專利名稱：L－醛糖內酯的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過屬于Pseudomonas屬或Gluconobacter屬的微生物從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的方法。
背景技術：
L-古洛糖酸-1，4-內酯(L-gulono-1，4-1actone)和L-半乳糖酸-1，4-內酯是L-醛糖內酯，它們分別是動物和植物對L-抗壞血酸(維生素C)進行生物合成中的中間產物。人們提出的動物中維生素C的合成途徑始自D-葡萄糖，然后通過中間產物D-葡糖-6-磷酸、D-葡糖-1-磷酸、UDP-D-葡糖、UDP-D-葡糖醛酸、D-葡糖醛酸、L-古洛糖酸、L-古洛糖酸-1，4-內酯和2-酮基-L-古洛糖酸-1，4-內酯，至終產物維生素C形成。人們提出的植物中維生素C的合成途徑始自D-葡萄糖，然后通過中間產物D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、GDP-D-甘露糖、GDP-L-半乳糖、L-半乳糖-1-磷酸、L-半乳糖、L-半乳糖酸-1，4-內酯和2-酮基-L-半乳糖酸-1，4-內酯，至終產物維生素C形成。
從1934年“Reichstein方法”被建立以來，對維生素C生物技術合成的可行性研究已經進行了很多年。微生物Gluconobacter oxydans DSM4025、Candida albicans和Saccharomyces cerevisiae能將L-半乳糖酸-1，4-內酯氧化成維生素C。Saccharomyces cerevisiae和Candida albicans擁有D-阿拉伯糖脫氫酶，催化分別從D-阿拉伯糖和L-半乳糖產生D-阿拉伯糖酸-1，4-內酯和L-半乳糖酸-1，4-內酯的過程。然而，未有報道描述用另外的L-己糖作為中間產物來對維生素C進行生物生產的可能性，所述己糖是L-艾杜糖(L-idose)、L-古洛糖和L-塔羅糖(L-talose)，其具有與維生素C相應的構型(在C4和C5位置上)。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了通過微生物從L-己醛糖來生產L-醛糖內酯的方法，所述微生物能從L-己醛糖生產L-醛糖內酯，以及，可選地，所述方法包括從反應混合物中分離L-醛糖內酯。
具體實施例方式
通過本發(fā)明的方法生產的L-醛糖內酯選自由L-古洛糖酸-1，4-內酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內酯和L-半乳糖酸所構成的組。
在本文中使用的“L-古洛糖酸-1，4-內酯(及其酸的形式，L-古洛糖酸)”或“L-半乳糖酸-1，4-內酯(及其酸的形式，L-半乳糖酸)”指作為物理化學平衡的結果，以內酯形式和酸的形式共同存在的混合物。
在用于生產L-醛糖內酯的本發(fā)明方法中使用的L-己醛糖選自L-古洛糖或L-半乳糖。
因此，在本發(fā)明中，L-古洛糖酸-1，4-內酯及其酸的形式，L-古洛糖酸生產自L-古洛糖，而L-半乳糖酸-1，4-內酯及其酸的形式，L-半乳糖酸生產自L-半乳糖。
L-己醛糖，例如L-古洛糖、L-半乳糖、L-艾杜糖和L-塔羅糖，是稀有的糖，其基本通過化學方法來生產，在商業(yè)上是高成本的化合物。然而，近來已有對L-古洛糖和L-半乳糖的生物制備的報道。EP 0 832 974 A2中報道了通過G.oxydans DSM 4025的酶A從D-山梨糖醇對L-古洛糖進行的生產。US 6,037,153中公開了通過L-核糖異構酶從L-山梨糖對L-古洛糖進行的生產。Izumori et al.(2001 Annual Meeting of the Society for Bioscienceand Bioengineering，Japan)中報道了從L-山梨糖對L-半乳糖進行的生產。
本發(fā)明的能從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的微生物可以選自Pseudomonas或Gluconobacter。優(yōu)選的微生物是Pseudomonas putida或Gluconobacter oxydans。更優(yōu)選的是P.putida ATCC 21812或G.oxydansIFO 3293。所述微生物也可以是具有P.putida ATCC 21812或G.oxydansIFO 3293的鑒定特征的微生物的生物學上和/或分類學上的均一培養(yǎng)物。
P.putida ATCC 21812菌株可從American Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA)獲得。G.oxydans IFO 3293菌株可從Institute for Fermentation，Osaka(17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532，Japan)獲得。
本文中使用的術語“生物性上和/或分類上同類的培養(yǎng)物”除包括P.putida ATCC 21812或G.oxydans IFO 3293之外，還包括具有P.putidaATCC 21812或G.oxydans IFO 3293的鑒定特征的不同種/屬的微生物。確定一種微生物是否屬于此種均一的培養(yǎng)物應當基于對16S rRNA序列的比較。
微生物“Pseudomonas putida”和“Gluconobacter oxydans”還包括此類物種的由《國際原核生物命名法規(guī)》(International Code ofNomenclature of Prokaryotes)所定義的具有相同物理-化學屬性的同物異名體(synonym)或基原異名體(basonym)。
本發(fā)明因此提供了通過屬于Pseudomonas屬或Gluconobacter屬的微生物從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的方法，尤其是從L-古洛糖生產L-古洛糖酸-1，4-內酯或L-古洛糖酸的方法，以及從L-半乳糖生產L-半乳糖酸-1，4-內酯或L-半乳糖酸的方法，所述微生物能從L-己醛糖來生產L-醛糖內酯，所述方法包括將L-醛糖內酯從反應混合物中分離出來。所述方法可于生長中的培養(yǎng)物或靜止細胞(resting cell)的反應中進行。
因此，本發(fā)明的一種實施方式是提供上述從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的方法，其中，上面定義的能從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的微生物被用于正在生長的培養(yǎng)物或靜止細胞的反應中。
本發(fā)明中，上述菌株的突變體也可以使用。本文中所用到的術語“突變”指微生物基因組序列的改變，其可以是由任何便捷手段引入的，所述便捷手段包括例如，化學誘變和UV誘變，隨后針對期待的表型進行篩選或選擇；通過重組技術在體外構建功能缺失的基因，以通過單交叉重組和雙交叉重組來替換所述微生物基因組中相應的原有基因；以及其它公知技術。見Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Harwood and Cutting，Molecular Biology Methods For Bacillus，John Wiley and Sons(1990)，pp.27-74。合適的誘變劑包括但不限于紫外線、X-射線、γ-射線和亞硝酸。此外，突變菌株可以通過分離自發(fā)突變形成的克隆來獲得，可以采用本領域技術人員公知的能達到此目的的任何方式。
所述微生物可在有氧條件下被培養(yǎng)于補充有適當營養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。培養(yǎng)可以于pH在大約1.0至9.0之間的情況下進行，優(yōu)選在大約2.0至8.0之間。雖然培養(yǎng)期是根據(jù)所用的pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化的，但是通常1至120小時將產生最有利的結果。優(yōu)選用于進行培養(yǎng)的溫度范圍是從大約13℃至45℃，更優(yōu)選為大約18℃至42℃。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供通過能從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的微生物從L-己醛糖生產L-醛糖內酯的方法，其中，所述方法在大約1至大約9的pH范圍內，大約13℃至大約45℃的范圍內的溫度下，進行1至120小時。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述方法進行于大約2至大約8的pH范圍內，大約18℃至大約42℃的范圍內的溫度下。
反應混合物中L-己醛糖的濃度可根據(jù)其它反應條件而變化，但是一般來說，其在1g/l至300g/l之間，優(yōu)選在10g/l至200g/l之間。
通常要求培養(yǎng)基中含有若干營養(yǎng)物質，例如可被吸收的碳源、可消化的氮源以及無機物、維生素、痕量元素和其它促進生長的因子?？杀晃盏奶荚吹睦影ǖ幌抻诟视?、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿糖醇、D-山梨糖醇和L-山梨糖。
若干有機或無機物質也可被用作氮源，例如酵母提取物、肉類提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米漿、尿素、氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等。無機物硫酸鎂、磷酸鉀、氯化亞鐵和氯化鐵、碳酸鈣等也可以使用。
維生素，例如生物素、氰鈷胺素、硫胺·HCl、吡哆醇·HCl、泛酸鈣、葉酸、肌醇、煙酸、p-氨基苯甲酸和核黃素對本發(fā)明都是有用的。
適合用于本發(fā)明的痕量元素選自稀有金屬，例如以無機鹽、維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的形式存在的Mo、Mn、Cu、Co和Zn，所述無機鹽形式例如是Na2MoO4·2H2O。其它促進生長的因子包括但不限于氨基酸例如色氨酸或組氨酸、嘌呤例如腺嘌呤或鳥嘌呤和嘧啶例如胞嘧啶和胸腺嘧啶。
反應之后，可以通過多種色譜的組合方式從反應混合物中回收L-醛糖內酯，所述色譜例如是薄層色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜或高效液相色譜。也可以使用本發(fā)明的反應混合物中未經純化的反應產物，作為進一步反應的底物。
下述實施例被用來進一步地闡述本發(fā)明的方法。這些實施例僅作闡述用，而并非欲以任何方式對本發(fā)明的范圍加以限制。
實施例1通過P.putida或G.oxvdans從L-古洛糖來生產L-古洛糖酸-1，4-內酯在由2.5％甘露醇、0.5％酵母提取物(Difco)和0.3％細菌蛋白胨(Difco)構成的MB瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃對P.putida ATCC 21812和G.oxydans IFO 3293進行48小時的培養(yǎng)。得到的細胞被用于靜止細胞反應。在室溫下對由2％的L-古洛糖、0.3％的NaCl、1％的CaCO3和1 mM吩嗪硫酸甲酯構成的反應混合物(1ml)進行17小時的培養(yǎng)。如表1中所概括的，產生的L-古洛糖酸-1，4-內酯和L-古洛糖酸的量通過薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)和高效液相色譜(HPLC)來測定。用硅膠(Kiesel gel 60F254，0.25mm，Merck)和由正丙醇-H2O-1％H3PO4-HCOOH(400∶100∶10∶1)構成的溶劑體系來開展TLC檢測。HPLC檢測是用YMC-Pack Polyamine II柱(150×4.6mm I.D.；YMC CO.，Ltd.，Kyoto，Japan)和用乙腈-50mM NH4H2PO4(67∶33)在210nm處進行的。向TLC板噴上0.5％的KIO4溶液，然后再噴上由15％的MnSO4溶液和四堿價飽和(tetrabase-saturated)的2N CH3COOH所形成的等體積混合物。產物L-古洛糖酸-1，4-內酯和L-古洛糖酸作為白斑被檢測到。
表1用L-古洛糖作為底物進行試管靜止反應


L-GuLL-古洛糖酸-1，4-內酯；L-GuAL-古洛糖酸；++超過5mM；+5mM或更少；nd無法探測到用L-古洛糖作為底物進行的反應還可以在微量靜止細胞反應中進行，所述反應中使用100μl由2％的L-古洛糖、0.3％的NaCl、1％的CaCO3構成的反應混合物。在Luria Bertani(LB)瓊脂上于37℃生長了一天的Escherichia coli HB 101也被用于本反應。表2中展示了產生的L-古洛糖酸-1，4-內酯和L-古洛糖酸的量。
表2用L-古洛糖作為底物進行微量靜止反應

L-GuLL-古洛糖酸-1，4-內酯；L-GuAL-古洛糖酸；+5mM或更少；nd無法探測到實施例2從L-半乳糖生產L-半乳糖-1，4-內酯P.putida ATCC 21812和G.oxydans IFO 3293在MB瓊脂平板上于30℃被培育了48小時。Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763在有2％的D-葡萄糖和1.8％瓊脂的YN培養(yǎng)基(Difco)上于30℃被培育了48小時。在Luria Bertani(LB)瓊脂上于37℃生長了一天的E.coli HB 101也被用于本反應。得到的細胞被用于進行靜止細胞反應。由2％的L-半乳糖、0.3％的NaCl、1％的CaCO3和細胞(OD600＝20)構成的反應混合物(100μl)在室溫被培養(yǎng)23小時。表3中概括了通過TLC和HPLC檢測出的L-半乳糖酸-1，4-內酯和L-半乳糖酸的產生量。較之Saccharomycescerevisiae ATCC 9763和E.coli HB 101，P.putida ATCC 21812和G.oxydans IFO 3293明顯生產出了更多的L-半乳糖酸-1，4-內酯和L-半乳糖

作為蛋白加樣對照，實驗A中的FAK蛋白量是相等的，而且與FAK抑制劑一起溫育對FAK表達沒有任何影響。在實驗B中，與表5所報導的IC50相一致，抗FAK-pY397印跡顯示估計的IC50值在0.37-1.1μm范圍內，其中50％的濃度接近1.1μm。如實驗C所示，與FAK的生物學相似且一致，用抗pY20免疫印跡測定的全部FAK磷酸化被估計IC50范圍在1.1-3.3μm的抑制劑所抑制，其中50％的抑制濃度較接近3.3μm。
權利要求
1.一種通過微生物從L-己醛糖來生產L-醛糖內酯的方法，所述微生物能從L-己醛糖生產L-醛糖內酯，以及，可選地，所述方法包括從反應混合物中分離出L-醛糖內酯。
2.如權利要求1所述的方法，其中，L-醛糖內酯選自由L-古洛糖酸-1，4-內酯、L-古洛糖酸、L-半乳糖酸-1，4-內酯和L-半乳糖酸所構成的組。
3.如權利要求1所述的方法，其中L-己醛糖選自L-古洛糖或L-半乳糖。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述微生物選自Pseudomonas或Gluconobacter。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述微生物是Pseudomonas putida或Gluconobacter oxydans。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述微生物是P.putida ATCC21812或G.oxydans IFO 3293。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述的微生物被用于正在生長的培養(yǎng)物或靜止細胞反應。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述方法在大約1至大約9的范圍內的pH和大約13℃至大約45℃的范圍內的溫度下，進行1至120小時。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述方法在大約2至大約8的范圍內的pH和大約18℃至大約42℃的范圍內的溫度下，進行1至120小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過屬于Pseudomonas屬或Gluconobacter屬的微生物從L－己醛糖生產L－醛糖內酯的方法，尤其是從L－古洛糖生產L－古洛糖酸－1，4－內酯或L－古洛糖酸的方法，以及從L－半乳糖生產L－半乳糖酸－1，4－內酯或L－半乳糖酸的方法。
文檔編號C12P17/04GK1681932SQ03821889
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月18日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者星野達雄, 新城雅子 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司