專利名稱:T細(xì)胞的分離和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明一般性地涉及診斷和治療例如多發(fā)性硬化癥(MS)的自身免疫性疾病的領(lǐng)域。更特別地,涉及抗原特異的T細(xì)胞的分離。此外,本發(fā)明涉及利用抗原特異的T細(xì)胞來治療例如MS的自身免疫性疾病。
背景由細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞或T輔助細(xì)胞上的T細(xì)胞受體(TCR)形成的細(xì)胞間識別復(fù)合物和抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的MHC/肽復(fù)合物是在不同類的細(xì)胞-細(xì)胞相遇時的共同識別成分,其在個體生物內(nèi)T細(xì)胞的所有組成成分的發(fā)育期間(陽性選擇;陰性選擇;外周存活)和在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的控制(T輔助細(xì)胞)和效應(yīng)階段(T殺死細(xì)胞)期間活化T細(xì)胞。
在適應(yīng)性的免疫應(yīng)答中,抗原由高變異度的分子,例如抗體或TCRs來識別,這些分子表達(dá)足夠不同的結(jié)構(gòu)而能夠識別任何抗原??贵w可結(jié)合抗原表面的任何部分。然而,TCRs只限于與結(jié)合APCs表面上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的I類或II類分子的短肽結(jié)合。肽/MHC復(fù)合物的TCR識別觸發(fā)T細(xì)胞的活化(無性系的擴展)。
TCRs是由兩個鏈組成的異二聚體,這兩個鏈可以是αβ(α-β)或γδ(γ-δ)。TCRs的結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白(Ig)的結(jié)構(gòu)非常相似。每個鏈具有兩個作為免疫球蛋白折疊的胞外結(jié)構(gòu)域。氨基末端結(jié)構(gòu)域是高度可變的并且被稱為可變(V)結(jié)構(gòu)域。最接近膜的結(jié)構(gòu)域是恒定(C)結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)域類似于免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域,并且類似于Fab片段。每個鏈的V結(jié)構(gòu)域具有3個互補的決定區(qū)(CDR)。每個TCR鏈在接近膜的一側(cè),具有短的連接序列,其中半胱氨酸殘基在兩個鏈之間形成二硫鍵。
編碼αβ和γδ異二聚體的基因只在T細(xì)胞系中表達(dá)。4個TCR基因座(α、β、γ和δ)具有與Ig非常相似的胚系組織結(jié)構(gòu)。α和γ鏈?zhǔn)峭ㄟ^V和J節(jié)段的重排而產(chǎn)生的,而β和δ鏈?zhǔn)峭ㄟ^V、D和J節(jié)段的重排而產(chǎn)生的。TCR鏈的基因節(jié)段位于不同的染色體上,除δ鏈基因節(jié)段是位于α鏈的V和J基因節(jié)段之間以外。δ-鏈基因節(jié)段的位置具有顯著性α-鏈基因節(jié)段的有效重排缺失了δ-鏈的C基因,因此在給定的細(xì)胞中,αβ異二聚體不能與γδ受體共表達(dá)。
在小鼠中,約有100個Vα和50個Jα基因節(jié)段,而只有一個Cα節(jié)段。δ-鏈基因家族約有10個V、2個D和2個J基因節(jié)段。β-鏈基因家族具有20-30個V節(jié)段和兩個包含1個Dβ、6個Jβ和1個Cβ的相同的重復(fù)。最后,γ-鏈基因家族包含7個V和3個不同的J-C重復(fù)。在人類中,該組織結(jié)構(gòu)與小鼠的相似,但是節(jié)段的數(shù)目不同。
α和β鏈中基因節(jié)段的重排與Igs的相似。α鏈,類似于Ig的輕鏈,是由V、J和C基因節(jié)段編碼的。β鏈,類似于Ig的重鏈,是由V、D和J基因節(jié)段編碼的。α鏈基因節(jié)段的重排導(dǎo)致VJ連接,而β鏈的重排導(dǎo)致VDJ連接。在重排基因的轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯后,α和β鏈表達(dá)后通過T細(xì)胞膜中的二硫鍵而連接。
TCR基因節(jié)段側(cè)接包含七聚物和九聚物的識別信號序列(RSS),其中含有12個核苷酸(1個轉(zhuǎn)彎)或23個核苷酸(兩個轉(zhuǎn)彎)的間插序列。如在Igs中,由重組活化的基因(RAG-1和RAG-2)編碼的酶負(fù)責(zé)重組過程。RAG1/2識別RSS并且以與Ig重排中相同的方式連接V-J和V-D-J節(jié)段。簡而言之,這些酶切割基因節(jié)段和RSS之間的1個DNA鏈,并且催化編碼序列中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。隨后信號序列被切除。
α鏈中V和J節(jié)段、β鏈中V、D和J節(jié)段的組合連接產(chǎn)生大量的潛在分子,由此產(chǎn)生TCRs的多樣化。也通過基因節(jié)段的交替連接而實現(xiàn)TCRs中的多樣性。相對于Ig,β和δ基因節(jié)段可以以備選的方式相連。β和δ基因節(jié)段中RSS側(cè)面的基因節(jié)段可在β鏈中產(chǎn)生VJ和VDJ,而在δ鏈上產(chǎn)生VJ、VDJ和VDDJ。如在Ig的情況中,也通過基因節(jié)段連接中的易變性而產(chǎn)生多樣性。
被稱為互補決定區(qū)(CDRs)的TCR的高變異度的環(huán)識別由MHC分子和結(jié)合肽組成的復(fù)合表面。α和β的CDR2環(huán)只接觸APC表面上的MHC分子,而CDR1和CDR3環(huán)同時接觸肽和MHC分子。與Ig相比較,在CDR1和CDR2中TCRs具有更有限的多樣性。然而,以TCRs中CDR3環(huán)的多樣性比Ig的要高,因為TCRs可連接多于一個的D節(jié)段,而導(dǎo)致連接多樣性的增加。
認(rèn)為許多自身免疫性疾病的發(fā)病機理是由自身免疫T細(xì)胞對存在于生物體中的自身抗原的應(yīng)答所引起的。與無性系選擇范例相抵觸,在胸腺中并不是所有的自身反應(yīng)性T細(xì)胞都是缺失的。具有針對廣譜的自身抗原的TCRs的那些T細(xì)胞代表了正常T細(xì)胞所有組成成分的部分,并且天然地在外周中循環(huán)。還不清楚為什么在其進(jìn)化期間,容許自身反應(yīng)性T細(xì)胞在胸腺中進(jìn)行分化,并且為外周所接納。雖然還不理解其生理學(xué)作用,但是當(dāng)這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞被活化時,它們在自身免疫病理學(xué)的誘導(dǎo)中賦予潛在的風(fēng)險。還可以從沒有自身免疫性疾病結(jié)論的正常個體分離自身反應(yīng)性T細(xì)胞。已經(jīng)證實自身反應(yīng)的抗原識別本身不足以介導(dǎo)自發(fā)裂解過程。自身反應(yīng)性T細(xì)胞成為病原的一個先決條件是它們必須是活化的。
自身反應(yīng)性T細(xì)胞涉及自身免疫性疾病,例如多發(fā)性硬化癥(MS)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機理。一般相信,MS中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的發(fā)病機理是由于T細(xì)胞對髓磷脂抗原,特別是對髓磷脂堿性蛋白(MBP)的應(yīng)答而產(chǎn)生的。發(fā)現(xiàn)MBP-活性的T細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生活化,并且與對照個體相比,在患有MS的患者的血液和腦脊髓液中以更高的前體頻率出現(xiàn)。這些MBP-活性的T細(xì)胞產(chǎn)生TH1細(xì)胞因子,例如IL-2、TNFα和γ-干擾素(IFNγ),其有助于炎癥細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且加劇MS中髓磷脂-破壞性的炎癥性應(yīng)答。
也已經(jīng)顯示髓磷脂活性的T細(xì)胞與動物中實驗性的自身免疫腦脊髓炎(EAE)的發(fā)病機理有關(guān),該炎癥類似于MS??稍谝赘袆游镏型ㄟ^注射在佐劑中乳化的髓磷脂蛋白質(zhì)來主動誘導(dǎo)EAE,或通過注射髓磷脂活性的T細(xì)胞系和來源于髓磷脂敏化的動物的細(xì)胞克隆來被動誘導(dǎo)EAE。當(dāng)在體外活化時,需要極少數(shù)目的髓磷脂活性的T細(xì)胞來誘導(dǎo)EAE,而具有相同活性的100-倍以上的靜止T細(xì)胞不能介導(dǎo)EAE。
已經(jīng)證明可通過用失活的髓磷脂活性的T細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種來預(yù)防和治療EAE,該方法被稱為T細(xì)胞疫苗接種(Ben-Nun等人,自然Nature,1981;29260-61)。T細(xì)胞疫苗接種誘導(dǎo)由抗-獨特型的T細(xì)胞和抗-動力型(ergotypic)的T細(xì)胞組成的調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答,其導(dǎo)致髓磷脂活性的T細(xì)胞的耗盡。通過耗盡髓磷脂活性的T細(xì)胞,在EAE和其他實驗性的自身免疫性疾病模型中觀察到治療作用(Lider等人,科學(xué)Science,1988;239820-822;Lohse等人,科學(xué)Science,1989;244820-822)。
由于在自身免疫性疾病模型中的成功,T細(xì)胞疫苗接種進(jìn)展到在患有MS的患者中進(jìn)行臨床試驗。根據(jù)在實驗性模型,例如EAE中的結(jié)果,相信自身反應(yīng)性T細(xì)胞的減少可能改善MS和其他自身免疫性疾病的臨床病程。
在引導(dǎo)性的臨床試驗中,用放射自體同源的MBP-活性的T細(xì)胞克隆進(jìn)行疫苗接種來引發(fā)CD8+細(xì)胞溶解型的T細(xì)胞應(yīng)答,該應(yīng)答特異地識別和裂解循環(huán)的MBP活性的T細(xì)胞(Zhang等人,科學(xué)Science,1993;2611451-1454,Medaer等人,柳葉刀Lancet,1995346807-808)。用放射MBP-活性的T細(xì)胞克隆進(jìn)行3次皮下接種導(dǎo)致MS患者中循環(huán)的MBP活性的T細(xì)胞減少。
在初級的臨床試驗中,通過用放射自體同源的MBP-活性的T細(xì)胞進(jìn)行3次皮下注射來對患者進(jìn)行接種,使在復(fù)發(fā)減少的MS患者和次級漸進(jìn)的MS患者中循環(huán)的MBP活性的T細(xì)胞減少(Zhang等人,JNeurol.,2002;249212-8)。通過測量復(fù)發(fā)的比率、擴展的無力狀態(tài)的積分和MRI病變活性,證實T細(xì)胞疫苗接種對每組患者都是有益的。然而,在上次注射后的大約12個月以后,有加速病程進(jìn)展的趨勢。明顯加速進(jìn)展的顯著性是未知的,但是可能與通過針對MBP活性的T細(xì)胞的T細(xì)胞疫苗接種誘導(dǎo)的免疫力的逐漸下降有關(guān)。在大約10-12%的免疫患者中,MBP活性的T細(xì)胞在大約與加速進(jìn)展的同時重新出現(xiàn)。有時,重新出現(xiàn)的MBP活性的T細(xì)胞來源于不同的克隆群體,該群體在疫苗接種前未被檢測到,表明MBP-活性的T細(xì)胞可能發(fā)生了無性系的轉(zhuǎn)變或表位的擴散。已經(jīng)在上述研究中觀察到MBP活性的T細(xì)胞的無性系轉(zhuǎn)變(Zhang等人,1995)并且可能與正在發(fā)展的疾病過程相關(guān)。
盡管已經(jīng)表明T細(xì)胞疫苗接種對于耗盡髓磷脂活性的T細(xì)胞是有效的,并且對MS患者有潛在的好處,但該治療仍然有若干問題。對于每個患者的T細(xì)胞疫苗治療必須個別地加以考慮,因為髓磷脂活性的T細(xì)胞的T細(xì)胞受體是高度不同的,并且在不同的MS患者之間是不同的(Vandevyver等人,Eur.J.Immunol.,1995;25958-968,Wucherpfennig等人,J.Immunol.,1994;1525581-5592,Hong等人,J.Immunol.,1999;1633530-3538)。
除個別地考慮每個患者外,利用目前的方法最多需要8周的時間來產(chǎn)生給定的T細(xì)胞疫苗。T細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)開始于從患者的腦脊髓液(CSFMCs)或外周血(PBMCs)分離單核細(xì)胞。然后將分離的單核細(xì)胞與髓磷脂肽一起培養(yǎng)7-10天,以活化髓磷脂活性的T細(xì)胞。然后通過測量在3天期間內(nèi)在存在髓磷脂肽時,[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入來測試培養(yǎng)物對于髓磷脂肽的特異增殖。然后將測試為對于髓磷脂肽的特異性增殖是陽性的培養(yǎng)物連續(xù)地稀釋來獲得無性系的T細(xì)胞系或直接進(jìn)行擴展。然后將細(xì)胞培養(yǎng)至多達(dá)到6-8周以擴展T細(xì)胞。當(dāng)最后的T細(xì)胞疫苗產(chǎn)物是無性系的時,該T細(xì)胞是均質(zhì)的,具有單一的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式。通常,將3至6個無性系的細(xì)胞系合并而產(chǎn)生異質(zhì)的制劑,具有多重的Vβ-Dβ-Jβ使用模式。當(dāng)最后的T細(xì)胞疫苗產(chǎn)物是通過直接擴展產(chǎn)生時,該T細(xì)胞是異質(zhì)的,具有多于一個的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式。
個別考慮T細(xì)胞疫苗接種的特性,和對生產(chǎn)每個疫苗所需要的長時間的細(xì)胞培養(yǎng)使得在目前方法論下的治療是昂貴的,并且是勞動密集的。細(xì)胞培養(yǎng)所需要的延長的時間也造成顯著的污染風(fēng)險。最后,髓磷脂活性的T細(xì)胞的無性系轉(zhuǎn)變或表位擴散的可能性可能需要在隨后的T細(xì)胞疫苗生產(chǎn)中對于每個患者使用不同的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式。
因此,需要發(fā)展用于分離具有針對例如MBP的抗原特異性的T細(xì)胞的改進(jìn)方法,其可能用來生產(chǎn)用于治療患有T細(xì)胞-介導(dǎo)的疾病,例如患有MS的患者的T細(xì)胞疫苗。也需要發(fā)展用于生產(chǎn)具有異質(zhì)的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式,以解決自身反應(yīng)性T細(xì)胞的無性系轉(zhuǎn)變換的T細(xì)胞疫苗的改進(jìn)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明一般性地指向用于分離抗原特異的T細(xì)胞,更特別的是特異于自身或自身抗原的T細(xì)胞的方法。用于分離一種或多種特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞的方法,一般包括培養(yǎng)包括獲得自具有所述抗原或其衍生物的患者的T細(xì)胞的樣品;選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR;而第二標(biāo)記選自IL-2、IFNg、TNFα、IL5、IL-10和IL-13。
本發(fā)明的方法對于分離在自身免疫性疾病的發(fā)病機理中起作用的自身反應(yīng)性T細(xì)胞特別有用。
本發(fā)明的方法也允許對自身免疫性疾病進(jìn)行診斷,以及監(jiān)測疾病的進(jìn)展并用于監(jiān)測對該疾病的治療效果。
本發(fā)明的方法也允許制備用于治療與T細(xì)胞有關(guān)的自身免疫性疾病的自體同源T細(xì)胞疫苗。
用于疫苗制備的方法一般包括如上所述分離抗原特異的T細(xì)胞,然后是任選的后續(xù)培養(yǎng)步驟,其中提供對分離的抗原特異的T細(xì)胞群的擴展。
本發(fā)明尤其也指向T細(xì)胞疫苗和包括用本發(fā)明方法分離的抗原特異性T細(xì)胞的藥物組合物。
本發(fā)明的方法也用于鑒定T細(xì)胞受體及其編碼核酸。
附圖簡述
圖1表明在多發(fā)性硬化癥患者中,在刺激前(左側(cè))、用MBP的第83-99位殘基刺激后(中間)以及用MBP的第83-99位殘基刺激后(右側(cè)),表達(dá)CD69和γIFN的細(xì)胞(上部)和表達(dá)CD69和TNFα的細(xì)胞(下部)的FACS鑒定。
圖2表明在健康的對照患者中,在刺激前(左側(cè))、用MBP的第83-99位殘基刺激后(中間)以及用MBP的第83-99位殘基刺激后(右側(cè)),表達(dá)CD69和γIFN的細(xì)胞(上部)和表達(dá)CD69和TNFα的細(xì)胞(下部)的FACS鑒定。
發(fā)明詳述1.定義為了幫助了解本發(fā)明,如下定義若干術(shù)語。
″自體抗原″或″自身抗原″,如在此所使用的,是指哺乳動物中天然的抗原或表位,其在所述的哺乳動物疾病中是免疫原性的,在哺乳動物種屬中是保守的,并且可能涉及自身免疫的發(fā)病機理。
″CD″、″分化簇″或″″共同的決定簇″,如在此所使用的,是指由抗體識別的細(xì)胞表面分子。一些CDs的表達(dá)是特異于特定的細(xì)胞系或成熟途徑的,并且其它CDs的表達(dá)根據(jù)活化狀態(tài)、位置或相同細(xì)胞的分化而變化。
″來源于″或″其衍生物″,在核苷酸序列的范圍中,是指核苷酸序列不只限于所描述的特異序列,而是包括該序列中的變異,其可包括核苷酸的加入、缺失、取代或修飾,其對該所述序列的改變程度仍保持在中等或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述序列的互補序列雜交的能力。在肽或多肽序列的范圍中,″來源于″或″其衍生物″是指肽或多肽不只限于所描述的特異序列,并且包括該序列中的變異,其可能包括氨基酸的加入、缺失、取代或修飾,其在所列出序列中的變異程度仍保留引發(fā)對所描述序列的免疫應(yīng)答的能力。
當(dāng)使用″免疫原性的″來描述肽或多肽時,它是指肽或多肽能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或抗體免疫應(yīng)答,或兩者皆有。
″涉及免疫的疾病″是指其中免疫系統(tǒng)涉及疾病的發(fā)病機理的疾病。涉及免疫的疾病的亞類是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括但不限于,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)、甲狀腺機能亢進(jìn)、炎癥性腸病、自身免疫眼色素視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性肌炎,和某些類型的糖尿病。鑒于所公開的內(nèi)容,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地認(rèn)識到通過本發(fā)明的組合物和方法能治療其他的自身免疫性疾病。
″PCR″指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),例如,如在美國專利號4,683,202(1987年7月28日授予Mullis)中所一般描述的,其在此引入作為參考。PCR是擴增技術(shù),其中所選擇的寡核苷酸或引物可在存在聚合因子(例如DNA或RNA聚合酶)和三磷酸核苷時,與核酸模板雜交,由此可從引物形成延伸產(chǎn)物。然后可使這些產(chǎn)物變性并且在擴增所存在的核酸的數(shù)目和數(shù)量的循環(huán)反應(yīng)中用作模板,這可便于對其進(jìn)行后繼檢測。多種PCR技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并可聯(lián)合用于在此所公開的內(nèi)容中。
″肽″或″多肽″是連接的氨基酸序列并且可能是天然的、合成的、或天然和合成物的修飾物或組合。
″引物″指無論是天然的、合成的或其修飾物的寡核苷酸,其能夠作為足夠與模板分子上的特異核苷酸序列互補的核苷酸合成的起始點。
″探針″指無論是天然的、合成的或其變體的寡核苷酸,其能夠特異地與足夠互補的核苷酸序列結(jié)合。
″T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病″指由于T細(xì)胞識別自身抗原而產(chǎn)生的疾病。
當(dāng)″療法″或″治療″涉及保護(hù)動物免于遭受疾病時,是指預(yù)防、抑制、壓制,或完全地消除疾病。預(yù)防疾病包括在疾病發(fā)病前將本發(fā)明的組合物施用于動物。抑制疾病包括在疾病誘導(dǎo)后,但在其在臨床上出現(xiàn)前將本發(fā)明的組合物施用于動物。壓制疾病包括在疾病的臨床出現(xiàn)后,將本發(fā)明的組合物施用于動物。
2.分離抗原特異的T細(xì)胞a.分離單克隆的抗原特異的T細(xì)胞可通過與抗原靶和抗原遞呈細(xì)胞一起培養(yǎng)而在細(xì)胞培養(yǎng)物中活化和擴展T細(xì)胞。一旦活化,T細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞信號的復(fù)合物級聯(lián),其導(dǎo)致許多基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在此所描述的本發(fā)明利用特異于活化的T細(xì)胞的基因產(chǎn)物來鑒定并分離具有所需要的抗原特異性的T細(xì)胞。
在第一個方面,本發(fā)明指向用于分離特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞的方法。將包括T細(xì)胞的樣品與特定的抗原一起培養(yǎng),其導(dǎo)致特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞的活化。樣品可與該抗原一起培養(yǎng)1至7天。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于1天。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于16小時。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于12小時。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于8小時。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于4小時。樣品也可與該抗原一起培養(yǎng)少于2小時。
然后可通過選擇表達(dá)如上所述活化的T細(xì)胞的基因產(chǎn)物的T細(xì)胞來分離特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞。可通過選擇具有亞型特異性基因產(chǎn)物或細(xì)胞表面標(biāo)記(例如,CD4對CD8)的T細(xì)胞來分離活化的T細(xì)胞的亞型。
目標(biāo)抗原包括髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)、髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)或其片段。目標(biāo)抗原也可能是免疫顯性的片段,包括但不限于,MBP的第83-99位殘基或第151-170位的殘基。目標(biāo)抗原也可能是兩個或多個令人感興趣的單個的抗原的組合。
用于活化T細(xì)胞的抗原或其衍生物可能是任何能夠引發(fā)對目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原?;罨乖赡苁悄繕?biāo)抗原或其衍生物。活化抗原可能是MBP、PLP、MOG,或其片段和/或衍生物?;罨乖部赡苁敲庖唢@性的片段,包括但不限于,MBP的第83-99位殘基或第151-170位的殘基,或其片段和/或衍生物?;罨乖部赡苁莾蓚€或多個單個的活化抗原的組合?;罨乖杀皇褂靡淮位蚨啻?,以活化特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞。
T細(xì)胞可能存在于任何包括單核細(xì)胞的樣品中??蓮腗S患者的外周血或大腦脊髓液或從RA患者的滑膜液中分離樣品。來自具有其他自身免疫性疾病的患者的T細(xì)胞可類似地從涉及該疾病的外周血和/或組織分離??衫帽绢I(lǐng)域公知的離心技術(shù),包括但不限于Ficoll梯度,在樣品中富集單核細(xì)胞。也可利用對于T細(xì)胞基因產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行陽性選擇、陰性選擇、或其組合來在樣品中富集T細(xì)胞。
用于鑒定或陰性選擇活化的T細(xì)胞的基因產(chǎn)物可能是細(xì)胞表面標(biāo)記或細(xì)胞因子,或其組合。用于鑒定活化的T細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記包括但不限于,CD69、CD4、CDS、CD25、HLA-DR、CD28和CD134。CD69是在B和T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒性白細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的早期活化標(biāo)記。CD25是IL-2受體和活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞的標(biāo)記。CD4是TCR的共同受體并且是胸腺細(xì)胞、TH1-和TH2-型T細(xì)胞、單核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記。CD8也是TCR的共同受體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的標(biāo)記。CD134只在活化的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)。
用于陰性選擇活化T細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記,包括但不限于CD36、CD40和CD44。CD28作為獨立于T細(xì)胞受體途徑的刺激T細(xì)胞活化的途徑而起作用,并且在CD4+和CD8+細(xì)胞上表達(dá)。CD36是膜糖蛋白并且是血小板、單核白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記。CD40是B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記。CD44是巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞的標(biāo)記??衫脤τ谳o助T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞表面基因產(chǎn)物表達(dá)(例如,CD4對CD8)進(jìn)行的陽性選擇、陰性選擇或其組合來分離T細(xì)胞的亞型。
用于鑒定本發(fā)明的活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子包括但不限于,由TH1-型T細(xì)胞(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2-型T細(xì)胞(抗體應(yīng)答)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。用于鑒定活化的TH1-型T細(xì)胞的細(xì)胞因子包括但不限于IL-2、γ干擾素(γIFN)和組織壞死因子α(TNFα)。用于鑒定活化的TH2-型T細(xì)胞的細(xì)胞因子包括但不限于IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。也可利用對于輔助T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞因子基因產(chǎn)物表達(dá)(例如,γIFN對IL4)進(jìn)行的陽性選擇、陰性選擇,或其組合來分離T細(xì)胞的亞型。
可通過鑒定表達(dá)CD69、CD4、CD25、IL-2、IFNγ、TNFα或其組合的細(xì)胞來分離特異于目標(biāo)抗原的活化的TH1-型T細(xì)胞。也可通過鑒定表達(dá)CD69和CD4以及IFNγ或TNFα的細(xì)胞來分離特異于目標(biāo)抗原的活化的TH1-型的T細(xì)胞??赏ㄟ^鑒定表達(dá)CD69、CD4、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13,或其組合的細(xì)胞來分離特異于目標(biāo)抗原的活化的TH2-型T細(xì)胞。可通過鑒定表達(dá)CD69、CD4、CD25、IL-2、IFNγ、TNFα或其組合的細(xì)胞和表達(dá)CD69、CD4、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13或其組合的細(xì)胞來分離特異于目標(biāo)抗原的活化的TH1-型T細(xì)胞和TH2-型T細(xì)胞的組合。
可通過本領(lǐng)域公知的,利用抗體的免疫選擇技術(shù)來鑒定用于對本發(fā)明的活化T細(xì)胞進(jìn)行陽性或陰性選擇的基因產(chǎn)物,所述的技術(shù)包括但不限于,熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)、磁性細(xì)胞分類技術(shù)、淘選技術(shù)和色譜法??稍谝粋€或多個步驟中對活化的T細(xì)胞上的兩個或多個標(biāo)記進(jìn)行免疫選擇,其中每個步驟陽性或陰性選擇一種或多種標(biāo)記。當(dāng)兩個或多個標(biāo)記的免疫選擇是在利用FACS的一個步驟中進(jìn)行時,可利用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記兩個或多個不同的抗體。
可利用由氧化鐵和多糖涂層組成的超順磁微珠進(jìn)行磁性細(xì)胞分類法。優(yōu)選地,該微珠的直徑可以為大約50納米,并且體積為一般哺乳動物細(xì)胞的大約百萬分之一。微珠優(yōu)選是足夠小的,以保持允許與細(xì)胞表面抗原快速、有效的結(jié)合的膠態(tài)懸浮體。優(yōu)選地,該微珠不干擾流式細(xì)胞光度術(shù),是可生物降解的,并且可忽略對細(xì)胞功能的影響。與微珠偶聯(lián)的抗體可能直接或間接地借助于第二抗體與配體的例如熒光素的結(jié)合。
抗體的種類可能是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE,或其片段或衍生物,包括Fab、F(ab′)2、Fd和單鏈抗體、雙抗體(diabodies)、特異抗體、雙官能抗體及其衍生物。抗體可能是單克隆抗體、多克隆抗體、親合純化的抗體或其混合物,其顯示出與特異于活化的T細(xì)胞的基因產(chǎn)物表位或由此衍生的序列的足夠的結(jié)合特異性??贵w也可能是嵌合的抗體。
可通過與本領(lǐng)域已知的一種或多種化學(xué)藥品、肽或多肽部分的附著來衍生抗體,從而允許鑒定和/或選擇與該抗體結(jié)合的活化T細(xì)胞。該抗體可以與例如熒光染料的化學(xué)藥品部分結(jié)合。通過熒光標(biāo)記抗體而結(jié)合的活化T細(xì)胞可利用,包括但不限于熒光激活細(xì)胞分類(FACS)的技術(shù)來分離??贵w也可與磁性顆粒,例如順磁微珠(Miltenyi Biotec,德國)結(jié)合。通過磁性標(biāo)記抗體而結(jié)合的活化的T細(xì)胞可利用,包括但不限于磁性細(xì)胞分類的技術(shù)來分離。
對于細(xì)胞表面表達(dá)的基因產(chǎn)物,抗體可直接與基因產(chǎn)物結(jié)合并可用于細(xì)胞選擇。對于以低濃度表達(dá)的細(xì)胞表面基因產(chǎn)物,磁性熒光脂質(zhì)體(Scheffold等人,自然醫(yī)學(xué)Nature Med 6107-110,2000)可用于細(xì)胞選擇。以低水平表達(dá)時,常規(guī)的熒光標(biāo)記抗體不能足夠靈敏地檢測出細(xì)胞表面表達(dá)的基因產(chǎn)物的存在。包含熒光基團(tuán)的脂質(zhì)體可與具有目標(biāo)特異性的抗體結(jié)合,由此允許對細(xì)胞表面表達(dá)的基因產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
對于胞內(nèi)基因產(chǎn)物,例如細(xì)胞因子,可在透化細(xì)胞后使用該抗體。備選地,為了避免由于透化而殺死細(xì)胞,如果胞內(nèi)基因產(chǎn)物最終是從細(xì)胞分泌出來的,可在其分泌通過細(xì)胞膜時,利用細(xì)胞表面上的″捕捉″抗體加以檢測。該捕捉抗體可能是特異于兩個不同抗原的雙抗體(i)令人感興趣的分泌的基因產(chǎn)物和(ii)細(xì)胞表面蛋白。細(xì)胞表面蛋白通常可能是存在于T細(xì)胞,或特別是淋巴細(xì)胞上的任何表面標(biāo)記(例如,CD45)。捕捉抗體可能首先結(jié)合細(xì)胞表面蛋白,然后在令人感興趣的胞內(nèi)基因產(chǎn)物分泌通過膜時與其結(jié)合,由此保持基因產(chǎn)物留在細(xì)胞表面上。然后可使用特異于捕獲的基因產(chǎn)物的標(biāo)記抗體來結(jié)合捕獲的基因產(chǎn)物,從而進(jìn)行活化的T細(xì)胞的選擇(Manz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 921921-1925,1995,其在此引入作為參考)。
也發(fā)現(xiàn)某些形式的細(xì)胞因子在細(xì)胞表面上以低濃度表達(dá)。例如,γIFN在細(xì)胞表面上顯示低濃度,具有與胞內(nèi)γIFN表達(dá)相似的動力學(xué)(Assenmacher等人,Eur J.Immunol,1996,26263-267)。對于在細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞因子的形式,常規(guī)的熒光標(biāo)記抗體或包含脂質(zhì)體的熒光基團(tuán)可用于檢測令人感興趣的細(xì)胞因子。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可認(rèn)識到用于檢測和選擇特異于活化的T細(xì)胞的胞外和胞內(nèi)基因產(chǎn)物的其他技術(shù)。
通過本發(fā)明分離的T細(xì)胞至少90%可能是從全血富集的。也可能從全血富集至少95%的T細(xì)胞。也可能從全血富集至少98%的T細(xì)胞。也可能從全血富集至少99.5%的T細(xì)胞。
b.分離的單克隆抗原特異的T細(xì)胞在第二個方面,本發(fā)明指向通過本發(fā)明第一個方面的方法分離的特異于目標(biāo)抗原的T細(xì)胞。
c.分離多克隆的抗原特異的T細(xì)胞在第三個方面,本發(fā)明指向用于分離特異于一種或多種目標(biāo)抗原的T細(xì)胞的方法。將包括T細(xì)胞的樣品與一種或多種抗原一起培養(yǎng),其導(dǎo)致特異于一種或多種抗原的T細(xì)胞的活化。然后可根據(jù)本發(fā)明的第一個方面來分離特異于一種或多種抗原的T細(xì)胞。
T細(xì)胞可具有異質(zhì)的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式,其表達(dá)各自特異于目標(biāo)抗原的不同TCRs。T細(xì)胞也可具有異質(zhì)的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式,其表達(dá)特異于多于一種目標(biāo)抗原的不同TCRs。如下所述,包括異質(zhì)的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式的T細(xì)胞可用來配制能在接種了疫苗的患者中預(yù)防表位擴散的多克隆的T細(xì)胞疫苗。
d.分離的多克隆抗原特異的T細(xì)胞在第四個方面,本發(fā)明指向通過本發(fā)明第三個方面的方法分離的特異于一種或多種目標(biāo)抗原的T細(xì)胞。
3.定量抗原特異的T細(xì)胞的數(shù)目在第五個方面,本發(fā)明指向通過確定由本發(fā)明第一或第三個方面的方法分離的T細(xì)胞的數(shù)目來實現(xiàn)確定樣品中特異于一種或多種目標(biāo)抗原的T細(xì)胞的相對頻率的方法。
4.診斷自身免疫性疾病在本發(fā)明的第六個方面,可通過從患者獲得樣品,并且由本發(fā)明第一或第三個方面的方法分離自身反應(yīng)性T細(xì)胞來診斷患有自身免疫性疾病的患者??赏ㄟ^比較患者和對照中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的水平來診斷自身免疫性疾病??筛鶕?jù)本發(fā)明第五個方面的方法來確定自身反應(yīng)性T細(xì)胞的水平。
5.監(jiān)測自身免疫性疾病的發(fā)展在本發(fā)明的第七個方面,可根據(jù)本發(fā)明第五個方面,通過確定來自患有自身免疫性疾病的患者的樣品中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的頻率來監(jiān)測自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的癥狀嚴(yán)重度可能與自身反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)。此外,樣品中自身反應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)目的增加可用來作為應(yīng)用治療使癥狀的嚴(yán)重度最小化,和/或在癥狀出現(xiàn)前治療疾病的指標(biāo)。
6.生產(chǎn)用于治療自身免疫性疾病的疫苗在本發(fā)明的第八個方面,可生產(chǎn)組合物用于治療自身免疫性疾病,其中使已經(jīng)通過本發(fā)明的第一或第三個方面的方法分離的自身反應(yīng)性T細(xì)胞(并且任選地,如在此所描述的,在培養(yǎng)物中擴展)失活??衫迷S多本領(lǐng)域公知的技術(shù)來使自身反應(yīng)性T細(xì)胞失活,這些技術(shù)包括但不限于,化學(xué)藥品失活或放射。可利用許多本領(lǐng)域公知的技術(shù)在失活的前后來保存自身反應(yīng)性T細(xì)胞,這些技術(shù)包括但不限于深低溫保藏。如下所述,該組合物可在自身免疫患者中用作減少自身反應(yīng)性T細(xì)胞的疫苗。
該組合物可以是利用本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)的藥物組合物??捎杉夹g(shù)人員,使用公認(rèn)的診斷和治療原理來生產(chǎn)藥物組合物,其可在疾病或紊亂的治療中用作臨床前和臨床的治療劑。
這種原理是本領(lǐng)域已知的,并且在例如,Braunwald等人編輯的,Harrison′s Principles of Internal Medicine,第11版,McGraw-Hill,出版者,紐約,N.Y.(1987)中有闡明,其在此引入作為參考。該藥物組合物可施用于受到該組合物有益作用的任何動物。接受該藥物組合物的動物可以是人類或其他的哺乳動物。
a.疫苗在第九個方面,本發(fā)明指向由本發(fā)明第八個方面的方法生產(chǎn)的組合物。該組合物可以是在自身免疫患者中用于耗盡自身反應(yīng)性T細(xì)胞的疫苗。
7.治療自身免疫性疾病在第十個方面,可通過施用本發(fā)明第九個方面所述的組合物在具有自身反應(yīng)性T細(xì)胞的患者中治療自身免疫性疾病。該組合物可以是在患者中導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞耗盡的疫苗。
疫苗可包括包含同質(zhì)(″單克隆″)或異質(zhì)(″多克隆″)的Vβ-Dβ-Jβ基因使用模式的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。臨床研究表明,接受自體同源的單克隆T細(xì)胞疫苗接種的自身免疫患者可顯示針對髓磷脂活性的T細(xì)胞的免疫性的逐漸下降。有時,重新出現(xiàn)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞可能來源于不同的克隆群體,表明髓磷脂活性的T細(xì)胞可以進(jìn)行與發(fā)展的疾病進(jìn)程潛在相關(guān)的無性系轉(zhuǎn)變或表位擴散。在由自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中,無性系轉(zhuǎn)變或表位擴散可能是個問題。包括能夠減少自身反應(yīng)性T細(xì)胞的多重群體的,多克隆自身反應(yīng)性T細(xì)胞的疫苗可以避免無性系轉(zhuǎn)變或表位擴散的問題。
該組合物可以是以任何手段給藥從而實現(xiàn)其預(yù)定目的的藥物組合物。例如,給藥方式可以是非腸胃的、皮下的、靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、透過皮膚起作用的、透過粘膜的、腦內(nèi)的、鞘內(nèi)的,或心室內(nèi)的途徑。備選地,或同時發(fā)生地,給藥方式可以是口服途徑。藥物組合物可通過快速濃注,或通過隨時間的逐步灌流而進(jìn)行腸道外給藥。
給藥劑量依賴于受體的年齡、性別、健康和重量,同時進(jìn)行的治療的種類、以及治療的頻率、和所需要的作用的特性。藥物組合物的給藥的劑量范圍可能是足夠大的,以產(chǎn)生預(yù)期的效果,借此例如,如本發(fā)明第七個方面所測量的,實現(xiàn)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的減少,并且顯著地預(yù)防、抑制或治療自身免疫性疾病。劑量不能太大而產(chǎn)生不良副作用,例如不需要的交叉反應(yīng)、全身性的免疫抑制、過敏反應(yīng)等。
藥物組合物可進(jìn)一步包括合適的藥物學(xué)上可接受的,包含賦形劑和輔助劑的載體,其可促進(jìn)將活性組合物加工成為藥物學(xué)上可使用的制劑。藥物組合物的添加劑可包括佐劑,例如明礬、殼聚糖,或本領(lǐng)域已知的其他佐劑的包涵物。(參見例如,Warren等人,Ann.Rev.Immunol.4369-388(1986);Chedid,L.,F(xiàn)eder.Proc.452531-2560(1986),其在此引入作為參考)。藥物組合物也可進(jìn)一步包括脂質(zhì)體,利用本領(lǐng)域已知的方法和化合物來增加遞送或生物活性。
用于非腸胃方式給藥的合適劑型包括失活的T細(xì)胞的水溶液,例如,在水溶液中的水溶鹽。此外,可施用包括失活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的油懸浮物。合適的脂性溶劑或媒介物包括脂肪油類,例如,芝麻油或合成脂肪酸的酯類,例如油酸乙酯或三酸甘油酯。含水的注射懸浮物可包含增加懸浮物粘性的物質(zhì),包括例如,羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮物也可包含穩(wěn)定劑。
可利用常規(guī)的藥物學(xué)上可接受的,用于注射給藥的非腸胃媒介物來配制失活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。這些媒介物可以是無毒性和治療性的,并且許多劑型在Remington′s Pharmaceutical Sciences(上述)中有闡明。賦形劑的非限制性實例是水、鹽水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液和Hank′s平衡鹽溶液。藥物組合物也可包含少量的添加劑,例如保持等滲性、生理pH和穩(wěn)定性的物質(zhì)。
配制失活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞,達(dá)到其總的細(xì)胞濃度為包括大約5×102個細(xì)胞/ml至大約1×109個細(xì)胞/ml。用于預(yù)防、抑制或治療自身免疫性疾病的失活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的優(yōu)選劑量可以在大約2×106個細(xì)胞至大約9×107個細(xì)胞的范圍內(nèi)。
8.確定TCR的所有組成成分在第十一個方面,本發(fā)明指向通過擴增來自由本發(fā)明的第一或第三個方面分離的T細(xì)胞的編碼一種或多種T細(xì)胞受體的核酸,來確定自身免疫患者中編碼一種或多種T細(xì)胞受體或其部分的核酸的所有組成成分的方法,其中利用引物對進(jìn)行所述的擴增。引物對的第一引物可以是長度為大約15至30個核苷酸的寡核苷酸,其與包括TCR基因可變區(qū)的核酸雜交。引物對的第二引物可以是長度為大約15至30個核苷酸的寡核苷酸,其與包括TCR基因恒定區(qū)的核酸雜交??墒褂靡飳頂U增與TCR基因的Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域雜交的核酸。
可以從樣品,利用本領(lǐng)域已知的任何特別的PCR技術(shù)或設(shè)備,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴增編碼來自T細(xì)胞的一種或多種T細(xì)胞受體或其片段的核酸(“靶序列”)。例如,PCR擴增可以遵循下列方法,其中制備的反應(yīng)混合物包含下列成分5μl 10×PCR緩沖液II(100mM Tris-HCl,pH8.3,500mM KCl),3μl 25mM MgCl2,1μl10mM dNTP混合物,0.3μl Taq聚合酶(5U/μL)(AmpliTaq Gold,Perkin Elmer,Norwalk,Conn.),30pmol的第一引物,30pmol的第二引物,以及1μl的樣品DNA。聚合酶在至少95℃的溫度是穩(wěn)定的,具有50-60的持續(xù)合成能力,并具有每分鐘大于50個核苷酸的延伸率。
進(jìn)行PCR反應(yīng)的擴增模式為95℃1分鐘(變性),56℃20秒(退火),以及72℃40秒(延伸),總共為40個循環(huán)。在第一個循環(huán)開始前,反應(yīng)混合物可進(jìn)行大約5分鐘至15分鐘時間的起始變性。類似地,在最后的循環(huán)完成后,反應(yīng)混合物可以進(jìn)行大約5分鐘至10分鐘時間的最終延伸。某些PCR反應(yīng)可進(jìn)行少至15-20個循環(huán)或多至50個循環(huán)。根據(jù)特異的PCR反應(yīng),對于擴增模式的每個步驟可使用更長或更短的保溫時間和更高或更低的溫度。
包括靶序列的樣品可以是核酸,例如基因組DNA、cDNA、預(yù)先經(jīng)PCR擴增的DNA,或DNA的任何其他形式??芍苯踊蜷g接地從包括T細(xì)胞,例如外周血單核細(xì)胞(PBMC)的任何動物或人類組織來分離樣品。基因組DNA可直接從包括T細(xì)胞的組織分離。cDNA可通過逆轉(zhuǎn)錄從包括T細(xì)胞的組織直接分離的mRNA來間接地分離得到。
可由兩步的PCR反應(yīng)間接地擴增基因組DNA、cDNA或任何其他形式的DNA而分離樣品DNA來增強檢測靶序列的能力。例如,可以進(jìn)行第一次PCR擴增反應(yīng)以擴增較大的初級片段,并且包括能使第一和第二引物有選擇地與其相反鏈結(jié)合的片段。然后利用初級片段作為模板,用第一和第二引物進(jìn)行第二次PCR擴增反應(yīng),以擴增包括靶序列的片段。如果在第一次PCR反應(yīng)中使用第一或第二引物來擴增初級片段,則第二PCR反應(yīng)是″半巢式的″。如果在第一次PCR反應(yīng)中不使用第一或第二引物來擴增初級片段,則第二次PCR反應(yīng)是″巢式的″。
在例證性的兩步PCR反應(yīng)中,可利用與TCR基因的Vβ區(qū)退火的第一初級引物和與TCR基因的Cβ區(qū)退火的第二初級引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)來擴增編碼一種或多種來自T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的一種或多種核酸,其擴增從Vβ經(jīng)過Vβ-Dβ-Jβ接合點延伸到Cβ的初級片段,然后是可能為巢式或半巢式的第二次PCR反應(yīng)。根據(jù)所公開的內(nèi)容,有經(jīng)驗的技術(shù)人員能夠選擇合適的引物和反應(yīng)條件用于靶序列的PCR擴增。
擴增靶序列后,可通過許多方法檢測擴增產(chǎn)物。例如,可將擴增產(chǎn)物的等分加載到電泳凝膠上,對其應(yīng)用電場按大小分離DNA分子。在另一個方法中,可將擴增產(chǎn)物的等分加載到用SYBR綠、溴化乙啶,或能結(jié)合DNA并發(fā)出可檢測信號的另一分子染色的凝膠上。干凝膠可包含與靶序列雜交的標(biāo)記寡核苷酸,從而可通過將凝膠暴露于感光膠片而獲得放射自顯影照片。
包括下列實施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將應(yīng)認(rèn)識到本實施例中所公開的技術(shù),隨后由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù),在本發(fā)明的實施中起很好的作用,并且因此可認(rèn)為其構(gòu)成實施的優(yōu)選模式。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員將根據(jù)所公開的內(nèi)容,認(rèn)識到在所公開的具體實施方案中可產(chǎn)生許多變化,并且仍然能獲得同樣的或相似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例1分離用于T細(xì)胞疫苗接種的髓磷脂活性的T細(xì)胞
1.制備PBMC和初級刺激在2小時內(nèi),對來自MS患者和對照患者的新鮮血液樣本進(jìn)行收集。備選地,可從MS患者的腦脊髓液(CSFMCs)獲得單核細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll梯度分離法從全血分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。具體地,用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)稀釋肝素化的血液(1∶1血液/HBSS),然后緩慢地覆蓋在離心管中的Ficoll-泛影葡胺溶液,并且在1800rpm,18℃-25℃,不剎車離心20分鐘。然后通過加入過量的HBSS并且在1700rpm,18℃-25℃離心10分鐘洗滌PBMCs。在RPMI 1640培養(yǎng)基中通過離心將純化的PBMCs洗滌3次,隨后將其重懸在AIM V培養(yǎng)基(Gibco,Grand Island,N.Y.)中。計數(shù)細(xì)胞數(shù)目并且將細(xì)胞以200,000個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔的U型底培養(yǎng)平板上。所有的平板標(biāo)記有患者的號碼和患者的首字母。于37℃,在存在表1中列出的合成肽時培養(yǎng)細(xì)胞,其中表1中列出的合成肽相應(yīng)于3個髓磷脂蛋白質(zhì),髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)和髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)的已知的免疫顯性區(qū)域,其濃度為20μg/ml。將平板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中,并且每日目測檢查。不換培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞7-10天,以有選擇地使特異于抗原的T細(xì)胞生長。
表1-活化肽
2.鑒定和選擇抗原特異的T細(xì)胞然后選擇上述細(xì)胞的指示活化的T細(xì)胞的基因產(chǎn)物的表達(dá)。參見上述第2(a)節(jié)。為了檢測最終從細(xì)胞分泌的胞內(nèi)細(xì)胞因子γIFN或TNFα,使用細(xì)胞因子捕捉試劑(Miltenyi Biotec)(如上所述)。簡而言之,為了結(jié)合細(xì)胞表面上的CD45分子或其他活化的T細(xì)胞表面標(biāo)記,例如CD69,首先將細(xì)胞因子捕捉試劑(一般結(jié)合活化的T細(xì)胞標(biāo)記和分泌的細(xì)胞因子的特異抗體)與細(xì)胞一起在4-8℃培養(yǎng)。然后將細(xì)胞和結(jié)合的細(xì)胞因子捕捉試劑在37℃培養(yǎng)45分鐘,以容許細(xì)胞內(nèi)的γIFN或TNFα也與細(xì)胞因子捕捉試劑結(jié)合,因為細(xì)胞因子是在培養(yǎng)期間從細(xì)胞內(nèi)部分泌的。然后利用特異于與熒光染料PE軛合的目標(biāo)細(xì)胞因子的抗體來檢測通過細(xì)胞因子捕捉試劑而現(xiàn)在與細(xì)胞表面結(jié)合的γIFN或TNFα。
利用結(jié)合不同熒光染料的抗體來檢測細(xì)胞表面分子CD4和CD69。首先通過門控選擇CD4+細(xì)胞群體,然后在該群體內(nèi),通過FACS分離″雙-陽性″(CD69和IFNγ或CD69和TNFα)染色的細(xì)胞并且進(jìn)行無菌收集。然后在存在放射的自體同源的PBMCs時,通過用rIL-2、PHA、抗CD3或其他普遍的T細(xì)胞促分裂原刺激7-10天,直接使分離的髓磷脂活性的T細(xì)胞擴展。在培養(yǎng)物中增殖髓磷脂-活性的T細(xì)胞系,直到細(xì)胞總數(shù)達(dá)到大約兩千萬。
實施例2診斷MS從患者收集2至100ml的血液,并且將一種或多種合成肽直接加入全血中以引發(fā)或刺激T淋巴細(xì)胞。該肽相應(yīng)于3個髓磷脂蛋白質(zhì),髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)和髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)的已知免疫顯性區(qū)域。將血液與肽一起培養(yǎng)1至7天以活化髓磷脂特異的T細(xì)胞。在該抗原初級期間的末尾,在短暫的再刺激分析中用抗原再激發(fā)細(xì)胞。
通過用去污劑溶液透化細(xì)胞膜,洗滌細(xì)胞,然后與一種或多種染色抗體一起培養(yǎng)來檢測髓磷脂肽活化的T細(xì)胞以檢測細(xì)胞表面上的CD4或CD69,或胞內(nèi)檢測IFNγ或TNFα。染色抗體是與不同的熒光染料結(jié)合的,因此當(dāng)通過FASC分析,以488納米激光激發(fā)時,它們以不同的波長發(fā)熒光。首先利用CD4+細(xì)胞進(jìn)行門控來選擇CD4+T細(xì)胞群,然后在該群體內(nèi),鑒定具有兩個抗體(CD69和γIFN或CD69和TNFα)的免疫活性的細(xì)胞。與相似研究中的健康對照(圖1,MS患者,圖2,健康對照)相比,在多發(fā)性硬化癥(MS)患者中″雙-陽性″髓磷脂-活性的T細(xì)胞的這個群體已經(jīng)顯示顯著的增加。
利用這個方法,可在處理前、處理期間和處理后確定患者血液中循環(huán)的髓磷脂-活性的T細(xì)胞數(shù)目,以確定MS治療對自身反應(yīng)性T細(xì)胞群的影響??梢詫㈦p-陽性染色的細(xì)胞的百分比或雙陽性染色的細(xì)胞的絕對數(shù)目確定為終點。
實施例3利用抗體-軛合的脂質(zhì)體診斷MS從患者獲得全血,并用如實施例2中所述的一種或多種合成肽加以刺激。將血液與肽一起培養(yǎng)3至16小時以活化髓磷脂特異的T細(xì)胞。在該抗原-引發(fā)期間的末尾,在用與針對IFNγ、TNFα、或其組合的抗體軛合的磁性熒光脂質(zhì)體染色前,在短暫的再刺激分析中用抗原再激發(fā)細(xì)胞。也用針對CD4和/或CD69的抗體染色細(xì)胞。如實施例2中所描述的,檢測染色的髓磷脂-活性的T細(xì)胞。
實施例4確定TCR克隆的所有組成成分可如實施例2和實施例3中所描述的經(jīng)細(xì)胞分類法,通過分離出雙-陽性染色的細(xì)胞群體來分析細(xì)胞群體中體現(xiàn)的T細(xì)胞受體(TCR)克隆的所有組成成分。從分離的細(xì)胞提取DNA,并且利用特異于25個已知TCR的可變的β鏈(Vβ)基因家族的寡核苷酸引物來進(jìn)行定量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析。該方法產(chǎn)生關(guān)于TCR Vβ基因使用的分布信息,并且表明致病性T細(xì)胞群體的克隆性。也可使用該方法確定MS患者中是否存在髓磷脂-活性的T細(xì)胞群體的無性系或表位轉(zhuǎn)變。
實施例5通過T細(xì)胞疫苗接種耗盡髓磷脂活性的T細(xì)胞使MS-復(fù)發(fā)減輕(RR)的患者和MS-次級漸進(jìn)(SP)的患者接受3次放射自體同源的髓磷脂活性的T細(xì)胞克隆的皮下注射,該克隆是通過直接擴展而分離的,其后在4、12和20周再進(jìn)行3次附加的注射。監(jiān)測患者在24個月期間內(nèi),在髓磷脂活性的T細(xì)胞的前體頻率、復(fù)發(fā)比率、擴展無力狀態(tài)的積分(EDSS)和MRI病變活性方面的變化。將該結(jié)果與以自身配對方式預(yù)接種疫苗的值相比較。此外,β-干擾素-1a臨床試驗中RR-MS(Jacobs等人,1996)和最新的β-IFN-1b研究中SP-MS(European Study Group Lancet,3521491-1497(1998))的安慰劑手臂的臨床資料被包括在內(nèi),以提供MS比較的自然病史數(shù)據(jù)。在接種疫苗后的第20周沒有檢測到T細(xì)胞頻率,或T細(xì)胞頻率實質(zhì)性地下降了。結(jié)果證實在患有MS的患者中通過T細(xì)胞接種疫苗而耗盡了髓磷脂活性的T細(xì)胞。
實施例6利用自體同源的髓磷脂活性的T細(xì)胞給MS患者接種疫苗該接種疫苗的方法與用于上述臨床研究的方法相似(Zhang等人,1993,Medaer等人,1995)。簡而言之,在存在放射的PBMCs作為副屬細(xì)胞來源時,用植物凝集素(PHA)(4μg/ml)活化根據(jù)實施例1制備的髓磷脂活性的T細(xì)胞克隆。然后在補充有10%加熱滅活的人AB血清和每mL 100單位的rIL-2的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞10天。隨后用無菌的鹽水洗滌活化的髓磷脂活性的T細(xì)胞3次以除去殘余的PHA、rIL-2和細(xì)胞碎片,最后重懸在2毫升的鹽水中。照射后(10,000rads,137Ce源),在2個手臂上皮下注射細(xì)胞(1ml/手臂)。用于疫苗接種的T細(xì)胞的數(shù)目的范圍是每次注射40×106到80×106個細(xì)胞,并且根據(jù)相對的皮膚表面面積推斷實驗動物中有效的T細(xì)胞劑量而進(jìn)行選擇(Ben-Nun等人,1981)。每個患者接受2次皮下注射,然后在4、12和20周重復(fù)注射。
然后觀察患者確定為無力發(fā)展的發(fā)病時間、EDSS、復(fù)發(fā)的比率和MRI病變活性。將結(jié)果與患者自己的預(yù)治療過程以及在RR-MS和SP-MS患者中兩個最近臨床試驗的安慰劑手臂進(jìn)行比較,其起評估MS自然病史的作用(Jacobs等人,1996),European Study Group,1998)。通過在EDSS上至少增加1.0(Poser等人,1983),持續(xù)至少2個月而確定發(fā)展的時間。研究上的惡化被定義為出現(xiàn)新的神經(jīng)病學(xué)癥狀或預(yù)先存在的神經(jīng)病學(xué)癥狀的惡化持續(xù)至少48小時,伴隨神經(jīng)病學(xué)檢驗上的客觀變化(在EDSS上惡化至少0.5個點)。指導(dǎo)患者報告在確定時間的定期巡檢之間發(fā)生的事件,并且由神經(jīng)病學(xué)家檢驗患者是否有顯示惡化的癥狀。安全評估包括不利的事件、生命體征和定期巡檢的體格檢查。利用Wilcoxon′s秩次和檢驗法分析T細(xì)胞疫苗接種前后的研究患者中臨床可變量的差異。
實施例7
疫苗接種后MS臨床病程的變化患者接受根據(jù)實施例1所制備的T細(xì)胞疫苗接種而沒有副作用。疫苗接種后,在24個月的期間內(nèi)在RR-MS患者中,平均的EDSS下降了。比較起來,在相同的觀察期間,RR-MS(n=56)自然病史中平均EDSS增加了0.61,正如在利用β-IFN-1a試驗進(jìn)行的試驗中所報道的(Jacobs等人,1996)。此外,具有未改變的或改善的EDSS的患者的比例比自然的MS病史患者要高。與MS自然病史中18%的患者相比,RR-MS治療組中的患者即使有,也很少有在24個月內(nèi)發(fā)展超過2.0的EDSS的。
在SP-MS群中,在24個月期間內(nèi)的平均EDSS進(jìn)度,與SP-MS自然病史中所記錄的相比減慢了(European Study Group,柳葉刀Lancet 1998;3521491-1497)。此外,利用Kaplan-Meier方法評估證實發(fā)展的時間顯示,與MS患者的自然病史相比有相當(dāng)大的延遲(對于RR-MS在12個月為20%的發(fā)展,而對于SP-MS為9個月)(Jacobs等人,Ann.Neurol,1996;39285-294,European Study Group,1998)。
序列表<110>Baylor College of MedicineOpexa Pharmaeeuticals Inc.
Zhang,Jingwu Z<120>T細(xì)胞的分離和鑒定<130>213838-00068<150>US60/402,521<151>2002-08-08<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(17)<223>人髓磷脂堿性蛋白的第110-126位氨基酸<400>1Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr1 15 10 15Pro<210>2<211>20<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(20)<223>人髓磷脂堿性蛋白的第167-186位氨基酸<400>2Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro1 5 10 15Met Ala Arg Arg20<210>3<211>20<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(20)<223>人髓磷脂蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)的第31-50位氨基酸<400>3Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu1 5 10 15Ile Glu Thr Tyr20<210>4<211>20<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(20)
<223>人髓磷脂蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)的第181-200位氨基酸<400>4Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser1 5 10 15Ile Gly Ser Leu20<210>5<211>17<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(17)<223>人髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白的第1-17位氨基酸<400>5Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val1 5 10 15Gly<210>6<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<221>肽<222>(1)..(21)<223>人髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白的第18-38位氨基酸
<400>6Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly1 5 10 15Met Glu Val Gly Trp20
權(quán)利要求
1.用于分離特異于目標(biāo)抗原的一種或多種T細(xì)胞的方法,包括(a)將包括T細(xì)胞的樣品與所述的抗原或其衍生物一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中所述的第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述的抗原是自身抗原。
3.權(quán)利要求2的方法,其中所述的自身抗原選自髓磷脂堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)、髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、膠原II型肽、熱休克蛋白、MAGE、PSA、CA125、GAD蛋白質(zhì)和與腫瘤相關(guān)的抗原。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述的抗原是自身抗原的免疫顯性表位。
5.權(quán)利要求4的方法,其中所述的免疫顯性表位選自髓磷脂堿性蛋白的第83-99位殘基和髓磷脂堿性蛋白的第151-170位殘基。
6.權(quán)利要求1的方法,其中利用分別針對所述的第一和第二標(biāo)記的抗體,或任選地與結(jié)合所述第二標(biāo)記的抗體組合而同時結(jié)合第一和第二標(biāo)記的雙特異抗體來選擇表達(dá)所述的第一和第二標(biāo)記的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法,其中所述的一種或多種抗體是熒光標(biāo)記的。
8.權(quán)利要求7的方法,其中通過熒光激活的細(xì)胞分類術(shù)來選擇所述的T細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6的方法,其中所述的第一抗體是與磁性微珠結(jié)合的。
10.權(quán)利要求9的方法,其中通過磁性激活細(xì)胞分類術(shù)來選擇所述的T細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)1至7天。
12.權(quán)利要求1的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于1天。
13.權(quán)利要求12的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于16小時。
14.權(quán)利要求13的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于12小時。
15.權(quán)利要求14的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于8小時。
16.權(quán)利要求15的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于4小時。
17.權(quán)利要求16的方法,其中將所述的抗原與所述的樣品一起培養(yǎng)少于2小時。
18.通過權(quán)利要求1的方法分離的T細(xì)胞。
19.權(quán)利要求1的方法,其中所述分離的T細(xì)胞是TH1或TH2 T細(xì)胞或其組合。
20.用于定量樣品中T細(xì)胞數(shù)目的方法,其中所述的T細(xì)胞特異于一種或多種目標(biāo)抗原,該方法包括(a)將包括T細(xì)胞的樣品與所述的抗原或其衍生物一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;以及(c)確定通過步驟(b)選擇出來的T細(xì)胞的數(shù)目。
21.用于診斷患者中自身免疫性疾病的方法,包括(a)將來源于所述患者的包括T細(xì)胞的樣品與跟所述疾病有關(guān)的一種或多種自身抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13。
22.用于監(jiān)測患者中自身免疫性疾病的方法,包括(a)將來源于所述患者的包括T細(xì)胞的樣品與一種或多種自身抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;以及(c)確定通過步驟(a)選擇出來的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)目。
23.用于治療患者中自身免疫性疾病的方法,包括(a)將來源于所述患者的包括T細(xì)胞的樣品與一種或多種自身抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;(c)使所述的選擇出來的自身反應(yīng)性T細(xì)胞失活;以及(d)將通過步驟(b)而失活的所述自身反應(yīng)性T細(xì)胞施用于所述的患者。
24.生產(chǎn)用于治療患者中自身免疫性疾病的組合物的方法,包括(a)將來源于所述患者的包括T細(xì)胞的樣品與一種或多種自身抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;以及(c)使所述的自身反應(yīng)性T細(xì)胞失活。
25.權(quán)利要求23或24的方法,進(jìn)一步包括擴展在步驟(b)中選擇出來的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)目。
26.通過權(quán)利要求24或25的方法生產(chǎn)的用于治療患有自身免疫性疾病的患者的組合物。
27.用于分離編碼T細(xì)胞受體或其部分的核酸的方法,其中所述的T細(xì)胞受體特異于目標(biāo)抗原,該方法包括(a)將包括T細(xì)胞的樣品與所述的抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;以及(c)利用至少一個特異于T細(xì)胞受體基因可變區(qū)的第一引物和特異于T細(xì)胞受體基因恒定區(qū)的第二引物來從通過步驟(b)分離的T細(xì)胞擴增編碼T細(xì)胞受體的所述核酸。
28.用于分離編碼一種或多種T細(xì)胞受體或其部分的一種或多種核酸的方法,其中所述的一種或多種T細(xì)胞受體特異于一種或多種目標(biāo)抗原,該方法包括(a)將包括T細(xì)胞的樣品與所述的一種或多種抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;以及(c)利用至少一個特異于T細(xì)胞受體基因可變區(qū)的第一引物和特異于T細(xì)胞受體基因恒定區(qū)的第二引物來從通過步驟(b)分離的T細(xì)胞擴增編碼一種或多種T細(xì)胞受體的一種或多種核酸。
29.用于確定患者中編碼一種或多種T細(xì)胞受體或其部分的核酸的所有組成成分的方法,其中所述的一種或多種T細(xì)胞受體特異于一種或多種目標(biāo)抗原,該方法包括(a)將來源于所述患者的包括T細(xì)胞的樣品與一種或多種所述的抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25,CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;(c)利用至少一個特異于T細(xì)胞受體基因可變區(qū)的第一引物和特異于T細(xì)胞受體基因恒定區(qū)的第二引物來從通過步驟(b)分離的T細(xì)胞擴增所述的編碼一種或多種T細(xì)胞受體的一種或多種核酸;以及(d)確定通過步驟(c)擴增的所述的一種或多種核酸的核苷酸序列。
30.用于確定自身免疫的患者中編碼一種或多種T細(xì)胞受體或其部分的核酸的所有組成成分的方法,其中所述的一種或多種T細(xì)胞受體特異于一種或多種目標(biāo)自身抗原,該方法包括(a)將來源于所述的自身免疫的患者的包括T細(xì)胞的樣品與所述的一種或多種自身抗原一起培養(yǎng);(b)選擇表達(dá)一種或多種第一標(biāo)記和一種或多種第二標(biāo)記的一種或多種T細(xì)胞,其中第一標(biāo)記選自CD69、CD4、CD25、CD36和HLADR,而第二標(biāo)記選自IL-2 IFNγ和TNFαIL5 IL-10和IL-13;(c)利用至少一個特異于T細(xì)胞受體基因可變區(qū)的第一引物和特異于T細(xì)胞受體基因恒定區(qū)的第二引物來從通過步驟(b)分離的T細(xì)胞擴增所述的編碼一種或多種T細(xì)胞受體的一種或多種核酸;以及(d)確定通過步驟(c)擴增的所述的一種或多種核酸的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的自體同源的T細(xì)胞疫苗及其生產(chǎn)的改進(jìn)方法。本發(fā)明也指向利用自體同源的T細(xì)胞疫苗治療自身免疫性疾病,例如多發(fā)性硬化癥或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。本發(fā)明進(jìn)一步指向與T細(xì)胞相關(guān)的疾病的診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1675542SQ03819234
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月8日
發(fā)明者臧敬五 申請人:貝勒醫(yī)學(xué)院, 奧佩艾克薩藥品公司