列的腺病毒主要晚期啟動子、3’剪接受體位點、二氫葉酸還原酶(DHFR)插入物、SV40早期多腺苷化位點(SV40)，和在大腸桿菌中增殖所需的pBR322序列。
質(zhì)粒pMT2 CXM是由EcoRI消化pMT2-VWF得到的，pMT2-VWF已經(jīng)保藏在美國典型微生物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland，USA)，保藏號ATCC67122。EcoRI消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入物，產(chǎn)生線性形式的pMT2，它可以連接并用于轉(zhuǎn)化對氨芐青霉素有抗性的大腸桿菌HB101或DH-5?？梢杂贸Ｒ?guī)方法制備質(zhì)粒pMT2DNA。然后使用環(huán)出/入誘變法構(gòu)建pMT2 CXM(Morinaga，等.，Biotechnology 84636，1984)。去除的第1075至1145位堿基涉及SV40復(fù)制起點和pMT2的增強子序列附近的Hind III位點。此外，在核苷酸1145處它插入了下列序列5′-CATGGGCAGCTCGAG-3′(SEQ IDNO42)。這個序列含有限制性內(nèi)切酶XhoI的識別位點。pMT2CXM的衍生物，術(shù)語稱作pMT23，含有限制性內(nèi)切酶PstI，EcoRI，SaII和XhoI的識別位點?？梢杂贸Ｒ?guī)方法制備質(zhì)粒pMT2 CXM和pMT23 DNA。
由pMT21得到的pEMC281也可以合適地實施本發(fā)明。pMT21是由pMT2得到的，pMT2是由pMT2-VWF得到的。如上所述EcoRI消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入物，產(chǎn)生線性形式的pMT2，它可以連接并用于轉(zhuǎn)化對氨芐青霉素有抗性的大腸桿菌HB101或DH-5。可以用常規(guī)方法制備質(zhì)粒pMT2 DNA。
pMT21是通過下列兩個修飾由pMT2得到的。第一，刪除76bp的DHFR cDNA的5’非翻譯區(qū)，其包括來自用于cDNA克隆的G/C標記的19個G殘基。在這個過程中，插入XhoI位點，就在DHFR上游獲得下列序列5′CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG 3′(SEQ ID NO43)PstI EcoRI XhoI第二，用EcoRV和Xba I消化引入單獨的ClaI位點，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理，并與ClaI接頭(CATCGATG，SEQ ID NO44)連接。此操作刪除了來自腺病毒相關(guān)RNA(VAI)區(qū)域的250bp片段，但是沒有干擾VAI RNA基因表達或功能。用EcoRI和XhoI消化pMT21，并用于驅(qū)動載體pEMC2B1。
EMCV引導序列的一部分是從pMT2-ECAT1(S.K.Jung，等，J.Virol.631651-1660，1989)獲得的，通過用EcoRI和PstI消化，產(chǎn)生2752bp片段。用TaqI消化這個片段，產(chǎn)生508bp的EcoRI-TaqI片段，在低熔點瓊脂糖凝膠上電泳純化它。合成帶有5’TaqI突出末端和3’XhoI突出末端的68bp接頭及其互補鏈，它具有下列序列5′CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTaqITTTGAAAAACACGATTGC3′(SEQ ID NO46)XhoI這個序列與EMC病毒引導序列的763至827核苷酸配對。也可以將EMC病毒引導序列內(nèi)第10位的ATG變?yōu)锳TT，隨后是XhoI位點。pMT21 EcoRI-16hol片段、EMC病毒EcoRI-TagI片段，和68bp寡核苷酸接頭TagI-16hol接頭三個連接產(chǎn)生了載體pEMC2/61。
這個載體含有SV40復(fù)制起點和增強子、腺病毒主要晚期啟動子、大部分腺病毒三部分引導序列的cDNA拷貝、小雜合插入序列、SV40聚腺苷酸信號和腺病毒VAI基因、DHFR和Q-內(nèi)酶胺標記和EMC序列，以適當關(guān)系指導期望cDNA在哺乳動物細胞中高水平的表達。
表達載體的構(gòu)建可以包括聚集蛋白聚糖酶相關(guān)DNA序列的修飾。例如，通過去除編碼區(qū)5’和3’末端的非編碼核苷酸，可以修飾編碼聚集蛋白聚糖酶的cDNA?？梢杂靡阎幸嬗诒磉_的其它序列取代刪除的非編碼核苷酸，也可以不進行此種取代。這些載體轉(zhuǎn)化到合適宿主細胞進行聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶樣蛋白的表達。另外，通過刪除編碼聚集蛋白聚糖酶前肽的序列并用編碼其它聚集蛋白聚糖酶完全前肽的序列取代它們，可以對聚集蛋白聚糖酶序列進行操作而表達聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶樣蛋白。也可能用來自不同聚集蛋白聚糖酶(如修飾的ADAMTS5)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域取代修飾的聚集蛋白聚糖酶(如修飾的ADAMTS4)中的蛋白結(jié)構(gòu)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以對表達載體的序列進行操作，通過消除編碼序列側(cè)翼的哺乳動物調(diào)節(jié)序列或用細菌序列取代它們而產(chǎn)生修飾的聚集蛋白聚糖酶分子胞內(nèi)或胞外表達的細菌載體。例如，可以進一步操作編碼序列(如與其它已知接頭連接或通過從那里刪除非編碼序列或用其它已知技術(shù)改變其中的核苷酸而修飾)。使用如Taniguchi等人，(Taniguchi等.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，775230-5233，1980)所述的程序，接著可以將修飾的編碼聚集蛋白聚糖酶的編碼序列插入已知細菌載體中。然后這個示例的細菌載體可以轉(zhuǎn)化細菌宿主細胞而表達本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶蛋白。對于細菌細胞中胞外表達聚集蛋白聚糖酶相關(guān)蛋白的策略，見如歐洲專利申請EP177,343。
可以對用于在昆蟲細胞中表達的昆蟲載體的構(gòu)建實施類似的操作(見如公開的歐洲專利申請EP155,476中所述程序)。采用被酵母細胞胞內(nèi)或胞外表達本發(fā)明因子的酵母調(diào)節(jié)序列也可以構(gòu)建酵母載體。(見如公開的PCT申請WO86/00639和歐洲專利申請EP123,289中所述程序)。
在哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲宿主細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生高水平的本發(fā)明聚集蛋白聚糖酶相關(guān)蛋白的方法可以包括構(gòu)建含有多拷貝異源聚集蛋白聚糖酶相關(guān)基因的細胞。異源基因與可擴增標記連接，如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，用于選擇在濃度不斷增加的氨甲喋呤(MTX)中增殖的含有拷貝數(shù)增加的細胞(Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.，159601-629，1982)。這個方法可以采用很多不同細胞類型。
例如，用各種方法包括磷酸鈣共沉淀法和轉(zhuǎn)染、電穿孔或原生質(zhì)體融合，含有修飾的聚集蛋白聚糖酶的編碼序列的表達質(zhì)粒和DHFR表達質(zhì)粒pAdA26SV(A)3(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol.，21304，1982)可以共導入DHFR缺陷型CHO細胞-DUKX-1311中。選擇在含透析胎牛血清的alpha培養(yǎng)基中生長的表達DHFR的轉(zhuǎn)化體，隨后選擇在濃度不斷增加的MTX(如以0.02、0.2、1.0和5pM MTX的循序步驟)中生長的細胞進行擴增(Kaufman等.Mol.Cell Biol.，51750，1983)?？寺∞D(zhuǎn)化體，用上述至少一個試驗監(jiān)測生物活性修飾的聚集蛋白聚糖酶的表達。聚集蛋白聚糖酶蛋白表達應(yīng)該隨MTX抗性水平的不斷增加而增加。使用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)檢測修飾的聚集蛋白聚糖酶多肽的特征，如用35S甲硫氨酸或半胱氨酸脈沖標記和聚丙烯酰胺凝膠電泳。可以后續(xù)類似的程序來產(chǎn)生其它修飾的聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶樣蛋白。
實施例9抗體的的制備制備了抗本發(fā)明修飾的聚集蛋白聚糖酶的抗體。為了開發(fā)能夠抑制聚集蛋白聚糖酶活性的抗體，用與弗氏完全佐劑混合的修飾的聚集蛋白聚糖酶蛋白作為前兩次免疫，其后用不完全佐劑，每隔兩周免疫一組小鼠。貫穿免疫期間，對血液進行采樣并測試循環(huán)抗體的存在。在第9周，選擇具有循環(huán)抗體的動物，免疫連續(xù)三天并殺死。取出脾臟并勻漿成細胞。用已建立方法(Oi and Herzenberg，SelectedMethods in Cellular Immunology，W.J. Freeman Co.，SanFrancisco，CA，351，1980)使用50％PEG1500將脾細胞與骨髓瘤融合伙伴(P3-x63-Ag8.653系)融合。融合細胞以2×105個細胞/孔的密度鋪在96孔微量滴定板上。24小時后，細胞接受HAT選擇(Littlefleld等.，Science，145709，1964)，有效殺死未融合和無產(chǎn)出的融合骨髓瘤細胞。
固相和液相ELISA鑒定分泌抗聚集蛋白聚糖酶抗體的成功融合的雜交瘤細胞。如上所述從CHO細胞制備修飾的聚集蛋白聚糖酶蛋白并包裹在聚苯乙烯上(對于固相試驗)或被生物素化(對于液相試驗)。也可以采用中和試驗，其中聚集蛋白聚糖酶包裹在聚苯乙烯板上，添加雜交瘤上清液抑制聚集蛋白聚糖酶活性。培養(yǎng)表達雜交瘤的聚集蛋白聚糖酶抗體并擴增進行進一步研究。通過限制性稀釋克隆選擇的雜交瘤并低溫保存。使用小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒(ZymedTmLaboratories，Inc.，San Francisco，CA)確定由雜交瘤產(chǎn)生的同種型抗體。
實施例10用抗聚集蛋白聚糖酶抗體治療患者的方法根據(jù)實施例10開發(fā)的抗體可以給予罹患聚集蛋白聚糖損失或聚集蛋白聚糖酶活性過度相關(guān)的疾病或紊亂的患者。患者一次或間隔服用該組合物，如每天一次，并且它們的疾病或紊亂的癥狀和跡象改善。例如，聚集蛋白聚糖損失減少或停止和和關(guān)節(jié)軟骨降解減少或停止。骨關(guān)節(jié)炎的癥狀減少或消失。這表明本發(fā)明的組合物對治療聚集蛋白聚糖損失或聚集蛋白聚糖酶活性過度相關(guān)的疾病或紊亂有效。抗體也可以對易感骨關(guān)節(jié)炎的患者使用，如具有該疾病家族史或標志物，但是尚未開始遭受其影響的那些人。表2顯示了試驗性實驗設(shè)計。
表2.用抗聚集蛋白聚糖酶抗體治療骨關(guān)節(jié)炎

前面說明書詳述了本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的教導下可以預(yù)期在實踐所述技術(shù)方案的過程中出現(xiàn)的很多改變和變型。這些改變和變型包括在關(guān)于此所附的權(quán)利要求內(nèi)。本申請中引用的所有文件的全部內(nèi)容引入作為參考。此外，公開的數(shù)據(jù)庫和所有參考文獻中引用的所有序列的全部內(nèi)容引入作為參考。
序列表<110>Wyeth<120>修飾的ADAMTS4分子<130>AM101378<160>53<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>837<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Va1 Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu
100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr
275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro
450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu545 550 555 560Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr565 570 575Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His580 585 590Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro595 600 605Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln610 615 620Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp
625 630 635 640Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg645 650 655Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe660 665 670Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln675 680 685Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asn Val Val Thr690 695 700Ile Pro Ala Gly Ala Thr His Ile Leu Val Arg Gln Gln Gly Asn Pro705 710 715 720Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr725 730 735Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val740 745 750Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser755 760 765Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln770 775 780Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe785 790 795 800Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp
805 810 815Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro820 825 830Trp Ala Gly Arg Lys835<210>2<211>1294<212>DNA<213>人工<220>
<223>這是PCR擴增克隆的人工DNA序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1294)<223>人工DNA序列<400>2ccatgtccca gacaggctcg catcccggga ggggcttggc agggcgctgg ctgtggggag 60cccaaccctg cctcctgctc cccattgtgc cgctctcctg gctggtgtgg ctgcttctgc 120tactgctggc ctctctcctg ccctcagccc ggctggccag ccccctcccc cgggaggagg 180agatcgtgtt tccagagaag ctcaacggca gcgtcctgcc tggctcgggc gcccctgcca 240ggctgttgtg ccgcttgcag gcctttgggg agacgctgct actagagctg gagcaggact 300ccggtgtgca ggtcgagggg ctgacagtgc agtacctggg ccaggcgcct gagctgctgg 360gtggagcaga gcctggcacc tacctgactg gcaccatcaa tggagatccg gagtcggtgg 420catctctgca ctgggatggg ggagccctgt taggcgtgtt acaatatcgg ggggctgaac 480tccacctcca gcccctggag ggaggcaccc ctaactctgc tgggggacct ggggctcaca 540
tcctacgccg gaagagtcct gccagcggtc aaggtcccat gtgcaacgtc aaggctcctc 600ttggaagccc cagccccaga ccccgaagag ccaagcgctt tgcttcactg agtagatttg 660tggagacact ggtggtggca gatgacaaga tggccgcatt ccacggtgcg gggctaaagc 720gctacctgct aacagtgatg gcagcagcag ccaaggcctt caagcaccca agcatccgca 780atcctgtcag cttggtggtg actcggctag tgatcctggg gtcaggcgag gaggggcccc 840aagtggggcc cagtgctgcc cagaccctgc gcagcttctg tgcctggcag cggggcctca 900acacccctga ggactcggac cctgaccact ttgacacagc cattctgttt acccgtcagg 960acctgtgtgg agtctccact tgcgacacgc tgggtatggc tgatgtgggc accgtctgtg 1020acccggaaat gggcgaattc ccactcggag ctgtgccatt gtggaggatg atgggctcca 1080gtcagccttc actgctgctc atgaactggg tcatgtcttc aacatgctcc atgacaactc 1140caagccatgc atcagtttga atgggccttt gagcacctct cgccatgtca tggcccctgt 1200gatggctcat gtggatcctg aggagccctg gtccccctgc agtgcccgct tcatcactga 1260cttcctggac aatggctatg ggcactgtct ctta 1294<210>3<211>1421<212>DNA<213>人工<220>
<223>這是PCR克隆的人工DNA序列<400>3ctccaagcca tgcatcagtt tgaatgggcc tttgagcacc tctcgccatg tcatggcccc60tgtgatggct catgtggatc ctgaggagcc ctggtccccc tgcagtgccc gcttcatcac120tgacttcctg gacaatggct atgggcactg tctcttagac aaaccagagg ctccattgca180tctgcctgtg actttccctg gcaaggacta tgatgctgac cgccagtgcc agctgacctt240
cgggcccgac tcacgccatt gtccacagct gccgccgccc tgtgctgccc tctggtgctc 300tggccacctc aatggccatg ccatgtgcca gaccaaacac tcgccctggg ccgatggcac 360accctgcggg cccgcacagg cctgcatggg tggtcgctgc ctccacatgg accagctcca 420ggacttcaat attccacagg ctggtggctg gggtccttgg ggaccatggg gtgactgctc 480tcggacctgt gggggtggtg tccagttctc ctcccgagac tgcacgaggc ctgtcccccg 540gaatggtggc aagtactgtg agggccgccg tacccgcttc cgctcctgca acactgagga 600ctgcccaact ggctcagccc tgaccttccg cgaggagcag tgtgctgcct acaaccaccg 660caccgacctc ttcaagagct tcccagggcc catggactgg gttcctcgct acacaggcgt 720ggccccccag gaccagtgca aactcacctg ccaggcccgg gcactgggct actactatgt 780gctggagcca cgggtggtag atgggacccc ctgttccccg gacagctcct cggtctgtgt 840ccagggccga tgcatccatg ctggctgtga tcgcatcatt ggctccaaga agaagtttga 900caagtgcatg gtgtgcggag gggacggttc tggttgcagc aagcagtcag gctccttcag 960gaaattcagg tacggataca acaatgtggt cactatcccc gcgggggcca cccacattct 1020tgtccggcag cagggaaacc ctggccaccg gagcatctac ttggccctga agctgccaga 1080tggctcctat gccctcaatg gtgaatacac gctgatgccc tcccccacag atgtggtact 1140gcctggggca gtcagcttgc gctacagcgg ggccactgca gcctcagaga cactgtcagg I200ccatgggcca ctggcccagc ctttgacact gcaagtccta gtggctggca acccccagga 1260cacacgcctc cgatacagct tcttcgtgcc ccggccgacc ccttcaacgc cacgccccac 1320tccccaggac tggctgcacc gaagagcaca gattctggag atccttcggc ggcgcccctg 1380ggcgggcagg aaataacctc actatgcggc cgcagtcagt c 1421<210>4<211>4307<212>DNA
<213>Homo sapiens<400>4cacagacaca tatgcacgag agagacagag gaggaaagag acagagacaa aggcacagcg60gaagaaggca gagacagggc aggcacagaa gcggcccaga cagagtccta cagagggaga120ggccagagaa gctgcagaag acacaggcag ggagagacaa agatccagga aaggagggct180caggaggaga gtttggagaa gccagacccc tgggcacctc tcccaagccc aaggactaag240ttttctccat ttcctttaac ggtcctcagc ccttctgaaa actttgcctc tgaccttggc300aggagtccaa gcccccaggc tacagagagg agctttccaa agctagggtg tggaggactt360ggtgccctag acggcctcag tccctcccag ctgcagtacc agtgccatgt cccagacagg420ctcgcatccc gggaggggct tggcagggcg ctggctgtgg ggagcccaac cctgcctcct480gctccccatt gtgccgctct cctggctggt gtggctgctt ctgctactgc tggcctctct540cctgccctca gcccggctgg ccagccccct cccccgggag gaggagatcg tgtttccaga600gaagctcaac ggcagcgtcc tgcctggctc gggcacccct gccaggctgt tgtgccgctt660gcaggccttt ggggagacgc tgctactaga gctggagcag gactccggtg tgcaggtcga720ggggctgaca gtgcagtacc tgggccaggc gcctgagctg ctgggtggag cagagcctgg780cacctacctg actggcacca tcaatggaga tccggagtcg gtggcatctc tgcactggga840tgggggagcc ctgttaggcg tgttacaata tcggggggct gaactccacc tccagcccct900ggagggaggc acccctaact ctgctggggg acctggggct cacatcctac gccggaagag960tcctgccagc ggtcaaggtc ccatgtgcaa cgtcaaggct cctcttggaa gccccagccc1020cagaccccga agagccaagc gctttgcttc actgagtaga tttgtggaga cactggtggt1080ggcagatgac aagatggccg cattccacgg tgcggggcta aagcgctacc tgctaacagt1140gatggcagca gcagccaagg ccttcaagca cccaagcatc cgcaatcctg tcagcttggt1200ggtgactcgg ctagtgatcc tggggtcagg cgaggagggg ccccaagtgg ggcccagtgc1260
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<223>PCR引物<400>5aaatgggcga attcccacca tgtcccagac aggctcgcat cc 42<210>6<21 1>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>8-bp尾序列<400>6aaatgggc8<210>7<211>6<212>DNA<213>人工
<220>
<223>EcoRI位點<400>7gaattc 6<210>8<211>5<212>DNA<213>人工<220>
<223>Kozak序列<400>8ccacc 5<210>9<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>9taagagacag tgcccatagc cattgt 26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>10ctccaagcca tgcatcagtt tgaatg 26
<210>11<211>41<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR片段<400>11gactgactgc ggccgcatag tgaggttatt tcctgcccgc c 41<210>12<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>8-bp尾序列<400>12gactgact8<210>13<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>NotI位點<400>13gcggccgc8<210>14<211>2542<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR克隆的ADAMTS4 cDNA
<400>14gaattcccac catgtcccag acaggctcgc atcccgggag gggcttggca gggcgctggc60tgtggggagc tcaaccctgc ctcctgctcc ccattgtgcc gctctcctgg ctggtgtggc120tgcttctgct actgctggcc tctctcctgc cctcagcccg gctggccagc cccctccccc180gggaggagga gatcgtgttt ccagagaagc tcaacggcag cgtcctgcct ggctcgggcg240cccctgccag gctgttgtgc cgcttgcagg cctttgggga gacgctgcta ctagagctgg300agcaggactc cggtgtgcag gtcgaggggc tgacagtgca gtacctgggc caggcgcctg360agctgctggg tggagcagag cctggcacct acctgactgg caccatcaat ggagatccgg420agtcggtggc atctctgcac tgggatgggg gagccctgtt aggcgtgtta caatatcggg480gggctgaact ccacctccag cccctggagg gaggcacccc taactctgct gggggacctg540gggctcacat cctacgccgg aagagtcctg ccagcggtca aggtcccatg tgcaacgtca600aggctcctct tggaagcccc agccccagac cccgaagagc caagcgcttt gcttcactga660gtagatttgt ggagacactg gtggtggcag atgacaagat ggccgcattc cacggtgcgg720ggctaaagcg ctacctgcta acagtgatgg cagcagcagc caaggccttc aagcacccaa780gcatccgcaa tcctgtcagc ttggtggtga ctcggctagt gatcctgggg tcaggcgagg840aggggcccca agtggggccc agtgctgccc agaccctgcg cagcttctgt gcctggcagc900ggggcctcaa cacccctgag gactcggacc ctgaccactt tgacacagcc attctgttta960cccgtcagga cctgtgtgga gtctccactt gcgacacgct gggtatggct gatgtgggca1020ccgtctgtga cccggctcgg agctgtgcca ttgtggagga tgatgggctc cagtcagcct1080tcagtgctgc tcatcaactg ggtcatgtct tcaacatgct ccatgacaac tccaagccat1140gcatcagttt gaatgggcct ttgagcacct ctcgccatgt catggcccct gtgatggctc1200atgtggatcc tgaggagccc tggtccccct gcagtgcccg cttcatcact gacttcctgg1260acaatggcta tgggcactgt ctcttagaca aaccagaggc tccattgcat ctgcctgtga1320
ctttccctgg caaggactat gatgctgacc gccagtgcca gctgaccttc gggcccgact1380cacgccattg tccacagctg ccgccgccct gtgctgccct ctggtgctct ggccacctca1440atggccatgc catgtgccag accaaacact cgccctgggc cgatggcaca ccctgcgggc1500ccgcacaggc ctgcatgggt ggtcgctgcc tccacatgga ccagctccag gacttcaata1560ttccacaggc tggtggctgg ggtccttggg gaccatgggg tgactgctct cggacctgtg1620ggggtggtgt ccagttctcc tcccgagact gcacgaggcc tgtcccccgg aatggtggca1680agtactgtga gggccgccgt acccgcttcc gctcctgcaa cactgaggac tgcccgactg1740gctcagccct gaccttccgc gaggagcagt gtgctgccta caaccaccgc accgacctct1800tcaagagctt cccagggccc atggactggg ttcctcgcta cacaggcgtg gccccccagg1860accagtgcaa actcacctgc caggcccggg cactgggcta ctactatgtg ctggagccac1920gggtggtaga tgggaccccc tgttccccgg acagctcctc ggtctgtgtc cagggccgat1980gcatccatgc tggctgtgat cgcatcattg gctccaagaa gaagtttgac aagtgcatgg2040tgtgcggagg ggacggttct ggttgcagca agcagtcagg ctccttcagg aaattcaggt2100acggatacaa caatgtggtc actatccccg cgggggccac ccacattctt gtccggcagc2160agggaaaccc tggccaccgg agcatctact tggccctgaa gctgccagat ggctcctatg2220ccctcaatgg tgaatacacg ctgatgccct cccccacaga tgtggtactg cctggggcag2280tcagcttgcg ctacagcggg gccactgcag cctcagagac actgtcaggc catgggccac2340tggcccagcc tttgacactg caggtcctag tggctggcaa cccccaggac acacgcctcc2400gatacagctt cttcgtgccc cggccgaccc cttcaacgcc acgccccact ccccaggact2460ggctgcaccg aagagcacag attctggaga tccttcggcg gcgcccctgg gcgggcagga2520aataacctca ctatgcggcc gc 2542
<210>15<211>625<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp
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325 330 335Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr340 345 350Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu355 360 365Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu370 375 380Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly385 390 395 400Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu405 410 415Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys420 425 430Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala435 440 445Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met450 455 460Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe465 470 475 480Arg Lys Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly485 490 495Ala Thr His Ile Leu Val Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser
500 505 510Ile Tyr Leu Ala Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly515 520 525Glu Tyr Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala530 535 540Val Ser Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser545 550 555 560Gly His Gly Pro Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala565 570 575Gly Asn Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg580 585 590Pro Thr Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg595 600 605Arg Ala Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg610 615 620Lys625<210>16<211>1875<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120
ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgaccttc cgcgaggagc agtgtgctgc ctacaaccac1140cgcaccgacc tcttcaagag cttcccaggg cccatggact gggttcctcg ctacacaggc1200gtggcccccc aggaccagtg caaactcacc tgccaggccc gggcactggg ctactactat1260gtgctggagc cacgggtggt agatgggacc ccctgttccc cggacagctc ctcggtctgt1320gtccagggcc gatgcatcca tgctggctgt gatcgcatca ttggctccaa gaagaagttt1380gacaagtgca tggtgtgcgg aggggacggt tctggttgca gcaagcagtc aggctccttc1440
aggaaattca ggtacggata caacaatgtg gtcactatcc ccgcgggggc cacccacatt1500cttgtccggc agcagggaaa ccctggccac cggagcatct acttggccct gaagctgcca1560gatggctcct atgccctcaa tggtgaatac acgctgatgc cctcccccac agatgtggta1620ctgcctgggg cagtcagctt gcgctacagc ggggccactg cagcctcaga gacactgtca1680ggccatgggc cactggccca gcctttgaca ctgcaggtcc tagtggctgg caacccccagl740gacacacgcc tccgatacag cttcttcgtg ccccggccga ccccttcaac gccacgcccc1800actccccagg actggctgca ccgaagagca cagattctgg agatccttcg gcggcgcccc1860tgggcgggca ggaaa 1875<210>17<211>482<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80
Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 l90Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255
Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn290 295 300Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys305 310 315 320Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr325 330 335Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr340 345 350Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu355 360 365Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu370 375 380Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly385 390 395 400Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu405 410 415Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys420 425 430
Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala435 440 445Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met450 455 460Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe465 470 475 480Arg Lys<210>18<211>1446<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc 240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660
catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgaccttc cgcgaggagc agtgtgctgc ctacaaccac1140cgcaccgacc tcttcaagag cttcccaggg cccatggact gggttcctcg ctacacaggc1200gtggcccccc aggaccagtg caaactcacc tgccaggccc gggcactggg ctactactat1260gtgctggagc cacgggtggt agatgggacc ccctgttccc cggacagctc ctcggtctgt1320gtccagggcc gatgcatcca tgctggctgt gatcgcatca ttggctccaa gaagaagttt1380gacaagtgca tggtgtgcgg aggggacggt tctggttgca gcaagcagtc aggctccttc1440aggaaa 1446<210>19<211>369<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30
Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Va1 Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala lle Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205
Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn290 295 300Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys305 310 315 320Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr325 330 335Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr340 345 350Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu355 360 365Thr
<210>20<211>1107<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgacc1107
<210>21<211>5<212>PRT<213>人工<220>
<223>新肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(5)<223>X可以是任何氨基酸<400>21Ala Arg Gly Xaa Xaa1 5<210>22<211>435<212>PRT<213>人工<220>
<223>原始催化構(gòu)建體<400>22Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45
Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 l05 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His lie Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220
Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400
Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp ASn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu His His His420 425 430His His His435<210>23<211>6<212>PRT<213>人工<220>
<223>His標記<400>23His His His His His His1 5<210>24<211>697<212>PRT<213>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4分子<400>24Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30
Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205
Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380
Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu545 550 555 560
Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr565 570 575Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His580 585 590Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro595 600 605Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln610 615 620Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp625 630 635 640Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg645 650 655Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe660 665 670Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Gly Ser675 680 685Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys690 695<210>25<211>11<212>PRT<213>人工<220>
<223>構(gòu)建體C標記序列
<400>25Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5 10<210>26<211>686<212>PRT<213>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4構(gòu)建體D<400>26Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110
Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285
Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460
Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu545 550 555 560Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr565 570 575Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His580 585 590Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro595 600 605Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln610 615 620Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp655 630 635 640
Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg645 650 655Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe660 665 670Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser675 680 685<210>27<211>858<212>PRT<21 3>人工<220>
<223>修飾的ADAMTS4分子<400>27Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Ash Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95
Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro As n Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270
Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Gly Ser Gly420 425 430Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Leu His Leu Pro Val Thr Phe435 440 445
Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr Phe Gly450 455 460Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala Ala Leu465 470 475 480Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr Lys His485 490 495Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala Cys Met500 505 510Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn Ile Pro515 520 525Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg530 535 540Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr Arg Pro545 550 555 560Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr Arg Phe565 570 575Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu Thr Phe580 585 590Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu Phe Lys595 600 605Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly Val Ala610 615 620
Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu Gly Tyr625 630 635 640Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro645 650 655Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala Gly Cys660 665 670Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met Val Cys675 680 685Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe Arg Lys690 695 700Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr705 710 715 720His Ile Leu Val Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser Ile Tyr725 730 735Leu Ala Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Tyr740 745 750Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala Val Ser755 760 765Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser Gly His770 775 780Gly Pro Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala Gly Asn785 790 795 800
Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr805 810 815Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala820 825 830Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys Gly835 840 845Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys850855<210>28<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>構(gòu)建體E插入序列<400>28Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10<210>29<211>846<212>PRT<213>人工<220>
<223>具有活性位點突變的ADAMTS4<400>29Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15
Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190
Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Gln Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365
Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540
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Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr725 730 735Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val740 745 750Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser755 760 765Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln770 775 780Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe785 790 795 800Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp805 810 815Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro820 825 830Trp Ala Gly Arg Lys Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys835 840 845<210>30<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>FLAG標記序列<400>30
Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>31<211>584<212>PRT<2I3>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4 ASM<400>31Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125
Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300
Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Gln Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leui Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480
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<223>截短的ADAMTS4 ASM<400>32Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15
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Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Gln Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365
Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp515 520 525Lys
<210>33<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>33taaatcgaat tcccaccatg tcccagacag gctcgcatcc cg 42<210>34<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>34tattatgtct actgggcagt cctcagtgtt gcaggag 37<210>35<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400> 35tat tatgtct acagcctgtg gaatattgaa gtcctgg 37<210>36<211>53<212>DNA<213>人工<220>
<223>Flag1序列
<400>36aattcctatg ctagtgctat cgtagactac aaggatgacg atgacaagta agc 53<210>37<211>53<212>DNA<213>人工<220>
<223>Flag2序列<400>37ggccgcttac ttgtcatcgt catccttgta gtctacgata gcactagcat agg 53<210>38<211>3916<212>DNA<213>人工<220>
<223>克隆載體<400>38agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcct atgctagtgc 300tatcgtagac tacaaggatg acgatgacaa gtaagcggcc gctcgagcat gcatctagag 360ggcccaattc gccctatagt gagtcgtatt acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 420gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 480ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 540tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 600
cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc660cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt720tagggttccg atttagagct ttacggcacc tcgaccgcaa aaaacttgat ttgggtgatg780gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca840cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atcgcggtct900attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga960tttaacaaat tcagggcgca agggctgcta aaggaaccgg aacacgtaga aagccagtcc1020gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa1080cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg1140ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt1200tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcagl260gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg1320attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca1380acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt1440tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg1500gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga1560agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctcg1620ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct1680tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac1740tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc1800gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt1860gatccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt1920
caacgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggatacccg1980tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat2040cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat2100tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg2160gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa2220gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt2280gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt2340catacactat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg ggcgcggtat2400tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg2460acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta2520cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat2580catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag2640agtgacacca cgatgcctgt agcaatgcca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa2700ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca2760ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc2820ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt2880atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc2940gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat3000atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt3060tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac3120cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc3180ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca3240
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 3300gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3360ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3420gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3480acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat 3540tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3600gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3660cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3720cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3780ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3840gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgagcga ccgagcgcag cgagtcagtg 3900agcgaggaag cggaag 3916<210>39<211>5676<212>DNA<213>人工<220>
<223>克隆載體<400>39aagctcgagc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg cgctgaatcc cgcggacgac60ccctctcggg gccgcttggg agtctctcgt ccccttctcc gtctgccgtt ccagccgacc120acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc cttctcatct gccggtccgt180gtgcacttcg cttcacctct gcacgttgca tggagaccac cgtgaacgcc catcagatcc240tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc aatgtcaacg accgaccttg300
aggcctactt caaagactgt gtgtttaagg actgggagga gctgggggag gagattaggt360taaaggtctt tgtattagga ggctgtaggc ataaattggt ctgcgcacca gcaccatgca420actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg tacatgtccc actgttcaag cctccaagct480gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccttat aaagaatttg gagctactgt540ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttcc gtcagctcga gtttaccact600ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga660aaagtgaaag tcgaggtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc720gaggtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact780ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gaggtcgagt ttaccactcc ctatcagtga840tagaaaagtg aaagtgaaag tcgaggtcga gtcgaggggg gctataaaag ggggtggggg900cgcgttcgtc ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tgggctcgcg960gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc1020cgaacggtac tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc1080tctcgactgt tggggtgagt actccctctc aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt1140gtcagtttcc aaaaacgagg aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag1200ggtggccgcg tccatctggt cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tgaggtgtgg1260caggcttgag atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc1320acaggtgtcc actcccaggt ccaactgcag acttcgaatt ctactgagtc gacacttcta1380gactacccgg gaatgcggcc gccgcaaatt ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat1440aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg1500tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc1560tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt1620
cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg1680acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac1740cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg1800tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg1860ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc1920gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgattg ctcgagccat catggttcga1980ccattgaact gcatcgtcgc cgtgtcccaa aatatgggga ttggcaagaa cggagaccta2040ccctggcctc cgctcaggaa cgagttcaag tacttccaaa gaatgaccac aacctcttca2100gtggaaggta aacagaatct ggtgattatg ggtaggaaaa cctggttctc cattcctgag2160aagaatcgac ctttaaagga cagaattaat atagttctca gtagagaact caaagaacca2220ccacgaggag ctcattttct tgccaaaagt ttggatgatg ccttaagact tattgaacaa2280ccggaattgg caagtaaagt agacatggtt tggatagtcg gaggcagttc tgtttaccag2340gaagccatga atcaaccagg ccacctcaga ctctttgtga caaggatcat gcaggaattt2400gaaagtgaca cgtttttccc agaaattgat ttggggaaat ataaacttct cccagaatac2460ccaggcgtcc tctctgaggt ccaggaggaa aaaggcatca agtataagtt tgaagtctac2520gagaagaaag actaacagga agatgctttc aagttctctg ctcccctcct aaagctatgc2580attttttata agaccatggg acttttgctg gctttagatc ataatcagcc ataccacatt2640tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa2700aatgaatgca attgttgttg ttaacttgt ttattgcagct tataatggtt acaaataaag2760caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt2820gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcccc ggccaacggt ctggtgaccc2880ggctgcgaga gctcggtgta cctgagacgc gagtaagccc ttgagtcaaa gacgtagtcg2940
ttgcaagtcc gcaccaggta ctgatcatcg atgctagacc gtgcaaaagg agagcctgta3000agcgggcact cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg3060gggttcgaac cccggatccg gccgtccgcc gtgatccatc cggttaccgc ccgcgtgtcg3120aacccaggtg tgcgacgtca gacaacgggg gagcgctcct tttggcttcc ttccaggcgc3180ggcggctgct gcgctagctt ttttggcgag ctcgaattaa ttctgcatta atgaatcggc3240caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac3300tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata3360cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa3420aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct3480gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa3540agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg3600cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca3660cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa3720ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg3780gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg3840tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg3900acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc3960tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag4020attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac4080gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc4140ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag4200taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt4260
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag4320ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca4380gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact4440ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca4500gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg4560tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc4620atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg4680gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca4740tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt4800atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc4860agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc4920ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca4980tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa5040aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat5100tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa5160aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa5220accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc5280gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca5340gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt5400ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac5460catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat5520tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta5580
cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 5640tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgcc5676<210>40<211>845<212>PRT<213>人工<220>
<223>具有插入的ADAMTS4 ASM<400>40Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110
Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285
Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Gln Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460
Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ala515 520 525Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys530 535 540Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro545 550 555 560Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser565 570 575Cys Asn Thr Glu Asp Cys ProThr Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu580 585 590Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe595 600 605Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln610 615 620Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr625 630 635 640
Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser645 650 655Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg660 665 670Ile lle Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly675 680 685Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg690 695 700Tyr Gly Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr His Ile705 710 715 720Leu Val Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala725 730 735Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu740 745 750Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg755 760 765Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro770 775 780Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln785 790 795 800Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser805 810 815
Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile820 825 830Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys835 840 845<210>41<211>8<212>PRT<213>人工<220>
<223>strep標記<400>41Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5<210>42<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNA插入物<400>42catgggcagc tcgag 15<210>43<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>插入pMT21<400>43ctgcaggcga gcctgaattc ctcgagccat catg 34
<210>44<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>Cla1接頭<400>44catcgatg8<210>45<211>68<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNA接頭<400>45cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 60acgattgc 68<210>46<211>223<212>PRT<213>人工<220>
<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體B<400>46Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30
Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly ProSer Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115c120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205
Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu His His His His His His210 215 220<210>47<211>485<212>PRT<213>人工<220>
<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體C<400>47Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285
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<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體D<400>48Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
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<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體E<400>49Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Ash Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 l60Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205Cly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Thr Phe Pro Gly Lys Asp225 230 235 240Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg245 250 255His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly260 265 270His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala275 280 285
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Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly465 470 475 480Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg Tyr Gly485 490 495Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr His Ile Leu Val500 505 510Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Leu Lys515 520 525Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu Met Pro530 535 540Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg Tyr Ser545 550 555 560Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro Leu Ala565 570 575Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln Asp Thr580 585 590Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser Thr Pro595 600 605Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile Leu Glu610 615 620Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys Gly Ser Ala Trp Ser625 630 635 640
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<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體G<400>50Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125
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<212>PRT<213>人工<220>
<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體H<400>51Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140
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<223>弗林蛋白酶處理的構(gòu)建體F<400>53Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Aspl 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60
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權(quán)利要求
1.一種與天然存在的全長ADAMTS4蛋白相比穩(wěn)定性提高的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，所述經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白與天然存在的全長ADAMTS4蛋白有至少一個氨基酸的差異。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白，其中天然存在的全長ADAMTS4蛋白包含SEQ ID NO15中所述的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白，其中經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白與天然存在的全長ADAMTS4蛋白的氨基酸序列的差異是通過選自置換、刪除、插入和化學修飾氨基酸殘基的方法，改變天然存在的全長ADAMTS4蛋白中的至少一個氨基酸而導入的。
4.權(quán)利要求1的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，包含全部或一部分ADAMTS4間隔結(jié)構(gòu)域的缺失，其中經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白具有聚集蛋白聚糖酶活性。
5.權(quán)利要求1的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白不具有自身催化活性。
6.權(quán)利要求1的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白包含肽標記。
7.權(quán)利要求1的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白包含ADAMTS4催化結(jié)構(gòu)域中的突變，該突變消除了所述經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性。
8.權(quán)利要求7的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，進一步包含全部或一部分ADAMTS4間隔結(jié)構(gòu)域的缺失。
9.一種與具有SEQ ID NO15所述的氨基酸序列的ADAMTS4蛋白相比穩(wěn)定性提高的經(jīng)分離并修飾的ADAMTS4蛋白，所述經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白包含選自SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27，29，31，32，40和46-53的氨基酸序列。
10.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列。
11.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求9的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列。
12.一種載體，其包含與表達控制序列可操作性連接的權(quán)利要求10的多核苷酸。
13.一種載體，其包含與表達控制序列可操作性連接的權(quán)利要求11的多核苷酸。
14.一種制備經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的方法，所述方法包括將包含編碼權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列的多核苷酸導入細胞；在允許由該多核苷酸表達經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和從該宿主細胞純化經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。
15.一種制備經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的方法，所述方法包括將包含編碼權(quán)利要求9所述經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列的多核苷酸導入細胞；在允許由該多核苷酸表達經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和從該宿主細胞純化經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。
16.一種鑒定權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的抑制劑的方法，所述方法包括步驟鑒定經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性；將經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白與候選試劑接觸；在所述候選試劑存在下，確定經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性；和確定所述候選試劑是否影響經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的活性。
17.一種治療聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病的藥物組合物，包括(a)權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的抑制劑或權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白特異性結(jié)合的抗體；和(b)藥學上可接受的載體。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中抗體抑制經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性。
19.一種治療哺乳動物中聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病的方法，所述方法包括步驟給哺乳動物導入有效量的權(quán)利要求17的藥物組合物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中聚集蛋白聚糖酶相關(guān)疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及與相應(yīng)天然的未修飾蛋白相比穩(wěn)定性提高的經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白。該經(jīng)修飾的ADAMTS4蛋白可以大量表達和分離，因此允許進一步研究該蛋白的特征，如結(jié)晶學和酶動力研究。純化的穩(wěn)定蛋白也將促進抗ADAMTS抗體的產(chǎn)生和ADAMTS酶抑制劑的開發(fā)。
文檔編號C12Q1/37GK1681920SQ03818423
公開日2005年10月12日申請日期2003年7月29日優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者克里斯托弗·約翰·科科倫, 卡爾·R·弗蘭納里, 曾維蘭, 利薩·A·拉塞, 托馬斯·麥克多納, 貝坦尼·A·弗里曼, 凱蒂·E·喬治亞迪斯, 愛德華·R·拉瓦利申請人:惠氏公司

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該技術(shù)已申請專利。僅供學習研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：克里斯托弗.約翰.科科倫;卡爾.R.弗蘭納里;曾維蘭;利薩.A.拉塞;托馬斯.麥克多納;貝坦尼.A.弗里曼;凱蒂.E.喬治亞迪斯;愛德華.R.拉瓦利
技術(shù)所有人：惠氏公司
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