專利名稱：利用c4bp支架制備多聚體融合蛋白的制作方法
技術領域：
所述發(fā)明涉及在原核細胞內制備高產量融合蛋白和多肽的方法，其中所述蛋白或肽包含C4bp結構域。
背景技術：
重組DNA技術的出現使大規(guī)模生產治療用生物活性蛋白成為可能。目前臨床上或研究中有許多重組DNA制備的產物，包括大分子蛋白如促紅細胞生成素，小分子肽和抗體片段。
本領域內眾所周知，蛋白的一個難題是其半衰期。許多蛋白和肽在體內的半衰期較短，減少了它們的用途。目前已發(fā)現，蛋白和肽分子的多聚化是延長這些分子的半衰期，從而允許它們在更長的時間內發(fā)揮作用的方法。發(fā)現許多有功能的生物分子處于寡聚物結構時，在體內會更有效。這是由于以下因素造成的，如通過親合力(avidity)而不是親和力(affinity)進行結合，和/或使分子交聯的能力(例如，胰島素受體的相同受體亞單位通過二聚化作用被激活，或非相同的分子以便在細胞如淋巴細胞表面形成信號復合物)。這些增加半衰期和親合力的性質使得蛋白或肽分子的使用量更小，從而減少費用和劑量依賴性的副作用。
人們曾提出了制備重組蛋白多聚體的不同方法。例如，已嘗試了蛋白與聚合物如聚乙二醇的化學連接(Katre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1487)。然而這項技術不但煩瑣而且需要大量純化的物質。在抗體分子中，嘗試改變在鉸鏈區(qū)和該分子的其它區(qū)域中形成二硫化物的可能性，用來調節(jié)抗體互相結合的程度。然而結果是不一致且不可預知的。同樣，使用蛋白A融合物產生多聚抗體可以成功地連接抗體片段，但是在其它領域的應用有限。
在WO91/11461中描述了使用補體4結合蛋白(C4bp)的新多聚化系統(tǒng)。人補體4結合蛋白(C4bp)是高分子量的(570kDa)血漿糖蛋白，其具有由7個相同的α鏈和單獨的β鏈組成的蜘蛛樣(spide like)結構。C4bp的α鏈有負責將分子裝配成多聚體的C-末端核心區(qū)。根據標準模型，C4bp單體+498位的半胱氨酸和另一單體+510位的半胱氨酸形成二硫鍵。在人血漿中還發(fā)現了只有7個α鏈組成的較小形式(minor form)。這種血漿糖蛋白的天然功能是抑制補體活化的經典途徑。
WO 91/11461提出C4bp蛋白的多聚化能力可以用來制備包含全部或部分C4bp和目的(interested)生物蛋白的融合蛋白。這個融合蛋白將形成多聚體，該多聚體為目的蛋白提供，其中所述蛋白有更長的血漿半衰期并且與其靶的親和力(affinity)或親合力(avidity)更強。在WO 91/11461中，C4bp融合蛋白成為治療性產品的新的遞送和載體系統(tǒng)的焦點。
C4bp的大多數α鏈由8個長度約為60個氨基酸的結構域串聯排列組成，該結構稱為補體控制蛋白(complement control protein)(CCP)重復。WO91/11461中描述的融合蛋白中，優(yōu)選包含一個或多個這樣的結構域。但是現已證實，所有的CCP都能缺失(只留下C-末端的57個氨基酸)，而不會抑制多聚化(Libyh M.T.等，(1997)Blood 90，3978)。C4bp的這個C-末端區(qū)域稱為C4bp核心。
Libyh等(1997)描述了基于C4bpα鏈C-末端部分的蛋白多聚化系統(tǒng)。C4bp的C-末端部分缺乏生物功能，但是它負責使產生C4bp CHO細胞胞漿中的C4bp發(fā)生多聚化。Libyh等能夠用C4bp片段誘導相關抗體片段的自發(fā)多聚化，從而產生ScFv片段的同源多聚體。所使用的C4bp的C-末端部分被置于ScFv序列的C-末端，可選由MYC標記隔開(space)。
Oudin等(2000，Journal of Immunology，164，1505)進一步應用C4bp核心多聚化系統(tǒng)形成異源多聚體多(multimeric multi)CR1/ScFv抗-Rh(D)分子。該嵌合體蛋白通過共轉染CHO細胞系以及兩種不同的載體(一種編碼CR1，另一種編碼ScFv抗Rh-D)而在所述細胞內表達，并且發(fā)現所述嵌合蛋白在分泌它們的轉染的細胞的胞漿中能自發(fā)地進行多聚化。
Christiansen等(2000，Journal of Virology，74，4672)進一步證明在293EBNA細胞中可產生同源多聚體融合蛋白，所述融合蛋白包含與C4bp核心相連的CD46外部結構域。
在Shinya等(1999，Biomed & Pharmacother，53，471)也已經證實了自我裝配型多聚體可溶性CD4-C4bp融合蛋白，該融合蛋白可在293細胞表達。
由于這些重組融合蛋白在小鼠體內的血漿半衰期延長，Shinya等進一步建議改進包含C4bp核心結構域的融合蛋白的藥代動力學性質。由于所使用的核心結構域是人源的，將它給藥人類所產生的不利免疫學后果可最小化。
目前，基于C4bp核心蛋白的融合蛋白已經可在真核細胞中表達。真核細胞的融合蛋白產量很少達到2mg/每毫升培養(yǎng)基上清液，(Oudin等ibid)，并且只有在基因擴增進行數個循環(huán)后才能達到這樣的水平。這個水平對于許多治療用融合蛋白的經濟化大量生產來說太低了。
一種獲得更高產量的方法是使用原核表達系統(tǒng)。WO 91/00567建議原核宿主細胞可以用于制備基于C4bp的蛋白，盡管這種生產還未得到實驗證實。然而大量的考慮都提示使用原核系統(tǒng)是不利的。尤其是許多真核蛋白在諸如大腸埃希氏菌屬等細胞中表達時，將失去它們的一些或全部有活性的折疊結構。其它真核蛋白在原核細胞中表達時會變性或完全失活。
C4bp是哺乳動物的分泌蛋白，且本領域已知在原核細胞中制備折疊形式的所述蛋白尤其困難。有二硫橋的蛋白和需要寡聚化的蛋白更麻煩。在細菌胞漿的還原性環(huán)境中二硫鍵無法正常產生，且它們一旦形成則會穩(wěn)定所述蛋白的錯誤折疊或聚集形式。
通常在原核細胞內表達的重組蛋白會在宿主原核細胞內的內含體中聚集。所述內含體是與細胞的其它成分分離的離散顆?；蛐∏?，所述細胞包含通常是聚集或失活形式的表達的蛋白。表達的蛋白在包含體中的存在使得使蛋白恢復活性可溶的形式非常困難，因為重折疊技術是無效而且費用高昂的。由內含體中純化的蛋白必須消耗大量勞動來操作，變性并重折疊以獲得相對低產量的活性、有功能的蛋白。
對于在原核細胞中表達C4bp核心融合蛋白，還必須考慮其它問題。首先，每個核心單體都保留兩個半胱氨酸殘基，根據本領域所接受的C4bp多聚體模型，這些半胱氨酸是在多聚體裝配過程中形成分子間二硫鍵所必需的。期望原核細胞胞質的還原環(huán)境(例如細菌的胞質)能通過減少這些二硫鍵來阻止C4bp核心多聚體的形成。
第二，多聚體通過真核細胞的分泌裝置(secretion apparatus)時被組裝，這些分泌裝置已知能輔助蛋白以原核細胞不能提供的方式(例如，存在蛋白的二硫化物異構酶和獨特的陪伴分子)進行折疊，第三，即使在使真核細胞中所得產量相對較低(mg/dl)的條件下，這個分泌路徑仍不能產生同源蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明人驚奇地發(fā)現，不僅C4bp核心融合蛋白能在原核細胞中有效合成，而且C4bp核心本身能夠進行正確的折疊，并在原核細胞胞漿的還原性境中組裝成同源多聚體。吃驚地發(fā)現在原核細胞中產生的C4bp核心多聚體含有二硫鍵。
進而，發(fā)明者還發(fā)現，與產自原核細胞表達系統(tǒng)的C4bp核心相融合的蛋白保留它們的功能活性。因此所述發(fā)明提供了獲得重組融合蛋白的方法，該融合蛋白包含C4bpα鏈的C-末端核心蛋白支架，且所述的重組融合蛋白能夠在原核宿主細胞的胞質中形成可溶的多聚體，該方法包括以下步驟(i)提供原核宿主細胞，其帶有編碼所述重組蛋白的核酸，該核酸與在所述原核細胞中有功能的啟動子可操控地連接；(ii)在所述重組蛋白能被表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和(iii)回收重組蛋白，其中所述蛋白以多聚體形式被回收而無需支架重折疊的步驟。
我們已發(fā)現本發(fā)明細胞培養(yǎng)物中蛋白的產量可相對較高，例如大于2mg/l培養(yǎng)物，如大于5mg/l培養(yǎng)物，優(yōu)選大于10mg/l培養(yǎng)物，如大于20mg/l培養(yǎng)物，甚至更優(yōu)選大于100mg/l培養(yǎng)物。
發(fā)明的C4bp核心融合蛋白包含更優(yōu)選C4bp核心蛋白序列，其N或C-末端與有生物活性的目的序列相融合。


圖1示不同物種的C4bp序列的比對。
圖2示融合蛋白db-C4bp(db是實施例1所描述的肽)通過離子交換柱的純化。
圖3示db-C4bp在第二個離子交換柱的進一步純化。
圖4示db-C4bp在凝膠層析柱的純化。
圖5示加熱步驟后db-C4bp在離子交換柱上的純化。
圖6示db-C4bp在凝膠層析柱中的進一步純化。
圖7示DsbA-C4bp在胰島素實驗中的作用。
圖8示pAVD77啟動子的序列和C4bp編碼區(qū)域。
圖9示在非還原條件下的C4bp融合蛋白分析。

發(fā)明內容
C4bpα鏈核心蛋白本文的“C4bp核心蛋白”，或“核心蛋白”，或“C4bp支架”是可以互相取代的。該蛋白可以是哺乳動物的C4bp核心蛋白，或其能形成多聚體的片段，或其能形成多聚體的合成變體。
許多哺乳動物的C4bp蛋白的序列在本領域是可得的。所述蛋白包括人類C4bp核心蛋白(SEQ ID NO1)。本領域可以提供人類C4bp核心蛋白的大量同源物。共有兩種同源物直向同源物(orthologues)和共生同源物(paralogues)。直向同源物被定義為不同生物體中的同源基因，即基因與產生它們的物種形成事件(speciation event)有共同祖先。共生同源物被定義為源自基因、染色體或基因組復制品的相同生物體內的同源基因，即從最近的一次物種形成事件起出現的基因的共同祖先。
例如一項關于Genbank的搜索表明以下物種具有哺乳動物C4bp核心同源蛋白，包括所述物種兔，大鼠，小鼠，和牛來源(分別為SEQ ID NO2-5)。平行同源物已在豬(ApoR)，豚鼠(AM67)，和小鼠(ZP3)中鑒定，分別顯示為SEQ ID NO6-8。
SEQ ID No1-8的比對如圖1所示?？梢钥闯霰M管在C-末端有很大程度的變異，但所有的8個序列還是有高度的相似性。還可使用通?？傻玫乃阉鞒绦蛉鏐LAST，通過搜索DNA或蛋白序列的數據庫，鑒定C4bp核心蛋白。
當所需哺乳動物來源的C4bp蛋白在數據庫中不能獲得時，則該蛋白可以通過本領域已建立的常規(guī)克隆方法獲得。本質上，這種技術包括使用編碼可得的C4bp核心蛋白之一的核酸作為探針，來復原并確定來自其它目的物種的C4bp核心蛋白序列。大量的技術都可用于該目的，比如PCR擴增和采用適當的mRNA源克隆所述基因(例如由胚胎，或活躍分化的細胞或腫瘤細胞)，或者如下方法，包括從哺乳動物獲得cDNA庫，例如來源于上述來源之一的cDNA文庫，在高嚴謹度條件下(如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，在約50-約60℃)用已知的C4bp核酸檢測所述的文庫，以及回收編碼全部或部分該哺乳動物C4bp蛋白的cDNA。如果獲得部分cDNA，那么可通過引物延長技術測定編碼序列的全長。
能形成多聚體的C4bp核心蛋白的片段包括至少47個氨基酸，優(yōu)選至少50個氨基酸。所述片段形成多聚體的能力的檢測可以通過如下方法進行在本發(fā)明原核宿主細胞中表達該片段，在導致共57個氨基酸的C4bp核心發(fā)生多聚化的條件下回收所述C4bp片段，以及確定該片段是否也形成多聚體?？扇〉?，C4bp核心片段包含SEQ ID NO1的至少6-52位殘基，或其同源物的相應殘基。
人SEQ ID NO1的C4bp核心蛋白對應全長C4bp蛋白序列的氨基酸+493至+549。本領域中已知形成多聚體的這種片段相當于C4bp核心蛋白的氨基酸+498至+549。
也可用C4bp核心的變體和能形成多聚體片段，所述變體保留形成多聚體的能力(可如上文對所述片段的描述那樣來確定)。所述變體與野生型哺乳動物C4bp核心或其多聚體形成片段優(yōu)選具有至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，如至少95％或最優(yōu)選至少98％的序列同一性。一方面，C4bp核心包含出現在SEQ ID No1-3和5-8的位置6和18的兩個半胱氨酸殘基?？扇〉?，該變體能保留這2個殘基間的部分(relative spacing)。
上述具體程度的同一性是與SEQ ID No1-8之一或其復合物形成片段的同一性。
最優(yōu)選上述具體程度的同一性是與SEQ ID NO1或其多聚體形成片段的同一性。
序列同一性程度由GAP算法決定，該算法是在本領域廣泛應用算法的“Wisconsin包(package)”的一部分，由Accelrys(formerly Genetics ComputerGroup，Madison，WI)提供。GAP使用Needleman和Wunsch算法對2個完整的序列進行比對，以使匹配的數量最大而缺口的數量最小。GAP可用于比對長度相似的密切相關的短序列，因此適合用來確定序列是否符合上述同一性水平。GAP可以使用默認參數。
哺乳動物C4bp核心蛋白的合成變體包括在C或N-末端有一個或多個氨基酸取代、缺失、插入或添加的變體。其中取代是具體所考慮的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括下表所列出的取代，其中第二欄同一區(qū)的氨基酸和第3欄完全同一行的氨基酸可以互相取代。

可以制備并檢測其形成多聚體的能力的C4bp核心蛋白的片段和變體的例子，包括SEQ ID No9至16，如下表1所示

A＝SEQ ID NO；B＝序列，C＝％同一性，參照同樣長度的SEQ ID NO1的片段計算。
除了N或C-末端平截外，在序列中進行缺失時，所述缺失優(yōu)選被限定為不多于l、2或3個相鄰或不相鄰的缺失。
對核心蛋白序列進行插入或N-末端或C-末端延長時，所述延長可取地限定在一定數目以內，以使得核心蛋白的大小超過野生序列的長度不多于20，優(yōu)選不多于15，最優(yōu)選不多于10個氨基酸。因此，對于SEQ ID NO1，通過插入或延長來進行修飾的核心蛋白的長度可取地不超過77個氨基酸。
N或C-末端延長可包括柔性接頭，如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，(n＝1-4)，所述接頭在本領域中用來使蛋白結構域互相連接(尤其是抗體V結構域)。
當發(fā)明中所述的融合蛋白由化學合成方法制備時，N或C-末端延長物可包括非天然存在于蛋白質中的氨基酸類似物，所述氨基酸類似物可用于本領域的肽或多肽的合成。
重組蛋白本發(fā)明的重組蛋白包含如上所述的C4bp核心(或“支架”)，其可單獨組成，或在框內(in frarne)連接至少一個有生物價值(biological interest)的序列。這種序列可以包括用于鑒定或純化蛋白的標記，和/或可用于治療，具體是人類治療的蛋白。
重組蛋白可以被描述為有共同的結構式BiN-Co-Bic，其中Co是上述的核心蛋白；BiN是核心蛋白的氨基末端或至少一種(例如1或2種)目的生物序列，Bic是核心蛋白的C-末端或至少一種(例1或2種)目的生物序列。
優(yōu)選，BiN和Bic之一不是目的生物序列(如其中一個或另一個是融合物的末端或可選為標記，例如聚組氨酸標記，以輔助回收所述蛋白)。更優(yōu)選，所述目的生物序列由BiN代表。
可選地，目的蛋白或非蛋白產物可以通過合成手段而與核心的側鏈相偶聯，例如通過賴氨酸殘基側鏈的氨基基團或通過加入所述核心序列或位于其末端的半胱氨酸殘基；或是與存在的半胱氨酸殘基相偶聯。
優(yōu)選目的生物序列不是通常與C4bp核心蛋白連接的C4結合蛋白的全部或部分，即所述目的生物序列是異源序列。
我們發(fā)現，符合上述定義的蛋白可以在細菌表達系統(tǒng)中表達并從該細菌表達系統(tǒng)中以多聚物的形式回收而無需支架重折疊。我們已經表達了單體重量約30kDa的蛋白。因此，該發(fā)明可以用于表達在該大小范圍內的蛋白，更常用于約100kDa的蛋白，更優(yōu)選，約50kDa。
一類具體的融合蛋白是指其中C4bp核心與具有2至25個氨基酸殘基的肽相融合的融合蛋白。許多生物活性肽是已知的或能夠通過噬菌體展示選出。然而，它們在體內常常是不穩(wěn)定的，這不僅是因為它們能通過腎小球濾過。它們融合成核心支架后變成不可濾過的。此外，還賦予了寡聚肽親合力(使得它們在更低的劑量時與靶更緊密地結合，而且使受體發(fā)生交聯)。具體的目的生物活性肽包括天然存在的肽或多肽激素，例如促生長激素抑制素、降鈣素、和α-MSH(黑素細胞刺激素)，及其變體以及本文所述的其它肽。
因此，一定范圍的C4bp核心蛋白的融合蛋白可以通過本發(fā)明的方法合成。預期所產生的多聚體融合蛋白顯示出增強的生物活性，這是因為多聚體具有更高密度的附著于C4bp核心蛋白的部分，所以預期有更長的半衰期和降低的轉化率。
目的生物序列可以是多肽或化合物(如藥物或藥物前體)，或與發(fā)明中所用的C4bp核心蛋白異源的碳水化合物。也就是說，它不是天然存在的相同分子的一部分，它可以產生自相同的生物體。當連接的部分是化合物時，這種連接可以起到保護該復合物以免其例如通過肝細胞色素發(fā)生代謝及被排出。并且將它遞送到組織。多肽的例子包括那些用于醫(yī)療或生物技術的多肽，如胰島素，細胞因子(包括白細胞介素和干擾素)，抗體及其片段，生長因子，受體，受體配體，激動劑或拮抗劑，酶，酶拮抗物，抗原、毒素和蛋白酶。
根據本發(fā)明制備的融合蛋白和本發(fā)明的新的融合蛋白可以制備為藥物組合物的形式，所述組合物包括蛋白以及一種或多種可藥用的載體或稀釋劑。該組合物根據目的用途和給藥融合蛋白的途徑來制備。
可藥用的載體或稀釋劑包括適合經口服，經直腸，經鼻，經局部(包括經頰和舌下)，經陰道或胃腸外(包括經皮下、經肌肉內、經靜脈內、經皮內、經鞘內和經硬膜外)給藥的配制劑中所用載體和稀釋劑。所述配制劑可以方便地作為單位劑量形式存在并由任何藥學領域已知的方法制備。
對于固體組合物而言，可應用傳統(tǒng)的非毒性固體載體包括例如藥用等級的甘露醇，乳糖，纖維素，纖維素衍生物，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等。以上所定義活性化合物可以利用如聚乙二醇，乙?；娜视王サ茸鳛檩d體配制成栓劑?？伤幱玫囊后w組合物可以例如通過在載體中對本發(fā)明的融合蛋白以及可選的藥物佐劑進行溶解、分散等以形成溶液或懸液來制備，所述載體例如水，右旋糖鹽水溶液，甘油，乙醇等等。如需要，待給藥的組合物也可以是輔助物質例如pH緩沖劑等等。對那些本領域熟練技術人員來說，制備這種制劑形式的實際方法是已知的，或者顯而易見的，見Remington’s Pharmaceuticai Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，19thEdition，1995。
在任何情況下，所給藥的組合物或制劑包含一定量的活性化合物，所述量能夠有效減輕得治療對象的癥狀。可以這樣的制備劑量形式或組合物，其包含的活性成分在0.25-95％范圍內，其余部分由非毒性載體平衡。
經胃腸外給藥的特征通常為注射，如經皮下、肌肉內、或靜脈內注射。注射劑可以制備成傳統(tǒng)形式，可制成液體溶液或懸液，適于在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式，或乳劑。適當的賦形劑為，例如水、鹽水、右旋糖、甘油，乙醇等。更新的經胃腸外給藥方法設計為植入緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，以便維持恒定的劑量水平。見例如美國專利3,710,795。
下面所述的多肽種類是優(yōu)選的，但所述發(fā)明不限于此。
細胞因子白介素包括任何已知的白介素，包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11和IL-12。白介素是免疫系統(tǒng)的調節(jié)物。一些白介素參與炎性反應或對疾病的免疫反應。
干擾素包括IFN-α的任何形式，同樣也包括IFN-β和INF-γ。這些物質用于免疫反應的調控。
另一種細胞因子是腫瘤壞死因子TNF-α和TNF-β。
其它的細胞因子包括MIP系統(tǒng)成員，包括MIP-1α，MIP-1β和RANTES。RANTES與CCR5 HIV共同受體(co-receptor)結合，且使用RANTES的治療能有效地減緩HIV感染的進程。
抗體當將所述抗體通過所述發(fā)明的方法而制備為C4bp融合蛋白時，抗體或抗體片段對抗原的親和力可以通過寡聚化作用被增強。抗體片段可以是片段諸如Fv，Fab，和F(ab’)2等或其任何衍生物，如單鏈Fv片段?？贵w和抗體片段可以是非重組的、重組的或人源化的?？贵w可以是任何免疫球蛋白同種型，例如IgG、IgM等等。
在另一方面，抗體片段可以是駱駝源化的(camelised)VH結構域。眾所周知，抗體及其同源抗原之間的主要分子間相互作用是通過VHCDR3介導的。然而，僅有VH的抗體(VH-Only antibody)，比如源自駱駝或llama的抗體(天然僅有VH的單鏈抗體)，與同源抗原只有較低的親和力。
本發(fā)明中的方法使改善有VH區(qū)或VHCDR3區(qū)的C4bp核心蛋白寡聚物的產量成為可能，所述寡聚物是具有高親和力的抗體。兩個以上的結構域可以包括在通過本發(fā)明的方法所制備的C4bp核心寡聚物中，所述寡聚物可包括8個結構域，形成8聚抗體分子。
抗體的靶可以包括腫瘤相關抗原，包括CEA和erbB，其可以分別見于許多結腸和乳腺腫瘤。
在一個實施方案中，目的生物蛋白可包含與酶融合的抗體，這種酶可將藥物前體轉化成對腫瘤細胞有毒性的藥物。這可用于抗體指導的酶-藥物前體治療(ADEPT)法中。可選，帶有抗腫瘤抗體的單體和帶有所述酶(如羧肽酶，硝基還原等)的單體可以在細胞中共表達或在不同細胞中表達，再混合在一起形成抗腫瘤細胞的異多聚體。
抗體也可以靶向病原生物體的抗原，包括下文提到用作免疫原的抗原。
生長因子生長因子包括激素，如生長激素(尤其是人生長激素hGH，以及單核細胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，EPO，和血小板來源的生長因子(PDGF)。這些生長因子的活生片段也可以應用。哺乳動物，尤其是人生長因子是具體優(yōu)選的。
受體受體在與人體內以異常或不需要的水平表達的蛋白相結合，從而可以發(fā)揮治療作用。
例如，TNF-α的過度表達與類風濕性關節(jié)炎有關，抗TNF治療對治療所述疾病已經成功了。因此目的生物蛋白可以是TNF-α受體。
目的受體是TNF受體家族的另一成員，即BAFF受體(Thompson等Science，2001，293，2108)。人BAFF受體(Genbank登錄號AF373846)是184個氨基酸的蛋白，其與TNF相關的配體BAFF相結合。這種配體在小鼠體內的過度表達能導致系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)樣癥狀，因此BAFF受體用于這種疾病的治療。
一方面，本發(fā)明提供了C4bp核心和BAFF受體的融合蛋白，包括其胞外結構域的片段，該片段能夠結合BAFF配體。這種片段對應BAFF的第2-51位氨基酸。
細胞表面受體也所是感興趣的。例如CD4受體是HIV表面蛋白gp120/160的靶，本領域已廣泛提出使用CD4或其可溶性片段作為HIV感染的治療，使得CD4能阻斷循環(huán)中的HIV進入CD4+T細胞的能力。
其它細胞表面受體也與病毒感染有關，如CD46和麻疹病毒(Christiansen等，ibid)感染相關，這種細胞表面受體蛋白也可以用于本發(fā)明中。
受體配體，激動劑和拮抗劑許多細胞表面受體被二聚化作用活化。已知的例子是胰島素和促紅細胞生成素的受體。所述配體的功能是同時和兩個受體結合，從而使它們發(fā)生二聚化并被活化。所述例子中，發(fā)生受體的自身磷酸化。這激活了所述受體，其中該受體其分子間部分有酪氨酸激酶結構域。當受體是單體時，激酶是無活性的，在發(fā)生二聚化時所述激酶被激活。這觸發(fā)分子間事件的級聯反應，統(tǒng)稱為信號傳導。
雖然一些配體，諸如P物質等，是短的多肽；其它(包括胰島素(51個氨基酸)，以及激酶和活性磷酸酶底物)是復合分子，所述復合分子具有由其表面伸出的結合環(huán)。能夠模擬受體的天然配體的較小分子可用于研究(例如，為了理解配體受體結合的特異性)。
短肽或環(huán)可以摻入本發(fā)明的融合蛋白，以形成多價的受體配體或激酶/活性磷酸酶底物，用于在非常低的濃度下活化或抑制受體和/或激酶。
變化可以導入到插入支架的異源多肽中，以便顯示(map)受體或激酶/磷酸酶對它們的配體或底物的特異性。變體可以帶有同樣的環(huán)，或可設計一系列標準的不同環(huán)，以迅速評估新的激酶/磷酸酶的特異性。
根據已知的技術，諸如PCR等，變體可以通過序列的隨機化產生。摻入發(fā)明的蛋白支架之前，所述變體可以通過篩選方案如噬菌體展示來選擇。
激動劑包括肽(包括肽模擬物)，它與受體結合，從而在即便不存在該受體的天然配體的條件下激發(fā)所述受體的作用。激動劑的例子是血小板生成素激動肽。這個線形14-聚肽的二聚體比其單體的活性高4000倍。(DowerW.J.et al.Stem Cells(1998)16，Suppl 2，21 Peptide agonists of thethrombopoietin receptor)。這個序列與C4bp的核心結構域的融合物IEGPTLROWLAARA，和下述其它肽一樣，可產生非常有效的血小板生成素激動劑，用于啟動血小板產生和/或成熟。
在另一方面，發(fā)明提供了包含C4bp核心蛋白和血小板生成素激動劑肽的重組蛋白，以及這種蛋白在用于促進人類受試者體內血小板產生和/或成熟的治療方法中的作用。該方法應包括給予需要治療的受試者有效劑量的所述蛋白。
另一激動劑的例子是促生長激素抑制素肽。已知這種循環(huán)肽與大量的G蛋白受體偶聯的相結合，從而抑制生長激素的釋放。類似物以Sandostatin(Novartis)進入市場用于大量醫(yī)學指征，包括治療與惡性類癌腫瘤相關的副作用以及治療由胃腸道感染引起的腹瀉。
促生長激素抑制素序列與絲狀噬菌體的融合物，如British Journal ofPharmacology(1998)，“Somatostatin displayed on filamentous phage as areceptor-specific agonist”第125卷，5-16頁所描述的，可產生能結合并活化促生長激素抑制素受體的雜種噬菌體。促生長激素抑制素與C4bp支架的融合物(該支架噬菌體)近似產生促生長激素抑制素受體的強激動劑，與雜種噬菌體相比所述激動劑作為藥物具有更可取的性能。類似地，這樣產生的寡聚激動劑能夠使促生長激素抑制素受體發(fā)生寡聚化作用，這可以加強信號，如Patel等in Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)Volumn 99，第3294-3299頁所述。
因此，所述發(fā)明提供了制備上述重組融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含有促生長激素抑制素。發(fā)明更進一步提供了一種融合蛋白，其為C4bpα鏈的C-末端核心蛋白與促生長激素抑制素相連形成的融合蛋白。發(fā)明進一步提供這種融合蛋白或編碼這種蛋白的核酸載體(如本文進一步定義和描述)在治療方法中的用途，所述治療包括治療與惡性類癌腫瘤相關的副作用以及治療由胃腸道感染引起的腹瀉。
拮抗劑包括與受體結合并阻止天然配體與所述受體結合的肽。
酶多種生物反應包括大量蛋白的序貫和/或協同的作用。這種蛋白活性可摻入本發(fā)明的單個分子。因此，優(yōu)選用于組成本發(fā)明寡聚物的單體包含編碼不同生物活性的氨基酸序列。有利地，所述活性是互補的，以便它們在生物反應中被序貫地需要，或協同地起作用。因此發(fā)明提供包含一種或多種酶的多功能大分子結構。
酶的例子包括細菌酶，如大腸桿菌的DsbA。
抗原根據本發(fā)明產生的多聚體的具體作用是產生免疫原(本文中這個本語等同于“抗原”)。這個根據本發(fā)明的方法產生的C4bp核心融合蛋白支架技術的主要應用是利用經組裝的或多聚化的肽或多肽作為抗原。寡聚化作用改進抗這類抗原的抗體的檢測和誘導。這些抗原中的一些有預防疾病的價值；它們可以用于預防接種。該方法允許由核苷酸序列快速進展為產生多價形式的重組抗原。預期的可讀框(ORF)可以用于設計編碼預期蛋白序列的寡核苷酸序列。將這些寡聚核苷酸克隆進入編碼C4bp核心蛋白的載體中允許抗原快速產生，而不需要例如分離cDNA以及在異源系統(tǒng)如大腸桿菌中表達它們。
細菌免疫原，寄生蟲免疫原，和病毒免疫原可用作多肽部分以產生多聚或異源-多聚C4bp融合蛋白，所述融合蛋白可用作疫苗。
這些免疫原的細菌來源包括那些導致細菌性肺炎，肺囊性肺炎(pneumocystis pneumonia)，腦膜炎，霍亂、破傷風，肺結核和麻風病的細菌。
寄生蟲來源包括瘧疾寄生蟲，如瘧原蟲(plasmodium)。
病毒來源包括痘病毒(poxviruses)，如牛痘病毒和orf病毒(orf virus)；皰疹病毒(herpes viruses)，如1和2型單純皰疹病毒，B-病毒，天花病毒(varicellazoster viruses)，巨細胞病毒和EB病毒；腺病毒(adenoviruses)，如哺乳動物腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovaviruses)，如乳頭瘤病毒如HPV-16，以及多瘤病毒(polyomaviruses)，如BK和JC病毒；細小病毒(parvoviruses)，如腺伴隨病毒；呼腸病毒(reoviruses)，如呼腸病毒1、2，和3；環(huán)狀病毒(orbiviruses)，如科羅拉多壁虱熱病毒(Colorado tick fever)；輪狀病毒(rotaviruses)，如人輪狀病毒；甲病毒屬(alphavirases)，如東方腦炎病毒(Eastern encephalitis virus)和委內瑞拉腦炎病毒(Venezuelanencephalitisvirus)；風疹病毒(rubiviruses)，如風疹病毒(rubella)；黃病毒(flaviviruses)，如黃熱病病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，蜱傳腦炎病毒(Tiek-borne encephalitis)和丙肝病毒；冠狀病毒(coronaviruses)如人冠狀病毒；副粘病毒(paramyxoviruses)，如副流感病毒1、2、3和4以及腮腺炎病毒；麻疹病毒(morbilliviruses)，如麻疹病毒(measles virus)；肺病毒(pneumovirus)，如呼吸道合胞病毒；水泡病毒(vesiculovirus)，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssaviruses)，如狂犬病毒；正粘病毒(orthomyxoviruses)，如流感病毒A和B；布尼亞病毒(bunyaviruses)，如LaCrosse病毒；白蛉熱病毒(phlebovirus)，如立夫特谷熱病毒(Rift valley fever virus)；內羅病毒(nairovirus)，如剛果出血熱病毒；嗜肝DNA病毒屬(hepadnaviridae)，如，乙肝病毒；沙粒病毒(arenaviruses)，如1cm病毒，Lasso病毒和Junin病毒；逆轉錄病毒(retroviruses)，如HTLV I，HTLV II，HIV-1和HIV-2；腸病毒(Enterouirus)，例如脊髓灰質炎病毒1，2和3，柯薩奇病毒(coxackie virus)，?？刹《?echovirus)，人腸病毒，甲肝病毒，戊肝病毒和諾沃克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒(rhinoviruses)，如人鼻病毒；和絲狀病毒屬(filoviridae)，如馬爾堡(病)病毒(Marburg(disease)virus)和埃鮑拉(Ebola)病毒。
來自這些細菌、病毒和寄生蟲來源的抗原可用于制備用作疫苗的多聚蛋白。所述多聚體可以包含攜帶不同抗原的單體的混合物。
可以制備用于研究或治療目的的人蛋白的免疫原。免疫原性肽在暴露于生物體免疫系統(tǒng)時能激發(fā)免疫反應，其是用于根據本發(fā)明所述的方法制備C4bp核心蛋白融合蛋白的優(yōu)選多肽。本發(fā)明的寡聚化C4bp核心融合蛋白的提高的產量有許多應用，其不僅可用于預防接種中，而且也可用于研究。例如由人類基因組工程產生的人類基因序列數據使得產生與新的多肽反應的抗血清成為迫切的需要。同樣的需要適用于原核細胞(如細菌)和其它真核細胞(包括真菌)的基因產物。由于與C4bp核心多聚體融合的目的免疫原對免疫球蛋白分子的親合力增強，認為它們具有更高的效力。
本發(fā)明在免疫應答的引發(fā)方面有許多優(yōu)勢。例如，寡聚體的應用允許向免疫系統(tǒng)同時呈遞多個抗原。這允許多價疫苗的制備，所述疫苗可激發(fā)針對存在于單一生物體或許多不同生物體內的一種以上表位的免疫應答。因此，根據本發(fā)明制成的疫苗可用于同時對一種以上疾病進行預防接種，或用于同時靶向給定病原體上的數個表位。所述表位可存在于單個的單體單位或不同的單體單位上，所述不同的單體單位相互結合以提供異源多聚體。
此外，本發(fā)明可通過將佐劑摻入C4bp核心寡聚體上，并和免疫原一起進行應用。適合的佐劑包括，例如，細菌毒素和細胞因子，如白細胞介素。免疫原的效價得以提高，使得抗血清的激發(fā)和免疫均更為有效。高度優(yōu)選的佐劑是補體的C3d組分。
C4bp核心融合蛋白在免疫中是有用的，因為該核心蛋白不僅通常不存在于免疫受體的血清或血漿中，而且它本身不誘發(fā)免疫應答。C4bp蛋白已知存在于許多哺乳動物種類中，并且本領域的熟練技術人員可使用標準基因克隆技術發(fā)現哺乳動物種類的適當同源物。
該系統(tǒng)允許在大腸桿菌中制備可溶蛋白的事實，使得可利用該系統(tǒng)將由于缺少C-末端和/或N-末端的限制(constraint)因而在其自己單獨表達時不進行折疊的蛋白制備為例如折疊的可溶蛋白，結構域或片段。改造具體的切割位點能產生目的游離結構域。類似地，在重折疊過程中限制目的肽的N-末端和/或C-末端是有益的。此外，由于寡聚化結構對于變性和分解(disassembly)有很強的抵抗力，在插入蛋白的變性過程中所述結構將保持穩(wěn)定。因此，在重折疊過程中，對于等量的目的蛋白，游離蛋白的實際濃度可通過與寡聚化數目等同的因素而降低。寡聚化反應對于純化也是有益的，因為蛋白技術中許多方法對于蛋白，且特別是低分子量的肽而言不是最佳的。
實驗方法根據本發(fā)明方法制備的C4bp核心融合蛋白可用于在體內或體外檢測或中和抗體。例如，在體外，多價或單價抗原攜帶型C4bp核心融合蛋白可用于從噬菌體展示實驗選擇抗體分子。此外，在體內，按照本發(fā)明方法制備的抗原攜帶型C4bp核心融合蛋白可用于中和自身免疫疾病的自身抗體，或用于檢測可指示病理狀態(tài)的抗體，如用于HIV檢測或其它診斷用途。
噬菌體展示噬菌體展示技術被證實在生物學研究中非常地有用。它使配體能夠從龐大的分子庫中被挑選出來。本發(fā)明的蛋白也利用這種技術的作用(power)，且比普通應用展現出更有力的優(yōu)勢。C4bp分子可顯示為fd噬菌體上的單體，如同單鏈Fv分子一樣。融合物文庫依據標準方法構建，在所得文庫中篩選目的配體。應注意這是基于親和力(affinity)的選擇。經過定性后，根據親和力選擇的配體可被寡聚化從而可利用抗體對抗原的親合力(avidity)。當配體的靶是寡聚物形式時，將形成非常緊密的結合。此外，單體形式的配體，可以和它們的結合配偶體交聯或寡聚化。這種效應的一個應用是觸發(fā)受體活化。
蛋白芯片當前，DNA微陣列(無論是寡核苷酸，PCR產物或克隆的DNA)，是促進基因表達的高度平行分析快速發(fā)展的主要工具。很明顯在許多情況下，直接監(jiān)測基因表達是更優(yōu)選的，也就是說，測定蛋白表達水平而非mRNA水平。后者僅能間接測定基因活性，其依賴標記cDNA的雜交，且非常易引起誤解，因為通常具體mRNA的豐度和所述mRNA翻譯為蛋白的頻度之間存在較低的相關性。此外，mRNA分析不可能測定編碼蛋白(即使被翻譯后)是否具有活性。這依賴于翻譯后修飾。
因此包含融合蛋白的蛋白序列可被產生并用于測定樣品中那些蛋白的表達水平，其中所述融合蛋白為核心支架融合蛋白與目的蛋白的一定范圍的配體的融合蛋白。
例如，可提供表達支架-配體融合蛋白的細菌細胞陣列，使得加入樣品后，融合蛋白可在原位表達和回收?？蛇x，融合體可分別生成，然后排列在適合的固體支持物上，用于檢測所述樣品中的蛋白。檢測可通過提供預定量的標記的目的蛋白，來與所述樣品中的蛋白競爭，然后測定有多少標記蛋白與配體結合來進行?？蛇x，可標記所述配體并檢測與目的蛋白結合的標記后配體的量。
核酸包含C4bp核心的蛋白可通過利用編碼該重組蛋白的核酸構建體，在原核宿主細胞中表達該蛋白來制備。
所述構建體通常是可復制的載體，其中所需宿主細胞中編碼蛋白的序列可操作地連接于適合蛋白表達的啟動子。所述啟動子可以是誘導型啟動子。適合的啟動子包括T7啟動子，tac啟動子，trp啟動子，λ啟動子PL或PR以及本領域熟練技術人員所熟知的其它啟動子。
所述載體可包含復制起點并可選地包含啟動子的調節(jié)物。所述載體可包含一或多個可選擇的標記基因，例如抗生素抗性基因如氨芐青霉素，四環(huán)素或優(yōu)選卡那霉素抗性基因。本領域中有多種已知的細菌表達載體，本發(fā)明可依據本領域內熟練技術人員的個人偏好而利用任何載體。
多種原核宿主細胞可用于本發(fā)明的方法中。這些宿主包括埃希氏菌屬(Escherichia)，假單胞菌屬(Pseudomonus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，嗜熱菌屬(Thermophilus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，腸桿菌屬(Enterobacteriacae)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的菌株。例如，埃希氏菌屬的大腸桿菌(E.coli)用于本發(fā)明方法時，該細菌的優(yōu)選菌株包括BL21(DE3)和它們的衍生物包括C41(DE3)，C43(DE3)或CO214(DE3)，或其它對重組蛋白表達毒性有抵抗性的菌株，其在WO98/02559中描述并且可得。
甚至更優(yōu)選，當啟動子不是T7啟動子時，可利用缺少原噬菌體DE3的這些菌株的衍生物。
DNA疫苗和治療法另一方面，本發(fā)明提供真核表達載體在人體或動物體的治療中的用途，所述載體包含編碼重組融合蛋白的核酸序列，所述重組融合蛋白包含C4bpα鏈C-末端核心蛋白支架。
這種治療可通過向患有遺傳病或其它疾病的細胞或組織內引入具體的核酸序列，或通過引入編碼用于激發(fā)免疫應答的抗原的核酸序列來實現其治療作用。為證明基因產物將對疾病細胞或組織產生直接或間接影響，也可以將基因序列引入細胞或組織，其不同于患所述疾病的細胞或組織。核酸的遞送可利用質粒載體(“裸露的”或配制劑形式)或重組表達載體來實現。
可用于基因治療的多種病毒載體包括腺病毒，皰疹病毒，痘病毒或RNA病毒如逆轉錄病毒。所述逆轉錄病毒載體可以是鼠或鳥逆轉錄病毒的衍生物?？刹迦雴蝹€外源基因的逆轉錄病毒載體的實例包括但不僅限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)，和勞斯肉瘤病毒(RSV)。當對象是人類時，可利用載體如長臂猿白血病病毒(GaLV)。
所述載體將包括轉錄調節(jié)序列，特別是足以指導RNA合成開始啟動子區(qū)域。適合的真核啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等1982 J.Molec.Appl.Genet.1，273)；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，1982Cell 31，355)；SV40早期啟動子(Benoist等1981 Nature 290，304)；勞斯肉瘤病毒啟動子(Gorman等1982 Proc.NatlAcad.Sci USA 79，6777)；和巨細胞病毒啟動子(Foecking等1980 Gene 45，101)。
用于需要基因治療的具體細胞類型的啟動子在許多情況下是需要的。在具體細胞類型用作平臺以產生目標為另一位點(直接或間接作用)的治療性蛋白時，所選的啟動子應在“工廠”位點良好工作。肌肉是上述觀點的很好實例，是因為其處于有絲分裂期后，它在沒有針對蛋白表達型肌纖維的免疫應答的情況下，可連續(xù)數年產生治療性蛋白。因此，利用強肌肉啟動子尤其適于本發(fā)明。除了治療肌肉疾病本身，肌肉的應用通常只適用于分泌型蛋白，所述分泌型蛋白可循環(huán)并在其它部位發(fā)揮功能(例如，激素，生長因子，凝血因子)。
將本發(fā)明這一方面的載體作為質粒載體或作為部分病毒載體給藥受試者，可受許多不同途徑的影響。質粒DNA可用于直接或間接給藥，其可以是“裸露的”或與陽離子和中性脂質(脂質體)配制在一起或微囊化的。所述DNA序列也可以包含于病毒(如，腺病毒，逆轉錄病毒，皰疹病毒，痘病毒)載體中，所述載體用于直接或間接遞送。遞送途徑包括但不僅限于經肌肉內，皮內(Sato，Y.等1996 Science 273，352)，靜脈內，動脈內，鞘內，肝內，吸入，陰道內滴注(Bagarazzi等1997 J Med.Primatol.26，27)，直腸內，腫瘤內或腹膜內。
因此本發(fā)明包括本文描述的載體作為藥物組合物，所述藥物組合物允許用DNA載體轉染一些細胞，從而使治療性多肽得以表達并產生治療效果(改善感染或疾病引起的癥狀)。本發(fā)明的藥物化合物可通過使本發(fā)明的構建體成為適合利用溶劑，載體，遞送系統(tǒng)，賦形劑和添加劑或輔助劑并給藥受試者的形式來制備。經常使用的溶劑包括無菌水和鹽水(緩沖的或非緩沖的)。載體包括金微粒，其通過基因槍(biolistically)遞送(如在氣壓(gas pressure)下)。其它常用的載體或遞送系統(tǒng)包括陽離子脂質體，螺旋物(cochleate)和微囊，所述載體或遞送系統(tǒng)可以為液體溶液，包含在遞送膠囊中或者或摻入食物中。
給藥基因治療載體的另一可選配制劑包括脂質體。脂質體的被囊化(encapsulation)為給藥多核苷酸和表達載體提供了可選配方。脂質體是由含水區(qū)室周圍的一個或多個脂質雙分子層組成的微觀小泡。通常參見，Bakker-Woudenberg等1993 Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12，Suppl.1，S61，和Kim，1993 Drugs 46，618。脂質體的成分和細胞膜相似，所以脂質體可被安全地給藥，并且是可生物降解的。依賴這種制備方法，脂質體可以是單層的或多層的，并且脂質體的大小可不同，直徑范圍從0.02μM到大于10μM。參見，例如，Machy等1987 LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY ANDPHARMACOLOGY(John Libbey)，和Ostro等1989 American J.Hosp.Phann.46，1576。
利用標準技術可將表達載體包入脂質體中。許多不同的脂質體組合物和合成方法為本領域熟練技術人員所熟知。參見，例如，美國專利4,844,904、美國專利5,000,959，美國專利4,863,740，美國專利5,589,466，美國專利5,580,859，和美國專利4,975,282，以上全部文獻包含在本文中作為參考。
通常，脂質體-被囊化的載體的給藥劑量根據以下因素變化，如病人的年齡，體重，身高，性別，總體醫(yī)學情況和既往醫(yī)學記錄。具體配制劑的劑量范圍可通過利用適合的動物模型確定。
在一個實施方案中，所述載體編碼融合蛋白，此融合蛋白包含核心和另外的一或多種抗原，并可選且優(yōu)選地包含具有免疫刺激特性的蛋白。C3d已知具有強大的免疫刺激特性并可用于所述目的，也可以用白細胞介素，尤其是白介素-2(IL-2)和白介素-12(IL-12)。
細胞培養(yǎng)本發(fā)明編碼融合蛋白的質?？衫贸Ｒ?guī)轉化技術引入宿主細胞，并且在促進該融合蛋白產生的情況下培養(yǎng)所述細胞。在利用誘導型啟動子時，細胞最初在缺乏誘導物的條件下培養(yǎng)，所述誘導物可在細胞生長到較高密度時加入以使蛋白回收最大化。
細胞培養(yǎng)條件是本領域內所熟知的，并且可根據已知方法使用。
從培養(yǎng)物中回收蛋白當細胞生長到允許產生蛋白時，可從該細胞中回收所述蛋白。我們驚奇地發(fā)現所述蛋白保持可溶狀態(tài)，因此細胞通常經旋轉沉下(spun down)并通過超聲處理而溶解，此過程中使蛋白級分保持可溶狀態(tài)并允許所述級分保留于上清液中，之后進一步高速(如15rpm，000進行1小時)離心。
上清液蛋白級分中的融合蛋白可通過標準蛋白層析技術的任意適合組合而純化。我們采用離子交換層析，之后用凝膠過濾層析。其它層析技術，如親和層析，也可被應用。
在一個實施方案中，我們發(fā)現在溶解產物離心后或在任何其它純化步驟后加熱上清液樣品，將有助于蛋白的回收。所述樣品可被加熱到70-80℃、持續(xù)大約10到30分鐘。
依據蛋白的目的用途，可對所述蛋白進行進一步的純化步驟，例如透析，或濃縮步驟，例如冷凍干燥。
以下實例將說明本發(fā)明。
實施例1.db-C4bp的生產載體構建體構建表達載體，其編碼下游盒肽序列MASMNHKGS(Sprengert M.L，Fuchs E.和Porter A.G 1996“The downstream boxan efficient andindependent translation initiation signal in Escherichia coli”EMBO J.Volume15，665-674)，所述序列的N-末端與人類C4bpα鏈的57個氨基酸的“核心”區(qū)域相融合。
簡言之，C4bp核心結構域完全由人類基因組中的單個外顯子編碼，因此允許它從人類基因組DNA中直接擴增。利用的寡核苷酸引物是
AVD 1025’CCCGCGGATCCGACCCCCGAAGGCTGTGA3’；和AVD 1035’CCCCGGAATTCTTATTATAGTTCTTTATCCAAAGTGG3’。
其包含加入的限制酶切位點，該位點用于克隆擴增的DNA片段。用BamHI和EcoRI酶消化PCR產物而獲得的183個堿基對的片段，所述片段在質粒載體中在翻譯增強子或“下游盒”和T7啟動子的下游克隆。所述質粒來源于Invitrogen提供的質粒pRsetA，但是復制的f1起點被來自質粒pSC101的對等(par)基因座所取代。因此它包含如下功能元件選擇標記(氨芐青霉素抗性)、復制起點(來自pUC家族)、T7啟動子、T7轉錄終止子以及對等基因座。產生的構建體被命名為質粒pAVD77。圖8顯示融合于C4bp編碼序列的翻譯增強子和T7啟動子序列(小寫字母)。
db-C4bp融合蛋白的預測大小是7491.5Da。
轉化和表達所述載體被轉化入大腸桿菌C41(DE3)菌株中，所述菌株為BL21(DE3)的衍生物(Bruno Miroux和John E.Walker 1996“Over-production of Proteins inEscherichia coliMutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteinsand Globular Proteins at High Levels”Journal of Molecular Biology Volume 260，289-298)。
將細胞接種于1L LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基，所述細胞在37℃、震搖條件下保溫3小時(直到OD600nm達到0.6)，然后用終濃度為0.7mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導3小時。所述細胞在4600rpm離心30分鐘收集。
這些沉淀(P)被重懸浮于30ml Tris 50mM pH7中，并且利用Emulsiflex儀器通過超聲處理兩次破壞所述細胞(在每次處理之間，以15000rpm離心1小時，保存每次離心所得的上清液(分別命名為SN1和SN2)，并且將沉淀P1重懸于相同的緩沖液中)。
混合兩次的上清液(60ml)并分為成每份30ml的兩份溶液。每份db-C4bp融合蛋白的30ml等分試樣用兩種類似方法之一進行純化除了一種方法中加熱的步驟在另一種方法中用MonoQ離子交換步驟所取代以外，這兩種方法完全相同。
不包括加熱步驟的純化利用離子交換層析(DEAE Fast Flow 70，利用13cm高，直徑2.6cm的柱)從500ml培養(yǎng)物中純化天然db-C4bp，所述過程使用TrisHCl緩沖液(50mM pH7)和鹽梯度(0M-1M NaCl)。所述融合蛋白在300-400mM NaCl之間洗脫。收集均為7.5ml的各個級分-見圖2。
將級分B8至B11混合，并用TrisHCl 20mM pH7透析。然后這種溶液加樣子離子交換柱上(MonoQ HR 16/10)，使用的是Tris緩沖液(50mM pH7)和鹽梯度(0M-1M NaCl)。收集2.5ml的級分。所述融合蛋白在500-550mMNaCl之間洗脫(圖3)。
將級分A10至B1混合，隨后將終溶液濃縮為10ml，然后在凝膠過濾柱(S75 26/60)上對所述溶液進行層析。收集5ml的級分。使用139ml的緩沖液(TrisHCl 100mM pH7，150mM NaCl)從該柱上洗脫所述融合蛋白，見圖4。以分子量標準物校準該柱，提示這種蛋白的分子量與白蛋白相似(67kDa)，其中白蛋白也在139ml的Tris 50mM+NaCl150mM中洗脫，然而所述單體的預期分子量是7.491kDa。這表明所述融合蛋白從大腸桿菌胞液中純化出來時即是寡聚物結構，而無需任何重折疊步驟。
將級分A10至B1混合(312μg/ml)，并且用磷酸鈉緩沖液(100mM，pH7.4)對等分試樣進行透析。
純化后每升培養(yǎng)物的蛋白產量是12.4毫克。
檢測CD譜顯示存在明顯的二級結構，所述結構與正確折疊的蛋白復合物一致。
實施例2.有加熱步驟的db-C4bp純化將含另一份30ml db-C4bp等分試樣的溶液在76℃加熱15分鐘，然后以20,500rpm離心1小時。包含db-C4bp的上清液通過離子交換層析(DEAEFast Flow 70ml)純化，使用的是Tris緩沖液(50mM pH7)和鹽梯度(0M-1MNaCl)。收集7.5ml的級分。所述融合蛋白在300-400mM NaCl之間洗脫(圖5)。
將片段B8至B11混合，隨后將終溶液濃縮為10ml，然后在凝膠過濾柱(S75 26/60)上對所述溶液進行層析。收集5ml的級分。使用140ml的緩沖液(TrisHCl 100mM pH7，150mM NaCl)從該柱上洗脫所述融合蛋白(圖6)。以分子量標準物校準該柱，提示這種蛋白的分子量與未經加熱而純化的蛋白的相似(67kDa)，其中所述單體的預期分子量是7.491kDa。因此該融合蛋白從大腸桿菌胞液中純化出來時也是寡聚物結構，而無需任何重折疊步驟。而且，即使在包含50mM TrisHCl pH7(也就是不含鹽)的緩沖液中加熱至760℃持續(xù)15分鐘時，所述融合蛋白仍保持寡聚物結構。
將級分A11至B1混合(312μg/ml)，并且用磷酸鈉緩沖液(100mM，pH7.4)對等分試樣進行透析。
利用圓二色性(circular dichroism)分析顯示，經過加熱的樣品的光譜與未經加熱的樣品的光譜是相同的。這證實了盡管進行了加熱，蛋白的二級結構要素(element)依然保持。
有加熱步驟時的產量是每升3.5毫克。
加入加熱步驟可顯著簡化蛋白的純化。本發(fā)明的實施例中，加熱取代了離子交換(MonoQ)步驟，且仍然得到至少相等純度的蛋白。
實施例3.使用變性劑處理蛋白為進一步確定蛋白確實是寡聚的，嘗試使純化的蛋白在室溫在6M氯化胍和20mM DTT(二硫蘇糖醇)中變性，然后在變性條件下重復凝膠過濾。
簡言之，如上所述使實施例1中的500ml細胞培養(yǎng)物生長并對其進行誘導。所述融合蛋白通過離子交換層析純化，使用的是TrisHCl緩沖液(50mM pH7.4)和鹽梯度(0M-1M NaCl)。所述融合蛋白在450-650mM NaCl之間洗脫，然后濃縮為10ml。經過濃縮步驟以后，db-C4bp蛋白的濃度為740微克每毫升。
然后所述蛋白以每毫升740微克的濃度、在4℃由6M氯化胍和20mMDTT處理，然后通過凝膠過濾柱(S-75)中進行層析。所述融合蛋白由11.4ml的緩沖液中從該柱洗脫。以分子量標準物校準層析柱顯示，該蛋白的分子量約為60kDa，然而單體預期的分子量是7.5kDa。因此該融合蛋白當從大腸桿菌胞液中純化出來時是寡聚物結構，而無需任何重折疊步驟，且即使處理為變性條件時也是這樣。
由CD分析證實，用6M胍HCl重復變性步驟2或6小時、并加熱至75℃-80℃確實產生了變性的蛋白。
實施例4.在大腸桿菌中克隆并重組表達融合于組氨酸標記序列的人C4bp核心為證實翻譯增強子不是大腸桿菌內核心區(qū)的高水平表達所必需的，并促進蛋白的純化，編碼下游盒的DNA序列由編碼6x組胺酸標記的序列所取代，其中用以下序列取代pAVD內的NdeI/BamHI限制性酶切片段CATATGCGGG GTTCTCATCA TCATCATCAT CATGGTCTGG TTCCGCGTGG ATCC
得到的質粒pAVD 93，超量生產8.46kDa的重組蛋白，所述蛋白具有以下氨基酸序列MRGSHHHHHH GLVPRGSETP EGCEQVLTGK RLMQCLPNPEDVKMALEVYK LSLEIEQLEL QRDSARQSTL DKEL質粒pAVD 93被轉化入細菌菌株C41(DE3)，并如上所述使用IPTG誘導融合蛋白的表達。SDS-PAGE分析顯示的8.5kDa蛋白在誘導3小時后出現于被誘導的培養(yǎng)物中，但不存在于未經誘導的培養(yǎng)物中。
實施例5.在大腸桿菌中克隆并重組表達融合于DsbA蛋白的人C4bp核心C4bp核心區(qū)與下游盒增強子編碼的短肽序列或組胺酸標記的融合，并不必定意味著核心區(qū)與較大蛋白的融合是可行的。為證實上述觀點，C4bp核心被融合于DsbA蛋白的C-末端，DsbA蛋白是通常在大腸桿菌周質間隙中發(fā)現的一種酶。DsbA由177個氨基酸組成，因此比核心區(qū)域本身(57個氨基酸)大。
構建編碼DsbA-C4bp融合蛋白的質粒pAVD 78pAVD77中編碼下游盒增強子的NdeI-BamHI DNA片段被編碼DsbA的NdeI-BamHI片段所取代。用于獲得編碼DsbA片段的寡核苷酸引物是AVD525’GGGGCCCCCATATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAG3’；和AVD1155’GGGGAATTCTTAGGATCCAGAACCTTTTTTCTCGGACAGATATITCAC3’。
這些引物用于擴增來自大腸桿菌基因組DNA的DsbA編碼序列(缺乏終止密碼子)。PCR產物用NdeI和BamHI限制酶消化，并克隆入pAVD 77以產生pAVD 78。
質粒pAVD 77被轉化入細菌菌株C41(DE3)，并如上所述使用IPTG誘導融合蛋白的表達。SDS-PAGE分析所示的28kDa蛋白存在于被誘導3小時后的培養(yǎng)物中，但不存在于未經誘導的培養(yǎng)物中。令人驚奇地是，這種蛋白存在于所述細胞提取物的可溶級分中。
DsbA-C4bp融合蛋白的純化融合蛋白通過兩步離子交換層析(第一次用DEAE，第二次用MonoQ)純化，每種情況都使用Tris HCl緩沖液(50mM pH7.4)和鹽梯度(0M-1MNaCl)。所述融合蛋白在第一次(DEAE)離子交換層析后在大約100mM NaCl時洗脫，然后由分辨率更高的(MonoQ)離子交換層析純化。從MonoQ在350mM NaCl洗脫的融合蛋白用S200凝膠過濾柱(10/30)濃縮，然后進行層析。融合蛋白在12.54ml的緩沖液中從層析柱上洗脫。
以分子量標準物校準層析柱顯示，該蛋白的分子量約為200kDa。單體的預期分子量是28.08kDa。因此該融合蛋白當從大腸桿菌胞液中純化出來時也是寡聚物結構，而無需任何重折疊步驟。
為證實融合蛋白確實是寡聚體，而不是在凝膠過濾時表現異常，純化后的蛋白在6M氯化胍和20mM DTT(2小時30分鐘，在室溫)中變性，并在變性條件下(也就是在6M氯化胍和20mM DTT存在的條件下)重復所述凝膠過濾。
在這些環(huán)境下，在12.5ml的體積中洗脫的蛋白，分子量大約為220kDa。因此所述融合蛋白在這些條件下沒有變性該蛋白仍是寡聚物。
用鹽酸胍在4℃處理16小時之后獲得這種蛋白的完全變性，這與上述實施例3相反，所述實施例3中需要加熱至75℃-80℃來進行完全變性。
DsbA-C4bp融合蛋白的活性為檢測DsbA-C4bp的活性，進行胰島素實驗。在DTT存在的條件下，活性DsbA催化胰島素二硫鍵的還原，使得兩條鏈分離，并由此導致游離胰島素B鏈的沉淀。濁度測定法因此被用來測定胰島素二硫鍵的還原作用。(Holmgren A(1979)Thioredoxin catalyses the reduction of insulin disulfides bydithiothereitol and dihydrolipoamide。J.Biol.Chem.254，9627)。
終反應混合物的終體積為1.2ml，其中含0.14mM新鮮制備的胰島素，0.1M磷酸鉀pH7.0，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，和0.67mM DTT，和100μg DsbA-C4bp融合蛋白。
該反應通過加入8μl的0.1M的DTT來啟動，并通過每5分鐘測定650nm的濁度增加直至第60分鐘為止進行監(jiān)測。測定每份樣品在650nm的吸光率之前，將所述樣品混合3-4次。該反應的容器空白(instrument blank)含0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.0，和2mM EDTA。
結果見圖7，并說明存在于DsbA-C4bp融合蛋白中的DsbA仍有活性，且其活性可與可溶的DsbA的活性直接可比。
實施例6.非還原條件下C4bp融合蛋白的分析在變性但非還原性條件下，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對C4bp融合蛋白進行分析，以確定在寡聚體的單體間是否存在二硫鍵。
db-C4bp(312μg/ml)的等分樣品(12μl)與Laemmli緩沖液(Tris HCl 1.5MpH6.8，SDS 2％，丙三醇15％，0.02％溴酚藍)在存在或不存在β-巰基乙醇時進行混合。這些樣品在90℃煮沸5分鐘，并通過含18％十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，同樣缺乏β-巰基乙醇。
其結果是，在缺乏β-巰基乙醇的條件下，db-C4bp融合蛋白作為寡聚體遷移(在凝膠頂部，圖9右側)，顯示單體間存在二硫鍵。相反，加入β-巰基乙醇導致db-C4bp蛋白以其單體分子量進行遷移，見于前述圖和圖9左側(顯示純化過程中db-C4bp的還原的樣品)。
序列表<110>阿維迪斯公司(AVIDIS SA)<120>利用C4bp支架制備多聚體融合蛋白<130>AHB/FP6155089<140>
<141>
<150>EP 02292043.3<151>2002-08-14<160>29<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>57<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55<210>2<211>57<212>PRT<213>穴兔(Oryctolagus cuniculus)<400>2Glu Val Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Gln Ala Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Ala Asp Pro Tyr Glu Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Leu Leu Glu Leu Gln Arg Asp Lys Ala35 40 45Arg Lys Ser Ser Val Leu Arg Gln Leu50 55<210>3<211>55<212>PRT<213>家鼠(Rattus sp.)
<400>3Glu Val Pro Lys Asp Cys Glu His Val Phe Ala Gly Lys Lys Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Ser Asn Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Thr Leu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Leu Gln Ile Asp Lys Ala35 40 45Lys His Val Asp Arg Glu Leu50 55<210>4<211>54<212>PRT<213>小家鼠(Mus sp.)<400>4Glu Ala Ser Glu Asp Leu Lys Pro Ala Leu Thr Gly Asn Lys Thr Met1 5 10 15Gln Tyr Val Pro Asn Ser His Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Thr Leu Glu Val Glu Leu Leu Gln Leu Gln Ile Gln Lys Glu35 40 45Lys His Thr Glu Ala His50<210>5<211>67<212>PRT<213>牛(Bos sp.)<400>5Glu Tyr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Val Thr Gly Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Gln Cys Leu Ser Arg Pro Glu Glu Val Lys Leu Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Ile Leu Gln Thr Asn Lys Leu Lys Lys35 40 45Glu Ala Phe Leu Leu Arg Glu Arg Glu Lys Asn Val Thr Cys Asp Phe50 55 60Asn Pro Glu65<210>6<211>57<212>PRT<213>野豬(Sus scrofa)
<400>6Glu Tyr Pro Glu Asp Cys Glu Gln Val His Glu Gly Lys Lys Leu Met1 5 10 15Glu Cys Leu Pro Thr Leu Glu Glu Ile Lys Leu Ala Leu Ala Leu Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Thr Asn Leu Leu Glu Leu Gln Ile Asp Lys Glu35 40 45Lys Lys Ala Lys Ala Lys Tyr Ser Thr50 55<210>7<211>56<212>PRT<213>豚鼠(Cavia porcellus)<400>7Glu Val Pro Glu Glu Cys Lys Gln Val Ala Ala Gly Arg Lys Leu Leu1 5 10 15Glu Cys Leu Pro Asn Pro Ser Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Val Lys35 40 45Ile Gln Glu Lys Phe Ser Lys Glu50 55<210>8<211>59<212>PRT<213>小家鼠(Mus sp.)<400>8Glu Val Leu Glu Asp Cys Arg Ile Val Ser Arg Gly Ala Gln Leu Leu1 5 10 15His Cys Leu Ser Ser Pro Glu Asp Val His Arg Ala Leu Lys Val Tyr20 25 30Lys Leu Phe Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu His Gln Lys Glu Lys Trp35 40 45Ile Gln Leu His Arg Lys Pro Gln Ser Met Lys50 55<210>9<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體
<400>
Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn1 5 10 15Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu20 25 30Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu35 40 45Asp Lys Glu Leu50<210>10<211>57<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>10Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55<210>11<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>11Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn1 5 10 15Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu20 25 30Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu35 40 45Asp Lys Glu Leu50
<210>12<211>57<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>12Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55<210>13<211>57<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>13Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55<210>14<211>50<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>14Glu Gly Cys Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu1 5 10 15
Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser20 25 30Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser35 40 45Thr Leu50<210>15<211>57<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>15Glu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met1 5 10 15Gln Ser Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr20 25 30Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala35 40 45Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu50 55<210>16<211>52<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述C4bp核心蛋白的變體<400>16Glu Gly Ser Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Ser Leu1 5 10 15Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser20 25 30Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser35 40 45Thr Leu Asp Lys50<210>17<211>5<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述柔性接頭<400>17Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>18<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述柔性接頭<400>18Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10<210>19<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述柔性接頭<400>19Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>20<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述柔性接頭<400>20Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser20<210>21<211>14<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述血小板生成素激動肽<400>21Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala1 5 10<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述下游盒肽序列<400>22Met Ala Ser Met Asn His Lys Gly Ser1 5<210>23<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>23cccgcggatc cgagaccccc gaaggctgtg a 31<210>24<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>24ccccggaatt cttattatag ttctttatcc aaagtgg 37<210>25<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼6x組氨酸標記的序列<400>25catatgcggg gttctcatca tcatcatcat catggtctgg ttccgcgtgg atcc 54
<210>26<211>74<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述由質粒pAVD 93產生的氨基酸序列<400>26Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly1 5 10 15Ser Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu20 25 30Met Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val35 40 45Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser50 55 60Ala Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu65 70<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>27ggggccccca tatggcgcag tatgaagatg gtaaacag 38<210>28<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>28ggggaattct taggatccag aacctttttt ctcggacaga tatttcac48<210>29<211>303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pAVD77中的啟動子和C4bp編碼區(qū)<400>29gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60
agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tggctagcat gaatcacaaa 120ggatccgaga cccccgaagg ctgtgaacaa gtgctcacag gcaaaagact catgcagtgt 180ctcccaaacc cagaggatgt gaaaatggcc ctggaggtat ataagctgtc tctggaaatt 240gaacaactgg aactacagag agacagcgca agacaatcca ctttggataa agaactataa 300taa30權利要求
1.獲得包含C4bpα鏈的C-末端核心蛋白支架的重組融合蛋白的方法，該重組融合蛋白能在原核宿主細胞中形成可溶的多聚體，所述方法包括以下步驟(i)提供攜帶編碼所述重組蛋白的核酸的原核宿主細胞，該核酸與在所述原核細胞中有功能的啟動子可操作地連接；(ii)在所述重組蛋白被表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞；和(iii)回收所述重組蛋白，其中所述蛋白以多聚體形式被回收，而無需支架重折疊的步驟。
2.權利要求1的方法，其中所述重組蛋白以至少2mg/l細胞培養(yǎng)物的濃度存在。
3.權利要求1或2的方法，其中所述宿主原核細胞是大腸桿菌。
4.權利要求3的方法，其中所述大腸桿菌選自菌株C41(DE3)[B96070444]，C43(DE3)[B96070445]或CO214(DE3)[NCIMB40884]，或對超量表達的重組蛋白的毒性有抗性的其它菌株。
5.權利要求1至4中任何一個的方法，其中所述重組蛋白包含與異源多肽融合的C4bp核心蛋白。
6.權利要求1至6中任何一個的方法，其中所述異源多肽是TNF受體蛋白。
7.前述權利要求中任何一個的方法，其中所述異源多肽是BAFF-R的BAFF結合部分。
8.權利要求1至6中任何一個的方法，其中所述異源多肽是血小板生成素激動肽IEGPTLRQWLAARA或促生長激素抑制素。
9.分離的核酸，所述核酸包含編碼融合蛋白的序列，所述融合蛋白為C4bpα鏈的C-末端核心蛋白與BAFF-R的融合蛋白。
10.分離的核酸，所述核酸包含編碼融合蛋白的序列，所述融合蛋白為C4bpα鏈的C-末端核心蛋白與血小板生成素激動肽IEGPTLRQWLAARA或促生長激素抑制素的融合蛋白。
11.原核表達載體，所述載體包含編碼C4bpα鏈的C-末端核心蛋白與異源多肽的融合蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列與在原核細胞中有功能的啟動子可操作地連接。
12.細菌宿主細胞，其由權利要求11中的表達載體轉化。
13.蛋白，所述蛋白包含與BAFF-R融合的C4bpα鏈C-末端核心蛋白。
14.蛋白，所述蛋白包含與血小板生成素激動肽IEGPTLRQWLAARA融合的C4bpα鏈C-末端核心蛋白。
15.權利要求1至8中任何一個的方法，其還包括將所述重組蛋白配制成組合物，所述組合物包含可藥用的載體或稀釋劑。
16.治療患者疾病的方法，所述疾病與血清BAFF水平的升高相關，所述方法包括將治療有效量的權利要求14的蛋白或權利要求9的核酸給藥患者的步驟。
17.權利要求16的方法，其中所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
18.真核表達載體，所述載體包含編碼權利要求13或14的蛋白的核酸序列，所述核酸序列與在真核細胞中有功能的啟動子可操作地連接。
19.真核宿主細胞，其由權利要求18的載體轉化。
20.權利要求18的表達載體在治療人體或動物體的方法中的應用。
21.真核表達載體在人體或動物體的治療中的用途，其中所述載體包含編碼重組融合蛋白的核酸序列，所述重組融合蛋白包含C4bpα鏈的C-末端核心蛋白支架。
全文摘要
所述發(fā)明提供了獲得重組融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含C4bpα鏈的C－末端核心蛋白支架，并且所述重組融合蛋白能在原核宿主細胞中形成可溶形式的多聚體，所述方法包括以下步驟(i)提供帶有編碼所述重組蛋白的核酸的原核宿主細胞，所述核酸與在所述原核細胞中有功能的啟動子可操作地連接；(ii)在所述的重組蛋白能夠被表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(iii)回收該重組蛋白，其中所述蛋白以多聚體形式被回收而不需要支架重折疊的步驟。
文檔編號C12N1/21GK1726283SQ03823684
公開日2006年1月25日 申請日期2003年8月12日 優(yōu)先權日2002年8月14日
發(fā)明者勞倫斯·加尼爾, 弗格爾·希爾, 米歇爾·朱利恩 申請人:阿維迪斯公司