專利名稱：Taci抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及TACI抗體，以及用TACI抗體調(diào)節(jié)下列分子的活性的方法，所述分子例如，TACI，腫瘤壞死因子(TNF)和TNFR-相關(guān)分子，包括TNF和TNFR的家族成員TALL-1，APRIL，TACI，BR3和BCMA。本發(fā)明還涉及體外、原位、和/或體內(nèi)診斷和/或治療與所述TNF和TNFR-相關(guān)分子分子有關(guān)聯(lián)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或病理情況(pathologyical condition)的方法。
背景技術(shù)：
各種分子，如腫瘤壞死因子-α(″TNF-α″)，腫瘤壞死因子-β(″TNF-β″或″淋巴毒素-α″)，淋巴毒素-β(″LT-β″)，CD30配體，CD27配體，CD40配體，OX-40配體，4-1BB配體，Apo-1配體(也稱Fas配體或CD95配體)，Apo-2配體(也稱Apo2L或TRAIL)，Apo-3配體(也稱TWEAK)，APRIL，OPG配體(也稱RANK配體、ODF或TRANCE)，及TALL-1(也稱BlyS、BAFF或THANK)已被鑒定為細(xì)胞因子的腫瘤壞死因子(″TNF″)家族的成員[見例如Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Schmid等，Proc.Natl.Acad.Sci.，831881(1986)；Dealtry等，Eur.J.Immunol.，17689(1987)；Pitti等，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996)；Wiley等，Immunity，3673-682(1995)；Browning等，Cell，72847-856(1993)；Armitage等Nature，35780-82(1992)，WO 97/01633，公開于1997年1月16日；WO 97/25428，公開于1997年7月17日；Marsters等，Curr.Biol.，8525-528(1998)；Chicheportiche等，Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Hahne等，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；WO98/28426，公開于1998年7月2日；WO98/46751，公開于1998年10月22日；WO/98/18921，公開于1998年5月7日；Moore等，Science，285260-263(1999)；Shu等，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；Schneider等，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay等，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999)]。在這些分子中，TNF-α，TNF-β，CD30配體，4-1BB配體，Apo-1配體，Apo-2配體(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配體(TWEAK)已被報(bào)告參與細(xì)胞凋亡。
TNF家族的各種分子在免疫系統(tǒng)的功能或發(fā)育中也具有所聲稱(purported)的作用[Gruss等，Blood，853378(1995)]。Zheng等已報(bào)告TNF參與CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的刺激后凋亡[Zheng等，Nature，377348-351(1995)]。其它研究人員已報(bào)告CD30配體可能參與胸腺自反應(yīng)性T細(xì)胞的缺失[Amakawa等，Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed CellDeath，Abstr.No.10，(1995)]。CD40配體活化B細(xì)胞的很多功能，包擴(kuò)增殖，免疫球蛋白分泌，及存活[Renshaw等，J.Exp.Med.，1801889(1994)]。另一最近鑒定的TNF家族細(xì)胞因子，TALL-1(BlyS)，已被報(bào)告在一些情況下可誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及免疫球蛋白分泌。[Moore等，見上文；Schneider等，見上文；Mackay等，J.Exp.Med.，1901697(1999)；Shu等，J.Leukocyte Biol.，65680-683(1999)；Gross等，Nature，404995-999(2000)]。
小鼠Fas/Apo-1受體或配體基因(分別叫做lpr和gld)的突變與一些自身免疫病相關(guān)，表明Apo-1配體可能在調(diào)節(jié)外周的自反應(yīng)性淋巴細(xì)胞克隆缺失中起作用[Krammer等，Curr.Op.Immunol.，6279-289(1994)；Nagata等，Science，2671449-1456(1995)]。據(jù)報(bào)告，Apo-1配體也誘導(dǎo)CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的刺激后凋亡，并可能參與活化的淋巴細(xì)胞在不再被需要時(shí)的去除[Krammer等，見上文；Nagata等，見上文]。據(jù)報(bào)道，特異性結(jié)合Apo-1受體的激動(dòng)劑小鼠單克隆抗體表現(xiàn)出與TNF-α相當(dāng)或類似的殺細(xì)胞活性[Yonehara等，J.Exp.Med.，1691747-1756(1989)]。
在文獻(xiàn)中已報(bào)告，被稱為OPG配體的TNF相關(guān)配體(也稱為RANK配體，TRANCE，或ODF)參與一些免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)。WO98/28426(公開于1998年7月2日)將此配體(本文指RANK配體)描述為2型跨膜蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白的可溶形式可誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的成熟，提高CD1α+樹突細(xì)胞在MLR中的異刺激(allo-stimulatory)能力，并在TGF-β存在時(shí)增加體外的有活力的人外周血T細(xì)胞的數(shù)量。[也見，Anderson等，Nature，390175-179(1997)]。WO98/28426也披露所述配體可提高一種巨噬細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系(稱做RAW264.7；ATCC TIB71)的TNF-α生產(chǎn)，但不刺激那些腫瘤細(xì)胞的一氧化氮生產(chǎn)。
文獻(xiàn)中已探討OPG配體/TRANCE/ODF在調(diào)控樹突細(xì)胞活性[見例如Wong等，J.Exp.Med.，1862075-2080(1997)；Wong等，J.Leukocyte Biol.，65715-724(1999)；Josien等，J.Immunol.，1622562-2568(1999)；Josien等，J.Exp.Med.，191495-501(2000)]及影響T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的活化[見例如Bachmann等，J.Exp.Med.，1891025-1031(1999)；Green等，J.Exp.Med.，1891017-1020(1999)]中推定的作用。Kong等，Nature，397315-323(1999)報(bào)道了攜帶已受損的opgl基因的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥，破骨細(xì)胞缺乏，并表現(xiàn)出T和B淋巴細(xì)胞的早期分化的缺陷。Kong等進(jìn)一步報(bào)告T細(xì)胞在體內(nèi)的系統(tǒng)性活化可造成OPGL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨損失的增加。[Kong等，Nature，402304-308(1999)]。
由這些TNF家族細(xì)胞因子介導(dǎo)的多種細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，據(jù)信是從它們結(jié)合到特異性細(xì)胞受體開始的。以前鑒定出大約為55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)的兩種獨(dú)特的TNF受體[Hohman等，J.Biol.Chem.，26414927-14934(1989)；Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.，873127-3131(1990)；EP 417,563，公開于1991年3月20日；Loetscher等，Cell，61351(1990)；Schall等，Cell，61361(1990)；Smith等，Science，2481019-1023(1990)；Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，882830-2834(1991)；Goodwin等，Mol.Cell.Biol.，113020-3026(1991)]。發(fā)現(xiàn)那些TNFRs共享包括胞外，跨膜和胞內(nèi)區(qū)的細(xì)胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)。自然發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)受體的胞外部分都是可溶性TNF結(jié)合蛋白[Nophar，Y.等，EMBO J.，93269(1990)；和Kohno，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，878331(1990)；Hale等，J.Cell.Biochem.Supplement 15F，1991，p.113(P424)]。
1型和2型TNFRs的胞外部分(TNFR1和TNFR2)含有從NH2末端開始，命名從1到4的四個(gè)半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(CRDs)的重復(fù)性氨基酸序列模式。[Schall等，見上文；Loetscher等，見上文；Smith等，見上文；Nophar等，見上文；Kohno等，見上文；Banner等，Cell，73431-435(1993)]。類似的CRDs的重復(fù)性模式存在于多個(gè)其它細(xì)胞表面蛋白，包括p75神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)[Johnson等，Cell，47545(1986)；Radeke等，Nature，325593(1987)]，B細(xì)胞抗原CD40[Stamenkovic等，EMBO J.，81403(1989)]，T細(xì)胞抗原OX40[Mallet等，EMBO J.，91063(1990)]以及Fas抗原[Yonehara等，見上文及Itoh等，Cell，66233-243(1991)]。CRDs也被發(fā)現(xiàn)在休普氏和粘液瘤痘病毒的可溶性類TNFR(sTNFR)T2蛋白中[Upton等，Virology，1602029(1987)；Smith等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，176335(1991)；Upton等，Virology，184370(1991)]。這些序列的最佳比對(duì)表明所述半胱氨酸殘基的位置是高度保守的。這些受體有時(shí)共同稱為TNF/NGF受體超家族的成員。
現(xiàn)已鑒定的TNF家族配體，除了淋巴毒素-α，主要為II型跨膜蛋白，它們的C末端位于胞外。相比之下，現(xiàn)在鑒定的TNF受體(TNFR)家族的多數(shù)受體主要為I型跨膜蛋白。然而，在TNF配體和受體家族中，發(fā)現(xiàn)家族成員之間鑒定出的同一性主要存在于胞外區(qū)(″ECD″)。若干個(gè)TNF家族的細(xì)胞因子，包括TNF-α，Apo-1配體和CD40配體，在細(xì)胞表面被蛋白酶剪切；每種情況下所得的蛋白通常形成具有可溶性細(xì)胞因子作用的同型三聚體分子。TNF受體家族蛋白也經(jīng)常被蛋白酶剪切以釋放能作為同質(zhì)(cognate)細(xì)胞因子的抑制物的可溶性受體ECD。
稱為RANK的TNFR家族成員，已被鑒定為OPG配體的受體(見WO98/28426公開于1998年7月2日；Anderson等，Nature，390175-179(1997)；Lacey等，Cell，93165-176(1998)。另一TNFR相關(guān)分子，叫做OPG(FDCR-1或OCIF)，也已被鑒定為OPG配體的受體。[Simonet等，Cell，89309(1997)；Yasuda等，Endocrinology，1391329(1998)；Yun等，J.Immunol.，1616113-6121(1998)]。見上文的Yun等，披露了OPG/FDCR-1/OCIF可以膜結(jié)合的形式和分泌的形式表達(dá)，并且在免疫系統(tǒng)細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞，EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系和扁桃體B細(xì)胞上具有限制性表達(dá)的模式。Yun等也披露在B細(xì)胞和樹突細(xì)胞中，OPG/FDCR-1/OCIF的表達(dá)可被參與B細(xì)胞活化的分子CD40上調(diào)。然而，Yun等承認(rèn)OPG/FDCR-1/OCIF如何在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中作用仍是未知的。
最近，已鑒定出TNFR家族的其它成員。在Bulow等，Science，278138-141(1997)中，研究人員描述了稱為跨膜活化物和CAML相互作用子或″TACI″的血漿膜受體。據(jù)報(bào)告，所述TACI受體含有TNF-R家族特征的半胱氨酸富集基序。在體外試驗(yàn)中，TACI在轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞表面與TACI特異性抗體的交聯(lián)導(dǎo)致了NF-KB的活化。[也見，WO 98/39361公開于September 18，1998]。TACI敲出小鼠被報(bào)告具有超反應(yīng)性B細(xì)胞，而BCMA裸鼠沒有可辨別的基因型[Yan等，Nature Immunology，2638-643(2001)；vonBulow等，Immunity，14573-582(2001)；Xu等，Mol.Cell.Biology，214067-4074(2001)]。
Laabi等，EMBO J.，113897-3904(1992)報(bào)告鑒定了一種叫做″BCM″的新基因，據(jù)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與B細(xì)胞最終成熟同時(shí)。所述BCM正常cDNA的開放閱讀框架預(yù)測(cè)了具有單個(gè)跨膜區(qū)的長(zhǎng)為184個(gè)氨基酸的多肽。這些研究人員后來(lái)命名這個(gè)基因?yàn)椤錌CMA″。[Laabi等，Nucleic Acids Res.，221147-1154(1994)]。據(jù)報(bào)告，BCMA mRNA的表達(dá)在代表前B淋巴細(xì)胞階段的人惡性B細(xì)胞系中缺乏，因而，據(jù)信其與淋巴細(xì)胞的分化階段相關(guān)[Gras等，Int.Immunology，71093-1106(1995)]。Madry等，Int.Immunology，101693-1702(1998)中描述了鼠BCMA cDNA的克隆。據(jù)報(bào)告，所述鼠BCMAcDNA可編碼185個(gè)氨基酸的多肽，該多肽與人BCMA多肽具有62％的同一性。鼠和人BCMA蛋白序列的比對(duì)表明，在N末端區(qū)有六個(gè)半胱氨酸的保守基序，由此推測(cè)所述BCMA蛋白屬于TNFR超家族[Madry等，見上文]。
據(jù)報(bào)告，Tall-1(Blys)配體與TACI和BCMA受體結(jié)合[Gross等，見上文(2000)；Thompson等，J.Exp.Med.，192129-135(2000)；Yan等，見上文(2000)；Marsters等，Curr.Biol.，10785-758(2000)；WO 00/40716，公開于2000年7月13日；WO 00/67034，公開于2000年11月9日]。TACI和BCMA均被報(bào)告與已知為April的配體結(jié)合。
在Marsters等，Curr.Biol.，6750(1996)中，研究人員描述了叫做Apo-3的全長(zhǎng)天然序列人多肽，該多肽的胞外半胱氨酸富集型重復(fù)表現(xiàn)出與TNFR家族的相近性，并因?yàn)樗税麧{死亡結(jié)構(gòu)域序列而與TNFR1和CD95類似[也見Marsters等，Curr.Biol.，61669(1996)]。Apo-3也被其它研究人員稱為DR3，wsl-1，TRAMP，和LARD[Chinnaiyan等，Science，274990(1996)；Kitson等，Nature，384372(1996)；Bodmer等，Immunity，679(1997)；Screaton等，Proc.Natl.Acad.Sci.，944615-4619(1997)]。
Pan等已公開另一被稱為″DR4″的TNF-受體家族成員[Pan等，Science，276111-113(1997)；也見WO98/32856公開于July 30，1998]。所述DR4被報(bào)告含有能構(gòu)成(engage)細(xì)胞自殺裝置的胞漿死亡結(jié)構(gòu)域。Pan等披露DR4據(jù)信為配體Apo2L/TRAIL的受體。
在Sheridan等，Science，277818-821(1997)及Pan等，Science，277815-818(1997)中，描述了另一據(jù)信為Apo2L/TRAIL的受體的分子[也見，WO98/51793公開于1998年11月19日；WO98/41629公開于1998年9月24日]。那種分子被稱為DR5(它也被稱為Apo-2；TRAIL-R，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER[Screaton等，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等，Nature.Genetics，17141-143(1997)；WO98/35986公開于1998年8月20日；EP870,827公開于1998年10月14日；WO98/46643公開于1998年10月22日；WO99/02653公開于1999年1月21日；WO99/09165公開于1999年2月25日；WO99/11791公開于1999年3月11日]。據(jù)報(bào)告，DR5與DR4一樣，包含胞漿死亡結(jié)構(gòu)域并能夠傳導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)。在Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)見Hymowitz等，Molecular Cell，4563-571(1999)所述。
而另一含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體DR6，最近才被鑒定出來(lái)[Pan等，F(xiàn)EBSLetters，431351356(1998)]。除去含有四個(gè)公認(rèn)的胞外半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域及一個(gè)胞漿死亡結(jié)構(gòu)域，據(jù)信DR6包含一個(gè)公認(rèn)與脯氨酸富集基序在胞漿區(qū)重疊的亮氨酸拉鏈序列。該脯氨酸富集基序類似于很多胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子內(nèi)的與src同源3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的序列。與上述其它包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體相比之下，DR6不誘導(dǎo)凋亡敏感性指示細(xì)胞系-MCF-7-的細(xì)胞死亡，提示該受體具有選擇性作用。與這一研究一致地，DR6目前據(jù)信與例如FADD、RAIDD和RIP的包含死亡結(jié)構(gòu)域的銜接分子無(wú)關(guān)，其介導(dǎo)來(lái)自活化死亡受體的下游信號(hào)[Pan等，F(xiàn)EBS Lett.，431351(1998)]。
還有一組最近鑒定出來(lái)被稱為″誘騙(decoy)受體″的受體，據(jù)信它作為抑制物，而不是信號(hào)傳導(dǎo)物起作用。該組包括DCR1(也稱為TRID，LIT或TRAIL-R3)[Pan等，Science，276111-113(1997)；Sheridan等，Science，277818-821(1997)；McFarlane等，J.Biol.Chem.，27225417-25420(1997)；Schneider等，F(xiàn)EBS Letters，416329-334(1997)；Degli-Esposti等，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；及Mongkolsapaya等，J.Immunol.，16036(1998)]和DCR2(也叫做TRUNDD或TRAIL-R4)[Marsters等，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Pan等，F(xiàn)EBS Letters，42441-45(1998)；Degli-Esposti等，Immunity，7813-820(1997)]這兩種細(xì)胞表面分子，及OPG[Simonet等，見上文；Emery等，見下文]和DCR3[Pitti等，Nature，396699-703(1998)]這兩種分泌性可溶蛋白。
TNFR家族其它新鑒定的成員包括CAR1，HVEM，GITR，ZTNFR-5，NTR-1，和TNFL1[Brojatsch等，Cell，87845-855(1996)；Montgomery等，Cell，87427-436(1996)；Marsters等，J.Biol. Chem.，27214029-14032(1997)；Nocentini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946216-6221(1997)；Emery等，J.Biol.Chem.，27314363-14367(1998)；WO99/04001公開于1999年1月28日；WO99/07738公開于February 18，1999；WO99/33980公開于1999年7月8日]。
如Tewari等最近所綜述，TNFR1，TNFR2和CD40通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化調(diào)節(jié)前炎性細(xì)胞因子和共刺激細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，以及細(xì)胞粘附分子的表達(dá)[Tewari等，Curr.Op.Genet.Develop.，639-44(1996)]。NF-κB為二聚化轉(zhuǎn)錄因子家族的前體，其亞單位含有保守的Rel區(qū)[Verma等，Genes Develop.，92723-2735(1996)；Baldwin，Ann.Rev.Immunol.，14649-681(1996)]。NF-κB的潛伏形式與IκB抑制物家族的成員復(fù)合；當(dāng)作為對(duì)某些刺激的應(yīng)答IκB被滅活時(shí)，釋放的NF-κB移位到核，在那里它與特異性DNA序列結(jié)合并活化基因的轉(zhuǎn)錄。如上所述，現(xiàn)已鑒定的TNFR成員包括或者缺乏胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域區(qū)域。一些缺乏死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR分子，如TNFR2，CD40，HVEM，和GITR，能夠調(diào)節(jié)NF-κB的活性。[見例如Lotz等，J.Leukocyte Biol.，601-7(1996)]。
TNF家族細(xì)胞因子及它們的受體的綜述，見Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)；Gruss和Dower，見上文，和Nagata，Cell，88355-365(1997)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了TACI抗體和使用TACI抗體的方法。所述抗體可以發(fā)揮拮抗劑或激動(dòng)劑的作用，并且發(fā)現(xiàn)可以用于體外(in vitro)，原位(in situ)或體內(nèi)(in vivo)診斷或治療與TALL-1，APRIL，TACI，BCMA，TACIs，或BR3的存在(或缺乏)相關(guān)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或病理情況。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括一種抗-TACI抗體，它能特異性結(jié)合人TACI和/或能調(diào)節(jié)與TACI和/或其配體相關(guān)的生物學(xué)活性，因此可以用于治療諸如免疫相關(guān)疾病等各種疾病和病理情況。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，抗-TACI抗體活化TACI。在另一實(shí)施方案中，抗-TACI抗體抑制B-細(xì)胞增殖或存活，伴有或不伴有對(duì)BlyS與TACI結(jié)合的阻斷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用TACI抗體阻斷或中和TALL-1或April與TACI之間相互作用的方法。所述拮抗劑還可以阻斷或中和TALL-1與TACI和/或BCMA的相互作用。例如，本發(fā)明提供了一種方法，它包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如白細(xì)胞(優(yōu)選B細(xì)胞)暴露于一或多種TACI抗體，抗體的用量可以有效降低、中和或者阻斷TALL-1配體或TACI受體的活性。所述細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或哺乳動(dòng)物中，例如患有免疫相關(guān)疾病或癌癥的哺乳動(dòng)物中。
本發(fā)明的典型方法包括，治療哺乳動(dòng)物中與TALL-1或APRIL表達(dá)和/或活性增加(increased)或增強(qiáng)(enhanced)相關(guān)、或者由TALL-1或APRIL表達(dá)和/或活性增加或增強(qiáng)引起的病理情況或疾病的方法。在所述治療方法中，可以施用優(yōu)選阻斷或減少TALL-1配體和/或APRIL配體的各自受體結(jié)合或活化的TACI抗體。任選地，所述方法中用到的TACI抗體能阻斷或中和TALL-1以及APRIL兩者的活性，例如，一種阻斷或中和TALL-1和APRIL兩者的活性的雙重拮抗劑(dual antagonist)。任選地，所述方法中用到的拮抗劑分子能阻斷或中和TALL-1的活性，但不能阻斷或中和APRIL的活性。所述方法涉及使用單一類型的拮抗劑分子或者使用兩種或更多種類型的拮抗劑分子的組合。
本發(fā)明還提供了包含TACI抗體的組合物。任選地，本發(fā)明組合物包括可藥用載體或稀釋劑。優(yōu)選所述組合物包括一或多種TACI抗體，該抗體的量可以有效治療病理情況或疾病。
本發(fā)明還提供了制品(articles of manufacture)和試劑盒，它們包括一或多種TACI抗體。
在更具體的實(shí)施方案中，提供了特異性結(jié)合TACI受體的抗體，所述受體包含SEQ ID NO3的氨基酸2-166。任選地，所述抗體不結(jié)合BCMA受體，并且所述抗體是單克隆抗體。任選地，所述單克隆抗體包含ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤所分泌的1G10.1.5抗體；ATCC保藏號(hào)為PTA-4298的雜交瘤所分泌的5B6.3.10抗體；或ATCC保藏號(hào)為PTA-4299的雜交瘤所分泌的6D11.3.1抗體。
本發(fā)明還提供了與下述單克隆抗體結(jié)合相同表位的單克隆抗體ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的1G10.1.5單克隆抗體；ATCC保藏號(hào)為PTA-4298的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的5B6.3.10單克隆抗體；ATCC保藏號(hào)為PTA-4299的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的6D11.3.1單克隆抗體；ATCC保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤細(xì)胞系7B6.15.11所產(chǎn)生的抗體；或ATCC保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤4C7.2.1所產(chǎn)生的抗體。
在另一些具體實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生單克隆抗體1G10.1.5并且ATCC保持為PTA-4297的雜交瘤細(xì)胞系，由ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤分泌的單克隆抗體1G10.1.5，產(chǎn)生單克隆抗體5B6.3.10并且ATCC保藏號(hào)為PTA-4298的雜交瘤細(xì)胞系，由ATCC保藏號(hào)為PTA-4298的雜交瘤分泌的單克隆抗體5B6.3.10，產(chǎn)生單克隆抗體6D11.3.1并且ATCC保藏號(hào)為PTA-4299的雜交瘤細(xì)胞系，由ATCC保藏號(hào)為PTA-4299的雜交瘤分泌的單克隆抗體6D11.3.1，產(chǎn)生單克隆抗體G10.1.5并且ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤細(xì)胞系，由ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤分泌的單克隆抗體G10.1.5，產(chǎn)生單克隆抗體并且ATCC保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤細(xì)胞系7B6.15.11，由ATCC保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤7B6.15.11產(chǎn)生的單克隆抗體，以及產(chǎn)生單克隆抗體并且ATCC保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤細(xì)胞系4C7.2.1，由ATCC保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤4C7.2.1產(chǎn)生的單克隆抗體。
本發(fā)明還提供了分離的抗-TACI受體單克隆抗體，其包含與含有SEQID NO3之氨基酸2-166的TACI受體結(jié)合并競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜交瘤ATCCPTA-4297產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體結(jié)合的抗體；分離的抗-TACI受體單克隆抗體，其包含與含有SEQ ID NO3之氨基酸2-166的TACI受體結(jié)合并競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜交瘤ATCC PTA-4298產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體結(jié)合的抗體；以及分離的抗-TACI受體單克隆抗體，其包含與含有SEQ ID NO3之氨基酸2-166的TACI受體結(jié)合并競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜交瘤ATCC PTA-4299產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體結(jié)合的抗體。
在另一實(shí)施方案中，所述抗體是嵌合抗-TACI抗體，它特異性結(jié)合TACI多肽并包含(a)自ATCC保藏號(hào)為PTA-4297的雜交瘤所分泌的1G10.1.5抗體衍生的序列；(b)自ATCC保藏號(hào)為PTA-4298的雜交瘤所分泌的5B6.3.10抗體衍生的序列；(c)自ATCC保藏號(hào)為PTA-4299的雜交瘤所分泌的6D11.3.1抗體衍生的序列；(d)自ATCC保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤7B6.15.11所分泌的抗體衍生的序列。任選地，所述抗體都是人源化抗體或(e)自ATCC保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤4C7.2.1所分泌的抗體衍生的序列。
在另一實(shí)施方案中，抗-TACI受體抗體與一或多種選自聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯(polyoxyalkylene)非蛋白聚合物相連，或與細(xì)胞毒性劑或酶相連，或與放射性同位素、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物相連。


圖1A和1B顯示編碼天然序列人TACI的多核苷酸序列(SEQ ID NO1)(反向互補(bǔ)序列見SEQ ID NO2)及其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。圖1C顯示TACI剪接變體“hTACI(265)”(SEQ ID NO17)。
圖2顯示編碼天然序列人BCMA的多核苷酸序列(SEQ ID NO4)(反向互補(bǔ)序列見SEQ ID NO5)及其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖3顯示編碼天然序列人TALL-1的多核苷酸序列(SEQ ID NO7)(反向互補(bǔ)序列見SEQ ID NO8)及其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO9)。
圖4A-4B顯示編碼天然序列人APRIL的多核苷酸序列(SEQ ID NO10)(反向互補(bǔ)序列見SEQ ID NO11)及其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
圖5A顯示編碼天然序列人TACIs的多核苷酸序列(SEQ ID NO13)(起始密碼子和終止密碼子用下劃線表示)，圖5B顯示其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
圖6A顯示編碼天然序列人BR3的多核苷酸序列(SEQ ID NO15)(起始密碼子和終止密碼子用下劃線表示)，圖6B顯示其公認(rèn)的氨基酸序列(SEQID NO16)。
圖7A-7B例舉了命名為參比蛋白(“Comparison Protein”)的氨基酸序列與命名為“PRO”的氨基酸序列之間序列同一性的計(jì)算方法。為了本發(fā)明的目的，“PRO”序列可以是本文圖中的TACI，BCMA，TALL-1，APRIL，TACIs，或BR3序列。
圖8顯示ELISA試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)檢測(cè)1D10，1G10，5B6和6D11抗體與TACI-IgG，BCMA-IgG和CD4-IgG(對(duì)照)結(jié)合的能力。
圖9的數(shù)據(jù)表明TACI是TALL-1刺激的負(fù)調(diào)節(jié)劑。圖9顯示抗-TACI抗體5B6和6D11阻斷B淋巴細(xì)胞增殖。
圖10顯示FACS分析結(jié)果，其中抗-TACI mAb識(shí)別并結(jié)合表達(dá)TACI的IM9細(xì)胞。
圖11顯示(A)小鼠中產(chǎn)生的抗人TACI的三種單克隆抗體(6D11，7B6，和4C7)與293細(xì)胞結(jié)合，所述細(xì)胞被0.1μg全長(zhǎng)人TACI轉(zhuǎn)染24hr，并用PE-偶聯(lián)的α-小鼠IgG1第二抗體進(jìn)行FACS分析，同種型對(duì)照用灰度表示；(B)人293細(xì)胞中NF-kB活性的活化，所述細(xì)胞用全長(zhǎng)人TACI表達(dá)質(zhì)粒、1μgELAM-螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和0.1μg對(duì)照pRL-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，然后用可溶性重組人BLyS或TACI抗體6D11，7B6和4C7處理；和(C)6D11和7B6抗-TACI抗體抑制抗-CD40抗體/IL-4-誘導(dǎo)的B-細(xì)胞增殖。
發(fā)明詳述I.定義術(shù)語(yǔ)“BR3”，“BR3多肽”或“BR3受體”在本文使用時(shí)包括“天然序列BR3多肽”和“BR3變體”(在本文有進(jìn)一步限定)?！癇R3”是指，由包含圖6所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其變體或片段，包含圖6所示序列的核酸分子，其變體，及上述物質(zhì)的片段。本發(fā)明的BR3多肽可從各種來(lái)源分離，如從人組織類型或從其它來(lái)源分離，或用重組和/或合成方法制備。
“天然序列”BR3多肽包含與從天然衍生的相應(yīng)BR3多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。此種天然序列BR3多肽可從自然界分離或通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列BR3多肽”具體包括該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)和天然等位基因變體。本發(fā)明的BR3多肽包括，包含圖6B(SEQ ID NO16)中第1至184位氨基酸殘基的毗連序列或由該序列組成的BR3多肽，以及2002年3月28日公開的WO 02/24909中所述的多肽(在該文中稱為“BAFF-R”)。
BR3“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的BR3多肽。通常，BR3多肽ECD具有不到約1％的這種跨膜區(qū)和/或胞漿區(qū)，優(yōu)選不到約0.5％。應(yīng)當(dāng)懂得，所鑒定出的本發(fā)明BR3多肽的任何跨膜區(qū)是依據(jù)本領(lǐng)域鑒定疏水區(qū)類型時(shí)常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)而確定的?？缒^(qū)的確切界限各不相同，但很可能與最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一末端相差不大于5個(gè)氨基酸。BR3的ECD形式包括那些包含圖6B的1至77位或2至62位氨基酸的多肽。
“BR3變體”指與天然序列全長(zhǎng)BR3或BR3 ECD的氨基酸序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性的BR3多肽。任選地，BR3變體包括單一的半胱氨酸富集區(qū)。此種BR3變體多肽包括，例如，在全長(zhǎng)氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中，添加或缺失一或多個(gè)氨基酸殘基所形成的BR3多肽。也考慮BR3 ECD片段。通常，BR3變體多肽與圖6所示核酸分子或其具體片段編碼的BR3多肽具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。BR3變體多肽不包括天然BR3多肽序列。一般，BR3變體多肽的長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)氨基酸，通常至少大約20個(gè)氨基酸，更通常至少大約30個(gè)氨基酸，更通常至少大約40個(gè)氨基酸，更通常至少大約50個(gè)氨基酸，更通常至少大約60個(gè)氨基酸，更通常至少大約70個(gè)氨基酸，更通常至少大約80個(gè)氨基酸，更通常至少大約90個(gè)氨基酸，更通常至少大約100個(gè)氨基酸，更通常至少大約150個(gè)氨基酸，更通常至少大約200個(gè)氨基酸，更通常至少大約250個(gè)氨基酸，更通常至少大約300個(gè)氨基酸，或更長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)“TACI”或“TACI多肽”或“TACI受體”包括“天然序列TACI多肽”和“TACI變體”(在本文有進(jìn)一步限定)。“TACI”是指由包含圖1所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其變體或片段，包含圖1所示序列的核酸分子，其變體，及上述物質(zhì)的片段。本發(fā)明的TACI多肽可從各種來(lái)源分離，如從人組織類型或從其它來(lái)源分離，或用重組和/或合成方法制備。
“天然序列”TACI多肽包含與天然衍生的相應(yīng)TACI多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此種天然序列TACI多肽可從自然界分離或通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列TACI多肽”具體包括該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)和天然等位基因變體。本發(fā)明的TACI多肽包括但不限于，von Bulow等的上述文獻(xiàn)以及1998年9月11日公開的WO98/39361中所述的多肽，剪接變體(以上稱“hTACI(265)”并顯示于圖1C(SEQ ID NO17))，包含圖1(SEQ ID NO3)第1-293位氨基酸殘基所示毗連序列的TACI多肽，以及2000年7月13日公開的WO 00/40716和2001年11月5日公開的WO 01/85782中所述的多肽。
TACI“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的TACI多肽。通常，TACI多肽ECD具有不到約1％的這種跨膜區(qū)和/或胞漿區(qū)，優(yōu)選不到約0.5％。應(yīng)當(dāng)懂得，所鑒定出的本發(fā)明TACI多肽的任何跨膜區(qū)是依據(jù)本領(lǐng)域鑒定疏水區(qū)類型時(shí)常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)而確定的?？缒^(qū)的確切界限各不相同，但很可能與最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一末端相差不大于5個(gè)氨基酸。TACI的ECD形式包括von Bulow等的上述文獻(xiàn)和WO98/39361所述的多肽。
“TACI變體”指與天然序列全長(zhǎng)TACI或TACI ECD的氨基酸序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性的TACI多肽。此種TACI變體多肽包括，例如，在全長(zhǎng)氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中，添加或缺失一或多個(gè)氨基酸殘基所形成的TACI多肽。也考慮TACI ECD片段。通常，TACI變體多肽與圖1所示核酸分子或其具體片段編碼的TACI多肽具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。TACI變體多肽不包括天然TACI多肽序列。一般，TACI變體多肽的長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)氨基酸，通常至少大約20個(gè)氨基酸，更通常至少大約30個(gè)氨基酸，更通常至少大約40個(gè)氨基酸，更通常至少大約50個(gè)氨基酸，更通常至少大約60個(gè)氨基酸，更通常至少大約70個(gè)氨基酸，更通常至少大約80個(gè)氨基酸，更通常至少大約90個(gè)氨基酸，更通常至少大約100個(gè)氨基酸，更通常至少大約150個(gè)氨基酸，更通常至少大約200個(gè)氨基酸，更通常至少大約250個(gè)氨基酸，更通常至少大約300個(gè)氨基酸，或更長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)“TACIs”在本文中使用時(shí)是指，包含圖5B第1至246位殘基所示氨基酸序列、或其片段或變體、并包含一個(gè)半胱氨酸富集區(qū)的多肽。任選地，此種TACIs多肽包含圖5B第1至246位殘基所示鄰接序列。任選地，此種TACIs多肽由包含圖5A所示編碼性多核苷酸序列的核酸分子編碼。本發(fā)明的TACIs多肽可從各種來(lái)源分離，如從人組織類型或從其它來(lái)源分離，或用重組和/或合成方法制備。“天然序列”TACIs多肽包含從自然界衍生的多肽。此種天然序列TACIs多肽可從自然界分離或通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。TACIs多肽可以包含圖5B所示多肽的片段或變體，并與圖5B所示序列具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選與圖5A所示核酸序列編碼的TACIs多肽或其具體片段具有至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。此種變體多肽包括，例如，在圖5B所示氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中，添加或缺失一或多個(gè)氨基酸殘基所形成的多肽。
TACIs“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的TACIs多肽。通常，TACIs多肽ECD具有不到約1％的這種跨膜區(qū)和/或胞漿區(qū)，優(yōu)選不到約0.5％。應(yīng)當(dāng)懂得，所鑒定出的本發(fā)明TACIs多肽的任何跨膜區(qū)是依據(jù)本領(lǐng)域鑒定疏水區(qū)類型時(shí)常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)而確定的?？缒^(qū)的確切界限各不相同，但很可能與最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一末端相差不大于5個(gè)氨基酸。TACIs的ECD形式包括含圖5B的1至119位氨基酸殘基、以及任選地圖5B的1至119位毗連氨基酸殘基的多肽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“BCMA”或“BCMA多肽”或“BCMA受體”包括“天然序列BCMA多肽”和“BCMA變體”(在本文會(huì)繼續(xù)限定)。“BCMA”是指由包含圖2所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其變體，包含圖2所示序列的核酸分子，其變體，及上述物質(zhì)的片段。本發(fā)明的BCMA多肽可從各種來(lái)源分離，如從人組織類型或從其它來(lái)源分離，或用重組和/或合成方法制備。
“天然序列”BCMA多肽包含與從天然衍生的相應(yīng)BCMA多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。此種天然序列BCMA多肽可從自然界分離或通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列BCMA多肽”具體包括天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)和天然等位基因變體。本發(fā)明的BCMA多肽包括Laabi et al.，EMBO J.，113897-3904(1992)；Laabi et al.，Nucleic Acids Res.，221147-1154(1994)；Graset al.，Int.Immunology，71093-1106(1995)；Madry et al.，Int.Immunology，101693-1702(1998)；2000年11月16日公開的WO 00/50633；2000年8月31日公開的WO 00/50633中所述的多肽；以及包含圖2(SEQ ID NO6)第1-184位氨基酸殘基所示毗連序列的BCMA多肽。
BCMA“胞外區(qū)”或“ECD”指基本不含有跨膜區(qū)和胞漿區(qū)的BCMA多肽。通常，BCMA多肽ECD具有不到約1％的這種跨膜區(qū)和/或胞漿區(qū)，優(yōu)選不到約0.5％。應(yīng)當(dāng)懂得，所鑒定出的本發(fā)明BCMA多肽的任何跨膜區(qū)是依據(jù)本領(lǐng)域鑒定疏水區(qū)類型時(shí)常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)而確定的?？缒^(qū)的確切界限各不相同，但很可能與最初鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一末端相差不大于5個(gè)氨基酸。TACI的ECD形式包括Laabi et al.，EMBO J.，113897-3904(1992)；Laabi et al.，Nucleic Acids Res.，221147-1154(1994)；Gras et al.，Int.Immunology，71093-1106(1995)；Madry et al.，Int.Immunology，101693-1702(1998)所述的多肽。
“BCMA變體”是指，與天然序列BCMA或BCMA ECD的氨基酸序列具有至少大約80％的氨基酸同一性的BCMA多肽。此種BCMA變體多肽包括，例如，在全長(zhǎng)氨基酸序列的N-和/或C-末端，及一或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中，添加或缺失一或多個(gè)氨基酸殘基所形成的BCMA多肽。也考慮BCMAECD片段。通常，BCMA變體多肽與圖2所示核酸分子編碼的BCMA多肽或其具體片段具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約81％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約82％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約83％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約84％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約86％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約87％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約88％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約89％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約91％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約92％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約93％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約94％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約96％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約97％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約99％的氨基酸序列同一性。BCMA變體多肽不包括天然BCMA多肽序列。通常，BCMA變體多肽的長(zhǎng)度為至少大約10個(gè)氨基酸，通常至少大約20個(gè)氨基酸，更通常至少大約30個(gè)氨基酸，更通常至少大約40個(gè)氨基酸，更通常至少大約50個(gè)氨基酸，更通常至少大約60個(gè)氨基酸，更通常至少大約70個(gè)氨基酸，更通常至少大約80個(gè)氨基酸，更通常至少大約90個(gè)氨基酸，更通常至少大約100個(gè)氨基酸，更通常至少大約150個(gè)氨基酸，更通常至少大約200個(gè)氨基酸，更通常至少大約250個(gè)氨基酸，更通常至少大約300個(gè)氨基酸，或更長(zhǎng)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“TALL-1”或“TALL-1多肽”包括“天然序列TALL-1多肽”和“TALL-1變體”?！癟ALL-1”是指由包含圖3所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其變體，包含圖3所示序列的核酸分子，其變體，以及具有天然序列TALL-1的生物活性的上述物質(zhì)的片段。優(yōu)選TALL-1的變體與圖3所示天然序列TALL-1多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少90％，還更優(yōu)選至少95％的氨基酸序列同一性?！疤烊恍蛄小盩ALL-1多肽包含與從天然衍生的相應(yīng)TALL-1多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此種天然序列TALL-1多肽可從自然界分離或用重組和/或合成途徑來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)“天然序列TALL-1多肽”具體包含該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)以及天然等位基因變體。術(shù)語(yǔ)“TALL-1”包括下述文獻(xiàn)中描述的多肽Shu等，GenBank登錄號(hào)AF136293；1998年5月7日公開的WO98/18921；1998年10月7日公開的EP 869,180；1998年6月25日公開的WO98/27114；1999年3月18日公開的WO99/12964；1999年7月8日公開的WO99/33980；1998年10月7日公開的EP 869,180；Moore等，見上文；Schneider等，見上文；和Mukhopadhyay等，見上文。
本文所用術(shù)語(yǔ)“APRIL”或“APRIL受體”包括“天然序列APRIL多肽”和“APRIL變體”?！癆PRIL”是指由包含圖4A-4B所示多核苷酸序列的核酸分子編碼的多肽及其變體，包含圖4A-4B所示序列的核酸分子，其變體，以及具有天然序列APRIL的生物活性的上述物質(zhì)的片段。優(yōu)選APRIL的變體與圖4A-4B所示天然序列APRIL多肽具有至少80％，更優(yōu)選至少90％，還更優(yōu)選至少95％的氨基酸序列同一性?！疤烊恍蛄小盇PRIL多肽包含與從天然衍生的相應(yīng)APRIL多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此種天然序列APRIL多肽可從自然界分離或用重組和/或合成途徑來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)“天然序列APRIL多肽”具體包含該多肽的天然截短形式或分泌形式(例如胞外區(qū)序列)，天然變體形式(例如旁路剪接形式)以及天然等位基因變體。術(shù)語(yǔ)“APRIL”包括下述文獻(xiàn)中描述的多肽Hahne et al.，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；GenBank登錄號(hào)AF046888；1999年1月7日公開的WO99/00518；1999年7月15日公開的WO99/35170；1999年3月18日公開的WO99/12965；1999年7月8日公開的WO99/33980；1997年9月18日公開的WO97/33902；1999年3月11日公開的WO99/11791；1999年3月28日公開的EP 911,633；和1999年10月7日公開的WO99/50416。
雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格度”可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定，通常根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算得出。一般而言，為了正確退火，較長(zhǎng)的探針需要較高溫度，而較短的探針需要較低溫度。雜交通常取決于變性的DNA在低于解鏈溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)序列時(shí)的重退火能力。探針和雜交序列之間所需同源程度越高，則可使用的相對(duì)溫度越高。結(jié)果是，相對(duì)溫度較高將使反應(yīng)條件趨于更加嚴(yán)格，而較低溫度則使反應(yīng)的嚴(yán)格度較小。有關(guān)雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度的其它細(xì)節(jié)和解釋，見Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文中“嚴(yán)格條件”或“高度嚴(yán)格條件”可以定義為(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫，0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，在50℃進(jìn)行洗滌；(2)使用變性劑，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉在42℃進(jìn)行雜交；或者(3)在42℃使用50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5xDenhardt′s溶液、超聲處理的鮭精DNA(50μg/m1)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌，于55℃在50％甲酰胺中洗滌，接著于55℃用含EDTA的0.1xSSC進(jìn)行高度嚴(yán)格洗滌。
“中度嚴(yán)格條件”可以按照Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989的定義，包括使用嚴(yán)格度低于前述的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度，離子強(qiáng)度和SDS％)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)實(shí)例是，于37℃在如下組成的溶液中過(guò)夜溫育20％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA，接著于約37-50℃在1xSSC中洗滌雜交膜。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員懂得如何根據(jù)需要調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等條件，以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。
當(dāng)核酸與另一種核酸序列產(chǎn)生功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，該核酸被“可操作相連”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白時(shí)，編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，其與該編碼序列是可操作相連的；核糖體結(jié)合位點(diǎn)處在促進(jìn)翻譯的位置上時(shí)，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA是鄰接的，而且，在分泌前導(dǎo)序列的情況中，是鄰接并處在同一個(gè)閱讀框中的。但增強(qiáng)子不是必需鄰接的。連接可通過(guò)，例如，在便利的限制性位點(diǎn)連接來(lái)完成的。如果不存在這類位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指所有天然的L-α-氨基酸。本定義包括正亮氨酸、鳥氨酸和同型半胱氨酸。氨基酸通過(guò)單字母或三字母命名之一鑒別AspD天冬氨酸 IleI異亮氨酸ThrT蘇氨酸LeuL亮氨酸SerS絲氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH組氨酸GlyG甘氨酸LysK賴氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸 ThpW色氨酸ValV纈氨酸GlnQ谷氨酰胺MetM蛋氨酸AsnN天冬酰胺在序列列表和圖中，可利用特定的其它單字母或三字母命名指代或鑒定序列中給定位置的兩個(gè)或更多氨基酸或核苷酸。
本文所述配體或受體多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”，是指候選序列的氨基酸殘基，在進(jìn)行序列對(duì)比并在必要時(shí)導(dǎo)入缺口以獲取最大百分比的序列同一性、而不將任何保守取代視為序列同一性時(shí)，與本文所述配體或受體序列的氨基酸殘基相同的百分?jǐn)?shù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域各種方法進(jìn)行序列對(duì)比以便測(cè)定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定測(cè)量對(duì)比所用的適宜參數(shù)，包括針對(duì)所比較的序列全長(zhǎng)獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然而，為此目的，氨基酸序列同一性％值是按照下述使用序列對(duì)比計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2而獲得的。ALIGN-2序列對(duì)比計(jì)算機(jī)程序的作者是Genentech，Inc.，其源代碼和用戶數(shù)據(jù)已經(jīng)提交地處Washington D.C.，20559的美國(guó)版權(quán)局，其美國(guó)版權(quán)注冊(cè)登記號(hào)為TXU510087。公眾通過(guò)Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)為在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選在數(shù)碼UNIX V4.0D使用而進(jìn)行編輯。ALIGN-2程序設(shè)定了所有序列對(duì)比參數(shù)并且不變。
本文中術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”是指抗體樣分子，其將異源蛋白(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)功能組合。結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括具有所需結(jié)合特異性但并非抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即為“異源”)的氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包括受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的鄰接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”使用其最廣泛含義，包括在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地阻斷、抑制、或中和TALL-1多肽和/或APRIL多肽的一或多種生物活性的任何分子。TALL-1和APRIL多肽的這類生物活性的實(shí)例包括，TALL-1或APRIL與TACI、BCMA、TACIs或BR3的結(jié)合，NF-KB的活化和B細(xì)胞對(duì)增殖及Ig分泌的活化，免疫相關(guān)疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和狼瘡，以及在文獻(xiàn)中進(jìn)一步報(bào)告的活性。拮抗劑可通過(guò)直接或間接方式起作用。例如，拮抗劑可以通過(guò)與TACIs或TACI結(jié)合，直接導(dǎo)致在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地阻斷、抑制、或中和TALL-1多肽和/或APRIL多肽的一或多種生物活性。所述拮抗劑也可例如，通過(guò)阻斷或抑制其與BCMA或BR3或另一效應(yīng)子分子的結(jié)合，間接導(dǎo)致在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地阻斷、抑制、或中和TALL-1多肽和/或APRIL多肽的一或多種生物活性。拮抗劑分子可以包含“雙重”拮抗劑活性，其中該分子能夠部分地或完全地阻斷、抑制或中和TALL-1和APRIL兩者的生物活性。
術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”使用其最廣泛含義，包括在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化TACI和/或TACIs多肽的一或多種生物活性的任何分子。TACIs和TACI的所述生物活性的實(shí)例包括，NF-KB的活化，免疫球蛋白生成和分泌的誘導(dǎo)以及細(xì)胞增殖。激動(dòng)劑可通過(guò)直接或間接方式起作用。例如，激動(dòng)劑直接結(jié)合TACIs或TACI，導(dǎo)致受體活化或信號(hào)傳導(dǎo)，從而在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化TACI和/或TACIs多肽的一或多種生物活性。所述激動(dòng)劑也可例如，刺激另一效應(yīng)子分子，由該分子導(dǎo)致TACIs或TACI受體活化或信號(hào)傳導(dǎo)，從而通過(guò)間接作用，在體外、原位、或體內(nèi)，部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化TACI和/或TACIs多肽的一或多種生物活性。
本文中術(shù)語(yǔ)“抗體”使用其最廣泛含義，具體包括，例如，抗BR3、TACIs、TALL-1、APRIL、TACI或BCMA的單個(gè)單克隆抗體，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，及抗體的片段。本文中“抗體”包括完整免疫球蛋白或抗體分子，多克隆抗體，多特異性抗體(即由至少兩種完整抗體形成的雙特異性抗體)和免疫球蛋白片段(例如Fab，F(xiàn)(ab’)2，或Fv)，只要其顯示本文所述任何所需激動(dòng)特性或拮抗特性。
抗體一般是顯示與特定抗原的結(jié)合特異性的蛋白或多肽。天然抗體通常是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成的異四聚體蛋白。典型地，每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同種型重鏈的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則排列的鏈間二硫橋。每條重鏈在其一個(gè)末端具有可變區(qū)(VH)，隨后是幾個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在其一個(gè)末端具有可變區(qū)(VL)，在其另一末端具有恒定區(qū)；輕鏈恒定區(qū)與重鏈第一恒定區(qū)并列，輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)并列。一般認(rèn)為，一些特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的接觸面[Chothia et al.，J.Mol.Biol.，186651-663(1985)；Novotny and Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-4596(1985)]。來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體輕鏈可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，歸為兩種截然不同的類型(即kappa和lambda)中的一類。免疫球蛋白根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可分成不同的類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾種可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgG-1，IgG-2，IgG-3，和IgG-4；IgA-1和IgA-2。與各類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱為alpha，delta，epsilon，gamma，和mu。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二價(jià)抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由多個(gè)抗體片段形成的多特異性抗體。
術(shù)語(yǔ)“可變”是指可變區(qū)一些部分的序列在不同抗體之間有很大差異，它們可在各個(gè)具體抗體針對(duì)其具體抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個(gè)稱為超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中高度保守的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個(gè)FR(分別為FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4)，主要采取β折疊構(gòu)型，由三個(gè)超變區(qū)相連，形成環(huán)狀連接，在某些情況下可形成所述β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的CDR通過(guò)FR緊密相連，彼此十分靠近，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)[見Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1987)]。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，例如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性作用。
本文中術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指來(lái)自基本均一的抗體群的抗體，即，除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，僅針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。
本文中單克隆抗體包括嵌合抗體、雜合抗體和重組抗體，以及抗體片段(例如Fab，F(xiàn)(ab’)2和Fv)，所述抗體通過(guò)將目的抗體的可變區(qū)(包括高變區(qū))與一種恒定區(qū)剪接而產(chǎn)生(例如“人源化”抗體)，或?qū)⑤p鏈與重鏈剪接而產(chǎn)生，或?qū)?lái)自一個(gè)物種的鏈和來(lái)自另一物種的鏈剪接而產(chǎn)生，或與異源蛋白融合而產(chǎn)生，不必考慮物種的起源或免疫球蛋白的種類或亞類，只要它們顯示所需生物活性或特性。見例如美國(guó)專利4,816,567和Mage et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97(MarcelDekker，Inc.New York，1987)。
因此，修飾詞“單克隆”表明該抗體來(lái)自基本均一的抗體群的特點(diǎn)，不解釋為需通過(guò)任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過(guò)由Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過(guò)重組DNA法進(jìn)行制備(例如見美國(guó)專利4,816,567)。“單克隆抗體”還可利用例如McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)所述技術(shù)從噬菌體庫(kù)中分離。
“人源化”非人(例如小鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白來(lái)源的最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈，或它們的片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合序列)。大多數(shù)場(chǎng)合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體(recipient)抗體)，但其中該受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的小鼠、大鼠、或家兔等非人物種抗體(供體(donor)抗體)CDR的殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基所取代。而且，人源化抗體可以包含未在受體抗體或或外源添加的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步細(xì)化(refine)和優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中CDR區(qū)的全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR區(qū)的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的相應(yīng)部分。人源化抗體最優(yōu)選還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常為人的免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
“人抗體”具有對(duì)應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列和/或它是利用本領(lǐng)域已知的或本文公開的制備人抗體的任何技術(shù)制備的。人抗體的這種定義包括含有至少一個(gè)人類重鏈多肽或至少一個(gè)人類輕鏈多肽的抗體，如含有鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可以用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體選自表達(dá)人抗體的噬菌體文庫(kù)(Vaughan et al.Nature Biotechnology，14309-314(1996)Sheets et al.PNAS，(USA)956157-6162(1998))；Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991))。人抗體也可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如引入已部分或完全滅活內(nèi)源免疫球蛋白基因的小鼠)來(lái)制備。在受到攻擊的情況下，可以觀察到人抗體的產(chǎn)生，其在所有方面均十分類似于人體中所見，包括基因重排、裝配和抗體庫(kù)(antibodyrepertoire)。該方法可參見例如美國(guó)專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下述科技文獻(xiàn)Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-13(1994)；Fishwild et al.，NatureBiotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。備選地，人抗體可通過(guò)人B淋巴細(xì)胞的無(wú)限增殖化產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體(這種B淋巴細(xì)胞可以從個(gè)體收集或可以經(jīng)過(guò)體外免疫)。參見，例如Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerneret al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；and US Pat No.5,750,373。
術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于指免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)，其可以通過(guò)木瓜蛋白酶消化完整抗體而產(chǎn)生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可變，通常將人IgG重鏈Fc區(qū)限定為，從約Cys226位或約Pro230位的氨基酸殘基到Fc區(qū)羰基端鏈(本文采用Kabat等的編號(hào)系統(tǒng)，出處同上)。免疫球蛋白Fc區(qū)通常包含兩個(gè)恒定區(qū)，一個(gè)CH2區(qū)和一個(gè)CH3區(qū)，并任選包含一個(gè)CH4區(qū)。
本文中“Fc區(qū)鏈”指Fc區(qū)兩條多肽鏈之一。
人IgG Fc區(qū)的“CH2”區(qū)(也稱“Cγ2”區(qū))通常從大約位點(diǎn)231的氨基酸殘基延伸至大約位點(diǎn)340的氨基酸殘基。CH2區(qū)獨(dú)特之處在于，其不與另一區(qū)緊密配對(duì)。優(yōu)選，兩個(gè)N連接的分支糖鏈位于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2區(qū)之間。據(jù)信糖可提供區(qū)-區(qū)配對(duì)的取代基，并幫助穩(wěn)定CH2區(qū)。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。本文的CH2區(qū)可以是天然序列CH2區(qū)或變體CH2區(qū)。
“CH3區(qū)”包括Fc區(qū)中殘基C末端到CH2區(qū)的鏈(即IgG中從大約位點(diǎn)341的氨基酸殘基到大約位點(diǎn)447的氨基酸殘基)。本文的CH3區(qū)可以是天然序列CH3區(qū)或變體CH3區(qū)(例如一種CH3區(qū)，其一條鏈引入了“凸起”而另一條鏈引入了與之對(duì)應(yīng)的“空腔”，見美國(guó)專利申請(qǐng)5,821,333)。此種變體CH3區(qū)可用于本文中的多特異性(例如雙特異性)抗體。
“鉸鏈區(qū)”通常是指人IgG1中從約Glu216或約Cys226至約Pro230的鏈(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可通過(guò)將形成重鏈間S-S鍵的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基置于同樣的位點(diǎn)而與IgG1序列比對(duì)。本文的鉸鏈區(qū)可為天然序列鉸鏈區(qū)或變體鉸鏈區(qū)。變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈通常每條鏈保留至少一個(gè)半胱氨酸殘基，從而變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈可以在這兩條鏈間形成二硫鍵。本文優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgG1鉸鏈區(qū)。
“功能性Fc區(qū)”具有天然序列Fc區(qū)的至少一種“效應(yīng)功能”?！靶?yīng)功能”的實(shí)例包括C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒活性(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性(ADCC)；胞吞作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體，BCR)等下調(diào)。此種效應(yīng)功能通常需要Fc區(qū)與結(jié)合區(qū)(例如抗體的可變區(qū))組合，并使用本領(lǐng)域已知評(píng)價(jià)該抗體效應(yīng)功能的各種方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
“天然序列Fc區(qū)”包括與天然發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“變體Fc區(qū)”包含與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列區(qū)別在于至少一個(gè)氨基酸修飾的氨基酸序列。優(yōu)選，變體Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽Fc區(qū)相比具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如在天然序列Fc區(qū)中或親本多肽Fc區(qū)中約1-10個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選約1-5個(gè)氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)將優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或親本多肽Fc區(qū)具有至少約80％的序列同一性，更優(yōu)選至少約90％的序列同一性，更優(yōu)選至少約95％的序列同一性。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性”和“ADCC”是指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后引起該靶細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC作用的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞則表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。關(guān)于造血細(xì)胞上FcR表達(dá)的總結(jié)見Ravetchand Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)，464頁(yè)，表3。為了評(píng)價(jià)目標(biāo)分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，例如美國(guó)專利5,500,362或5,821,337中所述。用于這類試驗(yàn)的有效效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。或者(或另外)，可在體內(nèi)，例如在Clynes et al.PNAS(USA)，95652-656(1998)所述的動(dòng)物模型中，評(píng)估目標(biāo)分子的ADCC活性。
“人類效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC作用的人類白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。所述效應(yīng)細(xì)胞可從其天然來(lái)源中分離，例如從本文所述血液或PBMC中分離。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用來(lái)描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的受體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體(包括這些受體的等位基因變體和旁路剪接形式)。FcγRII受體包括具有相似的氨基酸序列的FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，其主要區(qū)別在于其胞漿區(qū)?；罨荏wFcγRIIA在其胞漿區(qū)含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在胞漿區(qū)含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述見Daёron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234(1997)).FcRs are reviewed inRavetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods，425-34(1994)；and de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.，126330-41(1995)。本文中術(shù)語(yǔ)“FcR”函蓋其它FcR，包括有待將來(lái)鑒定的那些。該術(shù)語(yǔ)還包括負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒的新生期受體FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.，117587(1976)；and Kim et al.，J.Immunol.，24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性”和“CDC”是指在補(bǔ)體存在的條件下裂解靶的能力。補(bǔ)體活化途徑可以由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(C1q)與結(jié)合相關(guān)(cognate)抗原的分子(例如抗體)的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化作用，可進(jìn)行CDC試驗(yàn)，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202163(1996)所述。
“親和力成熟的”抗體在其一或多個(gè)CDR中有一或多個(gè)變化，從而導(dǎo)致該抗體針對(duì)抗原的親和力比不具有那些變化的親本抗體增強(qiáng)。優(yōu)選的親和力成熟抗體對(duì)靶抗原的親和力在納摩爾水平或者甚至是皮摩爾水平。親和力成熟的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。Marks et al.Bio/Technology，10779-783(1992)描述了通過(guò)VH和VL區(qū)重排(shuffling)實(shí)現(xiàn)親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變可參見Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 913809-3813(1994)；Schier et al.Gene，169147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.，1551994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.，154(7)3310-9(1995)；and Hawkins et al，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)。
術(shù)語(yǔ)“免疫特異性”在例如“抗體的免疫特異性結(jié)合”中使用時(shí)，是指抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與該抗體所識(shí)別的特異性抗原之間發(fā)生的抗原特異性結(jié)合相互作用。
“分離的，”當(dāng)用于描述本文公開的各種蛋白時(shí)，是指從蛋白的天然環(huán)境的成分中鑒定和分離和/或回收的蛋白。其天然環(huán)境中的雜質(zhì)成分是通?？梢愿蓴_該蛋白的診斷或治療用途的物質(zhì)，可以包括酶、激素、及其它蛋白性質(zhì)或非蛋白性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白可以(1)純化至足以通過(guò)采用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀得到至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)純化至在非還原或還原條件下經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯蘭或優(yōu)選銀染色證實(shí)為均質(zhì)的程度。分離的蛋白包括重組細(xì)胞中的原位蛋白，因?yàn)樗龅鞍椎奶烊画h(huán)境中的至少一種成分不存在。但是通常，通過(guò)至少一步純化步驟制備分離的蛋白。
“療法”或“治療”指治愈性治療以及預(yù)防性或防止性措施。
用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”是指哺乳類任何動(dòng)物，包括人、家禽、農(nóng)用動(dòng)物，和動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目用的動(dòng)物或?qū)櫸?，如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人。
“TALL-1相關(guān)病理情況”和“APRIL相關(guān)病理情況”分別指與TALL-1或APRIL相對(duì)于正常健康哺乳動(dòng)物而言過(guò)高或過(guò)低的異常表達(dá)水平或活性相關(guān)的病理或情況，此種過(guò)高或過(guò)低的水平出現(xiàn)在機(jī)體全身、局部或特定的組織或細(xì)胞類型或位置。TALL-1相關(guān)病理情況和APRIL相關(guān)病理情況包括急性和慢性免疫相關(guān)疾病和癌癥。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”，“癌癥的”和“惡性的”是指或是描述哺乳動(dòng)物以失控的細(xì)胞生長(zhǎng)為典型特征的病理情況。癌癥的實(shí)例包括但不限于，癌(carcinoma)包括腺癌、淋巴瘤，母細(xì)胞癌，黑素瘤，肉瘤和白血病。此種癌癥更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸道癌、Hodgkin’s和非Hodgkin’s淋巴瘤，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(livercancer)如肝癌(hepatic carcinoma)和肝細(xì)胞癌，膀胱癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，骨髓瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)，唾液腺癌，腎癌例如腎細(xì)胞癌和Wilms氏瘤，基底細(xì)胞癌，黑素瘤，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，睪丸癌，食道癌和各種頭頸部癌。本文優(yōu)選治療的癌癥包括淋巴瘤，白血病和骨髓瘤，以及上述癌癥的亞型，例如Burkitt淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，急性淋巴母細(xì)胞性或淋巴細(xì)胞性白血病，Hodgkin’s和非Hodgkin’s淋巴瘤以及急性髓樣白血病。
術(shù)語(yǔ)“免疫相關(guān)疾病”指一種疾病，其中哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的一種組分引起、介導(dǎo)或者負(fù)責(zé)哺乳動(dòng)物發(fā)病。也包括這樣一種疾病，其中刺激或干擾免疫應(yīng)答可以緩解疾病進(jìn)展。該術(shù)語(yǔ)包括，自身免疫性疾病，免疫-介導(dǎo)的炎癥，非-免疫-介導(dǎo)的炎癥，感染性疾病以及免疫缺陷疾病?？筛鶕?jù)本發(fā)明來(lái)治療的免疫相關(guān)疾病和炎癥的實(shí)例(其中一些為免疫或T細(xì)胞介導(dǎo))包括，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosis)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，青年期慢性關(guān)節(jié)炎(juvenile chronic arthritis)，脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)，系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis)(硬皮病(scleroderma))，特發(fā)性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)(皮肌炎(dermatomyositis)，多肌炎(polymyositis))，Sjogren’s綜合征，全身性血管炎(systemic vasculitis，sarcoidosis)，結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)，自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)(免疫性全血細(xì)胞減少癥(immunepancytopenia)，陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnalhemoglobinuria))，自身免疫性血小板減少癥(autoimmune thrombocytopenia)(特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)，免疫介導(dǎo)的血小板減少癥(immune-mediated thrombocytopenia))，甲狀腺炎(Grave’s病，橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，青年期淋巴細(xì)胞甲狀腺炎(juvenilelymphocytic thyroiditis)，萎縮性甲狀腺炎(atrophic thyroiditis))，糖尿病，免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎，腎小管間質(zhì)性腎炎)，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病(demyelinating diseases)如多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)，特發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或Guillain-Barré綜合征，及慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)，肝膽管疾病(hepatobiliary diseases)如傳染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎及其它非嗜肝性病毒肝炎)，自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)，肉芽腫性肝炎(granulomatous hepatitis)，及硬化性膽管炎(sclerosing cholangitis)，炎性和纖維化性肺疾病例如炎性腸疾病(潰瘍性結(jié)腸炎；Crohn’s病)，麩質(zhì)-敏感性腸病(gluten-sensitive enteropathy)，及Whipple’s病，自身免疫或免疫-介導(dǎo)的皮膚病包括大皰皮膚疾病(bullous skin diseases)，多形性紅斑(erythema multiforme)和接觸性皮炎(contact dermatitis)，牛皮癬(psoriasis)，過(guò)敏性疾病如哮喘，過(guò)敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis)，食物過(guò)敏反應(yīng)(food hypersensitivity)和風(fēng)疹(urticaria)，肺部免疫性疾病如嗜酸性粒細(xì)胞肺炎(eosinophilicpneumonias)，特發(fā)性肺部纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)及超敏反應(yīng)性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，移植相關(guān)性疾病包括移植排斥和移植物抗宿主疾病。傳染性疾病包括AIDS(HIV感染)，甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎，細(xì)菌感染，真菌感染，原蟲感染和寄生蟲感染。
“自身免疫性疾病”在本文中使用其廣泛、通常的含義，是指一些疾病或情況，其中哺乳動(dòng)物個(gè)體對(duì)其自體組織成分發(fā)生體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致破壞正?；蚪】档慕M織。實(shí)例包括但不限于，紅斑狼瘡，甲狀腺炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，多發(fā)性硬化癥，自身免疫性糖尿病和炎性腸病(IBD)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“前體藥物”指藥物學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其較親本藥物對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能被酶活化或轉(zhuǎn)化成更具活性的親本形式。見例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransanctions，14，pp.357-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于，含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸脂前體藥物，含硫酸鹽前體藥物，含肽前體藥物，D氨基酸修飾的前體藥物，糖基化前體藥物，含β內(nèi)酰胺的前體藥物，任選取代的含苯氧基乙酰胺的前體藥物或任選取代的含苯基乙酰胺的前體藥物，可被轉(zhuǎn)化成更具活性且不具有細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的實(shí)例包括，但不限于，下述化療劑。
本文中術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，和Lu的放射性同位素)，化療劑，毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化療劑”是在治療癌癥等疾病中使用的化學(xué)化合物。化療劑實(shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenins(特別是bullatacin和bullatacinone)；喜樹堿(包括合成的類似物拓?fù)涮婵?topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；cryptophycins(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如enediyne抗生素(如加利車霉素，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素θI1，參見例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；esperamicin；以及新制癌菌素生色團(tuán)(neocarzinostatin chromophore)和相關(guān)的色蛋白enediyne抗生素生色團(tuán))，阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來(lái)霉素，放線菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括嗎啉代-阿霉素，氰基嗎啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素和脫氧阿霉素)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿(maytan sinoids)(包括美登素和柄型菌素)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；單端孢霉烯族毒素類(尤其是T-2毒素，verracurin A，桿孢菌素A，蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春堿酰胺；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉醇樣物質(zhì)(taxoid)，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春花堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
本文中“生長(zhǎng)抑制劑”是指在體內(nèi)或體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低在S期過(guò)度表達(dá)此種基因的細(xì)胞的百分比的藥物。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期(在除S期以外的階段)進(jìn)展的制劑，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的制劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花類(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)，taxol和topo II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊甙(etoposide)和博來(lái)霉素。那些使G1期停滯的制劑還連帶(spill over)使S期停滯，例如DNA烷化劑如他莫昔芬、強(qiáng)的松、達(dá)卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。詳見The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cell cycle regulation，oncogens，and antineoplastic drugs″by Murakamiet al.(WB SaundersPhiladelphia，1995)，especially p.13。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是一般性術(shù)語(yǔ)，指由一個(gè)細(xì)胞群釋放的對(duì)另一個(gè)細(xì)胞群起細(xì)胞間介質(zhì)作用的蛋白。此種細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子，單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素，N-甲二磺酰人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒氏管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括天然蛋白或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。
II.方法和材料本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TALL-1，APRIL，TACI，BCMA，TACIs，和/或BR3活性的方法和材料，包括將所述細(xì)胞暴露于所需量的TACI抗體。優(yōu)選地，TACI抗體的用量為有效影響各自配體或各自受體的結(jié)合和/或活性從而實(shí)現(xiàn)治療效應(yīng)的量。這可以根據(jù)，例如，下文和實(shí)施例中描述的方法以體內(nèi)或回體方式實(shí)現(xiàn)。用這類TACI抗體治療的疾病的實(shí)例包括臨床稱為自身免疫病的哺乳動(dòng)物疾病，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，牛皮癬，和狼瘡或其它異常上調(diào)哺乳動(dòng)物B細(xì)胞應(yīng)答的病理情況，如癌癥。
A.抗體本文提供了抗-TACI受體抗體，其可用于在此公開的方法中。單克隆抗體可以用雜交瘤方法來(lái)制備，例如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)所述的方法。在雜交瘤方法中，小鼠、倉(cāng)鼠或其它適宜宿主動(dòng)物通常用致免疫劑免疫，以刺激那些產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與該致免疫劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，淋巴細(xì)胞可以在體外致敏。
致免疫劑通常包括TACI多肽(或TACI ECD)或其融合蛋白，例如TACIECD-IgG融合蛋白?；蛘?，致免疫劑可包含TACI的片段或一部分，所述片段或一部分具有一個(gè)或多個(gè)參與TALL-1或APRIL與TACI的結(jié)合的氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方式中，致免疫劑包含TACI的胞外區(qū)序列。
一般，如果需要人源細(xì)胞就用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，如果需要非人哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞就用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后用適宜的融合劑，如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與無(wú)限增殖的細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞[Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103]。無(wú)限增殖細(xì)胞系通常為轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類，牛和人類來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可以在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一或多種抑制未融合的無(wú)限增殖細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，親本細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)時(shí)，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選無(wú)限增殖細(xì)胞系是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體、并對(duì)HAT等培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。更優(yōu)選無(wú)限增殖細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，它們可以從，例如Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type CultureCollection)，Manassas，Virginia獲得。也有報(bào)道稱，人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63]。
然后，可以檢測(cè)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗TACI單克隆抗體的存在。優(yōu)選，由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過(guò)免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定，所述試驗(yàn)例如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。這類技術(shù)和試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以，例如用Munson and Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來(lái)確定。
在鑒定出所需雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆用有限稀釋法進(jìn)行再克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)[Goding，見上文]。適于此目的的培養(yǎng)基包括，例如，Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基。備選地，雜交瘤細(xì)胞可以以哺乳動(dòng)物腹水的形式在體內(nèi)生長(zhǎng)。
上述進(jìn)一步克隆所分泌的單克隆抗體可用經(jīng)典免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基或腹水分離或純化，所述方法例如，蛋白A-Sepharose凝膠，羥化磷灰石層析，凝膠電泳，透析，或親和層析。
單克隆抗體也可用重組DNA方法制備，如美國(guó)專利4,816,567所述的方法。編碼單克隆抗體的DNA可容易地用常規(guī)方法(例如，用能特異結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離并測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以作為此類DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，就可以將該DNA置于表達(dá)載體中，然后用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或不另外生成免疫球蛋白蛋白的骨髓瘤細(xì)胞)，從而在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。所述DNA也可通過(guò)，例如，用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠序列來(lái)修飾，Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.81，6851(1984)，或通過(guò)將全部或部分非-免疫球蛋白多肽的編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接來(lái)修飾。
通常，這些非-免疫球蛋白多肽可取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或取代本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，從而產(chǎn)生嵌合的二價(jià)抗體，該抗體包含一個(gè)對(duì)TACI具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)對(duì)另一種抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
嵌合或雜合抗體也可以用合成蛋白化學(xué)領(lǐng)域的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的方法在體外制備。例如，免疫毒素可以用二硫鍵交換反應(yīng)來(lái)構(gòu)建或通過(guò)形成硫醚鍵(thioether bond)來(lái)構(gòu)建。適合此目的的制劑實(shí)例包括巰基亞胺(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁亞酰胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
也可以制備單鏈Fv片段，如Iliades et al.，F(xiàn)EBS Letters，409437-441(1997)所述。利用各種接頭偶聯(lián)此類單鏈片段的方法可參見Kortt et al.，ProteinEngineering，10423-433(1997)。各種重組制備和操作抗體的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員常用的此類技術(shù)的示范性實(shí)例在下文中更詳細(xì)地描述。
(i)人源化抗體一般情況下，人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的(import)”殘基，它們通常來(lái)自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過(guò)程基本可以按照Winter及其同事[Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyenet al.，Science，2391534-1536(1988)]所述，用嚙齒類CDR或CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。
相應(yīng)地，此種“人源化”抗體是嵌合的抗體，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，用親本序列和人源化序列的三維模型，分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物，以此來(lái)制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀察這些展示結(jié)果，可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過(guò)這種方法，可以從共有序列和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?，CDR殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
(ii)人抗體人單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤方法制備。人骨髓瘤和小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體的相關(guān)報(bào)道可參見，例如，Kozbor，J.Immunol.133，3001(1984)，and Brodeur，et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。
現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它經(jīng)過(guò)免疫能在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠中，將導(dǎo)致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。例如，見Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，2551-255(1993)；Jakobovits et al.，Nature362，255-258(1993)。
Mondez等(Nature Genetics 15146-156 )進(jìn)一步改進(jìn)了該技術(shù)并產(chǎn)生出命名為“Xenomouse II”的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，當(dāng)其受到抗原攻擊時(shí)，可產(chǎn)生高親和性完全人抗體。這是通過(guò)將兆堿基(megabase)人重鏈和輕鏈基因座經(jīng)胚系整合到上述具有內(nèi)源JH節(jié)段缺失的小鼠中實(shí)現(xiàn)的。Xenomouse II具有含約66VH基因、完全DH和JH區(qū)以及三種不同恒定區(qū)(μ，δ和χ)的1,020Kb人重鏈基因座，并具有包含32VK基因、JK節(jié)段和CK基因的800Kb人κ基因座。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體與人類中所見的抗體在各方面均十分相似，包括基因重排、組裝和所有組成成分。由于內(nèi)源JH節(jié)段中的缺失阻止鼠基因座中的基因重排，人抗體優(yōu)先于內(nèi)源抗體表達(dá)。
或者，可以用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature348，552-553 )，從非免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)全套基因而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因克隆在相同的閱讀框內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對(duì)顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述見Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3，564-571(1993)?？墒褂肰-基因節(jié)段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson et al.，Nature352，624-628(1991)從致敏小鼠脾臟來(lái)源的V基因隨機(jī)組合小文庫(kù)中分離出一批多樣的抗-噁唑酮(oxazolone)抗體。可基本按照Marks et al.，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)，or Griffith etal.，EMBO J.12，725-734(1993)所述，構(gòu)建未經(jīng)免疫的人類供體的全套V基因，并分離針對(duì)多種多樣抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以較高速率積累突變(體細(xì)胞超變)。其中一些變化賦于較高親和力，而展示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后的抗原攻擊階段優(yōu)先復(fù)制并分化。這種天然過(guò)程可以用已知為“鏈改組”的技術(shù)(Marks et al.，Bio/Technol.10，779-783 )來(lái)模仿。在該方法中，通過(guò)噬菌體展示而獲得的“原代”人抗體的親和力可以得到改進(jìn)，方法是用未致敏供體的V區(qū)基因的天然變體(全套)所有組成相繼取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因。該技術(shù)允許產(chǎn)生具有nM水平的親和力的抗體和抗體片段。制備非常大的噬菌體抗體庫(kù)(也稱“所有庫(kù)的母庫(kù)”(the mother-of-all library))的策略在Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.21，2265-2266(1993)中描述。基因改組也可以用于從嚙齒動(dòng)物的抗體衍生出人抗體，其中的人抗體具有與起始的嚙齒動(dòng)物抗體相似的親和性和特異性。根據(jù)該方法(也稱“表位印痕(epitope imprinting)”)，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動(dòng)物抗體重鏈或輕鏈V區(qū)基因被全套人V區(qū)基因取代，產(chǎn)生嚙齒動(dòng)物-人嵌合體。對(duì)抗原的選擇導(dǎo)致分離出能重建功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人類可變區(qū)，即表位控制(govern)(決定(imprint))對(duì)配對(duì)物的選擇。當(dāng)重復(fù)該方法以取代余下的嚙齒動(dòng)物V區(qū)時(shí)，獲得人抗體(見PCT專利申請(qǐng)WO 93/06213，公開于1993年4月1日)。與嚙齒動(dòng)物的抗體通過(guò)CDR移植進(jìn)行的傳統(tǒng)人源化不同，該技術(shù)提供徹底的人抗體，其不具有嚙齒動(dòng)物來(lái)源的框架或CDR殘基。
如下所述，本發(fā)明的抗體可以任選包括單體抗體，二聚體抗體，以及多價(jià)抗體。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)構(gòu)建此種二聚體或多價(jià)形式。制備單價(jià)抗體的方法也是本領(lǐng)域熟悉的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾的重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fc區(qū)的任何點(diǎn)被截短，從而阻止重鏈的交聯(lián)。備選地，相關(guān)半胱氨酸殘基由另一氨基酸殘基取代或相關(guān)半胱氨酸殘基缺失從而阻止交聯(lián)。
(iii)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的單克隆抗體(優(yōu)選人抗體或人源化抗體)。在本發(fā)明中，一種結(jié)合特異性針對(duì)TACI或BR3受體，另一種結(jié)合特異性是針對(duì)任何其它抗原，如BCMA或BR3受體，優(yōu)選針對(duì)另一受體或受體亞基。例如，特異性結(jié)合TACI受體和另一種凋亡/信號(hào)傳遞受體的雙特異性抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備是基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條重鏈具有不同特異性(Millstein and Cuello，Nature305，537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機(jī)分配(random assortment)，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829(1993年5月13日公開)和Traunecker et al.，EMBO10，3655-3659(1991)。
依據(jù)另一種并且是更優(yōu)選的方法，可以將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可以在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于1994年3月3日公開的WO94/04690中。
產(chǎn)生雙特異抗體的進(jìn)一步詳細(xì)描述可以參見，例如Suresh et al.，Methods in Enzymology121，210(1986)。
(iv)異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。此種抗體據(jù)稱例如可以使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)和用于治療HIV感染(WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)制備。適宜的交聯(lián)劑為本領(lǐng)域已知，并在美國(guó)專利4,676,980中與一些交聯(lián)技術(shù)一起公開。
(v)抗體片段在一些實(shí)施方案中，抗TACI抗體(包括鼠，人和人源化抗體，以及抗體變體)是抗體片段。已開發(fā)了多種技術(shù)用于制備抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn)行蛋白水解消化來(lái)衍生(見例如，Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)and Brennan et al.，Science22981(1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)。例如，例如，F(xiàn)ab’-SH片段可以從大腸桿菌直接回收并利用化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992))。在另一實(shí)施方案中，利用亮氨酸拉鏈GCN4形成F(ab’)2以便促進(jìn)F(ab’)2分子的組裝。根據(jù)另一方法，F(xiàn)v，F(xiàn)ab或F(ab’)2片段可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。制備抗體片段的各種技術(shù)對(duì)于熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，可利用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化。木瓜蛋白酶消化的實(shí)例在1994年12月22日公開的WO 94/29348和美國(guó)專利4,342,566中描述。木瓜蛋白酶消化抗體通常產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為Fab片段，各具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))和殘余的Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
抗體消化產(chǎn)生的Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段區(qū)別于Fab片段在于，重鏈CH1區(qū)的羧基末端多出數(shù)個(gè)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH是指，在恒定區(qū)半胱氨酸殘基中帶有游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初產(chǎn)生時(shí)是Fab’片段對(duì)，它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是眾所周知的。
抗體在其恒定區(qū)的保守位點(diǎn)糖基化(Jefferis and Lund，Chem.Immunol.65111-128 ；Wright and Morrison，TibTECH1526-32 )。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈影響該蛋白的功能(Boyd et al.，Mol.Immunol.321311-1318 ；Wittwe and Howard，Biochem.294175-4180 )，并影響糖蛋白各部分之間的分子內(nèi)相互作用，這種相互作用可以影響構(gòu)象并表現(xiàn)在糖蛋白的三維表面(Hefferis and Lund，同上；Wyss and Wagner，Current Opin.Biotech.7409-416 )。寡糖也可根據(jù)特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)將指定的糖蛋白靶向特定的分子。例如，據(jù)報(bào)道在脫半乳糖基化的IgG中，寡糖部分“彈出”inter-CH2區(qū)，末端N-乙酰葡糖胺殘基變得可以與甘露糖結(jié)合蛋白結(jié)合(Malhotra et al.，Nature Med.1237-243 )。利用糖肽酶從產(chǎn)生在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的CAMPATH-1H(識(shí)別人淋巴細(xì)胞CDw52抗原的重組人源化鼠單克隆IgG1抗體)去除寡糖，結(jié)果使補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解(CMCL)徹底減少(Boyd et al.，Mol.Immunol.321311-1318 )，而用神經(jīng)氨酸酶選擇性去除唾液酸殘基不會(huì)造成DMCL的丟失。據(jù)報(bào)道，抗體的糖基化也影響抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性(ADCC)。尤其是，據(jù)報(bào)道，具有受四環(huán)素調(diào)節(jié)的β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)表達(dá)的CHO細(xì)胞，其ADCC活性增強(qiáng)，其中所述GnTIII是催化形成對(duì)分式(bisecting)GlcNAC的糖基轉(zhuǎn)移酶(Umana etal.，Mature Biotech.17176-180 )。
抗體的糖基化變體是改變了抗體糖基化模式的抗體。所謂改變就是去除該抗體中的一或多個(gè)糖部分，給該抗體添加一或多個(gè)糖部分，改變糖基化的組成(糖基化模式)、糖基化程度，等等。糖基化變體可以，例如，通過(guò)在編碼該抗體的核酸序列中去除、改變和/或添加一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來(lái)制備。
抗體的糖基化通常為N-連接或O-連接形式。N-連接是指，將糖部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使糖部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識(shí)別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化是指，將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸(hydroxyamino acid)，最常見是絲氨酸或蘇氨酸，但也可以是5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列，使其包含一或多個(gè)上述三肽序列而輕易實(shí)現(xiàn)(在添加N-連接的糖基化位點(diǎn)的情況下)。這種改變也可通過(guò)在原始抗體的序列中添加或取代一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)(在添加O-連接的糖基化位點(diǎn)的情況下)。
抗體的糖基化(包括糖基化模式)也可以在不改變根本的核苷酸序列(theunderlying nucleotide sequence)的情況下進(jìn)行改變。糖基化很大程度上依賴于表達(dá)該抗體時(shí)所用的宿主細(xì)胞。由于表達(dá)重組糖蛋白(例如抗體)作為潛在療法時(shí)，所用的細(xì)胞類型極少是天然細(xì)胞，因此可以預(yù)計(jì)抗體的糖基化模式中有顯著改變(見例如Hse et al.，J.Biol.Chem.2729062-9070 )。除了對(duì)宿主細(xì)胞的選擇以外，在重組產(chǎn)生抗體期間影響糖基化的因素包括，生長(zhǎng)方式，培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)物密度，氧化，pH，純化方案等。已有人提議多種方法來(lái)改變具體宿主生物中的糖基化模式，包括引入或過(guò)度表達(dá)參與寡糖生成的特定的酶(美國(guó)專利5,047,335；5,510,261和5.278,299)。糖基化，或特定類型的糖基化，可以從糖蛋白中酶促去除，例如利用內(nèi)糖苷酶H(Endo H)的作用去除。此外，可以對(duì)重組宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，例如在加工特定類型的多糖時(shí)有缺陷。這些技術(shù)以及類似技術(shù)為本領(lǐng)域熟知。
抗體的糖基化結(jié)構(gòu)可以通過(guò)傳統(tǒng)的糖分析技術(shù)輕易分析，所述技術(shù)包括凝集素層析，NMR，質(zhì)譜分析，HPLC，GPC，單糖組合分析，依次酶消化，和HPAEC-PAD(基于電荷用高pH陰離子交換層析分離寡糖)。為了分析的目的釋放寡糖的方法也是已知的，包括但不限于，酶處理(通常使用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)-β-半乳糖苷酶進(jìn)行)，使用強(qiáng)堿環(huán)境進(jìn)行消除以便釋放主要的O-連接結(jié)構(gòu)，以及使用無(wú)水肼釋放N-連接寡糖和O-連接寡糖的化學(xué)方法。
三價(jià)抗體(triabodies)也屬于本發(fā)明的范圍。此種抗體在例如Iliades等，見上文和Kortt等，見上文中描述。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)將該抗體與細(xì)胞毒性劑(例如毒素分子)或前體藥物活化酶偶聯(lián)來(lái)修飾，所述活化酶將前體藥物(例如肽基化療制劑，見WO8I/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥物。參見，例如，WO 88/07378和美國(guó)專利4,975,278。此技術(shù)也稱“抗體依賴性酶介導(dǎo)的前體藥物治療”(ADEPT)。
用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分，包括任何能夠?qū)η绑w藥物起作用并將其轉(zhuǎn)化成更具活性的細(xì)胞毒形式的酶。本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，堿性磷酸酶，其可以用于將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；芳香基硫酸酯酶，其可以用于將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；胞嘧啶脫氨酶，其可以用于將無(wú)毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等，其可以用于將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；caspases如caspase-3；D-丙氨酰羧肽酶，其可以用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物；糖裂解酶類，如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶，其可以用于將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的；β-內(nèi)酰胺酶，其可以用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，其可以用于將在其氨基氮的位置分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌玫降乃幬镛D(zhuǎn)化游離藥物?；蛘?，可以用具有酶活性的抗體(本領(lǐng)域也稱“抗體酶(abzyme)”)，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見，例如，Massey，Nature 328457-458(1987))?？贵w-抗體酶偶聯(lián)物可以如本文所述制備以便將抗體酶運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞群。
所述酶可以通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)與抗體共價(jià)結(jié)合，所述技術(shù)例如使用異源雙功能交聯(lián)試劑?；蛘撸梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)(如Neuberger et al.，Nature，312604-608(1984))構(gòu)建融合蛋白，在該融合蛋白中，本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接。
本發(fā)明還涉及抗體修飾。例如，可以將抗體連接于各種非蛋白聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯s，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。也可以將抗體捕獲(entrap)在微膠囊中，或容納在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述微膠囊可以通過(guò)諸如凝聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合作用來(lái)制備，例子分別有羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。為增加抗體的血漿半衰期，可以按美國(guó)專利5,739,277所述將補(bǔ)救受體(salvage receptor)結(jié)合表位并入抗體(特別是抗體片段)中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的Fc區(qū)表位，它負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血漿半衰期。
B.分析方法配體/受體結(jié)合研究可以用任何已知分析方法進(jìn)行，例如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，直接和間接夾心試驗(yàn)，以及免疫沉淀試驗(yàn)?；诩?xì)胞的試驗(yàn)和動(dòng)物模型可用作診斷方法，并進(jìn)一步用于理解本文鑒定的配體和受體之間的相互作用、以及本文所指的情況和疾病的發(fā)展和病因?qū)W。
在一種方法中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以用本文所述的配體或受體轉(zhuǎn)染，并分析所述激動(dòng)劑或拮抗劑刺激或抑制結(jié)合或活性的能力。適宜的細(xì)胞可以用所需基因轉(zhuǎn)染，并監(jiān)測(cè)其活性。所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以用于檢驗(yàn)拮抗劑或激動(dòng)劑抑制或刺激的能力，例如，調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖或Ig分泌的能力。由本文鑒定的基因的編碼序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞還可以用于鑒定免疫相關(guān)疾病或癌癥的候選治療藥物。
此外，基于細(xì)胞的試驗(yàn)中可以采用來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的原代培養(yǎng)物。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物衍生出連續(xù)細(xì)胞系的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的[見例如，Small et al.，Mol.Cell.Biol.，5642-648(1985)]。
一種適宜的基于細(xì)胞的試驗(yàn)是，將帶有表位標(biāo)記的配體(例如AP或Flag)添加到具有或表達(dá)各自受體的細(xì)胞直接，用抗標(biāo)記抗體進(jìn)行FACS染色，以此分析結(jié)合(在有或無(wú)或預(yù)計(jì)有拮抗劑時(shí))。在另一試驗(yàn)中，測(cè)定激動(dòng)劑或拮抗劑抑制TALL-1或APRIL誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖的能力。B細(xì)胞或細(xì)胞系在有或無(wú)或預(yù)計(jì)有激動(dòng)劑或拮抗劑時(shí)用TALL-1或APRIL培養(yǎng)，B細(xì)胞的增殖可以通過(guò)H-胸苷的摻入或細(xì)胞數(shù)來(lái)測(cè)定。
基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)的結(jié)果可以用體內(nèi)動(dòng)物模型進(jìn)一步檢驗(yàn)。多種已知的動(dòng)物模型可以用于進(jìn)一步理解本發(fā)明鑒定的激動(dòng)劑和拮抗劑在例如免疫相關(guān)疾病或癌癥的發(fā)展和病因?qū)W中的作用，并檢驗(yàn)候選治療劑的功效。此種模型的體內(nèi)性質(zhì)使其尤其預(yù)示人類病人中的反應(yīng)。免疫相關(guān)疾病的動(dòng)物模型包括非重組和重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物。非重組動(dòng)物模型包括，例如，嚙齒類，例如鼠模型。此種模型可以通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將細(xì)胞引入同系小鼠中來(lái)制備，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如皮下注射，尾靜脈注射，脾移植，腹腔移植，和腎包囊下移植。
例如，移植物抗宿主疾病的動(dòng)物模型是已知的。在將免疫活性細(xì)胞移植到免疫受抑制的病人或免疫耐受的病人中時(shí)，出現(xiàn)移植物抗宿主疾病。供體細(xì)胞識(shí)別并應(yīng)答宿主抗原。此應(yīng)答可以是從致命的嚴(yán)重炎癥到輕微的腹瀉和體重減輕不等。移植物抗宿主疾病模型提供了評(píng)價(jià)T細(xì)胞分別對(duì)MHC抗原和次要移植抗原的反應(yīng)性的方法。一個(gè)適宜的方案見CurrentProtocols in Immunology，unit 4.3。
皮膚同種異體移植排斥的動(dòng)物模型是檢驗(yàn)T細(xì)胞介導(dǎo)體內(nèi)組織破壞的能力的途徑(means)，該途徑指示并衡量它們?cè)诳共《竞湍[瘤免疫中的作用。最常見并被接受的模型使用鼠尾皮膚移植。重復(fù)試驗(yàn)表明皮膚同種異體移植排斥由T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞和殺傷-效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)而不是抗體介導(dǎo)。[Auchincloss，H.Jr.and Sachs，D.H.，F(xiàn)undamental Immunology，2nd ed.，W.E.Paul ed.，Raven Press，NY，1989，889-992]。一個(gè)適宜的方案見CurrentProtocols in Immunology，unit 4.4。其它可用于檢驗(yàn)本發(fā)明組合物的移植排斥模型是Tanabe，M.et al.，Transplantation，(1994)5823和Tinubu，S.A.et al.，J.Immunol.，(1994)4330-4338所述的同種異體心臟移植模型。
遲發(fā)型超敏反應(yīng)的動(dòng)物模型也提供了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能的分析方法。遲發(fā)型超敏反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)免疫反應(yīng)，其特征是，在與抗原接觸后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間炎癥才達(dá)到高峰，然后消退。這些反應(yīng)還出現(xiàn)于組織特異性自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化(MS)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE，是MS的一種模型)。一個(gè)適宜的方案見Current Protocols inImmunology，unit 4.5。
關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型是膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。此模型具有人自身免疫性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)特征，并且是人自身免疫性關(guān)節(jié)炎的可接受的模型。小鼠和大鼠模型的特征為滑膜炎，軟骨以及軟骨下成骨的破壞?？梢杂肅urrent Protocols in Immunology，unit 15.5所述方案，檢驗(yàn)本發(fā)明化合物對(duì)自身免疫性關(guān)節(jié)炎的作用。也可以參見Issekutz，A.C.et al.，Immunology，(1996)88569所述的模型，其使用抗CD18和VLA-4整聯(lián)蛋白的單克隆抗體。
已有文獻(xiàn)描述了一種哮喘模型，其中，用卵清蛋白致敏動(dòng)物，然后用氣溶膠將相同蛋白傳送給該動(dòng)物進(jìn)行抗原攻擊，以此誘導(dǎo)出抗原誘導(dǎo)性氣道高反應(yīng)性，肺嗜酸粒細(xì)胞增多和炎癥。多種動(dòng)物模型(豚鼠，大鼠，非人靈長(zhǎng)類)在用氣溶膠抗原攻擊后，顯示與人的特應(yīng)性哮喘相似的癥狀。鼠模型具有人哮喘的許多特征。檢驗(yàn)本發(fā)明組合物在哮喘治療中的活性和有效性的適宜方案見Wolyniec，W.W.et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，(1998)18777以及其中引用的參考文獻(xiàn)。
此外，本發(fā)明組合物還可在牛皮癬樣疾病的動(dòng)物模型上檢驗(yàn)。本發(fā)明的化合物可以在Schon，M.P et al.，Nat.Med.，(1997)3183所述的scid/scid小鼠模型中檢驗(yàn)，其中小鼠顯示類似牛皮癬的組織病理學(xué)皮膚損傷。另一適宜模型是Nickoloff，B.J.et al.，Am.J.Path.，(1995)146580所述的人皮膚/scid小鼠嵌合體。
已知有多種動(dòng)物模型可以用于檢驗(yàn)候選治療組合物的抗癌活性。這些包括，將人腫瘤異種移植到無(wú)胸腺裸鼠或scid/scid小鼠中的模型，或遺傳鼠腫瘤模型例如p53基因敲出小鼠。
重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物模型可以通過(guò)，用制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本文所述分子的編碼區(qū)引入目標(biāo)動(dòng)物的基因組來(lái)制造?？梢宰鳛檗D(zhuǎn)基因操作的目標(biāo)的動(dòng)物包括，且不限于小鼠，大鼠，兔，豚鼠，綿羊，山羊，豬和非人靈長(zhǎng)類，例如狒狒(baboon)，黑猩猩(chimpanzee)和猴子。本領(lǐng)域已知的將轉(zhuǎn)基因引入此種動(dòng)物的技術(shù)包括，原核顯微注射(Hoppe and Wanger，美國(guó)專利4,873,191))；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)將基因轉(zhuǎn)移到生殖系(germ line)中(例如，Van der Putten et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，6148-615 )；將基因靶向胚胎干細(xì)胞(Thompson et al.，Cell，56，313-321 )；胚胎電穿孔(Lo，Mol.Cel.Biol.，3，1803-1814 )；精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano etal.，Cell，57，717-73 ))。綜述參見，例如，美國(guó)專利4,736,866。
為了本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括，僅在其部分細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的那些動(dòng)物(“嵌合體動(dòng)物(mosaic animal)”)。該轉(zhuǎn)基因可以作為單個(gè)轉(zhuǎn)基因或作為串聯(lián)體(concatamer)，例如頭-頭或頭-尾串聯(lián)體而被整合。將轉(zhuǎn)基因選擇性引入具體細(xì)胞類型可通過(guò)，例如Lasko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，6232-636(1992)所述技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。例如，可以用Southern印跡分析或PCR擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的整合。然后，可以利用諸如原位雜交，Northern印跡分析，PCR或免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)來(lái)分析mRNA表達(dá)的水平。還可以檢查該動(dòng)物的免疫疾病病理或是否存在癌性或惡性組織，例如通過(guò)組織學(xué)檢查確定免疫細(xì)胞對(duì)具體組織的浸潤(rùn)。
或者，可以構(gòu)建“基因敲出”動(dòng)物，其具有缺陷的或已改變的、編碼本文所述多肽的基因，該基因是編碼該多肽的內(nèi)源基因與編碼引入該動(dòng)物胚細(xì)胞的相同多肽的經(jīng)改變基因組DNA之間同源重組的結(jié)果。例如，可以根據(jù)已有的技術(shù)，用編碼具體多肽的cDNA來(lái)克隆編碼該多肽的基因組DNA?？梢詫⒕幋a具體多肽的基因組DNA的一部分缺失或用另一基因取代，所述另一基因例如編碼可用來(lái)監(jiān)測(cè)整合的選擇性標(biāo)記的基因。通常，未改變的側(cè)翼DNA(位于5’和3’末端)的數(shù)千堿基都包含在載體中[見例如Thomasand Capecchi，Cell，51503(1987)關(guān)于同源重組載體的描述]。將該載體引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過(guò)電穿孔來(lái)引入)，選出一些細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，引入的DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組[見例如，Li et al.，Cell，69915(1992)]。然后，將選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的囊胚中，以形成聚集嵌合體[見例如Bradley，in Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsAPractical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152]。隨后，將嵌合胚植入適宜的假孕雌性代養(yǎng)動(dòng)物中，植入的胚胎將產(chǎn)生“基因敲出”動(dòng)物。那些在生殖細(xì)胞中攜帶同源重組DNA的后代可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，并用來(lái)產(chǎn)生后代動(dòng)物，使這些動(dòng)物的所有細(xì)胞都包含同源重組DNA?！盎蚯贸觥眲?dòng)物可以，例如，以它們抵抗一些病理疾病的能力和它們由于缺乏該多肽而產(chǎn)生病理情況的特征來(lái)表征。
C.配制劑本文描述的TACI抗體可選在載體中應(yīng)用。適宜載體和它們的配制劑在Osol等編輯的，Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th ed.，1980，MackPublishing Co.中描述。通常，在載體中使用適量的可藥用鹽使配制劑等滲。所述載體的實(shí)例包括鹽水，林格溶液(Ringer’s solution)和葡萄糖溶液(dextrose solution)。載體的pH優(yōu)選約5-8，更優(yōu)選約7.4-7.8。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，有一些載體是更優(yōu)選的，這取決于，例如，所給藥的活性制劑的給藥途徑和濃度。載體可以為凍干配制劑或水溶液的形式。
可接受的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑優(yōu)選在所用劑量及濃度對(duì)細(xì)胞和/或受體無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(少于約10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它糖包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
配制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但相互無(wú)負(fù)面影響的那些。
本文所述TACI抗體也可容納在微膠囊中，或容納在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述微膠囊可以通過(guò)諸如凝聚(coacervation)技術(shù)或界面聚合作用來(lái)制備，例子分別有羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見Remington′s PharmaceuticalSciences16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
用于體內(nèi)給藥的配制劑必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)除菌濾膜過(guò)濾而輕易實(shí)現(xiàn)。
也可制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括含有活性制劑的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實(shí)例包括，聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間更短。
D.治療模式本文描述的分子可用于治療各種病理情況，如免疫相關(guān)疾病或癌癥。這些情況可通過(guò)例如施用本文所述的一種或多種TACI抗體或拮抗劑或激動(dòng)劑，刺激或抑制哺乳動(dòng)物中一種選定的與TALL-1，APRIL，TACI，BCMA，TACIs或BR3相關(guān)的活性來(lái)治療。
對(duì)哺乳動(dòng)物的本文所述各種病理情況的診斷可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員完成。本領(lǐng)域已有一些診斷技術(shù)可以，例如診斷或檢測(cè)哺乳動(dòng)物中與癌癥或免疫相關(guān)的疾病。例如，可鑒定癌癥的技術(shù)包括，但不限于，觸診，血液分析，X線，NMR等。免疫相關(guān)疾病也可以很容易地鑒定。系統(tǒng)性紅斑狼瘡這種疾病的主要起因(central mediator)是，產(chǎn)生針對(duì)自身蛋白/組織的自體-反應(yīng)性抗體并隨后產(chǎn)生免疫-介導(dǎo)的炎癥。臨床上多有個(gè)器官和系統(tǒng)受到影響，包括腎，肺，肌骨骼(musculoskeletal)系統(tǒng)，粘膜皮膚(mucocutaneous)，眼，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，胃腸道，骨髓和血液。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫炎癥疾病，它主要涉及多個(gè)關(guān)節(jié)的滑膜，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。其發(fā)病機(jī)理依賴T淋巴細(xì)胞而且與類風(fēng)濕因子，針對(duì)自體IgG的自身抗體的生產(chǎn)相關(guān)，結(jié)果形成了在關(guān)節(jié)液和血液中達(dá)到高水平的免疫復(fù)合物。這些關(guān)節(jié)內(nèi)復(fù)合物可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞向滑膜的明顯浸潤(rùn)及其后的明顯滑膜改變；如果被類似細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)間隔/關(guān)節(jié)液中會(huì)增加大量中性粒細(xì)胞。受影響的組織主要為關(guān)節(jié)，通常是對(duì)稱方式。然而，關(guān)節(jié)外疾病也會(huì)以兩種主要形式出現(xiàn)。一種形式是發(fā)生關(guān)節(jié)外損害并伴有進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病及肺部纖維化，脈管炎，及皮膚潰瘍的典型損害。關(guān)節(jié)外疾病的第二種形式為所謂的Felty’s綜合征，該病在RA病程中出現(xiàn)得晚，有時(shí)在關(guān)節(jié)病變靜止后出現(xiàn)，并涉及嗜中性白細(xì)胞減少癥，血小板減少癥和脾腫大的存在。這可伴隨有多器官的脈管炎并形成梗塞，皮膚潰瘍和壞疽。病人通常也在覆蓋病變關(guān)節(jié)的皮下組織中出現(xiàn)(develop)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)；結(jié)節(jié)晚期具有為混合的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)物包繞的壞死中心。其它可以在RA中出現(xiàn)的表現(xiàn)包括心包炎，胸膜炎，冠狀動(dòng)脈炎，伴有肺部纖維化的間質(zhì)性肺炎，干性角膜結(jié)膜炎，和類風(fēng)濕結(jié)節(jié)。
青年期慢性關(guān)節(jié)炎(Juvenile chronic arthritis)為通常開始于16歲以下的慢性自發(fā)性炎癥。它的表型與RA有一些類似；一些類風(fēng)濕因子陽(yáng)性病人被分類為青年期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。該疾病被再分類為三大類少關(guān)節(jié)型，多關(guān)節(jié)型，及全身型。此種關(guān)節(jié)炎可以很嚴(yán)重，且通常為破壞性(destructive)，造成關(guān)節(jié)強(qiáng)硬并延緩生長(zhǎng)。其它表現(xiàn)可包括慢性前葡萄膜炎和系統(tǒng)性淀粉樣變性病。
椎關(guān)節(jié)病(Spondyloarthropathy)為具有一些共同臨床特征并與HLA-B27基因產(chǎn)物的表達(dá)共同相關(guān)的一組病癥。所述病癥包括關(guān)節(jié)強(qiáng)直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)，Reiter’s綜合征(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)，關(guān)節(jié)炎伴有炎性腸疾病(arthritis associated with inflammatory bowel disease)，脊椎炎伴有牛皮癬(spondylitis associated with psoriasis)，青年期起始椎關(guān)節(jié)病(juvenile onsetspondyloarthropathy)和未分化椎關(guān)節(jié)病(undifferentiatedspondyloarthropathy)。區(qū)別特征包括伴有或不伴有脊椎炎的骶骨關(guān)節(jié)病(sacroileitis)；炎性非對(duì)稱關(guān)節(jié)炎；與HLA-B27(I類MHC的HLA-B基因座的血清型等位基因)相關(guān)；眼部炎癥，及缺乏其它類風(fēng)濕疾病相關(guān)的自身抗體。常被暗示為誘導(dǎo)該疾病的關(guān)鍵的細(xì)胞是CD8+T淋巴細(xì)胞，這是一種靶向I類MHC分子呈遞的抗原的細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可與I類MHC等位基因HLA-B27反應(yīng)，如同它是I類MHC分子所表達(dá)的外源肽。有人假設(shè)，HLA-B27的表位可以模擬細(xì)菌或其它微生物抗原表位，并因此誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
系統(tǒng)性硬化癥(Systemic sclerosis)(硬皮病(scleroderma))的病因?qū)W未知。該疾病的特點(diǎn)是皮膚的硬化；可能這是通過(guò)活動(dòng)性炎癥過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)的。硬化癥可為局限的或全身的；血管損傷是常見的而且微脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是系統(tǒng)性硬化癥發(fā)展早期的重要事件；血管損傷可能是免疫介導(dǎo)的。很多病人有皮膚損傷部位的單核細(xì)胞浸潤(rùn)并且有抗核抗體，這暗示具有免疫學(xué)基礎(chǔ)。ICAM-1通常在皮膚損傷中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面被上調(diào)，這表明T細(xì)胞與這些細(xì)胞的相互作用可能在此病的發(fā)病機(jī)制中起作用。其它參與的器官包括胃腸道平滑肌萎縮和纖維化導(dǎo)致異常蠕動(dòng)/運(yùn)動(dòng)；腎影響小弓狀動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈的同心、內(nèi)皮下、血管內(nèi)膜組織增生(concentricsubendothelial intimal proliferation)導(dǎo)致腎皮質(zhì)血流降低，可造成蛋白尿，氮質(zhì)血癥(azotemia)及高血壓；骨骼肌萎縮，間質(zhì)性纖維化；炎癥；肺間質(zhì)性肺炎和間質(zhì)性纖維化；及心臟收縮帶壞死，瘢痕/纖維化。
特發(fā)性炎癥肌病(Idiopathic inflammatory myopathy)包括皮肌炎，多肌炎和其它為病因?qū)W未知但導(dǎo)致肌肉虛弱的慢性肌肉炎癥病癥。肌肉損傷/炎癥通常是對(duì)稱和進(jìn)行性的。自身抗體與多數(shù)形式相關(guān)。這些肌炎特異性自身抗體是針對(duì)并抑制參與蛋白合成的成分，蛋白和RNA的功能。
Sjogren’s綜合征(Sjogren′s syndrome)是起因于免疫介導(dǎo)的炎癥及后來(lái)的淚腺和唾液腺功能性破壞。該疾病可與炎性結(jié)締組織疾病相關(guān)或伴發(fā)。此疾病與抗Ro抗原和La抗原(此二者均為小RNA-蛋白復(fù)合物)的自身抗體的產(chǎn)生相關(guān)。損害可導(dǎo)致干性角膜結(jié)膜炎(keratoconiunctivitis sicca)，口腔干燥(xerostomia)，及其它表現(xiàn)或相關(guān)癥狀包括膽汁性肝硬變，外周或感覺神經(jīng)的神經(jīng)病變，和可觸知的紫癜(palpable purpura)。
全身性脈管炎(Systemic vasculitis)為其中原發(fā)性損害為炎癥，之后是對(duì)血管的損害，導(dǎo)致由病變血管供血的組織缺血/壞死/變性，在一些病例中終末器官功能逐步紊亂。脈管炎也可以是其它免疫炎癥介導(dǎo)的疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性硬化癥等，特別是也與免疫復(fù)合物形成相關(guān)的疾病)的繼發(fā)損害或后遺癥(sequelae)。原發(fā)性全身性脈管炎的疾病包括全身性壞死性脈管炎結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritis nodosa)，變應(yīng)性血管炎(allergic angiitis)和肉芽腫病(granulomatosis)，多血管炎(polyangiitis)；多發(fā)性肉芽腫病(Wegener′s granulomatosis)；淋巴瘤樣肉芽腫病(lymphomatoidgranulomatosis)；和巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(giant cell arteritis)。其它多種脈管炎包括粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征(MLNS或川崎癥)，孤立的(isolated)CNS脈管炎，Behet′s病，閉塞性血栓性脈管炎(Buerger′s病)和皮膚壞死性小靜脈炎。所列的大多數(shù)類型的脈管炎，其病理機(jī)制據(jù)信主要是由于免疫球蛋白復(fù)合物在血管壁沉積，之后誘導(dǎo)了由ADCC或/和補(bǔ)體活化造成的炎癥應(yīng)答。
結(jié)節(jié)病(Sarcoidosis)為病因?qū)W未知的疾病，其特點(diǎn)為上皮樣肉芽腫在身體的幾乎任何組織中存在；肺受累是最常見的。病因機(jī)制包括活化的巨噬細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞在病灶的持續(xù)(persistence)，以及后來(lái)由這些細(xì)胞類型釋放局部和全身活性產(chǎn)物所造成的慢性后遺癥。
自身免疫性溶血性貧血(包括自身免疫性溶血性貧血，免疫全血細(xì)胞減少癥(immune pancytopenia)，和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(paroxysmal nocturalhemoglobinuria))，是產(chǎn)生與紅細(xì)胞(并且在一些病例中，也包括血小板等其它血細(xì)胞)表面表達(dá)的抗原反應(yīng)的抗體的結(jié)果，它反映那些抗體包被細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血和/或ADCC/Fc-受體-介導(dǎo)的機(jī)制被去除。
在自身免疫性血小板減少癥，包括血小板減少性紫癜，和其它臨床類型(settings)中的免疫介導(dǎo)的血小板減少癥中，發(fā)生血小板破壞/去除是由于，抗體或補(bǔ)體附著于血小板并隨后通過(guò)補(bǔ)體溶血，ADCC或FC-受體介導(dǎo)的機(jī)制去除。
甲狀腺炎包括Grave’s疾病，橋本氏甲狀腺炎，青年期淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，和萎縮性甲狀腺炎，都是針對(duì)甲狀腺抗原的自身免疫應(yīng)答的結(jié)果，該免疫應(yīng)答產(chǎn)生與蛋白反應(yīng)的抗體，此種蛋白存在于甲狀腺并對(duì)其特異。已有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ㄗ园l(fā)模型大鼠(BUF和BB大鼠)和小雞(肥胖小雞品系)；誘導(dǎo)模型用甲狀腺球蛋白或甲狀腺微粒體抗原(甲狀腺過(guò)氧化物酶)免疫動(dòng)物。
I型糖尿病或胰島素-依賴性糖尿病為胰島β細(xì)胞的自身免疫破壞；此種破壞是通過(guò)自身抗體和自體反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的?？挂葝u素或胰島素受體的抗體也可形成胰島素不反應(yīng)性的表型。
免疫介導(dǎo)的腎病，包括腎小球腎炎和腎小管間質(zhì)性腎炎，是抗體或T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腎組織傷害的結(jié)果，它或者直接因產(chǎn)生抗腎抗原的自身反應(yīng)性抗體或T細(xì)胞引起，或者間接因與其它非腎抗原反應(yīng)的抗體和/或免疫復(fù)合物在腎沉積引起。因而其它引起免疫復(fù)合物形成的免疫介導(dǎo)性疾病也間接誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的腎病。直接和間接的免疫機(jī)制導(dǎo)致炎癥應(yīng)答，它在腎組織產(chǎn)生/誘導(dǎo)損害的發(fā)展，結(jié)果造成器官功能損害，而且在一些病例中會(huì)發(fā)展為腎衰。體液和細(xì)胞免疫機(jī)制可參與損害的發(fā)病機(jī)理。
中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病(Demyelinating diseases)，包括多發(fā)性硬化、自發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或Guillain-Barr綜合征、以及慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病，都備認(rèn)為具有自身免疫基礎(chǔ)并導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘作用，它是對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte)或直接對(duì)髓鞘質(zhì)損害的結(jié)果。在MS，有證據(jù)提示，疾病的誘發(fā)和進(jìn)展是依賴T淋巴細(xì)胞的。多發(fā)性硬化為依賴T淋巴細(xì)胞、并具有復(fù)發(fā)-緩解病程或慢性進(jìn)行性病程的脫髓鞘疾病。其病因?qū)W未知；然而，病毒感染，遺傳性誘因，環(huán)境，和自身免疫力都起作用。損害包括主要為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)；CD4+T淋巴細(xì)胞為損害部位的主要細(xì)胞類型。少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡以及隨后脫髓鞘的機(jī)制是未知的，但可能受T淋巴細(xì)胞驅(qū)策。
炎性和纖維化肺部疾病，包括嗜酸性粒細(xì)胞肺炎(EosinophilicPneumonias)；自發(fā)性肺纖維化，和超敏反應(yīng)性肺炎可能包括失調(diào)性(disregulated)免疫炎性應(yīng)答。對(duì)該應(yīng)答的抑制具有治療效果。
自身免疫或免疫介導(dǎo)的皮膚疾病，包括大皰皮膚疾病(Bullous SkinDiseases)，多形紅斑(Erythema Multiforme)，及接觸性皮炎(ContactDermatitis)，都是通過(guò)自身抗體介導(dǎo)的，該自身抗體的生成是T淋巴細(xì)胞依賴性的。
牛皮癬為T淋巴細(xì)胞-介導(dǎo)的炎癥。損害包含T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，以及一些中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。
過(guò)敏性疾病，包括哮喘；過(guò)敏性鼻炎；特應(yīng)性皮炎；食物超敏反應(yīng)和風(fēng)疹都是依賴T淋巴細(xì)胞的。這些疾病主要通過(guò)T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥，IgE介導(dǎo)的炎癥或二者的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)。
移植相關(guān)疾病，包括移植物排斥反應(yīng)和移植物-抗-宿主-疾病(GVHD)，都是依賴T淋巴細(xì)胞的；抑制T淋巴細(xì)胞功能具有改善作用。
其它可以受益于對(duì)免疫和/或炎性應(yīng)答的干預(yù)的疾病為感染性疾病，其包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎)，細(xì)菌感染，真菌感染，以及原蟲和寄生蟲感染(可以用刺激MLR的分子(或衍生物/激動(dòng)劑)治療，以增強(qiáng)對(duì)感染因子的免疫應(yīng)答)，免疫缺陷病(可以用刺激MLR的分子/衍生物/激動(dòng)劑)進(jìn)行治療，以便增強(qiáng)對(duì)先天的、后天獲得的、感染誘導(dǎo)的(如在HIV感染中)、或因醫(yī)生治療(即，如由化療)引起的疾病的免疫應(yīng)答)，和腫瘤形成。
TACI抗體或拮抗劑或激動(dòng)劑可根據(jù)已知方法給藥，如靜脈給藥(例如作為大丸劑(bolus)給藥或通過(guò)持續(xù)輸注一段時(shí)間而給藥)等，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹腔、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部、或吸入途徑給藥。備選地，可以使用多種商品化裝置經(jīng)微型-泵輸注來(lái)給藥。所述拮抗劑或激動(dòng)劑也可以利用本領(lǐng)域已描述的基因治療技術(shù)來(lái)加以應(yīng)用。
TACI抗體或拮抗劑或激動(dòng)劑的有效給藥量和給藥方案可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)范疇內(nèi)的事。單一劑量或多劑量都可以采用?，F(xiàn)認(rèn)為，單獨(dú)應(yīng)用拮抗劑或激動(dòng)劑時(shí)，有效量可以為每天約1ng/kg-100mg/kg體重或更多。種屬間有效劑量的比例(Interspecies scaling)可以用本領(lǐng)域已知方式進(jìn)行換算，例如見Mordenti et al.，Pharmaceut.Res.，81351(1991)。
當(dāng)體內(nèi)給藥TACI抗體或其拮抗劑或激動(dòng)劑時(shí)，根據(jù)給藥途徑，正常劑量可以是每天約10ng/kg-100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多，優(yōu)選約1μg/kg/天-10mg/kg/天。具體運(yùn)送劑量和運(yùn)送方法指南可以參見，例如，美國(guó)專利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。預(yù)計(jì)不同的治療化合物和不同的疾病需要不同的配方才有效，例如，向一種器官或組織給藥所必需的運(yùn)送方式可能不同于向另一器官或組織給藥的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所需給藥劑量將基于，例如，接受該治療的哺乳動(dòng)物、給藥途徑、以及給與該哺乳動(dòng)物的其它藥物或治療而不同。
根據(jù)細(xì)胞類型和/或疾病嚴(yán)重性的不同，在例如一次或多次分別給藥或持續(xù)輸注給藥時(shí)，拮抗劑抗體或激動(dòng)劑抗體的起始給藥劑量是約1μg/kg-150mg/kg(例如0.1-20mg/kg)。典型的日劑量可以是約1μg/kg-100mg/kg或更多，取決于上述因素。在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥時(shí)，根據(jù)病情的不同，可以持續(xù)治療，直到疾病癥狀出現(xiàn)所需抑制。但也可以使用其它劑量方案。
任選地，在給予任何治療之前，可以測(cè)試哺乳動(dòng)物或病人，以便確定TALL-1，APRIL，TACI，BCMA，TACIs或BR3的活性或水平。所述測(cè)試可以通過(guò)對(duì)血清樣品或外周血白細(xì)胞進(jìn)行ELISA或FACS來(lái)實(shí)現(xiàn)。
單一類型的治療可用于本發(fā)明的方法中。例如，可以給藥TACI抗體?；蛘?，熟練技術(shù)人員可以在所述方法中選用TACI抗體與拮抗劑或激動(dòng)劑的組合，例如TACI抗體與BR3抗體的組合。還優(yōu)選采用雙重激動(dòng)劑或拮抗劑，即，例如阻斷或抑制TALL-1和APRIL的拮抗劑。此種拮抗劑分子可以，例如，與TALL-1和APRIL，或TACI，TACIs，BR3以及BCMA之間保守的表位結(jié)合。
所述方法中還可以包括其它治療。所述一或多種其它治療可包括但不限于，施用本領(lǐng)域已知且在上文I部分具體詳述的放療，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)抑制劑，化療劑，細(xì)胞毒性劑，酪氨酸激酶抑制劑，ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，血管生成抑制劑，和依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶抑制劑。此外，還有一些療法是基于，靶向腫瘤抗原的治療性抗體例如RituxanTM或HerceptinTM，以及抗血管生成抗體例如抗VEGF。
化療劑的制備和劑量方案可根據(jù)廠家說(shuō)明書施用或由熟練操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。所述化療的制劑和劑量方案也參見Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。例如，化療劑可以在給藥激動(dòng)劑或拮抗劑之前、或之后、或同時(shí)給藥。例如，激動(dòng)劑或拮抗劑也可以與抗雌激素化合物例如他莫昔芬或抗孕激素例如奧納司酮(見EP616812)以此種分子已知的劑量聯(lián)用。
也可以另外還施用抗其它抗原的抗體，例如結(jié)合CD20，CD11a，CD18，CD40，ErbB2，EGFR，ErbB3，ErbB4，血管內(nèi)皮因子(VEGF)或TNFR家族其它成員(例如DR4，DR5，OPG，TNFR1，TNFR2)的抗體?；蛘呋虼送猓部梢詫⑴c相同的、或兩種不同的、或更多種不同的本文所述抗原結(jié)合的兩種或更多種抗體聯(lián)合給與病人。有時(shí)，對(duì)病人另外還給與一種或更多種細(xì)胞因子也有利。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文的激動(dòng)劑或拮抗劑與生長(zhǎng)抑制劑聯(lián)合給藥。例如，可以先施用生長(zhǎng)抑制劑，隨后施用本發(fā)明的激動(dòng)劑或拮抗劑。
拮抗劑或激動(dòng)劑(以及一種或更多其它療法)可以同時(shí)或依次施用。施用拮抗劑或激動(dòng)劑后，可分析經(jīng)處理的體內(nèi)細(xì)胞。在體內(nèi)處理的情況中，可用熟練操作人員熟悉的多種方式監(jiān)測(cè)經(jīng)處理的哺乳動(dòng)物。例如，可分析B細(xì)胞活性的標(biāo)記物例如Ig的產(chǎn)生(非特異性或抗原特異性)。
E.重組制備的方法本發(fā)明還提供編碼本文所述TACI抗體的分離的核酸，包含該核酸的載體和宿主，以及制備該抗體的重組技術(shù)。
為了重組制備所述抗體，分離其編碼核酸并插入復(fù)制型載體中以便進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA)或表達(dá)。編碼所述抗體的DNA可以用常規(guī)方法很容易地分離并測(cè)序(例如使用能夠特異型結(jié)合編碼所述抗體的基因的寡核苷酸探針)。有多種載體可以利用。載體組分通常包括但不限于一或多個(gè)下列組分信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。
本文的方法包括制備嵌合或重組抗-TACI抗體的方法，其包括提供載體、用該載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、以及在足以產(chǎn)生重組抗-TACI抗體產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟，其中所述載體包含編碼抗-TACI抗體輕鏈和/或重鏈的DNA。
(i)信號(hào)序列組分本發(fā)明的抗-TACI抗體不僅可以直接表達(dá)，還可作為與異源多肽融合的多肽來(lái)表達(dá)，所述異源多肽優(yōu)選信號(hào)序列或其它在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點(diǎn)的多肽。所選異源信號(hào)序列是被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶裂解)的序列。對(duì)于不能識(shí)別和加工天然抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列被選自，例如，堿性磷酸酶，青霉素酶，1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核生物信號(hào)序列取代。為了進(jìn)行酵母分泌，可以將天然信號(hào)序列取代為，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)α因子前導(dǎo)序列和克魯維酵母(Kluyveromyces)α因子前導(dǎo)序列)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或WO 90/13646描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒的分泌前導(dǎo)序列，如單純皰疹病毒gD信號(hào)都可以采用。
這些前體區(qū)的DNA與編碼所述抗體的DNA連接在閱讀框內(nèi)。
(ii)復(fù)制起點(diǎn)組分表達(dá)載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。這樣的序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母菌，多種病毒起點(diǎn)(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。復(fù)制起點(diǎn)組分一般不是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所必需的(SV40起點(diǎn)的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動(dòng)子)。
(iii)選擇基因組分表達(dá)載體和克隆載體可以包含選擇基因，也稱選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物限制(arrest)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇的實(shí)例采用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的另一例選擇標(biāo)記是允許鑒定能攝取所述抗體核酸的細(xì)胞的那些，如DHFR，胸苷激酶，金屬硫蛋白-I型和-II型，優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。
例如，細(xì)胞被DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化后，先將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來(lái)鑒定細(xì)胞。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是DHFR活性有缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
或者，宿主細(xì)胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼抗-DR4抗體的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標(biāo)記如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過(guò)在含有針對(duì)該選擇標(biāo)記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行選擇。參見美國(guó)專利4,965,199。
適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記(Jones，Genetics，8512(1977))。此后，酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1損傷的存在提供了通過(guò)在缺乏色氨酸的條件中生長(zhǎng)而檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒來(lái)互補(bǔ)。
此外，源自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)。備選地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)報(bào)道了一種用于在乳克魯維酵母(K.lactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。還有人公開了用于通過(guò)克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定、多拷貝表達(dá)載體。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)啟動(dòng)子組分表達(dá)載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識(shí)別的啟動(dòng)子，它與所述抗體核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，和雜合(hybrid)啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。但其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。適用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還可以包含與編碼抗-TACI抗體的DNA可操作相連的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處有另一種序列CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作為一種信號(hào)用于將poly-A尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表達(dá)載體中。
適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些另具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子聯(lián)合使用也是有利的。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，從載體轉(zhuǎn)錄抗-TACI抗體可以受啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子例如來(lái)自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(fowlpox virus)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，來(lái)自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等，來(lái)自熱休克啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。美國(guó)專利4,419,446中公開了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來(lái)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利4,601,978中敘述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)改進(jìn)。另見Reyes等，Nature，297598-601(1982)關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人β干擾素cDNA。備選地，可以將勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列用作啟動(dòng)子。
(v)增強(qiáng)子元件組分編碼本發(fā)明抗-TACI抗體的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體中來(lái)增加。目前已知很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。但通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp 100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。也可參見Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。增強(qiáng)子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5’或3’側(cè)，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’側(cè)。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止組分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還可以包括對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和mRNA穩(wěn)定所必需的序列。這些序列通常來(lái)自真核細(xì)胞或病毒的DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼多價(jià)抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有效的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026以及本文公開的表達(dá)載體。
(vii)選擇并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞克隆或表達(dá)本文所述載體中的DNA的適宜宿主細(xì)胞，包括上述原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠菌假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌(Streptomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實(shí)例是用于說(shuō)明，并非限制。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于編碼TACI抗體的載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個(gè)其它屬、種和株已有商品供應(yīng)，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)等。
適合于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的容許型昆蟲宿主細(xì)胞草地夜蛾(SpodopteraFrugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾(Autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。
棉花(cotton)、玉米(corn)、土豆(potato)、大豆(soybean)、矮牽牛(petunia)、西紅柿(tomato)和煙草(tobacco)的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關(guān)注最多的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或經(jīng)過(guò)再克隆后能在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；倉(cāng)鼠幼鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annala N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Hep G2)；以及骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞(例如，Y0，J558L，P3和NS0細(xì)胞)(見美國(guó)專利5,807,715)。
宿主細(xì)胞用上述用于制備抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在改進(jìn)型傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進(jìn)已適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
(viii)培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham’s F10(Sigma)，極限必需培養(yǎng)基((MEM)，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。此外，Ham et al.，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes et al.，Anal.Biochem.102255(1980)，U.S.Pat.Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；or 5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或U.S.Patent Re.30,985所述的任一種培養(yǎng)基也可以用作宿主細(xì)胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(如胰島素，運(yùn)鐵蛋白，或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如GentamycinTM)，痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的無(wú)機(jī)化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等，都是在選定的表達(dá)宿主上已用到的那些，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。
(ix)純化使用重組技術(shù)時(shí)，所述抗體可產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，在周質(zhì)空間中，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體是產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，首先要通過(guò)例如離心或超濾作用除去顆粒狀殘?jiān)?為宿主細(xì)胞或裂解的片段)。Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了一種將已分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體分離的方法。簡(jiǎn)言之，在有乙酸鈉(pH 3.5)，EDTA，和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情況下將細(xì)胞團(tuán)解凍約30分鐘。細(xì)胞碎片可以通過(guò)離心除去。在抗體分泌至培養(yǎng)基的情況中，通常首先使用諸如Amicon或MilliporePellicon超濾單元等市售蛋白濃縮濾器濃縮這類表達(dá)系統(tǒng)的上清。上述任一步驟中可以包括PMSF等蛋白酶抑制劑，以便抑制蛋白水解，還可以包括抗生素，以便防止外來(lái)污染物(adventitious contaminant)的生長(zhǎng)。
從所述細(xì)胞制備的抗體組合物可以利用，例如，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析純化技術(shù)。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴于所述抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可以用來(lái)純化基于人γ1，γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmarket al.，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有小鼠同種型以及用于人γ3(Guss et al.，EMBO J.515671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)最常是瓊脂糖，也可以采用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如控制孔徑的玻璃(controlled pore glass)或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)與瓊脂糖相比，其流速更快且處理時(shí)間更短。當(dāng)抗體包含CH3區(qū)時(shí)，可以用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)純化。其它蛋白純化技術(shù)，例如離子交換柱分級(jí)分離，乙醇沉淀，反相HPLC，硅層析，肝素SEPHAROSETM層析，陽(yáng)離子或陰離子交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸銨沉淀也可以采用，這取決于所回收的抗體。
F.制品(ARTICLES OF MANUFACTURE)在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了含有對(duì)治療上述病癥有用的物質(zhì)的制品。該制品包含容器和標(biāo)簽。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器內(nèi)裝載有效治療所述疾病的組合物，并可具有無(wú)菌存取口(例如該容器可以是靜脈點(diǎn)滴袋(intravenoussolution bag)或帶有能通過(guò)皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。組合物中的活性制劑可包含拮抗劑或激動(dòng)劑。在容器上的或與容器相連的標(biāo)簽表明，組合物可以用來(lái)治療指定的疾病。該制品還可以包含第二個(gè)容器，其中含有可藥用緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，林格溶液(Ringer’s solution)，和葡萄糖溶液。它還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，注射器和帶有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。
2002年7月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/398,530，以及Seshasayee，Det al.，(2003)Immunity 18279-288都全文引入本文作為參考。
提供下述例子是為舉例說(shuō)明而不是限定。說(shuō)明書中引用的所有文獻(xiàn)內(nèi)容都引入本文作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1制備抗-TACI單克隆抗體給Balb/c小鼠(從Charles River Laboratories獲得)注射置于MPL-TDM佐劑(購(gòu)自Ribi Immunochemical Research Inc.，Hamilton，MT)中的2μg人TACI-IgG進(jìn)行免疫，每只后足墊注射10次。人TACI-IgG免疫粘附素按照Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.，8810535-10539(1991)的方法制備。所述免疫粘附素構(gòu)建體由人TACI多肽的氨基酸2-166組成。TACI-ECD構(gòu)建體在CHO細(xì)胞中表達(dá)，然后通過(guò)蛋白A親和層析純化，所述表達(dá)使用異源信號(hào)序列(pCMV-1 Flag的前-原胰蛋白酶氨基酸1-17(Sigma))并在TACI序列下游編碼人IgG1 Fc區(qū)。
末次加強(qiáng)免疫的3天后，從小鼠取出腘淋巴結(jié)(popliteal lymph node)，在添加了1％青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(獲自Biowhittaker Corp.)中制備單細(xì)胞懸液。然后將淋巴結(jié)細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63AgU.1(ATCCCRL 1597)用35％聚乙二醇融合，在96-孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。融合所得雜交瘤在HAT培養(yǎng)基中篩選。融合的10天后，雜交瘤培養(yǎng)上清在ELISA中篩選，以便測(cè)試是否存在結(jié)合TACI-IgG但不結(jié)合CD4-IgG的單克隆抗體。還用捕獲ELISA法篩選這些單克隆抗體與BMCA-IgG的任何結(jié)合。
為了進(jìn)行捕獲ELISA，包被96-孔微滴板(Maxisorb；Nunc，Kamstrup，Denmark)，方法是向每孔添加50μl 2.0μg/ml山羊抗-人IgG-Fc(Cappel Inc)在50mM碳酸鹽緩沖液，pH 9.6中的溶液并4℃保溫過(guò)夜。非特異性結(jié)合位點(diǎn)用200μl 2％BSA室溫封閉1小時(shí)。然后，培養(yǎng)板用洗滌緩沖液(含0.05％Tween 20的PBS)洗3次。洗滌之后，將培養(yǎng)板用50μl/孔0.4μg/mlTACI-IgG的PBS液室溫保溫1小時(shí)。洗3次后，在指定孔中添加100μl雜交瘤上清或各種濃度的多克隆血清。在其它指定孔中添加100μl經(jīng)過(guò)P3X63AgU.1骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(conditioned medium)作為對(duì)照。將培養(yǎng)板在振蕩器上室溫保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗3次。
然后，每孔添加50μl已在試驗(yàn)緩沖液(0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，0.01％Thimersol的PBS液)中1∶1000稀釋的HRP-偶聯(lián)型山羊抗-小鼠IgG Fc(購(gòu)自Cappel Laboratories)，將培養(yǎng)板在振蕩器上室溫保溫1小時(shí)。板用洗滌緩沖液洗3次后，每孔添加50μl底物(TMB microwell peroxidasesubstrate，Kirkegaard & Perry，Gaithersburg，MD)，室溫保溫10分鐘。每孔添加50μl TMB 1-成分終止液(二乙基乙二醇(diethyl glycol)，Kirkegaard &Perry)終止反應(yīng)，在自動(dòng)微滴板讀板儀上讀取450nm的吸光度。
然后將在ELISA中測(cè)試為陽(yáng)性的上清用有限稀釋法克隆兩次。
實(shí)施例2鑒定能識(shí)別膜TACI的抗-TACI抗體按實(shí)施例1所述產(chǎn)生并制備抗-TACI抗體1G10.1.5，5B6.3.10.和6D11.3.1。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，這些mAb識(shí)別膜TACI。簡(jiǎn)言之，將人B淋巴樣IM9細(xì)胞(ATCC，CCL-159)(5×105細(xì)胞在100μl RPMI-1640完全培養(yǎng)基中)鋪到48-孔微滴板中，在37℃、5％CO2中與100μl FITC-山羊抗-小鼠IgG Fc在200ml結(jié)合緩沖液中的溶液保溫過(guò)夜。洗滌后，用FACScan分析細(xì)胞。
圖10顯示試驗(yàn)結(jié)果，其中抗-TACI mAb識(shí)別能表達(dá)TACI的IM9細(xì)胞。
實(shí)施例3抗-TACI抗體的同種型分型(Isotyping)抗-TACI單克隆抗體(見實(shí)施例2)的同種型通過(guò)將培養(yǎng)板與同種型特異性山羊抗-小鼠Ig(Fisher Biotech，Pittsburgh，PA)在4℃保溫過(guò)夜來(lái)確定。非特異性結(jié)合位點(diǎn)用2％BSA封閉后，添加100μl雜交瘤培養(yǎng)上清或.5μg/ml純化的mAb。室溫保溫30分鐘后，將培養(yǎng)板與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠Ig室溫保溫30分鐘。結(jié)合在培養(yǎng)板上的HRP水平用上述HRP底物檢測(cè)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗-TACI抗體1G10.1.5，5B6.3.10.和6D11.3.1為IgG1型。
實(shí)施例4抗-TACI Mab與人BCMA的交叉反應(yīng)性用上述捕獲ELISA測(cè)定1G10.1.5，5B6.3.10和6D11.3.1抗體與人BCMA的潛在交叉反應(yīng)性，所述方法有以下改動(dòng)。將人BCMA-IgG分子捕獲到山羊抗-人IgG-Fc包被的微滴孔中。按照上文已引用過(guò)的Ashkenazi等所述方法制備BCMA-ECD免疫粘附素。所述免疫粘附素構(gòu)建體由人BCMA多肽的氨基酸5-51組成。BCMA-ECD構(gòu)建體在CHO細(xì)胞中表達(dá)，然后通過(guò)蛋白A親和層析純化，所述表達(dá)使用異源信號(hào)序列(pCMV-1 Flag的前-原胰蛋白酶氨基酸1-17(Sigma))并在BCMA序列下游編碼人IgG1 Fc區(qū)。
如圖8所示，這些抗-TACI mAb在捕獲ELISA中不能識(shí)別BCMA-IgG。
實(shí)施例5抗-TACI mAb阻斷B細(xì)胞增殖進(jìn)行體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)，以便確定1G10.1.5，5B6.3.10和6D11.3.1抗體對(duì)B細(xì)胞的效應(yīng)。
用Lymphocyte Separation Medium(ICN)從人外周血分離B細(xì)胞，然后用CD19+MACS珠(Miltenyi Biotech)純化。將富集的B細(xì)胞重新懸浮在完全培養(yǎng)基(RPMI-1640，10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺)中，以5×105細(xì)胞/孔鋪在組織培養(yǎng)板中。然后將這些細(xì)胞用10μg/ml抗-人CD40抗體(BDPharmingen)，100ng/ml IL-4(R&D Systems)，以及不同濃度的抗-TACI抗體在37℃培養(yǎng)72小時(shí)。用抗-小鼠IgG1抗體(BD Pharmingen)作為對(duì)照。測(cè)定B細(xì)胞的增殖，方法是在培養(yǎng)的最后6小時(shí)，將培養(yǎng)物用甲基3H-胸苷(1μCi/孔)脈沖，然后收獲。胸苷的摻入通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量。
結(jié)果見圖9，細(xì)胞的增殖用CPM×10-3表示。數(shù)據(jù)表明，由抗-CD40抗體誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖被6D11.3.1和5B6.3.10抗-TACI抗體以劑量依賴的方式抑制。來(lái)自TACI敲出小鼠的其它數(shù)據(jù)表明，TACI受體功能受到抑制，而且在缺乏TACI的情況下，B細(xì)胞可以不接受來(lái)自TALL-1的抑制信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6
BLyS與huTaci結(jié)合為了進(jìn)行Blys結(jié)合huTACI的ELISA試驗(yàn)，包被96-孔微滴板(Maxisorb；Nunc，Kamstrup，Denmark)，方法是每孔添加50μl 2.0μg/ml山羊抗-人IgG-Fc(Cappel Inc)在50mM碳酸鹽緩沖液，pH 9.6中的溶液，4℃保溫過(guò)夜。非特異性結(jié)合位點(diǎn)用200μl 2％BSA室溫封閉1小時(shí)。然后，培養(yǎng)板用洗滌緩沖液(含0.05％Tween 20的PBS)洗3次。洗滌之后，將培養(yǎng)板用50μl/孔0.4μg/ml TACI-IgG在試驗(yàn)緩沖液(0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，PBS)中的溶液保溫。洗3次后，在指定孔中添加100μl雜交瘤上清或各種濃度的多克隆血清。在其它指定孔中添加100μl經(jīng)過(guò)P3X63AgU.1骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基作為對(duì)照。將培養(yǎng)板在振蕩器上室溫保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗3次。
接著，每孔添加100μl已在試驗(yàn)緩沖液中1∶1600稀釋的生物素化人BlyS，將培養(yǎng)板在振蕩器上室溫保溫1小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗3次。每孔添加50μl已在試驗(yàn)緩沖液(0.5％牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，PBS)中1∶1000稀釋的鏈親和素-HRP(購(gòu)自Zymed laboratory，CA)，將培養(yǎng)板在振蕩器上室溫保溫1小時(shí)。培養(yǎng)板用洗滌緩沖液洗3次后，每孔添加50μl底物(TMB microwell peroxidase substrate，Kirkegaard & Perry，Gaithersburg，MD)，室溫保溫10分鐘。每孔添加50μl TMB 1-成分終止液(二乙基乙二醇，Kirkegaard & Perry)終止反應(yīng)，在自動(dòng)微滴板讀板儀上讀取450nm的吸光度。
實(shí)施例7在ELISA試驗(yàn)中B細(xì)胞增殖被不阻斷BlyS與TACI結(jié)合的抗-TACI抗體抑制在小鼠中產(chǎn)生其它抗TACI抗體，并研究這些抗體對(duì)人初級(jí)B細(xì)胞(primary B cell)中信號(hào)傳遞的影響。圖11A證實(shí)，三種抗-TACI單克隆抗體6D11，7B6.15.11和4C7.2.1可以與經(jīng)全長(zhǎng)人TACI轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞結(jié)合。但未觀察到這些TACI抗體與模擬轉(zhuǎn)染(mock-transfected)的293細(xì)胞的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
分析這些抗體的NF-kB活化活性。將人293細(xì)胞用0.1μg全長(zhǎng)人TACI表達(dá)質(zhì)粒以及1μg ELAM-螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒和0.1μg對(duì)照pRL-TK質(zhì)粒(Promega Corporation)轉(zhuǎn)染。4小時(shí)后，添加指定量的可溶性重組人BlyS或TACI抗體，保持20小時(shí)，測(cè)定報(bào)告基因的活性。三種抗體中有兩種(6D11和7B6)活化NFκB-螢光素酶報(bào)告蛋白(dual-luciferase reporter assay system，Promega Corporation)，從而顯示激動(dòng)劑活性。
不同的轉(zhuǎn)染效力用等量的蛋白和內(nèi)部腎海鰓(Renilla)報(bào)告子對(duì)照來(lái)控制。在圖11B中，三種抗體有兩種(6D11和7B6)顯示激動(dòng)劑活性。與用作對(duì)照的可溶性人BlyS相比，6D11和7B6可以活化NF-κB報(bào)告蛋白。第三種抗體4C7不刺激報(bào)告蛋白的活性，它不是激動(dòng)劑抗體。6D11抗體阻斷BlyS與TACI的結(jié)合；但7B6和4C7不阻斷該結(jié)合(ELISA，數(shù)據(jù)未顯示)。
在人B-細(xì)胞增殖試驗(yàn)中檢測(cè)所述抗體。用磁珠(Lymphocyte SeparationMedium，ICN Pharmaceuticals，之后用CD19+MACS珠，Miltenyi Biotech)通過(guò)陽(yáng)性選擇從外周血分離5×105人B細(xì)胞，用α-CD40抗體(10μg/ml，BDPharmingen)和IL-4(100ng/ml，R&D Systems)以及遞增濃度的兩種不同的TACI激動(dòng)劑抗體克隆對(duì)細(xì)胞刺激72小時(shí)。將[H3]計(jì)數(shù)作為TACI激動(dòng)劑抗體濃度的函數(shù)作圖。所有三種抗體都是相同的小鼠同種型(IgG1)，用4C7作為匹配同種型對(duì)照抗體。從圖中每一數(shù)值減去無(wú)任何刺激時(shí)的本底B細(xì)胞增殖水平。兩種TACI激動(dòng)劑抗體6D11和7B6顯著抑制由α-CD40抗體/IL4誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，而非激動(dòng)劑抗體4C7無(wú)此抑制。從圖11C可看出，α-CD40抗體-誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖被兩種抗TACI激動(dòng)型單克隆抗體以劑量依賴方式抑制。所有三種抗體都是相同的小鼠同種型(IgG1)，用4C7作為匹配同種型對(duì)照抗體。從圖中每一數(shù)值減去無(wú)任何刺激時(shí)的本底B細(xì)胞增殖水平。結(jié)果觀察到，6D11和7B6可以刺激293細(xì)胞中的NF-κB活性并抑制B細(xì)胞增殖，而非激動(dòng)型抗體4C7不能如此，這表明，所觀察到的對(duì)增殖的效應(yīng)是由于TACI誘導(dǎo)的主動(dòng)抑制信號(hào)。
生物材料的保藏以下生物材料已經(jīng)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American TypeCulture Collection)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC)生物材料ATCC保藏號(hào)保藏日1G10.1.5PTA-4297 2002年5月7日5B6.3.10PTA-4298 2002年5月7日6D11.3.1PTA-4299 2002年5月7日
4C7.2.1 PTA-49992003年2月11日7B6.15.11PTA-50002003年2月11日該保藏是按照國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約及其章程(布達(dá)佩斯條約)進(jìn)行的。這確保自保藏日起30年內(nèi)維持該保藏物的活培養(yǎng)物。該保藏可以根據(jù)布達(dá)佩斯條約以及Genentech，Inc.與ATCC之間的協(xié)議從ATCC獲得，所述協(xié)議確保公眾在相關(guān)美國(guó)專利被授權(quán)、或者任何美國(guó)專利申請(qǐng)或外國(guó)專利申請(qǐng)被公開(以先為準(zhǔn))后，可以永久且無(wú)限制地獲得該保藏物的后代培養(yǎng)物，并確保由美國(guó)專利商標(biāo)委員會(huì)根據(jù)35USC’122及委員會(huì)的細(xì)則(包括37 CFR’1.14，特別參見886 OG 638)確定的人可以獲得所述后代培養(yǎng)物。
本申請(qǐng)的受讓人同意，當(dāng)保藏材料的培養(yǎng)物在適宜條件下培養(yǎng)時(shí)死亡或丟失或遭到破壞，將在接到通知后迅速用另一相同材料替換。獲得該保藏材料并不表明，可以違背任何政府根據(jù)其專利法所授予的權(quán)利而實(shí)施本發(fā)明。
我們認(rèn)為，前面撰寫的說(shuō)明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明的范圍并不限于本文所提供的實(shí)施例。事實(shí)上，除了本文所示和所述之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然可以根據(jù)前面的描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)，并且這些改動(dòng)也落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合TACI受體的抗體，所述TACI受體包含SEQ ID NO3的氨基酸2-166。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體不與BCMA受體結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含由保藏號(hào)為ATCC PTA-4297的雜交瘤分泌的抗體1G10.1.5；由保藏號(hào)為ATCC PTA-4298的雜交瘤分泌的抗體5B6.3.10，或由保藏號(hào)為ATCC PTA-4299的雜交瘤分泌的抗體6D11.3.1。
5.一種單克隆抗體，其與下列抗體結(jié)合相同的表位由保藏號(hào)為ATCCPTA-4297的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體1G10.1.5；由保藏號(hào)為ATCCPTA-4298的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體5B6.3.10；或由保藏號(hào)為ATCCPTA-4299的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體6D11.3.1。
6.雜交瘤細(xì)胞系，它產(chǎn)生單克隆抗體1G10.1.5并且具有保藏號(hào)ATCCPTA-4297。
7.單克隆抗體1G10.1.5，由保藏號(hào)為ATCC PTA-4297的雜交瘤分泌。
8.雜交瘤細(xì)胞系，它產(chǎn)生單克隆抗體5B6.3.10并具有保藏號(hào)ATCCPTA-4298。
9.單克隆抗體5B6.3.10，由保藏號(hào)為ATCC PTA-4298的雜交瘤分泌。
10.雜交瘤細(xì)胞系，它產(chǎn)生單克隆抗體6D11.3.1并具有保藏號(hào)ATCCPTA-4299。
11.單克隆抗體6D11.3.1，由保藏號(hào)為ATCC PTA-4299的雜交瘤分泌。
12.分離的抗-TACI受體單克隆抗體，包含與TACI受體結(jié)合且競(jìng)爭(zhēng)性抑制保藏號(hào)為ATCC PTA-4297的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體的結(jié)合的抗體，其中所述TACI受體含有SEQ ID NO3的氨基酸2-166。
13.分離的抗-TACI受體單克隆抗體，包含與TACI受體結(jié)合且競(jìng)爭(zhēng)性抑制保藏號(hào)為ATCC PTA-4298的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體的結(jié)合的抗體，其中所述TACI受體含有SEQ ID NO3的氨基酸2-166。
14.分離的抗-TACI受體單克隆抗體，包含與TACI受體結(jié)合且競(jìng)爭(zhēng)性抑制保藏號(hào)為ATCC PTA-4299的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體的結(jié)合的抗體，其中所述TACI受體含有SEQ ID NO3的氨基酸2-166。
15.嵌合抗-TACI抗體，它特異性結(jié)合TACI多肽并包含(a)由保藏號(hào)為ATCC PTA-4297的雜交瘤分泌的抗體1G10.1.5所衍生的序列；(b)由保藏號(hào)為ATCC PTA-4298的雜交瘤分泌的抗體5B6.3.10所衍生的序列；或(c)由保藏號(hào)為ATCC PTA-4299的雜交瘤分泌的抗體6D11.3.1所衍生的序列。
16.權(quán)利要求15的抗-TACI抗體，為人源化抗體。
17.權(quán)利要求1的抗-TACI受體抗體，與一或多種非蛋白聚合物相連，所述聚合物選自聚乙二醇，聚丙二醇和聚氧化烯。
18.權(quán)利要求1的抗-TACI受體抗體，與細(xì)胞毒性劑或酶相連。
19.權(quán)利要求1的抗-TACI受體抗體，與放射性同位素、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物相連。
20.權(quán)利要求1的抗-TACI受體抗體，為糖基化抗體。
21.權(quán)利要求1的抗-TACI受體抗體，為非糖基化抗體。
22.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)TALL-1或TACI多肽的生物學(xué)活性的方法，包括使所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于有效量的TACI受體抗體；其中所述抗體特異性結(jié)合包含SEQ ID NO3的氨基酸2-166的TACI受體。
23.一種抗體，它特異性結(jié)合TACI受體，抑制B-細(xì)胞增殖，且不抑制BLyS與TACI受體的結(jié)合。
24.權(quán)利要求1的抗體，為單克隆抗體。
25.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體由2003年2月11日在ATCC保藏的保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤細(xì)胞系7B6.15.11產(chǎn)生。
26.權(quán)利要求24的抗體，所述單克隆抗體與下列抗體結(jié)合相同的表位由2003年2月11日在ATCC保藏的保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤細(xì)胞系7B6.15.11產(chǎn)生的抗體。
27.單克隆抗體，它與下列單克隆抗體結(jié)合相同的表位由2003年2月11日在ATCC保藏的保藏號(hào)為PTA-5000的雜交瘤細(xì)胞系7B6.15.11產(chǎn)生的單克隆抗體。
28.雜交瘤細(xì)胞系，它產(chǎn)生單克隆抗體7B6并且作為7B6.15.11保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-5000。
29.單克隆抗體7B6，由保藏在ATCC、保藏號(hào)為ATCC PTA-5000的雜交瘤產(chǎn)生。
30.一種單克隆抗體，包含與TACI受體結(jié)合且競(jìng)爭(zhēng)性抑制保藏號(hào)為ATCC PTA-5000的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體與所述TACI受體的結(jié)合的抗體。
31.一種單克隆抗體，它特異性結(jié)合TACI多肽并包含由保藏號(hào)為ATCCPTA-5000的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)所衍生的序列。
32.權(quán)利要求31的抗體，是嵌合抗體。
33.權(quán)利要求31的抗體，是人源化抗體。
34.權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體，它與一或多種非蛋白聚合物相連，所述聚合物選自聚乙二醇，聚丙二醇，和聚氧化烯。
35.權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體，它與細(xì)胞毒性劑或酶相連。
36.權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體，它與放射性同位素、熒光化合物、或化學(xué)發(fā)光化合物相連。
37.權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體，為糖基化抗體。
38.權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體，為非糖基化抗體。
39.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)TACI多肽的生物活性的方法，包括將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于權(quán)利要求23，26，30和31之一的抗體。
40.一種單克隆抗體，與下列抗體結(jié)合相同的表位由保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤細(xì)胞系4C7.2.1產(chǎn)生的抗體
41.保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤細(xì)胞系4C7.2.1。
42.單克隆抗體，由保藏號(hào)為PTA-4999的雜交瘤4C7.2.1分泌。
43.一種嵌合抗-TACI抗體，它特異性結(jié)合TACI多肽并包含由保藏號(hào)為ATCC PTA-4999的雜交瘤4C7.2.1分泌的抗體的可變區(qū)所衍生的序列。
44.權(quán)利要求43的抗-TACI抗體，為人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了TACI受體抗體。所述TACI抗體可以包括在藥物組合物、制品、或試劑盒中。本發(fā)明還提供了用所述TACI抗體進(jìn)行治療和診斷的方法。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1692127SQ03822152
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者阿南·丘恩塔拉佩, 伊奎貝爾·格雷沃爾, 金京珍, 嚴(yán)民宏 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司