專利名稱：生產維生素b的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新穎微生物并涉及一種使用該微生物制備維生素B6的方法。
本發(fā)明所使用的“維生素B6”包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是一種對人類或其它動物不可缺少的維生素，并被用作藥物原料或飼料添加劑。使用衍生自中華根瘤菌屬(也被認為是Rhizobium)(EP765938)的微生物制備維生素B6的方法，作為一種生產維生素B6的發(fā)酵方法，已為人們所知。但是，人們有必要構建一種具有更高維生素B6產量的新微生物并且有必要開發(fā)出一種改進的工業(yè)發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法能夠利用所述微生物以十分高生產效力生產維生素B6。
根據本發(fā)明，有可能比以往的方法更有效地生產維生素B6。本發(fā)明者首先構建一種能夠生產維生素B6的中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的重組微生物，該微生物與一種含有帶吡哆醇-5’-磷酸鹽(pyridoxol 5’-phosphate)合酶基因(此后稱為pdxJ)載體的重組質粒相融合。顯示出該重組微生物維生素B6生產量的提高。該重組微生物被進一步突變以獲得組氨酸需求或甘氨酸抗性的表型性狀。這一突變微生物顯示出進一步提高的維生素B6生產力。同時獲得了上述兩種表型性質的突變體顯示出維生素B6生產力的急劇的增加，并且它們通過培養(yǎng)該微生物能夠有效地在培養(yǎng)基肉湯(broth)中生產維生素B6，且能夠以所期望的純度回收維生素B6。
本發(fā)明提供了一種能夠生產維生素B6的中華根瘤菌屬重組微生物突變體，該突變體具有含pdxJ基因的重組質粒，并獲得了組氨酸需求或甘氨酸抗性的表型性狀，或獲得了上述表型性狀的組合。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產維生素B6的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物并收集產生的維生素B6。
作為制備本發(fā)明微生物的親代菌株，可以使用任何能夠生產維生素B6的中華根瘤菌屬的菌株，并且中華根瘤菌屬的微生物可以從自然資源中得到分離，或從培養(yǎng)中心(culture collection)購買。本發(fā)明優(yōu)選的是S.meliloti IFO14782(DSM10226)。能夠產生大量維生素B6的微生物通過下面所描述的方法構建。
(1)制備包含帶有pdxJ基因的重組質粒的S.meliloti IFO 14782[A]pdxJ表達質粒的構建此處所涉及的“pdxJ”是一種編碼催化從1-脫氧-D-木酮糖-5磷酸鹽(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate)和氨基丙酮-3-磷酸鹽(aminoacetone3-phosphate)合成吡哆醇-5’-磷酸鹽的酶的基因。優(yōu)選的是來自中華根瘤菌屬微生物的pdxJ基因。例如，S.meliloti IFO 14782的pdxJ基因能夠通過下列方式進行克隆。用于聚合酶鏈反應(此后稱為PCR)的引物根據S.meliloti菌株1021的DNA數據庫中的pdxJ DNA序列合成，并且在每一引物的5’末端還包含有限制酶識別位點。該pdxJ基因能夠借助PCR并結合引物和S.meliloti IFO 14782染色體DNA的使用而得以擴增。擴增的pdxJ被連結到能夠在大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中復制的載體上，比如可獲得的pUC系列或pBR系列。通過對內切核酸酶消化的質粒進行瓊脂糖凝膠分析，能夠篩選出有pdxJ插入的質粒，其擴增區(qū)域的序列可以通過DNA順序分析儀加以確定。
作為在大腸埃希氏菌(E.coli)中表達PdxJ蛋白的載體，該載體能夠被修飾成為一種新質粒，該質粒具有在E.coli中起作用的啟動子，如后接限制酶識別序列的ptac，ptrp，plac或ptrc。通過將如此獲得的pdxJ插入至如此獲得的表達質粒，該質粒又在啟動子的控制下編碼pdxJ，從而獲得在E.coli中表達PdxJ蛋白的質粒。
可以使用具有廣泛宿主范圍的載體，比如pVK100，pRK290，pLAFR1或RSF1010，作為在S.meliloti中表達PdxJ蛋白的載體。通過將編碼作用于S.meliloti的啟動子的DNA片段以及pdxJ插入到具有廣泛宿主范圍的載體中可以獲得在S.meliloti中表達PdxJ蛋白的質粒，其中啟動子如ptac，plac，ptrc，pS1(S.meliloti的小核糖體亞單位啟動子)或pNm(新霉素抗性基因的啟動子)。
該用于構建重組載體的方法可以根據分子生物、生物工程和基因工程領域中已知的標準技術加以實施。帶有pdxJ的重組質粒向S.meliloti IFO 14782的導入。
根據分子生物學、生物工程和基因工程領域中已知的技術，能夠將編碼S.meliloti的pdxJ的質粒轉化到E.coli。
編碼pdxJ的廣譜宿主質粒可以通過下面方法中的三親雜交引入S.meliloti IFO 14782。S.meliloti作為受體菌株，帶有輔助質粒的E.coli作為輔助菌株，帶有供體質粒的E.coli作為供體菌株，三者經分別培養(yǎng)然后混合在一起。在平板上混合培養(yǎng)之后，獲得重組質粒的S.meliliot可以在含有適量抗生素的瓊脂平板上進行篩選，生長在平板上的質粒菌落可以通過核酸內切酶消化加以檢測。
(2)制備具有氨基酸需求的突變體，其中使用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)(此后稱為NTG)誘導該變異的發(fā)生已知在S.meliloti IFO 14782中吡哆醇可以通過兩個前體1-脫氧-D-木酮糖(1-deoxy-D-xylulose)和4-羥基-L-蘇氨酸(4-hydroxy-L-threonine)的閉環(huán)作用進行合成[Tazoe et al.，J.Biol.Chem.27511300-11305(2000)]。通常，由支路合成的氨基酸累積物被報道為可通過對氨基酸需求的誘導得以大大地加強。因此，可以想到的是通過分離有氨基酸需求的突變體而獲得維生素B6的更高產量。用NTG對在(1)[B]中制備的S.meliloti IFO 14782/pVKP601進行突變誘導以制備能在培養(yǎng)基肉湯中通過氨基酸需求突變的誘導產生出更多吡哆醇的突變體。菌株細胞用NTG處理。經過處理以后，進行促恢復性培養(yǎng)并且將產生的培養(yǎng)物鋪板到瓊脂培養(yǎng)基上。為分離有氨基酸需求的突變體，在包含維生素和核酸的無機氮鹽的瓊脂培養(yǎng)基上對菌落的生長進行測試。通過該測試，能夠篩選出有氨基酸需求的菌落，并且維生素B6的高產量菌株可以通過測試其在發(fā)酵生產中維生素B6的生產力而進行選擇。菌株PY-C341-K1是本發(fā)明的目的突變體之一。
(3)制備由NTG突變誘導而來的具有甘氨酸抗性的突變體在S.meliloti IFO 14782中的維生素B6的生物合成如在(2)中所描述的是眾所周知的。吡哆醇由糖(sugar)和氨基酸前體合成，而后一前體來自羥乙醛(glycolaldehyde)和甘氨酸。甘氨酸不僅是維生素B6的前體并且是菌株生長的強抑制劑。因此，甘氨酸抗性突變體的誘導可增強維生素B6的生產。因為抑制強度在測試培養(yǎng)基中不同，為分離甘氨酸抗性突變體，應當在適當培養(yǎng)基中對相對于菌株最小抑制限量的甘氨酸濃度進行檢測。由此，用NTG對(2)中獲得的菌株PY-C341-K1進行突變誘導以產生甘氨酸抗性突變體。用(2)中描述的同樣的方法對菌株細胞進行NTG處理。處理之后，進行促恢復性培養(yǎng)并且將產生的培養(yǎng)物鋪板到瓊脂培養(yǎng)基上。為分離有甘氨酸抗性的突變體，細胞懸浮液被涂布于含有適當甘氨酸濃度的瓊脂培養(yǎng)基平板上。培養(yǎng)之后，可以在包含甘氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上篩選甘氨酸抗性菌落。
本發(fā)明獲得的微生物培養(yǎng)在含有可同化的碳源，可消化的氮源，無機鹽以及其他對其生長所必須的營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中。作為碳源，可以使用例如葡萄糖，果糖，乳糖，麥芽糖，半乳糖，蔗糖，淀粉，糊精，或甘油。作為氮源，可以使用例如蛋白胨，玉米漿，豆分，酵母提取液，肉類提取物，氯化銨，硫酸銨，硝酸銨，尿素或它們的混合物。此外，對于微量元素，硫酸鹽，鹽酸鹽，或磷酸鈣，鎂，鋅，錳，鈷以及鐵可以被使用。并且，如果需要，常規(guī)的營養(yǎng)因子，磷酸鹽離子捕集劑，或者防沫劑，例如碳酸鎂，氧化鋁，水鋁英石，動物油脂，植物油，或礦物油也能作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加劑進行添加。
培養(yǎng)基的pH可以是大約5.0至9.0，優(yōu)選的是6.5至7.5。培養(yǎng)溫度可以是大約10℃至40℃，優(yōu)選的是25℃至35℃。培養(yǎng)時間可以是大約1天到15天，優(yōu)選的是2天到9天。在培養(yǎng)中，適度的通風和攪拌通常能獲得好的結果。
培養(yǎng)之后，產生的維生素B6可以從培養(yǎng)基肉湯中分離并純化。為此目的，一種通常用于從培養(yǎng)基肉湯中提取某種產物的方法可以通過利用維生素B6的不同性質而得以應用。為此，例如，將細胞從培養(yǎng)基肉湯中移走，濾出液中所期望的物質通過活性炭得以吸收，然后進一步用離子交換樹脂洗脫和純化。作為選擇，培養(yǎng)物濾出液被直接運用到離子交換樹脂，洗脫之后，所期望的物質從乙醇和水的混合物中再結晶。
用于本發(fā)明的微生物包括所有能夠生產維生素B6的中華根瘤菌屬的突變菌株，該突變菌株具有帶pdxJ基因的重組質粒，并獲得組氨酸需求或甘氨酸抗性的表型性狀，或獲得上述表型性狀的組合。在中華根瘤菌屬菌株中，尤其優(yōu)選的菌株是根據布達佩斯條約于2002年9月17日保藏于德國Gttingen DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)的保藏號為DSM15209的S.meliloti PY-EGC1。
本發(fā)明將通過下面的實施例進行更為詳細的說明，應該理解的是本發(fā)明并不限于這些列舉的實施例。
在這些實施例中，產生于培養(yǎng)基肉湯中的維生素B6能夠通過濁度方法使用Saccharomyces Carlsbergensis ATCC 9080[Osbone and Voogt，TheAnalysis of Nutrients in Foods Academic Press，London，224-227(1978)]而加以測定。并且，在發(fā)酵肉湯中的維生素B6的衍生物，比如吡哆醇，吡哆醛，以及吡哆胺能夠通過高壓液相色譜(此后稱作HPLC)分別進行量化。
實施例1S.meliloti IFO 14782/pVK601的制備(1)克隆S.meliloti IFO 14782的pdxJ為擴增S.meliloti IFO 14782的pdxJ，使用PCR法，下面的兩個引物根據在S.meliloti菌株1021基因組數據庫(Accession No.NC-003047)中的pdxJ的DNA序列(2249854-2250606，complement)合成引物A(SEQ ID NO1)具有包含pdxJ起始密碼子的限制酶NdeI識別序列，引物B(SEQ ID NO2)具有pdxJ終止密碼子之后的PstI位點。染色體DNA從生長在包含1％BactoTryptone(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，0.5％Bacto酵母提取液(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，0.5％Nacl，0.061％MgSO4·7H2O，以及0.036％Cacl2·2H2O，QIAGEN genomic-tip(QIAGEN GmbH，Germany)的培養(yǎng)基(此后稱作LBMC)中的細胞中提取。
使用advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH Laboratories，Inc.CA，USA)進行PCR。100μl反應混合物包括10ng S.meliloti IFO 14782染色體DNA，50pmol兩引物，10μl 10×HFdNTP混合，10μl附加的10×HF PCR反應緩沖液，以及2μl 50×advantage-HF聚合酶混合物。反應條件如下保持94℃3分鐘，包括4個循環(huán)的98℃30秒，53℃1分鐘，72℃1分鐘，98℃30秒，包括20個循環(huán)的98℃30秒，68℃1分鐘，然后在72℃保持10分鐘。10μl的反應混合物在1％(W/V)瓊脂糖膠上跑樣，用QIAEXII(QIAGENGmbH，Germany)從膠中回收770bp的DNA條帶。使用SureClone連接試劑盒(Amersham Biosciences Corp.，NJ，USA)將該片段與pUC18連接，用SmaI消化，用堿性磷酸酶去磷酸化。
如此獲得的連接混合物被轉化到大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細胞(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)并涂布在含有1％Bacto Tryptone，0.5％Bacto酵母提取液，和0.5％Nacl(此后稱作LB)，并帶有100μg/ml氨芐青霉素(ampicillin，此后稱作Amp)的平板上。通過Automatic DNA分離系統(tǒng)PI-50(Kurabo Industry Ltd.，Japan)準備生長在平板上的質粒菌落。通過限制酶分析質粒，可以獲得重組質粒pSHT56，其中在pUC18上pdxJ具有與lacZ基因相同的方向。使用QIAGEN plasmid midi試劑盒(QIAGEN GmbH，Germany)從含有pSHT56的E.coli JM109中制備pSHT56。質粒中的pdxJ DNA序列通過ALF DNA測序儀(Amersham Biosciences Corp.，NJ，U.S.A)進行確定，它與S.meliloti菌株1021基因組數據庫中的相應序列一致。
作為在E.coli中表達pdxJ的載體，pUC18被改造為pUC-trc2，它具有后接NdeI識別序列之后的含有pTrc99A的trc啟動子區(qū)(AmershamBiosciences Corp.，NJ，U.S.A)。使用QIAGEN plasmid midi試劑盒從含有pUC-trc2的E.coli JM109中制備pUC-trc2。為使表達質粒在E.coli中進行pdxJ表達，使用NdeI消化pUC-trc2，用瓊脂糖膠回收2.5Kb片段，并用堿性磷酸酶去磷酸化(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)。另一方面，用NdeI剪切pSHT56，并進行瓊脂糖凝膠電泳，用QIAGEN從膠中回收產物1Kb片段，用連接試劑盒(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)將所指定的pUC-trc2的2.5Kb片段與獲得的1Kb片段連接。用如此獲得的連接混合物轉化E.coli JM109，然后涂布于含有100μg/ml Amp的平板上。通過Automatic DNA分離系統(tǒng)PI-50制備生長在該平板上的質粒菌落。通過限制酶分析質粒，可以獲得重組質粒pSHT57，其中pdxJ具有與trc啟動子相同的方向。通過使用QIAGEN plasmid midi試劑盒(QIAGEN GmbH，Germany)從含有pSHT57的E.coli JM109中制備pSHT57。
(2)構建在S.meliloti IFO 14782中表達pdxJ的表達質粒為在S.meliloti IFO 14782中構建表達載體，使用據報道是具有廣泛宿主范圍的可在S.meliloti中復制的IncP-1型載體pVK100。使用QIAGEN plasmidmidi試劑盒從E.coli HB101/pVK100中制備pVK100，然后用HindIII消化，用平端試劑盒進行平頭末端處理(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)，并用堿性磷酸酶去磷酸化。用BamHI和KpnI消化pSHT57。從瓊脂糖膠中回收含有trc啟動子和pdxJ的875bp片段，平端試劑盒進行平端處理，然后用連接試劑盒與指定的pVK100連接。用獲得的連接混合物轉化E.coli HB101感受態(tài)細胞(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)并涂布在含有10μg/ml四環(huán)素(此后稱作TC)的LB平板上。用Automatic DNA分離系統(tǒng)PI-50制備生長在該平板上的質粒菌落，通過限制酶分析該質粒，可以獲得重組質粒pVK601，其中trc啟動子和pdxJ與卡那霉素(Kanamycin)抗性基因方向相反(附

圖1)。
(3)對E.coli AT3208，pdxJ-突變體的補充pSHT57被轉化至pdxJ-突變體E.coli AT3208中(從E.coli Genetic StockCenter，Yale Univ.，U.S.A購買)。所有Amp抗性轉化子生長在缺乏維生素B6的EMM培養(yǎng)基上，其中含有10g葡萄糖，8g缺乏維生素的酪蛋白氨基酸(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，U.S.A)，2.5mg MnSO4·5H2O，125mgMgSO4·7H2O，125mgCaCl2·2H2O，425mgKCl，250μgFeCl3·6H2O，250μg鹽酸硫胺素，8μg生物素，每升15g(pH6.8)Bacto瓊脂(Becton DickinsonMicrobiology systems，MD，U.S.A)，而pdxJ-突變體，E.coli AT3208不會生長在平板上。這說明被克隆的pdxJ表達PdxJ。
(4)pVK601向S.meliloti IFO 14782的導入通過下面所描述的三親雜交將pVK601導入S.meliloti IFO 14782。作為受體菌株，S.meliloti IFO 14782在30℃搖動條件下以140rpm在5ml液態(tài)LBMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時。將400μl培養(yǎng)物被轉移至新鮮的相同培養(yǎng)基中，并進一步培養(yǎng)6小時。帶有pRK2013的E.coli HB101(Kmr；IncP tra+，CoLEIori)(ATCC 37159)作為輔助菌株在37℃搖動條件下以140rpm在5ml含有50μg/ml卡那霉素的液態(tài)LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時。將100μl培養(yǎng)物轉移至新鮮的相同培養(yǎng)基中，并進一步培養(yǎng)6小時。帶有pVK601的E.coli HB101在37℃搖動條件下以140rpm在5ml含有10μg/ml TC的液態(tài)LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時。將100μl培養(yǎng)物轉移至新鮮的相同培養(yǎng)基中，并進一步培養(yǎng)6小時。收集每一種菌株，并以1∶1∶4(v/v/v)的比率混合細胞?；旌衔镤佋谥糜贚BMC瓊脂糖平板上的硝化纖維素濾器上。以30℃條件培養(yǎng)平板20小時之后，將濾器上的細胞刮取下并懸浮在無菌的0.85％NaCl溶液中。懸浮液被適當稀釋并涂布于含有20μg/ml萘啶酸(nalidixic acid)(對S.meliloti IFO 14782進行篩選)和10μg/mlTC(對pVk601進行篩選)的LBMC培養(yǎng)基上。這些平板在30℃條件下培養(yǎng)5天之后，挑取生長在平板上的菌落并用QIAGEN plasmidmini試劑盒(QIAGEN GmbH，Germany)收集質粒提取物。如此獲得的質粒DNA用核酸內切酶處理，在瓊脂糖膠上顯示出與pVK601同樣的模式。根據該結果，在測試菌落中篩選出作為S.meliloti IFO 14782/pVK601的菌落。
實施例2以30℃培養(yǎng)48小時的生長在瓊脂板上的成環(huán)的S.meliloti IFO14782/pVK601和親代株S.meliloti IFO 14782被培養(yǎng)至含有8ml移種培養(yǎng)基(seed medium)(此后成為SM)的試管中，其中培養(yǎng)基含有1％葡萄糖，1％玉米漿(Oji Cornstarch Co.，Led.，Tokyo，Japan)，0.2％Baco酵母提取液，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O和0.001％FeCl3·7H2O(pH7.0)，這些試管在互反搖動器(275rpm)上以30℃進行振動培養(yǎng)。振動19個小時后，每4ml培養(yǎng)物被轉移至500ml含有200ml生產培養(yǎng)基的帶兩個擋板的搖瓶中，其中培養(yǎng)基含有6％葡萄糖，3％玉米漿(Oji Cornstarch Co.，Led.，Tokyo，Japan)，0.8％Baco酵母提取液，0.35％NH4Cl，0.05％MgSO4·7H2O，0.025％MnSO4·5H2O和1％Allophosite(Shinagawa Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)以及0.025％Actocol(pH6.8)的，上述培養(yǎng)物30℃條件下在搖動器(180rpm)上搖動。培養(yǎng)7天后，每一培養(yǎng)基肉湯中懸浮液中的維生素B6的含量通過高壓液相色譜儀(此后稱為HPLC)進行定量測定，產生的維生素B6使用如下描述的4’-脫氧吡哆醇(4’-deoxypyridoxol)根據國際標準方法進行計算。為制備用于HPLC的樣品，100μl含有作為國際標準物質的100mg/l 4’-脫氧吡哆醇(4’-deoxypyridoxol)的溶液被加入至400μl標準吡哆醇和來自肉湯培養(yǎng)基的懸浮液的溶液中，隨后將混合物置于下述的柱中。分析條件如下柱，Capcellpak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)；移動相，0.1M高氯酸鈉(sodium perchlorate)，0.1 M磷酸鉀(potassium phosphate)，以及2％乙腈(acetonitrile，pH3.5)；柱溫25-26℃，流速1.0ml/min；檢測器，紫外線檢測器(UV)(292nm)。其結果是，S.meliloti IFO 14782/pVK601產生的每升119mg吡哆醇大于其親株，菌株IFO14782產量的大約1.34倍。
實施例3將實施例1獲得的S.meliloti IFO 14782/pVK601以30℃培養(yǎng)17小時的條件培養(yǎng)在含有帶5μg/mlTc的LBMCG培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，以此制備菌株中的細胞懸浮液。含有5ml反應混合物的試管培養(yǎng)在以30℃的溫度交互振蕩(275rpm)30分鐘的條件下，其中反應混合物在50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中包含有150ug/ml的NTG和每毫升1.6×109細胞。細胞用無菌鹽水洗滌兩次，然后懸浮于無菌鹽水中。100μl的細胞懸浮液涂布于含有5μg/ml Tc的LBMCG的瓊脂平板上，然后將該平板在30℃下培養(yǎng)2天。在平板上生長的細胞被回收在7ml無菌鹽水中，然后在無菌鹽水中對細胞懸浮液進行連續(xù)稀釋至10-1-10-7倍，并涂布到相同的瓊脂平板上。為了分離氨基酸需求突變體，生長在含有5μg/ml Tc的LBMCG上的1,136個克隆的生長通過瓊脂基本培養(yǎng)基(此后稱作MM)進行檢測，該培養(yǎng)基含有1％的葡萄糖，0.22％的NH4Cl，0.06％的K2HPO4，0.06％KH2PO4，0.04％MgSO4·7H2O，0.02％CaCl2·2H2O，0.04％NaCl以及下列金屬鹽，維生素，和核酸(每升)12mg FeCl3·6H2O，4mgMnSO4·5H2O，0.5mgH3BO3，0.4mgNa2MoO4，0.32mg ZnSO4·7H2O，0.04mgCuSO4·5H2O，0.002mg CoCl2·6H2O，4mg泛酸鈣(calcium pantothenate)，3mg硫胺.HCL，1.25mg核黃素(riboflavine)，0.04mg生物素，10mg次黃嘌呤，10mg鳥嘌呤硫酸鹽(guanine sulfate)，10mg胸腺嘧啶，和10mg包含5ug/mlTc的尿嘧啶。30℃培養(yǎng)4天之后，顯示長勢很弱或沒有生長的37個克隆被挑選至含有5μg/ml Tc的LBMCG瓊脂上，然后利用瓶發(fā)酵對維生素B6的生產力進行檢測。37個克隆中的成環(huán)細胞(one loopful cells)以及S.meliloti IFO14782/pVK601(親株)被培養(yǎng)在含有8mlSM培養(yǎng)基的試管中，然后試管在互反搖動器(275rpm)上以30℃進行搖動培養(yǎng)。搖動19個小時后，每4ml培養(yǎng)基肉湯被轉移至含有200ml PM培養(yǎng)基的帶有兩個擋板的500ml瓶中以30℃在振蕩器(180rpm)上振動。培養(yǎng)7天之后，通過HPLC對每個培養(yǎng)肉湯懸浮液中的維生素B6的含量進行定量測定。其結果是，S.meliloti PY-C341K1生產的每升171mg吡哆醇大于其親株，菌株IFO14782/pVK601產量的大約1.44倍。
菌株PY-C341K1的氨基酸需求與其親株，菌株IFO14782/pVK601通過在含有8ml MM并補充有各種氨基酸的試管中以30℃培養(yǎng)2天而加以檢測。根據該結果，菌株S.meliloti PY-C341K1以及其親株，菌株IFO14782/pVK601生長在補充有42ug/ml組氨酸的MM培養(yǎng)基中。
實施例4如實施例3中所描述的相同的方式，S.meliloti PY-C341K1被培養(yǎng)在含有10ug/mlTc的LBMCG的瓶中，以30℃培養(yǎng)16小時，從而制備菌株的細胞懸浮液。含有5ml反應混合物的試管培養(yǎng)在以30℃的溫度交互振蕩(275rpm)30分鐘的條件下，其中反應混合物在50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中包含有0，30，50ug/ml的NTG和每毫升1.6×109細胞。每反應混合物中的細胞用無菌鹽水洗滌兩次，然后懸浮于鹽水中。100μl的細胞懸浮液被涂布于含有10μg/ml Tc的LBMCG的瓊脂平板上，然后將該平板在30℃下培養(yǎng)2-3天。生長在平板上的細胞通過在無菌鹽水中懸浮而進行回收。懸浮液離心之后，細胞懸浮物被稀釋至達到濁度OD600＝1.6，最終達到10-5。每100μl稀釋液涂布于五個含有10ug/mlTC和0，0.125，0.15或0.175％甘氨酸的LBMCG瓊脂培養(yǎng)基上，由于0.15％甘氨酸完全抑制S.meliloti PY-C341K1在BMCG平板上的生長，隨后平板在30℃下培養(yǎng)4天。用50ug/ml NTG處理的生長在含有10ug/mlTc和0.175％甘氨酸的LBMCG平板上的10個克隆被挑選至含有10ug/mlTc的LBMCG瓊脂平板上。30℃下培養(yǎng)2天之后，10個克隆生產維生素B6的生產力與親株(S.meliloti PY-C341K1)一起經瓶發(fā)酵進行檢測。一些成環(huán)細胞被培養(yǎng)在含有8mlSM培養(yǎng)基的試管中，然后這些試管在交互振蕩器(275rpm)上以30℃的溫度振蕩。振蕩19個小時后，每4ml培養(yǎng)基肉湯被轉移至帶有兩個擋板的500ml瓶中，其中瓶中含有200ml且其中修正為0.175％NH4Cl的PM培養(yǎng)基，并以30℃在振蕩器(180rpm)上振動。振蕩4天之后，無菌尿素溶液以0.125％被加入至每個瓶中，然后進一步持續(xù)振蕩3天。通過如實施例3所描述的HPLC方法對7天以來培養(yǎng)肉湯懸浮液中的維生素B6的含量進行定量測定。其結果是，S.meliloti PY-EGC1生產的每升362mg吡哆醇大于其親株，菌株PY-341K1產量的大約2.11倍。
實施例5從如實施例5所描述的相同培養(yǎng)條件下制備的S.meliloti PY-EGC1肉湯培養(yǎng)物中回收維生素B6。每一純化步驟中的吡哆醇及其濃度用HPLC進行測定。含有344mg/L PN的肉湯培養(yǎng)物，其168小時培養(yǎng)產物中的一升以7500rpm離心10min。獲得的上清液pH值用1N鹽酸調節(jié)至3.1，然后上清液被應用到裝有350ml離子交換樹脂安伯來特(Amberlite)CG120(H+型，100-200孔，Rohm and Haas Company，Philadelphia，Pennsylvania，USA)的柱中。用500ml去離子水洗滌該柱，然后用5％氫氧化銨洗脫。維生素B6部分在下降的壓力條件下得到濃縮。如此獲得的殘留物溶解于10ml去離子水中，該溶液在裝有380ml Dowex1×4(OH-型，200-400孔，Dow ChemicalCo.，Ltd.，Midland，Michigan，U.S.A)的柱(5.5×16cm)上進行離子交換，然后用500ml去離子水洗滌。然后用0.1N HCl洗脫該柱。在降低的壓強下，含有吡哆醇的部分被濃縮至小容積內。固體殘留物溶解于少量的熱乙醇(hot ethanol)中，溶液保持在4℃過夜。獲得的沉淀通過過濾收集，然后真空干燥至獲得282mg粗結晶。從乙醇中進行再結晶至獲得217mg具有160℃熔點的白色結晶。紅外線吸收法，UV吸收法以及NMR光譜測定產量與可信的吡哆醇產量相一致。
表1概述了S.meliloti IFO 14782(DSM No.10226)，S.meliloti IFO14782/pVK601以及就此獲得的其突變體的產量。
表1S.meliloti IFO 14782(DSM No.10226)，S.meliloti IFO 14782/pVK601以及它們的突變體的吡哆醇產量
序列表<110>羅奇維生素股份公司(Roche Vitamins AG)<120>生產維生素B6的方法<130>NDR5222<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工的<400>1tcccatatgc ctgcaaagct ctcc<210>2<211>24<212>DNA<213>人工的<400>2tccctgcagt taagccgtct cgcc
權利要求
1.一種能夠生產維生素B6的中華根瘤菌屬重組微生物突變體，其具有含pdxJ基因的重組質粒，它獲得了組氨酸需求或甘氨酸抗性，或其組合。
2.根據權利要求1的突變體，其中所述突變體具有的甘氨酸抗性比重組微生物最小抑制濃度高1.1倍。
3.根據權利要求1的重組微生物，其中所述的重組質粒包括載體質粒pVK100。
4.根據權利要求1的重組微生物，其中吡哆醇-5’-磷酸鹽合酶(pyridoxol5’-phosphate synthase)基因是來源于能生產維生素B6的中華根瘤菌屬的微生物。
5.根據權利要求1的重組微生物，它是Sinorhizobium meliloti PY-EGCl。
6.一種制備維生素B6的方法，其包括在pH值大約5.0到9.0的培養(yǎng)基中，在含氧條件下，溫度10℃到40℃培養(yǎng)1天到15天根據權利要求1的微生物，從培養(yǎng)基中分離維生素B6。
7.根據權利要求6的方法，其中該微生物是Sinorhizobium melilotiPY-EGCl。
全文摘要
公開了一種能夠生產維生素B
文檔編號C12R1/41GK1685052SQ03823010
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權日2002年9月27日
發(fā)明者星野達雄, 長谷洋一郎, 市川敬子, 田副正明 申請人:Dsm Ip資產公司