專利名稱：用于細胞培養(yǎng)的無動物蛋白質培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的組合物的無動物蛋白質細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及無動物蛋白質培養(yǎng)方法，其中可在不含動物蛋白質的條件下培養(yǎng)、增殖和傳代細胞。這些方法在培養(yǎng)細胞，如重組細胞或用病毒感染的細胞中是有用的，且可用于生產(chǎn)經(jīng)過細胞培養(yǎng)所得的生物制品。
背景技術：
對于細胞的培養(yǎng)，特別是真核細胞，更特別是哺乳動物細胞，常需要使用特殊的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基提供營養(yǎng)物質和為細胞有效生長和生產(chǎn)目的蛋白質或病毒所必需的生長營養(yǎng)物質。細胞培養(yǎng)基配方已經(jīng)補充有大量的添加物，包括不確定的組分，如胎牛血清(FCS)、幾種動物來源的蛋白質和/或牛來源的蛋白質水解產(chǎn)物。
一般而言，血清或血清來源的物質，如清蛋白、轉鐵蛋白或胰島素，可能含有會污染培養(yǎng)物和由培養(yǎng)物獲得的生物制品的多余的介質。此外，必須檢測人血清來源的添加物的所有已知的病毒，包括能通過血清傳遞的肝炎和HIV。而且，牛血清和牛血清來源的產(chǎn)物，例如胰蛋白酶，有承受BSE污染的危險。另外，所有血清來源的產(chǎn)物可能被未知的介質污染。細胞培養(yǎng)中，在來源于人或其它動物源的血清或蛋白質添加物的情況下，特別是如果細胞用于生產(chǎn)施用于人的藥劑或疫苗存在許多問題(例如，不同批次的質量和成分變化，以及存在受支原體、病毒或BSE因子污染的危險)。
因此，為提供有效的宿主系統(tǒng)和不需要血清或其它動物蛋白質化合物的培養(yǎng)條件，已經(jīng)做了許多嘗試。簡單的無血清培養(yǎng)基一般包括基礎培養(yǎng)基、維生素、氨基酸、有機和無機鹽，以及使培養(yǎng)基變?yōu)闋I養(yǎng)復雜化的可能的附加成分。然而，這種培養(yǎng)基經(jīng)常是營養(yǎng)不足的，且必須補充動物來源的蛋白質補充物或用于細胞培養(yǎng)的重組的蛋白質如胰島素、胰島素樣生長因子或其它生長因子。
為避免在無血清細胞培養(yǎng)基中使用動物蛋白質補充物，已經(jīng)做了幾種嘗試以提供完全沒有蛋白質的細胞培養(yǎng)基。
Cinatl等人，Cell Biology International 117885-895(1993)公開了一種特別用于在聚乙烯醇縮甲醛(PVF)培養(yǎng)表面上使VERO細胞連續(xù)增殖的培養(yǎng)基(PFK-1)的開發(fā)。
WO 96/15231公開了由合成的極限必需培養(yǎng)基和酵母提取物組成的無血清培養(yǎng)基用于增殖脊椎動物細胞和病毒的生產(chǎn)方法。
在WO 98/15614中公開了一種由包含水稻肽和酵母提取物或酶解產(chǎn)物的基礎細胞培養(yǎng)基，和/或植物脂質組成的培養(yǎng)基配方用于動物細胞的生長。
在WO 01/23527中公開了一種包含純化的大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組細胞。
WO 00/03000公開了一種包含大豆水解產(chǎn)物和酵母提取物的培養(yǎng)基，但也需要存在重組形式的動物蛋白質，如生長因子。
為有效生產(chǎn)生物制品，如病毒或重組蛋白質，達到最佳的細胞密度以獲得最大的產(chǎn)物產(chǎn)量是重要的。
因此，目前的需求在于增加細胞的生長、代謝活性和密度，以及提供完全沒有動物蛋白質的理想的細胞培養(yǎng)基用于生產(chǎn)生物制品，如用作人的藥物或疫苗。此外，如果培養(yǎng)基中不存在動物蛋白質，則下游加工，例如來自培養(yǎng)基中的所需產(chǎn)物的純化可以是更加經(jīng)濟和省時的。另外，實施本發(fā)明可避免不必要的免疫原性動物蛋白質可能誘導的有害免疫學反應。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供無動物蛋白質的培養(yǎng)基。為實現(xiàn)該目的和其它目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基。大豆水解產(chǎn)物可以至少0.05％(w/v)的濃度存在，酵母水解產(chǎn)物以至少0.05％(w/v)的濃度存在。可選擇地，大豆水解產(chǎn)物可以小于1.0％(w/v)的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物可以小于0.3％(w/v)的濃度存在?？蛇x擇地，大豆水解產(chǎn)物能以介于約0.2％(w/v)至約0.6％(w/v)之間的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以介于約0.05％(w/v)至約0.2％(w/v)之間的濃度存在?？蛇x擇地，大豆水解產(chǎn)物能以介于約0.25％(w/v)至約0.35％(w/v)之間的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以介于約0.05％(w/v)至約0.15％(w/v)之間的濃度存在。可選擇地，大豆水解產(chǎn)物能以約0.3％(w/v)的濃度存在，而酵母水解產(chǎn)物能以約0.1％(w/v)的濃度存在?？蛇x擇地，培養(yǎng)基包含相對于1重量份的酵母水解產(chǎn)物3重量份的大豆水解產(chǎn)物。酵母水解產(chǎn)物可以是超濾純化的酵母水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述酵母水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。同樣地，大豆水解產(chǎn)物可以是超濾純化的大豆水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。
本發(fā)明也提供培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物的方法，該方法包括提供包含約0.05％(w/v)至約1％(w/v)濃度的大豆水解產(chǎn)物和約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)濃度的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；以及在培養(yǎng)基中增殖細胞以形成細胞培養(yǎng)物。如上所述，本發(fā)明中也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。細胞可以是動物細胞，如昆蟲細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、干細胞，以及優(yōu)選用于體外生產(chǎn)病毒的細胞。細胞也可以是重組細胞。代表性的細胞包括選自下述的細胞BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS-細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK-細胞、TCMK-1細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、293細胞和RK-細胞。
本發(fā)明也提供一種無動物蛋白質的培養(yǎng)細胞的匯合的方法，該方法包括提供包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質的培養(yǎng)基；使細胞在培養(yǎng)基中生長，來傳代和移種生長在培養(yǎng)基中的細胞同時與非動物來源的蛋白酶接觸以獲得培養(yǎng)細胞的匯合。細胞可以是動物細胞、重組細胞和/或病毒感染的細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在這里也是適用的。
而且，本發(fā)明提供在無動物蛋白質培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)基包含約0.05％(w/v)至約1％(w/v)濃度的大豆水解產(chǎn)物和約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)濃度的酵母水解產(chǎn)物。如上所述的，本發(fā)明也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。細胞可以是動物細胞、重組細胞和/或病毒感染的細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在這里也是適用的。
另外，本發(fā)明提供生產(chǎn)病毒的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖病毒。細胞可以是動物細胞和/或重組細胞，特別是哺乳動物細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。在培養(yǎng)的細胞上待生產(chǎn)的病毒可選自已知的感染培養(yǎng)細胞的類型。例如，當利用哺乳動物細胞培養(yǎng)物時，病毒可選自以下屬正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒。使用的病毒可以是野生型病毒、減毒病毒、重排列病毒或重組病毒。另外，代替用于以病毒感染細胞的實際病毒顆粒，根據(jù)病毒學領域中技術人員已知的感染性克隆的轉染方法，可以利用感染性的核酸克隆。
本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)痘病毒(包括牛痘病毒)的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用痘病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖痘病毒。細胞可以是哺乳動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。
此外，本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)冠狀病毒(包括嚴重急性呼吸綜合癥體相關的的冠狀病毒)的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用冠狀病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖冠狀病毒。細胞可以是哺乳動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。
此外，本發(fā)明提供生產(chǎn)正粘病毒的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用正粘病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖正粘病毒。正粘病毒可以是流感A、B或C病毒。細胞可以是哺乳動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。
本發(fā)明另外提供生產(chǎn)羅斯河病毒(Ross River Virus)的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用羅斯河病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖羅斯河病毒。細胞可以是哺乳動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)黃病毒的方法，該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用黃病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖黃病毒。黃病毒可以選自黃熱病毒、及其衍生的嵌合病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒(West nile Virus)和丙型肝炎病毒。細胞可以是動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。
本發(fā)明進一步提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，其中該方法包括提供一種已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用病毒感染細胞；培養(yǎng)感染的細胞以繁殖病毒；收獲產(chǎn)生的病毒或病毒抗原；由收獲的病毒或病毒抗原制備免疫原性組合物。細胞可以是動物細胞和/或重組細胞。此前提到的培養(yǎng)基特性和細胞類型在此也是適用的。收獲的病毒或病毒抗原可以是經(jīng)過純化的。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括提供一種哺乳動物細胞的培養(yǎng)物，其中該細胞選自已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的猴腎細胞、牛腎細胞、狗腎細胞、豬腎細胞、小鼠腎細胞、大鼠腎細胞、羊腎細胞、倉鼠腎細胞和人細胞；用選自正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒的病毒感染細胞；培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖病毒；收獲如此產(chǎn)生的病毒或病毒抗原；以及由收獲的病毒或病毒抗原制備免疫原性組合物。
另外，本發(fā)明提供用正粘病毒、痘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒或腺病毒感染的細胞培養(yǎng)物，其中將細胞培養(yǎng)在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。大豆水解產(chǎn)物可以是約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的濃度，酵母水解產(chǎn)物可以是約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的濃度。如上述舉例的，根據(jù)本發(fā)明也可以使用其它濃度的水解產(chǎn)物。
本發(fā)明進一步提供來自培養(yǎng)基的沒有動物蛋白質，包括重組蛋白質的正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒或腺病毒的制劑，其中在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)用流感病毒感染的細胞來獲得所述制劑，其中所述培養(yǎng)基中包括大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。大豆水解產(chǎn)物的濃度可以為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度可以為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明也可使用其他濃度的水解產(chǎn)物。在進一步處理之后，這些病毒制劑適合用于生產(chǎn)病毒抗原和疫苗。
鑒于以下述說明和數(shù)據(jù)，本發(fā)明的這些和其它方面對于技術人員而言是顯而易見的。
發(fā)明詳述以各種語法形式表示的術語“無動物蛋白質的培養(yǎng)基”是指一種沒有添加來自高等的多細胞非植物真核生物(即脊椎動物)的蛋白質和蛋白質組分的培養(yǎng)基，該細胞具有如天然存在的蛋白質的二級、三級和四級結構特征。要避免的典型蛋白質是存在于血清和血清來源的物質如白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和其它生長因子的蛋白質。根據(jù)本發(fā)明也要避免可含有免疫原性細菌成分的重組生產(chǎn)的動物蛋白質，它們不存在于本發(fā)明的無動物蛋白質的培養(yǎng)基中。動物蛋白質和蛋白質組分不同于可獲自植物，如大豆(通常長度為約10-30個氨基酸)以及獲自較低等的真核生物，如酵母的非動物蛋白質，小的多肽和寡肽。當然，一旦用增殖的細胞接觸或接種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基就會含有由那些細胞流出或分泌的動物蛋白質，包括在培養(yǎng)遺傳修飾的細胞時由這些細胞表達的任何重組蛋白質。因此，術語無動物蛋白質的培養(yǎng)基，及由其生產(chǎn)的生物材料和制劑，不解釋成要求不存在由培養(yǎng)基中增殖的細胞流出或分泌的蛋白質，而是指不用動物來源或重組產(chǎn)生的蛋白質或蛋白質成分直接添加到培養(yǎng)基中。
以各種語法形式表示的術語“基礎培養(yǎng)基”，是合成的培養(yǎng)基，如DMEM、HAM′s F12、培養(yǎng)基199或RPMI，或其組合，及文獻中已知的或商業(yè)上可獲得的其他培養(yǎng)基。依照本發(fā)明，每種不含動物蛋白質的合成培養(yǎng)基均可與大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物組合物結合使用。基礎培養(yǎng)基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機和無機鹽、碳源，每一成分以可維持體外細胞培養(yǎng)的量存在。例如，可以使用DMEM/HAM′s F12(1∶1)培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以含有輔助物質，如緩沖物質，像碳酸氫鈉、氧化穩(wěn)定劑、抵消機械應力的穩(wěn)定劑，或蛋白酶抑制劑。如果需要，可以加入非離子表面活性劑，如聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONICF-71或PLURONIC F-108)到培養(yǎng)基中作為消泡劑。若沒有添加表面活性劑，上升并爆裂的氣泡會導致破壞位于這些氣泡表面的那些細胞(“飛濺”)，這些試劑通常用于保護細胞避免曝氣的負效應。非離子表面活性劑的量優(yōu)選介于約0.05和約10g/L之間，一般介于約0.1和約5g/L之間。另外，培養(yǎng)基也可以含有環(huán)糊精或其衍生物，一般介于約0.001g/L和約1g/L之間。
根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)基包含可加入基礎培養(yǎng)基中的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。術語“水解產(chǎn)物”包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解產(chǎn)物。水解產(chǎn)物可以分別獲自大量的大豆蛋白胨或酵母提取物制劑，其可以進一步通過自分解、熱分解和/或質壁分離酶促消化(例如，通過木瓜蛋白酶)和/或形成。水解產(chǎn)物也可以以商業(yè)上獲得的，如Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，其可獲自如QuestInternational，Norwich，紐約，OrganoTechnie，S.A.法國；或Deutsche Hefewerke股份有限公司，德國。在WO 98/15614中也公開了酵母提取物的來源。在WO 00/03000中也公開了酵母提取物和大豆水解產(chǎn)物的來源。
用于本發(fā)明培養(yǎng)基中的水解產(chǎn)物優(yōu)選是由天然組分純化的，因為在該純化期間優(yōu)選地除去會干擾有效培養(yǎng)的雜質，從而改善水解產(chǎn)物的一致性。純化可以通過超濾或交聯(lián)葡聚糖層析，例如使用SephadexG25或Sephadex G10或等同物、離子交換層析、親和層析、大小排阻層析或“反相”層析。這些方法是本領域已知的。使用這些方法，可以選擇含有限定分子量為優(yōu)選≤1000道爾頓，更優(yōu)選≤500道爾頓，還更優(yōu)選≤350道爾頓的大豆或酵母水解產(chǎn)物組分。優(yōu)選至少90％的水解產(chǎn)物的分子量≤1000道爾頓。大豆和酵母水解產(chǎn)物的平均分子量優(yōu)選為介于約220到375道爾頓之間。大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的pH值范圍應在約6.5和7.5之間。總的含氮量應介于約8和11％之間，優(yōu)選介于9.0和10.0％之間且灰分含量≤18％。有益的水解產(chǎn)物的特點在于游離氨基酸的含量介于約5和3 0％之間。內(nèi)毒素(如果存在)含量應為＜500U/g。
根據(jù)本發(fā)明的一種培養(yǎng)基具有以下組分合成的基本培養(yǎng)基(DMEM/HAM′s F12(1∶1)培養(yǎng)基(1-25g/L)、大豆水解產(chǎn)物(0.5-10g/L)和酵母水解產(chǎn)物(0.5-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-1g/L)、NaHCO3(0.1-10g/L)。培養(yǎng)基的pH介于pH6.8到7.6之間，優(yōu)選介于pH 7.0到7.3之間。
對于技術人員而言顯而易見的是，上下文的數(shù)值和范圍中的術語“約”是指近似或接近所列值或范圍的值或范圍，以使得本發(fā)明能如預期的實施，如具有促進細胞生長的所需要的程度，如從這里含有的教導所顯而易見的，且應用于所有值。因此，該術語包括除由系統(tǒng)錯誤產(chǎn)生的那些值以外的值。
已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，補充了本發(fā)明范圍內(nèi)的酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無動物蛋白質的基礎培養(yǎng)基相對于現(xiàn)有技術中描述的培養(yǎng)基更有利于細胞生長的速度、細胞代謝活動和細胞終密度。相對于WO98/15614顯示較高的植物肽濃度是較為不佳的教導，這甚至是更加令人驚訝的。如這里描述的，相對于單獨包含大豆水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基，甚或單獨加入培養(yǎng)基中的酵母水解產(chǎn)物或大豆水解產(chǎn)物的終濃度等同于組合的水解產(chǎn)物濃度的總和用包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的本發(fā)明的無動物蛋白質培養(yǎng)基，細胞顯示了更高的生長速度、更高的生物量的終細胞密度和增加的代謝活動(用％每分鐘氧消耗表示)。例如，培養(yǎng)基中單獨的終濃度約為0.4％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物，對細胞生長和細胞密度具有抑制作用。包含0.4％(w/v)或更高濃度的大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基與包含0.3％(w/v)的培養(yǎng)基相比并不能達到更高的細胞密度。然而，包含最后總水解產(chǎn)物濃度為0.4％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物組合的培養(yǎng)基顯示了顯著增加的細胞代謝活動、細胞生長和終細胞密度。
依照本發(fā)明，培養(yǎng)基中大豆和酵母水解產(chǎn)物的總量應介于約0.2％(w/v)和約0.6％(w/v)之間，其中培養(yǎng)基中大豆水解產(chǎn)物的比率相對于酵母水解產(chǎn)物更高。大豆和酵母水解產(chǎn)物之間的最佳比率應分別為約3∶1(大豆/酵母)。
如這里描述的本發(fā)明的培養(yǎng)基對于培養(yǎng)細胞是特別有用的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術語“細胞”指普通術語且包含培養(yǎng)單個細胞、組織、器官、昆蟲細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、原代細胞、傳代細胞系、干細胞和/或遺傳工程化的細胞，如表達異源多肽或蛋白質的重組細胞。重組細胞包括，例如表達異源多肽或蛋白質，如生長因子或血液因子的CHO細胞或BHK細胞。經(jīng)常用于增殖病毒的細胞包括VERO細胞和CV-1細胞。
適合在本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動物細胞，包括人源的細胞，其可以是源自組織樣品的原代細胞、二倍體細胞株、轉化的細胞或已建立的細胞系。哺乳動物細胞可以包括人和類似的非人細胞。非人源的哺乳動物細胞可以是猴腎細胞、牛腎細胞、狗腎細胞、豬腎細胞、兔腎細胞、小鼠腎細胞、大鼠腎細胞、羊腎細胞、倉鼠腎細胞、中國倉鼠卵巢細胞或源自任何組織的動物細胞。特別地，能培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞可以是BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS-細胞、COS-1細胞、COS-3細胞、COS-7細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK-細胞、TCMK-1細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、293細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、W1-38細胞、BHK細胞、293細胞和RK細胞。實例或重組細胞包括表達因子VIII、FII、FIX、FX、vWF例如，本領域技術人員已知的所有因子的CHO細胞。
以其各種語法形式表示的術語“傳代細胞”或“傳代細胞系”(CCL)，意為無限制復制且能在懸浮培養(yǎng)物中生長或在生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)的培養(yǎng)細胞。CCLs的非限制性生長允許從標準化的細胞培養(yǎng)基、低成本地進行長期培養(yǎng)。哺乳動物細胞系可以選自CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、LLK-MK2細胞、NS-1細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、CV-1細胞、兔腎(RK)細胞，和如由Butler等人BIOS Scientific Publisher第1-24頁(1992)公開的其它細胞系，其在此引入作為參考。優(yōu)選檢測CCLs沒有外來因子，如細菌、真菌、支原體、原生動物和病毒。
以其各種語法形式表示的術語“細胞培養(yǎng)物”，是指細胞在懸液、搖瓶、培養(yǎng)瓶等中生長。大規(guī)模的方法，如包括在攪拌發(fā)酵罐中附著于微載體生長的貼壁細胞的生物反應器也包括在內(nèi)。此外，可能不僅培養(yǎng)表面依賴性細胞，還可使用含本發(fā)明培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)技術。如果細胞在微載體上生長，則該微載體選自基于葡聚糖、膠原、塑料、明膠和纖維素的微載體，及如Butler，Spier和Griffiths，Animalcell Biotechnology 3283-303(1988)中描述的其它微載體。多孔載體，例如Cytoline或Cytopore，以及基于葡聚糖的載體，如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex 2)或基于明膠的載體，如明膠包被的葡聚糖(Cytodex 3)是合適的。這些載體可從Pharmacia獲得。
在細胞培養(yǎng)生長和產(chǎn)物生產(chǎn)過程中，細胞優(yōu)選生在無動物蛋白質培養(yǎng)基中在培養(yǎng)基條件下由的安瓿到生物量。優(yōu)選使用已適應于培養(yǎng)基的細胞。已發(fā)現(xiàn)，使用這樣預適應的細胞不但獲得增加的產(chǎn)量，而且通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，它們的培養(yǎng)穩(wěn)定性也明顯地得到改善。
以其各種語法形式表示的術語“培養(yǎng)”，是指在允許生長和延續(xù)的生存力的條件下體外維持細胞。哺乳動物細胞一般培養(yǎng)在約37℃的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基的最佳pH范圍約為6.8至7.6，優(yōu)選介于7.0和7.3之間。如果需要，分批培養(yǎng)的細胞可每隔約2至3天，或更多或更少頻度地更換完全培養(yǎng)基。灌流培養(yǎng)的細胞(例如在生物反應器或發(fā)酵罐中)可以連續(xù)再循環(huán)為基礎而更換新鮮的培養(yǎng)基。依據(jù)上下文和需要，培養(yǎng)方法可以包括細胞的移種、傳代和增殖。
因此本發(fā)明提供培養(yǎng)細胞的方法，該方法包括細胞在包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基中生長的步驟。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，細胞在本發(fā)明的無動物蛋白質培養(yǎng)基中從小規(guī)模生長到大規(guī)模的生物量。為獲得細胞培養(yǎng)生物量，細胞的傳代和移種優(yōu)選用非動物來源的蛋白酶，如鏈霉蛋白酶或其純化的組分進行。一種蛋白酶是如美國申請系列號10/006,223中描述的灰色鏈霉菌屬(SGT)的純化胰蛋白酶樣組分，其在此全部引入作為參考。在細胞培養(yǎng)期間，特別是在附著于載1體生長的貼壁細胞的培養(yǎng)期間，為避免動物來源的物質，載體優(yōu)選為合成載體，或用非動物來源物質包被的微載體。例如DEAE-葡聚糖或包被季胺的葡聚糖微載體。
本發(fā)明也提供無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)方法，其中細胞在缺乏動物蛋白質的條件下培養(yǎng)、移種和傳代。該方法包括以下步驟提供包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基，使細胞在所述的培養(yǎng)基中生長，使用非動物來源的蛋白酶傳代和移種所述的生長在該培養(yǎng)基中的細胞，進一步生長移種的細胞以達到匯合的細胞密度，以及重復細胞的移種和生長步驟直到達到所需要的最終細胞培養(yǎng)生物量。該方法包括在無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞生長，使用非動物來源的蛋白酶，優(yōu)選純化的灰色鏈霉菌屬(SGT)的胰蛋白酶樣組分，來移種和傳代細胞。在附著于載體生長的貼壁細胞的培養(yǎng)過程中，載體優(yōu)選為合成載體，或非動物來源物質包被的微載體。通過組合這些步驟，可以避免使用動物蛋白質。
適合在本發(fā)明的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長的細胞包括，但不限于BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、TCMK-1細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、RK-細胞、BHK-21細胞、WI-38細胞、293細胞和/或MRC-5細胞。這些細胞可以用病毒，如正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒、腺病毒和技術人員已知的其它病毒感染。更特別地，用于感染細胞培養(yǎng)物的病毒可以是流感病毒、牛痘病毒和天花、禽痘病毒、牛痘病毒、蜱傳腦炎病毒(TBE)、脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒、羅斯河病毒、黃熱病毒及其衍生的嵌合病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、風疹病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒measles virus、呼吸道合胞體病毒(RSV)、皰疹單純病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、輪狀病毒、口蹄疫病毒(FMDV)。在本領域技術人員認知的范圍內(nèi)選擇病毒和用于繁殖病毒的細胞。在用各種病毒分別感染之前，細胞可以培養(yǎng)在本發(fā)明的培養(yǎng)基中且生長達到最佳的細胞密度。令人驚訝地，在本發(fā)明的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長和增殖的細胞培養(yǎng)物顯示了病毒產(chǎn)率的顯著增加。繁殖病毒的實施例已經(jīng)顯示與單獨包含酵母提取物的培養(yǎng)基相比在用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)和生長的細胞上繁殖的不同病毒有2至5倍增加的病毒產(chǎn)量。這使該系統(tǒng)比現(xiàn)有技術中描述的系統(tǒng)更有利于細胞的生長和病毒的生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，細胞是VERO細胞且病毒是選自流感病毒、TBE-病毒、牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒、羅斯河病毒、黃熱病及其衍生的嵌合病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、風疹病毒、HCV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒、HSV、CMV、EBV、輪狀病毒。也可以使用已知生長在VERO細胞中的其它病毒。
本發(fā)明也提供牛痘病毒的生產(chǎn)，通過提供在包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長和培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，用牛痘病毒感染所述細胞，以及培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖牛痘病毒。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明的這方面，細胞可以是VERO細胞、CV-1細胞、RK-細胞、BHK-21細胞、MRC-5細胞，或牛痘病毒能生長的任何細胞。牛痘病毒可以是天然存在的牛痘病毒、天花病毒疫苗株、有毒牛痘株、減毒牛痘株和重組牛痘病毒。
本發(fā)明也提供正粘病毒的生產(chǎn)，其是通過下述方式進行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基制成的無動物蛋白質培養(yǎng)基中培養(yǎng)和生長的細胞培養(yǎng)物，用正粘病毒感染細胞，以及培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖正粘病毒。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細胞可以是BSC-1細胞、CV-1細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、WI-38細胞、MRC-5細胞，或能使正粘病毒繁殖的任何細胞。正粘病毒可以是流感病毒，如流感A、B或C。
本發(fā)明也提供羅斯河病毒的生產(chǎn)，其是通過下述方式進行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基制成的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長和培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，用羅斯河病毒感染所述細胞，以及培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖羅斯河病毒。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細胞可以是BSC-1細胞、CV-1細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、BHK-21細胞、WI-38細胞、MRC-5細胞或能使羅斯河病毒繁殖的任何細胞。
另外，本發(fā)明提供黃病毒的生產(chǎn)，其是通過下述方式進行的，即提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基制成的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長和培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，用黃病毒感染細胞，以及培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖黃病毒。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。黃病毒可以是黃熱病毒，或其嵌合衍生物的重組體、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒和丙型肝炎病毒。這里鑒定的細胞類型可以用于繁殖黃病毒。
本發(fā)明還提供細小核糖核酸病毒的生產(chǎn)，其是下述方式進行的通過提供在由包含酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基制成的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生長和培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，用細小核糖核酸病毒感染細胞，以及培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖細小核糖核酸病毒。優(yōu)選地，細胞生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中。細小核糖核酸病毒可以是脊髓灰質炎病毒或甲型肝炎病毒。這里鑒定的細胞類型可以用于繁殖細小核糖核酸病毒。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括以下步驟提供動物細胞的培養(yǎng)物，其中細胞是選自已在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的猴腎細胞、牛腎細胞、狗腎細胞、豬腎細胞、小鼠腎細胞、大鼠腎細胞、羊腎細胞、兔腎細胞、倉鼠腎細胞和人細胞；用選自正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒的病毒感染細胞，培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以繁殖病毒，收獲產(chǎn)生的病毒且由收獲的病毒制備免疫原性組合物。生產(chǎn)和收獲的病毒可以用本領域中已知的方法純化，如離子交換或凝膠過濾。
現(xiàn)在已概括地描述了本發(fā)明，通過參考以下實施例同樣會得到進一步理解，這里提供的實施例是用于闡明目的而不以任何方式加以限制。
實施例實施例1
培養(yǎng)基的配制用添加有無機鹽、氨基酸、維生素和其它成分的基礎DMEM/HAM′sF12(1∶1)培養(yǎng)基制備無動物蛋白質的培養(yǎng)基。也加入碳酸氫鈉(1-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.1-1g/L)和不同濃度的大豆水解產(chǎn)物(QuestTechnologies，紐約)或酵母水解產(chǎn)物(Deut sche Hefewerke，德國)或其組合物。
實施例2在無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞增殖無動物蛋白質培養(yǎng)基中的VERO細胞VERO細胞(非洲綠猴，Cercopthecus aethiops，腎)用作細胞系。細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，登記號為ATCC CCL 81，傳代數(shù)為124。使細胞生長在如這里所述的各種培養(yǎng)基中。
將工作細胞庫的細胞以分離比為1∶6-1∶8在T-培養(yǎng)瓶、搖瓶和微載體系統(tǒng)中擴增。細胞在37℃下生長6-8天。氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。當細胞已經(jīng)達到匯合生長生物量生產(chǎn)結束時，測定細胞密度和耗氧率。
在生物量生產(chǎn)結束時，測定細胞培養(yǎng)物的生物量的細胞數(shù)，如Schrfe等人Biotechnologie in LaborPraxis 101096-1103(1988)描述的，通過胰蛋白酶消化細胞和用CASY細胞計數(shù)器來計數(shù)(方法A)，或如Sanford等人，J.Nat′l Cancer Inst.11773-795(1951)描述的，通過檸檬酸和結晶紫處理后用血細胞計數(shù)器來計數(shù)(方法B)。
將VERO細胞培養(yǎng)和生長在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含濃度為0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物，或濃度為0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物，或酵母與大豆的濃度比(酵母/大豆)為0.05％/0.05％(w/v)、0.1％/0.2％(w/v)、0.1％/0.3％(w/v)、0.2％/0.2％(w/v)、0.3％/0.2％(w/v)或0.2％/1.0％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。通過方法A和B計算在包含不同濃度的大豆水解產(chǎn)物、酵母水解產(chǎn)物或其組合的無動物蛋白質培養(yǎng)基中生物量生產(chǎn)結束時細胞培養(yǎng)物的細胞密度。
結果證明單獨的酵母和大豆水解產(chǎn)物支持細胞生長。在酵母水解產(chǎn)物濃度為0.1％時，細胞密度達到約11.8×105個細胞/ml，然而增加酵母水解產(chǎn)物的濃度至高于0.3％(w/v)時，其對細胞生長和隨后的細胞密度具有負效應。單獨的大豆水解產(chǎn)物的濃度介于0.1％(w/v)至0.2％(w/v)，顯示了比0.3％(w/v)和0.4％(w/v)的大豆?jié)舛扔懈俚募毎L和細胞密度。不過，培養(yǎng)在包含0.3％(w/v)或0.4％(w/v)大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞密度和細胞的耗氧沒有顯著不同，且約1％w/v高濃度的大豆水解產(chǎn)物對細胞生長不具有正效應。單獨的大豆水解產(chǎn)物的最佳濃度確定為介于0.2％w/v和1.0％w/v之間。相對于包含單獨的大豆或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基，將用大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的組合添加至基礎培養(yǎng)基，達到的最終細胞密度顯著地增加。用濃度為0.05％(w/v)的大豆和0.05％(w/v)的酵母時，達到的細胞密度約為1 2.1×105個細胞/ml，且相對于生長在單獨包含0.1％(w/v)大豆水解產(chǎn)物(10×105個細胞/ml)或0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物(11.8×105個細胞/ml)的培養(yǎng)基中的細胞，具有更高的細胞培養(yǎng)物的細胞密度。生長在包含濃度為0.2％(w/v)酵母和1.0％(w/v)大豆的培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物的細胞密度，與在包含0.05％(w/v)大豆和0.05％酵母(w/v)的培養(yǎng)基中獲得的密度相似。
對細胞生長最顯著的作用是在大豆水解產(chǎn)物濃度相對于酵母水解產(chǎn)物高約2-3倍的培養(yǎng)基中。生長在包含濃度約為0.3％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和約為0.1％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞，達到約為21.0×105個細胞/ml的細胞密度，因此顯示相對于單獨生長在約0.4％(w/v)大豆水解產(chǎn)物中的細胞高約2倍的細胞密度，而相對于培養(yǎng)在單獨包含約0.4％(w/v)酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞高約2.5倍的細胞密度。培養(yǎng)在包含酵母和大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞的代謝活動也高于生長在單獨包含酵母或大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞。包含0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中耗氧率為1.5(％每分鐘)，單獨包含0.4％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物或大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的小于1.0(％每分鐘)。在包含0.1％(w/v)酵母水解產(chǎn)物和0.3％(w/v)大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，耗氧約為2.9(％每分鐘)，其比培養(yǎng)在單獨包含大豆或酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的細胞高出約2倍。
另外細胞周期，其在補充有單獨的酵母或大豆水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中為7天，在水解產(chǎn)物組合(大豆和酵母)的培養(yǎng)基中減至6天。
實施例3重組細胞的增殖重組哺乳動物細胞，如rFVIII-CH0細胞的細胞培養(yǎng)物在10L的攪拌罐中灌流培養(yǎng)。使用實施例1中的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)和生長培養(yǎng)基。將細胞固定在多孔微載體上(Cytopore，Pharmacia)且培養(yǎng)至少6周。灌流速度為每天變化4體積；pH為6.9至7.2；O2濃度約為20-50％且溫度為37℃。測定細胞密度。
實施例4生長在添加有酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的VERO細胞上病毒抗原生產(chǎn)的比較a.細胞培養(yǎng)生物量的生產(chǎn)限定傳代數(shù)的VERO細胞從液氮中解凍且在roux和搖瓶中傳代以生產(chǎn)足夠的細胞接種在1.5升的生物反應器中。如實施例1和2中描述的，使細胞生長在添加有酵母水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物組合的基礎培養(yǎng)基中。在以最終細胞密度1.5×106個細胞/ml達到匯合之后，用純化的鏈霉蛋白酶組分，如美國申請系列號10/006,223中描述的灰色鏈霉菌屬胰蛋白酶(SGT)，從微載體中釋放細胞，并轉移到10升的生物反應器中。這依次用作具有3.0g/l微載體濃度的100升生物反應器的接種物。從含有107個細胞的工作細胞庫安瓿開始，需要約30代以在最后的發(fā)酵容器中達到最終匯合的VERO細胞生物量。細胞在37℃下生長。在病毒繁殖過程期間，氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。
將VERO細胞的工作細胞庫的細胞在T-培養(yǎng)瓶和搖瓶中以1∶6的分離比進行擴增。在作為生物反應器的1.5、10和501攪拌發(fā)酵罐中，使用Cytodexl微載體作為附著基底，進行進一步的細胞增殖。細胞在37℃下生長。在病毒繁殖過程期間，氧飽和度為20％+/-10％和pH為7.1+/-0.35的培養(yǎng)條件保持恒定。
b.流感病毒的增殖用兩種不同的流感毒株New Caledonia A/H1 N1和Panama A/H3N2感染VERO細胞，并在各自的培養(yǎng)基中繁殖。在病毒繁殖過程結束時，通過超速離心法純化含有病毒的澄清的上清液。根據(jù)容量抗原產(chǎn)率(總SRD，單向放射免疫擴散)和操作結束時上清液的抗原含量(密度梯度純化的抗原)，對用單獨含酵母水解產(chǎn)物或含酵母和大豆水解產(chǎn)物的VERO細胞培養(yǎng)物的收獲物進行比較。比較兩種培養(yǎng)基配方的產(chǎn)量并總結于表1中。
表1.
在不同的培養(yǎng)基組合物中VERO流感病毒產(chǎn)率的比較
酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物的組合顯示比單獨的酵母水解產(chǎn)物有顯著的改善。
c.痘病毒的生產(chǎn)用適合在無動物蛋白質的VERO細胞中繼續(xù)傳代生長的天花疫苗生產(chǎn)株(Dryvax，Wyeth疫苗，獲自Acambis，Inc.，適合在永久細胞系中生長的小牛淋巴疫苗株)，以0.1-0.3的感染復數(shù)(m.o.i)，感染VERO細胞。在37℃下培養(yǎng)2-4天時間后，收獲細胞并從細胞回收病毒。
表2顯示了在添加有單獨的酵母水解產(chǎn)物或酵母和大豆水解產(chǎn)物的基礎培養(yǎng)基中生長的細胞中獲得的病毒產(chǎn)量的結果。
權利要求
1.一種包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度至少為0.05％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度至少為0.05％(w/v)。
3.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度小于1.0％(w/v)存在，酵母水解產(chǎn)物的濃度小于0.3％(w/v)。
4.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度介于約0.2％(w/v)至約0.6％(w/v)之間，酵母水解產(chǎn)物的濃度介于約0.05％(w/v)至約0.2％(w/v)之間。
5.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度介于約0.25％(w/v)至約0.35％(w/v)之間，酵母水解產(chǎn)物的濃度介于約0.05％(w/v)至約0.15％(w/v)之間。
6.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度約為0.3％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度約為0.1％(w/v)。
7.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中相對于1重量份的酵母水解產(chǎn)物存在3重量份的大豆水解產(chǎn)物。
8.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中酵母水解產(chǎn)物是超濾純化的酵母水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述酵母水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。
9.根據(jù)權利要求1的無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基，其中大豆水解產(chǎn)物是超濾純化的大豆水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量小于或等于500道爾頓。
10.一種生產(chǎn)無動物蛋白質的細胞培養(yǎng)基的方法，其中將酵母水解產(chǎn)物和大豆水解產(chǎn)物添加到無任何動物蛋白質的基礎培養(yǎng)基中。
11.根據(jù)權利要求10的方法，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度至少為0.05％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度至少為0.05％(w/v)。
12.根據(jù)權利要求10的方法，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度小于1.0％(w/v)，酵母水解產(chǎn)物的濃度小于0.3％(w/v)。
13.一種培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物的方法，該方法包括提供包括濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基；以及在該培養(yǎng)基中增殖細胞以形成細胞培養(yǎng)物。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述細胞是選自昆蟲細胞、鳥類細胞和哺乳動物細胞的動物細胞。
15.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述細胞是重組細胞。
16.根據(jù)權利要求13的方法，其中細胞選自BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS-細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK-細胞、TCMK-1細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞和RK-細胞。
17.一種無動物蛋白質的匯合細胞培養(yǎng)方法，包括提供包括大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質的培養(yǎng)基；使細胞在該培養(yǎng)基中生長，以及傳代和移種生長在該培養(yǎng)基中的細胞同時與非動物來源的蛋白酶接觸以獲得匯合的細胞培養(yǎng)物。
18.一種在無動物蛋白質培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，其中該培養(yǎng)基包括濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物。
19.根據(jù)權利要求18的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞是選自昆蟲細胞、鳥類細胞和哺乳動物細胞的動物細胞。
20.根據(jù)權利要求18的細胞培養(yǎng)物，其中細胞是重組細胞。
21.根據(jù)權利要求18所述培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，其中細胞是經(jīng)病毒感染的。
22.根據(jù)權利要求18的細胞培養(yǎng)物，其中細胞選自BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS-細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK-細胞、TCMK-1細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞和RK-細胞。
23.一種生產(chǎn)病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖病毒。
24.根據(jù)權利要求21的方法，其中細胞是選自昆蟲細胞、鳥類細胞和哺乳動物細胞的動物細胞。
25.一種生產(chǎn)牛痘病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用牛痘病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖牛痘病毒。
26.一種生產(chǎn)冠狀病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用冠狀病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖冠狀病毒。
27.一種生產(chǎn)正粘病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用正粘病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖正粘病毒。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中正粘病毒是流感A、B或C病毒。
29.一種生產(chǎn)羅斯河病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用羅斯河病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖羅斯河病毒。
30.一種生產(chǎn)黃病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用黃病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖黃病毒。
31.根據(jù)權利要求30的方法，其中黃病毒選自黃熱病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒和丙型肝炎病毒。
32.一種生產(chǎn)細小核糖核酸病毒的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用細小核糖核酸病毒感染細胞；以及培養(yǎng)感染的細胞以繁殖細小核糖核酸病毒。
33.根據(jù)權利要求32的方法，其中細小核糖核酸病毒選自脊髓灰質炎病毒和甲型肝炎病毒。
34.一種生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括提供已生長在包含濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)的大豆水解產(chǎn)物和濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)的酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物；用病毒感染細胞；培養(yǎng)感染的細胞以繁殖病毒；收獲產(chǎn)生的病毒或病毒抗原從收獲的病毒或病毒抗原中制備免疫原性組合物。
35.根據(jù)權利要求34的方法，其中所述的收獲的病毒或病毒抗原經(jīng)過純化。
36.一種生產(chǎn)包含病毒或病毒抗原的免疫原性組合物的方法，該方法包括提供哺乳動物細胞的培養(yǎng)物，其中該細胞選自已生長在包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的無動物蛋白質培養(yǎng)基中的猴腎細胞、牛腎細胞、狗腎細胞、豬腎細胞、小鼠腎細胞、大鼠腎細胞、羊腎細胞、倉鼠腎細胞和人細胞；用選自正粘病毒、副粘病毒、呼腸孤病毒、細小核糖核酸病毒、黃病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、冠狀病毒和腺病毒的病毒感染細胞；培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物以增殖病毒；收獲如此生產(chǎn)的病毒或病毒抗原；以及從收獲的病毒或病毒抗原制備免疫原性組合物。
37.一種經(jīng)正粘病毒感染的細胞培養(yǎng)物，其中將細胞在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
38.根據(jù)權利要求37的培養(yǎng)物，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)，且酵母水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)。
39.一種經(jīng)痘病毒感染的細胞培養(yǎng)物，其中將細胞在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
40.根據(jù)權利要求39的培養(yǎng)物，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)，且酵母水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)。
41.一種經(jīng)皰疹病毒感染的細胞培養(yǎng)物，其中將細胞在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
42.根據(jù)權利要求41的培養(yǎng)物，其中大豆水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約1％(w/v)，且酵母水解產(chǎn)物的濃度為約0.05％(w/v)至約0.3％(w/v)。
43.一種無動物蛋白質的正粘病毒制劑，其中該制劑可通過在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)流感病毒感染的細胞而獲得，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
44.一種無動物蛋白質的皰疹病毒制劑，其中該制劑可通過在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用流感病毒感染的細胞而獲得，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
45.一種無動物蛋白質的痘病毒制劑，其中該制劑可通過在無動物蛋白質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用流感病毒感染的細胞而獲得，其中該培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含源自大豆水解產(chǎn)物和酵母水解產(chǎn)物的非動物來源肽組合物的無動物蛋白質細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也提供一種無動物蛋白質的培養(yǎng)方法，其中在不含動物來源成分的條件下培養(yǎng)、增殖和傳代細胞。該方法對于培養(yǎng)細胞，如重組細胞或經(jīng)病毒感染的細胞，以及對于在無動物蛋白質成分的條件下，通過細胞培養(yǎng)過程生產(chǎn)生物制品是有用的。
文檔編號C12N5/02GK1681917SQ03821326
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月8日 優(yōu)先權日2002年7月9日
發(fā)明者M·賴特, W·蒙德特, L·格里爾伯格, B·克勞斯 申請人:巴克斯特國際有限公司, 巴克斯特健康護理股份有限公司