專利名稱：：涉及痘病毒和癌的方法及組合物的制作方法
背景技術(shù)：
：1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及包含一個(gè)或多個(gè)突變從而使其特別適于癌癥治療的痘病毒，尤其是指痘苗病毒。2.相關(guān)領(lǐng)域的描述正常組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是一種細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間高度平衡的過程。細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間失去平衡就會(huì)致癌(Solyanik等，1995；Stokke等，1997；Mumby和Walter，1991；Natoli等，1998；Magi-Galluzzi等，1998)。例如，宮頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和腦癌只是可能發(fā)生的多種癌中的幾種(Erlandsson，1998；Kolmel，1998；Mangray和King，1998；Gertig和Hunter，1997；Mougin等，1998)。事實(shí)上，癌癥的發(fā)生率相當(dāng)高，僅在美國(guó)每年就有超過500,000的人死于癌癥。細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的維持至少部分是由原癌基因和腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)的。原癌基因或腫瘤抑制基因可編碼誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)(如sis、erbB、src、ras和myc)、抑制細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)(如Rb，p16，p19，p21，p53，NF1和WT1)或調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的蛋白質(zhì)(如bcl-2)(Ochi等，1998；Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等，1998)。但是，基因重排或這些原癌基因和腫瘤抑制基因的突變都會(huì)導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)化為致癌的癌基因或使腫瘤抑制因子變成無活性的多肽。一般來說單一點(diǎn)突變就足以完成這種轉(zhuǎn)化。例如，腫瘤抑制蛋白p53上的點(diǎn)突變就可以導(dǎo)致其完全失去野生型p53的功能(Vogelstein和Kinzler，1992)。到目前為止，只有幾種有效的方法用于治療多種常見類型的癌。對(duì)于單個(gè)個(gè)體來說，選用何種治療措施要根據(jù)診斷結(jié)果、疾病分期以及其他因素如年齡、性別及患者的健康狀況。最常用的癌癥治療方法是手術(shù)、放療和化療。手術(shù)在腫瘤的診斷和治療中扮演主要角色。通?；顧z和去除癌性生長(zhǎng)物都需要通過手術(shù)方法。但是，如果腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，則手術(shù)就不可能使患者痊愈，因此需要采用其他治療措施。放療、化療和免疫治療是手術(shù)治療措施的替代方法(Mayer，1998；Ohara，1998；Ho等，1998)。放療是指通過高能射線精確照射以摧毀癌細(xì)胞，與手術(shù)很相似，主要用于治療未轉(zhuǎn)移的局域化的癌細(xì)胞。放療的副作用包括皮膚刺激、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、脫發(fā)和無力(Curran，1998；Brizel，1998)?；熓侵咐每拱┧幹委煱┌Y，是另一種癌癥治療模式。一種特定抗癌藥的療效通常由于藥物難以進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)而受到限制(el-Kareh和Secomb，1997)?；煵呗缘幕A(chǔ)在于腫瘤組織可以生長(zhǎng)，其中抗腫瘤藥物的靶位是快速分裂的癌細(xì)胞。最常用的化療方法包括多種抗癌藥的聯(lián)合化療，這種方法被證實(shí)可以提高多種癌的反應(yīng)率(美國(guó)專利5,824,348；美國(guó)專利5,633,016和美國(guó)專利5,798,339，本文已納入作為參考)?；熕幬锏闹饕弊饔檬沁@些藥物也可以影響正常組織細(xì)胞，最可能受影響的是那些在某些情況下快速分裂的細(xì)胞(如骨髓、胃腸道、生殖系統(tǒng)和毛囊)?；熕幬锏钠渌拘孕?yīng)包括口瘡、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、嘔吐、疲乏、出血、脫發(fā)和感染。免疫治療是癌癥研究中一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，是另一種治療某些類型癌的方法。從理論上說，免疫系統(tǒng)被刺激后可將腫瘤細(xì)胞認(rèn)定為異源物質(zhì)，從而將它們作為摧毀的靶位。但不幸的是，這時(shí)的免疫系統(tǒng)發(fā)生的反應(yīng)一般都不足以阻止大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)。但是，最近研究的熱點(diǎn)集中在免疫治療領(lǐng)域以開發(fā)出增強(qiáng)或補(bǔ)充免疫系統(tǒng)自然防衛(wèi)機(jī)制的方法。目前正在研究或正在使用的免疫治療方法有免疫佐劑(如牛結(jié)核菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香化合物)(美國(guó)專利5,801,005；美國(guó)專利5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)、細(xì)胞因子治療(如干擾素(IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)以及基因治療(如TNF，IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美國(guó)專利5,830,880和美國(guó)專利5,846,945)和單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，抗-HER-2，抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國(guó)專利5,824,311)。這些方法雖然表現(xiàn)出了一定的前景，但是取得成功的例子還是有限的。復(fù)制選擇性的瘤溶解病毒具有可用于癌癥治療的前景(Kirn等，2001)。這些病毒可通過直接的復(fù)制依賴性和/或病毒基因表達(dá)依賴性瘤溶解效應(yīng)引起腫瘤細(xì)胞的死亡(Kirn等，2001)。另外，該病毒還可以增強(qiáng)誘導(dǎo)宿主內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)(Todo等，2001；Sinkovics等，2000)。這些病毒經(jīng)改造后還可以在腫瘤內(nèi)表達(dá)治療性目的基因以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)(Hermiston，2000)。但是這種治療方法還存在一些主要的限制。雖然某些種類的病毒已被證明具有一定程度的腫瘤選擇性，但是這種新方法還需要將瘤溶解病毒改造和/或增強(qiáng)其腫瘤選擇性以使其安全性達(dá)到最高。當(dāng)通過靜脈注射時(shí)以及當(dāng)具有潛在毒性的治療基因插入到這些病毒中以增強(qiáng)其抗腫瘤能力時(shí)這種選擇性尤其重要；基因的表達(dá)也要只限于正常組織。另外，通過其他機(jī)制如誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)或靶向到腫瘤相關(guān)血管以增強(qiáng)抗腫瘤能力也是值得贊許的。因此，需要找到一種更有效的并且毒性較低的癌癥治療措施。使用瘤溶解病毒進(jìn)行治療是一個(gè)克服上述缺點(diǎn)的領(lǐng)域。因此，本發(fā)明的目的在于解決這些問題。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)痘病毒經(jīng)改造后可以1)產(chǎn)生出對(duì)不同細(xì)胞群或不同類型的組織有不同影響的物質(zhì)和/或2)產(chǎn)生出具有更高感染性并且通過從感染細(xì)胞內(nèi)釋放出來而能夠感染其他細(xì)胞的痘病毒。本發(fā)明的痘病毒，如痘苗病毒的Copenhagen株，可以和其他治療措施(如化療)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，通過靶向到腫瘤的血管產(chǎn)生有益的療效而不會(huì)對(duì)抗或抑制TNF和/或INF通路。需要說明的是痘苗病毒的任何病毒株都可以使用。在某些實(shí)施方案中，痘苗病毒的Copenhagen株或其衍生物是優(yōu)選的。在一些實(shí)施方案中，痘病毒對(duì)靶細(xì)胞具有較高的毒性或治療效應(yīng)，而對(duì)于其他的非靶細(xì)胞來說是相對(duì)無毒的，這是通過抗病毒反應(yīng)將非靶細(xì)胞區(qū)分開來。這種病毒可用于在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)痘病毒或異源肽或多肽，從而導(dǎo)致這些細(xì)胞發(fā)生致命性感染。特別需要注意的是對(duì)于非靶細(xì)胞或非靶組織來說，痘病毒是“減毒的”，即該病毒的毒力是減弱的、降低的、下降的、被抑制的或被去除的，包括其介導(dǎo)宿主內(nèi)源性抗病毒反應(yīng)的能力。因此，本發(fā)明涉及包含痘苗病毒的組合物和方法，其中的痘苗病毒經(jīng)過改造，使其可用于處理細(xì)胞或組織，這些細(xì)胞或組織產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)的能力已被消除，而對(duì)于可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗病毒反應(yīng)的正常細(xì)胞或組織來說，這些病毒是無效的。本發(fā)明的方法特別優(yōu)選使用這種痘苗病毒來治療癌細(xì)胞或腫瘤。本發(fā)明的病毒被認(rèn)為是可以溶解腫瘤的并且其安全性得到提高和/或可被正常組織加速清除，其機(jī)制在于與非正常細(xì)胞(如癌細(xì)胞或癌組織)相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞具有產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)的能力(如擁有、產(chǎn)生和/或誘導(dǎo)免疫反應(yīng))。正常細(xì)胞或組織具有這種能力，而癌細(xì)胞或癌組織通常不表達(dá)、或低水平表達(dá)可誘導(dǎo)或參與抗病毒反應(yīng)的細(xì)胞蛋白。這種細(xì)胞蛋白包括干擾素、TNF、趨化因子、細(xì)胞因子以及其他因子。在正常細(xì)胞或組織內(nèi)，激發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)能力下降的減毒病毒可以很容易地被清除；但是在非正常細(xì)胞和/或組織內(nèi)抗病毒反應(yīng)減弱，因此即使是減毒的病毒也不能被有效清除。本發(fā)明某些實(shí)施方案的基礎(chǔ)就是本文所討論的病毒是一種經(jīng)改善的治療方式，如增強(qiáng)其在正常細(xì)胞內(nèi)的安全性、降低其毒性，因此這些病毒對(duì)正常細(xì)胞的影響要小于非正常細(xì)胞。因此，減毒病毒在癌細(xì)胞內(nèi)更易復(fù)制和表達(dá)基因，其中對(duì)干擾素的誘導(dǎo)或反應(yīng)減弱或缺失。本發(fā)明的組合物和方法涉及痘病毒。下面所討論的病毒包含在本發(fā)明的組合物和方法中。雖然許多實(shí)施方案利用的是痘苗病毒，但是其他痘病毒也可以用同樣的方式制備或使用，因此，涉及痘苗病毒的實(shí)施方案也適用于具有相同基因的其他痘病毒或其他病毒。本發(fā)明涉及在其病毒基因組內(nèi)含有一個(gè)或多個(gè)突變的經(jīng)改造的痘苗病毒。突變可通過重組基因工程方法引入到病毒內(nèi)，如隨機(jī)突變或?qū)⒉《局貜?fù)傳代。利用重組基因工程將病毒基因組(或病毒基因組前體)改造的病毒被稱為“重組”病毒。突變可以是一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的缺失或替代。突變可以在基因內(nèi)(包括編碼序列和非編碼序列，如轉(zhuǎn)錄控制序列)，也可以在其他位置。編碼區(qū)的突變可產(chǎn)生具有缺失、插入或替代的同源肽或多肽。核酸突變也可以導(dǎo)致移碼突變從而產(chǎn)生出截短的肽或多肽，或者氨基酸序列發(fā)生改變的肽或多肽。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，痘苗病毒是減毒的，這就需要改造病毒的基因組以使其毒力減弱。突變可影響具有不同功能的多肽。下列類型的多肽中的一種或多種都可以發(fā)生突變1)干擾素調(diào)節(jié)多肽；2)補(bǔ)體控制多肽；3)TNF或趨化因子調(diào)節(jié)多肽；4)絲氨酸蛋白酶抑制因子；5)IL-1β調(diào)節(jié)多肽；6)非感染性EEV形式的多肽；以及7)可抑制感染性病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放的病毒多肽(抗感染性病毒形式的多肽)。另外，痘苗病毒的A41L或C11R(或其他痘病毒的相應(yīng)多肽)也可以發(fā)生突變。每一類多肽都是直接或間接具有特定功能的多肽。該類多肽的突變不是排他性的，因?yàn)橐粋€(gè)多肽可能不僅僅具有一種特定的功能。干擾素調(diào)節(jié)多肽是指具有影響細(xì)胞內(nèi)干擾素誘導(dǎo)或活化通路活性的痘病毒多肽。干擾素參與某些細(xì)胞或生物的抗病毒機(jī)制。痘病毒表達(dá)可抑制這種機(jī)制的干擾素調(diào)節(jié)多肽。特別需要說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應(yīng)。這些多肽可直接或間接調(diào)節(jié)、影響、干擾、抑制、降低、改變或消除干擾素的活性或功能。干擾素α、β和γ是干擾素調(diào)節(jié)多肽的靶位。干擾素調(diào)節(jié)多肽還可以細(xì)分為可特異性結(jié)合干擾素的多肽；這種多肽可被稱為干擾素結(jié)合多肽。B18R是一種可溶性的痘苗病毒多肽，是一種干擾素結(jié)合多肽，尤其可與IFNα/β特異性結(jié)合。B8R是可與干擾素γ特異性結(jié)合的另外一種痘苗病毒多肽。干擾素調(diào)節(jié)多肽包括而不限于B18R，在其他病毒株、如痘苗病毒的Copenhagen株中被稱為B19R，痘苗病毒的B8R，B13R，vC12L，A53R和E3L，以及具有相似活性或特征的其他病毒多肽。干擾素調(diào)節(jié)多肽還可以非排他性地分為優(yōu)先調(diào)節(jié)IFNα和/或β通路的一類(包括痘苗病毒的B18R、B8R、B13R和vC12L)和調(diào)節(jié)IFNγ通路的一類(包括痘苗病毒的B8R、B13R和vC12L)。任何具有免疫抑制功能的其他多肽也包括在內(nèi)。補(bǔ)體控制多肽是指參與抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和/或病毒滅活的痘病毒多肽。病毒病原的清除機(jī)制包括殺傷被感染的細(xì)胞或者通過補(bǔ)體依賴的機(jī)制滅活宿主內(nèi)的病毒顆粒。特別需要說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應(yīng)。這些多肽可直接或間接調(diào)節(jié)、影響、干擾、抑制、降低、改變或消除補(bǔ)體的活性或功能。補(bǔ)體控制多肽包括而不限于痘苗病毒的VCP，也被稱為C3L或C21L，以及具有該特性或功能的其他多肽(術(shù)語“功能”和“活性”可互換)。TNF調(diào)節(jié)多肽是指具有影響細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)活性的痘病毒多肽，這些免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)可通過TNF受體滅活。這種反應(yīng)包括誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。痘病毒表達(dá)這些TNF調(diào)節(jié)多肽作為中和TNF介導(dǎo)的病毒清除和/或病毒感染細(xì)胞清除的方式。這些多肽具有特異性結(jié)合及抑制細(xì)胞外TNF的功能，從而抑制病毒的清除。需要特別說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應(yīng)。這些TNF調(diào)節(jié)多肽可直接或間接調(diào)節(jié)、影響、干擾、抑制、降低、改變或消除該機(jī)制的活性或功能。因此可使病毒的感染繼續(xù)進(jìn)行、病毒的毒力增強(qiáng)。TNF調(diào)節(jié)多肽包括而不限于痘苗病毒的A53R和B28R以及具有相似活性或特性的其他多肽。絲氨酸蛋白酶抑制因子(SPI)是指能抑制絲氨酸蛋白酶的痘病毒多肽。這種多肽被稱為serpins。這些多肽可通過其SPI活性抑制調(diào)亡誘導(dǎo)分子引起的調(diào)亡，因此即使在存在抗病毒調(diào)亡誘導(dǎo)細(xì)胞因子、fas、粒酶或其他調(diào)亡刺激因子的情況下也允許病毒復(fù)制。SPI包括而不限于痘苗病毒的B13R和B22R以及具有相似活性或特性的其他多肽。IL-1β調(diào)節(jié)因子是指能直接或間接影響IL-1激發(fā)的抗病毒反應(yīng)的痘病毒多肽。IL-1可直接作用于B細(xì)胞，促使其增殖和合成免疫球蛋白。IL-1還可以作為一種啟動(dòng)因子使B細(xì)胞對(duì)IL-5產(chǎn)生反應(yīng)。IL-1可刺激NK細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖和活化。IL-18調(diào)節(jié)因子是指能直接或間接影響IL-18激發(fā)的抗病毒反應(yīng)的痘病毒多肽。IL-18可誘導(dǎo)IFNγ和/或誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化。這些IL-1β或IL-18調(diào)節(jié)因子可直接或間接調(diào)節(jié)、影響、干擾、抑制、降低、改變或消除該機(jī)制的活性或功能。需要特別說明的是這些調(diào)節(jié)多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應(yīng)。IL-1β調(diào)節(jié)多肽包括而不限于痘苗病毒的B13R和B15R以及具有相似活性或特性的其他多肽。需要說明的是突變的其他IL-1調(diào)節(jié)因子也是本發(fā)明的一部分。IL-18調(diào)節(jié)因子包括而不限于vC12L和其他多肽。抑制感染性病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放的病毒多肽、抗感染性EEV形式的多肽是指直接使感染性EEV形式的痘苗病毒不產(chǎn)生的病毒多肽。例如，約束或抑制EEV形式從細(xì)胞膜釋放的多肽是抑制抗感染性EEV形式的多肽。參與調(diào)節(jié)病毒EEV形式的多肽包括而不限于痘苗病毒的A34R和B5R以及可影響痘病毒EEV形式形成的各種其他蛋白質(zhì)。A34R上的密碼子151突變使賴氨酸替換成天冬氨酸(K151D突變)的突變可使A34R蛋白抑制EEV形式的病毒到達(dá)細(xì)胞膜的能力下降。本發(fā)明痘病毒內(nèi)的其他突變包括編碼C11R、病毒EGF樣蛋白、A41L、B7R、N1L和/或vCKBP的基因上的突變，這些蛋白可能具有趨化因子結(jié)合活性(美國(guó)專利5,871,740和Seet等，2001，本文已納入作為參考)。對(duì)于vCKBP的描述見美國(guó)專利5,871,740和Seet等，2001，本文都已納入作為參考。另外需要說明的是，本發(fā)明的病毒還可以具有病毒基因組的缺失突變以便于插入異源核酸序列。這些缺失突變可以發(fā)生在非必須區(qū)，或者與輔助病毒或宿主細(xì)胞互補(bǔ)的必須區(qū)。在某些實(shí)施方案中，痘病毒、特別是痘苗病毒在編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的第一基因上至少包含一個(gè)突變從而產(chǎn)生出至少缺乏第一干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒。在其他的實(shí)施方案中，突變發(fā)生在編碼可直接結(jié)合干擾素的干擾素調(diào)節(jié)蛋白的基因上。需要說明的使干擾素結(jié)合多肽可以是B8R和/或B18R。其他比較常見的類型也可以應(yīng)用。突變也可以發(fā)生在下列一種或多種多肽上1)抑制免疫反應(yīng)組分的分泌型病毒因子(如TNF和其他細(xì)胞因子；趨化因子，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)蛋白；干擾素α/β和γ；白細(xì)胞介素如IL-1和IL18；A41L；N1L；vC12L和C11R)；2)可抑制調(diào)亡的細(xì)胞內(nèi)病毒因子(如絲氨酸蛋白酶抑制因子)和/或抑制免疫活化的細(xì)胞內(nèi)病毒因子(如B13R、B22R和B7R)；以及3)可抑制感染性病毒從細(xì)胞內(nèi)釋放的病毒多肽。這些種類的突變是非排他性的，因?yàn)橐环N蛋白可能不僅僅具有一種特定的功能。在整個(gè)申請(qǐng)文件中術(shù)語“缺乏X功能的病毒”是指該病毒至少缺乏蛋白質(zhì)X的一種功能。如果蛋白質(zhì)X在正常情況下具有兩種功能，那么缺乏X功能的病毒就是指該病毒至少缺乏多肽X的兩種功能之一。功能的缺失可通過各種方式達(dá)到，其中包括編碼多肽X的核酸、或者參與其表達(dá)的核酸區(qū)相對(duì)于具有功能性多肽X的病毒來說是突變的。另外，這個(gè)術(shù)語并不意味著該病毒缺乏所有的X功能，但是在其基因組內(nèi)有突變從而使多肽所具有的X功能1)不再表達(dá)或者2)對(duì)于功能X來說不再具有活性(多肽仍可以具有其他的完整功能)。本發(fā)明的痘苗病毒(或其他痘病毒)在下列7類基因中的一類或多類基因中可以具有修飾或突變1)編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的基因(包括而不限于B8R、B18R、B13R、E3L和/或vC12L)，這些基因上的突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種干擾素調(diào)節(jié)功能；2)編碼補(bǔ)體控制多肽的基因(包括而不限于VCP)，該基因的突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)功能；3)編碼TNF調(diào)節(jié)多肽的基因(包括而不限于A53R和B28R)，這些基因的突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種TNF調(diào)節(jié)功能；4)編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因(包括而不限于B13R、B22R和/或K2L)，這些基因的突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種絲氨酸蛋白酶抑制因子的功能；5)編碼IL-1β調(diào)節(jié)多肽的基因(包括而不限于B15R)，這些基因的突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種IL-1β調(diào)節(jié)多肽的功能；6)編碼多肽的基因(包括而不限于B5R和/或A34R)，這些基因的突變可導(dǎo)致感染性EEV形式的痘苗病毒增多；或7)C11R、vCKBP、B7R、N1L和/或A41L。本發(fā)明的其他痘苗病毒也可以發(fā)生突變使病毒缺乏vC12LIL-18調(diào)節(jié)功能。另外，這種病毒還可以在上述7類基因的任何一類上發(fā)生突變。需要說明的是本發(fā)明的病毒可在一類多肽的不止一個(gè)基因上發(fā)生突變，因此，病毒基因組可在同一類多肽上發(fā)生1、2、3、4、5或更多個(gè)多肽的突變而使其缺乏該類多肽的功能。需要進(jìn)一步說明的是，本發(fā)明的病毒也可在不止一類多肽上發(fā)生突變。因此，病毒基因組可在編碼1、2、3、4、5、6、7或8類多肽的基因上發(fā)生突變從而使病毒缺乏編碼多肽的相應(yīng)功能。另外，本發(fā)明的病毒可在同一類多肽及不同類多肽的多個(gè)基因上發(fā)生突變。本申請(qǐng)中上面所討論的基因及其編碼多肽是突變的優(yōu)選靶位，通過這些突變可使本發(fā)明的痘苗病毒缺乏那些特定的多肽及相應(yīng)的功能。而且，有關(guān)痘苗病毒的任何突變不需要額外的試驗(yàn)就可以用于其他痘病毒?？梢员煌蛔兓蛘呖梢允蛊渲辽僖环N功能喪失的特異性痘病毒多肽包括而不限于A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L及vCKBP。因此，本發(fā)明的痘病毒可在編碼這些相應(yīng)的痘苗病毒多肽的基因中的一個(gè)或多個(gè)上引入突變。在本發(fā)明的痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使A34R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使A41LR的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使A53R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B5R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B7R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B8R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B13R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B15R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B18R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B22R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B28R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使B29R(也被稱為C23L)的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使C11R的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使E3L的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使K2L的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、N1L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使N1L的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、vC12L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使vC12L的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L和/或vCKBP。在本發(fā)明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使vCKBP的至少一個(gè)功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)多肽的至少一個(gè)功能喪失的突變A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L和/或vC12L。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，Copenhagen株或WesternReserve病毒株被突變以制備本發(fā)明的痘苗病毒。這些病毒株還可以在上述7類多肽的一類或多類上被進(jìn)一步突變。本發(fā)明的痘苗病毒還可以包含缺乏B8R、B18R、B13R或vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏B8R干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏B13R干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏B8R和B13R干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏B8R、B13R和vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能并且還缺乏B28或A53R干擾素調(diào)節(jié)功能或者二者都缺乏的病毒；缺乏B8R、B13R和vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能并且還缺乏B18R干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏B8R、B13R、B18R和vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能并且還缺乏B28和/或A53R干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏至少一種干擾素調(diào)節(jié)功能和VCP補(bǔ)體調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏至少一種干擾素調(diào)節(jié)功能和A53R、B28R和/或vCKBPTNF調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏至少一種干擾素調(diào)節(jié)功能和B13R、B22R和/或K2L絲氨酸蛋白酶功能的病毒；缺乏至少一種干擾素調(diào)節(jié)功能和B13R和/或B15RIL-1β調(diào)節(jié)功能的病毒；缺乏至少一種干擾素調(diào)節(jié)功能和包含A34R或B5R的突變使感染性EEV形式的痘苗病毒產(chǎn)率提高的病毒；缺乏C11R、vCKBP、B7R、N1L和/或A41L功能的病毒；或者缺乏上述功能的任意組合的病毒。其他的痘苗病毒具有導(dǎo)致病毒缺乏vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能的突變。這種病毒還可以包含上述7類多肽中一類或多類多肽上發(fā)生的突變。在某些實(shí)施方案中，病毒缺乏B8R、B13R和/或B18R功能，而在另一些實(shí)施方案中，病毒還可以缺乏B15RIL-1β調(diào)節(jié)功能，和/或上述的其他任意功能，如vCKBP和/或B13R和/或B29RTNF調(diào)節(jié)功能。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，痘病毒用于注射給生物體，其中病毒包含在藥用組合物中。本發(fā)明的組合物還包含干擾素(α、β和/或γ)和/或抗腫瘤藥物，如抗體、化療多肽或編碼治療性腫瘤多肽的核酸。本發(fā)明的方法包括使用本文所述的任意痘病毒。許多實(shí)施方案涉及通過給予癌細(xì)胞或癌癥患者以有效量的痘苗病毒來治療癌細(xì)胞或癌癥患者。在某些實(shí)施方案中，痘苗病毒不能表達(dá)如下多肽中的至少一種a)功能性第一干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)功能性補(bǔ)體控制多肽；c)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；f)功能性非感染性EEV形式的多肽；g)功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽。需要特別注意的是那些缺乏a)-g)功能性多肽中一種以上多肽的病毒?！肮δ苄远嚯摹笔侵妇哂刑囟üδ艿亩嚯?；例如，缺乏功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽的病毒是指基因組被修飾從而使病毒缺乏干擾素調(diào)節(jié)功能的病毒(與此相對(duì)的是缺乏所有干擾素調(diào)節(jié)多肽的所有干擾素調(diào)節(jié)功能)。病毒可以包含突變以表達(dá)突變的多肽，但是所得到的多肽是突變的因而不再具有野生型的功能。在本發(fā)明的某些方法中，癌細(xì)胞就是腫瘤細(xì)胞。另外，本發(fā)明的組合物可在體外或體內(nèi)給予細(xì)胞。因此，癌細(xì)胞可位于腫瘤患者體內(nèi)?；颊呖梢允菍?shí)體瘤患者。在這種情況下，實(shí)施方案還可以包括對(duì)患者實(shí)施手術(shù)，如切除部分或全部腫瘤。病毒組合物可在手術(shù)前、手術(shù)后或手術(shù)的同時(shí)給予患者。在另外的實(shí)施方案中，患者還可以被直接注射、內(nèi)窺鏡注射、氣管內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、靜脈注射、損傷部位注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、區(qū)域注射、經(jīng)皮注射、局部注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、膀胱內(nèi)注射或皮下注射。病毒組合物可注射1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次，可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)注射一次，或者每1、2、3、4、5、6、7天注射一次，或者每1、2、3、4、5周注射一次；或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月注射一次。治療癌癥的方法還可以包括對(duì)患者實(shí)施化療或放療，并且可以實(shí)施多次?；熕幬锇ǘ幌抻陧樸K(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、泰索帝、紫杉醇、反鉑(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、氨甲蝶呤、吉西他濱、奧沙利鉑、依立替康、托泊替康或上述藥物的類似物或衍生物。放療包括而不限于X射線照射、紫外線照射、γ-照射、電子束輻射或微波。另外，細(xì)胞或患者可注射蛋白酶或肽酶以提高細(xì)胞產(chǎn)生感染性EEV形式的病毒的能力。肽酶或蛋白酶可以包含在含病毒的藥用組合物中。另外，還可以給予細(xì)胞或患者微管穩(wěn)定劑，其中包括而不限于紫杉烷，這也是本發(fā)明方法的一部分。需要特別說明的是本文所討論的任何痘病毒或經(jīng)修飾的痘病毒，包括WesternReserve和Copenhagen痘苗病毒株(以及其衍生物)都可以聯(lián)合使用。例如，Copenhagen痘苗病毒株可與紫杉醇聯(lián)合使用以獲得對(duì)癌細(xì)胞或癌癥患者的治療效果。在某些實(shí)施方案中，給予病毒組合物的癌細(xì)胞可以是膀胱、血液、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食管、胃腸道、頭、腎、肝、肺、鼻咽、宮頸、卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮細(xì)胞。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，減毒的痘苗病毒還可以包含編碼異源治療多肽的核酸序列。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，異源治療多肽可以是腫瘤抑制因子、免疫調(diào)節(jié)因子、血管生成抑制劑、抗血管多肽、細(xì)胞毒性多肽、調(diào)亡誘導(dǎo)因子、藥物前體活化酶或細(xì)胞增殖抑制多肽。本發(fā)明的方法可以包括使用減毒痘苗病毒的IHD-J株或包含A34R的K151D突變的減毒痘苗病毒。另外，為了制備對(duì)補(bǔ)體或補(bǔ)體級(jí)聯(lián)損傷耐受性更高的痘苗病毒，可以從過量表達(dá)至少一種人補(bǔ)體抑制蛋白的細(xì)胞系內(nèi)制備病毒。補(bǔ)體抑制蛋白可以是CD55、CD46或CD59。在某些特殊實(shí)施方案中包含治療患者癌癥的方法，該方法包括給予患者有效量的藥用組合物，其中含有重組痘苗病毒，該病毒內(nèi)編碼B8R、B18R或vC12L的基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致該病毒缺乏B8R、B18R或vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能?！坝行Я俊钡乃幱媒M合物一般定義為足以達(dá)到可檢測(cè)的及可重復(fù)的改善、減輕、緩解或限制疾病，如癌或其癥狀的藥物量。含102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1016、1016、1017、1018、1019、1020、1025或更多病毒顆粒或pfu的組合物可以分1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次注射給患者。需要進(jìn)一步說明的是減毒痘苗病毒缺乏B8R、B18R或vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能，并且在編碼B13R的基因上擁有突變，這樣就會(huì)使病毒缺乏B13R干擾素調(diào)節(jié)功能。在其他的實(shí)施方案中，減毒痘苗病毒缺乏B8R、vC12L和B13R干擾素調(diào)節(jié)功能，而在其他的實(shí)施方案中病毒缺乏B8R、B18R或vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能中的至少兩種。需要特別注意的是減毒痘苗病毒缺乏B8R、B18R和vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能。另外，缺乏B8R、B18R或vC12L干擾素調(diào)節(jié)功能的重組痘苗病毒還可以缺少下列功能中的至少一種a)補(bǔ)體控制多肽功能；b)TNF-調(diào)節(jié)功能；c)絲氨酸蛋白酶抑制因子功能；d)IL-1β調(diào)節(jié)因子功能；e)抗感染性EEV形成功能；或者f)A41L、B7R、N1L和/或vCKBP趨化因子調(diào)節(jié)功能或C11REGF樣功能。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括通過使癌細(xì)胞與減毒痘苗病毒接觸從而殺傷癌細(xì)胞的方法，其中減毒痘苗病毒包含突變，該突變可使病毒抑制干擾素、趨化因子、細(xì)胞因子、補(bǔ)體或中和抗體介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的能力下降。某些實(shí)施方案包括在編碼B8R、B13R、B18R或vC12L的核酸序列上具有突變的減毒痘苗病毒。需要進(jìn)一步說明的是這些病毒可以缺乏上述自然段中所討論的a)-f)中的一種或多種功能。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中包含治療癌癥患者腫瘤的方法，該方法包括將治療有效量的含減毒痘苗病毒和增強(qiáng)減毒痘苗病毒抗腫瘤活性藥物的組合物與腫瘤接觸，從而有效地治療腫瘤。可以增強(qiáng)減毒痘苗病毒抗腫瘤活性的藥物可以是干擾素、蛋白酶、肽酶、微管穩(wěn)定劑、化療、放療、基因治療、免疫治療或免疫調(diào)節(jié)治療。除了治療方法外，本發(fā)明還涉及制備增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒的方法，該方法包括a)用痘苗病毒感染過量表達(dá)補(bǔ)體抑制蛋白的人細(xì)胞系；b)從感染細(xì)胞內(nèi)分離EEV形式的痘苗病毒。“增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒”是指比野生型痘苗病毒的EEV形式具有更強(qiáng)的或更高的耐受病毒降解機(jī)制能力的EEV形式的痘苗病毒。在某些方法中，痘苗病毒在編碼A34R的基因上具有突變。在某些情況下，突變可導(dǎo)致K151D突變。其他的實(shí)施方案包含補(bǔ)體抑制蛋白CD55、CD46或CD59。還有一些實(shí)施方案的人細(xì)胞系過量表達(dá)不止一種補(bǔ)體抑制蛋白。除了方法以外，通過制備增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒的方法而得到的組合物也是本發(fā)明的一部分。至少包含10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒的組合物都包括在本發(fā)明中。同樣，本發(fā)明還涉及制備增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒所用的人源細(xì)胞系。這種細(xì)胞系可被痘苗病毒感染、含有痘苗病毒或痘苗病毒表達(dá)構(gòu)建體，過量表達(dá)至少一種補(bǔ)體抑制多肽。補(bǔ)體抑制多肽可以是CD55、CD46或CD59。宿主細(xì)胞可被至少缺乏下列一種功能的痘苗病毒感染a)干擾素調(diào)節(jié)功能；b)補(bǔ)體控制多肽功能；c)TNF-調(diào)節(jié)功能；d)絲氨酸蛋白抑制因子功能；e)IL-1β調(diào)節(jié)因子功能；f)功能性抗感染的EEV形式的多肽；或g)功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽。本發(fā)明的其他方法包括治療精微的殘存腫瘤的方法，該方法包括i)確定患者具有可切除的腫瘤；(ii)切除腫瘤；以及(iii)使腫瘤床(tumerbed)與痘苗病毒接觸，這些痘苗病毒在編碼下列多肽的基因上至少擁有一個(gè)突變A34R、A411、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP。其他方法包括治療攜帶腫瘤的患者，該方法包括(i)手術(shù)暴露腫瘤；以及(ii)使所述的腫瘤與缺乏A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L和/或vCKBP功能的減毒痘苗病毒接觸。在其他的實(shí)施方案中，治療荷瘤患者的方法包括在一段時(shí)期內(nèi)用減毒痘苗病毒灌注腫瘤。而在另外一些實(shí)施方案中，涉及抑制荷瘤患者的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括給予患者減毒痘苗病毒，從而在患者體內(nèi)達(dá)到治療效果。整個(gè)申請(qǐng)中所用的術(shù)語“治療效果”是指通過治療可使患者的健康狀況改善或增強(qiáng)的情況，其中包括癌前病變和癌癥的治療。這些效果的非窮盡性例子包括延長(zhǎng)患者一定時(shí)間的生存期、降低或延緩疾病的惡性進(jìn)展、腫瘤縮小、轉(zhuǎn)移延遲、癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的增殖速度降低以及由疾病所造成的疼痛減輕。本發(fā)明的其他方面涉及治療患者多藥耐藥腫瘤的方法，該方法包括i)給予患者減毒的痘苗病毒以及ii)對(duì)患者進(jìn)行化療或放療，從而在患者體內(nèi)產(chǎn)生療效。另外，還涉及使患者體內(nèi)無法手術(shù)切除的腫瘤變成可切除的腫瘤的方法，該方法包括給予患者有效量的減毒痘苗病毒，然后切除部分或全部腫瘤。另外，本發(fā)明還涉及治療對(duì)化療或放療耐受的腫瘤患者的方法，該方法包括給予患者減毒痘苗病毒并對(duì)患者進(jìn)行化療或放療。需要特別說明的是上述有關(guān)特殊方法或組合物的任一實(shí)施方案也可以通過本發(fā)明的其他方法和組合物來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)單詞“一個(gè)”或“一種”與權(quán)利要求和/或說明書中的術(shù)語“包含”合用時(shí)是指“一個(gè)”，但是也可以指“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或一個(gè)以上”。本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳細(xì)描述可以變得更加明晰。但是應(yīng)當(dāng)理解的是詳細(xì)描述和闡述本發(fā)明特殊實(shí)施方案的特殊實(shí)施例只是以說明的方式提供，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)這些詳細(xì)描述可以很容易地理解包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。附圖簡(jiǎn)述下面的附圖是本說明書的一部分，可用于進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)再結(jié)合本文對(duì)特殊實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1A和1B舉例說明了痘苗病毒株在(圖1A)A2780人卵巢癌細(xì)胞系和(圖1B)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞系內(nèi)的復(fù)制情況(x-軸是病毒株，y-代表噬菌斑形成單位/ml+/-S.E.)。圖2舉例說明了痘苗病毒株在正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)內(nèi)的復(fù)制情況(x-軸代表病毒株，y軸代表噬菌斑形成單位/ml+/-S.E.)。圖3舉例說明了痘苗病毒株在癌細(xì)胞(A2780)和正常細(xì)胞(NHBE)內(nèi)的爆發(fā)比例(爆發(fā)比例)(x軸代表病毒株，y代表爆發(fā)比例)。圖4舉例說明了痘苗病毒株在癌細(xì)胞(HCT116)和正常細(xì)胞(NHBE)內(nèi)的爆發(fā)比例(爆發(fā)比例)(x軸代表病毒株，y代表爆發(fā)比例)。爆發(fā)比例是指腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PFU與正常細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PFU之比。圖5A和5B顯示的是圖6、7、8、9中的數(shù)據(jù)所進(jìn)行的典型等效線圖解法分析結(jié)果，表明痘苗病毒(Copenhagen株)和紫杉醇在HCT116(圖5B)和LNCaP(圖5A)細(xì)胞系內(nèi)有協(xié)同作用。圖6顯示的是利用紫杉醇和痘苗病毒聯(lián)合治療后所進(jìn)行的典型MTS分析所得到HCT116細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。圖7顯示的是利用紫杉醇和痘苗病毒聯(lián)合治療后所進(jìn)行的典型MTS分析所得到HCT116細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。圖8顯示的是利用紫杉醇和痘苗病毒聯(lián)合治療后所進(jìn)行的典型MTS分析所得到LNCaP細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。圖9顯示的是利用紫杉醇和痘苗病毒聯(lián)合治療后所進(jìn)行的典型MTS分析所得到LNCaP細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。圖10說明了一個(gè)典型試驗(yàn)，其中IFN耐藥的和IFN敏感的細(xì)胞用WR或WR-B18R(-)處理+/-IFN處理(感染后5小時(shí)用IFNα處理)。說明性實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及用于治療癌癥的瘤溶解痘病毒。痘病毒經(jīng)過改造使其可以更好地或更有效地殺傷癌細(xì)胞和/或?qū)Ψ前┘?xì)胞的毒性更低或損傷更小。更具體地說，痘病毒可以被突變以修飾其基因產(chǎn)物，使其可以更好地感染宿主和癌細(xì)胞。I.痘病毒在正常情況下病毒可被免疫調(diào)節(jié)分子如干擾素(-α、-β、-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF)滅活、抑制或清除(Moss、1996)。病毒感染后宿主組織和炎癥/免疫細(xì)胞通?？煞置谶@些分子。這些分子具有直接的抗病毒效應(yīng)，和/或通過補(bǔ)充和/活化炎癥細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生間接的效應(yīng)。由于這些免疫清除機(jī)制的重要性，因此病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)抑制這些細(xì)胞因子/趨化因子和干擾素誘導(dǎo)和/或功能的基因產(chǎn)物。例如，痘苗病毒(VV；以及其他一些痘病毒)可編碼結(jié)合并抑制CC趨化因子(如RANTES，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，MIP-1-α)的分泌蛋白vCKBP(B29R)(Alcami等，1998)。某些VV病毒株還可以表達(dá)可結(jié)合并滅活TNF的分泌型病毒蛋白(如ListerA53R)(Alcami等，1999)。大多數(shù)痘病毒株具有編碼結(jié)合并抑制干擾素α/β(如B18R)或干擾素-γ(B8R)的分泌蛋白的基因。vC12L是一種IL-18結(jié)合蛋白，可抑制IL-18誘導(dǎo)IFN-γ分泌和NK細(xì)胞/細(xì)胞毒T細(xì)胞活化。大多數(shù)痘病毒的毒力研究都是在小鼠體內(nèi)進(jìn)行的。這些蛋白中的許多，但不是全部(如B18R在小鼠體內(nèi)是無活性的)在小鼠體內(nèi)是有活性的。當(dāng)這些蛋白具有抗鼠靶細(xì)胞因子的活性時(shí)，這些基因的缺失將導(dǎo)致其毒力減弱、安全性提高，產(chǎn)生出這些基因缺失或功能突變的VV突變株。另外，對(duì)這些突變株的炎癥反應(yīng)/免疫反應(yīng)及對(duì)這些突變株的清除通常要比表達(dá)抑制蛋白的親本病毒株高。例如，痘病毒分泌蛋白的T1/35kDa家族(趨化因子結(jié)合/抑制蛋白)的缺失可導(dǎo)致侵潤(rùn)到病毒感染組織內(nèi)的白細(xì)胞顯著增加(Graham等，1997)。VV內(nèi)vC12L基因的缺失可導(dǎo)致病毒在接種到小鼠鼻內(nèi)后的滴度/毒性下降；另外，NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性隨IFN-γ的誘導(dǎo)而升高(Smith等，2000)。粘液瘤病毒T7基因(可結(jié)合IFN-γ和多種趨化因子)的缺失可導(dǎo)致病毒毒力下降，毒性模型內(nèi)的組織炎癥/侵潤(rùn)顯著增高(Upton等，1992；Mossman等，1996)。粘液瘤病毒M-T2基因的缺失也可以導(dǎo)致病毒在兔模型內(nèi)的毒力下降(Upton等1991)。B18R抗干擾素-α/-β基因產(chǎn)物的缺失也可以導(dǎo)致病毒對(duì)IFN介導(dǎo)的清除的敏感性升高，在正常組織內(nèi)的滴度降低、毒力下降(Symons等，1995；Colamonici等，1995；Alcami等，2000)。總之，這些病毒基因產(chǎn)物具有降低抗病毒免疫反應(yīng)和減少炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)到病毒感染組織內(nèi)的功能。通過缺失/突變使蛋白功能喪失可導(dǎo)致病毒在宿主組織內(nèi)的毒力降低和/或原炎癥特性升高。細(xì)胞因子和趨化因子具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性效應(yīng)(Vicari等，2002；Homey等，2002)。這些效應(yīng)可直接作用于腫瘤細(xì)胞(如TNF)，或者通過對(duì)非腫瘤細(xì)胞的作用間接發(fā)揮效應(yīng)。后者的例子是TNF，它是通過對(duì)腫瘤相關(guān)血管的毒性而發(fā)揮抗腫瘤活性的；這樣可導(dǎo)致腫瘤失去血液供應(yīng)而發(fā)生壞死。另外，趨化因子可補(bǔ)充(在某些情況下可活化)免疫效應(yīng)細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞。這些免疫效應(yīng)細(xì)胞可通過多種機(jī)制殺傷腫瘤。這些機(jī)制包括表達(dá)抗腫瘤的細(xì)胞因子(如TNF)，表達(dá)fas配基，表達(dá)穿孔素和粒酶，補(bǔ)充自然殺傷細(xì)胞等。炎癥反應(yīng)最終可誘導(dǎo)出全身的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。最后，許多這些細(xì)胞因子(如TNF)或趨化因子可協(xié)同化療或放療措施來破壞腫瘤。通過全身給予重組的免疫刺激蛋白產(chǎn)生臨床療效是不可行的，因?yàn)?)全身給藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)以及2)刺激局部侵潤(rùn)和抗腫瘤效應(yīng)需要在腫瘤組織內(nèi)的局部表達(dá)。我們需要的是找到方法使這些分子在腫瘤塊內(nèi)達(dá)到局部高濃度，而循環(huán)中的濃度達(dá)到最低。病毒可以經(jīng)改造后使其表達(dá)細(xì)胞因子或趨化因子基因以增強(qiáng)其效應(yīng)。這些基因從復(fù)制選擇性載體中的表達(dá)與從非復(fù)制選擇性載體中的表達(dá)相比具有潛在的優(yōu)勢(shì)。從復(fù)制病毒中的表達(dá)可使其在腫瘤塊內(nèi)達(dá)到局部較高的濃度；另外，復(fù)制病毒有助于通過腫瘤細(xì)胞的破壞/溶解及在原炎癥環(huán)境中釋放腫瘤抗原來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。但是這種方法也有幾個(gè)不足。如果病毒在局部高濃度表達(dá)，攜帶毒性基因的復(fù)制完整型病毒(即使是腫瘤特異性的)就有可能釋放到環(huán)境中，從而引起人們對(duì)其安全性的嚴(yán)重關(guān)注。因而，基因組內(nèi)表達(dá)有強(qiáng)原炎癥基因的病毒可能會(huì)對(duì)患者和公眾產(chǎn)生安全性風(fēng)險(xiǎn)。另外，病毒大小限制了利用病毒如腺病毒來表達(dá)多個(gè)基因和/或大基因；這些分子在聯(lián)合使用時(shí)的效率肯定更高。最后，現(xiàn)在使用的許多瘤溶解病毒表達(dá)抗炎癥蛋白，因此這些病毒將會(huì)在其感染的腫瘤組織內(nèi)誘導(dǎo)出炎癥環(huán)境。結(jié)果會(huì)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)、抗血管效應(yīng)和化療/放療敏感性的誘導(dǎo)。A.痘苗病毒1.干擾素調(diào)節(jié)多肽干擾素-α/-β可通過幾種機(jī)制阻斷病毒的復(fù)制。干擾素-γ直接的病毒抑制效應(yīng)較弱，但是它可以通過幾種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)中和干擾素抗病毒效應(yīng)的分泌型基因產(chǎn)物。例如，痘苗病毒(及其他痘病毒)編碼可分別結(jié)合干擾素-γ和-α/-β的B8R和B18R(Smith等，1997；Symons等，1995；Alcami等，2000)。另外的一種可抑制干擾素產(chǎn)生的痘苗病毒基因產(chǎn)物是caspase-1抑制因子B13R，它可以抑制干擾素-γ-誘導(dǎo)因子IL-18的活化。干擾素調(diào)節(jié)蛋白包括而不限于B18R，在其他的病毒株如痘苗病毒的Copenhagen株中被稱為B19R；B8R；B13R；vC12L；A53R；E3L以及其他具有相似活性或特性的病毒多肽。IFN調(diào)節(jié)多肽還可以非排他性地分為優(yōu)先調(diào)節(jié)IFNα和/或β通路的一類(包括痘苗病毒的B18R、B8R、B13R或vC12L)和調(diào)節(jié)IFNγ通路的一類(包括痘苗病毒的B8R、B13R或vC12L)。癌細(xì)胞通常對(duì)干擾素耐受。多種機(jī)制參與其中。這些機(jī)制包括ras轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化(如ras突變，上游生長(zhǎng)因子受體過量表達(dá)/突變等)，這是癌細(xì)胞的一個(gè)常見特征，會(huì)導(dǎo)致PKR抑制。另外，腫瘤組織內(nèi)的淋巴細(xì)胞通常通過各種機(jī)制被抑制，如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和fas-L。由于淋巴細(xì)胞是干擾素-γ產(chǎn)生的主要來源，因此淋巴細(xì)胞的抑制會(huì)導(dǎo)致腫瘤內(nèi)干擾素-γ的分泌減少。因而干擾素?zé)o法對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生效應(yīng)。另外，干擾素自身具有抗腫瘤效應(yīng)。例如，IFN-γ可增強(qiáng)MHCI類分子相關(guān)抗原的提呈；這將使CTL可以更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。例如，IFN-α/β可阻止腫瘤組織內(nèi)的血管形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。2.補(bǔ)體控制多肽病毒克隆被清除的主要機(jī)制是通過補(bǔ)體依賴的機(jī)制殺傷宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞或肌體內(nèi)的病毒顆粒。被感染的細(xì)胞死亡后就不可能再產(chǎn)生有感染性的病毒了。另外，在調(diào)亡過程中細(xì)胞內(nèi)可釋放降解DNA的酶。這些酶可使病毒DNA降解，使病毒滅活。調(diào)亡可被各種機(jī)制誘導(dǎo)，其中包括活化的補(bǔ)體與補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物的結(jié)合。痘病毒如痘苗病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的病毒和/病毒感染細(xì)胞的清除。因此這些基因可阻止調(diào)亡的發(fā)生，抑制通過補(bǔ)體依賴的機(jī)制清除病毒，因此病毒感染得以進(jìn)行，病毒的毒力升高。例如，痘苗病毒補(bǔ)體控制蛋白(VCP；如C21L)可阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和/或病毒滅活(Isaacs等，1992)。VCP還具有抗炎癥效應(yīng)，因?yàn)樗谋磉_(dá)可使侵潤(rùn)到病毒感染組織內(nèi)的白細(xì)胞減少。補(bǔ)體控制多肽包括而不限于VCP，也被稱為C3L或C21L。癌細(xì)胞通常過量表達(dá)細(xì)胞抗補(bǔ)體蛋白；這將使癌細(xì)胞在受補(bǔ)體攻擊+/-腫瘤特異性抗體時(shí)得以存活(Caragine等，2002；Durrant等，2001；Andoh等，2002)。因此，那些由于其自身對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷具有耐受性的優(yōu)先作用于腫瘤細(xì)胞的藥物對(duì)各種人源腫瘤具有選擇性和較高的活性(Durrant等，2001)。另外，癌細(xì)胞的標(biāo)志之一就是失去了正常的調(diào)亡機(jī)制(Gross等，1999)。對(duì)調(diào)亡的耐受促使其形成腫瘤并且對(duì)抗腫瘤藥物，如免疫治療藥物、化療藥物和放療耐受(Eliopoulos等，1995)。調(diào)亡抑制可由前調(diào)亡分子(如bax)功能的丟失、抗調(diào)亡分子(如bcl-2)表達(dá)水平的增加/功能的增強(qiáng)以及補(bǔ)體敏感性的喪失所介導(dǎo)。3.TNF調(diào)節(jié)多肽在各種病毒顆粒清除機(jī)制中有一種機(jī)制就是通過誘導(dǎo)如上所述的調(diào)亡殺傷宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞。調(diào)亡可由各種機(jī)制所介導(dǎo)，其中包括TNF和淋巴毒素α(LTα)與細(xì)胞TNF受體的結(jié)合，這種結(jié)合可激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF受體被活化后可參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡(Wallach等，1999)。痘病毒的各種病毒株，包括某些痘苗病毒株，經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制TNF介導(dǎo)的病毒和/和病毒感染細(xì)胞的清除。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)通過結(jié)合及隔絕細(xì)胞內(nèi)的TNF來抑制炎癥反應(yīng)和TNF的調(diào)亡誘導(dǎo)活性，結(jié)果導(dǎo)致病毒的清除被抑制。由于病毒不能被清除，因此病毒的感染得以繼續(xù)，病毒的毒力增強(qiáng)。許多痘病毒家族都可以表達(dá)分泌型病毒TNF受體(vTNFR)。例如，有幾種痘病毒可編碼vTNFRs，如粘液瘤病毒(T2蛋白)，牛痘病毒株和痘苗病毒株，如Lister可編碼CrmB、CrmC(A53R)、CrmD、CrmE、B28R蛋白和/或其等價(jià)物。這些vTNFRs具有抑制TNF介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和/或病毒滅活的功能(Saraiva和Alcami，2001)。TNF調(diào)節(jié)蛋白包括而不限于A53R、B28R(這個(gè)蛋白是存在的，但是在痘苗病毒的Copenhagen株中可能是無活性的)以及具有相似活性或特性的其他多肽。癌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志是異常的基因表達(dá)，這可導(dǎo)致其對(duì)多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子機(jī)制的敏感性喪失，如對(duì)TNF抗腫瘤活性的敏感性。因此，對(duì)于病毒在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的傳播來說病毒免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是不需要的。4.絲氨酸蛋白酶抑制劑病毒顆粒被清除的一個(gè)主要機(jī)制是誘導(dǎo)宿主內(nèi)被感染的細(xì)胞調(diào)亡。感染細(xì)胞死亡后就無法繼續(xù)產(chǎn)生有感染性的病毒了。另外，在調(diào)亡過程中細(xì)胞可以釋放出降解DNA的酶。這些酶可降解病毒DNA使病毒滅活。各種機(jī)制都可以誘導(dǎo)調(diào)亡，其中包括細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子)的結(jié)合、細(xì)胞毒T細(xì)胞或fas配基結(jié)合而導(dǎo)致的粒酶表達(dá)；級(jí)聯(lián)活化是常見的調(diào)亡通路的關(guān)鍵部分。病毒經(jīng)進(jìn)化后可表達(dá)基因產(chǎn)物抑制細(xì)胞內(nèi)由某些分子所誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些分子包括fas配基或腫瘤壞死因子(TNF)/TNF相關(guān)分子(如腺病毒的E310.4/14.5、14.7基因(Wold等，1994)；腺病毒的E1B-19kD(Boyd等，1994)；牛痘病毒的crmA；痘苗病毒的B13R)(Dobbelstein等，1996；Kettle等，1997)。這些基因產(chǎn)物可抑制調(diào)亡誘導(dǎo)分子所誘導(dǎo)的調(diào)亡，因此即使存在抗病毒調(diào)亡誘導(dǎo)細(xì)胞因子、fas、粒酶或其他調(diào)亡刺激因子，病毒的復(fù)制也可以進(jìn)行。VVSPI-2/B13R與牛痘病毒CrmA高度同源；SPI-1(VV)與CrmA的同源性較低(Dobbelstein等，1996)。這些蛋白是serpins(絲氨酸蛋白酶抑制劑)，CrmA和SPI-2都具有阻止各種形式的調(diào)亡的功能。例如對(duì)白細(xì)胞介素-1β-轉(zhuǎn)化酶(ICE)和粒酶的抑制可阻止感染細(xì)胞的調(diào)亡。這些蛋白可抑制IL-18的活化進(jìn)而降低IL-18所誘導(dǎo)的IFN-γ釋放。因而IFN-γ對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的免疫刺激效應(yīng)被抑制(Kettle等，1997)。SPIs包括而不限于B13R、B22R以及其他具有相似活性或特性的多肽。癌細(xì)胞的標(biāo)志之一就是失去了正常的調(diào)亡機(jī)制(Gross等，1999)。對(duì)調(diào)亡的耐受促使其形成腫瘤并且對(duì)抗腫瘤藥物，如免疫治療藥物、化療藥物和放療耐受(Eliopoulos等，1995)。調(diào)亡抑制可由前調(diào)亡分子(如bax)功能的丟失、抗調(diào)亡分子(如bcl-2)表達(dá)水平的增加/功能的增強(qiáng)所介導(dǎo)。5.IL-1β-調(diào)節(jié)多肽IL-1β是一種具有局部和全身生物學(xué)活性的因子。已有的研究結(jié)果表明IL-1β和IL-1α之間的功能差異只有幾種。IL-1β的許多生物學(xué)活性是用描述IL-1的許多不同縮寫來描述的。除了在豬細(xì)胞內(nèi)無活性外IL-1無種屬特異性。IL-1的某些生物學(xué)活性是通過誘導(dǎo)其他介質(zhì)的合成來間接介導(dǎo)的，其中包括ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)、PGE2(前列腺素E2)、PF4(血小板因子-4)、CSF(集落刺激因子)、IL-6和IL-8。IL-1的合成可被其他細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，其中包括TNF-α、IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒、絲裂原和抗原。IL-1的主要生物學(xué)活性是刺激T輔助細(xì)胞，該細(xì)胞被誘導(dǎo)后可分泌IL-2并表達(dá)IL-2受體。病毒感染巨噬細(xì)胞后可產(chǎn)生大量的IL-1抑制因子，這些抑制因子支持T細(xì)胞成熟缺陷患者體內(nèi)細(xì)胞的機(jī)會(huì)感染和轉(zhuǎn)化。IL-1可直接作用于B細(xì)胞，促使其增殖并合成免疫球蛋白。IL-1也可以作為啟動(dòng)因子使B細(xì)胞對(duì)IL-5發(fā)生反應(yīng)。IL-1可刺激NK細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖和活化。病毒蛋白阻斷IL-1β的合成是病毒抑制或消除IL-1激發(fā)的系統(tǒng)抗病毒反應(yīng)的一種策略。研究發(fā)現(xiàn)可有效阻斷IL-1功能的結(jié)合蛋白也可由牛痘病毒的基因編碼，這些蛋白的活性與B15R相似。痘苗病毒還可以編碼被稱為B8R的另外一種蛋白，該蛋白的功能類似于細(xì)胞因子的受體(Alcami和Smith，1992；Spriggs等，1992)。IL-1調(diào)節(jié)多肽包括而不限于B13R、B15R以及其他具有相似活性或特性的多肽。癌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志是異常的基因表達(dá)，這可導(dǎo)致其對(duì)多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子機(jī)制的敏感性喪失，如對(duì)IL-1抗腫瘤活性的敏感性。因此，對(duì)于病毒在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的傳播來說病毒免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是不需要的。6.EEV形式病毒傳播到轉(zhuǎn)移瘤部位、甚至固體瘤內(nèi)的效率一般不高(Heise等，1999)。靜脈注射的病毒通常會(huì)被抗體(如腺病毒)(Kay等，1997)和/或補(bǔ)體系統(tǒng)(如HSV)(Ikeda等，1999)清除或滅活。除了這些免疫反應(yīng)介導(dǎo)的機(jī)制之外，這些病毒的生物分布也會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)病毒沉淀在正常組織而不是腫瘤組織內(nèi)。例如，靜脈注射腺病毒主要集中在肝臟和脾臟內(nèi)；只有低于0.1％的病毒可以進(jìn)入腫瘤內(nèi)，即使是免疫缺陷小鼠(Heise等，1999)。因此，雖然在免疫缺陷小鼠腫瘤模型內(nèi)用極高劑量的病毒可以達(dá)到適度的抗腫瘤效果，但是靜脈注射途徑的效率極低，并且對(duì)病毒的效果有嚴(yán)重影響。痘苗病毒可在固體瘤內(nèi)復(fù)制并引起腫瘤的壞死。另外，胸苷激酶缺失突變可使病毒具有感染腫瘤塊和卵巢組織的能力，并且在小鼠腫瘤模型系統(tǒng)內(nèi)可很好地表達(dá)標(biāo)記基因(Gnant等，1999)。但是，由于這些研究一般都是基于5天后標(biāo)記基因表達(dá)的情況來確定腫瘤的變化，因此還不清楚病毒是否可以在腫瘤/卵巢組織內(nèi)良好地沉淀、表達(dá)基因和復(fù)制(Puhlmann等，2000)。無論通過何種機(jī)制，不含其他目的基因的病毒所得到的抗腫瘤效果都是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的(Gnant等，1999)。相反，瘤內(nèi)注射病毒可以得到顯著的抗腫瘤效果(McCart等，2000)。因此，如果提高靜脈注射到腫瘤內(nèi)的病毒量則可以改善靜脈注射的效果。痘苗病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可產(chǎn)生胞內(nèi)病毒(IMV，胞內(nèi)成熟病毒；IEV，胞內(nèi)包裝病毒)和胞外病毒(EEV，胞外包裝病毒；CEV，細(xì)胞相關(guān)的胞外病毒)(Smith等，1998)。野生型痘苗病毒株復(fù)制后所產(chǎn)生的病毒中有約99％的是IMV。該病毒形式在環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，因此是個(gè)體之間傳播的主要形式；但是，該形式的病毒在感染宿主內(nèi)無法有效傳播，因?yàn)椴《緹o法從細(xì)胞內(nèi)有效釋放以及對(duì)補(bǔ)體和/或抗體中和反應(yīng)的敏感性。與此相反的是，EEV可釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，這種形式的病毒一般只占病毒產(chǎn)量的約1％(Smith等，1998)。EEV負(fù)責(zé)病毒在感染宿主內(nèi)的傳播，在宿主外則容易被降解。更重要的是，EEV進(jìn)化出了幾種機(jī)制來避免其在血液內(nèi)被中和。首先，EEV對(duì)補(bǔ)體相對(duì)耐受(Vanderplasschen等，1998)；這一特性歸功于宿主細(xì)胞將補(bǔ)體抑制劑插入到外膜包被內(nèi)以及痘苗病毒可將補(bǔ)體控制蛋白(VCP)分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。其次，EEV與IMV相比對(duì)中和抗體的耐受性相對(duì)要高(Smith等，1997)。EEV還可以在感染后比IMV更早(如4-6小時(shí))釋放(IMV只在細(xì)胞死亡過程中或死亡后釋放)，因此EEV形式的病毒傳播更快(Blasco等，1993)。但是，不幸的是野生型痘苗病毒只能產(chǎn)生極少量的EEV。另外，用痘苗病毒治療(即病毒的輸入劑量)到目前為止只限于細(xì)胞內(nèi)病毒。常規(guī)的痘苗病毒(VV)制備和純化方法都可以導(dǎo)致EEV被滅活(Smith等，1998)，病毒的制備一般用非人源細(xì)胞系；非人源細(xì)胞來源的EEV不能耐受補(bǔ)體介導(dǎo)的清除作用(EEV所產(chǎn)生的補(bǔ)體抑制蛋白具有種屬特異性)。因此，痘苗病毒的療效受IMV形式的病毒對(duì)中和反應(yīng)的相對(duì)敏感性及病毒在實(shí)體瘤組織內(nèi)的傳播效率低下的限制；這種傳播一般是指從一個(gè)細(xì)胞到臨近的細(xì)胞內(nèi)。IMF通過血流或淋巴系統(tǒng)傳播到遠(yuǎn)端腫瘤組織內(nèi)的效率也不高。因此，EEV形式的痘苗病毒天然具有優(yōu)于目前所用形式(IMV)的痘苗病毒的特征；EEV適于在實(shí)體瘤的局部及其臨近或遠(yuǎn)端腫瘤位點(diǎn)內(nèi)快速而有效地傳播。由于EEV對(duì)補(bǔ)體效應(yīng)相對(duì)耐受，因此當(dāng)EEV從同一物種的細(xì)胞內(nèi)制備時(shí)，通過血管內(nèi)注射后該病毒形式在血液中的穩(wěn)定性要比標(biāo)準(zhǔn)方法制備的痘苗病毒(只含IMV)高、并且維持活性的時(shí)間要更長(zhǎng)(Smith等，1998)。由于EEV對(duì)抗體介導(dǎo)的中和反應(yīng)耐受，因此該病毒形式通過血管內(nèi)注射后在血液中維持活性的時(shí)間要比標(biāo)準(zhǔn)方法制備的痘苗病毒(只含IMV)長(zhǎng)(Vanderplasschen等，1998)。這個(gè)特性對(duì)于在中和抗體升高的情況下需要重復(fù)注射時(shí)特別重要；所有被認(rèn)可的抗癌療法都需要重復(fù)注射。因此，痘苗病毒及其他痘病毒的EEV形式能高效地將治療性病毒及其攜帶的基因通過血流轉(zhuǎn)移到腫瘤內(nèi)，與標(biāo)準(zhǔn)的痘病毒制備物相比其系統(tǒng)效應(yīng)會(huì)提高。最后，病毒在大眾中傳播的危險(xiǎn)會(huì)顯著降低，因?yàn)镋EV在體外是很不穩(wěn)定的。參與病毒EEV形式調(diào)節(jié)的多肽包括而不限于A34R、B5R以及可影響痘病毒EEV形式產(chǎn)生的其他各種蛋白。A34R上的密碼子151突變可使賴氨酸殘基變成天冬氨酸殘基(K151D)，這樣A34R蛋白就不能將EEV形式的病毒定位到細(xì)胞膜上。B5R是一種可結(jié)合補(bǔ)體的EEV膜結(jié)合多肽。A34R的完全缺失可導(dǎo)致EEV的釋放增加，但是病毒的感染性會(huì)大大降低，而K151D突變可增加EEV的釋放，同時(shí)也能保持釋放病毒的感染活性。B5R的序列與VCP(抗補(bǔ)體)同源，但是還未發(fā)現(xiàn)它具有補(bǔ)體抑制活性。一種鑒定增強(qiáng)型EEV形式的方法簡(jiǎn)述如下。EEV稀釋到冷MEM中，與含活性血清或熱滅活血清(56℃，30min，對(duì)照)的冷MEM混合(1∶1)(血清的最終稀釋度為1/10、1/20或1/30)。在7℃孵育75分鐘后，樣品在冰上冷卻，將mAb5B4/2F2加到新鮮的EEV樣品中中和所有的污染物(IMV和破裂的EEV)。然后使病毒顆粒與RK13細(xì)胞在冰上結(jié)合1小時(shí)，將補(bǔ)體和未結(jié)合的病毒顆粒洗去，2天后計(jì)數(shù)形成的噬菌斑。噬菌斑的數(shù)量越多說明對(duì)補(bǔ)體的耐受性約高。Vanderplasschen等，PNAS1998；95(13)7544-7549，本文已納入作為參考。描述分離EEV形式的痘苗病毒的經(jīng)典方法參見Blasco等，1992(本文已納入作為參考)。7.其他多肽其他病毒免疫調(diào)節(jié)多肽包括可結(jié)合免疫反應(yīng)的其他介質(zhì)的多肽和/或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)相關(guān)分子通路的多肽。例如，趨化因子結(jié)合多肽如B29R(在痘苗病毒的Copenhagen株中雖然存在該蛋白，但是無活性)、C23L、vCKBP、A41L以及具有相似活性或特性的多肽。其他痘苗病毒蛋白，如痘苗病毒生長(zhǎng)因子(如C11L)是一種病毒EGF樣生長(zhǎng)因子，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中也是修飾的靶位?？杀环Q為病毒免疫調(diào)節(jié)因子的其他多肽包括而不限于B7R、N1L或具有提高痘病毒毒力活性或特征的其他多肽。8.痘苗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，A56R或K2L編碼核酸的修飾、缺失或突變可導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞的融合或VV感染所誘導(dǎo)的syncitia形成。痘苗病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合常常會(huì)增強(qiáng)VV的抗腫瘤效應(yīng)，因?yàn)閂V可在腫瘤內(nèi)傳播。由于細(xì)胞融合而導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)病毒傳播通?？墒共《咎舆^中和抗體和免疫反應(yīng)的攻擊。這些基因中的一個(gè)或兩個(gè)都發(fā)生突變的VV可以更有效地殺傷和感染臨近的未感染細(xì)胞(即“旁觀者效應(yīng)”)，這樣就可以提高病毒的局部抗腫瘤效應(yīng)。B.其他痘病毒痘苗病毒是痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒、正痘病毒屬的一員。正痘病毒屬與脊椎動(dòng)物痘病毒亞科的其他屬相比其成員具有更高的同源性，正痘病毒屬包括11個(gè)不同但是又密切相關(guān)的種，其中有痘苗病毒、天花病毒(天花致病原)、牛痘病毒、水牛痘病毒、猴痘病毒、鼠痘病毒和馬痘病毒以及其他病毒(見Moss，1996)。如本文所描述，本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以延伸到正痘病毒屬以及副痘病毒屬、禽痘病毒屬、羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬軟疣痘病毒屬和亞塔痘病毒屬的其他成員。痘病毒家族的一個(gè)屬通常用血清學(xué)方式來定義，其中包括在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的中和反應(yīng)和交叉反應(yīng)。正痘病毒屬的各個(gè)成員及Chordovirinae亞科的其他成員利用免疫調(diào)節(jié)分子，如本文所描述的那些調(diào)節(jié)分子來抑制宿主的免疫反應(yīng)。因此，本文所描述的發(fā)明并不限于痘苗病毒，而是適用于多種病毒。C.病毒制備痘苗病毒可用Earl和Moss描述的方法制備，參見Ausbel等，《分子生物學(xué)前沿方法》16.15.1-16.18.10頁，本文已納入作為參考。II.蛋白和核酸組合物本發(fā)明涉及適用于研究和治療癌細(xì)胞和癌癥患者的痘病毒。本發(fā)明涉及經(jīng)改造后與野生型相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的痘病毒，尤其是痘苗病毒，這樣的病毒就具有了可用于治療癌細(xì)胞的優(yōu)良特性，并且對(duì)非癌細(xì)胞來說是低毒的或無毒的。下文以實(shí)施例的方式描述了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法和組合物的各種方法。提供了利用重組DNA技術(shù)制備突變病毒的
背景技術(shù)：
。A.蛋白質(zhì)性組合物在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備缺乏一種或多種功能性多肽或蛋白的方法和/或制備能更好釋放的特殊形式病毒，如具有感染性的EEV形式病毒的方法。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及痘病毒以及和作為藥用制劑一部分的蛋白質(zhì)性組合物聯(lián)合使用。本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”是指至少含一個(gè)氨基酸殘基的分子。在某些實(shí)施方案中使用的是野生型的蛋白質(zhì)或多肽，而在本發(fā)明的多數(shù)實(shí)施方案中，病毒蛋白或多肽是缺失的或者是經(jīng)過修飾的，這樣就可以使病毒更適用于治療癌細(xì)胞或癌癥患者。上述術(shù)語在本文中可以交互使用?！靶揎椀鞍住被颉靶揎椂嚯摹笔侵富瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型蛋白或多肽發(fā)生改變的蛋白或多肽。在某些實(shí)施方案中，修飾蛋白或多肽至少具有一個(gè)改變的活性或功能(假設(shè)蛋白或多肽有多種活性或功能)。相對(duì)于野生型蛋白或多肽的活性或功能來說，改變的活性或功能可以是以某些其他方式(如特異性)降低、消失、消除、增強(qiáng)、提高或改變的活性或功能。需要特別說明的是修飾蛋白或多肽的一種活性或功能發(fā)生改變但是卻保留了野生型蛋白或多肽的其他活性或功能。另外，修飾蛋白可以是完全失去功能的，或者其編碼核酸序列被改變從而使其根本不再表達(dá)該多肽、因移碼突變而表達(dá)截短的多肽或者表達(dá)不同的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，突變蛋白或多肽的長(zhǎng)度可以包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500或更多個(gè)氨基酸殘基，以及上述數(shù)值之間的任何數(shù)目的氨基酸殘基。需要說明的是多肽可通過截短而發(fā)生突變，使其比相應(yīng)的野生型多肽短。本文所用的術(shù)語“氨基分子”是指任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸類似物，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在某些實(shí)施方案中，蛋白分子的殘基是連續(xù)的，其間無任何非氨基分子將氨基分子殘基的序列中斷。在其他的實(shí)施方案中，序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基分子基序。在一些特殊的實(shí)施方案中，蛋白分子的殘基序列可被一個(gè)或多個(gè)非氨基分子基序中斷。相應(yīng)的，術(shù)語“蛋白質(zhì)性組合物”包含氨基分子序列，該序列內(nèi)至少含有一個(gè)含20個(gè)天然合成蛋白質(zhì)中常見氨基酸的序列，或者至少含有一個(gè)修飾的或不常見的氨基酸。蛋白組合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)制備，其中包括通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然材料中分離蛋白化合物，或者用蛋白材料化學(xué)合成。各種基因的核苷酸和蛋白質(zhì)、多肽和肽序列已經(jīng)被鑒定出來，可在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的電子數(shù)據(jù)庫中找到。一個(gè)這樣的數(shù)據(jù)庫是生物技術(shù)信息基因庫國(guó)家中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation’sGenbank)和GenPept數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。這些已知基因的編碼區(qū)可用本文所描述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他方法擴(kuò)增和/或表達(dá)。1.功能方面當(dāng)本申請(qǐng)?zhí)峒安《镜鞍谆蚨嚯牡墓δ芑蚧钚詴r(shí)，除非特別說明，是指該病毒蛋白或多肽在生理?xiàng)l件下的活性或功能。例如，干擾素調(diào)節(jié)多肽是指可直接或間接影響至少一種干擾素及其活性的多肽。多肽可直接或間接誘導(dǎo)、增強(qiáng)、提高、增加、消除、減弱、降低、抑制或屏蔽干擾素的活性。在某些實(shí)施方案中，直接影響干擾素的例子包括可特異性結(jié)合干擾素的干擾素調(diào)節(jié)多肽。確定哪個(gè)分子具有這種活性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的試驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)。例如，將編碼調(diào)節(jié)干擾素或其突變體的產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)移到可誘導(dǎo)出干擾素活性的細(xì)胞內(nèi)，然后與轉(zhuǎn)移這種基因的細(xì)胞進(jìn)行比較，通過確定其對(duì)干擾素反應(yīng)水平的不同就可以確定哪些分子具有干擾素調(diào)節(jié)功能。需要特別說明的是調(diào)節(jié)因子可以是影響蛋白質(zhì)性組合物表達(dá)的分子，這些蛋白質(zhì)性組合物參與靶分子通路，如通過結(jié)合干擾素編碼的轉(zhuǎn)錄子。確定哪個(gè)分子是干擾素、IL-1β、TNF或其他具有療效的分子的調(diào)節(jié)因子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法實(shí)現(xiàn)，本文中已經(jīng)描述了一些，例如利用天然的和/或重組的病毒蛋白。2.病毒多肽的突變體本發(fā)明的多肽氨基酸序列的改變可以是替代、插入或缺失突變體。與野生型相比，編碼病毒多肽的基因發(fā)生突變可影響1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個(gè)多肽的非連續(xù)或連續(xù)氨基酸。痘苗病毒編碼的各種多肽可通過參考Rosel等，1986，Goebel等，1990和Genbank登錄號(hào)NC_001559來確定，本文都已納入作為參考。缺失突變體缺少天然或野生型蛋白的一個(gè)或多個(gè)殘基。每個(gè)殘基都可以缺失，一個(gè)區(qū)(如催化區(qū)或結(jié)合區(qū))的全部或部分也可以缺失。終止密碼子被引入(通過替代或插入)到核酸編碼序列中時(shí)可產(chǎn)生出截短的蛋白。插入突變一般是指在多肽的非終止點(diǎn)上插入殘基，包括插入一個(gè)免疫原性表位或者僅僅插入一個(gè)或多個(gè)殘基。也可以制備末端添加產(chǎn)物，這被稱為融合蛋白。替代突變體一般是指在蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上將一個(gè)氨基酸替換成另一個(gè)氨基酸，這樣可以使多肽的一個(gè)或多個(gè)特性發(fā)生改變而不會(huì)丟失其他的功能或活性。替代可以是保守替代，即一個(gè)氨基酸用另外一個(gè)具有相似形狀或電荷的氨基酸替代。保守替代是本領(lǐng)域所熟知的，例如其中包括如下交換丙氨酸到絲氨酸；精氨酸到賴氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到絲氨酸；谷胺酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；組氨酸到天冬酰胺或谷胺酰胺；異亮氨酸到亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸到纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；絲氨酸到蘇氨酸；蘇氨酸到絲氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸到異亮氨酸或亮氨酸。另外，替代也可以是非保守的，這樣多肽的功能或活性會(huì)受到影響。非保守的替代一般是指用一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的殘基來替代另一個(gè)殘基，如極性氨基酸或帶電荷的氨基酸替代非極性氨基酸或不帶電荷的氨基酸，反之亦然。術(shù)語“功能等價(jià)的密碼子”用于本文中是指編碼相同氨基酸的密碼子，如編碼精氨酸或絲氨酸的密碼子有6個(gè)，另外也指編碼生物等價(jià)氨基酸的密碼子(見下表1)。表1密碼子列表還應(yīng)當(dāng)理解的是氨基酸和核酸序列還可以包含附加的殘基，如附加的N-或C-末端氨基酸或者5’或3’序列，這在本文所描述的上述序列中是必需的，只要該序列復(fù)合上述標(biāo)準(zhǔn)，包括保持所表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。添加末端序列特別適合于那些包含各種非編碼序列的核酸序列，其中非編碼序列位于編碼區(qū)的5’或3’端，或者那些包含各種內(nèi)部序列，即內(nèi)含子的核酸序列，內(nèi)含子是大家所熟知的包含在基因內(nèi)的序列。下面的討論是基于蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生交換而產(chǎn)生等價(jià)的或者是改進(jìn)的第二代分子。例如，蛋白質(zhì)內(nèi)的某些氨基酸被其他氨基酸所替代，但是蛋白質(zhì)與某些結(jié)構(gòu)，如抗體上的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力并沒有顯著下降。由于蛋白質(zhì)的相互結(jié)合能力和性質(zhì)決定了蛋白質(zhì)的生物功能活性，因此某些氨基酸替代可在蛋白質(zhì)序列內(nèi)或者其DNA編碼序列內(nèi)發(fā)生，但是卻可以產(chǎn)生出具有相似特性的蛋白質(zhì)。因此發(fā)明者認(rèn)為在基因的DNA序列上進(jìn)行的各種改變可以使其生物功能或活性不丟失，如下面所討論的。表1顯示的是編碼特定氨基酸的密碼子。在進(jìn)行這些改變時(shí)，需要考慮氨基酸的水性指數(shù)。氨基酸水性指數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)生物功能的重要性在本領(lǐng)域中是被普遍認(rèn)知的(Kyte和Doolittle，1982)。氨基酸的相對(duì)水性特征可影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而也就決定了蛋白質(zhì)與其他分子，如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。還應(yīng)當(dāng)理解的是在本領(lǐng)域中相似氨基酸的替代可在親水性指數(shù)的基礎(chǔ)上有效進(jìn)行。美國(guó)專利4,554,101闡明一個(gè)蛋白質(zhì)的局部最大平均親水性指數(shù)是由其相鄰的氨基酸所決定的，并且與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)，本文已納入作為參考。如美國(guó)專利4,554,101所詳細(xì)描述的，下列親水性指數(shù)值被賦予了各個(gè)氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷胺酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)理解的是一個(gè)氨基酸被另外一個(gè)具有相似親水性指數(shù)的氨基酸替代后可以得到一個(gè)生物等價(jià)和免疫等價(jià)的蛋白質(zhì)。在這種替代中，親水性指數(shù)值差異在±2之內(nèi)的氨基酸替代是優(yōu)選的，差異在±1之內(nèi)的氨基酸替代是更優(yōu)選的，差異在±0.5之內(nèi)的氨基酸替代是尤其優(yōu)選的。如上面所指出的，氨基酸替代一般都是根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性來進(jìn)行，如其疏水性、親水性、電荷、側(cè)鏈長(zhǎng)度等。考慮了上述各種特征的典型替代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。III.核酸分子A.編碼天然蛋白或修飾蛋白的多核苷酸本發(fā)明涉及可從細(xì)胞中分離的多核苷酸，該多核苷酸可表達(dá)全長(zhǎng)的或部分的蛋白或多肽。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，涉及被特異性突變的病毒基因組，這種突變可使病毒缺乏某些功能性病毒多肽。多核苷酸可編碼含全部或部分病毒氨基酸序列的肽或多肽，這些多核苷酸也可以被改造使之不編碼這種病毒多肽，或者編碼至少有一個(gè)功能或活性降低、消除或缺失的病毒多肽。重組蛋白可從產(chǎn)生活性蛋白的表達(dá)細(xì)胞內(nèi)純化。基因組及痘苗病毒編碼區(qū)的定義見于Rosel等，1986，Goebel等，1990和/或Genbank登錄號(hào)NC_00159，本文都已納入作為參考。本文所用的術(shù)語“DNA節(jié)段”是指從特定物種的基因組DNA中分離出來的游離形式的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA節(jié)段是指含野生型、多態(tài)性或突變多肽編碼序列的DNA節(jié)段，可以從哺乳動(dòng)物或人的基因組總DNA內(nèi)分離或純化。多肽、比多肽短的DNA節(jié)段以及重組載體，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等也包含在術(shù)語“DNA節(jié)段”內(nèi)。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語“痘病毒多核苷酸”是指編碼痘病毒多肽的核酸分子，可從基因組總核酸中分離。同樣，“痘苗病毒多核苷酸”是指編碼痘苗病毒多肽的核酸分子，可從基因組總核酸中分離?！岸徊《净蚪M”或“痘苗病毒基因組”是指在存在或不存在輔助病毒的情況下可使宿主細(xì)胞產(chǎn)出病毒顆粒的核酸分子。與野生型病毒相比，基因組可以是重組突變的，也可以不是。術(shù)語“cDNA”是指以信使RNA(mRNA)為模板制備的DNA。與基因組DNA或基因組非或部分處理的RNA模板來源的DNA多聚物不同的是，利用cDNA的優(yōu)點(diǎn)在于cDNA主要包含相應(yīng)蛋白的編碼序列。有時(shí)也需要使用全部或部分基因組序列，比如要獲得最佳表達(dá)需要非編碼區(qū)時(shí)或者非編碼區(qū)如內(nèi)含子是反義策略的靶位時(shí)。還需要說明的是一個(gè)給定物種的特定多肽可由天然突變體代表，該突變體的核酸序列有些許不同，但是所編碼的蛋白是相同的(見上述表1)。同樣，含游離的或純化的野生型或突變多肽基因的多核苷酸是指包含野生型或突變多肽編碼序列的DNA節(jié)段，在某些情況下也包含調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列是從天然基因或蛋白編碼序列中分離出來的。在這種情況下，術(shù)語“基因”也可以簡(jiǎn)單地指功能蛋白、多肽或肽編碼單位(包括正確轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾或定位所需要的任何序列)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這個(gè)功能術(shù)語包含可表達(dá)或適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白和突變體的基因組序列、cDNA序列和人工基因小片段。編碼全長(zhǎng)的或部分的天然或修飾多肽的核酸含有編碼該多肽的全部或部分的連續(xù)核酸序列，其長(zhǎng)度可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多個(gè)核苷酸、核苷或堿基對(duì)。本發(fā)明的某些特殊實(shí)施方案涉及游離的DNA節(jié)段以及含DNA插入序列的重組載體，其中DNA插入序列編碼野生型或突變的痘病毒多肽或肽，這些多肽或肽的氨基酸序列內(nèi)包含與天然多肽一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。因此，游離的DNA節(jié)段或含DNA節(jié)段的載體可編碼抑制或降低TNF活性的TNF調(diào)節(jié)因子或TNF調(diào)節(jié)多肽。術(shù)語“重組的”可與多肽聯(lián)用或作為特異性多肽的名稱，一般是指在體外經(jīng)改造的核酸分子編碼的多肽或這種分子的復(fù)制產(chǎn)物所編碼多肽。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及游離的DNA節(jié)段以及含DNA插入序列的重組載體，其中DNA插入序列編碼多肽或肽，這些多肽或肽的氨基酸序列內(nèi)包含與多肽一致或基本一致的連續(xù)氨基酸序列。本發(fā)明所用的核酸片段不論其編碼序列的長(zhǎng)度如何都可以和其他的核酸序列連接，如啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)、額外的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼序列等，這樣其全長(zhǎng)的變化就會(huì)相當(dāng)大。因此需要說明的是幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片段都可以使用，但是優(yōu)選的核酸片段長(zhǎng)度受制備方法及其在重組DNA技術(shù)中的用途限制。需要說明的是本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可編碼任何物種的全長(zhǎng)多肽，也可以編碼截短的多肽，如截短的痘苗病毒多肽，這時(shí)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄子代表了截短的版本。截短的轉(zhuǎn)錄子被翻譯成截短的蛋白。另外，核酸序列可編碼帶有其他異源編碼序列的全長(zhǎng)多肽序列，這樣有利于多肽的純化、運(yùn)輸、分泌、轉(zhuǎn)錄后修飾或多肽的療效如靶向性和活性。如上面所討論的，修飾多肽編碼序列可添加上標(biāo)簽或其他異源多肽，其中“異源的”是指與修飾多肽不一樣的多肽。在一個(gè)非限定性例子中，一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體可制備成包含與特定基因，如B18R基因一致或互補(bǔ)的一段連續(xù)核苷酸的構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體可以至少含有20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、500,000、750,000到1,000,000核苷酸，或者更長(zhǎng)的構(gòu)建體，甚至可以達(dá)到和包含染色體的長(zhǎng)度(包括所有的中間長(zhǎng)度和中間范圍)，假設(shè)核酸構(gòu)建體如酵母人工染色體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。很容易理解的是本文所用的“中間長(zhǎng)度”和“中間范圍”是指包含上述數(shù)值或上述數(shù)值之間的任意長(zhǎng)度或范圍(即包含這些數(shù)值和這些數(shù)值之間的所有整數(shù)值)。本發(fā)明所用的DNA節(jié)段包含生物功能等價(jià)的修飾多肽和肽，如修飾的白樹素毒素。這種序列的產(chǎn)生可能是密碼子簡(jiǎn)并性和功能等價(jià)的結(jié)果，已知在天然狀態(tài)下核酸序列及其編碼的蛋白序列都可能發(fā)生。另外，功能等價(jià)的蛋白或肽可利用重組DNA技術(shù)制備，其中可根據(jù)修飾氨基酸的特性人工改變蛋白的結(jié)構(gòu)。通過位點(diǎn)特異性突變技術(shù)可將人為設(shè)計(jì)的改變引入到蛋白序列內(nèi)，如可以提高蛋白質(zhì)的抗原性、降低蛋白質(zhì)對(duì)受體的體內(nèi)毒性效應(yīng)、或提高含蛋白的治療藥物的療效。本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及游離的DNA節(jié)段和序列內(nèi)包含本文所描述的序列(和/或參考文獻(xiàn)所描述的序列)來源的連續(xù)核酸序列的重組載體。但是，這種序列可被突變以制備活性不同于野生型蛋白的蛋白產(chǎn)物。還應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不局限于這些已知序列的特定核酸序列和氨基酸序列。重組載體和游離DNA節(jié)段可以包含不同序列，包括痘病毒編碼區(qū)自身、在基礎(chǔ)編碼區(qū)上具有特定改變或修飾的編碼區(qū)，或者可以編碼包含痘病毒編碼區(qū)在內(nèi)的更長(zhǎng)的多肽、或編碼具有突變氨基酸序列的生物等價(jià)蛋白或肽。本發(fā)明的DNA節(jié)段包含生物等價(jià)的痘病毒蛋白和肽。這種序列的產(chǎn)生可能是密碼子簡(jiǎn)并性和功能等價(jià)的結(jié)果，已知在天然狀態(tài)下核酸序列及其編碼的蛋白序列都可能發(fā)生。另外，功能等價(jià)的蛋白或肽可利用重組DNA技術(shù)制備，其中可根據(jù)修飾氨基酸的特性人工改變蛋白的結(jié)構(gòu)。通過位點(diǎn)特異性突變技術(shù)可將人為設(shè)計(jì)的改變引入到蛋白序列內(nèi)，如可以提高蛋白質(zhì)的抗原性。B.誘導(dǎo)痘病毒多核苷酸發(fā)生突變?cè)诟鞣N實(shí)施方案中，痘病毒多核苷酸都可以被改變或突變。改變或突變包括插入、缺失、點(diǎn)突變、顛換等，結(jié)果可導(dǎo)致某些通路或分子機(jī)制的調(diào)節(jié)、活化和/或滅活，或者改變基因產(chǎn)物的功能、定位或表達(dá)，特別是使基因產(chǎn)物失去功能。編碼全長(zhǎng)或部分痘病毒的多核苷酸的突變可用各種標(biāo)準(zhǔn)的突變方法完成(Sambrook等，1989)。突變是生物的量或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程。突變包括單個(gè)基因的核苷酸序列的修飾、基因或整個(gè)染色體的阻斷。單個(gè)基因的改變可以是點(diǎn)突變的結(jié)果，其中包括DNA序列內(nèi)單個(gè)核苷酸的去除、添加或替代，也可以是插入或缺失多個(gè)核苷酸的結(jié)果。突變可在接觸化學(xué)或物理突變劑后被誘導(dǎo)。這些突變誘導(dǎo)劑包括離子輻射、紫外線和化學(xué)物質(zhì)的不同組合，如烷化劑和多環(huán)芳香烴，這些物質(zhì)都可以直接或間接(一般發(fā)生在經(jīng)代謝生物轉(zhuǎn)化后)與核酸發(fā)生相互作用。當(dāng)被影響的DNA復(fù)制或修飾時(shí)這種誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的DNA損傷可導(dǎo)致堿基序列的改變，從而發(fā)生突變。也可以通過特殊的靶向性方法進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。1.隨機(jī)突變a)插入突變插入突變是指插入一段已知的DNA片段使基因滅活。由于插入了某類DNA片段，因此所產(chǎn)生的突變一般是喪失功能的突變而不是獲得功能的突變。但是，通過插入使DNA片段獲得功能的突變也有幾個(gè)例子。插入突變已在細(xì)菌和果蠅中取得了很大成功(Cooley等，1988)，現(xiàn)在已經(jīng)成為谷物突變(Arabidopsis；(Marks等，1991；Koncz等，1990)和金魚草突變(Sommer等，1990)的有效工具。插入突變可通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。b)化學(xué)誘變化學(xué)誘變具有某些優(yōu)勢(shì)，如能發(fā)現(xiàn)所有突變中哪個(gè)對(duì)表型的影響最大，操作簡(jiǎn)單而且成本低。大多數(shù)化學(xué)致癌物都可以使DNA發(fā)生突變。苯并[a]芘、N-乙酰氧基-2-乙酰氨基芴和aflotoxinB1可引起細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA的GC到TA的顛換。苯并[a]芘還可以引起替代如AT到TA的替代。N-硝基化合物可引起GC到AT的轉(zhuǎn)換。接觸n-亞硝脲后胸腺嘧啶04位置上的烷基化可導(dǎo)致TA到CG的轉(zhuǎn)換。c)輻射突變離子輻射可使生物分子降解。吸收額外能量可導(dǎo)致離子和自由基的形成以及某些共價(jià)鍵的斷裂。不同分子之間以及同一分子的不同晶體形式之間對(duì)輻射損傷的敏感度不同。依賴于總的積聚劑量以及劑量率(如果存在自由基，它們所引起的分子損傷大小依賴于其自然擴(kuò)散率和作用時(shí)間)。使樣品盡可能冷卻可減輕或控制損傷的程度。離子輻射引起的DNA損傷程度一般與劑量率成正比。在本發(fā)明中，術(shù)語“離子輻射”是指含粒子或光子的輻射，這些粒子或光子具有足夠的能量，或者可以產(chǎn)生足夠的能力引起離子化(獲得或失去電子)。一種典型的和優(yōu)選的離子輻射是X射線。特定細(xì)胞或特定分子發(fā)生突變所需要的離子輻射的劑量一般依賴于細(xì)胞或分子的特性以及所要突變靶位的特性。確定有效輻射劑量的方法是本領(lǐng)域所熟知的。d)體外篩選突變利用易錯(cuò)PCR也可以引入隨機(jī)突變。通過在多個(gè)含不同模板稀釋度的管內(nèi)進(jìn)行PCR可提高突變的幾率。一個(gè)特別有用的突變技術(shù)是丙氨酸篩選突變，其中可以有多個(gè)殘基分別被丙氨酸替代，這樣就可以了解失去側(cè)鏈相互作用后的效應(yīng)，并且使大規(guī)模干擾蛋白構(gòu)象的危險(xiǎn)降到最低(Cunningham等，1989)。體外篩選飽和誘變?yōu)榇罅揩@得結(jié)構(gòu)-功能信息提供了一種快速的方法，其中包括(i)確定調(diào)節(jié)配基結(jié)合特異性的殘基，(ii)根據(jù)這些可使活性保持的氨基酸以及可使活性喪失的氨基酸所處的位置可以更好地了解配基的結(jié)合活性，(iii)評(píng)價(jià)一個(gè)活性位點(diǎn)或蛋白子域的整體可塑性，(iv)確定可使結(jié)合活性增強(qiáng)的氨基酸替代。2.位點(diǎn)特異性突變結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變代表了分析和改造蛋白-配基相互作用的一個(gè)有效工具(Wells，1996；Braisted等，1996)。該技術(shù)可通過在目的DNA內(nèi)引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的改變來制備和檢測(cè)序列突變體。位點(diǎn)特異性突變利用編碼DNA序列目的突變及其臨近的足夠數(shù)目的未修飾核苷酸的特異性寡核苷酸序列。在這種方法中，引物序列的長(zhǎng)度和復(fù)雜性要足以在要交叉的缺失連接的兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙螺旋。優(yōu)選的引物長(zhǎng)度約為17到25個(gè)核苷酸，其中交叉的連接序列兩側(cè)約為5到10個(gè)殘基。該方法一般利用即有單鏈形式又有雙鏈形式的噬菌體載體。用于位點(diǎn)特異性突變的載體包括載體如M13噬菌體。這些噬菌體載體都是商業(yè)化的，其使用方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。雙鏈質(zhì)粒也常被用于位點(diǎn)特異性突變，利用該載體可以省卻將目的基因從噬菌體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒的步驟。一般來說，需要首先獲得單鏈載體或者使雙鏈載體的雙鏈退火，載體的序列內(nèi)包含一個(gè)編碼目的蛋白或基因元件的DNA序列。然后使合成的攜帶目的突變序列的寡核苷酸引物與單鏈DNA制備物復(fù)性，在選擇雜交條件時(shí)要考慮發(fā)生錯(cuò)配的程度。雜合的產(chǎn)物利用DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)完成含突變的DNA鏈的合成。這樣就形成了異源雙螺旋，其中一條鏈編碼原始的非突變序列，另一條鏈帶有目的突變。然后用這種異源雙螺旋分子轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，篩選含重組載體的克隆，其中重組載體內(nèi)帶有突變序列。一個(gè)蛋白質(zhì)上某個(gè)殘基在功能上的完整信息以及信息的內(nèi)容可通過飽和突變來獲得，其中要檢測(cè)所有的19個(gè)氨基酸替代。這種方法的缺點(diǎn)是多殘基飽和突變的算法是令人畏懼的(Warren等，1996，Zeng等，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等，1995；Hilton等，1996)。需要研究數(shù)百個(gè)、甚至數(shù)千個(gè)位點(diǎn)特異性的突變。但是，經(jīng)改進(jìn)的技術(shù)可使突變的制備和篩選變得更快速簡(jiǎn)捷。見美國(guó)專利5,798,208和5,830,650對(duì)“草率”突變的描述。位點(diǎn)特異性突變的其他方法見美國(guó)專利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377和5,789,166的描述。C.載體為了在痘病毒基因組內(nèi)引入突變，天然和修飾多肽可由包含在載體內(nèi)的核酸分子編碼。本文所用的術(shù)語“載體”是指攜帶核酸分子的載體，其中載體內(nèi)插入的外源核酸分子可通過載體被導(dǎo)入到可以復(fù)制載體的細(xì)胞內(nèi)。核酸序列是“外源性的”是指對(duì)于載體導(dǎo)入的細(xì)胞來說該核酸是外源的，或者該序列雖然與細(xì)胞內(nèi)的序列同源但是其在宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的位置通常不包含該核酸。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)以及人工染色體(如YACs)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)構(gòu)建這種載體，這些方法在Sambrook等，(1989)和Ausubel等，1994中有描述，本文已納入作為參考。除了可以編碼修飾多肽如白樹素以外，載體還可以編碼未修飾的多肽序列，如標(biāo)記物或靶向性分子。可以編碼這種融合蛋白的載體包括pIN載體(Inouye等，1985)、編碼一組組氨酸的載體和用于制備谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可溶性融合蛋白的pGEX載體以利于以后的純化和分離或裂解。靶向性分子是一種可以使修飾多肽特異性地定位到特定器官、組織、細(xì)胞或受體其他位置的分子。術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有核酸序列的載體，其中的核酸序列至少編碼部分能被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成蛋白、多肽或肽。在另外一些情況下，這些序列不翻譯，而是轉(zhuǎn)錄出反義分子或核酶。表達(dá)載體含有各種“調(diào)控序列”，調(diào)控序列是指操作連接的編碼序列在特定宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所需要的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列外，載體和表達(dá)載體還可以包含具有其他功能的核酸序列，這些序列將在下文描述。1.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子“啟動(dòng)子”是一種調(diào)控序列，是核酸序列上一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄起始和速率的區(qū)域?？梢园{(diào)節(jié)蛋白和分子結(jié)合的元件如RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語“操作位置的”、“操作連接的”、“控制下的”和“轉(zhuǎn)錄控制下的”是指相對(duì)于核酸序列來說啟動(dòng)子位于正確的功能位置和/或方向，可以調(diào)控該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。啟動(dòng)子可以連接有“增強(qiáng)子”，也可以不連接，增強(qiáng)子是指參與核酸序列轉(zhuǎn)錄活化的順式調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子可以是與某個(gè)基因或序列天然相連的序列，如通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而得到的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子被稱為“內(nèi)源性的”。同樣，增強(qiáng)子也可以是與某個(gè)序列天然相連、位于該序列上游或下游的序列。另外，將編碼核酸片段置于重組的或異源的啟動(dòng)子控制之下也有某些優(yōu)勢(shì)，重組的或異源的啟動(dòng)子是指在天然狀態(tài)下該序列不是與核酸序列相聯(lián)系的。重組的或異源的增強(qiáng)子也是指在天然狀態(tài)下不是與核酸序列相聯(lián)系的增強(qiáng)子。這種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、從其他原核細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞中分離出的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子以及非“天然的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和/或改變表達(dá)的突變的不同元件。除了可以通過合成方法制備啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列外，還可以利用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)，其中包括PCRTM，結(jié)合本文所描述的組合物來制備序列(見美國(guó)專利4,683,202，5,928,906，本文都已納入作為參考)。另外，需要說明的是可控制無核細(xì)胞器如線粒體、葉綠體內(nèi)的序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控序列也可以使用。很顯然，利用啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子來有效地控制DNA節(jié)段在細(xì)胞、細(xì)胞群和生物體內(nèi)的表達(dá)是十分重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般都熟悉如何使用啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，知道如何選擇細(xì)胞以表達(dá)蛋白，例如Sambrook等，(1989)所描述的，本文已納入作為參考。所使用的啟動(dòng)子可以是組成性的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和/或可在適當(dāng)?shù)臈l件下使被導(dǎo)入的DNA節(jié)段高水平表達(dá)的啟動(dòng)子，例如在大規(guī)模制備重組蛋白和/或肽時(shí)。啟動(dòng)子可以是異源的，也可以是內(nèi)源性的。表2列舉了一些可用于本發(fā)明中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的元件/啟動(dòng)子。這個(gè)列表并沒有將調(diào)控表達(dá)的所有可能的元件都包括在內(nèi)，而僅僅是舉了其中的一些例子。表3給出了可誘導(dǎo)元件的一些例子，這些元件是核酸序列上可被特異性刺激因子活化的區(qū)域。組織特異性啟動(dòng)子或元件的鑒定及其活性特征的分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這種區(qū)域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生長(zhǎng)抑素受體2基因(Kraus等，1998)、鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)，鼠α2(XI)膠原(Tsumaki，等，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee，等，1997)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II(Wu等，1997)、人血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Almendro等，1996)、以及SM22α啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子還有dectin-1和dectin-2啟動(dòng)子。其他可用于本發(fā)明的病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以及可誘導(dǎo)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子列在表2和表3中。其他任何的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(如每個(gè)真核細(xì)胞啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫EPDB)都可以用于驅(qū)動(dòng)編碼寡糖處理酶、蛋白折疊輔助蛋白、選擇性標(biāo)記蛋白或異源目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。另外，用于腫瘤基因治療(表4)或可以靶向到腫瘤(表5)的組織特異性啟動(dòng)子也可用于調(diào)控本發(fā)明的核酸分子。表4癌癥基因治療的候選組織特異性啟動(dòng)子表5用于靶向道腫瘤的組織特異性候選啟動(dòng)子2.起始信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼序列的有效翻譯還需要特異性的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子或其臨近序列。包含ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號(hào)也需要提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地確定這一點(diǎn)并提供必須的信號(hào)。大家都知道起始密碼子必須位于目的編碼序列閱讀框架內(nèi)才能確保整個(gè)插入序列被翻譯。外源性的翻譯控制信號(hào)可以是天然的，也可以是合成的。插入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件可以提高表達(dá)的效率。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)可以使多個(gè)基因或多個(gè)順反子信使RNA表達(dá)。IRES元件可以使核糖體繞過5’甲基化帽子依賴性翻譯的掃描模式在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。小核糖核酸病毒家族的兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)來源的IRES元件以及哺乳動(dòng)物信使RNA來源的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以被連接到異源開放閱讀框架上。多個(gè)開放閱讀框架可以一起轉(zhuǎn)錄，其中每個(gè)閱讀框架都被IRES隔開，轉(zhuǎn)錄出一條多順反子信使RNA。利用IRES元件每個(gè)開放閱讀框架都可以有核糖體結(jié)合從而可以高效翻譯。利用單個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出一條信使RNA可以使多個(gè)基因都得到有效表達(dá)(見美國(guó)專利5,925,565和5,935,819，本文已納入作為參考)。3.多克隆位點(diǎn)載體可包含多克隆位點(diǎn)(MCS)，MCS是指包含多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸序列，通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)每個(gè)酶切位點(diǎn)都可以用于消化載體(見Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，本文已納入作為參考)?！跋拗菩詢?nèi)切酶消化”是指利用內(nèi)切酶催化裂解核酸分子的過程，其中內(nèi)切酶只在核酸分子的特定位置上切割。很多這樣的限制性內(nèi)切酶都可以買到。這種內(nèi)切酶的使用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。載體通常被在MCS內(nèi)切割的限制性內(nèi)切酶線性化或片段化從而可以使外源序列連接到載體上?！斑B接“是指兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，其中兩個(gè)核酸片段可以是彼此不相臨近的。涉及限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的。4.剪接位點(diǎn)大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄出來的真核RNA分子都會(huì)發(fā)生RNA剪接以去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄子內(nèi)的內(nèi)含子。含基因組真核序列的載體需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)以保證轉(zhuǎn)錄子被正確處理，然后表達(dá)蛋白(見Chandler等，1997，本文已納入作為參考)。5.終止信號(hào)本發(fā)明的載體或構(gòu)建體一般都包含至少一個(gè)終止信號(hào)?！敖K止信號(hào)”或“終止子”由參與RNA聚合酶所轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子特異性終止的DNA序列組成。因此，在某些實(shí)施方案中，需要結(jié)束RNA轉(zhuǎn)錄子合成的終止信號(hào)。終止子是在體內(nèi)獲得理想的信使RNA表達(dá)水平所必須的。在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)域還可以包含允許新轉(zhuǎn)錄子發(fā)生位點(diǎn)特異性裂解以暴露多聚腺苷酸信號(hào)的特異性DNA序列。這種序列可向特異的內(nèi)源性聚合酶發(fā)出信號(hào)，使之將一段約200A的殘基(polyA)添加到轉(zhuǎn)錄子的3’末端。經(jīng)這種polyA尾巴修飾的RNA分子更穩(wěn)定，其翻譯的效率也更高。因此，在其他涉及真核生物的實(shí)施方案中，優(yōu)選包含RNA裂解信號(hào)的終止子，更優(yōu)選的是該終止子信號(hào)可促進(jìn)信使RNA的多聚腺苷酸化。終止子和/或多聚腺苷酸位點(diǎn)元件可提高信使RNA的表達(dá)水平和/或使核糖體閱讀過表達(dá)盒進(jìn)入其他序列的可能降到最低。本發(fā)明所用的終止子包括本文所描述的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的轉(zhuǎn)錄子的任何已知的終止子，其中包括而不限于基因的終止序列，如牛生長(zhǎng)激素終止子，或者病毒的終止序列，如SV40終止子。在某些實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)錄或可翻譯的序列可能缺少終止信號(hào)，如由于序列截短。6.多聚腺苷酸信號(hào)基因表達(dá)，特別是真核基因表達(dá)一般都包含多聚腺苷酸信號(hào)以使轉(zhuǎn)錄子正確多聚腺苷酸化。據(jù)信多聚腺苷酸信號(hào)的性質(zhì)不是成功實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的關(guān)鍵，任何這樣的序列都可以使用。優(yōu)選的實(shí)施方案包括SV40多聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸信號(hào)，已知這些多聚腺苷酸信號(hào)在各種靶細(xì)胞內(nèi)都有功能，并且使用方便。多聚腺苷酸化可提高轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定性，或者可以促進(jìn)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。7.復(fù)制起點(diǎn)為了在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增載體，載體內(nèi)需包含一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)(通常被稱為“ori”)，這是一種復(fù)制在此處開始的特異性核酸序列。另外，如果宿主細(xì)胞是酵母，可以使用自主復(fù)制序列(ARS)。8.選擇和篩選標(biāo)記在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以通過在表達(dá)載體內(nèi)添加一個(gè)標(biāo)記而便于含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞在體外或體內(nèi)被鑒定。這種標(biāo)記可以使細(xì)胞具有可鑒定的表型從而便于鑒定含表達(dá)載體的細(xì)胞。一般來說，篩選標(biāo)記是一種可提供篩選特性的序列。陽性篩選標(biāo)記是指在標(biāo)記物存在的情況下可被篩選的標(biāo)記，而負(fù)性標(biāo)記是指在標(biāo)記物存在的情況下不被篩選的標(biāo)記。陽性篩選標(biāo)記的例子有耐藥標(biāo)記。一般來說，包含藥物篩選標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如提供新霉素嘌羅霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組胺醇耐藥性的基因都是有用的篩選標(biāo)記。除了能提供一種表型以便于區(qū)分轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記外，其他類型的標(biāo)記，包括篩選標(biāo)記，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如GFP，其篩選的基礎(chǔ)是比色分析。另外，可篩選的酶如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)也可以使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何使用免疫標(biāo)記，可能結(jié)合FACS分析。用何種標(biāo)記被認(rèn)為是不重要的，只要該標(biāo)記可與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)就可以。選擇和篩選標(biāo)記的其他例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。D.宿主細(xì)胞本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互用。所有這些術(shù)語都包括其子代，可以是任何代和所有代的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是并不是所有的子代細(xì)胞都是一致的，因?yàn)榭赡軙?huì)發(fā)生定向的或隨機(jī)的突變。在用于表達(dá)異源核酸序列時(shí)，“宿主細(xì)胞”是指原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括任何可被轉(zhuǎn)化的生物，只要它能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)載體所編碼的異源基因。宿主細(xì)胞可以而且已經(jīng)被用作載體或病毒(如果不能表達(dá)外源多肽則不能作為載體)的受體。宿主細(xì)胞可以是“被轉(zhuǎn)染的”或“被轉(zhuǎn)化的”是指外源核酸，如修飾蛋白編碼序列，被轉(zhuǎn)移或?qū)氲剿拗骷?xì)胞內(nèi)的過程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代受體細(xì)胞及其子代細(xì)胞。根據(jù)所要得到的結(jié)果是復(fù)制載體或是表達(dá)部分或全部載體編碼核酸序列，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其中包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。許多細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物都可用作宿主細(xì)胞，可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得，這是收集和保存活體培養(yǎng)物和遺傳材料的組織(www.atcc.org)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)載體的結(jié)構(gòu)及所要得到的結(jié)果能夠確定選擇何種合適的宿主。例如，質(zhì)粒和粘?？杀粚?dǎo)入到原核宿主細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制大量的載體。作為宿主細(xì)胞用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)菌包括DH5α、JM109和KC8，以及許多商業(yè)化的細(xì)菌宿主，如SURECompetentCells和SOLOPACKTMGoldCells(STRATAGENE，LaJolla，CA)。另外，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌LE392也可以作為宿主細(xì)胞復(fù)制噬菌體。合適的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母、啤酒酵母和畢赤酵母。用于復(fù)制和/或表達(dá)載體的真核宿主細(xì)胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。各種類型的細(xì)胞和生物來源的宿主細(xì)胞都可以得到，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。同樣，病毒載體可用于真核宿主細(xì)胞，也可用于原核宿主細(xì)胞，特別是能復(fù)制或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。某些載體可包含調(diào)控序列以使其既可以在原核細(xì)胞，又可以在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還了解培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞并使其中的載體復(fù)制的條件。還清楚和了解大規(guī)模制備載體以及載體編碼的核酸及其同源多肽、蛋白或肽的技術(shù)和條件。E.表達(dá)系統(tǒng)許多表達(dá)系統(tǒng)至少包含上述部分或全部組合物。原核和真核表達(dá)系統(tǒng)可用于本發(fā)明以制備核酸序列或其同源的多肽、蛋白和肽。許多這樣的系統(tǒng)都已商品化，并且在許多地方都可以購(gòu)買。昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可使異源核酸片段高水平地表達(dá)蛋白質(zhì)，如美國(guó)專利5,871,986、4,879,236所描述，本文已納入作為參考，這種系統(tǒng)可以購(gòu)買到，如INVITROGEN的MAXBAC2.0桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和CLONTECH的BACPACKTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)除了本發(fā)明描述的表達(dá)系統(tǒng)以外，其他表達(dá)系統(tǒng)的例子有STRATAGENE的COMPLETECONTROLTM可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個(gè)合成的蛻皮素可誘導(dǎo)受體，以及該公司的pET表達(dá)系統(tǒng)，這是一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。另外一種可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是INVITROGEN的T-REXTM(可被四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，這是一種含全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。INVITROGEN還有一種酵母表達(dá)系統(tǒng)，被稱為畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在嗜甲醇的畢赤酵母內(nèi)高水平表達(dá)重組蛋白。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何構(gòu)建一個(gè)載體，如表達(dá)構(gòu)建體，來制備核酸序列或其同源的多肽、蛋白或肽。F.核酸檢測(cè)本文所描述的核酸序列除了可用于表達(dá)痘病毒蛋白、多肽和/或肽之外，還有很多其他用途。例如，可作為探針或引物用于涉及核酸雜交的實(shí)施方案中。也可用于本發(fā)明的診斷或篩選方法中。本發(fā)明包含編碼痘病毒或痘病毒多肽調(diào)節(jié)因子的核酸的檢測(cè)方法。1.雜交利用13到100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的探針或引物，優(yōu)選17到100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的探針或引物，在本發(fā)明的某些方面可達(dá)到1-2kb或更長(zhǎng)，可以形成穩(wěn)定而特異的雙螺旋分子。具有20個(gè)以上的連續(xù)堿基是互補(bǔ)序列的分子一般是優(yōu)選的，可提高所得到的雜合分子的穩(wěn)定性和/或特異性。通常來說，優(yōu)選的用于雜交的核酸分子含有一段或多段含20到30個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列，如果需要甚至可以更長(zhǎng)。這樣的片段很容易制備，例如通過化學(xué)方法直接合成這樣的片段，或通過將所選擇的序列導(dǎo)入到重組載體內(nèi)以制備這樣的片段。相應(yīng)的，本發(fā)明的核苷酸序列可用于和互補(bǔ)的DNA和/或RNA片段形成特異性的雙螺旋分子，或從樣品中擴(kuò)增DNA或RNA的引物。根據(jù)應(yīng)用的目的不同，人們可以在不同的雜交條件下利用不同特異性的探針或引物來發(fā)現(xiàn)或擴(kuò)增靶序列。在需要高特異性的應(yīng)用中，人們一般希望在相對(duì)高嚴(yán)格的條件下雜交。例如，相對(duì)低的鹽濃度和/或相對(duì)較高的溫度，如約0.02M到0.10MNaCl、約50℃到70℃的條件。這種高嚴(yán)格條件不允許探針或引物和模板或靶序列之間有錯(cuò)誤配對(duì)，特別適于分離特異性基因或檢測(cè)特異性的mRNA轉(zhuǎn)錄子。一般來說，逐漸提高甲酰胺的加入量可以使雜交條件更嚴(yán)格。對(duì)于某些用途來說，如位點(diǎn)特異性突變，優(yōu)選較低的嚴(yán)格條件。在這種條件下，即使雜交鏈的序列不是完全互補(bǔ)也可以發(fā)生雜交，但是會(huì)在一個(gè)或多個(gè)位置上發(fā)生堿基錯(cuò)配。通過提高鹽的濃度和/或降低溫度可以使雜交條件的嚴(yán)格程度降低。例如，中等嚴(yán)格程度的雜交條件是約0.1到0.25MNaCl、約37℃到55℃的溫度，而低嚴(yán)格條件是指約0.15M到0.9M的鹽濃度和約20℃到55℃的溫度。根據(jù)所希望得到的結(jié)果可以很容易的調(diào)整雜交條件。在其他實(shí)施方案中，雜交可在如下條件下進(jìn)行50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKCl、3mMMgCl2、1.0mM二硫蘇糖醇，溫度約在20℃到37℃之間。其他可用的雜交條件包括約10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、1.5mMMgCl2，溫度約在40℃到72℃之間。在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的具有確定序列的核酸上連接一些合適的分子，如標(biāo)記物來進(jìn)行雜交是有好處的。很多適宜的指示劑都是本領(lǐng)域所熟知的，其中包括熒光的、放射性、酶催化的指示劑或其他配基，如親和素/生物素，這些都可以被檢測(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以用熒光標(biāo)記物或酶標(biāo)記物，如尿素酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶來代替放射性標(biāo)記物或其他影響環(huán)境的試劑。在使用酶標(biāo)記物的例子中，可使用比色指示劑底物通過可見的或分光光度的檢測(cè)方式來檢測(cè)與樣品中互補(bǔ)核酸的雜交情況。一般來說，本文所描述的探針或引物可作為試劑用于溶液雜交，如PCRTM中以檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)情況，或者用于固相雜交的實(shí)施方案中。在固相雜交的實(shí)施方案中，被檢測(cè)的DNA(或RNA)被吸附或固定在基質(zhì)或表面上。然后使這種被固定的單鏈核酸與所選擇的探針在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交。雜交條件的選擇要根據(jù)特定的環(huán)境(如靶核酸的G+C含量、類型、核酸的來源、雜交探針的大小等)。對(duì)于某種特定用途來說如何選擇最佳的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。洗滌雜交的分子去除非特異性結(jié)合的探針分子以后，通過確定結(jié)合標(biāo)記物的量來檢測(cè)和/或定量雜交的情況。典型的固相雜交方法見于美國(guó)專利5,843,663、5,900,481和5,919,626的描述?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他雜交方法見于美國(guó)專利5,849,481、5,849,486和5,851,772。這些文獻(xiàn)的相關(guān)部分以及本說明書中這部分所涉及的其他參考文獻(xiàn)都以參考文獻(xiàn)的方式被納入到本文中。2.核酸的擴(kuò)增用作擴(kuò)增模板的核酸可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法從細(xì)胞、組織和其他樣品中分離(Sambrook等，1989)。在某些實(shí)施方案中，分析是用完整細(xì)胞和組織勻漿物和液體生物樣品進(jìn)行，不需要純化模板核酸。核酸可以是基因組DNA或分離的或全細(xì)胞RNA。如果用RNA為模板，則需要首先將其反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的DNA。本文所用的術(shù)語“引物”包括可以模板依賴的方式啟動(dòng)起始核酸合成的任何核酸序列。一般來說，引物是長(zhǎng)度為10到20和/或30bp的寡核苷酸，但是也可以使用更長(zhǎng)的序列。引物可以雙鏈和/或單鏈的形式提供，但是優(yōu)選單鏈形式的引物?？膳c本文所鑒定的基因序列相應(yīng)的核酸特異性雜交的引物對(duì)與模板核酸在允許特異性雜交的條件下接觸。根據(jù)使用目的的不同，可以選擇高嚴(yán)格雜交條件從而只允許引物與其完全互補(bǔ)的序列雜交。在其他的實(shí)施方案中，可以降低的雜交條件的嚴(yán)格性以使與引物序列有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基的核酸也可以被擴(kuò)增。雜交后，模板-引物復(fù)合物與一種或多種具有促進(jìn)模板依賴的核酸合成的酶接觸。經(jīng)過多輪擴(kuò)增，也被稱為“循環(huán)”，就可以制備出足量的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后檢測(cè)和定量擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些用途中，檢測(cè)以可見的方式進(jìn)行。另外，檢測(cè)也可以是通過測(cè)定摻入的放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光、放射活性來間接確定產(chǎn)物的量，甚至可以通過一個(gè)能發(fā)出電脈沖信號(hào)和/或熱脈沖信號(hào)的系統(tǒng)來檢測(cè)(Bellus，1994)。許多模板依賴的方法都可用于擴(kuò)增存在于給定模板樣品中的寡核苷酸序列。一個(gè)最為大家所熟知的擴(kuò)增方法就是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(被稱為PCRTM)，本方法的詳細(xì)描述見于美國(guó)專利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，1988，本文都已完整納入作為參考。確定所要擴(kuò)增的mRNA的量可通過反轉(zhuǎn)錄酶PCRTM擴(kuò)增方法。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法是大家所熟知的(見Sambrook等，1989)。另外一些反轉(zhuǎn)錄方法利用熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶。這些方法描述于WO90/07641。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。RT-PCR的經(jīng)典方法見美國(guó)專利5,882,864的描述。另外一種擴(kuò)增方法是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)，描述于歐洲專利申請(qǐng)320308，本文已完整納入作為參考。美國(guó)專利4,883,750描述了一種與LCR類似的方法用于探針對(duì)與靶序列的結(jié)合?；赑CRTM和寡核苷酸連接酶分析(OLA)的方法也可以使用，見美國(guó)專利5,912,148的描述?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他靶核酸序列擴(kuò)增方法描述于美國(guó)專利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291和5,942,391，英國(guó)專利申請(qǐng)2202328和PCT申請(qǐng)PCT/US89/01025，本文都已完整納入作為參考。PCT申請(qǐng)PCT/US87/00880所描述的Qbeta復(fù)制酶也可以作為本發(fā)明的擴(kuò)增方法。在該方法中，復(fù)制RNA序列在存在RNA聚合酶的情況下被加到樣品中，該復(fù)制RNA序列含有一個(gè)與靶序列互補(bǔ)的區(qū)。聚合酶就會(huì)拷貝該復(fù)制序列，從而可以檢測(cè)這種復(fù)制序列。一種恒溫?cái)U(kuò)增方法也可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸，其中限制性內(nèi)切酶和連接酶被用于完成靶分子的擴(kuò)增，靶分子內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)的一條鏈上含有核苷5’-[α-硫代]-三磷酸(Walker等，1992)。美國(guó)專利5,916,779所描述的鏈錯(cuò)位擴(kuò)增(SDA)是另外一種可以恒溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，其中包括多輪的鏈錯(cuò)位和合成，即切口平移。其他的核酸擴(kuò)增方法包括轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989；PCT申請(qǐng)WO88/10315，本文已完整納入作為參考)。歐洲專利申請(qǐng)329822描述了一種核酸擴(kuò)增方法，其中包括循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)，該方法也可用于本發(fā)明。PCT專利申請(qǐng)WO89/06700(本文已完整納入作為參考)描述了核酸序列擴(kuò)增方案，該方案的基礎(chǔ)是啟動(dòng)子區(qū)/引物序列與單鏈靶DNA(“ssDNA”)雜交，然后轉(zhuǎn)錄出該序列的多個(gè)RNA拷貝。該方案不用多個(gè)循環(huán)，即從合成的RNA轉(zhuǎn)錄子中不產(chǎn)生新的模板。其他的擴(kuò)增方法有“RACE”和“one-sidedPCR”(Frohman，1990；Ohara等，1989)。3.核酸的檢測(cè)擴(kuò)增以后需要將擴(kuò)增產(chǎn)物與模板和/或剩余的引物分開。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物用標(biāo)準(zhǔn)方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙稀酰胺或聚丙稀酰胺凝膠電泳分開(Sambrook等，1989)。分開的擴(kuò)增產(chǎn)物從凝膠上切下并洗脫出來以便于進(jìn)行下一步的操作。使用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠可將分開的條帶通過加熱凝膠然后提取而獲得核酸。核酸也可以用本領(lǐng)域熟知的色譜技術(shù)分離。有許多種色譜技術(shù)可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，其中包括吸附層析、分配層析、離子交換層析、羥磷灰石結(jié)晶層析、分子排阻層析、反向?qū)游?、柱層析、紙層析、薄層色譜、以及氣相色譜和HPLC。在某些實(shí)施方案中，可將擴(kuò)增產(chǎn)物顯影。一個(gè)典型的顯影方法是用溴乙錠染色，然后在紫外燈下觀察。另外，如果擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)被標(biāo)記上放射性或熒光標(biāo)記核苷酸，分離出的擴(kuò)增產(chǎn)物可使X-射線膠片曝光或者在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光下顯影。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物被分離出來后用標(biāo)記的核酸探針與擴(kuò)增的標(biāo)記序列接觸。探針最好連接上發(fā)光基團(tuán)，但也可以進(jìn)行放射性標(biāo)記。在另外的實(shí)施方案中，探針連接有結(jié)合物如抗體或生物素或其他帶有可檢測(cè)基序的結(jié)合物。在特定的實(shí)施方案中，可通過DNA印跡技術(shù)與標(biāo)記探針雜交而檢測(cè)。該技術(shù)涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的DNA印跡(見Sambrook等，1989)。上述技術(shù)的一個(gè)例子見于美國(guó)專利5,279,721的描述，本文已納入作為參考，其中描述了自動(dòng)化的電泳和核酸轉(zhuǎn)移裝置和方法。該裝置不需要在外面處理凝膠就可以進(jìn)行電泳和雜交，特別適于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他核酸檢測(cè)方法描述于美國(guó)專利5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,726、5,846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、5,929,227、5,932,413和5,935,791，本文都已納入作為參考。4.其他測(cè)定方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)其他一些方法也可用于遺傳篩選，如檢測(cè)基因組DNA、cDNA和/或RNA樣品中是否存在突變?？捎糜跈z測(cè)點(diǎn)突變的方法包括變性梯度凝膠電泳(“DGGE”)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(“RFLP”)、化學(xué)或酶催化裂解方法、PCRTM擴(kuò)增出的靶區(qū)域直接測(cè)序(見上)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(“SSCP”)以及本領(lǐng)域所熟知的其他方法。一種篩選點(diǎn)突變的方法是基于RNA酶可裂解RNA/DNA或RNA/DNA異源雙鏈上錯(cuò)配的堿基對(duì)。本文所用的術(shù)語“錯(cuò)配”是指雙鏈RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子上含有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)或錯(cuò)誤配對(duì)核苷酸的區(qū)域。因此，這個(gè)定義包括了由于插入/缺失突變以及單個(gè)堿基或多個(gè)堿基點(diǎn)突變而導(dǎo)致的錯(cuò)配。美國(guó)專利4,946,773描述了一種RNA酶A錯(cuò)配裂解分析方法，該方法是使單鏈DNA或RNA檢測(cè)樣品與RNA探針接觸，然后用RNA酶A處理核酸雙螺旋，為了檢測(cè)錯(cuò)配的堿基，RNA酶A處理的單鏈產(chǎn)物根據(jù)大小的不同在電泳上分開，然后與經(jīng)同樣處理的對(duì)照雙鏈相比較。包含對(duì)照雙螺旋中未見的小片段(裂解產(chǎn)物)的樣品標(biāo)記為陽性。其他研究人員也描述了RNA酶I在錯(cuò)配試驗(yàn)中的應(yīng)用。使用RNA酶I檢測(cè)錯(cuò)配的方法描述于PromegaBiotech的文獻(xiàn)中。Promega出品了一種包含RNA酶I的試劑盒，據(jù)報(bào)道這種RNA酶I可以裂解已知的4個(gè)錯(cuò)配堿基中的3個(gè)。其他一些報(bào)道顯示利用MutS蛋白或其他DNA修飾酶也可以檢測(cè)單堿基錯(cuò)配?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的檢測(cè)缺失、插入或替代突變的其他方法描述于美國(guó)專利5,849,483、5,851,770、5,866,337、5,925,525和5,928,870，本文都已完整納入作為參考。G.基因轉(zhuǎn)移方法適于核酸轉(zhuǎn)移以表達(dá)本發(fā)明的組合物的方法被認(rèn)為可以包括能將核酸(如DNA，包括病毒載體和非病毒載體)導(dǎo)入到細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的任何方法，如本文所描述的和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。這些方法包括而不限于通過注射(美國(guó)專利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，本文已納入作為參考)、包括微注射(Harlan和Weintraub，1985；美國(guó)專利5,789,215，本文已納入作為參考)；電穿孔(美國(guó)專利5,384,253，本文已納入作為參考)；鈣磷酸鹽沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；DEAE-葡聚糖、然后用聚乙二醇(Gopal，1985)；直接的聲波負(fù)載(Fechheimer等，1987)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；微發(fā)射炮擊(PCT專利申請(qǐng)WO94/09699和95/06128；美國(guó)專利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，本文已納入作為參考)；碳化硅纖維攪拌(Kaeppler等，1990；美國(guó)專利5,302,523和5,464,765，本文已納入作為參考)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利5,591,616和5,563,055，本文已納入作為參考)；或PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993；美國(guó)專利4,684,611和4,952,500，本文已納入作為參考)；脫水/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，1985)直接轉(zhuǎn)移基因。通過使用這些技術(shù)，細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物體可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。H.脂質(zhì)組分和基序在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含與核酸、氨基酸分子如肽或其他小分子化合物相連接的一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)的組合物。在本文所討論的所有實(shí)施方案中，分子既可以是痘病毒多肽或痘病毒多肽調(diào)節(jié)因子，如編碼全長(zhǎng)或部分痘病毒多肽的核酸，也可以是編碼全長(zhǎng)或部分痘病毒多肽調(diào)節(jié)因子的氨基酸分子。脂質(zhì)是不溶于水、能用有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)。本文所特別指出的化合物以外的化合物可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解為脂質(zhì)，也包括在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)。脂質(zhì)成分和非脂質(zhì)成分可通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵彼此結(jié)合。脂質(zhì)可以是天然的，也可以是人工合成的(即人工設(shè)計(jì)并制備的)。但是，脂質(zhì)通常是一種生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知的，包括中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜烯、溶血脂質(zhì)(lysolipids)、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、含有醚和酯連接脂肪酸的脂質(zhì)、可聚合的脂質(zhì)、以及上述脂質(zhì)的組合物。與脂質(zhì)相關(guān)的核酸分子或氨基酸分子、如肽可被分散在含脂質(zhì)溶液中、用脂質(zhì)溶解、乳化、混合、與脂質(zhì)連接、共價(jià)結(jié)合、以懸液的形式懸浮于脂質(zhì)中、以及以其他方式與脂質(zhì)相聯(lián)系。脂質(zhì)或脂質(zhì)/本發(fā)明的痘病毒相關(guān)組合物并不局限于任何特定結(jié)構(gòu)的分子。例如，可以簡(jiǎn)單地分散在溶液中，可能形成不同大小和形狀的凝集物。在其他的例子中，可以雙層的結(jié)構(gòu)存在，如微膠?；蛭莸慕Y(jié)構(gòu)。在其他的非限定性例子中，也可以考慮lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-痘病毒復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)組合物可以包含約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、約60％、約61％、約62％、約63％、約64％、約65％、約66％、約67％、約68％、約69％、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％或上述數(shù)值之間任何范圍的特定脂質(zhì)、脂類或非脂質(zhì)組分，如藥物、蛋白、糖、核酸或本文所描述的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他物質(zhì)。在一個(gè)非限定性例子中，脂質(zhì)組合物包含約10％到20％中性脂質(zhì)、約33％到34％的腦苷脂和約1％的膽固醇。在另一個(gè)非限定性例子中，脂質(zhì)體包含約4％到12％的萜烯，其中約1％的微膠粒是番茄紅素，另外約有3％到11％的脂質(zhì)體包含其他萜烯；約10％到35％的磷脂酰膽堿以及約1％的藥物。因此，需要說明的是本發(fā)明的組合物包含任何組合或任何百分比的脂質(zhì)、脂類或其他組分。IV.藥用制劑、給藥途徑和治療方案在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種通過給予經(jīng)修飾的痘病毒，如痘苗病毒治療過度增殖性疾病、如癌癥的方法。可用該方法治療的腫瘤包括肺癌、頭頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺內(nèi)的癌前病變、結(jié)腸癌、黑色素瘤、膀胱癌以及可被治療的其他癌或腫瘤。一般來說，有效量的藥用組合物是指足夠量的可重復(fù)達(dá)到改善、減輕、縮小或抑制疾病及其癥狀的組合物。也可以用更嚴(yán)格的定義，其中包括消除、根除或治愈疾病?；颊咦詈镁哂羞m當(dāng)?shù)墓撬韫δ?定義為外周粒細(xì)胞絕對(duì)值＞2,000/mm3，血小板絕對(duì)值為100,000/mm3)、適當(dāng)?shù)母喂δ?膽紅素＜1.5mg/dl)和適當(dāng)?shù)哪I功能(肌氨酸酐＜1.5mg/dl)。A.給藥途徑利用本發(fā)明的方法和組合物殺死細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤或組織以及反轉(zhuǎn)或降低腫瘤細(xì)胞惡性表型一般是通過使過度增殖的細(xì)胞與治療性化合物如多肽或編碼多肽的表達(dá)構(gòu)建體接觸。給藥途徑可根據(jù)損傷的部位及損傷的程度不同而不同，如真皮內(nèi)注射、透皮注射、胃腸外途徑、靜脈注射、肌肉注射、鼻內(nèi)給藥、皮下注射、局部給藥、經(jīng)皮注射、氣管內(nèi)給藥、腹腔注射、動(dòng)脈注射、膀胱內(nèi)給藥、瘤內(nèi)注射、吸入給藥、灌注、灌洗、直接注射或口服給藥及制劑為了改善血管疾病的治療效果，可以使血管細(xì)胞與治療性化合物接觸。與癌癥治療或診斷相關(guān)的任何制劑和給藥途徑都適用于血管疾病。對(duì)于不連續(xù)的易接近的實(shí)體瘤來說，采用瘤內(nèi)注射或注射到腫瘤血管內(nèi)的方式給藥是特別合適的。局部、區(qū)域或系統(tǒng)給藥也可以采用。對(duì)于＞4cm的腫瘤來說，注射的量約為4-10ml(優(yōu)選10ml)，而對(duì)于＜4cm的腫瘤來說，注射的量約為1-3ml(優(yōu)選3ml)。多點(diǎn)注射給藥時(shí)單次劑量包含約0.1-0.5ml的體積。對(duì)于病毒顆粒來說最好通過多點(diǎn)注射來給藥，點(diǎn)與點(diǎn)之間的間隔約1cm。在進(jìn)行手術(shù)干預(yù)的情況下，本發(fā)明可作為預(yù)處理措施使無法進(jìn)行手術(shù)的腫瘤變成可被切除的腫瘤。另外，本發(fā)明還可以在手術(shù)的時(shí)候和/或手術(shù)以后使用以治療殘存的或轉(zhuǎn)移的腫瘤。例如，被切除的腫瘤床可注射或灌注含痘病毒多肽或痘病毒的制劑，其中的痘病毒包含突變，該突變可使痘病毒能夠更有效地治療癌或癌細(xì)胞。灌注可在手術(shù)切除后持續(xù)進(jìn)行，例如通過在手術(shù)部位植入一個(gè)導(dǎo)管。本發(fā)明也包含周期性的術(shù)后治療措施。在合適的情況下可進(jìn)行連續(xù)給藥，例如當(dāng)腫瘤被切除后處理腫瘤床以去除殘存的微小腫瘤時(shí)。優(yōu)選通過注射器或?qū)Ч芙o藥。這種連續(xù)給藥可持續(xù)約1-2小時(shí)到2-6小時(shí)、約6-12小時(shí)、約12-24小時(shí)、約1-2天、約1-2周或更長(zhǎng)時(shí)間。一般來說，通過持續(xù)灌注方式所給予的治療性組合物的劑量與單點(diǎn)注射或多點(diǎn)注射所給予的劑量等價(jià)，并且在灌注期間可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。還需要說明的是四肢灌注方式也可用于注射本發(fā)明的治療性組合物，尤其是用于治療黑色素瘤和肉瘤時(shí)。治療方案可以不同，要根據(jù)腫瘤的類型、腫瘤的部位、疾病的進(jìn)展情況以及患者的健康狀況和年齡而定。顯然，某些類型的腫瘤需要更積極的治療措施，而同時(shí)某些患者可能無法耐受較繁重的治療過程。臨床醫(yī)生最適宜根據(jù)治療性制劑的效力和毒性(如果有)來作決定。在某些實(shí)施方案中，被處理的腫瘤可能是無法被切除的，或者至少最初是無法被切除的。通過治療性病毒構(gòu)建體的處理可能能夠提高腫瘤的可切除性，可能由于腫瘤的邊界發(fā)生皺縮，或者由于去除了腫瘤某些侵入的部分。經(jīng)過處理后就可能能夠切除了。切除后可進(jìn)一步采用其他處理措施來消除腫瘤部位殘存的微小腫瘤組織。處理原發(fā)腫瘤或切除后腫瘤床的過程通常包括多次注射。一般來說，治療原發(fā)腫瘤需要在2周內(nèi)注射6次。2周的治療方案可重復(fù)進(jìn)行1、2、3、4、5、6或更多次。在治療期間，需要對(duì)整個(gè)治療方案不斷進(jìn)行評(píng)價(jià)和調(diào)整。治療方案包括不同的“單位劑量”。單位劑量定義為預(yù)先確定的治療性組合物的量。藥物使用劑量、給藥途徑和劑型的選擇是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。單位劑量并不一定只通過一次注射來完成，也可以在一定的期間內(nèi)持續(xù)輸注。本發(fā)明的單位劑量為了方便用病毒構(gòu)建體的噬菌斑形成單位(pfu)來表示。另外，根據(jù)病毒種類及其可得到的滴度不同，可給予患者或患者的細(xì)胞1到100、10到50、100-1000、或者高達(dá)約1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、或1×1015或更多的有感染性的病毒顆粒(vp)。B.可注射的組合物和制劑本發(fā)明中將編碼全長(zhǎng)或部分痘病毒基因組的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到腫瘤或腫瘤細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)選方法是通過瘤內(nèi)注射。但是，本文所描述的藥用組合物也可以通過其他方式給藥，如胃腸外途徑、靜脈注射、真皮內(nèi)注射、肌肉注射、透真皮注射、甚至腹腔注射，如美國(guó)專利5,543,158、5,641,515和5,399,363所描述(本文都已完整納入作為參考)。核酸構(gòu)建體可用注射器或其他任何可注射溶液的方法注射，只要表達(dá)構(gòu)建體能夠通過特定孔徑的注射針頭就可以。最近所描述的一種無針注射系統(tǒng)(美國(guó)專利5,846,233)含有一個(gè)安裝在安瓿腔內(nèi)的噴嘴用于吸取溶液，一個(gè)動(dòng)力裝置用于將液體推出噴嘴轉(zhuǎn)移到注射部位。在基因治療中也可以用注射器系統(tǒng)將預(yù)先確定的精確量的溶液以任意深度注射到多個(gè)部位(美國(guó)專利5,846,225)?；钚曰衔锏挠坞x堿溶液或藥用鹽溶液可通過在水中與適宜的表面活性劑，如羥丙基纖維素混合而制備。分散劑可用甘油、液體聚乙烯甘油或其混合物、或油來制備。在普通儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑都要加入防腐劑以阻止微生物的生長(zhǎng)。適于注射的藥用制劑包括無菌水溶液或分散劑，以及在使用前可臨時(shí)制備成無菌注射溶液或分散劑的粉末(美國(guó)專利5,466,468，本文已完整納入作為參考)。無論何種情況，制劑都必須是無菌的，并且其流動(dòng)性要足以能夠通過注射器。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，并且要防止微生物，如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙烯甘油等)、上述物質(zhì)的適當(dāng)混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？梢酝ㄟ^包被，如卵磷脂，使顆粒在分散劑中保持所需的直徑以及通過使用表面活性劑使制劑維持合適的流動(dòng)性。可通過加入各種抗細(xì)菌和抗真菌物質(zhì)，如對(duì)羥基苯甲酸酯類(parabens)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等來防止微生物的生長(zhǎng)。在許多情況下，加入一些等滲物質(zhì)，如糖或氯化鈉是優(yōu)選的。可通過在組合物中加入吸收延遲物質(zhì)，如單硬脂酸鋁和明膠使可注射組合物的吸收緩慢。對(duì)于通過胃腸外途徑給藥的水溶液來說，如果需要溶液應(yīng)是緩沖的，液體稀釋劑應(yīng)首先用足量的鹽或糖調(diào)節(jié)成等滲的。這些水溶液特別適于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射和腹腔注射。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書的描述可以選擇應(yīng)用這種水溶液所需要的無菌水溶劑。例如，一個(gè)劑量的藥物可溶解到1ml等滲的氯化鈉溶液中，然后添加到1000ml皮下補(bǔ)液溶液中或注射到輸注的適當(dāng)部位(見“Remington’sPharmaceuticalSciences”，第15版，1035-1038頁和1570-1580頁)。要根據(jù)被治療的個(gè)體的情況來調(diào)整注射的劑量。不論在任何情況下都負(fù)責(zé)給藥的人來確定不同個(gè)體所需要的合適劑量。而且對(duì)于給人注射來說，制劑必須符合FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所制定的無菌、熱源、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。無菌注射液可通過使溶于合適溶劑中的所需量的活性化合物與上述各種其他組分混合、然后通過過濾除菌來制備。一般來說，分散劑可通過將各種無菌活性成分加入到含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需要的上述各種其他組分的無菌載體內(nèi)而制備。如果是用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，該技術(shù)可從上述過濾除菌的溶液中制備出活性成分和其他所需成分的粉末。本文所描述的組合物可制備成中性制劑和鹽制劑。藥用鹽包括酸加鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的鹽)，可用無機(jī)酸制備，如鹽酸和磷酸，也可以用有機(jī)酸制備，如乙酸、醋漿草酸、酒石酸、扁桃酸等。與游離羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣和氫氧化鐵，或者有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組胺、普如卡因等。制成制劑以后，溶液就可以以劑型相配的方式、以治療有效量注射。各種劑型都可以很容易地給藥，如可注射溶液、緩釋膠囊等。本文所用的術(shù)語“載體”包含各種溶劑、分散介質(zhì)、載體、包被物、稀釋劑、抗細(xì)菌和抗真菌藥物、等滲和吸收延遲物質(zhì)、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。利用這種介質(zhì)和試劑制備藥用活性物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。除了那些與活性組分不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑以外，其在治療性組合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明所涉及的。補(bǔ)充的活性組分也可以添加到組合物中。術(shù)語“藥用的”是指給人體注射以后不會(huì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)或類似不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有蛋白性活性組分的水性組合物的制備方法是本領(lǐng)域所熟知的。一般來說，這種組合物應(yīng)制備成可注射的溶液或懸液，或者在注射前可制備成溶液或懸液的固體形式。C.聯(lián)合治療本發(fā)明的化合物和方法可用于治療過度增殖性疾病，其中包括癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化。為了提高本發(fā)明的組合物，如減毒痘苗病毒的治療效率，這些組合物可與其他能有效治療這些疾病的藥物聯(lián)合使用。例如，腫瘤可用本發(fā)明的治療性化合物聯(lián)合其他的腫瘤治療措施來治療，如抗癌藥或手術(shù)。各種聯(lián)合治療措施都可以使用；例如，減毒痘病毒如痘苗病毒是“A”，第二種抗癌措施是“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A將本發(fā)明的治療性表達(dá)構(gòu)建體給予患者可按照第二種治療措施的通用方法進(jìn)行，并且需要考慮痘病毒治療措施的毒性。如果需要，可重復(fù)進(jìn)行幾個(gè)治療周期。還需要說明的是，各種標(biāo)準(zhǔn)的治療措施以及手術(shù)干預(yù)都可以和本文所描述的癌癥或腫瘤治療措施聯(lián)合使用。1.抗癌治療措施“抗癌”藥是對(duì)生物體內(nèi)的腫瘤能產(chǎn)生消極影響的藥物，如殺傷癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的調(diào)亡、降低癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)生或轉(zhuǎn)移的數(shù)目、縮小腫瘤、抑制腫瘤的生長(zhǎng)、減少腫瘤或癌細(xì)胞的血供、激發(fā)抗癌細(xì)胞或腫瘤的免疫反應(yīng)、阻止或抑制腫瘤的發(fā)展、或者延長(zhǎng)癌癥患者的生存期。抗癌藥包括生物藥(生物治療)、化療藥和放療藥。最常見的情況是這些組合物各以有效量聯(lián)合使用以殺傷或抑制細(xì)胞的增殖。這個(gè)過程包括細(xì)胞與表達(dá)構(gòu)建體和藥物或多個(gè)因子同時(shí)接觸。這可以通過使細(xì)胞與一種包含兩種藥物的組合物或藥用制劑接觸，或者使細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑同時(shí)接觸，其中一種組合物含表達(dá)構(gòu)建體，另一種組合物含第二藥物。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥和放療藥耐受是臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域遇到的一個(gè)主要問題。目前癌癥研究的一個(gè)目標(biāo)就是通過結(jié)合基因治療找到提高化療和放療療效的方法。例如，單純皰疹病毒-胸苷激酶(HS-tK)基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到腦腫瘤內(nèi)后可成功地誘導(dǎo)出腫瘤對(duì)抗病毒藥物更昔洛韋的敏感性(Culver等，1992)。在本發(fā)明中，除了其他一些前調(diào)亡調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之外，痘病毒治療同樣可聯(lián)合化療、放療、免疫治療以及其他生物干預(yù)措施。另外，基因治療可在其他藥物治療前或治療后數(shù)分鐘到數(shù)周內(nèi)進(jìn)行。在其他藥物和表達(dá)構(gòu)建體分別給予細(xì)胞的實(shí)施方案中，兩種治療措施實(shí)施的時(shí)間間隔一般不能太長(zhǎng)，這樣才能保證藥物和表達(dá)構(gòu)建體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在這種情況下，兩種治療措施最好在約12-24小時(shí)內(nèi)分別給予細(xì)胞，更優(yōu)選的是在6到12小時(shí)內(nèi)。但是在某些情況下，人們希望將治療的間隔時(shí)間延長(zhǎng)，比如不同的治療措施之間間隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)到數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。a.化療癌癥的治療措施還包括與化療和放療聯(lián)合的各種治療措施。例如，聯(lián)合化療包括順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合藥、紫杉醇、吉西他濱、新霉酰胺、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、氨甲蝶呤、Temazolomide(DTIC的液態(tài)形似)、或上述藥物的類似物或衍生物?；熕幣c生物治療聯(lián)合被稱為生物化療。b.放療可引起DNA損傷并被廣泛應(yīng)用的其他因素包括大家所熟知的射線、X射線和/或直接給予腫瘤細(xì)胞放射性同位素。本發(fā)明涉及的其他形式的DNA損傷因子還包括微波和紫外線輻射。最可能的情況是所有這些因子都可以對(duì)DNA、DNA的前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)、染色體的裝配和維持造成廣泛的損傷。X射線的使用劑量范圍為每日50-200倫琴持續(xù)一段時(shí)間(3到4周)到單次劑量2000-6000倫琴。放射性同位素的劑量使用范圍很寬，要根據(jù)放射性同位素的半衰期、所激發(fā)的輻射的強(qiáng)度和類型以及腫瘤細(xì)胞的攝取量而定。術(shù)語“接觸”和“暴露于”在本文中用于細(xì)胞時(shí)是指治療性構(gòu)建體和化療或放療藥轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或者與靶細(xì)胞直接并排放置的過程。為了達(dá)到殺死細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，兩種治療措施都要以有效量給予細(xì)胞以便于殺死細(xì)胞或阻止其分裂。c.免疫治療一般來說，免疫治療依賴于利用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子靶向并摧毀癌細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)因子可以是腫瘤細(xì)胞表面某些標(biāo)記物特異性的抗體?？贵w本身可以單獨(dú)作為治療效應(yīng)因子或者可以激活其他細(xì)胞來影響細(xì)胞的殺傷?？贵w也可以被連接到藥物或毒素(化療藥物、放射性核苷酸、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)上，只作為一種靶向性藥物。另外，效應(yīng)因子可以是攜帶能與腫瘤細(xì)胞靶位直接或間接相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞。聯(lián)合治療，即直接的細(xì)胞毒活性和某種痘病毒多肽的抑制或降低活性可以為癌癥的治療提供有益的幫助。免疫治療還可以作為聯(lián)合治療的一部分。聯(lián)合治療的常用方法將在下面討論。在免疫治療的一個(gè)方面，腫瘤細(xì)胞必須攜帶可作為靶位的某種標(biāo)記，即在其他大多數(shù)細(xì)胞上不存在的標(biāo)記。腫瘤細(xì)胞上存在多種標(biāo)記物，這些標(biāo)記物都可以作為本發(fā)明的適宜靶位。常見的腫瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿系統(tǒng)腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erbB和p155。免疫治療的另一個(gè)方面涉及利用免疫刺激效應(yīng)產(chǎn)生抗癌效應(yīng)。免疫刺激分子包括細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、IFNγ，趨化因子如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生長(zhǎng)因子如FLT3配基。聯(lián)合使用免疫刺激分子，無論是以蛋白的形式，還是腫瘤抑制因子如mda-7的基因轉(zhuǎn)移，都可以增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)(Ju等，2000)。正如以前所討論的，目前正在研究或正在應(yīng)用的免疫治療措施有免疫佐劑(如牛型結(jié)核菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國(guó)專利5,801,005；美國(guó)專利5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)、細(xì)胞因子治療(如干擾素α、β和γ；IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)、基因治療(如TNF，IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美國(guó)專利5,830,880和5,846,945)以及單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，抗HER-2，抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國(guó)專利5,824,311)。赫賽汀(Herceptin)(曲妥單抗)是一種嵌合的(鼠-人)單克隆抗體，能夠阻斷HER2-neu受體。它具有抗腫瘤活性，已被批準(zhǔn)用于治療惡性腫瘤(Dillman，1999)。赫賽汀和化療藥物聯(lián)合治療癌癥已被證明比單獨(dú)的治療措施更有效。因此，本發(fā)明涉及利用一種或多種抗癌治療措施與本文所描述的痘病毒相關(guān)治療方法聯(lián)合使用以治療腫瘤的方法。i)被動(dòng)免疫治療現(xiàn)在已經(jīng)有許多治療癌癥的被動(dòng)免疫療法。大致可以分為以下幾類單獨(dú)注射抗體；注射連接有毒素或化療藥的抗體；注射連接有放射性同位素的抗體；注射抗獨(dú)特型抗體；以及凈化骨髓中的腫瘤細(xì)胞。被動(dòng)免疫治療優(yōu)選人源單克隆抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨颊唧w內(nèi)的毒副作用很低或沒有。但是，這樣的抗體很少，并且到目前為止只適用于瘤內(nèi)注射，因此其應(yīng)用受到限制?？股窠?jīng)節(jié)苷脂抗原的人源單克隆抗體已被用于注射到再發(fā)的皮膚黑色素瘤患者的腫瘤內(nèi)(Irie和Morton，1986)。經(jīng)過每日或每周的瘤內(nèi)注射后，10位患者中有6位患者的腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。在另外的試驗(yàn)中，通過瘤內(nèi)注射兩種人源單克隆抗體獲得了中等程度的療效(Irie等，1989)。較好的是注射一種以上的抗兩種不同抗原的單克隆抗體，甚至多種抗原的抗體。治療方法還包括給予淋巴因子或其他免疫增強(qiáng)劑，如Bajorin等，(1988)的描述。有關(guān)人源單克隆抗體的研究進(jìn)展會(huì)在本說明書的其他部分作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。ii)主動(dòng)免疫治療主動(dòng)免疫治療注射的是抗原性肽、多肽或蛋白質(zhì)，或者自身的或同種異體的腫瘤細(xì)胞組合物或“疫苗”，一般需要和不同的細(xì)菌佐劑聯(lián)合使用(Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。對(duì)于黑色素瘤的免疫治療來說，那些激發(fā)出高滴度IgM反應(yīng)的患者通常比未激發(fā)出或激發(fā)的IgM抗體滴度比較低的患者生存率更高(Morton等，1992)。IgM抗體一般都是瞬時(shí)抗體，但是抗神經(jīng)節(jié)苷脂和抗糖類的抗體好像是例外。iii)獲得性免疫治療獲得性免疫治療是指在體外分離出患者血液中的淋巴細(xì)胞或腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞，在體外用淋巴因子如IL-2活化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤壞死基因，然后再輸注到患者體內(nèi)(Rosenberg等，1988；1989)。為達(dá)到這個(gè)目的，需要給動(dòng)物或患者注射免疫有效量的活化的淋巴細(xì)胞和本文所描述的含佐劑的抗原肽組合物?；罨牧馨图?xì)胞最好是患者自身的易于從血液或腫瘤標(biāo)本中分離并在體外被活化(或“擴(kuò)增”)的細(xì)胞。這種形式的免疫治療已對(duì)幾例黑色素瘤和腎癌產(chǎn)生了抑制作用，但是發(fā)生反應(yīng)的患者比未發(fā)生反應(yīng)的患者明顯要少。d.基因在另外一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療措施是基因治療，其中治療性多核苷酸在注射減毒痘病毒之前、之后或同時(shí)注射。痘病毒與編碼下列基因產(chǎn)物之一的載體一起轉(zhuǎn)移可對(duì)靶組織產(chǎn)生聯(lián)合的抗癌效應(yīng)。另外，痘病毒可改造成含治療性多核苷酸的病毒載體。本發(fā)明包含多種蛋白質(zhì)，其中一些將在下文描述。表7列舉了本發(fā)明所涉及的可作為基因治療靶位的各種基因。i)細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)根據(jù)功能的不同可分為不同的類型。這些蛋白質(zhì)的一個(gè)共同點(diǎn)就是其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的能力。例如，一種形式的PDGF，sis癌基因，就是一種分泌型的生長(zhǎng)因子。癌基因很少來源于編碼生長(zhǎng)因子的基因，到目前為止，sis是唯一已知的天然癌基因生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種特殊的細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子的反義mRNA被用于阻止該細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子的表達(dá)。蛋白質(zhì)FMS、ErbA、ErbB和neu是生長(zhǎng)因子受體。這些受體的突變可導(dǎo)致其調(diào)節(jié)功能的喪失。例如，Neu受體蛋白跨膜區(qū)的一個(gè)點(diǎn)突變可導(dǎo)致neu癌基因的產(chǎn)生。ErbA癌基因來源于甲狀腺激素的胞內(nèi)受體。被修飾的癌基因ErbA受體被認(rèn)為可與內(nèi)源性的甲狀腺激素受體競(jìng)爭(zhēng)，引起增殖失控。最大的一類癌基因包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(如Src、Abl和Ras)。Src蛋白是胞漿蛋白酪氨酸激酶，在某些情況下它可以從原癌基因轉(zhuǎn)化成癌基因，這是其酪氨酸殘基527突變的結(jié)果。相反，在一個(gè)例子中，GTP酶蛋白ras從原癌基因轉(zhuǎn)化成癌基因是其序列上的12位氨基酸從纈氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸的結(jié)果，這種突變可導(dǎo)致ras的GTP酶活性下降。蛋白Jun、Fos和Myc可作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)核功能直接產(chǎn)生影響。ii)細(xì)胞增殖的抑制因子腫瘤抑制癌基因的功能是抑制過度的細(xì)胞增殖。這些基因的滅活可使其抑制活性喪失，結(jié)果導(dǎo)致增殖失控。下面將要描述腫瘤抑制因子p53、p16和C-CAM。除了上面所描述的p53之外，另外一個(gè)細(xì)胞增殖抑制因子是p16。真核細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換主要被細(xì)胞周期素依賴的激酶或CDK激發(fā)。一種CDK，細(xì)胞周期素依賴的激酶4(CDK4)可調(diào)節(jié)細(xì)胞通過G1期。這個(gè)酶的活性可在G1晚期使Rb磷酸化。CDK4的活性受活化亞單位-D型周期素和抑制亞單位-p16INK4的調(diào)節(jié)，這兩個(gè)亞單位是能夠特異性結(jié)合并抑制CDK的蛋白質(zhì)，因此可以調(diào)節(jié)Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16INK4蛋白是CDK4的抑制因子(Serrano，1993)，因此這個(gè)基因的缺失可使CDK的活性升高，導(dǎo)致Rb蛋白的過度磷酸化。已知p16還可以調(diào)節(jié)CDK6的功能。p16INK4屬于新發(fā)現(xiàn)的一類CDK-蛋白，該類CDK蛋白還包括p16B、p19、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因位于染色體上的9p21區(qū)，這是一個(gè)多種類型的腫瘤經(jīng)常發(fā)生缺失的染色體區(qū)。p16INK4基因在人源腫瘤細(xì)胞系中常常發(fā)生純合的缺失和突變。這些現(xiàn)象說明p16INK4基因是一種腫瘤抑制基因。但是這種解釋受到了挑戰(zhàn)，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到p16INK4基因在原發(fā)的未經(jīng)培養(yǎng)的腫瘤中發(fā)生突變的幾率比培養(yǎng)的細(xì)胞要低的多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1994；Orlow等，1994；Arap等，1995)。通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)載體恢復(fù)野生型p16INK4的功能可降低某些人源癌細(xì)胞系的克隆形成能力(Okamoto，1994；Arap、1995)?？捎糜诒景l(fā)明的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合蛋白、p21/p27融合蛋白、抗血栓基因(如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、參與血管形成的基因(如VEGF、FGF、血小板凝血酶敏感蛋白、BAI-1、GDAIF或其受體)和MCC。iii)細(xì)胞調(diào)亡調(diào)節(jié)因子調(diào)亡或程序性細(xì)胞死亡是正常胚胎發(fā)育、維持成年組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、以及抑制腫瘤形成的一個(gè)基本過程(Kerr等，1972)。Bcl-2家族的蛋白和ICE樣蛋白酶已被證明在其他系統(tǒng)中是重要的調(diào)節(jié)因子和調(diào)亡效應(yīng)因子。Bcl-2蛋白是一種與濾泡淋巴瘤有關(guān)的蛋白，在受到不同調(diào)亡刺激信號(hào)后在控制調(diào)亡和增加細(xì)胞的存活中扮演主要角色(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)?，F(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到進(jìn)化保守的Bcl-2蛋白是相關(guān)蛋白家族的一個(gè)成員，這個(gè)家族可被分類為死亡激動(dòng)劑或死亡拮抗劑。Bcl-2被發(fā)現(xiàn)以后被證明可抑制各種刺激信號(hào)所激發(fā)的細(xì)胞死亡?，F(xiàn)在已經(jīng)清楚Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白家族具有相似的結(jié)構(gòu)和序列同源性。這個(gè)家族的不同成員或者具有與Bcl-2相同的功能(如BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者與Bcl-2的功能相反，可促進(jìn)細(xì)胞的死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。e.手術(shù)大約60％的癌癥患者都做過不同類型的手術(shù)，其中包括為了預(yù)防、診斷或分期、治愈和緩解的目的而進(jìn)行的手術(shù)。以治愈為目的的手術(shù)可結(jié)合其他治療措施，如本發(fā)明的治療措施、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他治療方法。以治愈為目的的手術(shù)包括切除腫瘤，其中癌組織的全部或部分被物理去除、切掉和/或毀壞。腫瘤切除是指通過物理方法至少去除腫瘤的一部分。除了切除腫瘤以外，手術(shù)治療措施還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電手術(shù)和顯微手術(shù)(Mohs手術(shù))。本發(fā)明還可用于配合淺表癌、癌前病變或少量正常組織的去除。全部或部分癌細(xì)胞、癌組織或腫瘤被切除以后，在體內(nèi)可能會(huì)形成空腔。本發(fā)明的治療措施可通過灌注、直接注射或局部使用來實(shí)施，并配合以其他的抗癌治療措施。這種治療措施可重復(fù)進(jìn)行，如每1、2、3、4、5、6或7天、每1、2、3、4和5周、每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月進(jìn)行一次。這種治療措施還可以選擇不同劑量。f.其他因子其他因子也可與本發(fā)明聯(lián)合使用以改善治療的效果。這些因子包括免疫調(diào)節(jié)因子、影響細(xì)胞表面受體和GAP連接表達(dá)上調(diào)的因子、細(xì)胞增殖抑制和分化因子、細(xì)胞粘附抑制因子、增加過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡誘導(dǎo)因子敏感性的因子以及其他生物因子。免疫調(diào)節(jié)因子包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β和γ；IL-2及其他細(xì)胞因子；F42K及其他細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES及其他趨化因子。細(xì)胞表面受體或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配基)的表達(dá)上調(diào)可通過其對(duì)過度增殖細(xì)胞的自分泌或旁分泌效應(yīng)提高本發(fā)明的調(diào)亡誘導(dǎo)能力。提高增加GAP連接的數(shù)目增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)水平可提高對(duì)臨近過度增殖細(xì)胞群的抗過度增殖效應(yīng)。在其他的實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖抑制和分化因子可與本發(fā)明聯(lián)合使用以改善本發(fā)明的抗過度增殖效應(yīng)。細(xì)胞粘附抑制因子也可以提高本發(fā)明的療效。細(xì)胞粘附抑制因子的例子有病灶粘附激酶(FAK)抑制因子和洛伐他汀。本發(fā)明還包括能提高過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡的敏感性的其他因子，如抗體c225，這些因子也可與本發(fā)明聯(lián)合以改善治療的效果。Apo2配基(Apo2L，也叫TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)細(xì)胞因子家族的一個(gè)成員。TRAIL可激活多種類型的癌細(xì)胞發(fā)生快速調(diào)亡，但是對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。各種組織中都有TRAILmRNA。大多數(shù)正常細(xì)胞對(duì)TRAIL的細(xì)胞毒活性耐受，說明存在保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生TRAIL誘導(dǎo)的調(diào)亡的機(jī)制。TRAIL的第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的受體被稱為死亡受體4(DR4)，含有胞漿“死亡域”；DR4可轉(zhuǎn)導(dǎo)TRAIL攜帶的調(diào)亡信號(hào)。其他可結(jié)合TRAIL的受體也被鑒定出來。其中一個(gè)受體被稱為DR5，含有一個(gè)與DR4非常相似的死亡域和調(diào)亡信號(hào)。DR4和DR5mRNA在多種正常組織和腫瘤細(xì)胞系內(nèi)都有表達(dá)。最近，誘騙受體如DcR1和DcR2被證明可通過DR4和DR5阻止TRAIL誘導(dǎo)的調(diào)亡。因此，這些誘騙受體代表了一種新型的對(duì)前調(diào)亡細(xì)胞因子在細(xì)胞表面的直接調(diào)節(jié)敏感性的機(jī)制。這些抑制性受體在正常組織內(nèi)優(yōu)先表達(dá)說明TRAIL可作為抑制抗癌因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞的調(diào)亡，而對(duì)正常細(xì)胞起保護(hù)作用(Marsters等，1999)。利用細(xì)胞毒性化療藥物進(jìn)行腫瘤的治療取得了很多成功，但是，化療的后果之一就是藥物耐藥表型的出現(xiàn)/獲得以及多藥耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)依然是治療這類腫瘤所遇到的主要問題，因此需要采用其他的方法，如基因治療?？膳c化療、放療或生物治療聯(lián)合應(yīng)用的其他治療措施包括溫?zé)岑煼?，該方法是將患者的組織置于高溫下(可達(dá)106°F)。外部或內(nèi)部發(fā)熱裝置可用于局部、區(qū)域或全身溫?zé)嶂委煛＞植繙責(zé)嶂委熓侵钢粚?duì)一個(gè)小的區(qū)域加熱，如腫瘤部位。外部加熱通常是通過體外的裝置發(fā)射高頻微波靶向到腫瘤。內(nèi)部加熱是利用一個(gè)無菌的探針，如一個(gè)細(xì)的熱金屬絲或充滿熱水的中空細(xì)管、植入的微波天線或射頻電極?；颊叩钠鞴倩蛩闹杀患訜嵋赃M(jìn)行區(qū)域治療，該療法利用能產(chǎn)生高能量的裝置進(jìn)行，如磁體。另外，可以抽出患者的一部分血液，加熱后再輸注到能內(nèi)部加熱的區(qū)域。全身溫?zé)岑煼ㄔ诎U(kuò)散到全身的情況下也可以使用。熱水套、熱蠟、感應(yīng)線圈和熱房可用于此目的。激素療法也可與本發(fā)明或上述其他癌癥治療措施聯(lián)合使用。激素可被用于降低某些激素的表達(dá)水平或阻斷某些激素的效應(yīng)以治療某些類型的腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌。這種療法通常與至少一種其他治療措施聯(lián)合使用，作為輔助治療措施或降低轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。表6癌基因?qū)嵤├旅娴膶?shí)施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)該知道，下面實(shí)施例中所描述的技術(shù)代表了發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，它們?cè)诒景l(fā)明的實(shí)踐中發(fā)揮了很好的作用，因此被認(rèn)為構(gòu)成了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施模式。但是，本領(lǐng)域的那些熟練技術(shù)人員根據(jù)本說明書可以對(duì)本文所描述的特定實(shí)施方案作出修改，只要不脫離本發(fā)明的精神和范圍一樣可以得到類似的或相同的結(jié)果。實(shí)施例1痘苗病毒在細(xì)胞系內(nèi)的擴(kuò)增本實(shí)施例評(píng)價(jià)了含16種不同常規(guī)痘苗病毒實(shí)驗(yàn)室株/突變株(和兔痘病毒及其他痘病毒)的一組病毒Copenhagen、Dairen、Evans、USSR、Tashkent、TianTan、WR、IHD-J、IHD-W、Lister、NYCBOH、Patwadangar、King和WR突變株B8R、B18R、B13R。評(píng)價(jià)了這些病毒株在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力。優(yōu)選的病毒應(yīng)該是在癌細(xì)胞內(nèi)相對(duì)高復(fù)制而在正常細(xì)胞內(nèi)弱復(fù)制的病毒(即在腫瘤和正常細(xì)胞之間有較大的治療比或指數(shù))。共檢測(cè)了兩個(gè)人源腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)2780結(jié)腸癌細(xì)胞系和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所)。正常細(xì)胞包括正常的人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)。為了測(cè)定病毒的細(xì)胞致病效應(yīng)，使增殖的細(xì)胞生長(zhǎng)到70％匯合時(shí)(含2％FBS的DMEM)轉(zhuǎn)染0.001到10感染單位(MOI)的病毒。5到6天后培養(yǎng)皿用MTT(Promega)染色，然后測(cè)定吸光度值。正常細(xì)胞在生長(zhǎng)到完全匯合后使其停止增殖，隨后用含0.2％FBS的DMEM培養(yǎng)。通過細(xì)胞周期分析和細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定增殖是否停止。每個(gè)樣品測(cè)定4次，試驗(yàn)至少重復(fù)兩次。在病毒復(fù)制試驗(yàn)中，細(xì)胞生長(zhǎng)(37℃、5％CO2、含2％FBS、NHBE細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DMEM，如Heise等，(2000)所描述)到70％匯合后用1或10感染單位(MOI，每個(gè)細(xì)胞感染的病毒量)的病毒感染。在培養(yǎng)基中孵育3小時(shí)后換液。48小時(shí)后(以前的數(shù)據(jù)表明痘苗病毒的復(fù)制在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值)收獲細(xì)胞和上清用于病毒滴度分析。經(jīng)3輪冷凍和融解后獲得細(xì)胞裂解物，隨后在超聲/水浴中進(jìn)行30秒的脈沖。然后通過蔗糖墊純化病毒，上清液和裂解物的系列稀釋物用BSC-1細(xì)胞測(cè)定病毒的滴度(純化和滴度測(cè)定方法見Alcami和Smith(1995)的描述)。典型的結(jié)果顯示在圖1-4中。痘苗病毒Copenhagen株在兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系內(nèi)的復(fù)制水平都等于或超過本試驗(yàn)中的其他所有病毒(圖1A和1B；y-軸代表噬菌斑形成單位/ml+/-S.E.)。相反，在正常人源細(xì)胞中Copenhagen株的毒力比其他病毒都弱(圖2)。最后，所有病毒在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)爆發(fā)的比值顯示在圖3(A2780NHBE)和圖4(HCT116NHBE)中。Copenhagen株在A2780(P＜0.001)和HCT116(p＜0.001)中的爆發(fā)比例都明顯升高。Copenhagen株在兩株細(xì)胞內(nèi)的爆發(fā)比例分別約為20,000和30,000，而其他病毒的爆發(fā)比例都低于5000，最少的低于2000(如Lister和Wyeth株)。同樣，體外細(xì)胞致病效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)Copenhagen對(duì)A2780和HCT116的腫瘤細(xì)胞殺傷活性明顯高于或等于Lister株和NYCBOH株。實(shí)施例2痘苗病毒/紫杉醇聯(lián)合治療雖然有些病毒如腺病毒和HSV已被用于和化療藥聯(lián)用，但是痘苗病毒還沒有進(jìn)行過這樣的試驗(yàn)(包括Copenhagen株)。痘苗病毒經(jīng)改造后表達(dá)前藥活化酶(如胸苷激酶)，與相對(duì)無毒的前藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可通過前藥活化基因產(chǎn)物活化前藥而使其變成有毒性的藥物(Puhlmann等，2000)。被批準(zhǔn)用于治療癌癥患者的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒化療藥物與痘苗病毒之間的協(xié)同作用是痘病毒，包括痘苗病毒和特異性的Copenhagen株的一個(gè)優(yōu)越特性。紫杉醇(a.k.a.紫杉醇)在美國(guó)和歐洲已被批準(zhǔn)用于治療癌癥患者。痘苗病毒Copenhagen株與紫杉醇聯(lián)合處理HCT116和LNCaP癌細(xì)胞系。等效線圖解法作圖和分析結(jié)果表明痘苗病毒和紫杉醇有協(xié)同效應(yīng)(圖5)。等效線圖解結(jié)果得自MTS試驗(yàn)數(shù)據(jù)，如CellTiter96Aqueous非放射性的細(xì)胞增殖分析(Catalog#G5421，PromegaCorp.，Madison，WI)，如圖6、7、8和9中所顯示的細(xì)胞存活率。如果沒有協(xié)調(diào)效應(yīng)，也沒有拮抗作用，圖5中所有的數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于代表數(shù)據(jù)點(diǎn)預(yù)期位置的線以下，因此這些數(shù)據(jù)點(diǎn)說明了痘苗病毒和紫杉醇對(duì)這些癌細(xì)胞系殺傷作用的協(xié)同效應(yīng)。本方法包括在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為5％CO2、37°、含10％FCS的DMEM。細(xì)胞生長(zhǎng)到約50％匯合時(shí)用含2％FCS的DMEM換液，然后用紫杉醇(劑量范圍為3×10-8到3×104nM，對(duì)數(shù)增量)和/或病毒(VVCopenhagen株，MOI為每個(gè)細(xì)胞10-6到105病毒顆粒)處理。細(xì)胞分為四組，分別用1)空白處理，2)只用病毒處理，3)只用紫杉醇處理，4)病毒處理后再用紫杉醇處理。細(xì)胞共感染6天，然后進(jìn)行MTS分析(Promega，WI，USA，參見廠家的說明書)。細(xì)胞用紫杉醇共處理6天，然后進(jìn)行MTS分析(參見廠家的說明書)。進(jìn)行聯(lián)合處理的細(xì)胞感染病毒的方式與病毒單獨(dú)處理組一樣，然后立刻再用紫杉醇處理(固定比例的病毒紫杉醇)。然后按照上述方法分析細(xì)胞。MTS細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)表示為對(duì)照細(xì)胞存活率的百分比，如圖6、7、8和9中所示。協(xié)同效應(yīng)評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)分析方法(等效線圖解法作圖和分析)見Nielsen等(1997、1998)的描述。簡(jiǎn)言之，制作劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞系(與未處理細(xì)胞比較)每個(gè)細(xì)胞(即，以及所有的試驗(yàn)條件)的EC50值。每種藥物檢測(cè)9個(gè)濃度(見上)，單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。每個(gè)試驗(yàn)包括VV/紫杉醇的4個(gè)不同稀釋比例(3、33、333、3333)。制作等效線圖以確定是否存在協(xié)調(diào)效應(yīng)或拮抗作用。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)重復(fù)的樣品。實(shí)施例3痘苗病毒注射導(dǎo)致的腫瘤抑制在C57B/6小鼠腹側(cè)皮下注射懸浮于100μlPBS中的5×105CMT-64細(xì)胞或106CMT-93細(xì)胞使其形成小鼠皮下腫瘤異種移植物。在第一組試驗(yàn)中，攜帶B8R和B18R突變的WR株痘苗病毒注射到具有免疫力的C57/B6小鼠腹側(cè)皮下CMT-93腫瘤內(nèi)(估計(jì)基線腫瘤大小為40-100μl)，劑量為104到108病毒顆粒，懸浮于40μl液體中，分別于1、3和5天注射。在腫瘤的中心刺一個(gè)針孔，在腫瘤的四個(gè)象限中分別刺出一個(gè)針孔。當(dāng)針頭退出時(shí)約有1/4的液體進(jìn)入到每個(gè)針孔內(nèi)。對(duì)照組用補(bǔ)骨脂素-UV滅活的病毒和PBS處理，處理方式與治療組一樣。每?jī)芍軠y(cè)量一次腫瘤的大小，得到二維數(shù)據(jù)，腫瘤的體積用如下公式計(jì)算(長(zhǎng))×(寬)×(寬)×(3.14/6)。通過與注射溶劑和滅活病毒的對(duì)照組腫瘤相比可以發(fā)現(xiàn)治療組出現(xiàn)了明顯的抗腫瘤效應(yīng)，生存期延長(zhǎng)，并且可以觀察到劑量-效應(yīng)關(guān)系。10只用108和1010B8R突變VV處理的小鼠中有8只的腫瘤被完全抑制，在整個(gè)試驗(yàn)過程中處于無瘤狀態(tài)(共3個(gè)月)。10只接收相同劑量B18R注射的小鼠中有9只的腫瘤被完全抑制，在同樣的試驗(yàn)周期內(nèi)處于無瘤狀態(tài)。而在對(duì)照組中只有1只小鼠的腫瘤被完全抑制。平均生存期為2周，處理后24天處死所有的小鼠。108到1010顆粒治療組的小鼠生存期明顯延長(zhǎng)(KM生存期分析；時(shí)序檢驗(yàn)；p＜0.01)。觀察動(dòng)物的總體狀況(如活動(dòng)情況，皮毛起皺情況)，每周稱重2次；結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯的體重變化或總體狀況改變。然后在CMT-64鼠腫瘤異種移植模型上利用B18R和對(duì)照溶劑實(shí)施相同的處理/注射方案。雖然沒有觀察到完全的反應(yīng)，但是由于腫瘤生長(zhǎng)而需要處死動(dòng)物所需的延遲時(shí)間，在B18R處理組和補(bǔ)骨脂素-UV滅活病毒組之間有顯著差異(平均值約為2周對(duì)4周；p＜0.05，時(shí)序檢驗(yàn)，Kaplan-Meier分析由于腫瘤生長(zhǎng)而需要處死動(dòng)物的時(shí)間)。實(shí)施例4有關(guān)鼠腫瘤異種移植物的EEV-增強(qiáng)效應(yīng)在具有免疫力的BALB/c小鼠腹側(cè)皮下注射懸浮于100μlPBS中的5×105JC鼠乳腺癌細(xì)胞使其形成小鼠皮下腫瘤異種移植物。腫瘤一旦達(dá)到可注射的尺寸(基線腫瘤大小40-100μl)，就將WesternReserve(無IHD-J突變的WR)VV、IHD-J突變的WR(A34R/K151D突變)病毒或PBS注射到皮下JC腫瘤內(nèi)。病毒劑量為每天1010病毒顆粒，懸浮于40μlPBS中，分別于1、3和5天注射(每個(gè)治療組含8只小鼠)。PBS對(duì)照組用相同的方式處理。在腫瘤的中心刺一個(gè)針孔，在腫瘤的四個(gè)象限中分別刺出一個(gè)針孔。當(dāng)針頭退出時(shí)約有1/4的液體進(jìn)入到每個(gè)針孔內(nèi)。對(duì)照組用PBS處理，處理方式與治療組一樣。每?jī)芍軠y(cè)量一次腫瘤的大小，得到二維數(shù)據(jù)，腫瘤的體積用如下公式計(jì)算(長(zhǎng))×(寬)×(寬)×(3.14/6)。與PBS處理組和WesternReserve處理組相比，IHD-J處理組出現(xiàn)了明顯的抗腫瘤效應(yīng)(腫瘤生長(zhǎng)延遲和腫瘤縮小)，由于腫瘤生長(zhǎng)而需要處死動(dòng)物的時(shí)間(即生存期)明顯延長(zhǎng)。根據(jù)Kaplan-Meier生存期分析，通過時(shí)序檢驗(yàn)(用于比較存活曲線)發(fā)現(xiàn)，IHD-J組由于腫瘤生長(zhǎng)而需要處死動(dòng)物的時(shí)間(生存期)比PBS(p＜0.05)和WR(p＜0.05)組明顯延長(zhǎng)。兩個(gè)對(duì)照組的平均存活時(shí)間為2周，而IHD-J組的平均存活時(shí)間為4.5周。治療組內(nèi)的所有小鼠都未出現(xiàn)明顯的系統(tǒng)毒性反應(yīng)，也沒有動(dòng)物因處理而死亡。IHD-J突變可顯著提高抗腫瘤效應(yīng)(與無IHD-J突變的WR病毒相比)，并且毒性效應(yīng)沒有升高。腫瘤可在皮下生長(zhǎng)，長(zhǎng)到直徑2-6mm時(shí)可開始處理。實(shí)施例5干擾素-結(jié)合基因的缺失及對(duì)IFN耐受性癌細(xì)胞的特異性相對(duì)于正常細(xì)胞有提高利用試驗(yàn)來分析缺失干擾素(IFN)結(jié)合基因的痘病毒與野生型對(duì)照痘病毒相比是否具有更高的腫瘤特異性，在正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力是否減弱。比較WR(WesternReserve)和B18R基因(B18R)缺失的WR突變株在存在或缺少IFN-α(1,000單位/ml，體外感染后5小時(shí)加入)的情況下的復(fù)制情況(圖10)。試驗(yàn)細(xì)胞為正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE，CloneticsCorp.，USA)、C33A人宮頸癌細(xì)胞(ATCC)和HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞(ATCC)。在預(yù)試驗(yàn)中，這些細(xì)胞在病毒感染前用IFN(5,000單位/ml)預(yù)處理24小時(shí)以確定其對(duì)干擾素抗病毒復(fù)制效應(yīng)的敏感性。和預(yù)想的一樣，兩種病毒對(duì)干擾素預(yù)處理抑制效應(yīng)的敏感性是一樣的。NHBE和HCT116細(xì)胞是干擾素敏感性的，因?yàn)镮FN預(yù)處理后病毒的復(fù)制明顯減少；C33A細(xì)胞是干擾素耐受性的，因?yàn)镮FN預(yù)處理對(duì)病毒的復(fù)制沒有明顯影響。癌細(xì)胞用含10％FCS的DMEM培養(yǎng)；正常細(xì)胞用廠商說明書描述的含血清添加物的DMEM培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70％匯合時(shí)，每個(gè)細(xì)胞用10病毒感染單位(moi)的病毒感染。感染后5小時(shí)，IFN或者以1,000單位/ml的濃度添加到培養(yǎng)基中(添加IFN的細(xì)胞)，或者不添加IFN(不添加IFN的細(xì)胞)。感染后48小時(shí)收獲細(xì)胞及其裂解物，然后分離痘苗病毒病測(cè)定病毒的滴度(噬菌斑形成單位的確定)(用BS-C-1細(xì)胞測(cè)定滴度，如Tscharke等，2002所描述，本文已納入作為參考)。如圖10所示，在IFN存在的情況下，含有B18R突變的痘苗病毒在兩株IFN敏感細(xì)胞，包括NHBE，內(nèi)的復(fù)制被明顯抑制(p＜0.01，斯氏t-檢驗(yàn)，與不含IFN的相比)。相反，這個(gè)突變病毒在IFN耐受C33A癌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制不被抑制。正如所預(yù)料的，野生型WR不受IFN處理的影響，因?yàn)樵摬《灸墚a(chǎn)生功能性B18R基因產(chǎn)物(P＝0.8)。利用其他的IFN耐受癌細(xì)胞系可得到相似的結(jié)果。因此，與野生型病毒相比，IFN結(jié)合基因B18R的缺失可導(dǎo)致治療指數(shù)的增加，保護(hù)正常細(xì)胞不受損傷。在鼠腫瘤異種移植模型上也證明了B8R和B18R上的IFN結(jié)合突變可產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。由B18R和/或B8R缺失導(dǎo)致的相對(duì)安全性的提高在小鼠體內(nèi)是被低估的，因?yàn)槭蟮陌蠭FN分子的親和力顯著降低(Symons等，2002)。其他一些試驗(yàn)是在兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的，注射方式為真皮內(nèi)注射，方法見Symons等的描述，所得到的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的兔試驗(yàn)結(jié)果一致(與野生型對(duì)照病毒相比，B8R突變的痘苗病毒可增加炎癥細(xì)胞的積聚，從而可以加速病毒從皮膚損傷部位的清除)。因此，抗腫瘤效應(yīng)和從正常細(xì)胞加速病毒清除的效應(yīng)在體外和體內(nèi)都得到證實(shí)(Symons等)。實(shí)施例6預(yù)演性實(shí)施例顯示TNF調(diào)節(jié)功能喪失所引起的效應(yīng)含有和不含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子或趨化因子抑制基因缺失/滅活的病毒對(duì)(如野生型WR及其B29R/vCKBP缺失的突變株)用于感染具有免疫力的小鼠(C57B/6或BALB/c)體內(nèi)的鼠腫瘤(如CMT-93、CMT-64或JC)。這種比較只在病毒基因產(chǎn)物抑制鼠細(xì)胞因子/趨化因子的程度與抑制人細(xì)胞因子/趨化因子的程度一樣時(shí)才有效。靜脈注射和/或瘤內(nèi)注射病毒(病毒顆粒為105到1010，注射1到6次)后檢測(cè)腫瘤組織和正常組織內(nèi)病毒復(fù)制的情況(不同時(shí)間點(diǎn)得到的噬菌斑形成單位)、CC趨化因子水平(如免疫組化染色或ELISA分析)、細(xì)胞因子水平(如免疫組化(IHC)染色或ELIS分析)以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的情況(H和E或IHC染色)。另外，還要測(cè)定兩種病毒的抗腫瘤效應(yīng)(Kaplan-Meier腫瘤抑制/存活曲線)和毒性(體重下降情況；血液學(xué)指標(biāo)；血清生化指標(biāo))。結(jié)果將是突變病毒1)抗腫瘤效應(yīng)提高，腫瘤內(nèi)的炎癥誘導(dǎo)反應(yīng)加強(qiáng)(如免疫效應(yīng)細(xì)胞增多)；在正常組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性與野生型病毒一樣或降低(如肝、脾、肺和/或腦)；3)對(duì)腫瘤特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)增強(qiáng)或維持原水平。最后，化療和/或放療聯(lián)合突變病毒比聯(lián)合野生型病毒所達(dá)到的抗腫瘤效應(yīng)有望得到提高。還可以在兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行毒性試驗(yàn)以進(jìn)一步確定本發(fā)明病毒的特征(Tscharke等，2002，本文已納入作為參考)。實(shí)施例7預(yù)演性實(shí)施例顯示IFN調(diào)節(jié)功能喪失所引起的效應(yīng)含有和不含有一個(gè)或多個(gè)干擾素結(jié)合多肽缺失/滅活的病毒對(duì)(如野生型WR痘苗病毒及其B18R缺失的突變株)用于感染具有免疫力的小鼠體內(nèi)的腫瘤，如上述實(shí)施例所討論的，其靶IFN分子可被痘苗病毒基因產(chǎn)物有效結(jié)合。需要指出的是，由于鼠干擾素與人干擾素相比對(duì)VV多肽具有一定的耐受性，因此在小鼠體內(nèi)得到的效果可能比人體內(nèi)的效果弱。如上所述，靜脈注射和/或瘤內(nèi)注射病毒后檢測(cè)腫瘤組織和正常組織內(nèi)的病毒復(fù)制和擴(kuò)散情況。另外，還要測(cè)定兩種病毒的抗腫瘤效應(yīng)和毒性。預(yù)期結(jié)果是突變病毒在正常組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性降低(如肝、脾、肺和/或腦)，但是在腫瘤內(nèi)依然可以復(fù)制并誘導(dǎo)腫瘤壞死。野生型痘苗病毒(如WR)在正常組織和腫瘤組織內(nèi)的復(fù)制/誘導(dǎo)壞死的能力差異較小。另外，與鹽水處理的對(duì)照腫瘤和野生型病毒處理的對(duì)照腫瘤相比，用突變病毒處理的腫瘤血管形成能力下降(如在等量的血管標(biāo)記物上通過H和E染色，CD31的免疫組化染色)。最后，化療和/或放療聯(lián)合突變病毒比聯(lián)合野生型病毒所達(dá)到的免疫介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)和療效有望得到提高。還可以在兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行毒性試驗(yàn)以進(jìn)一步確定本發(fā)明病毒的特征(Tscharke等，2002，本文已納入作為參考)。實(shí)施例8預(yù)演性實(shí)施例顯示絲氨酸蛋白酶抑制因子功能喪失所引起的效應(yīng)如上所述，含有和不含有抗調(diào)亡基因缺失/滅活的病毒對(duì)用于感染具有免疫力的小鼠體內(nèi)的腫瘤。病毒包括而不限于表達(dá)或不表達(dá)B13R(SPI-2)的痘苗病毒。如上面所描述，靜脈注射病毒后檢測(cè)腫瘤組織和正常組織內(nèi)病毒的復(fù)制和擴(kuò)散情況。另外，在瘤內(nèi)和/或靜脈注射病毒后按照上述方法評(píng)價(jià)突變病毒的抗腫瘤效應(yīng)和毒性。預(yù)期結(jié)果是突變病毒在正常組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性下降，和/或在正常組織內(nèi)被清除的速度快于腫瘤組織。野生型病毒在正常組織和腫瘤組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性的差異(如果有)較小。瘤內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈或其他途徑注射病毒以后，突變病毒的抗腫瘤效應(yīng)有望能達(dá)到或超過野生型病毒的抗腫瘤效應(yīng)。聯(lián)合化療研究用的是同一個(gè)模型系統(tǒng)。小鼠分別接受對(duì)照藥(安慰劑)、單獨(dú)的化療藥、單獨(dú)的病毒(野生型或突變型)或病毒加化療藥處理。突變病毒加化療藥的療效有望高于單獨(dú)的化療藥和野生型病毒加化療藥的療效。病毒聯(lián)合放療也可能得到同樣的結(jié)果。實(shí)施例9預(yù)演性實(shí)施例顯示補(bǔ)體調(diào)節(jié)功能喪失所引起的效應(yīng)如上所述，含有和不含有VCP基因缺失/滅活的病毒對(duì)用于感染具有免疫力的小鼠體內(nèi)的腫瘤。如上面所描述，靜脈或其他途徑注射病毒后檢測(cè)腫瘤組織和正常組織內(nèi)病毒的復(fù)制和擴(kuò)散情況。另外，在瘤內(nèi)和/或靜脈注射病毒后按照上述方法評(píng)價(jià)突變病毒的抗腫瘤效應(yīng)和毒性。預(yù)期結(jié)果是突變病毒在正常組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性下降，和/或在正常組織內(nèi)被清除的效率高于腫瘤組織。野生型病毒在正常組織和腫瘤組織內(nèi)的復(fù)制能力和毒性的差異(如果有)較小。瘤內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈或其他途徑注射病毒以后，突變病毒的抗腫瘤效應(yīng)有望能達(dá)到或超過野生型病毒的抗腫瘤效應(yīng)。聯(lián)合化療研究用的是同一個(gè)模型系統(tǒng)。例如，小鼠分別接受對(duì)照藥(安慰劑)、單獨(dú)的化療藥、單獨(dú)的病毒(野生型或突變型)或病毒加化療藥處理。突變病毒加化療藥的療效有望高于單獨(dú)的化療藥和野生型病毒加化療藥的療效。腫瘤靶向性的單克隆抗體聯(lián)合病毒也可能得到同樣的結(jié)果。*********根據(jù)本說明書，本說明書和權(quán)利要求書所描述的所有組合物和方法無需特別的試驗(yàn)就可以制備和實(shí)施。本發(fā)明的組合物和方法是利用優(yōu)選實(shí)施方案來描述的，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的組合物和/或方法以及本文所描述的方法的步驟或步驟的順序作出改動(dòng)。更具體地說，本文所描述的因子可用某些化學(xué)和物理相關(guān)的因子代替，但是可以得到相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是，所有這種相似的替代和修改都被認(rèn)為包含在權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻(xiàn)下面的文獻(xiàn)都已特地納入本文作為參考。美國(guó)專利4,554,101美國(guó)專利4,683,195美國(guó)專利4,683,202美國(guó)專利4,684,611美國(guó)專利4,800,159美國(guó)專利4,879,236美國(guó)專利4,883,750美國(guó)專利4,946,773美國(guó)專利4,952,500美國(guó)專利5,220,007美國(guó)專利5,279,721美國(guó)專利5,284,760美國(guó)專利5,302,523美國(guó)專利5,322,783美國(guó)專利5,354,670美國(guó)專利5,366,878美國(guó)專利5,384,253美國(guó)專利5,389,514美國(guó)專利5,399,363美國(guó)專利5,464,765美國(guó)專利5,466,468美國(guó)專利5,538,877美國(guó)專利5,538,880美國(guó)專利5,543,158美國(guó)專利5,550,318美國(guó)專利5,563,055美國(guó)專利5,580,859美國(guó)專利5,589,466美國(guó)專利5,591,616美國(guó)專利5,610,042美國(guó)專利5,633,016美國(guó)專利5,635,377美國(guó)專利5,641,515美國(guó)專利5,656,610美國(guó)專利5,702,932美國(guó)專利5,736,524美國(guó)專利5,739,169美國(guó)專利5,780,448美國(guó)專利5,789,166美國(guó)專利5,789,215美國(guó)專利5,798,208美國(guó)專利5,798,339美國(guó)專利5,801,005美國(guó)專利5,824,311美國(guó)專利5,824,348美國(guó)專利5,830,650美國(guó)專利5,830,880美國(guó)專利5,840,873美國(guó)專利5,843,640美國(guó)專利5,843,650美國(guó)專利5,843,651美國(guó)專利5,843,663美國(guó)專利5,846,225美國(guó)專利5,846,233美國(guó)專利5,846,708美國(guó)專利5,846,709美國(guó)專利5,846,717美國(guó)專利5,846,726美國(guó)專利5,846,729美國(guó)專利5,846,783美國(guó)專利5,846,945美國(guó)專利5,849,481美國(guó)專利5,849,483美國(guó)專利5,849,486美國(guó)專利5,849,487美國(guó)專利5,849,497美國(guó)專利5,849,546美國(guó)專利5,849,547美國(guó)專利5,851,770美國(guó)專利5,851,772美國(guó)專利5,853,990美國(guó)專利5,853,992美國(guó)專利5,853,993美國(guó)專利5,856,092美國(guó)專利5,858,652美國(guó)專利5,861,244美國(guó)專利5,863,732美國(guó)專利5,863,753美國(guó)專利5,866,331美國(guó)專利5,866,337美國(guó)專利5,866,366美國(guó)專利5,871,740美國(guó)專利5,871,986美國(guó)專利5,882,864美國(guó)專利5,900,481美國(guó)專利5,905,024美國(guó)專利5,910,407美國(guó)專利5,912,124美國(guó)專利5,912,145美國(guó)專利5,912,148美國(guó)專利5,916,776美國(guó)專利5,916,779美國(guó)專利5,919,626美國(guó)專利5,919,630美國(guó)專利5,922,574美國(guó)專利5,925,517美國(guó)專利5,925,525美國(guó)專利5,925,565美國(guó)專利5,928,862美國(guó)專利5,928,869美國(guó)專利5,928,870美國(guó)專利5,928,905美國(guó)專利5,928,906美國(guó)專利5,928,906美國(guó)專利5,929,227美國(guó)專利5,932,413美國(guó)專利5,932,451美國(guó)專利5,935,791美國(guó)專利5,935,819美國(guó)專利5,935,825美國(guó)專利5,939,291美國(guó)專利5,942,391美國(guó)專利5,945,100美國(guó)專利5,981,274美國(guó)專利5,994,624Alcami和Smith，Cell.，71(1)153-67，1992.Alcami等，Sem.Virol.，5419-427，1998.Alcami等，Virology，74(23)11230-9，2000.Almendro等，J.Immunol.，157(12)5411-5421，1996.Andoh等，CancerImmunol.Immunother.，50(12)663-72，2002.Angel等，Mol.Cell.Biol.，72256，1987.Angel等，Cell，49729，1987b.Angel等，Mol.Cell.Biol.，72256，1987a.Arap等，CancerRes.，55(6)1351-1354，1995.Atchison和Perry，Cell，46253，1986.Atchison和Perry，Cell，48121，1987.Austin-Ward和Villaseca，Rev.Med.Chil.，126(7)838-45，1998.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，John，Wiley&Sons，Inc，NewYork，1994.Bajorin等，J.Clin.Oncol.，6(5)786-92，1988.Bakhshi等，Cell.，41(3)899-906，1985.Banerji等，Cell.，27(2Pt1)299-308，1981.Banerji等，Cell.，33(3)729-740，1983.Bellus，J.Macromol.Sci.PureAppl.Chem.，A31(1)1355-1376，1994.Berkhout等，Cell，59273-282，1989.Blanar等，EMBOJ.，81139，1989.Blasco和Moss，J.Virology，66(7)4170-4179，1992.Blasco等，J.Virology，67(6)3319-3325，1993.Bodine和Ley，EMBOJ.，62997，1987.Boshart等，Cell，41521，1985.Bosze等，EMBOJ.，5(7)1615-1623，1986.Boyd等，Cell.，79341-351，1994.Braddock等，Cell，58269，1989.Braisted和Wells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(12)5688-5692，1996.Brizel，Semin.Radiat.Oncol.，8(4)237-246，1998.Bukowski等，Clin.CancerRes.，4(10)2337-47，1998.Bulla和Siddiqui，J.Virol.，621437，1986.Burton和Barbas，Adv.Immunol.，57191-280，1994.Caldas等，Nat.Genet.，8(1)27-32，1994.Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol.，81993，1988.Campere和Tilghman，GenesandDev.，3537，1989.Campo等，Nature，30377，1983.Caragine等，CancerRes.，62(4)1110-5，2002.Carbonelli等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，177(1)75-82，1999.Celander和Haseltine，J.Virology，61269，1987.Celander等，J.Virology，621314，1988.Chandler等，Cell，33489，1983.Chandler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8)3596-601，1997.Chang等，Mol.Cell.Biol.，92153，1989.Chatterjee等，ProcNatl.AcadSci.U.S.A.，869114，1989.Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，7(8)2745-2752，1987.Cheng等，CancerRes.，54(21)5547-5551，1994.Choi等，Cell，53519，1988.Christodoulides等，Microbiology，144(Pt11)3027-37，1998.Cleary和Sklar，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(21)7439-7443，1985.Cleary等，J.Exp.Med.，164(1)315-320，1986.Cocea，Biotechniques，23(5)814-816，1997.Cohen等，J.Cell.Physiol.，575，1987.Colamonici等，J.Biol.Chem.，27015974-15978，1995.Cooley等，Science，239(4844)1121-1128，1988.Costa等，Mol.Cell.Biol.，881，1988.Cripe等，EMBOJ.，63745，1987.Culotta和Hamer，Mol.Cell.Biol.，91376，1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于，所述干擾素結(jié)合多肽是B18R。4.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述干擾素調(diào)節(jié)多肽結(jié)合IFNγ。5.如權(quán)利要求4所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述干擾素結(jié)合多肽是B8R。6.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒在至少一個(gè)下述基因上還含有一個(gè)第二突變a)編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的第二基因，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏第二種功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)編碼補(bǔ)體控制多肽的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性補(bǔ)體控制多肽；c)編碼TNF調(diào)節(jié)多肽的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)編碼IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽；f)編碼功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R；或者g)編碼一種多肽的基因，其中該基因突變可導(dǎo)致感染性EEV形式的痘苗病毒增加。7.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒是Copenhagen或WesternReserve株，該病毒株上編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的第一基因發(fā)生突變。8.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述干擾素結(jié)合蛋白是B8R或B18R。9.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼第二干擾素調(diào)節(jié)多肽的基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏第二種功能性第二干擾素調(diào)節(jié)多肽。10.如權(quán)利要求9所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述功能性第二干擾素調(diào)節(jié)多肽是B8R、B18R、B13R、E3L或vC12L。11.如權(quán)利要求10所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B8R。12.如權(quán)利要求10所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B13R。13.如權(quán)利要求10所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B8R和B13R。14.如權(quán)利要求13所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B8R、B13R和vC12L。15.如權(quán)利要求14所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒還缺乏功能性B28R或A53R。16.如權(quán)利要求15所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B28R和A53R。17.如權(quán)利要求14所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒還缺乏功能性B18R。18.如權(quán)利要求17所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒還缺乏功能性B28R或A53R。19.如權(quán)利要求18所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒缺乏功能性B28R和A53R。20.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼補(bǔ)體控制多肽的基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性補(bǔ)體控制多肽。21.如權(quán)利要求20所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述功能性補(bǔ)體控制多肽是VCP。22.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼TNF調(diào)節(jié)多肽的基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性TNF調(diào)節(jié)多肽。23.如權(quán)利要求22所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述功能性TNF調(diào)節(jié)多肽是A53R、B28R或vCKBP。24.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子。25.如權(quán)利要求24所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述的絲氨酸蛋白酶抑制因子是B13R、B22R或K2L。26.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼IL-1β調(diào)節(jié)因子的基因發(fā)生突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性IL-1β調(diào)節(jié)因子。27.如權(quán)利要求26所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽是B13R或B15R。28.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒上編碼功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽的基因發(fā)生突變。29.如權(quán)利要求28所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述多肽是B7R、vCKBP或N1L。30.如權(quán)利要求28所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述多肽是A41L、vCKBP或C11R。31.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒含有能使感染性EEV形式的痘苗病毒產(chǎn)量增加的突變。32.如權(quán)利要求31所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述可導(dǎo)致感染性EEV形式的病毒增加的突變基因是編碼A34R或B5R的基因。33.如權(quán)利要求32所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述可導(dǎo)致感染性EEV形式的病毒增加的突變基因是編碼A34R的基因。34.權(quán)利要求33所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述A34R上的突變是K151D突變。35.如權(quán)利要求6所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒包含a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)中的至少兩個(gè)不同的突變。36.如權(quán)利要求35所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒包含g)的突變和a)、b)、c)、d)、e)或f)中的至少一個(gè)突變。37.如權(quán)利要求1所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒包含在藥用組合物中。38.如權(quán)利要求37所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述組合物還包含干擾素。39.如權(quán)利要求37所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述組合物還包含抗癌藥。40.如權(quán)利要求39所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述抗癌藥是抗體、化療藥或編碼腫瘤抑制因子的核酸。41.一種含第一突變的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述突變可導(dǎo)致病毒缺乏功能性vC12L多肽。42.如權(quán)利要求41所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒在至少一個(gè)下述基因上還含有一個(gè)第二突變a)編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的第二基因，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏第二種功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)編碼補(bǔ)體控制多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性補(bǔ)體控制多肽；c)編碼TNF調(diào)節(jié)多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)編碼IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽；f)編碼功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R；或者g)編碼一種多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致感染性EEV形式的痘苗病毒增加。43.如權(quán)利要求41所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒是Copenhagen或WesternReserve株，該病毒株上編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的第一基因發(fā)生突變。44.如權(quán)利要求41所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒在編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的基因上發(fā)生第二突變，該突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏第二種功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽。45.如權(quán)利要求44所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述第二種功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽是B8R、B13R或B18R。46.一種含第一突變的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述該突變可導(dǎo)致病毒缺乏功能性B15R多肽。47.如權(quán)利要求46所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，該病毒在至少一個(gè)下述基因上還含有一個(gè)第二突變a)編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽的基因，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)編碼補(bǔ)體控制多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性補(bǔ)體控制多肽；c)編碼TNF調(diào)節(jié)多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)編碼IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性IL-1β調(diào)節(jié)因子多肽；f)編碼功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致病毒至少缺乏一種功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R；或者g)編碼一種多肽的基因，其中，該基因突變可導(dǎo)致感染性EEV形式的痘苗病毒增加。48.如權(quán)利要求47所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述病毒在編碼干擾素調(diào)節(jié)多肽或TNF調(diào)節(jié)因子的基因上發(fā)生突變。49.如權(quán)利要求48所述的減毒痘苗病毒，其特征在于，所述干擾素調(diào)節(jié)多肽是B13R，TNF調(diào)節(jié)因子B29R。50.一種治療癌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括給予癌細(xì)胞有效量的痘病毒病毒，該病毒至少不表達(dá)如下的一種多肽a)功能性第一干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)功能性補(bǔ)體控制多肽；c)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；f)功能性非感染性EEV形式的多肽；g)功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R多肽。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒缺乏一種以上的下列多肽a)功能性第一干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)功能性補(bǔ)體控制多肽；c)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；f)功能性抗感染性EEV形式的多肽；g)功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R多肽；或者h(yuǎn))功能性第二干擾素調(diào)節(jié)多肽。52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒缺乏功能性第一干擾素調(diào)節(jié)多肽。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒是Copenhagen或WesternReserve株。54.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述病毒缺乏的功能性第一或第二干擾素調(diào)節(jié)多肽是B18R或B8R。55.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒至少缺乏一種功能性補(bǔ)體控制多肽。56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒缺乏的功能性補(bǔ)體控制多肽是VCP。57.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒至少缺乏一種功能性TNF調(diào)節(jié)多肽。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒缺乏的功能性TNF調(diào)節(jié)多肽是A53R、B28R或vCKBP。59.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒至少缺乏一種功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子。60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶抑制因子是B13R、B22R或K2L。61.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒至少缺乏一種功能性IL-1β調(diào)節(jié)因子。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述IL-1β調(diào)節(jié)因子是B13R或B15R。63.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒至少缺乏一種功能性抗感染性EEV形式的多肽。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒在抗感染性EEV形式的多肽A34R上有一個(gè)K151D突變或者在編碼B5R的基因上發(fā)生突變。65.如權(quán)利要求50所述的方法，該方法還包括給予細(xì)胞干擾素。66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述干擾素是IFNα、IFNβ或IFNγ。67.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒包含在藥用組合物中。68.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。69.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞位于患者體內(nèi)。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒通過直接注射、內(nèi)窺鏡注射、氣管內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、靜脈注射、損傷部位內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔注射、局部給藥、經(jīng)皮注射或皮下注射途徑給予患者。71.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述患者帶有實(shí)體瘤。72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述方法還包括切除全部或部分實(shí)體瘤。73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒在切除腫瘤前給予患者。74.利要求73所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒在切除腫瘤后給予患者。75.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對(duì)患者進(jìn)行化療或放療。76.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，對(duì)患者至少進(jìn)行一次化療。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述化療藥物是順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、泰索帝、紫杉醇、反鉑、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、氨甲蝶呤、吉西他濱、奧沙利鉑、依立替康、托泊替康或上述藥物的任何類似物或衍生物。78.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，對(duì)患者至少進(jìn)行一次放療。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其特征在于，對(duì)患者至少進(jìn)行一次X射線照射、UV輻射、γ-照射、電子束照射或微波照射。80.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是膀胱細(xì)胞、血細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、食管細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、頭部細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、鼻咽細(xì)胞、頸細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、舌細(xì)胞或子宮細(xì)胞。81.如權(quán)利要求50所示的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒要注射一次以上。82.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒還含有編碼異源治療性多肽的核酸。83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述異源治療性多肽是腫瘤抑制因子、免疫調(diào)節(jié)因子、血管形成抑制因子、抗血管多肽、細(xì)胞毒性多肽、調(diào)亡誘導(dǎo)因子、前藥活化酶或細(xì)胞增殖抑制多肽。84.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予細(xì)胞蛋白酶或肽酶。85.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒是IHD-J株，或在A34R上含有K151D突變，或在編碼B5R的基因上含有突變。86.如權(quán)利要求50所示的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒由過量表達(dá)至少一種人補(bǔ)體抑制蛋白的細(xì)胞系產(chǎn)生。87.如權(quán)利要求86所示的方法，其特征在于，所述補(bǔ)體抑制蛋白是CD55、CD46或CD59。88.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予細(xì)胞微管穩(wěn)定藥。89.如權(quán)利要求88所示的方法，其特征在于，所述的微管穩(wěn)定藥是紫杉烷。90.一種治療患者體內(nèi)癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括給予患者有效量的藥用組合物，該組合物包含在編碼B8R、B18R或vC12L的基因上發(fā)生突變的減毒痘苗病毒。91.如權(quán)利要求90所述的方法，其特征在于，所述藥用組合物還包含干擾素或編碼干擾素的核酸。92.如權(quán)利要求90所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒缺乏功能性B8R、B18R或vC12L多肽。93.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒缺乏功能性B8RR或vC12L多肽，并在編碼B13R的基因上還包含一個(gè)突變，其中的病毒缺乏功能性B13R多肽。94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒缺乏功能性B8R、vC12L或B13R多肽。95.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒至少缺乏功能性B8R、B18R或vC12L多肽中的兩個(gè)。96.如權(quán)利要求95所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒缺乏功能性B8R、B18R或vC12L多肽。97.如權(quán)利要求90所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒還不能表達(dá)下列多肽中的至少一個(gè)a)功能性補(bǔ)體控制多肽；b)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；c)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；d)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；e)功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R多肽；或者f)功能性抗感染性EEV形式的多肽。98.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒還不能表達(dá)下列多肽中的至少一個(gè)a)功能性補(bǔ)體控制多肽；b)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；c)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；d)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；e)功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R多肽；或者f)功能性抗感染性EEV形式的多肽。99.一種殺傷癌細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括使癌細(xì)胞與減毒痘苗病毒接觸，其中所述減毒痘苗病毒所具有的抑制干擾素、趨化因子、細(xì)胞因子、補(bǔ)體或中和抗體介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的能力下降。100.如權(quán)利要求99所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒在編碼B8R、B13R、B18R或vC12L的核酸上發(fā)生突變。101.如權(quán)利要求99所述的方法，其特征在于，所述減毒痘苗病毒不能表達(dá)下列多肽中的至少一個(gè)a)功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)功能性補(bǔ)體控制多肽；c)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；f)功能性A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R多肽；或者g)功能性抗感染性EEV形式的多肽。102.一種治療癌癥患者體內(nèi)癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括使腫瘤部位與治療有效量的減毒痘苗病毒和增強(qiáng)減毒痘苗病毒抗腫瘤效應(yīng)的因子接觸，其中所述痘苗病毒和增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)的因子的表達(dá)可達(dá)到治療癌癥的目的。103.如權(quán)利要求102所述的方法，其特征在于，所述能增強(qiáng)減毒痘苗病毒抗腫瘤效應(yīng)的因子是干擾素、蛋白酶、肽酶、微管穩(wěn)定劑、化療、放療、基因治療、免疫治療和免疫調(diào)節(jié)治療。104.一種制備增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒的方法，其特征在于，所述方法包括a)用痘苗病毒感染過量表達(dá)補(bǔ)體抑制蛋白的人細(xì)胞系；b)從被感染的細(xì)胞內(nèi)分離EEV形式的痘苗病毒。105.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，所述痘苗病毒在編碼A34R蛋白的基因上發(fā)生突變，其中，該突變可導(dǎo)致K151D突變。106.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，所述補(bǔ)體抑制蛋白是CD55、CD46或CD59。107.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，所述人細(xì)胞系可過量表達(dá)一種以上的補(bǔ)體抑制蛋白。108.一種治療殘存的微小癌的方法，其特征在于，所述方法包括(i)確定患者攜帶有可切除的腫瘤；(ii)切除腫瘤；以及(iii)使腫瘤床與在編碼下列多肽的基因上至少發(fā)生一種突變的痘苗病毒接觸A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L或vCKBP。109.一種治療腫瘤患者的方法，其特征在于，所述方法包括(i)通過手術(shù)暴露腫瘤；以及(ii)使所述的腫瘤與缺乏下列多肽功能的減毒痘苗病毒接觸A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、N1L、vC12L或vCKBP。110.一種治療腫瘤患者的方法，其特征在于，所述方法包括在一段時(shí)期內(nèi)用減毒痘苗病毒灌注腫瘤。111.一種抑制癌癥患者體內(nèi)癌轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述方法包括給予患者減毒痘苗病毒，從而在患者體內(nèi)產(chǎn)生療效。112.一種治療患者體內(nèi)多藥耐藥腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括i)給予患者減毒痘苗病毒以及ii)對(duì)患者進(jìn)行化療或放療，從而在患者體內(nèi)產(chǎn)生療效。113.一種使患者體內(nèi)的無法切除的腫瘤轉(zhuǎn)化成可切除的腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括給予患者有效量的減毒痘苗病毒并切除全部或部分腫瘤。114.一種治療攜帶化療或放療耐受癌的癌癥患者的方法，其特征在于，所述方法包括給予患者減毒痘苗病毒，然后對(duì)患者進(jìn)行化療或放療。115.一種含痘苗病毒的組合物，其特征在于，所述組合物至少包含50％增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒。116.如權(quán)利要求115所述的組合物，其特征在于，所述組合物至少包含60％增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒。117.如權(quán)利要求116所述的組合物，其特征在于，所述組合物至少包含70％增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒。118.一種制備增強(qiáng)型EEV形式的痘苗病毒的人細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系包含痘苗病毒并能過量表達(dá)至少一種補(bǔ)體抑制多肽。119.如權(quán)利要求118所述的人細(xì)胞系，其特征在于，所述補(bǔ)體抑制多肽是CD55、CD46或CD59。120.如權(quán)利要求118所述的人細(xì)胞系，其特征在于，所述痘苗病毒不能表達(dá)下列多肽中的至少一個(gè)a)功能性干擾素調(diào)節(jié)多肽；b)功能性補(bǔ)體控制多肽；c)功能性TNF調(diào)節(jié)多肽；d)功能性絲氨酸蛋白酶抑制因子；e)功能性IL-1β調(diào)節(jié)多肽；f)功能性抗感染性EEV形式的多肽；或者g)功能性A41L、B7R、N1L或vCKBP趨化因子結(jié)合多肽或C11REGF樣多肽。全文摘要本發(fā)明涉及利用改變的痘病毒，包括經(jīng)改造后可產(chǎn)生更有效的治療性劑的痘苗病毒，治療癌和癌細(xì)胞的方法和組合物。這種痘病毒經(jīng)改造后變成減毒株，或者其影響正常細(xì)胞的能力減弱。在某些實(shí)施方案中，方法和組合物包括攜帶突變的痘病毒，這種突變可使痘病毒在宿主內(nèi)激發(fā)抗病毒反應(yīng)的能力減弱或消失。攜帶這些突變及其他突變的痘病毒可用于更有效地治療癌癥。文檔編號(hào)C12N7/00GK1754002SQ03823719公開日2006年3月29日申請(qǐng)日期2003年8月11日優(yōu)先權(quán)日2002年8月12日發(fā)明者大衛(wèi)·科恩申請(qǐng)人:大衛(wèi)·科恩