專利名稱：低壓精子分離系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有選擇性可控的精子生育力特征的精子授精樣品，該精子授精樣品通過夾帶在具有相應的選擇性可調節(jié)流動性質的液流中產生；以及評價并比較精子授精樣品生育力的方法。
背景技術：
隨著安全、可靠地將精子分離成富含X染色體的類群和富含Y染色體的類群的方法的發(fā)展，已經在許多種家畜中實現(xiàn)了性別預選。例如，可參見以下申請所公開的方法和裝置WO 00/06193、WO 02/043574、WO 01/85913、WO 99/33956、WO 01/40765、WO 98/34094、WO 99/42810和WO 02/043486。
關于經性別選擇的精子的一個顯著問題有可能是，按照常規(guī)方法將精子以足以產生經性別選擇的授精樣品或經性別選擇的授精物的速率分離時，將迫使流式細胞計數(shù)器或流式分選裝置的液流壓力升高到每平方英寸約50磅，其中所述精子樣品或授精物對于商業(yè)應用來說是可以存活或足以生育的。對于在因壓力的應用而具有流動特征的液流中夾帶的許多種哺乳動物的精子來說，其存活力、運動力或其它生育力特征已發(fā)生了改變。
關于經性別選擇的精子授精物或經性別選擇的精子授精樣品的另一個顯著問題是精子生育力特征的巨大差別，不同樣品之間的生育力特征差別可能非常大。這樣，在基本相同條件下成功實施的人工授精也會產生不同的妊娠率。
現(xiàn)有精子性別選擇技術的另一顯著問題是缺乏可以直接在體內(例如，與人工授精過程相關)和體外(例如，與IVF(體外受精)過程相關)對經性別選擇的精子的生育力進行比較的測定方法。
本發(fā)明克服了與精子生育力下降等與精子相關的各種問題，所述精子已分離成富含X染色體和富含Y染色體的類群，并克服了缺乏異質精子(heterospermatic)測定方法的問題，所述異質精子測定方法是用于對經分離或分選的精子、尤其是流式分選的精子的功能和生育力進行比較的方法。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的主要目的是提供控制精子的諸如運動力、存活力、受精率、卵裂率或胚囊率等精子生育力特征的裝置和方法，所述精子是對得自哺乳動物雄性個體的精液進行分離而得到的。
根據本發(fā)明，提供可控的精子生育力可以用各種各樣哺乳動物的精子來實現(xiàn)，所述哺乳動物包括但不限于牛、馬、綿羊、犬、貓、豬、海洋動物、鹿、靈長類動物、山羊或由Wilson，D.E.和Reeder，D.M.，MammalSpecies of the World(世界哺乳動物種類)，Smithsonian Institution Press，(1993)所列的哺乳動物，在此將其以參考的方式引入本文。
對于本發(fā)明的一些實施方案來說，可控的精子生育力特征包括在將精子從哺乳動物雄性動物的精液分離出來之前確定選擇生育力特征，以及應用本發(fā)明來改變精子的生育力特征，以提供所需的生育力特征。對于本發(fā)明的其他實施方案來說，精子處理條件從更廣泛的精子處理條件中選擇，這些條件可用于處理特定哺乳動物的精子以獲得具有可控精子生育力特征的精子?？煽鼐由μ卣骺梢园軇泳?、完整頂體、可存活精子在經處理精子群體中的所需比例，也可包括當將經處理的精子用于使卵母細胞體外受精時所需的卵母細胞卵裂率或胚囊形成率，也可包括當將經處理的精子用于人工授精時所需的妊娠率或子代性別比。對于本發(fā)明的一些實施方案來說，與對相同精子群的常規(guī)處理相比，在經處理的精子群內可以達到更高的能動精子比例、更高的可存活精子比例、更高的完整頂體比例或更多的可生育精子數(shù)。本發(fā)明的一些實施方案能提供具有可控精子生育力特征的精子，所述生育力特征與新鮮射精液中精子的生育力特征基本無差別或基本相當。在其他實例中，應用本發(fā)明的實施方案在必要時可以產生具有可控精子生育力特征的精子，所述生育力特征與新鮮射精液中精子的生育力特征基本不相同。具體地說，本發(fā)明的某些實施方案可以用于提供具有可控精子生育力特征的牛精子或用于提供具有可控精子生育力特征的馬精子，如果必要的話所述精子的所述生育力特征可基本與新射出的牛精液或馬精液中牛精子或馬精子的生育力特征相當。
本發(fā)明的另一主要目的是提供具有可控精子生育力特征的精子授精樣品，這些精子授精樣品可以不加限制地應用于哺乳動物雌性個體的人工授精、卵母細胞的體外受精或精子的胞質內注射，等等。
本發(fā)明的另一主要目的是提供對精子進行性別選擇的方法，其可以提供諸如運動力、存活力、受精率、卵裂率、胚囊率等生育力特征的確定控制。本發(fā)明此主要目的的一個方面是可提供流式細胞計數(shù)或細胞分選的裝置，或細胞流式計數(shù)或細胞分選的方法，其可以對經性別選擇的精子的生育力特征進行確定控制。
本發(fā)明的另一目的是提供經性別選擇的、具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品，這些牛精子授精樣品專用于牛類哺乳動物雌性個體的人工授精，樣品含有約100,000至約3,000,000個具有可控精子生育力特征的經性別選擇的牛精子。
本發(fā)明的另一目的是提供經性別選擇的、具有可控精子生育力特征的馬精子授精樣品，這些馬精子授精樣品專用于馬類哺乳動物雌性個體的人工授精，樣品含有約5,000,000至約50,000,000個具有可控精子生育力特征的經性別選擇的馬精子。
本發(fā)明的另一重要目的是提供在以下過程中保持精子的可控精子生育力特征的裝置或方法，所述過程為精子的處理、儲存和使用，包括但不限于雌性哺乳動物的授精或卵母細胞的受精。
本發(fā)明的另一重要目的是提供用具有可控精子生育力特征的精子授精樣品進行雌性哺乳動物人工授精的方法。就本發(fā)明的某些實施方案而言，與此類人工授精方法中精子的常用數(shù)量或典型數(shù)量相比，無論是否將這些精子分成富含X染色體或富含Y染色體的精子群，該授精方法所使用的具有可控性生育力特征的精子數(shù)很低或更少。
本發(fā)明的另一主要目的是提供評價精子群的相對生育力的方法。本發(fā)明的一些實施方案提供了當對得自于哺乳動物不同雄性個體的精子各自進行了基本相同的流式計數(shù)處理時，對所述精子的相對生育力進行評價的方法。本發(fā)明的其他實施方案提供了對經過不同的流式計數(shù)處理的得自于哺乳動物相同雄性個體的精子群的相對生育力進行評價的方法。本發(fā)明的一些實施方案提供了顯示具有可控性生育力特征的精子的相對生育力的方法。
本發(fā)明的更多重要目的在下面的發(fā)明說明中自然得以明確。


圖1為按照本發(fā)明所使用的流式計數(shù)儀分離技術的分選系統(tǒng)示意圖。
圖2為典型流式細胞計數(shù)儀自由下落區(qū)中夾帶的細胞的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及精液或精子的處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)可維持、增強、測定、檢驗或確定精子在采集、處理、儲存、運輸、分離或授精等各個過程中的生物學、化學、物理、生理或功能特性。
本發(fā)明的一個實施方案可以包括從上述廣義界定的哺乳動物中獲取精子。所述精子可以被夾帶在具有流動特征的液流中。導管中液流的流動特征受以下因素影響液流的流變學性質、導管(液流在其中流動)的構造或幾何形狀，以及施加于液流的外力，例如流體靜力壓、擺動振蕩、壓電振動、熱振動等等。
重要的是，液流的這些流動特征可以有助于使液流在導管中移動所需要的壓力。作為非限制性的實例，在流式細胞計數(shù)中，液流在相對較大的橫截面內移動，然后在相對較小的橫截面內移動，并穿過分析界面到達最終收集處。
這種類型的構造或幾何形狀與液流的流變學性質一起可以產生局部力，如壓縮力或偏轉力等，這些力可以影響諸如在液流中夾帶的精子等顆粒的物理完整性。
對于本發(fā)明的一些實施方案，圖1顯示了非限制性的概念性流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器，所述實施方案包括以流式細胞計數(shù)或細胞分選為手段對精子進行分析、基于精子特性的分離、性別選擇或進行其他處理的組件或步驟。
流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器包括圖1所示的全部或部分組件，包括但不限于精子源(1)，其用于放置或供應精子以用于分析、分離、控制生育力特征或進行其他處理。
將精子以被鞘液(3)包圍的方式沉積在噴嘴(2)內。本發(fā)明中可以利用與流式細胞計數(shù)儀或流式分選儀器兼容的任意鞘液，該鞘液可以提供流式分析或處理時精子可接受的環(huán)境，其包括但不限于含有磷酸緩沖鹽水、檸檬酸鹽溶液(如2.9％檸檬酸鈉溶液)或HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)緩沖液的鞘液，所述鞘液可以單獨使用也可以進行各種組合后使用。
鞘液(3)通常由一些鞘液源(4)提供，以便當精子源(1)供應精子時，可以同時通過噴嘴(2)添加鞘液(3)。在這種方式下，鞘液(3)形成所述精子的鞘液環(huán)境。由于是在一定壓力下將各種液流提供給流式細胞儀，所以它們在噴嘴口(5)流出噴嘴(2)。
通過提供某種可由振蕩器控制器(7)非常精確地控制的振蕩器(6)，可在噴嘴(2)內形成壓力波并將其傳遞給在噴嘴口(5)離開噴嘴(2)的鞘液。由于振蕩器(6)如此對鞘液(3)進行作用，因此離開噴嘴口(5)的液流(8)最終并有規(guī)則地形成液滴(9)。因為精子由鞘液環(huán)境所包繞，所以液滴(9)可以在內部包含獨立分開的精子(10)。
由于液滴(9)通常包含分離開的精子(10)，所以流式計數(shù)儀或細胞分選儀器可以根據液滴(9)中所含有的精子的精子區(qū)別特征將液滴加以區(qū)分并分離出來。這通過精子傳感系統(tǒng)(11)來完成。該精子傳感系統(tǒng)至少包括某種檢測器(12)，所述檢測器對包含于各液滴(9)中的精子產生反應。
授予Johnson的美國專利5,135,759中詳細論述了一種精子傳感系統(tǒng)(11)，在此將其以參考的方式引入本文。按照Johnson專利對精子的解釋，精子傳感系統(tǒng)(11)可以基于特定染色劑的相對存在或相對缺失而產生反應，所述染色劑可以由諸如激光束(13)等刺激物所激發(fā)。盡管每種精子均可以被染色劑染色，但X染色體和Y染色體長度的不同使得染色的水平不同。因此，通過感知各精子中染色劑存在的程度，可以通過對不同發(fā)射水平進行區(qū)分而把含有X染色體的精子與含有Y染色體的精子區(qū)別開來。根據本發(fā)明也可以替換使用其他已知的光學、檢測及精子分析系統(tǒng)，而Johnson的專利所提供的說明只是出于示例性的目的，以便可以理解本發(fā)明的大量而不同的用途。也可參見WO 01/85913，將其以參考的方式引入本文。
為了在流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器分離技術中最終使細胞達到適當?shù)姆珠_和分離，將傳感器(12)接收到的信號反饋給某種分選儀識別系統(tǒng)(14)，其可以快速做出決定并且可以根據在所述液滴(9)中是否存在所需細胞而分別使各液滴(9)帶有不同的電荷。按照這種方式，分選儀辨別系統(tǒng)(14)可以允許靜電偏轉板(15)根據液滴(9)是否含有具特定精子特征的精子而使液滴(9)發(fā)生偏轉。結果是流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器可以通過使細胞落入到一個或一個以上的收集容器(16)內，從而將細胞加以分離。這樣，通過感知精子的某些性質，流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器就可以根據特定特性將細胞區(qū)別開來，并將其置于合適的收集容器(16)中。在某些流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器中，使含X染色體精子的液滴帶正電荷，從而偏向一個方向，而使含Y染色體精子的液滴帶負電荷，從而偏向另一個方向，廢液(未分選細胞)不帶電荷，從而以未偏轉的液流被收集入抽吸管等。
現(xiàn)主要參考圖2，則可進一步理解該過程。如該圖所示，噴嘴(2)噴出液流(8)，液流(8)因振蕩器(7)(圖2中未顯示)而形成滴液(9)。由于細胞源(1)(圖2中未顯示)可以供應精子(10)，所述精子可按如Johnson所述加以染色(或在本發(fā)明一些實施方案中使用DIC(微分干涉相襯法)技術時不染色)，由激光(或使用DIC技術時照明光源)(13)照射染色劑(使用DIC技術時的精子頭部)所產生的光束的光發(fā)射分別由傳感器(12)測定，從而當將液滴(9)從液流(8)中分離出來時，可以由流式細胞計數(shù)儀控制各液滴(9)上是否有電荷的存在。這一控制依據液滴(9)中內含物的不同而使液滴(9)帶上正電荷、負電荷，或不帶電荷。如圖2所示，某些液滴顯示為偏轉的液滴(17)。這些偏轉的液滴(17)是含有精子(10)的液滴，該精子可以是一種性別或是另一種性別。然后它們沉積于合適的收集器(16)中，從而產生了經性別選擇的精子群。
不管液流是否出現(xiàn)于流式細胞計數(shù)儀、細胞分選器或其他在液流中夾帶精子的設備中，液流的流動特征均可以加以鑒定，并且可以引入用于改變液流的流動特征的調節(jié)設備以提高或降低諸如壓縮力、偏轉力等作用力，從而可以使液流中所夾帶的顆粒發(fā)生物理、生理、功能或機械上的改變。
這樣，利用調節(jié)設備可以產生流動路徑中液流特征的選擇性調節(jié)范圍，并且其可以用遞增測量值表示。例如，流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀器環(huán)境中液流特征的改變可以被遞增調節(jié)的并以每平方英寸的磅數(shù)來衡量，與液流或鞘液速度的上升或下降相對應，通常液流壓力可允許有每平方英寸約20至100磅的遞增上升或下降。
根據本發(fā)明的一些實施方案，特定種類哺乳動物的精子在具有可調液流流動特征的液流中輸送。接著可以對液流的流動特征在遞增測量(incrementally measured)的范圍內加以選擇性調節(jié)，在此范圍內流動的精子仍能存活。然后，按照測量范圍內所產生的多種流動特征中各個流動特征對所采集的大量精子樣品中每個精子樣品的精子生育力特征進行評測。
隨后，可以對精子的精子生育力特征進行控制，從而可以產生具有所需精子生育力特征的精子授精樣品，所述精子來自于一種哺乳動物或一種哺乳動物的個體成員。
例如，將分別來自于6頭公牛的精子用125μm的Hoechst 33342于34℃染色45分鐘，并將其粗分選(經過流式細胞儀或細胞分選儀器而未分選成亞群)或用具有內徑為70μm的噴嘴的流式細胞計數(shù)儀以約95％精確度和30磅/平方英寸(psi)、40psi或50psi的液流壓力將其分選成含X染色體或含Y染色體(或二者均有)的精子群。將液流的壓力從50psi降到30psi，分選率僅下降了2％至3％。
然后將精子冷卻到5℃，通過離心加以濃縮，裝入0.25ml吸管中，每100μl柱中共約有2×106個精子，用真空冷凍法與未經分選的對照一起冷凍。隨后將管中的精子解凍。
然后由兩位觀察者對各種的精子生育力特征進行盲評于解凍后30分鐘和120分鐘評估前進運動力，于解凍后150分鐘用流式細胞計數(shù)加以評測，用PI(碘化丙啶)染色來評測活精子百分比，并用Hamilton Thorne系統(tǒng)于解凍后120分鐘進行CASA分析(計算機輔助精液分析)。整個過程重復兩次。
因子的方差分析(ANOVA)表明公牛和壓力均具有顯著的影響(p＜0.005，表1)。
表1、精子解凍后在分選時對不同系統(tǒng)壓力的響應a

a均有統(tǒng)計學顯著性，p＜0.005。
*側向頭部移位的振幅。
數(shù)字越大，表明僵硬程度越小，越具有正常的運動力。所有的響應中，在公牛之間存在典型的差異。但是，公牛-處理間相互作用除一個之外均非常小，表明該結果可類似地應用于群體中的大部分公牛。為提高壓力遞增調節(jié)液流的流動特征基本上可以影響所測量的所有精子生育力特征，但在表1中僅列出了有高度統(tǒng)計學顯著性的那些。
可以理解，在約50psi和約40psi時提取的精子樣品之間其精子生育力特征發(fā)生了顯著的改變，而在約40psi和約30psi之間的改變要小得多，表明不能將對于精子生育力特征的影響假設為線性。對于暴露于30psi的所述流動特征的牛精子來說，如果將精子用于母牛的授精或人工授精，精子生育力特征基本與未經分選的對照相同或相當，而且許多響應還優(yōu)于未經分選的對照。對取自公馬的精子進行類似的過程，獲得了類似的結果和結論。
可以對精子生育力特征進行控制，且對于取自哺乳動物的精子也是如此。對于大多數(shù)哺乳動物來說，改變液流特征以遞增式地降低液流壓力，不管是在流式細胞計數(shù)還是其他環(huán)境中均可得到具不同精子生育力特征的系列梯度的相應精子樣品，這些精子樣品可用于不同的過程，包括如下所述的人工授精、體外受精或胞質內注射。
本發(fā)明提供了其他檢驗來評估二項反應，如妊娠/未妊娠，除非處理間的差異非常大，否則這些反應通常均需要處理大量的動物以獲得統(tǒng)計學顯著性。在本發(fā)明的一個實施方案中包括競爭性(competitive)或異質精子的受精，授精前將不同處理組或雄性個體的精子進行混合并測定從各雄性個體或處理組得到的胚胎、胎兒或子代的比例，該方案可以擴大由于處理差異而產生的經經性別選擇的精子在精子生育力特征方面的差異。
例如，通過在兩個不同液流壓力下利用流式細胞計數(shù)或細胞分選基于DNA含量對精子進行性別選擇后，可以以性別為遺傳學標記用異質精子授精來評估生育力。用被調節(jié)至30psi或50psi的液流壓力在約95％的準確度下將來自兩頭公牛的精子各自分選為含X染色體或含Y染色體或同時含二者的精子群。分選后，通過離心濃縮精子，對于每頭公牛將于30psi分選的1×106個含X染色體精子和于50psi分選的1×106個含Y染色體精子置于0.25ml的吸管內，在另一個吸管中則相反為在30psi分選的1×106個含Y染色體精子和在50psi分選的1×106個含X染色體精子。然后將這些精子與未經分選的對照一起冷凍，數(shù)月后解凍，并在觀察到發(fā)情期后12小時或24小時將其植入85個霍爾斯坦(Holstein)小母牛子宮體內，其中兩個授精者間的亞組是平衡的。
受精后2個月，妊娠的43頭小母牛中有81％胎的牛性別(由超聲來確定)與在30psi時處理的精子的性別一致。如果認為在兩種壓力下分選的精子其精子生育力特征無差別，則上述結果與預期的50∶50的性別比率不同(p＜0.01)。性別選定的精子在每劑量為2×106個精子時，妊娠率為51％(43/85)，這與來自同一次射精液的每個劑量為20×106個未進行性別選擇的精子的對照組的妊娠率類似，對照組的妊娠率為39％(9/23)。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了利用具有可控精子生育力特征的精子來改變卵裂率和胚囊形成率的方法。通過對牛精子分別于40psi和50psi進行流式分選以產生各自具有可控生育力特征的兩個牛精子樣品。用來自各個精子樣品的含X染色體精子和含Y染色體精子進行授精介質中的精子濃度的劑量效應試驗。因此，可以進行包含2個液流壓力、3個精子濃度(1×106、0.33×106和0.11×106個精子/ml)、6頭公牛和2個性別的多因素過程。
從來自屠宰場的卵巢中約2mm至約8mm的卵泡中抽取約2,000個卵母細胞。按《Journal of Animal Sciences(動物科學雜志)》，78152-157(2000)所述在整個過程中使用化學成分確定的培養(yǎng)基(CDM)，將其以參考的方式引入本文。在含有0.5％FAF-BSA、15ng/mlNIDDK-oFSH-20、1μg/ml USDA-LH-B-5、0.1μg/ml E2、50ng/μl EGF和0.1mM半胱胺的M-CDM中于38.8℃和含5％CO2的空氣中持續(xù)放置23小時使卵母細胞成熟。將每管2×106個精子的經分選的冷凍精子進行解凍，在400g(重力)下用2ml的45％和2ml的90％珀可(percoll)梯度液離心20分鐘。棄去上層清液，在精子團粒中加入含有0.5％FAF-BSA、2mM咖啡因和0.02％肝素的FCDM，在500g(重力)下離心5分鐘。棄去上層清液，留下約50μl精子懸液。將成熟的卵母細胞在FCDM中洗滌一次并以15個/5μl為一組轉移到25μl的礦物油下的FCDM滴劑中。通過在每個滴劑中加入10μl精子懸液，于38.8℃、在含5％CO2的空氣中放置18小時來完成受精。將假定的受精卵在38.5℃、在5％O2、5％CO2和90％N2(氮氣)中在CDM1中培養(yǎng)2天并在CDM2中培養(yǎng)4.5天。在第7.5天時，評估胚囊的發(fā)育情況將質量分成1到4(1為優(yōu)秀，4為差)，將發(fā)育階段分成6到8(6為完整，6.5為擴張中，7為已擴張，7.5為孵化中，8為已孵化胚囊)。數(shù)據(表1)經反正弦轉換后用ANOVA和第一偏差進行分析。
利用在約40psi時所獲得的具有可控精子生育力特征的精子比在約50psi時所獲得的精子的卵裂率(53.6％和43.6％)及胚囊率(18.2％和14.7％)要高一些(p＜0.01)。劑量與壓力之間無交互作用，因此各個精子濃度下對于更低的壓力均有相似的優(yōu)勢。對于卵裂和胚囊產量可以發(fā)現(xiàn)明確的精子濃度的劑量效應(表2)。同樣，對于兩種反應在公牛間均存在巨大的差異(P＜0.01)，并且對于卵裂百分率來說存在著公牛-劑量的交互作用(P＜0.01)。這些數(shù)據表明，某些公牛的精子劑量應大于1.0×106個精子/ml。Y-精子的胚胎質量優(yōu)于X-精子的胚胎質量(1.12對1.57，p＜0.01)。當對胚胎進行性別選擇時，對于IVF胚胎，其他研究人員已經注意到了這一點，現(xiàn)在已經用有性別的精子確證了這種效果。
表2、用公牛表示的每個卵母細胞的卵裂率(％，C)和胚囊率(％，B)數(shù)據。

a，b，c帶不同上標的值在組內有差別，p＜0.01。
**經分選的精子的生育力低于未經分選的對照精子的生育力，部分原因是由于在用流式細胞技術進行精子分選過程中所受到的機械損傷。降低系統(tǒng)壓力可以同時改善IVF中的精子質量和生育力。本研究評估了精子分選時系統(tǒng)壓力的影響，并評估了延長卵母細胞的成熟時間對ICSI(胞漿內精子注射)后胚胎發(fā)育的影響。將分別來自3頭公牛的精子用125μM Hoechst 33342于34℃染色45分鐘，用壓力為40psi或50psi的SX MoFlo分選儀以約95％的精確度將其分選成含X染色體的精子群和含Y染色體的精子群，然后低溫保存。將得自屠宰場的卵巢的50個牛卵母細胞放到各孔中，孔內含有1ml的CDM1，在CDM1中含有0.5％的無脂肪酸-牛血清白蛋白(FAF-BSA)、2mM葡萄糖、50ng/ml EGF(表皮生長因子)、15ng/ml NIDDK-oFSH(羊促濾泡激素)-20、1μg/mlUSDA-LH-B-5、1μg/ml E2(雌二醇)和0.1mM半胱胺的，然后于38.5℃和含5％CO2的空氣中使卵母細胞成熟24小時或30小時。通過渦旋將成熟卵母細胞的卵丘細胞除去，選取帶有極體的卵母細胞。將得自經分選的冷凍-解凍精子的能動精子分別用2ml的45％和90％的Percoll液通過離心進行回收，并將濃度調到4×106個精子/ml。將成熟的卵母細胞分成兩個注射組使用Piezo注射系統(tǒng)的ICSI組和假注射組。精子注射管的外徑為8μm～10μm。所有操作均在室溫(24℃～25℃)下進行。注射后，卵母細胞用5μM離子霉素活化4分鐘，在50μl的CDM1中于38.5℃、5％CO2、5％O2和90％N2中進行培養(yǎng)，在注射72小時后對卵裂進行評估。對ICSI組和假注射組中未分裂的卵母細胞用地衣紅染色，然后評價受精狀態(tài)。進一步培養(yǎng)分裂的胚胎，并在注射后7.5天評價胚囊的發(fā)育情況。對數(shù)據進行方差分析，對百分率數(shù)據進行反正弦轉換。
對于成熟24小時的卵母細胞，在40psi和50psi下分選的精子對于卵裂率或胚囊率沒有差別(p＞0.1)，壓力和公牛之間也沒有交互作用。公牛對所研究的全部反應均有顯著的影響(p＜0.05)。用40psi分選的精子注射時，成熟30小時的卵母細胞可獲得比成熟24小時的卵母細胞更高的卵裂率(22.9％對12.2％，P＜0.05)，而胚囊率則無差異(p＞0.1)。ICSI組的全部胚囊發(fā)育情況比假注射組的好(7.5％對1.3％，P＜0.05)。當用成熟24小時的未分裂卵母細胞進行受精狀態(tài)評估時，ICSI組含有2個極體和/或解聚精子的百分率要高于假注射組(15.7％對1.7％，P＜0.05)。對于成熟30小時的卵母細胞，兩組間的受精狀態(tài)無差異。我們得出結論，使用于40psi和50psi分選的能動精子進行ICSI后，胚囊的分裂或發(fā)育沒有差別。
在本發(fā)明的另一實施方案中，使用性別作為遺傳學標記的異質精子授精可以用于對雄性的生育力進行分級，以及用于對處理中不涉及精子性別選擇的精子的生育力進行分級。目前體外精子功能試驗與雄性生育力之間沒有很好的相關性，同質精子授精每次處理需要進行數(shù)百次授精以獲得精確的生育力數(shù)據。異質授精通過將2個或2個以上的雄性的精子混合起來，實現(xiàn)了對大部分受檢物種的相對生育力的精確估計。
將來自4組(每組4頭公牛)的冷凍的經流式分選的精子解凍后，以組內3頭公牛的所有組合(ABC、ABD、ACD、BCD)將其植入發(fā)情期開始后12小時或24小時的小母牛中。用來自各公牛的等量的可前進運動精子進行授精，解凍后總共有600,000個能動精子。將各個授精物的一半放置在各個子宮角中。發(fā)情后14.5至20天不做手術而收集胚胎。從332頭小母牛中收集到了165個(48％)正在生長的胚胎。用多態(tài)性DNA標記對胚胎進行基因型分析，以確定每個胚胎活檢物的雄性親代?；蛐头治龊?，可將165個胚胎中的118個歸屬到具體的雄性親代。利用最大可能性分析法則來計算用于對公牛組進行分級的異質精子指數(shù)。根據這些指數(shù)對組內的每頭公牛進行分級(表1)。第1組中，最差的公牛其生育力顯著低于其他兩頭公牛(P＜0.05)。第2組中，占優(yōu)勢的公牛具有最高的指數(shù)(p＜0.05)。在第3組和第4組也可發(fā)現(xiàn)類似的差別。但是，其中三個組的某些公牛的生育力高低是不明確的(P＞0.05)。
表1、組內公牛個體的異質精子指數(shù)±SE(標準誤差)

a，b帶不同上標的指數(shù)具有差別，P＜0.05。
使用這些方法，每組4頭公牛平均有30個基因型胚胎，使得可以對生育力具有明顯差異的公牛進行檢測?？捎么思夹g對精子處理進行評估。該體內試驗需要的雌性個體少，且快速提供了有關哪個公牛具有相對較高或較低的生育力的信息。
通過用本發(fā)明的性別選定的精子使雌性個體人工授精而得到的小牛群基本與用未經性別選擇的精子所得到的對照小牛是一樣的。而且，用性別選定的精子使雌性個體人工授精所獲得的小牛約有90％的性別與預計的一樣。如上所述，精子可以根據DNA的含量在以H33342染色后用流式細胞計數(shù)或細胞分選進行性別選擇。性別選擇后的精子可以如《Theriogenology(動物生殖學)》，521375中所述在低溫保存，在此將其以參考的方式引入本文。
各種食用牛及奶牛中的小母牛和母牛，其發(fā)情期可以通過下列方法得到同步每日喂飼0.5mg醋酸美侖孕酮(MGA)，持續(xù)14天，然后在17至19天后肌肉注射(im)25mg前列腺素F2(PGF2)；或以12天為間隔肌肉注射25mg的前列腺素F2。不管使用冷凍-解凍的性別選定授精樣品還是使用來自于同次射精液的冷凍-解凍精子，均在首次觀察到發(fā)情后12小時或24小時完成授精。對每一飼養(yǎng)組，約有2/3的授精是使用經性別選擇的精子，余下的使用對照精子。2個月后用超聲診斷妊娠情況及胎兒的性別。
在產仔及斷奶期間在不同管理水平下在13個農場中對牛進行管理(每個農場的數(shù)量為49至228個)。收集的數(shù)據包括妊娠時間、出生時體重，產仔難度(1＝正常至4＝剖腹產)、斷奶時體重、新生牛死亡數(shù)以及出生至斷奶期間的死亡數(shù)。并非所有的農場所都記錄了出生時體重和斷奶時體重。將數(shù)據進行包含下列因素的方差分析管理組別、分選與對照精子、產仔的性別。對百分率數(shù)據進行反正弦轉換。表1列出了最小二乘平均數(shù)。
表1、性別分選小牛和對照小牛的產仔結果

a對任何響應均無顯著性差異(P＞0.1)。
在所研究的任何響應中經性別選擇組和對照組的小牛之間沒有差異(P＞0.1)，也沒有發(fā)現(xiàn)顯著的交互作用。對于所研究的全部反應，管理組均存在顯著的效應(除斷奶時存活率為P＜0.02外，其余均為P＜0.001)。同樣雌性和雄性小牛之間在以下方面均有顯著的差異(所有的P均小于0.001)出生時體重(32.2kg和35.5kg)、斷奶時體重(232kg和246kg)、產仔難度(1.20和1.42)和妊娠時間(278天和280天)。
對照組小牛的性別比率是雄性占51.0％(N＝382)。X染色體分選精子產生的雌性占87.7％，而Y染色體分選精子產生的雄性占93.6％(N＝94)。有少數(shù)小牛出生時即死亡，未記錄這些小牛的性別并且未包含在內。
公馬精子流式細胞分離的最新發(fā)展，使得可以產生預定性別的正常小馬駒(Lindsey A.C.，Morris L.H.，Allen W.R.，Schenk J.L.，Squires E.L.，Bruemmer J.E.Equine vet.J.2002，34128-132)。為實現(xiàn)此技術，需要將精液從流式細胞儀轉至母馬處。該研究對經性別預選后的新鮮公馬精子的壽命和頂體狀態(tài)進行了檢驗。對7匹公馬每匹用人造陰道收集三次射精液，并置于脫脂乳-葡萄糖稀釋劑(體積比為1∶1)內，于20℃在2～6小時內運到實驗室。將精液以400g離心10分鐘，除去精液漿。將精子團粒重懸浮于Kenneys改良臺氏培養(yǎng)基(Kenneys modified tyrodesmedium，KMT)中，濃度為100×106個精子/ml，用Hoechst 33342(5mg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)染色，孵育30分鐘，進行流式細胞計數(shù)。將分選出來的精子離心，重懸于KMT中，濃度為40×106個精子/ml，以250μl的等分液于4℃或20℃儲存48小時。在分選前以及分選后0、2、12、24、36和48小時評估精子的總前進運動力(TPM)和頂體狀態(tài)。TPM用顯微鏡進行評估，頂體用異硫氰酸熒光素-花生凝集素(FITC-PNA)(Sigma-Aldrich)染色并分成完整、部分缺損或完全缺失。公馬、時間及儲存溫度的影響用Proc GLM程序進行分析，并進行最小平均數(shù)比較(SAS研究所)。
公馬對隨時間的精子運動力和完整頂體比率有影響(P＝0.03)。用Hoechst 33342染色和孵育使完整頂體的比率下降(表1)。但是，分選后所觀察到的完整頂體比率高于分選前精子群中的完整頂體比率。在分選后的48小時內，隨著完全缺失頂體的增加(P＜0.0001)，完整頂體的比率下降(P＜0.0001)，但時間對部分缺損頂體的比率沒有影響。分選后精子儲存溫度具有顯著影響，使得在20℃儲存12小時的精子的運動力高于在4℃儲存12小時的精子的運動力。通過流式細胞計數(shù)對精子進行性別分選篩選出了可以使頂體完整性保持24小時的精子群，其相當于新鮮精子。經FACS(熒光激活的細胞分選法)分離后精子壽命可以維持12小時，能使經性別選擇后的精子被運送到位于距流式細胞計數(shù)儀處有一定距離的母馬處。
表1、流式分選的精子隨時間變化的運動力和頂體狀態(tài) a，b同一欄內帶不同上標的值具有顯著性差別(p＜0.05)。
在已進行的研究中已經精確和可靠地產生了預定性別的小馬駒(Lindsey等.，Equine Vet.J.2002，34128-132)。但是，如果可以得到冷凍/解凍的經性別分選的精子，則經性別分選的精子可以在工業(yè)上得到更有效的應用。本研究的目的是比較兩類精子的運動特征，其中一類精子于15℃儲存18小時、流式分選，然后冷凍，另一類精子于15℃運輸18小時后直接低溫保存。對于5匹公馬中每匹均使用兩次射精液。在收集之后，兩種處理所用的精子均用Kenney改良臺氏培養(yǎng)基(KMT)稀釋到25×106個精子/ml，并在15℃的水浴中儲存18小時。儲存之后，使精子溫度達到周圍環(huán)境的溫度(約22℃)，然后以600g離心10分鐘。棄去精液漿，在KMT中將精子沉淀重懸浮到500×106個精子/ml。從該樣品移去一等分精子(作為對照)，用脫脂乳、蛋黃冷凍稀釋劑(4％甘油，F(xiàn)R5)稀釋到87×106個精子/ml，使其在90分鐘內緩慢冷卻至5℃，然后冷凍于液氮蒸氣中。精子的另一等分液(流式分選組)用KMT稀釋到100×106個精子/ml，用Hoechst 33342(5mg/ml，Sigma-Aldrich，St.LouisMO)染色，孵育30分鐘，然后進行流式細胞計數(shù)分選。分選的精子以850g離心20分鐘，在FR5中重懸浮到87×106個精子/ml，使其在90分鐘內緩慢冷卻至5℃，然后低溫保存。將用于兩種處理的精子裝在0.25ml的吸管內，每管含有20×106個精子。在解凍后30分鐘和90分鐘時(由2位觀察人員)對可見(visual)前進運動力進行評估(盲評)。每管的等分精子均用KMT和含2mM咖啡因的KMT稀釋?？墒箻悠酚?7℃平衡5～10分鐘后再進行評估。每一組的第二吸管用Hamilton-Thorn運動力分析儀(CASA)進行評估(含或不含咖啡因)。結果如表1所示。運動參數(shù)的差別由方差分析來確定。根據大部分經測量的反應，流式分選對精子運動力有損害。另外，2mM咖啡因可以對許多精子反應進行改善。這里存在著交互作用，因此與對照精子相比，咖啡因可以使分選精子的某些反應得到更大的改善。因此，分選所帶來的損傷可以部分地由咖啡因來補償。母馬的生殖道中也可能存在類似的補償。目前研究仍在進行，以對分選過的、低溫保存的公馬精子的生育力與在低溫保存前已儲存并分選過的精子的生育力進行比較。

a，b，c，d同一欄內不同上標的值具有差別(P，0.05)。
C-用2mM咖啡因刺激的處理組。
將科羅拉多州和明尼蘇達州的年齡為3～6歲的母麋鹿，在9月份通過將孕酮CIDR(含有孕酮并緩慢釋放的陰道栓)植入陰道12～14天以使它們發(fā)情期同步。移去CIDR后，給麋鹿肌肉內施用200IU的eCG，在60小時后使其同步授精。通過電刺激射精從5歲大的公麋鹿收集新鮮的精液，緩慢冷卻4小時以上，直到約20℃，作為純射精液運輸?shù)骄臃诌x試驗室。將1.5ml等分液于15,000g離心10秒，使射精液濃縮到1×109個精子/mL以用于染色。將精液在112μM的Hoechst 33342中，在TALP液中濃度為200×106個精子/mL的條件下，于34℃孵育45分鐘，然后稀釋到100×106個精子/mL用于分選。根據含有X染色體的精子與含有Y染色體的精子其DNA含量不同來分選精子。含有X染色體的麋鹿精子DNA含量比含有Y染色體的麋鹿精子DNA含量多3.8％。使用MoFloSX，以50psi操作，使用基于TRIS的鞘液，對精子進行4小時以上的流式分選。用發(fā)射功率為150mW的氬激光的351及364波段來激發(fā)與DNA結合的Hoechst 33342染色劑。收集含有X染色體和含有Y染色體的精子(通過對用聲波降解的精子等分液進行DNA重分析，驗證其純度約為92％)，將其以約4700個精子/秒的速度收集到含有2ml的20％蛋黃-TRIS稀釋劑的試管中。連續(xù)收集15ml的分選體積。對于每一性別，分選得到約110×106個精子，冷卻90分鐘以上使之達到5℃。于5℃將等體積的含甘油(12％)的稀釋劑加到經分選的體積中。通過將含30ml的分選精子等分液于4℃以850×g離心20分鐘來進行濃縮。匯集精子沉淀，調節(jié)到21.7×106個精子/mL，并裝到0.25ml的吸管內。每根管中均含有總量為5×106的精子，將其在液氮蒸氣中進行冷凍。作為對照，同時將來自相同射精液的總量為5×106個精子象經性別分選的精子一樣在0.25ml的管中冷凍。于37℃解凍30秒后，通過目測估計，分別有65％和60％的精子(分別為對照和經性別分選)具有前進運動力。用常規(guī)的子宮體內經子宮頸精液沉積法，對三匹來自不同地方及不同飼養(yǎng)條件的母麋鹿進行授精。授精后40天，通過檢測血液中妊娠特異性的蛋白B(Bio Tracking，Moscow，Idaho)來確定妊娠情況。位于一個地方的10匹母麋鹿授精時狀態(tài)不好，用經性別分選的或對照精子均未能妊娠。在其他地區(qū)用經性別分選的精子所獲得的妊娠率(61％，11/18)與用對照授精物獲得的妊娠率(50％，3/6)類似。得到這些妊娠率(經性別分選的和對照)所使用的精子少于正常的麋鹿人工授精所使用的精子。11只用經性別分選的精子所得到的小仔中有9只(82％)為預期的性別。
本發(fā)明還可包括根據本發(fā)明上述任意實施方案所產生的哺乳動物；或者可以包括根據本發(fā)明各種實施方案所產生的具有預定性別的哺乳動物，所述實施方案提供了富含X染色體精子群或富含Y染色體精子群的精子授精樣品；或者包括根據本發(fā)明任意實施方案產生的所哺乳動物，在所述實施方案中精子授精樣品所含有的精子數(shù)量少于特定哺乳動物授精時通常所使用的精子數(shù)量；或者包括上述根據本發(fā)明所產生的麋鹿子代。
從上文中可以很容易地理解，本發(fā)明的基本思想可以用不同途徑來具體實施。本發(fā)明涉及精子處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括進行精子處理的技術及裝置。在本申請中，通過所述各種裝置所得到的部分結果和所采用的固有步驟而公開了各種細胞處理技術。它們僅僅是利用所述預期裝置的自然結果。另外，當部分裝置被披露時，應該理解，這些裝置不僅完成了某些方法，并且還可以用多種方式加以改變。重要的是，對于所有的前述內容，應當理解所有這些方面均包含在本發(fā)明所披露的內容之中。
這份非臨時申請中所包括的討論，其目的是為了提供基本的描述。讀者應知道，具體的討論可能并非明確地描述所有可能的實施方案，許多替代選擇是隱含的。它可能沒有充分地解釋本發(fā)明的普遍性質，也可能沒有明確地顯示各個性質或元件實際上如何代表大量不同功能或大量替代方案或等同元件。同樣，這些也隱含地包括在本發(fā)明的公開內容中。當從裝置術語的角度描述本發(fā)明時，裝置的每一元件隱含地執(zhí)行一種功能。裝置權利要求不僅可包括所述的裝置，還可以包括用于實現(xiàn)本發(fā)明的功能或每個元件所執(zhí)行的功能的方法或過程的權利要求。所有描述及術語均并非是對權利要求范圍的限制，權利要求的范圍包含在整個專利申請中。
同時應當理解的是，可以實施各種變更而不會背離本發(fā)明的本質。這些變更也暗含地包括在本說明中。它們仍屬于本發(fā)明的范圍。廣泛的公開內容包括于本發(fā)明的公開內容之內，其中包括已經展示的顯式實施方案、大量隱含的替代實施方案及廣泛的方法或過程。
而且，本發(fā)明及權利要求的每個不同元件還可以用多種方式獲得。本公開內容應理解為包括每一個這樣的變化，不論它是任意的裝置的實施方案、方法或過程的實施方案的變更，還是甚至僅僅是其中任意元件的變更。特別是，應該理解，由于本方面公開內容涉及本發(fā)明的元件，每個元件的文字可以用等同的裝置術語或方法術語來表達——甚至僅僅是其具有相同的功能或結果。應認為這些等同的、更廣泛的甚至是更上位的術語包含于各元件或動作的描述中。當需要對本發(fā)明所包括的隱含的廣泛范圍進行明確時，這些術語可加以替換。僅舉一個例子來說，應該理解的是，所有的動作均可以用執(zhí)行該動作的裝置或促使產生該動作的元件來表達。類似地，每一公開的物理元件應理解為包含了對所述物理元件執(zhí)行的動作的公開。就此最后一方面來說，僅舉一個例子，“流式分選儀”的公開內容應理解為包含了“流式分選”動作的公開內容，無論其是否明確討論過；反過來說，當有“流式分選”動作的有效公開時，這樣的公開內容應理解為包括了“流式分選儀”，甚至包括了“流式分選方式”的公開。這些變化及替代術語應理解為明確包括在說明書內。
本專利申請中提及的任何法律、法令、規(guī)章或準則的條款，或此專利申請中提及的專利、出版物或其他參考文獻均以參考的方式引入本文。另外，對于所用的每一術語，應當理解，除非其在本申請中的應用與通用詞典中的解釋不一致，否則應當認為，本文引入了通用詞典中對各條術語的定義。在此以參考的方式引入例如Random House Webster’s UnabridgedDictionary(《蘭登書屋韋氏大詞典》)第二版的所有定義、替代術語和同義詞。最后，以參考方式引入該臨時專利申請的參考文獻列表中所列出的所有文獻或其他與該申請同時提交的信息聲明均在此附上，并以參考的方式引入；但是，對于上述每一項來說，這些以參考方式引入的信息或聲明可被認為與此/這些發(fā)明的專利權不一致，很清楚這樣的聲明不能認為是本申請人所做出的。
因此，應理解為申請人至少要求如下i)本文所公開和描述的各種精子處理裝置；ii)所公開和描述的相關方法；iii)這些裝置和方法的類似、等同甚至是隱含的變化；iv)可以完成所公開和描述的所示各個功能的替代設計；v)完成每一所示功能的替代設計和方法，其為隱含的完成所公開和描述的功能的替代設計和方法；vi)作為分開的和獨立的發(fā)明所顯示的各個性質、元件及步驟；vii)由所公開的不同系統(tǒng)或組分而改進的申請；viii)由此類系統(tǒng)或元件所生成的最終產品；以及ix)基本在上文中并參考任何所附實施例所描述的方法和裝置，X)所公開元件的各種組合及排列，及xi)從屬于每個或其中任何一個獨立權利要求或概念的每個從屬的潛在的從屬權利要求或概念。就這點上，應理解的是出于實踐的原因及為了避免增加數(shù)以百計權利要求的可能性，申請人最終僅提交了具有最初的從屬權利要求的權利要求。支持應當被理解為達到有關新實體法規(guī)(new matterlaws)所要求的程度，以便能夠在一項獨立權利要求或概念之下增加各種的從屬權利要求或其他要素，作為任何其他獨立權利要求或概念的從屬權利要求或要素，上述法規(guī)包括但不限于《歐洲專利公約》第123(2)條和美國專利法35 USC 132或其他此類法律。而且，如果使用或當使用表示轉接關系的措詞“包含”時，根據習慣上對權利要求的解釋，使用該詞是為了保持本文權利要求為“開放式”。因此，除非上下文需要，術語“包含”或諸如“包括“或“含有”等變化形式應理解為，它們意指包括所聲明的要素或步驟或者要素或步驟的組，而不排除任何其他的要素或步驟或者要素或步驟的組。這樣的術語應以其最廣泛的形式來解釋，以使申請人獲得法律許可的最廣泛的范圍。
權利要求
1.一種生成精子授精樣品的方法，該方法包括a.從哺乳動物的雄性個體獲取精液；b.生成具有流動特征的液流；c.改變所述液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力；d.將精子夾帶入所述液流中；e.通過調節(jié)所述液流的壓力來控制精子的生育力特征；及f.產生具有可控精子生育力特征的精子授精樣品。
2.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述哺乳動物選自牛、馬、綿羊、犬、貓、豬、海洋動物、鹿、靈長類動物或山羊。
3.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述液流包含鞘液流。
4.如權利要求3所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述鞘液流包括含有磷酸緩沖鹽溶液的鞘液。
5.如權利要求3所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述鞘液流包括含有檸檬酸鹽緩沖液的鞘液。
6.如權利要求5所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述檸檬酸鹽緩沖液包含約2.9％的檸檬酸鈉。
7.如權利要求3所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述鞘液流包括含有HEPES緩沖液的鞘液。
8.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述液流在流式細胞計數(shù)儀或細胞分選儀中產生。
9.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中改變所述液流的流動特征以調節(jié)液流壓力的步驟包括改變所述流動特征以將所述液流的壓力調節(jié)到每平方英寸約20磅至每平方英寸約60磅之間。
10.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；通過調節(jié)所述液流的壓力來控制精子的生育力特征的步驟包括確定被夾帶入所述液流中的牛精子的生育力特征，該牛精子的生育力特征與所述精液中的所述牛精子的生育力特征之間無實質性差別。
11.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；通過調節(jié)所述液流的壓力來控制精子的生育力特征的步驟包括確定被夾帶入所述液流中的所述牛精子的生育力特征，該牛精子的生育力特征與所述精液中的所述牛精子的牛精子生育力特征基本相當。
12.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；產生具有可控精子生育力特征的精子授精樣品的步驟包括產生具有牛精子生育力特征的牛精子授精樣品，該牛精子授精樣品的牛精子生育力特征與所述精液中的所述牛精子的生育力特征之間無實質性差別。
13.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；產生具有可控精子生育力特征的精子授精樣品的步驟包括產生具有牛精子生育力特征的牛精子授精樣品，該牛精子授精樣品的牛精子生育力特征與所述精液中的所述牛精子的生育力特征基本相當。
14.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約30磅至每平方英寸約50磅之間。
15.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約30磅至每平方英寸約40磅之間。
16.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公牛獲取牛精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約40磅。
17.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；通過調節(jié)所述液流的壓力來控制精子的生育力特征的步驟包括確定被夾帶入所述液流中的馬精子的生育力特征，該馬精子的生育力特征與所述精液中的所述馬精子的生育力特征之間無明顯差別。
18.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；通過調節(jié)所述液流的壓力來控制精子的生育力特征的步驟包括確定被夾帶入所述液流中的馬精子的生育力特征，該馬精子的生育力特征與所述精液中的所述馬精子的生育力特征基本相當。
19.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；產生具有可控精子生育力特征的精子授精樣品的步驟包括產生具有所述馬精子生育力特征的馬精子授精樣品，該馬精子授精樣品的馬精子生育力特征與所述精液中的所述馬精子的生育力特征之間無實質性差別。
20.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；產生具有可控精子生育力特征的精子授精樣品的步驟包括產生具有馬精子生育力特征的馬精子授精樣品，該馬精子授精樣品的馬精子生育力特征與所述精液中的所述馬精子的生育力特征基本相當。
21.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約30磅至每平方英寸約50磅之間。
22.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約30磅至每平方英寸約40磅之間。
23.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中從哺乳動物的雄性個體獲取精液的步驟包括從公馬獲取馬精液；所述改變液流的流動特征以調節(jié)液流的壓力的步驟包括改變所述液流的所述流動特征以將液流壓力調節(jié)到每平方英寸約40磅。
24.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述精子的生育力特征包括精子的運動力。
25.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括牛精子的運動力。
26.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括馬精子的運動力。
27.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括精子的存活力。
28.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括牛精子的存活力。
29.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括馬精子的存活力。
30.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括所述哺乳動物雌性個體的妊娠率，該雌性個體已用所述具有可控精子生育力特征的精子授精樣品進行授精。
31.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括母牛的妊娠率，該母牛已用具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品進行授精。
32.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括母馬的妊娠率，該母馬已用具有可控精子生育力特征的馬精子授精樣品進行授精。
33.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括卵母細胞的卵裂率，該卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的精子授精樣品進行受精。
34.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括牛卵母細胞的卵裂率，該牛卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品受精。
35.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括馬卵母細胞的卵裂率，該馬卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的馬精子授精樣品進行受精。
36.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括卵母細胞的胚囊率，該卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的精子授精樣品進行受精。
37.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括牛卵母細胞的胚囊率，該牛卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品進行受精。
38.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述生育力特征包括馬卵母細胞的胚囊率，該馬卵母細胞已用所述具有可控精子生育力特征的馬精子授精樣品進行受精。
39.如權利要求31所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品含有約1×105至2×107個所述的牛精子。
40.如權利要求31所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述具有可控精子生育力特征的牛精子授精樣品含有約1×106至3×106個所述的牛精子。
41.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，該方法還包括將所述精子染色的步驟。
42.如權利要求41所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述將精子染色的步驟包括用Hoechst 33342對所述精子進行染色。
43.如權利要求1所述的生成精子授精樣品的方法，該方法還包括在所述液流中產生液滴，其中在一些所述液滴中含有一個精子，該精子為任何一種所述精子。
44.如權利要求43所述的生成精子授精樣品的方法，該方法還包括根據性別特征區(qū)分所述精子。
45.如權利要求44所述的生成精子授精樣品的方法，其中根據性別特征區(qū)分所述精子的步驟包括根據DNA含量區(qū)分所述精子。
46.如權利要求44所述的生成精子授精樣品的方法，其中根據性別特征區(qū)分所述精子的步驟包括根據精子頭部的體積區(qū)分所述精子。
47.如權利要求44所述的生成精子授精樣品的方法，該方法還包括根據所述性別特征分離精子的步驟。
48.如權利要求47所述的生成精子授精樣品的方法，該方法還包括將所述具有可控精子生育力特征的精子授精樣品收集到收集容器中的步驟。
49.如權利要求48所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述將具有可控精子生育力特征的所述精子授精樣品收集到收集容器中的步驟包括將經性別選擇的精子授精樣品收集到所述收集容器中。
50.如權利要求49所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述經性別選擇的精子授精樣品包括用于人工授精的經性別選擇的精子授精樣品。
51.如權利要求49所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述經性別選擇的精子授精樣品包括用于體外受精的經性別選擇的精子授精樣品。
52.如權利要求49所述的生成精子授精樣品的方法，其中所述經性別選擇的精子授精樣品包括用于胞質內注射的經性別選擇的精子注射樣品。
53.一種對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，該方法包括a.從哺乳動物的雄性個體獲取精液；b.提供經過第一處理條件處理的含Y染色體的經性別選擇的精子；c.提供經過第二處理條件處理的含X染色體的經性別選擇的精子；d.產生授精樣品，該授精樣品中的所述經過第一處理條件處理的含Y染色體的經性別選擇的精子和所述經過第二處理條件處理的含X染色體的經性別選擇的精子成一定比率；e.用所述授精樣品使所述哺乳動物的至少一個雌性個體授精，所述授精樣品中的經過第一處理條件處理的含Y染色體的精子和所述經過第二處理條件處理的含X染色體的精子成所述比率；f.由所述哺乳動物的至少一個雌性個體產生子代；g.通過對以下兩種比率進行比較來評價所述經性別選擇的精子的生育力，一種比率為所述哺乳動物的至少一個雌性個體所產生的子代的性別比率，另一種比率為所述經過第一處理條件處理的含Y染色體的精子與所述經過第二處理條件處理的含X染色體的精子的比率。
54.如權利要求53所述的對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，其中所述經過第一處理條件處理的含Y染色體的精子與經過第二處理條件處理的含X染色體的精子的所述比率包括基本等量的經過第一處理條件處理的含Y染色體的精子和經過第二處理條件處理的含X染色體的精子。
55.如權利要求53所述的對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，其中所述哺乳動物的所述至少一個雌性個體的子代的所述性別比率包括胚胎的性別比率。
56.如權利要求53所述的對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，其中所述哺乳動物的所述至少一個雌性個體的子代的所述性別比率包括胎仔的性別比率。
56.如權利要求53所述的對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，其中所述哺乳動物的所述至少一個雌性個體的子代的所述性別比率包括已出生后代的性別比率。
57.如權利要求53所述的對經性別選擇的精子的生育力進行評價的方法，其中所述哺乳動物的所述至少一個雌性個體包括數(shù)量足夠多的所述哺乳動物的雌性個體，以產生數(shù)量足夠多的子代來確定子代的所述性別比率。
58.一種對來自于一種哺乳動物的雄性個體的精子的生育力進行評價的方法，該方法包括a.從一種哺乳動物的至少兩個雄性個體獲取精子；b.對所述至少兩個雄性個體的所述精子進行基本相同的流式細胞計數(shù)處理；c.用精子混合物使所述哺乳動物的至少一個雌性個體授精，所述精子混合物由所述哺乳動物的至少兩個雄性個體中的每一個個體的所述精子以基本等量混合而成，所述精子經過基本相同的流式細胞計數(shù)處理；d.從所述哺乳動物的至少一個雌性個體收集胚胎；e.測定所述哺乳動物的所述至少兩個雄性個體中的哪一個為每個胚胎的雄性親代；及f.根據以所述哺乳動物的至少兩個雄性個體中的每一個個體作為雄性親代的相對胚胎數(shù)，對所述至少兩個雄性個體的相對生育力進行分級。
59.如權利要求58所述的對來自于一種哺乳動物的雄性個體的精子的生育力進行評價的方法，其中所述流式細胞計數(shù)處理包括根據性別特征對來自所述至少兩個雄性個體的每一個個體的所述精子進行分離。
60.如權利要求58所述的對來自于一種哺乳動物的雄性個體的精子的生育力進行評價的方法，其中所述流式細胞計數(shù)處理包括對來自于所述至少兩個雄性個體的每一個個體的精子進行性別選擇。
61.一種對來自于一種哺乳動物的雄性個體的精子的生育力進行評價的方法，該方法包括a.從一種哺乳動物的至少兩個雄性個體獲取精子；b.將所述至少兩個雄性個體的精子進行基本相同的流式細胞計數(shù)處理；c.用精子混合物使卵母細胞體外受精，所述精子混合物由所述哺乳動物的至少兩個雄性個體中的每一個個體的所述精子以基本等量混合而成，所述精子經過基本相同的流式細胞計數(shù)處理；d.收集通過使所述卵母細胞體外受精而產生的胚胎；e.測定所述哺乳動物的所述至少兩個雄性個體中哪一個為每個胚胎的雄性親代；及f.根據以所述哺乳動物的至少兩個雄性個體中的每一個個體作為雄性親代的相對胚胎數(shù)，對所述至少兩個雄性個體的相對生育力進行分級。
全文摘要
用于生成精子授精樣品的精子處理系統(tǒng)，所述精子授精樣品的精子具有可控的精子生育力特征。
文檔編號C12N5/00GK1674780SQ03818558
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月1日 優(yōu)先權日2002年8月1日
發(fā)明者約翰·L·申克, 喬治·E·塞德爾, 徐泰光 申請人:Xy公司, 科羅拉多州州立大學