專利名稱：遺傳分析和鑒定的制作方法
背景技術(shù)：
遺傳分析廣泛用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究以及診斷學(xué)中，以對(duì)患者進(jìn)行篩選，模式和基因型分析。臨床實(shí)驗(yàn)?zāi)壳疤峁┝藢?duì)超過300種疾病或情況的遺傳測(cè)試，包括在BRCA1和BRCA2基因，以及P53，N-，C-和K-RAS，細(xì)胞色素P450，CFTR，HLA I和II類，杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和β-球蛋白基因中進(jìn)行突變分析。測(cè)試項(xiàng)目繼續(xù)增加，因?yàn)槿祟惢蚪M計(jì)劃的發(fā)展使得可識(shí)別在引起疾病中起作用的遺傳定子。
遺傳測(cè)試包括基因和/或染色體分析，來檢測(cè)可遺傳的或其它突變以及染色體異常，以提供對(duì)疾病易感性的診斷。此外，監(jiān)測(cè)蛋白水平來獲得疾病發(fā)展或?qū)χ委煈?yīng)答的指示。遺傳測(cè)試用于診斷和檢測(cè)癌癥，以及評(píng)估個(gè)體發(fā)生該疾病的癥狀前風(fēng)險(xiǎn)。目前，例如，診斷為幾種疾病如運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Atexia-telangiectasia)，布盧姆氏綜合癥(Bloom′ssyndrome)，范可尼貧血(Fanconi′s anemia)或著色性干皮病(XerodermaPigmentosum)的家族成員，能用于測(cè)試在各自的基因中突變的發(fā)生。此外，調(diào)節(jié)基因p53中的幾種突變也與發(fā)展為不同類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。那些遺傳了p53突變的個(gè)體處于發(fā)生肉瘤，腦瘤或白血病的高風(fēng)險(xiǎn)之中。用于遺傳分析的DNA分型和DNA指紋分析的標(biāo)準(zhǔn)分析方法包括，(1)串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)(VNTR)分析(如，Nakamura et al.，Science，Vol.235，pp.1616-1622(1987)，(2)短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析(如，Edwards et al.，Am.J.Hum.genet.Vol.49，pp.746-756(1991)；Ricciardone et al.，Biotechniques，Vol.23，pp.742-747(1997)，(3)單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析(如，Nickerson etal.，Proc.Natl.Acids.Sci.U.S.A.，Vol.87，pp.8923-8927(1990)；Nikiforovet al.Nucleic Acids Res.Vol.22，pp.4167-4175(1994)；Ross et al.，Anal.Chem.Vol.69，pp.4197-4202))，(d)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPS)分析(如，Botstein et al.，Am.J.Hum.Genet.Vol.32，pp.314-331(1980))，和(4)線粒體DNA序列分析。VNTR和STR分析使用簡(jiǎn)單或多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(如，Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，Vol.51，pp.263-273(1986)；Mullis et al.，Science，Vol.239，Vol.487-491(1988))。RFLP分析利用限制性酶消化DNA，接著用標(biāo)記探針進(jìn)行DNA雜交技術(shù)；和線粒體DNA序列分析在諸如循環(huán)測(cè)序的已知方法中利用PCR技術(shù)和常規(guī)雙脫氧測(cè)序的組合。在特異性遺傳定位中STR數(shù)量上個(gè)體間的差異，顯示與幾種常見的遺傳疾病相關(guān)。例如，不穩(wěn)定雙重復(fù)已知與疾病狀態(tài)如囊腫性纖維化和結(jié)腸直腸癌相關(guān)。某些不穩(wěn)定三重復(fù)已知與幾種遺傳疾病包括肯尼迪氏病，脆性X染色體綜合征和肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)。尤其亨廷頓(氏)舞蹈病已經(jīng)廣泛研究，而且對(duì)一段基因進(jìn)行了STR作圖，以鑒定51個(gè)跨躍1.86Mbp DNA區(qū)段的三重復(fù)。高階重復(fù)，如四聚物，也與特定疾病狀態(tài)包括亨廷頓(氏)舞蹈病和1型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)相關(guān)。
基于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法的DNA分型，要求大量的樣本制備和重要的PCR后處理。后者包括限制性酶消化，瓊脂糖/丙烯酰胺凝膠電泳，序列分析或這些方法的組合的步驟。這些多步驟方案在數(shù)據(jù)中引入了相當(dāng)大的誤差，而且勞動(dòng)強(qiáng)度大并耗費(fèi)時(shí)間。
DNA指紋分析，也稱為身份測(cè)試，依靠高多態(tài)性遺傳基因座的分析來提供明確的個(gè)體分子鑒定。多種多態(tài)性標(biāo)記包括限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，STRs/微衛(wèi)星和串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)(VNTRS)/小衛(wèi)星可用于這種目的。RFLP分析要求對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切消化，接著進(jìn)行凝膠電泳并使放射性標(biāo)記的探針與凝膠雜交。該程序的復(fù)雜性阻礙了RFLP分析廣泛用于鑒定測(cè)試。SNPs，其中一個(gè)等位基因與另一個(gè)等位基因在單一位置不同，在編碼和非編碼區(qū)出現(xiàn)的平均頻率為1000個(gè)堿基中出現(xiàn)1個(gè)，并組成了人基因組中所有多態(tài)性的90％(Brooker，GENE，234177-186(1999))。它們已經(jīng)用于與疾病如癌癥相關(guān)基因的作圖、骨髓移植物供體的分類和群體遺傳學(xué)范圍內(nèi)的遺傳研究(Kwok at al.，Mol.Med.Today，538-543，(1999))。然而，在開發(fā)合適的SNPs組以提供明確的DNA指紋的時(shí)候，要求仔細(xì)的確認(rèn)那些新的標(biāo)記。此外，與目前常用的STR標(biāo)記相比，用于確保排除不明確的既定可能性所需的SNP標(biāo)記組較大。SNPs和STR多態(tài)性都可用作標(biāo)記，但是需要每個(gè)STR多態(tài)性中大約7到12個(gè)SNPs得到99.73％的排斥力。STRs和VNTRs是多信息的多態(tài)性標(biāo)記。許多遺傳基因座含有由短、重復(fù)序列單元組成的多態(tài)性STR區(qū)域，長(zhǎng)度一般為3到7個(gè)堿基。三聚和四聚STRs出現(xiàn)頻率為每一個(gè)15,000堿基的既定序列出現(xiàn)一次，并廣泛用于在家系和法醫(yī)檢定法中進(jìn)行身份分類。相較于SNPs的情況，其中需要大量的基因座用于排除，只需要9個(gè)特異性STR基因座就可以提供99.73％的組合平均排斥力(Alford et.al Current Opinion in Biotechnology，29-33(1994)，Latour et al，829-37(2001)。STRs可以使用針對(duì)旁臨串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的特異性引物序列，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來進(jìn)行擴(kuò)增。
由于在等位基因中重復(fù)單元數(shù)的差異而引起的其它多態(tài)性，包括串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)(VNTRS)/小衛(wèi)星，其是含有9到60個(gè)堿基的短序列的串聯(lián)重復(fù)，以及含有1到5個(gè)堿基的微衛(wèi)星。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星通常被認(rèn)為是VNTRs的亞類。由于估計(jì)大約500,000個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)分布于人基因組，平均間隔為7,000個(gè)堿基，VNTR區(qū)域也可用于身份測(cè)試。
在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中，使用放射性標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的引物通過PCR對(duì)STRs和VNTRs進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳或毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離用于鑒定。
在遺傳測(cè)試的常規(guī)執(zhí)行中，與樣本和患者鑒定相關(guān)的信息是人工記錄的，一般涉及制作貼到樣本收集容器上的條形碼標(biāo)記。這種標(biāo)記程序表示可能的重要誤差來源，包括違反運(yùn)行規(guī)程，貼錯(cuò)標(biāo)簽和轉(zhuǎn)換樣本。
因此，需要存在一個(gè)機(jī)制，由此收集的已知生物學(xué)樣本在收集的時(shí)候就被明確標(biāo)記和確認(rèn)。這將保護(hù)以防在分析過程中違反運(yùn)行規(guī)程，貼錯(cuò)標(biāo)簽和轉(zhuǎn)換樣本。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了平行分析STRs和相關(guān)重復(fù)序列單元的方法，以明確地把樣本與遺傳測(cè)試結(jié)果和患者身份聯(lián)系起來。特別地，本發(fā)明提供了與完成遺傳分析同時(shí)記錄分子鑒定(ID)的方法，通過把患者的遺傳模式與患者的分子指紋聯(lián)系起來，從而使樣本的疏忽違反運(yùn)行規(guī)程的發(fā)生率最小化，并通過與以前記錄或后面記錄的分子鑒定進(jìn)行比較來進(jìn)行明確的鑒定。
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于分析從患者樣本獲得的靶核酸序列，并同時(shí)提供患者的遺傳指紋的組合物。所述組合物包括一第一組探針和一第二組探針。所述第一組探針包括能與從用于遺傳測(cè)試的患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針，而所述第二組包括用于與多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記雜交的寡核苷酸探針。與這些標(biāo)記的所述雜交提供了能確認(rèn)患者的遺傳指紋。這兩組探針都連接到珠子上，所述珠子帶有能用于唯一確定連接到所述珠子上的所述探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于分析從患者樣本獲得的靶核酸序列，并同時(shí)提供患者的遺傳指紋的方法。該方法包括提供第一組探針和第二組探針。所述第一組探針包括能與從用于遺傳測(cè)試的患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針，而所述第二組探針包括用于與多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記雜交的寡核苷酸探針。與這些標(biāo)記的所述雜交提供了能確認(rèn)患者的遺傳指紋。所述第一組和第二組探針都連接到珠子上，所述珠子帶有能用于唯一確定連接到所述珠子上的所述探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性。該方法進(jìn)一步包括使靶序列和多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記與所述第一組和第二組探針接觸，然后檢測(cè)所述第一組探針與所述靶序列之間的雜交，并檢測(cè)所述第二組探針與所述多態(tài)性標(biāo)記之間的雜交。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于分析從患者樣本獲得的靶核酸序列的方法。該方法包括提供一種唯一聯(lián)系序列分析與樣本的裝置，并包括提供一組探針，所述探針包括能與從患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針。所述探針連接到珠子上，所述珠子帶有能唯一確定連接到所述珠子上的所述探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性。所述方法進(jìn)一步包括使寡核苷酸探針與含有靶核酸序列的溶液接觸，以使靶序列與相應(yīng)的探針雜交，并檢測(cè)所述探針與所述靶序列的雜交。該溶液用能唯一確定靶溶液的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，以便通過探測(cè)標(biāo)記來確定患者的身份。所述標(biāo)記可以在溶液加入到寡核苷酸之前或之后或同時(shí)添加給樣本。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種測(cè)定靶核酸序列中串聯(lián)核苷酸重復(fù)數(shù)的方法，其中串聯(lián)重復(fù)在每側(cè)通過一個(gè)非重復(fù)旁臨序列旁臨。所述方法包括，提供一組連接到珠子上的寡核苷酸探針，其中每個(gè)珠子都帶有能唯一確認(rèn)連接到所述珠子上的所述探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性。每個(gè)探針都能與靶序列退火，而且含有探測(cè)位點(diǎn)。設(shè)計(jì)這組探針以使這些探針具有不同的重復(fù)核苷酸數(shù)。當(dāng)探針與靶序列退火形成雜交復(fù)合物時(shí)，每個(gè)探針的探測(cè)位點(diǎn)都與一個(gè)位于串聯(lián)重復(fù)里面或其外面的靶位點(diǎn)連接。所述方法進(jìn)一步包括使靶序列與寡核苷酸探針接觸，以使所述靶序列與所述探針形成雜交復(fù)合物。所述靶序列和這組探針之間的雜交復(fù)合物，被平行探測(cè)以確定探針的探測(cè)位點(diǎn)結(jié)束于靶重復(fù)外或靶重復(fù)里面。還確定了靶序列中的重復(fù)數(shù)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在靶核酸序列分析中產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)的序列特異性擴(kuò)增的方法。該方法可以實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增到的信號(hào)，而且該方法包括提供一溫度控制的樣本密封裝置，其能實(shí)時(shí)記錄在該裝置中產(chǎn)生的光學(xué)檢測(cè)信號(hào)。該方法進(jìn)一步包括提供一種溫度控制裝置，用于控制該裝置的溫度，并在樣本密封裝置內(nèi)，提供一組探測(cè)寡核苷酸探針。這些探針能與靶核酸形成雜交復(fù)合物并連接到珠子上。每個(gè)珠子都帶有能確定連接到所述珠子上的所述探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性。使寡核苷酸探針與靶序列接觸，從而所述探針與所述靶序列之間形成雜交復(fù)合物。這種雜交復(fù)合物再與第二寡核苷酸探針接觸，所述第二寡核苷酸探針含有標(biāo)記，并能與所述雜交復(fù)合物內(nèi)包含的探測(cè)探針連接。該方法還包括提供一裝置，使所述第二標(biāo)記的寡核苷酸探針與所述雜交復(fù)合物內(nèi)的所述探測(cè)探針連接，然后實(shí)時(shí)檢測(cè)來自固定探針組的光學(xué)信號(hào)。進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)退火-連接-檢測(cè)-變性循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都能以算術(shù)級(jí)數(shù)增加延伸探針的數(shù)量，并包括以下步驟(i)提供用于形成雜交復(fù)合物的第一溫度；(ii)提供用于發(fā)生探測(cè)探針和第二標(biāo)記探針的連接酶催化連接的第二溫度，其中連接與珠子的光學(xué)信號(hào)變化相關(guān)，所述珠子帶有連接的探針；(iii)描繪和/或記錄來自探針的光學(xué)信號(hào)；和(iv)提供用于使全部的雜交復(fù)合物變性的第三溫度。
當(dāng)聯(lián)系下述的詳細(xì)描述和伴隨的附圖時(shí)，可以更清楚地理解本發(fā)明的目的，特征和優(yōu)點(diǎn)，其中的詳細(xì)描述應(yīng)當(dāng)理解為只是示例說明。


圖1為顯示產(chǎn)生嵌入的遺傳ID的方法的示意圖。
圖2為顯示了CFTR區(qū)域的限制性圖譜的示意圖(X是SNP標(biāo)記，D7S122和D7S8是STRs，MET是甲硫氨酸，NOT1是限制性位點(diǎn)，IRP是基因)。
圖3為顯示了在CFTR基因的外顯子內(nèi)突變的示意圖。
圖4是一個(gè)DNA序列，其顯示了CFTR基因的外顯子7內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記(大寫字母表示已知的多態(tài)性)。
圖5A是一個(gè)DNA序列，其顯示了CFTR基因的外顯子10內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記。
圖5B為設(shè)計(jì)用于CFTR基因外顯子10內(nèi)SNP鑒定的探針的示意圖。
圖6為顯示用磷酸化引物進(jìn)行PCR分析的方法的示意圖。
圖7為顯示了分析肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因缺失的方法的示意圖。大多數(shù)多態(tài)性標(biāo)記在該基因中缺失。可以設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增發(fā)生缺失的外顯子的旁臨序列。缺失的序列和多態(tài)性標(biāo)記可以同時(shí)被鑒定。
圖8為顯示了具有位于環(huán)外面的基因，以及環(huán)內(nèi)各種疾病導(dǎo)致的突變和多態(tài)性的線粒體基因組的示意圖。
圖9A為探針設(shè)計(jì)的示意圖，其用于帶有使用標(biāo)記的ddNTPs的錨定序列的STR長(zhǎng)度多態(tài)性。
圖9B為使用STR多態(tài)性對(duì)THO1基因座的結(jié)果的示意圖。
圖10A為探針設(shè)計(jì)的示意圖，其用于不帶錨定序列的STR長(zhǎng)度多態(tài)性。
圖10B顯示了使用不帶有錨定的探針對(duì)THO1基因座的結(jié)果。
圖11A為帶有兩種不同標(biāo)記的ddNTPs的芯片上的STR長(zhǎng)度多態(tài)性的示意圖。在該情況中，ddNTPs用不同的顏色進(jìn)行不同的標(biāo)記。
圖11B顯示了使用兩種不同標(biāo)記的ddNTPs獲得的結(jié)果，其中綠色ddNTP整合有正確的匹配，橙色ddNTP當(dāng)探針終止于重復(fù)內(nèi)時(shí)整合。
圖12顯示了錨定長(zhǎng)度對(duì)使用6個(gè)或11個(gè)堿基的兩種錨定進(jìn)行STR多態(tài)性分析的SBE的影響。
圖13是用于STR多態(tài)性分析的雜合引物的示意圖。
圖14說明了退火溫度對(duì)用于STR多態(tài)性分析的SBE的影響。
圖15A說明了對(duì)內(nèi)部探測(cè)探針的熒光能量轉(zhuǎn)移。
圖15B說明了對(duì)外部探測(cè)探針的熒光能量轉(zhuǎn)移。
圖16示例了用于鑒定CFTR基因內(nèi)含子8中的聚-T變異體的探針序列設(shè)計(jì)。
圖17示例了使用CFTR基因內(nèi)含子8中的聚-T變異體鑒定各種靶的結(jié)果。
圖18示例了探針序列設(shè)計(jì)用于鑒定較長(zhǎng)的重復(fù)，如那些10到幾百個(gè)堿基長(zhǎng)度的重復(fù)。
圖19A示例了通過連接探測(cè)探針來鑒定重復(fù)序列(T1是起始檢測(cè)溫度，T2是終止檢測(cè)溫度，其中T2大于T1)。
圖19B示例了通過連接和芯片上循環(huán)來鑒定重復(fù)序列(T1，T2和T3表示3種檢測(cè)不同溫度，其中T3＞T2＞T1)。
詳細(xì)描述患者的遺傳模式分析不僅在基礎(chǔ)和應(yīng)用臨床研究中，而且在疾病診斷和對(duì)疾病誘因的評(píng)估中的作用越來越重要。一種安全，可靠的遺傳測(cè)試方法優(yōu)選合并在個(gè)體測(cè)試中涉及患者鑒定的所有相關(guān)信息。本發(fā)明提供了用于聯(lián)系從患者樣本分析獲得的遺傳模式與患者身份的方法和組合物。在記錄遺傳指紋或分子識(shí)別(ID)的基礎(chǔ)上，在遺傳測(cè)試或者任何診斷或預(yù)兆測(cè)試的同時(shí)建立了患者遺傳模式與身份之間的這種相關(guān)性。
本發(fā)明的方法可用于預(yù)防在遺傳測(cè)試過程中的違反運(yùn)行規(guī)程，貼錯(cuò)標(biāo)簽和轉(zhuǎn)換樣本。這些方法可用于父性和母性測(cè)試，遷移和遺傳爭(zhēng)論，雙胞胎中的接合性測(cè)試，近親交配測(cè)試，骨髓移植成功的評(píng)估，人遺體的確認(rèn)以及諸如包括精液或血液的法醫(yī)檢定測(cè)試。本發(fā)明通過整合遺傳指紋或分子識(shí)別到遺傳或其它測(cè)試的記錄中，其以例如這里詳細(xì)描述的圖象的形式獲得，預(yù)防或糾正了與違反運(yùn)行規(guī)程，貼錯(cuò)標(biāo)簽和轉(zhuǎn)換樣本相關(guān)的鑒定錯(cuò)誤。這樣，建立了記錄與患者身份之間的明確關(guān)系。分子識(shí)別可用于追蹤并確認(rèn)樣本的身份，從而提供鑒定的方法。本發(fā)明的方法提供了組合物和用于產(chǎn)生遺傳ID，這里也稱作ID的方法，同時(shí)完成遺傳或者其它診斷或預(yù)兆測(cè)試。在分析遺傳基因座如含有多個(gè)突變和廣泛分布標(biāo)記的CFTR的情況中，本發(fā)明提供了記錄位于靶內(nèi)的已經(jīng)擴(kuò)增的ID標(biāo)記的方法，其用于遺傳分析目的。在分析中，其中的遺傳基因座只含有很少幾個(gè)突變，位于其它基因組區(qū)域內(nèi)的ID標(biāo)記可通過提供另外的引物來進(jìn)行擴(kuò)增。
一種遺傳指紋分析常用的方法包括，某些基因座內(nèi)許多重復(fù)序列單元的多態(tài)性分析。為了促進(jìn)重復(fù)序列多態(tài)性的整合，這里提供的方法用于通過STR/VNTR分析進(jìn)行陣列形式的鑒定測(cè)試。本發(fā)明的方法最小化了樣本操作和處理所需的步驟數(shù)，從而最小化了測(cè)定過程影響結(jié)果的可能性，這種可能性是開發(fā)用于患者鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)要關(guān)注的。盡管這里描述的遺傳指紋分析方法尤其可用于在遺傳模式分析的情況中提供患者身份，它們也可用于聯(lián)合其它遺傳分析，如基因分型，單倍體分型或HLA分子分型。本發(fā)明方法發(fā)現(xiàn)也可用于遺傳分析的獨(dú)立進(jìn)行地遺傳鑒定的情況中。
而且，通過把ID指派給特定的樣本容器或載體，本發(fā)明的方法產(chǎn)生了載體ID與遺傳ID之間的明確關(guān)聯(lián)，從而不僅最小化了樣本操作錯(cuò)誤的可能性，而且能確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。載體ID和遺傳ID與一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)系，進(jìn)行患者身份的數(shù)據(jù)確認(rèn)和鑒定。
一組已知序列的DNA片斷用作本發(fā)明所述的外部標(biāo)記的用途，在至少兩個(gè)方面是比現(xiàn)有技術(shù)有利的。第一，標(biāo)簽的確定，及因此鑒定被標(biāo)簽的樣本，可使用如雜交，延伸和連接等方法與感興趣的遺傳分析同時(shí)進(jìn)行。第二，得到的樣本ID通?？汕度氲接蛇z傳分析產(chǎn)生的圖像或數(shù)據(jù)記錄中。也就是說，樣本ID和遺傳分析的結(jié)果保持相關(guān)聯(lián)。相反，通過現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行的標(biāo)簽鑒定通常要求完成單獨(dú)的分析程序如用于確定外部標(biāo)記的DNA片斷長(zhǎng)度的電泳，以及遺傳測(cè)試本身。
如這里所用的，術(shù)語“多態(tài)性”指基因中的序列變異，“突變”指與或被認(rèn)為與一種表型相關(guān)的基因中的序列變異。術(shù)語“基因”指編碼功能性產(chǎn)物蛋白調(diào)控區(qū)域的基因組的片斷。本發(fā)明中所用的用于患者確認(rèn)的多態(tài)性標(biāo)記，可位于基因組的編碼區(qū)或非編碼區(qū)。術(shù)語“患者”，如這里所用的，指提供測(cè)試樣本的個(gè)體，從該測(cè)試樣本獲得的靶核酸用于遺傳測(cè)試目的。
術(shù)語“ID”，“ID標(biāo)記”和“標(biāo)記”這里可互換使用，指內(nèi)部標(biāo)記和外部標(biāo)記，它們的高可變性使它們適于作為特殊個(gè)體的分子識(shí)別。為了本發(fā)明的目的，內(nèi)部標(biāo)記，特別包括用于DNA指紋分析的遺傳ID標(biāo)記，可以是位于感興趣的基因內(nèi)的“內(nèi)在的”標(biāo)記，或可以是非內(nèi)在的，或“外來的”標(biāo)記。
內(nèi)部標(biāo)記包括位于基因組的基因座內(nèi)的SNPs，STRs，VNTRs和其它多態(tài)性位點(diǎn)。外部標(biāo)記包括化學(xué)的，熒光的，磁性的，分子的和一般在樣本收集時(shí)能整合到樣本中的其它標(biāo)簽。它們可用于使遺傳或其它測(cè)試如預(yù)兆和診斷測(cè)試中獲得的結(jié)果與患者身份唯一相關(guān)。外部標(biāo)記的例子包括生物標(biāo)記如由寡核苷酸，肽核酸，DNA，RNA，蛋白質(zhì)，ABO血型等等組成的標(biāo)簽，以及化學(xué)標(biāo)記如光學(xué)活性顆粒，染料等等。
隨機(jī)DNA序列標(biāo)簽的收集，如那些構(gòu)建用于某些雜交檢測(cè)的標(biāo)簽，表示一類能提供很大的編碼能力的外部標(biāo)記。例如，最近公布的一組164個(gè)序列標(biāo)簽(http//waldo.wi.mit.edu/publications/SBE-TAGS)，衍生自λ噬菌體的基因組，能提供2164不同的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，選自文庫(kù)的每個(gè)DNA序列標(biāo)簽的給定樣本中存在或缺失，可通過提供顏色編碼珠子的鑒定陣列來確定，其中每種類型的珠子表示一種能唯一與一種序列標(biāo)簽匹配的寡核苷酸探針。來自鑒定陣列中的珠子的這組信號(hào)，用相同類型的珠子進(jìn)行平均，組成了患者樣本的分子條形碼。
通過本領(lǐng)域已知的方法合成的無機(jī)熒光毫微顆粒，對(duì)以顆粒大小確定的波長(zhǎng)進(jìn)行的單個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生應(yīng)答而發(fā)光，表示另一類外部標(biāo)記。特定亞類的毫微顆粒標(biāo)簽在樣本中的存在，可通過樣本的光譜分析并同時(shí)完成感興趣的DNA分析來進(jìn)行確定?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了兩種類型的無機(jī)毫微顆粒標(biāo)記，即半導(dǎo)體Q-點(diǎn)(量子點(diǎn))顆粒和RLS(諧振光散射)金屬毫微顆粒。量子點(diǎn)是毫微米(10-9米)大小的顆粒，由半導(dǎo)體材料如硒化鎘(CdSe)，碲化鎘(CdTe)或砷化銦(InAs)制成。它們的組成和小的體積(幾百個(gè)到幾千個(gè)原子)給予這些點(diǎn)特別的光學(xué)特性，其能通過改變這些點(diǎn)的體積和組成而容易地定制。量子點(diǎn)吸收光，然后迅速地以不同的波長(zhǎng)發(fā)射光。盡管其它的有機(jī)染料和無機(jī)材料顯示這種現(xiàn)象，但是量子點(diǎn)具有窄的、對(duì)稱發(fā)射光譜的明亮和非漂白的優(yōu)點(diǎn)，而且具有使用單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)可同時(shí)激發(fā)的多種可分辨的顏色(Bruchez et al.，“Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels，Science，281，2013(1998)，Alivisatos，“Semiconductor Clusters，Nanocrystals，and Quantum Dots Science，271，933(1996))。
諧振光散射技術(shù)(RLS技術(shù))是基于“毫微大小的”金屬(例如金或銀)膠體顆粒，當(dāng)用簡(jiǎn)單的白光源照射時(shí)其能以散射光的形式輻射能量。單個(gè)RLS顆粒產(chǎn)生的單色光信號(hào)比從最靈敏的熒光團(tuán)獲得的信號(hào)高104到106倍，因此這些毫微顆粒能在多種分析生物檢測(cè)和測(cè)試形式中用作超靈敏的生物標(biāo)記。(Yguerabide，J.Analytical Biochemistry，262，137-156(1998)，Yguerabide，J.Analytical Biochemistry，262，157-176(1998))。
為了使用本發(fā)明的外部標(biāo)記，收集樣本如血液，唾液，毛發(fā)或骨髓樣本。外部標(biāo)記被整合作為樣本的部分，并且當(dāng)樣本進(jìn)行處理和分析時(shí)保持與樣本整合或其他關(guān)聯(lián)。這種標(biāo)記在包括群體載體篩選，基因分型，單倍體分型或諸如細(xì)胞因子，抗原或血清中抗體等蛋白質(zhì)分析的模式分析的檢測(cè)中可以被整合。
在某些實(shí)施方案中，一種或多種外部標(biāo)記可用于一種或多種內(nèi)部標(biāo)記的場(chǎng)合。在其它的實(shí)施方案中，一種或多種外部標(biāo)記可用于與一種或多種內(nèi)部標(biāo)記組合，從而提供另一種進(jìn)行樣本確認(rèn)和鑒定的方法。外部標(biāo)記也可整合到檢測(cè)中，該檢測(cè)包含于設(shè)計(jì)并提供用于收集和/或儲(chǔ)存患者樣本的柱體中，從而建立樣本，檢測(cè)容器或載體與遺傳測(cè)試之間的物理聯(lián)系。
用于遺傳測(cè)試和遺傳指紋分析的靶序列或靶核酸，可以是基因，調(diào)控序列，基因組DNA，cDNA和RNA(包括mRNA和rRNA)的部分?；蚪MDNA樣本通常在與探針接觸之前進(jìn)行擴(kuò)增?；蚪MDNA可從任何組織來源或循環(huán)細(xì)胞(除了純的紅血球)獲得。例如，基因組DNA方便的來源包括全血，精液，唾液，眼淚，尿，糞便，汗，口腔細(xì)胞，皮膚和毛發(fā)。含有多態(tài)性位點(diǎn)的基因組DNA的擴(kuò)增，如果從其獲得樣本的個(gè)體在多態(tài)性位點(diǎn)是純合的就產(chǎn)生單一種類的靶核酸，或者如果個(gè)體是雜合的就產(chǎn)生兩種靶分子。RNA樣本也經(jīng)常進(jìn)行擴(kuò)增。在這種情況中，擴(kuò)增通常先于反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。所有表達(dá)的mRNA的擴(kuò)增可如例如WO96/14839和WO 97/01603中所述的進(jìn)行，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考。如果提供樣本的個(gè)體在表達(dá)的RNA內(nèi)出現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)是雜合的，對(duì)來自二倍體樣本的RNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，會(huì)產(chǎn)生兩種靶分子，或者如果RNA的種類進(jìn)行可變剪接則可能更多。通常使用本領(lǐng)域已知的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。靶樣本中的核酸可在擴(kuò)增的過程中通過混入一種或多種標(biāo)記的核苷酸到擴(kuò)增混合物中來進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記也可以在擴(kuò)增之后連接到擴(kuò)增產(chǎn)物上(如通過末端-標(biāo)記)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以是RNA或DNA，取決于擴(kuò)增反應(yīng)中使用的酶和底物。
串聯(lián)重復(fù)，如例如短的串聯(lián)重復(fù)(STRs)，可用作遺傳ID標(biāo)記。通常，進(jìn)行基因分型和相關(guān)的遺傳測(cè)試的感興趣遺傳基因座，含有由在個(gè)體之間高可變的很多重復(fù)序列單元組成的重復(fù)序列。本發(fā)明的一個(gè)方面，其中的標(biāo)記是串聯(lián)重復(fù)，靶核酸序列中的串聯(lián)重復(fù)數(shù)可通過這里所述的平行探測(cè)來確定。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了在遺傳測(cè)試過程中給突變打分，通常設(shè)計(jì)針對(duì)感興趣的每個(gè)可變靶位的探針對(duì)。成對(duì)的兩個(gè)探針都與靶核酸序列互補(bǔ)，除了突變位點(diǎn)，其中成對(duì)探針中的至少一個(gè)與靶互補(bǔ)。探針的長(zhǎng)度足以與靶進(jìn)行雜交，優(yōu)選長(zhǎng)度為10到50個(gè)堿基，更優(yōu)選長(zhǎng)度為10到20個(gè)堿基。探針也可通過接頭連接到固體支持物上。突變分析包括一種或多種靶序列的探測(cè)，并可用便于高通量篩選的多種方式進(jìn)行。例如，針對(duì)不同靶序列的探針可以通過如這里所述的把探針連接到編碼的珠子上而排列于平面隨機(jī)陣列中。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以形成相同基質(zhì)(如硅電極)上的不同亞陣列，而且編碼和定位珠子亞陣列的珠子都提供關(guān)于位于各個(gè)珠子上的探針的身份的信息。如對(duì)重復(fù)的序列的分析，平行探測(cè)包括形成靶與序列特異性探針之間的雜交復(fù)合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針延伸提供了通過熒光標(biāo)記的dNTPs整合進(jìn)行延伸產(chǎn)物直接標(biāo)記的方法，包括但不限于，組合延伸和芯片上溫度循環(huán)的方法。標(biāo)記的延伸產(chǎn)物可通過這里所述的成像進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，能“引導(dǎo)”延伸反應(yīng)的延伸探針組，以能保持它們的特性并減少延伸產(chǎn)物鑒定中的不明確的方式，固定于固相載體上。例如，這可以通過空間分散不同探針和/或通過化學(xué)編碼探針特性來完成。
當(dāng)探針與靶鏈在允許雜交復(fù)合物形成的條件下接觸時(shí)，位于每個(gè)探針3’末端上或其附近的探測(cè)位點(diǎn)通常以兩種構(gòu)象中的一種，即以“重復(fù)-內(nèi)部”構(gòu)象或以“重復(fù)-外部”構(gòu)象，與靶排列。前者中，探測(cè)位點(diǎn)與靶的重復(fù)序列中的位點(diǎn)并列；后者中，探測(cè)位點(diǎn)與靶的前導(dǎo)序列中的位點(diǎn)并列。
探針通常設(shè)計(jì)成具有與目的基因組區(qū)域互補(bǔ)的尾巴和前導(dǎo)序列。為了制備通用的尾巴和前導(dǎo)序列，雜交引物可以設(shè)計(jì)成具有擴(kuò)增產(chǎn)物的部分的序列。例如，正向和反向PCR引物可以設(shè)計(jì)成在它們各自的5’末端含有富含GC的標(biāo)簽?；蚪MDNA的PCR擴(kuò)增在產(chǎn)物的5’末端引入該標(biāo)簽(圖13)。寡核苷酸探針然后被設(shè)計(jì)成含有與引物標(biāo)簽互補(bǔ)的5’錨定序列。這種設(shè)計(jì)機(jī)動(dòng)性便于改正探針與擴(kuò)增的靶之間的連接以使滑動(dòng)最小化(也就是，靶在幾個(gè)不同的位置雜交)，并增強(qiáng)檢測(cè)中的區(qū)分。例如，尾巴序列以從一個(gè)重復(fù)序列中不存在的核苷酸(兩個(gè)-和三個(gè)-核苷酸重復(fù))開始的方式設(shè)計(jì)，并能通過單個(gè)堿基延伸進(jìn)行檢測(cè)。
通過一組含有重復(fù)可變數(shù)的探測(cè)探針進(jìn)行靶重復(fù)序列探測(cè)的步驟，被設(shè)計(jì)成把對(duì)應(yīng)于兩種構(gòu)象中的一種的兩個(gè)值中的一個(gè)指派給每個(gè)探針，即匹配，(數(shù)字表示為1)，或不匹配，(數(shù)字表示為0)。由針對(duì)重復(fù)序列多態(tài)性的一組探針產(chǎn)生的探測(cè)結(jié)果的二進(jìn)制序列，確定了該多態(tài)性內(nèi)的靶重復(fù)數(shù)。如在很多實(shí)施例中詳細(xì)描述的，多種探針結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法的變化都是可能的，包括但不限于，用以熒光能量轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行檢測(cè)的直接雜交，及模板介導(dǎo)的探針延伸，其包括單個(gè)堿基延伸或連接。
在某些實(shí)施方案中，探針序列可以構(gòu)造成含有補(bǔ)償序列，位于第一個(gè)探針重復(fù)的5’端，而且該補(bǔ)償序列與靶重復(fù)的第一個(gè)或多個(gè)(但不是所有的)核苷酸匹配。含有補(bǔ)償?shù)奶结樑c靶以最佳的排列退火，又在兩種可能構(gòu)象之一產(chǎn)生了雜交復(fù)合物。在第一種構(gòu)象中，探針重復(fù)被數(shù)量等于補(bǔ)償大小的靶重復(fù)在探針的3’方向置換，以便探針的3’末端與一種靶重復(fù)的內(nèi)部位置連接。在第二種構(gòu)象中，探針序列的3’末端與前導(dǎo)序列內(nèi)的位置連接，該位置可通過補(bǔ)償?shù)拇笮〈_定。
對(duì)于每個(gè)感興趣的重復(fù)序列多態(tài)性，探針組可以構(gòu)建成含有相同的(隨意的)錨定序列和相同(隨意的)補(bǔ)償序列，但接著具有更高的重復(fù)數(shù)，以便探針組能跨越這里詳細(xì)描述的可能的靶重復(fù)范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可以設(shè)計(jì)成含有與靶的尾巴和前導(dǎo)序列互補(bǔ)的5’-或3’-錨定序列，以穩(wěn)定探針與靶的所需連接。目的組合物的前導(dǎo)和尾巴序列可以通過本領(lǐng)域已知的PCR方法(Innis et al，Academic Press，San Diego，CA(1990)，Mattila et al.，Nucleic Acid Research，4967(1991))在患者DNA擴(kuò)增的位點(diǎn)引入。前導(dǎo)和尾巴序列可以轉(zhuǎn)換以確定互補(bǔ)DNA鏈上的重復(fù)。
在其它的實(shí)施方案中，既不含5’-也不含3’-錨定序列的寡核苷酸探針可用于競(jìng)爭(zhēng)雜交。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，標(biāo)記的或未標(biāo)記的靶首先與設(shè)計(jì)成含有足夠大重復(fù)數(shù)的“封閉”DNA鏈形成雜交組合物，以超過最大預(yù)期的靶重復(fù)數(shù)。在該雜交復(fù)合物中，所有的靶重復(fù)因而是雙重構(gòu)象的。使這種“封閉”靶的溶液現(xiàn)在與顯示具有不同重復(fù)數(shù)探針的編碼珠子的陣列接觸。反應(yīng)混合物進(jìn)行孵育使探針與封閉鏈競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合靶重復(fù)。在該設(shè)計(jì)中，只有那些含有的重復(fù)數(shù)與靶重復(fù)數(shù)相等或超過靶重復(fù)數(shù)的探針，將從靶中取代(部分)封閉鏈并從而獲得檢測(cè)信號(hào)。以增加的嚴(yán)緊度洗滌，并調(diào)整本文所述的退火溫度，增強(qiáng)區(qū)分的水平。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在升高的溫度記錄檢測(cè)圖象，而且信號(hào)被記錄作為升高的溫度的函數(shù)。在所有探針-靶雜交復(fù)合物的強(qiáng)度-對(duì)-溫度圖中的連續(xù)峰，表示各自的解鏈溫度，而且探針含有與具有最高解鏈溫度的靶重復(fù)數(shù)相等或超過其的重復(fù)數(shù)。不同顏色標(biāo)記的靶可以在相同反應(yīng)中進(jìn)行分析。
與固定的探針形成雜交復(fù)合物的靶，可通過這里前面所述的檢測(cè)方法觀察。例如，與靶鏈退火的探針可以用標(biāo)記的dNTPs延伸，以便當(dāng)探針與靶中的重復(fù)數(shù)最佳匹配時(shí)出現(xiàn)延伸。幾種用于產(chǎn)生陽性檢測(cè)信號(hào)的其它構(gòu)象也可以容易地構(gòu)建。
如通常所述的序列特異性探針，用于平行探測(cè)重復(fù)序列的探針可以通過接頭部分固定到固體支持物上，該接頭部分的應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的。作為總的原則，探針應(yīng)當(dāng)足夠長(zhǎng)以避免與不相關(guān)的DNA靶序列退火。探針的長(zhǎng)度可以為大約10到50個(gè)堿基，更優(yōu)選大約15到25個(gè)堿基，甚至更優(yōu)選18到20個(gè)堿基。在多重檢測(cè)中，可使一種或多種溶液形式的靶與多種固定的探針在允許進(jìn)行退火和延伸反應(yīng)的條件下接觸。因此，本發(fā)明具有超過現(xiàn)有的通過凝膠電泳分析重復(fù)序列多態(tài)性的方法的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有方法是一種不適于高通量操作的方法。
本發(fā)明還包括用于平行探測(cè)單核苷酸多態(tài)性和單位點(diǎn)突變，以及用于檢測(cè)其它類型突變和多態(tài)性如多核苷酸多態(tài)性(例如，兩個(gè)，三個(gè)等等)，和通常觀察到的并可用于遺傳測(cè)試的小的插入和缺失的方法。
為了使完成分析所需的勞動(dòng)，材料和時(shí)間最小化，要求在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增和分析多個(gè)基因座。多重?cái)U(kuò)增方法尤其可用于遺傳疾病的分析，其中包括，杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，自毀容貌綜合征和囊性纖維化。此外，幾種自身免疫性疾病(如糖尿病)已經(jīng)與人白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)中的多態(tài)性相關(guān)。HLA復(fù)合體的多態(tài)性基因座顯示了強(qiáng)的連鎖不均衡，以致特定的單倍型在染色體上比預(yù)期的更常出現(xiàn)。對(duì)胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的易感性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與DQ基因座編碼的特定II類等位基因相關(guān)?；蜃鵇Qα可用于分子分型，并可用于包括疾病測(cè)序和分子分型的同時(shí)分析。
遺傳學(xué)上定義的線粒體疾病，其大部分是由線粒體(mt)DNA中的突變引起的，提供了另一個(gè)例子。平均的人細(xì)胞含有成千個(gè)mtDNA分子，其是編碼37個(gè)基因，13個(gè)氧化磷酸化(OXPHOS)多肽，rRNAs和22tRNAs的16,586核苷酸對(duì)的閉合循環(huán)分子。mtDNA分子具有比核基因組更高的突變率。
幾個(gè)mtDNA突變與大腦，心臟，骨骼肌和腎的變性疾病相關(guān)(圖8)。線粒體腦肌病形成了與受損的氧化磷酸化相關(guān)的紊亂的遺傳異源組。患者可能顯示從肌肉衰弱到視力降低和大腦變性紊亂的大范圍臨床癥狀，而對(duì)其目前沒有有療效的治療。線粒體基因組中發(fā)生的堿基取代和重排突變，與眼肌病，Keam-Sayre或Pearson綜合征和成人型糖尿病相關(guān)。線粒體疾病起因于雌性種系中的突變或獲得的突變。ATP合成酶中的堿基取代突變與肌肉衰弱，共濟(jì)失調(diào)，色素性視網(wǎng)膜炎(NARP)，Leigh綜合征，中央視覺降低(LHON)肌張力障礙和MELAS相關(guān)。三種mtDNA突變已經(jīng)證實(shí)與阿爾茨海默氏病和帕金森病相關(guān)。
幾個(gè)多態(tài)性標(biāo)記已經(jīng)在mtDNA中鑒定，并廣泛用于群體遺傳學(xué)研究中。這些標(biāo)記中的大多數(shù)都位于含有導(dǎo)致疾病的突變的基因內(nèi)，而且能與其一起擴(kuò)增。特異性地，32序列多態(tài)性，位于tRNA基因內(nèi)，適合作為單獨(dú)的ID標(biāo)記，其能嵌入到突變模式中。(Garboczi，et al，Mol.CellBioChem 10721-29(1991))。
本發(fā)明的方法包括靶核酸序列與遺傳ID標(biāo)記的同時(shí)探測(cè)。這可通過提供兩組或多組核酸探針來完成，如單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA，或帶有合成主鏈的核酸類似結(jié)構(gòu)如肽核酸。根據(jù)本發(fā)明，第一組探針設(shè)計(jì)成與感興趣的靶核酸序列互補(bǔ)，第二組探針設(shè)計(jì)成與一種或多種指定的ID標(biāo)記互補(bǔ)。這些第一與第二組探針可以連接到固相載體上，例如，芯片，晶片，玻片，膜，顆粒，珠子或任何能與考慮的檢測(cè)兼容的表面。
如這里所用的，術(shù)語“珠子”，“微球體”，“微?！焙汀邦w?！笨梢曰Q使用。珠子成分可包括，但不限于，塑膠，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸聚合物，順磁物質(zhì)，碳石墨，二氧化鈦，乳膠或交叉連接右旋糖苷如瓊脂糖，纖維素，尼龍，交叉連接膠束和聚四氟乙烯。
珠子可以帶有物理或化學(xué)可區(qū)分的特性。例如，珠子可用光學(xué)可區(qū)分的標(biāo)簽組染色，如那些含有一種或多種熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)染料的標(biāo)簽，可通過激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)，激發(fā)態(tài)壽命或發(fā)射強(qiáng)度來區(qū)分。以某種摩爾比率組合的光學(xué)可區(qū)分染料可用于根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法對(duì)珠子進(jìn)行染色。用于外和內(nèi)表面的組合的色碼描述于國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/10719，在此引入作為參考。能在物理或化學(xué)可區(qū)分特性的基礎(chǔ)上被鑒定的珠子被認(rèn)為是“編碼的”。
每組珠子的化學(xué)或物理可區(qū)分特性的檢測(cè)，以及使用這些珠子在遺傳或其它測(cè)試(如診斷或預(yù)后測(cè)試)中產(chǎn)生的這種珠子上的光學(xué)信號(hào)的確定，可分別通過記錄一組珠子或這些珠子的陣列的譯碼圖象和檢測(cè)圖象并對(duì)兩個(gè)圖象進(jìn)行比較來進(jìn)行。例如，在某些實(shí)施方案中，可以使用帶有圖象檢測(cè)器和計(jì)算機(jī)化影像捕捉和分析裝置的系統(tǒng)。獲得譯碼圖象以確定能唯一鑒定顯示于珠子表面的探針的化學(xué)和/或物理可區(qū)分特性。這樣，陣列中每個(gè)顆粒上的探針的身份可通過可區(qū)分的特性來提供。獲得陣列的檢測(cè)圖象以對(duì)如這里下面詳細(xì)描述的檢測(cè)中產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。
除了被編碼外，具有特異性寡核苷酸探針或引物的珠子可以某種方式空間分散，以便珠子的位置能提供關(guān)于珠子和進(jìn)而探針或引物身份的信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，空間編碼可通過把珠子置于兩個(gè)或多個(gè)空間分散的子陣列中來提供。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在譯碼和分析之前，珠子可以排列在基質(zhì)上的平面陣列中。珠子陣列可通過PCT/US01/20179中所述的方法制備，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考。珠子陣列也可以使用美國(guó)專利號(hào)6,251,691中所述的方法形成，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考。例如，光控動(dòng)電力可用于裝配稱為“LEAPS”過程中的珠子陣列，如美國(guó)專利號(hào)6,251,691所述?？蛇x擇地，如果使用了順磁珠子，可以通過應(yīng)用垂直于表面的磁場(chǎng)而在基質(zhì)表面形成陣列。珠子陣列也可以通過把珠子機(jī)械地置于基質(zhì)表面的約束結(jié)構(gòu)(如凹口)中而形成。在某些實(shí)施方案中，珠子陣列在形成后可通過物理方法，如，例如，通過使珠子嵌入到凝膠中形成凝膠顆粒膜來進(jìn)行固定。
使用隨機(jī)編碼珠子陣列進(jìn)行多重分子分析的例子，可通過ABO(和RH)血型的遺傳分析和測(cè)試提供。在該實(shí)施方案子中，編碼珠子陣列裝配于給定芯片的分散位置中，以允許同時(shí)進(jìn)行遺傳分析和測(cè)試。該分析可通過在編碼珠子上顯示對(duì)應(yīng)于ABO型和RH因子的各自的抗原，并把這些珠子裝配到用于在多重免疫檢測(cè)中檢測(cè)患者血清中抗體模式的陣列中來進(jìn)行。
ABO血液分型是基于人類和大多數(shù)脊椎動(dòng)物都攜帶有連接到某些膜蛋白的絲氨酸側(cè)鏈上的復(fù)雜寡糖的事實(shí)。氧連接的多糖復(fù)合物經(jīng)常暴露于人細(xì)胞的外表面，而且當(dāng)攜帶它們的細(xì)胞被注射到不含相同細(xì)胞表面抗原的個(gè)體中時(shí)，會(huì)引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。這種失配個(gè)體中的相反的免疫應(yīng)答模式形成了ABO血組分類的基礎(chǔ)，其中相同血型的個(gè)體可以接受另一個(gè)體的輸血，而具有不同血型的個(gè)體則不能。在與Rh因子兼容或不兼容的基礎(chǔ)上定義了其它血型，并用于聯(lián)系血型與不同個(gè)體的遺傳指紋。
血型反映了確定A和B血型的兩個(gè)基因的表達(dá)。A基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，其催化末端N-乙酰基-半乳糖胺(Gal Nac)殘基添加到核心多糖上，而B基因編碼使半乳糖(Gal)殘基添加到相同位置的類似酶。當(dāng)A和B基因存在時(shí)，兩種結(jié)構(gòu)都發(fā)現(xiàn)了，但當(dāng)僅僅存在O基因時(shí)，暴露寡糖上的位點(diǎn)。AA或AO個(gè)體的細(xì)胞攜帶A抗原，BB或BO個(gè)體的細(xì)胞攜帶B抗原，而AB個(gè)體的細(xì)胞攜帶A和B抗原，OO個(gè)體的細(xì)胞兩種抗原都不攜帶。
因此，生物化學(xué)標(biāo)記，其構(gòu)成了患者病史檔案的部分，如限定個(gè)體血型的細(xì)胞表面抗原組，能用于把遺傳模式與患者身份聯(lián)系起來。這種信息可通過芯片上的遺傳測(cè)試獲得，并與同時(shí)記錄的生化ID標(biāo)記聯(lián)系起來，該生化ID標(biāo)記可依次與現(xiàn)有的患者記錄相互參照來確保真實(shí)性。
根據(jù)本發(fā)明的方法，靶核酸序列與遺傳指紋的同時(shí)探測(cè)可通過以下方法進(jìn)行，首先如這里的實(shí)施例中所詳細(xì)描述的，確定遺傳ID標(biāo)記或多種感興趣的標(biāo)記，然后，設(shè)計(jì)多種寡核苷酸探針第一組針對(duì)感興趣的靶核酸序列，第二組針對(duì)感興趣的標(biāo)記或多個(gè)標(biāo)記。也就是說，第一組探針用于為遺傳測(cè)試或模式分析所設(shè)計(jì)的檢測(cè)中，第二組探針用于與遺傳測(cè)試同時(shí)進(jìn)行的分子指紋測(cè)定中。當(dāng)使用內(nèi)在標(biāo)記時(shí)，在靶序列中內(nèi)在標(biāo)記與其它指定的多態(tài)性突變一起進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)使用外在標(biāo)記時(shí)，需要用于分散但同時(shí)擴(kuò)增的分散引物組。
含有多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增靶核酸序列，或多種用于遺傳模式分析與遺傳ID標(biāo)記的這種序列的探測(cè)包括，通過使靶與編碼的，序列特異性寡核苷酸探針退火形成雜交復(fù)合物，來測(cè)定探針與靶片斷之間序列互補(bǔ)的程度。
靶基因與標(biāo)記的探測(cè)，可用本發(fā)明范圍內(nèi)的各種方法來完成。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中(這里稱為“直接雜交”)，熒光標(biāo)記的靶片斷可用于把可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)如熒光賦予雜交的探針-靶復(fù)合物。標(biāo)記的靶可使用標(biāo)記的引物通過前面的靶擴(kuò)增容易地生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，直接雜交可使用標(biāo)記的可檢測(cè)探針。例如，如這里提供的實(shí)施例中所詳細(xì)描述的，熒光能量轉(zhuǎn)移可用于通過形成三成員的雜交復(fù)合物來產(chǎn)生可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶序列組合物可從用于提供的探針組的酶介導(dǎo)的連接和延伸反應(yīng)的信號(hào)模式測(cè)定。在延伸介導(dǎo)的檢測(cè)中，聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)產(chǎn)生了反映設(shè)計(jì)用作引物功能的序列特異性探針的延伸或延長(zhǎng)的信號(hào)模式。通過本發(fā)明的任何方法產(chǎn)生的信號(hào)模式包含連同“指紋”一起的唯一個(gè)體基因型。
如這里所使用的，“雜交”是指第一核酸分子優(yōu)選與特定的第二核苷酸分子結(jié)合，退火，雙鏈或雜交。雜交復(fù)合物的穩(wěn)定性隨序列組成，長(zhǎng)度和外部條件而改變。雜交方法包括那些依賴于控制反應(yīng)條件的嚴(yán)緊性來破壞在混合物中形成的一些但是不是所有的雜交復(fù)合物的方法。使用這些方法，使形成雜交復(fù)合物的探針與靶序列之間完全互補(bǔ)的從部分互補(bǔ)的中區(qū)分開是可能的。
為了便于檢測(cè)，雜交復(fù)合物可以進(jìn)行修飾，使其含有一種或多種標(biāo)記。這些標(biāo)記可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法整合?？捎糜诒景l(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記包括通過分光鏡，光化學(xué)，生物化學(xué)，免疫化學(xué)，電學(xué)，光學(xué)或化學(xué)方法可檢測(cè)的任何組合物。本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括，高親合力結(jié)合標(biāo)記如用于使用標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素或其共扼物進(jìn)行染色的生物素，磁珠，熒光染料(例如，熒光素，Texas紅，若丹明，綠色熒光蛋白，等等)，放射性同位素標(biāo)記(例如，3H，125I，35S，14C或32P)，酶(例如，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)，表位標(biāo)記和顏色標(biāo)記如膠體金，著色的玻璃或塑料珠子(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳膠，等等)。檢測(cè)這些標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，例如，放射性同位素標(biāo)記可使用照相軟片或閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，熒光標(biāo)記可使用光電探測(cè)器探測(cè)發(fā)射的光來檢測(cè)。酶標(biāo)記一般通過給酶提供底物并檢測(cè)酶對(duì)底物作用所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來進(jìn)行檢測(cè)，顏色標(biāo)記可簡(jiǎn)單地目測(cè)著色的標(biāo)記來進(jìn)行檢測(cè)。一種方法使用膠體金作為標(biāo)記，其可通過測(cè)定來自金的光散射來進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記可在雜交之前或之后添加給擴(kuò)增產(chǎn)物。
“直接標(biāo)記”是可檢測(cè)的標(biāo)記，其在雜交之前直接連接，或整合到核酸中。相反地，“間接標(biāo)記”附著，或整合到雜交后形成的雜交復(fù)合物中。通常，間接標(biāo)記在雜交之前連接到已經(jīng)連接到擴(kuò)增核酸上的結(jié)合部分上。因此，例如，擴(kuò)增核酸可在雜交之前進(jìn)行生物素化。雜交之后，共扼熒光團(tuán)的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈霉素將結(jié)合含有生物素的雜交雙鏈體，提供容易檢測(cè)的標(biāo)記。
檢測(cè)與陣列中的探針雜交的標(biāo)記核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，當(dāng)使用顏色標(biāo)記時(shí)，對(duì)標(biāo)記進(jìn)行簡(jiǎn)單的目測(cè)就足夠了。當(dāng)使用放射性同位素標(biāo)記的探針時(shí)，檢測(cè)放射性(例如，使用照相軟片或固態(tài)檢測(cè)器)就足夠了。熒光標(biāo)記靶核酸的檢測(cè)可通過熒光顯微鏡方法來完成。雜交復(fù)合物陣列可使用光源以選擇的特定熒光標(biāo)記的激發(fā)波長(zhǎng)來激發(fā)，并檢測(cè)在發(fā)射波長(zhǎng)得到的熒光。激發(fā)光源可以是，例如，適于熒光標(biāo)記激發(fā)的激光。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探測(cè)步驟包括，靶退火的探針的延伸。該反應(yīng)，由聚合酶催化，通過以反映靶序列在已存在的雜交復(fù)合物中的組成的次序，給探針序列添加一種或多種三磷酸核苷，來產(chǎn)生延伸的雜交復(fù)合物。為了進(jìn)行該延伸反應(yīng)，探針的長(zhǎng)度必須包含末端延伸起始(“TEI”)序列。該TEI序列依次含有探測(cè)位點(diǎn)，其優(yōu)選與3’末端相符，但可能被引物序列中的3-4個(gè)堿基從3’末端取代。如果探測(cè)位點(diǎn)的組成與指定的靶位點(diǎn)的組成相匹配就進(jìn)行延伸。
通過添加選擇的脫氧核苷三磷酸(dNTPs)以復(fù)制突出的單互補(bǔ)鏈并檢測(cè)反應(yīng)的特異性，來延伸雙鏈DNA的3’凹缺末端的方法，在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有報(bào)道(Wu，Proc.Natl Acad.Sci，57(1)170-171(1967)，Wu，J.Mol.Biol，1435(3)523-37(1968))。它們同時(shí)整合一種dNTP，達(dá)到在每個(gè)位置含有4個(gè)dNTP，并使用具有放射性標(biāo)記的dNTP來檢測(cè)成功的整合。
相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了平行模式的重復(fù)序列分析，其中所有的延伸反應(yīng)在由位點(diǎn)特異性探測(cè)探針與靶形成的多拷貝雙鏈DNA中同時(shí)發(fā)生。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，為了便于平行檢測(cè)成功的延伸，可以使延伸反應(yīng)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)成像。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可提供兩種或多種探針用于特異性指定位點(diǎn)的探測(cè)，這些探針構(gòu)建用于預(yù)期位于探測(cè)位點(diǎn)和接近指定多態(tài)性位點(diǎn)一定范圍內(nèi)的非指定多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性或突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些多種探針序列含有至少一種與特異性靶序列在接近確保延伸范圍內(nèi)的所有位置都匹配的探針。
此外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用了覆蓋探針組。覆蓋探針組，(描述于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/364,416，其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考)包含允許同時(shí)探測(cè)位于核酸序列內(nèi)給定的多個(gè)指定多態(tài)性位點(diǎn)的探針，并包括對(duì)于每個(gè)位點(diǎn)，至少一種能與靶退火以允許在后續(xù)延伸反應(yīng)的基礎(chǔ)上分配兩個(gè)可能值之一，“匹配的” (延伸)或“非匹配” (沒有延伸)給該位置的探針。
與每個(gè)指定位置相關(guān)的覆蓋探針組可能含有兩種或多種在一個(gè)或多個(gè)位置不同的探針。在某些實(shí)施方案中，探針序列可含有能與DNA中的任何核苷酸形成堿基對(duì)的通用核苷酸。在某些實(shí)施方案中，探針可連接到編碼的微粒上，而且特異性地，覆蓋探針組中的兩種或多種不同類型的探針可連接到相同類型的微粒上。把兩種或多種不同類型的探針連接到珠子上的過程稱為“探針合并”。
TEI區(qū)域內(nèi)一個(gè)位置的錯(cuò)配，或在雙鏈錨定(“DA”)區(qū)域(也即，退火的結(jié)果)內(nèi)三個(gè)或多個(gè)位置的錯(cuò)配足以阻止延伸。因此，顯示這種組成不同的兩種探針的延伸，通常產(chǎn)生不同的延伸模式。所有這些探針只要它們是分離的，也即單獨(dú)編碼的，就可以在平行延伸反應(yīng)中倍增。
顯示相同TEI結(jié)果與顯示至多兩個(gè)位置不同的DA結(jié)果的探針，通常產(chǎn)生與最佳匹配相當(dāng)或較低產(chǎn)率(和信號(hào)強(qiáng)度)的延伸反應(yīng)。在第一種情況中，表示容許錯(cuò)配，由被討論的探針匹配的等位基因組將擴(kuò)展至包括那些DA區(qū)域內(nèi)顯示容許錯(cuò)配序列構(gòu)象的等位基因。在第二種情況中，表示僅僅部分容許，這里描述了三種方法以進(jìn)一步說明等位基因匹配模式。第一種方法中，那些在它們各自的DA區(qū)域顯示一個(gè)或兩個(gè)核苷酸多態(tài)性的探針包括于覆蓋組中，并通過定量比較由覆蓋組內(nèi)不同探針?biāo)a(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來獲得關(guān)于靶序列的信息。在第二種方法中，包括由系鏈(tether)連接的分離TEI和DA區(qū)域的探針，用于使DA區(qū)域更遠(yuǎn)離TEI區(qū)域以避免靶多態(tài)性。第三種方法中，探針被合適的合并，在該情況中只提供匹配等位基因組的適度延伸。
而這種提供或鑒定非指定的多態(tài)性位點(diǎn)的方法，尤其可用于聯(lián)系序列特異性探針的倍增延伸，它也可用于小的測(cè)序反應(yīng)(參見，如Pastinen，et al-Genome Res.7606-614(1997)，引入這里作為參考)。
在某些實(shí)施方案中，催化引物延伸的聚合酶是缺乏3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。這種酶的例子包括T7DNA聚合酶，T4DNA聚合酶，ThemoSequenase和Taq聚合酶。當(dāng)靶含有RNA序列時(shí)可使用反轉(zhuǎn)錄酶。除了聚合酶之外，也可以添加三磷酸核苷，優(yōu)選所有四種堿基。例如，可添加dNTPs或類似物。在某些其它實(shí)施方案中，可以添加ddNTPs。
成功的探針延伸，可通過與延伸的引物相關(guān)的固相載體的光學(xué)信號(hào)的變化來表示。這可通過本領(lǐng)域熟知的直接或間接標(biāo)記方法來完成。(如標(biāo)記核酸并檢測(cè)標(biāo)記的雜交核酸的方法的綜述，參見LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24，P.Tigson Ed.，Elsevier，NY(1993))。
直接標(biāo)記中，延伸反應(yīng)產(chǎn)生了具有對(duì)應(yīng)的光學(xué)信號(hào)的產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)染料可以連接到在延伸過程中被添加的一個(gè)或多個(gè)核苷酸上，以便延伸的引物獲得特有的光學(xué)信號(hào)。前面已經(jīng)描述了成功的延伸，其包括使用標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸(dNTPs)如Cye3-dUTP或者雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。(Wu，1968，參見上述)。
在間接標(biāo)記中，光學(xué)信號(hào)產(chǎn)生于延伸反應(yīng)之后進(jìn)行的附加步驟中。本發(fā)明還提供了提供用于檢測(cè)成功延伸反應(yīng)的光學(xué)信號(hào)的新方法，從而不需要標(biāo)記的dNTPs或ddNTPs，其是有利的，因?yàn)槿绻鹍NTPs或ddNTPs是標(biāo)記的，可用的聚合酶的效率在調(diào)節(jié)dNTP或ddNTP過程中會(huì)降低。
本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括，形成三成員的雜交復(fù)合物，以及它們用于串聯(lián)重復(fù)的平行探測(cè)中的應(yīng)用，包括但不限于，組合連接和芯片上溫度循環(huán)的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，探測(cè)步驟利用形成的三成員雜交復(fù)合物。除了靶和探測(cè)探針外，該復(fù)合物包括修飾的探針，其在與退火的探測(cè)探針很接近的位置與靶退火。合適地，該修飾的探針可與探測(cè)探針連接。
在一個(gè)實(shí)施方案中，形成的三成員的雜交復(fù)合物包括，探測(cè)探針和設(shè)計(jì)成熒光能量轉(zhuǎn)移對(duì)的讀出探針。該讀出探針的序列與靶的選擇結(jié)果匹配，覆蓋接近靶退火的探測(cè)探針3’端的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)。換句話說，只有當(dāng)探測(cè)探針的3’端與重復(fù)序列多態(tài)性內(nèi)部的靶位點(diǎn)連接時(shí)，才形成三成員的雜交復(fù)合物。為了使三成員的雜交復(fù)合物中的探測(cè)探針和讀出探針形成熒光能量轉(zhuǎn)移對(duì)，探測(cè)探針被構(gòu)建成在它的3’端或其附近含有第一個(gè)熒光團(tuán)，稱為供體，而讀出探針被構(gòu)建成在它的5’端或其附近含有第二個(gè)熒光團(tuán)，稱為受體。當(dāng)供體和受體與靶退火時(shí)，一個(gè)通常不超過3-4個(gè)核苷酸的缺口使供體從受體中分隔開。在這些條件下，當(dāng)三成員的雜交復(fù)合物形成時(shí)就發(fā)生從供體到受體的熒光能量轉(zhuǎn)移，而當(dāng)不形成三成員的復(fù)合物時(shí)就不發(fā)生。
熒光能量轉(zhuǎn)移的例子如圖15a和15b所示。兩組寡核苷酸探針設(shè)計(jì)成與重復(fù)序列之前的擴(kuò)增產(chǎn)物中的序列互補(bǔ)。在該設(shè)計(jì)中，三成員的雜交復(fù)合物以這樣的僅僅把含有正確重復(fù)數(shù)的探測(cè)探針置于很接近的讀出探針中的方式形成，從而使熒光能量從供體轉(zhuǎn)移到受體。
在該方式中，通過探測(cè)探針和靶形成的雜交復(fù)合物的“重復(fù)內(nèi)末端”和“重復(fù)外末端”構(gòu)象，在使用雙重染色檢測(cè)進(jìn)行的平行探測(cè)檢測(cè)中很容易區(qū)分。前者允許形成三成員的雜交復(fù)合物，從而允許熒光能量轉(zhuǎn)移，從而以供體的激發(fā)波長(zhǎng)照射產(chǎn)生受體的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光。相反，后者不形成三成員的雜交復(fù)合物，從而以供體的激發(fā)波長(zhǎng)照射產(chǎn)生供體的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光。
本發(fā)明的探測(cè)方法，當(dāng)使用覆蓋多個(gè)靶序列重復(fù)的讀出探針時(shí)，尤其可用于分析不需要單個(gè)重復(fù)分辨的長(zhǎng)重復(fù)序列多態(tài)性。亨廷頓基因提供了一個(gè)例子，其含有位于蛋白編碼序列的起始的CAG三核苷酸重復(fù)的多態(tài)性延伸。該疾病是由該基因的一個(gè)拷貝中該重復(fù)異常大的擴(kuò)展而導(dǎo)致。本發(fā)明可用于鑒定患者樣本中重復(fù)的擴(kuò)展。
另一個(gè)實(shí)施方案包括，在第一個(gè)溫度T1，形成在探測(cè)探針與讀出探針間不存在缺口的三成員的雜交復(fù)合物，讀出探針被設(shè)計(jì)成3’端或其附近含有熒光染料。形成三成員的復(fù)合物之后，讀出探針于第二個(gè)溫度T2連接到探測(cè)探針上，而且雜交復(fù)合物于第三個(gè)溫度T3＞Tm(其中Tm是解鏈溫度)變性，以留下表示讀出探針終止于起始雜交復(fù)合物的重復(fù)區(qū)段內(nèi)部的熒光鏈。該方法可被推廣到雙重染色檢測(cè)形式，其中具有不同熒光染料的第二個(gè)讀出探針與重復(fù)序列多態(tài)性外部區(qū)域中的序列退火(圖19)。
這種探測(cè)方法允許通過溫度T1，T2和T3之間的重復(fù)性循環(huán)，而進(jìn)行線性的芯片上擴(kuò)增，從而每個(gè)靶序列在連接產(chǎn)物形成中用作模板。
某種程度上，用于STR分析的方法，如本發(fā)明所述，是分析核酸中的重復(fù)序列單元和其它多態(tài)性的一般方法，它可用于分析來自除了人類來源之外的DNA。
例如，可分析微生物DNA(如細(xì)菌DNA)來進(jìn)行包括鑒定藥物抗性菌株的菌株分類，以及指導(dǎo)抗生素治療的選擇。DNA標(biāo)記如限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs)和多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)(STRs，VNTRs)已經(jīng)用于細(xì)菌和酵母菌株的鑒定。當(dāng)菌株單獨(dú)通過形態(tài)和生化標(biāo)記不能區(qū)別或區(qū)分時(shí)，這尤其有幫助。一種特別的應(yīng)用是炭疽桿菌(炭疽)的菌株分類，其是已知最單一同態(tài)的細(xì)菌種類之一。在位于vrrA基因的可變區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)的基礎(chǔ)上已經(jīng)鑒定了5個(gè)已知的菌株。
本發(fā)明STR分析方法的另一個(gè)應(yīng)用，是在鑒定和篩選顯示所需特性的特異性遺傳品種的情況中。例如，這些遺傳標(biāo)記可用于標(biāo)簽感興趣的特性，該特性通過未表征的遺傳因子確定并具有緊密聯(lián)系的明確的多態(tài)性基因座。已經(jīng)用于標(biāo)記輔助篩選(MAS)，鑒定和植物品種保護(hù)，作物育種和指紋識(shí)別目的的幾類DNA標(biāo)記包括，單位點(diǎn)改變(如SNPs)，以及單和多基因座重復(fù)標(biāo)記如VNTRs，STRs，與簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSRs)。
從下面的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。不過，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地理解這里的特定方法和討論的結(jié)論只是對(duì)后面的權(quán)利要求中所述的發(fā)明的解釋。
實(shí)施例實(shí)施例1具有嵌入的遺傳指紋的囊腫性纖維化突變模式在該實(shí)施例中，對(duì)CFTR基因中的突變進(jìn)行分析，以產(chǎn)生具有遺傳標(biāo)識(shí)嵌入板作為內(nèi)部標(biāo)記的遺傳模式(圖1)。大多數(shù)感興趣的CF突變位于外顯子3到21上(圖2和表1)。如果CFTR基因內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記的頻率對(duì)于CF患者相較于總的群體而言沒有顯著差異，這些標(biāo)記的探測(cè)在與正常染色體相對(duì)的突變體的分析中沒有產(chǎn)生偏差。
選擇合適的引物確保位于CFTR基因內(nèi)的序列多態(tài)性能與指定的突變同時(shí)擴(kuò)增，以通過后面的雜交進(jìn)行探查。在包括由編碼的珠子組成的陣列的優(yōu)選實(shí)施方案中，一組珠子用與感興趣的CFTR突變互補(bǔ)的探針進(jìn)行修飾，第二組探針用與選擇的內(nèi)在多態(tài)性ID標(biāo)記互補(bǔ)的探針進(jìn)行修飾。(擴(kuò)增的)患者樣本的等分試樣置于裝配的珠子陣列中，以產(chǎn)生并記錄，在一單一步驟中，具有嵌入遺傳ID的遺傳模式。在包括隨機(jī)編碼珠子陣列的優(yōu)選實(shí)施方案中，下述的是典型的檢測(cè)條件。
用兩種熒光染料的不同組合進(jìn)行染色的珠子，用中性鏈親和素(neutravidin)和生物素化的寡核苷酸探針進(jìn)行功能化，后一個(gè)步驟在TBS(10mM Tris HCl，0.5M NaCl w/v)中于室溫進(jìn)行45min。使用用Cy5標(biāo)記5′的正向引物和用磷酸鹽基團(tuán)修飾的反向引物對(duì)靶進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)成與特異性外顯子最旁臨的內(nèi)含子序列，或與標(biāo)記某些外顯子的起始或末端的序列同源。這些引物的使用，允許靶基因與位于由選擇的引物限定的基因座內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
外顯子7的多態(tài)性當(dāng)含有3個(gè)CF突變(334W，347P和1078T)的外顯子7，用它的末端旁臨的引物組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，位于dbSNP 100083C/T，dbSNP 100084C/G，dbSNP 100085 A/G，dbSNP 1799834C/G，dbSNP1800086C/G，dbSNP 1800087A/G位置的序列多態(tài)性也被擴(kuò)增了(圖3和4)。這些多態(tài)性表示內(nèi)在的ID標(biāo)記，其通過與位于隨機(jī)陣列內(nèi)的編碼珠子上的對(duì)應(yīng)寡核苷酸探針組雜交而進(jìn)行探測(cè)。
外顯子10的多態(tài)性最常見的CF突變，δ508，位于外顯子10上。位于外顯子10上的SNPs包括dbSNP 100089C/T，dbSNP 100090C/T，dbSNP 213950 A/G，dbSNP 100092C/G，dbSNP 1801178A/G dbSNP 180093G/T，dbSNP 180094A/G和dbSNP 1900095G/T(圖5)，可與突變一起擴(kuò)增，并通過與位于隨機(jī)陣列中的編碼珠子上的對(duì)應(yīng)寡核苷酸組雜交而進(jìn)行探測(cè)。
從患者樣本提取的基因組DNA，使用引物組在多重PCR(mPCR)反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行囊腫性纖維化分析的mPCR方案的優(yōu)選實(shí)施方案(L.McCurdy，Thesis，Mount Sinai School of Medicine，2000，其引入這里作為參考)如下所述。使用標(biāo)簽的嵌合引物進(jìn)行多重PCR，在其各自的5’末端，用一個(gè)通用序列來縮小各自的解鏈溫度范圍。合成的PCR引物在5’末端含有Cy5或Cy55(Amersham)標(biāo)記。使用Perkin Elmer 9600熱循環(huán)儀，進(jìn)行28個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由10秒的變性步驟，于94℃以48秒傾斜(ramp)，10秒的退火步驟，于60℃以36秒傾斜，和40秒的延伸步驟，于72℃以38秒傾斜組成，每50μl的反應(yīng)混合物含有500ng基因組DNA，1X PCR緩沖液(10mM Tris HCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl2，200uM每種PCR級(jí)的dNTPs和5個(gè)單位的Taq DNA聚合酶。對(duì)每個(gè)引物對(duì)確定最佳的引物濃度。
擴(kuò)增以后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化以除去所有的試劑，并通過分光光度分析測(cè)定DNA的濃度。為了產(chǎn)生單鏈的靶，PCR產(chǎn)物(200ng)用2.5單位的(λ)核酸外切酶在1X緩沖液中于37℃孵育20min，并于75℃滅活10min。在這些條件下，酶從5’-磷酸化末端消化雙鏈DNA的一條鏈，并釋放5’磷酸單核苷(圖6)。產(chǎn)物直接用于雜交混合物(2.25MTMAC，0.15％SDS，3mM EDTA)中。
對(duì)于每個(gè)雜交反應(yīng)，5μl的雜交混合物置于硅片的表面，每個(gè)芯片攜帶顯示寡核苷酸探針的編碼珠子的陣列。芯片置于帶蓋子的盤中，并置于55℃孵育器中的振動(dòng)表面(～200rpm)中15min。芯片通過用1XTMAC緩沖液沖洗陣列三次來進(jìn)行洗滌。記錄來自陣列中每個(gè)珠子的Cy5熒光信號(hào)，并使用熒光顯微鏡、CCD照相機(jī)和圖像分析軟件進(jìn)行分析，以確定突變模式。
實(shí)施例2具有嵌入遺傳指紋的杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良突變模式該實(shí)施例解釋了用于杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)的遺傳ID的設(shè)計(jì)，X-連接的隱性特性大部分出現(xiàn)在雄性中，其特征在于肌肉力量的逐步衰退。盡管肌肉的DMD蛋白(抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白)分析，提供了精確的診斷測(cè)試，但是它是有侵襲性的并且成本和風(fēng)險(xiǎn)高。而且，由于蛋白在羊水或絨毛膜絨毛組織中不表達(dá)，蛋白測(cè)試不適于產(chǎn)前診斷。另一方面，已經(jīng)克隆了DMD基因，而且使用要求與10個(gè)cDNA探針雜交的Southern印跡，鑒定了幾種缺失(圖7)。(Kunkel，et al，Nature，32273-77(1986))。
多重PCR方法已經(jīng)描述用于同時(shí)分析這些基因缺失。(Monaco etal，Nature，323646-650(1986))。內(nèi)在遺傳ID可以得自位于DMD基因內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)的幾個(gè)二核苷酸重復(fù)多態(tài)性組。圖7闡述了用于分析DMD基因內(nèi)的基因缺失和多態(tài)性ID標(biāo)記的方法。PCR引物設(shè)計(jì)成位于外顯子序列的旁臨，以致旁臨序列內(nèi)存在缺失而阻斷了靶的擴(kuò)增，導(dǎo)致后續(xù)探測(cè)中無效的結(jié)果。
實(shí)施例3遺傳模式與遺傳指紋記錄的匹配提供通過已知的DNA指紋識(shí)別方法記錄的遺傳指紋，如，例如，用作部分新生兒測(cè)試或那些用于整個(gè)選擇的群體的方法(例如，防衛(wèi)部隊(duì)的成員或監(jiān)獄犯人)，本發(fā)明的方法提供了確認(rèn)遺傳指紋并同時(shí)進(jìn)行遺傳測(cè)試的方法。例如，標(biāo)記，如STRs，其被記錄用于親子關(guān)系和法醫(yī)檢定分析。此外，可以使用得自SNP基因分型或單倍體分型中的標(biāo)記。從而，具有嵌入遺傳ID的遺傳模式通過匹配遺傳IDs很明確地與特定的患者記錄相關(guān)聯(lián)。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法，人的遺傳指紋可以與其它的遺傳數(shù)據(jù)一起記錄到數(shù)據(jù)庫(kù)中。如果個(gè)體接著進(jìn)行后續(xù)的遺傳測(cè)試(例如，為了任何遺傳疾病或單倍體分型)，第二個(gè)測(cè)試的結(jié)果可通過比較與第一個(gè)和第二個(gè)測(cè)試相關(guān)的遺傳指紋而明確證實(shí)。
實(shí)施例4TH01中STR長(zhǎng)度多態(tài)性的芯片上鑒定HUMTH01基因座在酪氨酸羥化酶基因中含有四核苷酸重復(fù)(CATT)。為了測(cè)定這些STR多態(tài)性的長(zhǎng)度，合成的寡核苷酸探針，含有設(shè)計(jì)成與靶的尾巴序列互補(bǔ)的六個(gè)核苷酸的5’錨定序列，以及設(shè)計(jì)成與靶的前導(dǎo)序列互補(bǔ)的六個(gè)核苷酸的3’錨定序列，如下5’ttc cct..….cac cat 3’
為了測(cè)定靶中重復(fù)序列的長(zhǎng)度，提供了一組寡核苷酸探針，其含有一個(gè)長(zhǎng)度匹配的探針，因此在重復(fù)CATT序列單元的數(shù)量?jī)?nèi)，，與任何預(yù)期的互補(bǔ)靶重復(fù)數(shù)匹配。在該設(shè)計(jì)中，只有含有正確數(shù)量的四聚物重復(fù)的探針，將與靶形成雜交復(fù)合物，其中5’錨定和3’錨定都能分別與靶的尾巴和前導(dǎo)序列適當(dāng)連接，而且只有正確連接的探針被延伸從而產(chǎn)生陽性檢測(cè)信號(hào)。
合成寡核苷酸探針，其含有17個(gè)核苷酸而且生物素標(biāo)記通過12-C間隔區(qū)方式連接到5’末端(生物素-TEG)(圖9a)，并使用商業(yè)銷售商提供的反相HPLC方法(Synthegen TX)進(jìn)行純化。使用生物素部分，探針連接到涂有抗生物素蛋白鏈霉素的編碼珠子上，該珠子裝配到硅片中的平面陣列中。使含有10mM Tris-HCl(pH 7.4)1mM EDTA，0.2M NaCl和0.1％ Triton X-100的雜交混合物中的1微摩爾含有6個(gè)CATT重復(fù)的單鏈靶，與隨機(jī)編碼的珠子陣列接觸并于50℃孵育20min。雜交混合物然后被含有3U的Thermo Sequenase(Amersham Pharmacia BiotechNJ)，和與具有TAMRA標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)類似物(NEWLife Sciences)的1X酶緩沖液的混合物取代，并于60℃進(jìn)行探針延伸3min。退火和延伸反應(yīng)可在單個(gè)步驟中通過添加ddNTPs或dNTPs到混合物中并于兩個(gè)溫度進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)行。珠子陣列然后用蒸餾水洗滌15min，含有來自陣列中每個(gè)珠子的熒光信號(hào)的圖象使用熒光顯微鏡和CCD照相機(jī)進(jìn)行記錄。分析圖象來確定每個(gè)延伸(和熒光)探針的身份。如圖9b所示，記錄的最強(qiáng)的信號(hào)來自顯示6個(gè)四聚物的探針(ST-6)的珠子，表明該探針含有于靶重復(fù)數(shù)相匹配的正確重復(fù)數(shù)。
實(shí)施例5使用含有3’錨定(“鉤狀”)序列的探針在芯片上確定STR長(zhǎng)度多態(tài)性設(shè)計(jì)的含有短3’錨定(“鉤狀”)序列(但不是5’錨定序列)的寡核苷酸，被連接到編碼的珠子上(圖10a)。特異性地，分別含有3，4和6個(gè)四聚物重復(fù)的探針，被設(shè)計(jì)用于探測(cè)含有由5’前導(dǎo)序列和3’尾巴序列旁臨的6個(gè)四聚物重復(fù)的靶片斷。
在該設(shè)計(jì)中，所有的探針將與靶形成雜交復(fù)合物，其中探針的3’錨定序列與靶的前導(dǎo)序列適當(dāng)?shù)剡B接。但是，通過設(shè)定檢測(cè)溫度為超過除最長(zhǎng)的探針以外的所有探針的解鏈溫度的值，只有含有該探針的雜交化合物保留，而且僅該探針被延伸以產(chǎn)生陽性檢測(cè)信號(hào)。
如這里前面所述的，在存在DNA聚合酶和ddGTP時(shí)進(jìn)行單堿基延伸。如所期望的，記錄的最強(qiáng)的信號(hào)來自顯示6個(gè)四聚物探針的珠子(圖10b)。這些結(jié)果證實(shí)通過本發(fā)明的組合物和方法能產(chǎn)生高水平的區(qū)分。
實(shí)施例6使用雙重染色檢測(cè)在芯片上鑒定STR長(zhǎng)度多態(tài)性寡核苷酸的設(shè)計(jì)如實(shí)施例4，但是單堿基延伸反應(yīng)在存在分別用TAMRA(綠色)和熒光素(橙色)(NEW Life Sciences)標(biāo)記的兩種ddNTPs時(shí)進(jìn)行(圖11a)。如果退火的探針終止于重復(fù)序列的外部(外部標(biāo)記)，綠色ddNTP被整合，而如果退火的探針終止于重復(fù)序列的內(nèi)部(內(nèi)部標(biāo)記)橙色ddNTP則整合。含有6個(gè)四聚物重復(fù)的靶被添加到溶液中，并如前所述的進(jìn)行檢測(cè)和綜合分析。如前，記錄在由6個(gè)四聚物探針ST-6的延伸所產(chǎn)生的綠色信道中的強(qiáng)信號(hào)，表明該探針含有正確的重復(fù)數(shù)。此外，由3個(gè)四聚物探針ST3和4個(gè)四聚物探針ST4的延伸所產(chǎn)生的橙色信道中的強(qiáng)信號(hào)，表明這些探針終止于重復(fù)序列的內(nèi)部而且含有錯(cuò)誤的重復(fù)數(shù)(圖11b)。這種雙重染色形式通過產(chǎn)生組中所有探針的陽性信號(hào)提供了檢測(cè)結(jié)果的附加的確認(rèn)。
實(shí)施例7錨定長(zhǎng)度對(duì)探針滑動(dòng)的影響合成的兩組寡核苷酸探針，除了3，4和6個(gè)四聚物重復(fù)外，含有兩組探針分別有6和11個(gè)核苷酸的5’錨定序列，以及相同的3’錨定序列，如下5’ttc cct…………cac cat 3’5’ctt att tcc ct……….cac cat 3’
如前所述，5’錨定序列設(shè)計(jì)成與重復(fù)旁臨的靶尾巴序列互補(bǔ)。為了測(cè)定靶中重復(fù)序列的長(zhǎng)度，提供的一組寡核苷酸探針含有一個(gè)長(zhǎng)度匹配的探針，從而在重復(fù)CATT序列單元數(shù)內(nèi)，與任何預(yù)期的互補(bǔ)靶重復(fù)數(shù)匹配。
使用如前所述的反應(yīng)條件(實(shí)施例4)，含有較長(zhǎng)的5’錨定序列的探針產(chǎn)生了高于含有短的5’錨定序列的信號(hào)水平，表明較長(zhǎng)的探針形成的雜交復(fù)合物的穩(wěn)定性較高。(圖12)。錨定序列可以改變以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)的需要。
實(shí)施例8退火溫度對(duì)STR多態(tài)性分析的特異性的影響設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，單堿基延伸的進(jìn)行如實(shí)施例5所述，但是于兩個(gè)不同的退火溫度，即于37℃和50℃。對(duì)50℃獲得的結(jié)果進(jìn)行的圖像分析，顯示在含有正確重復(fù)數(shù)的ST-6探針與含有不正確重復(fù)數(shù)的探針之間區(qū)別較大，而對(duì)37℃獲得的結(jié)果進(jìn)行的圖像分析顯示基本上沒有區(qū)別(圖14)。選擇正確的檢測(cè)溫度能相當(dāng)大地增強(qiáng)檢測(cè)的特異性。
實(shí)施例9同義和反義探針本實(shí)施例示例了使用既不含5’也不含3’錨定序列的寡核苷酸探針進(jìn)行同義和反義DNA鏈的分析。含有這種錨定序列與同義和反義DNA兩者中的尾巴和前導(dǎo)序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，也可用于其它實(shí)施方案中。兩組探針都連接到編碼的珠子上，該編碼的珠子分別裝配到置于相同芯片載體上的兩個(gè)硅片表面。用兩組引物擴(kuò)增靶，每個(gè)靶含有6個(gè)重復(fù)以及一個(gè)3’尾巴序列和一個(gè)5’前導(dǎo)序列。如實(shí)施例5中所述的，單堿基延伸當(dāng)存在DNA聚合酶和ddNTPs時(shí)進(jìn)行。在該設(shè)計(jì)中，只有探針含有與靶重復(fù)數(shù)相匹配的正確重復(fù)數(shù)時(shí)才發(fā)生延伸。
實(shí)施例10聚T鑒定設(shè)計(jì)寡核苷酸探針用于CFTR基因中內(nèi)含子8聚胸苷(T)束(tract)變異體(5T，7T，9T)的鑒定。合成每個(gè)探針并使用由商業(yè)銷售者(IDT)提供的反相HPLC進(jìn)行純化，以含有通過12C-間隔區(qū)(生物素-TEG)的方式連接至5’末端的生物素標(biāo)記。探針被設(shè)計(jì)成含有與靶的3’尾巴序列匹配的5’錨定序列，以及與靶的5’前導(dǎo)序列匹配的3’錨定(“鉤狀”)序列。錨定序列長(zhǎng)度在4和10個(gè)堿基間變化；更長(zhǎng)的錨定序列長(zhǎng)度也是可能的(圖16)。含有可變重復(fù)數(shù)的探針固定于前面所述的編碼珠子上。
在該設(shè)計(jì)中，當(dāng)DNA聚合酶存在時(shí)，只有于靶序列連接并與靶重復(fù)數(shù)匹配的探針被延伸。在延伸步驟中，提供dNTPs，至少一種熒光標(biāo)記的dNTP來產(chǎn)生熒光標(biāo)記的延伸產(chǎn)物，或者一種或多種標(biāo)記的ddNTPs用于進(jìn)行如前面實(shí)施例所述的單堿基延伸。通過如本申請(qǐng)中所述的陣列的瞬時(shí)成像來記錄信號(hào)。使用含有不同長(zhǎng)度聚-T變異體的靶得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)各種聚-T變異體的鑒定是可以的。
實(shí)施例11CFTR基因聚T變異體的鑒定解鏈溫度，含有nT變異體的給定的雜交復(fù)合物的Tm(n)，反映了變異體的長(zhǎng)度以及探針與靶之間不匹配的程度。也就是說，通過設(shè)定檢測(cè)溫度使除了那些含有與靶中的聚-T序列長(zhǎng)度匹配或超過其的探針的雜交復(fù)合物外的所有雜交復(fù)合物不穩(wěn)定，從而達(dá)到最佳的區(qū)分。例如，通過設(shè)定檢測(cè)溫度T以滿足Tm(5)＜T＜Tm(7)，Tm(9)的條件，很容易鑒定含有7T變異體的靶。
為了進(jìn)行檢測(cè)，1μmol的靶被添加到退火和延伸混合物中，其含有10mM Tris-HCl(pH 7.4)1mM EDTA，0.2M NaCl，0.1％ Triton X-100，3U的Thermo Sequenase(Amersham Pharmacia Biotech NJ)，以及TAMRA-標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)類似物(NEN Life Sciences)。
退火和延伸之后，珠子陣列用蒸餾水洗滌15min。使用熒光顯微鏡和CCD照相機(jī)記錄含有來自陣列中每個(gè)珠子的熒光信號(hào)的圖象，并對(duì)圖象進(jìn)行分析以確定每個(gè)延伸引物的身份。圖17中的結(jié)果證實(shí)通過本發(fā)明的組合物和方法完全能鑒定靶中的聚T變異體。
實(shí)施例12設(shè)計(jì)梯級(jí)探針用于長(zhǎng)重復(fù)的分析本實(shí)施例解釋了設(shè)計(jì)探針用于分析很多遺傳疾病中普遍存在的長(zhǎng)靶重復(fù)的方法。該方法包括“基數(shù)-補(bǔ)償(base-offset)”結(jié)構(gòu)，其中第一組“基數(shù)”探針構(gòu)建成含有1N，2N，3N，...(N＞1)重復(fù)，而且這些“基數(shù)”探針連接到分離的編碼珠子上。第二組“補(bǔ)償-探針”構(gòu)建成含有全部N+n重復(fù)，其中n＜N。重要地，為了使所需的編碼數(shù)最少，含有相同補(bǔ)償?shù)乃刑结樁歼B接到相同類型的編碼珠子上。圖18描述了具有公因子如5’錨定序列的兩種分離的探針設(shè)計(jì)。
當(dāng)診斷不需要進(jìn)行單重復(fù)分析時(shí)，該方法尤其有用。例如，在診斷對(duì)某種疾病狀態(tài)(如亨廷頓氏疾病)的誘因時(shí)，關(guān)鍵是要使用單重復(fù)分析來確定僅僅在35與41之間的重復(fù)數(shù)，確定病理學(xué)可能性的臨界范圍。也即，具有超過41個(gè)重復(fù)的患者將發(fā)生該疾病，而具有少于35個(gè)重復(fù)的患者則不會(huì)，病理學(xué)的可能性隨35與41之間的重復(fù)數(shù)而增加。
例如，為了測(cè)定為7(即N＝7)的分析中靶重復(fù)數(shù)達(dá)到42，6個(gè)“基數(shù)-探針”被構(gòu)建成分別含有7，14，21，...，42個(gè)重復(fù)。這些探針連接到編碼珠子上。在前面的實(shí)施例中所述的檢測(cè)條件下，使除了那些含有重復(fù)數(shù)與靶重復(fù)數(shù)匹配或超過靶重復(fù)數(shù)的探針的雜交復(fù)合物外所有的雜交復(fù)合物都不穩(wěn)定。例如，通過設(shè)定檢測(cè)溫度，T，到超過Tm(35個(gè)重復(fù))的適當(dāng)高值，在檢測(cè)之前可以容易地確定很精確的數(shù)值，含有32個(gè)靶重復(fù)的樣本產(chǎn)生僅針對(duì)含有35和42個(gè)重復(fù)的基數(shù)探針的信號(hào)，而含有39個(gè)靶重復(fù)的樣本產(chǎn)生僅針對(duì)含有42個(gè)重復(fù)的基數(shù)探針的信號(hào)。在第一種情況中，不需要進(jìn)一步的分析。在第二種情況中，靶被確定含有至少35個(gè)重復(fù)，使用一組“補(bǔ)償探針”來確定確切的數(shù)量。因此，補(bǔ)償，n＜7，在1與6之間變化，顯示相同補(bǔ)償數(shù)的探針分為一組。也即，具有0+1，7+1，14+1，...35+1個(gè)重復(fù)的那些探針，具有0+2，7+2，14+2，...35+2個(gè)重復(fù)的那些探針，等等直到具有0+6，7+6，14+6，...35+6個(gè)重復(fù)的那些探針被分組(“集中”)，并連接到相同類型的編碼珠子上。在上述的檢測(cè)條件下，含有39個(gè)重復(fù)的樣本產(chǎn)生對(duì)于補(bǔ)償探針n＝4，5和6，但不針對(duì)補(bǔ)償探針n＝1，2和3的信號(hào)，因?yàn)榍懊?組分別含有具有35+4，35+5，35+6個(gè)重復(fù)的探針，而后3組中表示的最大重復(fù)數(shù)，35+3，與靶重復(fù)數(shù)不匹配或不超過靶重復(fù)數(shù)。這組檢測(cè)讀數(shù)確定了確切的靶重復(fù)數(shù)。
相關(guān)的設(shè)計(jì)使用2組“基數(shù)探針”，第二組相對(duì)于第一組而改變。在上述的實(shí)施例中，改變?yōu)棣＝3的第二組基數(shù)探針，含有具有0+3，7+3，14+3，...35+3個(gè)重復(fù)的探針，每個(gè)都連接到編碼珠子上。對(duì)于具有39個(gè)重復(fù)的患者樣本，第一組基數(shù)探針產(chǎn)生僅針對(duì)具有42個(gè)重復(fù)的基數(shù)探針的信號(hào)，從而把靶重復(fù)數(shù)設(shè)為＞35；第二組基數(shù)探針根本不產(chǎn)生信號(hào)，從而把靶重復(fù)數(shù)設(shè)為＞38。這種使用倍數(shù)改變補(bǔ)償探針組的可選擇設(shè)計(jì)對(duì)確定靶的重復(fù)數(shù)尤其有用。
實(shí)施例13通過連接和芯片上循環(huán)鑒定多態(tài)性重復(fù)本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)用于鑒定TH01基因座中的重復(fù)數(shù)的實(shí)驗(yàn)，在由2個(gè)探針與靶形成的三成員的雜交復(fù)合物中，使用連接來把標(biāo)記的檢測(cè)探針連接到鄰近的固定捕捉探針上。
設(shè)計(jì)的檢測(cè)探針與靶的前導(dǎo)序列(如實(shí)施例1)和部分重復(fù)序列互補(bǔ)。在第一種溫度，T1，靶將與固定的捕捉探針退火。添加檢測(cè)探針，于第一種溫度，或優(yōu)選的第二種，更高的溫度，T2＞T1，并允許與靶的前導(dǎo)序列退火，但是只有當(dāng)它含有正確的靶重復(fù)數(shù)時(shí)才被連接。選擇在第三種溫度，T3＞T1，T2，以使非連接的三成員雜交復(fù)合物不穩(wěn)定，只有在那些保留連接的檢測(cè)探針的珠子上才留有信號(hào)(圖19a)。這些珠子鑒定了具有正確重復(fù)數(shù)的探針。
在上述設(shè)計(jì)的變化中，該檢測(cè)通過T1＜T2＜T3的順序進(jìn)行多次循環(huán)，以使每個(gè)單獨(dú)靶鏈介導(dǎo)多個(gè)連接反應(yīng)。在確保捕捉和檢測(cè)探針過剩的情況下，循環(huán)導(dǎo)致了線性的信號(hào)擴(kuò)增。該檢測(cè)可在具有瞬間成象的輕便熱循環(huán)儀中于任何溫度進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其用于分析從患者樣本獲得的靶核酸序列，并用于提供所述患者的遺傳指紋，所述的組合物含有第一組探針，含有能與從用于遺傳測(cè)試的患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針，第二組探針，含有用于與多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記雜交的寡核苷酸探針，與所述標(biāo)記的雜交提供了能對(duì)所述患者進(jìn)行鑒定的遺傳指紋，其中第一組和第二組探針都連接到珠子上，所述的珠子帶有能唯一確定與連接到所述珠子上的探針的化學(xué)或物理學(xué)可區(qū)分特性。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中的珠子排列于平面陣列中。
3.權(quán)利要求2所述的珠子，其中的珠子陣列包括子陣，而且第二組探針與第一組探針位于不同的子陣中。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中的平面珠子陣列置于電極上。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中的平面珠子陣列置于硅片上。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中的珠子具有能唯一確定連接到所述珠子上的探針的化學(xué)標(biāo)記，其中的化學(xué)標(biāo)記包括一種或多種熒光染料。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中的靶核酸序列被分析以確定它是否含有突變，而且其中的靶核酸和多態(tài)性標(biāo)記位于相同的基因上。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中的靶核酸序列被分析以確定它是否含有突變，而且其中的靶核酸和多態(tài)性標(biāo)記位于不同的基因上。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中的靶序列包括突變位點(diǎn)，并提供了多個(gè)相應(yīng)的探針，所述的探針與所述靶序列互補(bǔ)，除對(duì)應(yīng)于該突變位點(diǎn)的核苷酸之外，而且位于所述位點(diǎn)的核苷酸一起達(dá)到了位于所述位點(diǎn)的所有突變。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中靶序列包括突變位點(diǎn)，并提供了多個(gè)相應(yīng)的探針，所述的探針與所述靶序列互補(bǔ)，除對(duì)應(yīng)于該突變位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于所述位點(diǎn)的核苷酸一起提供了所有四種堿基A，C，G和T/U。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中每個(gè)標(biāo)記都含有多態(tài)性位點(diǎn)，而且對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，提供了多個(gè)對(duì)應(yīng)的探針，所述探針與所述標(biāo)記序列互補(bǔ)，除了位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸一起達(dá)到了位于所述位點(diǎn)的所有已知多態(tài)性。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中每個(gè)標(biāo)記都含有多態(tài)性位點(diǎn)，而且對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，提供了多個(gè)對(duì)應(yīng)的探針，所述探針與所述標(biāo)記序列互補(bǔ)，除了位于多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸一起提供了所有的四種堿基A，C，G和T/U。
13.權(quán)利要求3的組合物，其中的多態(tài)性標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性。
14.權(quán)利要求3的組合物，其中的多態(tài)性標(biāo)記包括STR。
15.一種方法，用于分析從患者樣本獲得的靶核酸序列，并用于提供所述患者的遺傳指紋，所述方法包括以下步驟(a)提供第一組探針，其含有與從用于遺傳測(cè)試的患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針，(b)第二組探針，其含有用于與多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記雜交的寡核苷酸探針，與所述標(biāo)記的雜交提供了能對(duì)所述患者進(jìn)行鑒定的遺傳指紋，其中第一組和第二組探針都連接到珠子上，所述的珠子帶有能唯一確定連接到所述珠子上的探針的化學(xué)或物理學(xué)可區(qū)分特性；(c)使靶序列和多個(gè)多態(tài)性標(biāo)記與所述第一組和第二組探針接觸；和(d)檢測(cè)第一組探針與靶序列之間的雜交，并檢測(cè)第二組探針與多態(tài)性標(biāo)記之間的雜交，所述方法同時(shí)提供對(duì)靶序列和所述患者的唯一遺傳指紋的分析。
16.權(quán)利要求15的方法，其中具有連接到其上的探針的珠子排列于平面陣列中。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的珠子陣列包括子陣，而且第二組探針與第一組探針位于不同的子陣中。
18.權(quán)利要求16的方法，其中的平面珠子陣列置于電極上。
19.權(quán)利要求16的方法，其中的平面珠子陣列置于硅片上。
20.權(quán)利要求16的方法，其中的珠子具有能唯一確定連接到所述珠子上的探針的化學(xué)標(biāo)記，其中的化學(xué)標(biāo)記包括一種或多種熒光染料。
21.權(quán)利要求16的方法，其中的靶核酸序列被分析以確定它是否含有突變，而且其中的靶核酸和多態(tài)性標(biāo)記位于相同的基因上。
22.權(quán)利要求16的方法，其中的靶核酸序列被分析以確定它是否含有突變，而且其中的靶核酸和多態(tài)性標(biāo)記位于不同的基因上。
23.權(quán)利要求16的方法，其中的靶序列包括突變位點(diǎn)，并提供了多個(gè)相應(yīng)的探針，所述的探針與所述靶序列互補(bǔ)，除對(duì)應(yīng)于該突變位點(diǎn)的核苷酸之外，而且位于所述位點(diǎn)的核苷酸一起達(dá)到了位于所述位點(diǎn)的所有突變。
24.權(quán)利要求16的方法，其中靶序列包括突變位點(diǎn)，并提供了多個(gè)相應(yīng)的探針，所述的探針與所述靶序列互補(bǔ)，除對(duì)應(yīng)于該突變位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于所述位點(diǎn)的核苷酸一起提供了所有四種堿基A，C，G和T/U。
25.權(quán)利要求16的方法，其中每個(gè)標(biāo)記都含有多態(tài)性位點(diǎn)，而且對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，提供了多個(gè)對(duì)應(yīng)的探針，所述探針與所述標(biāo)記序列互補(bǔ)，除了位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸一起達(dá)到了位于所述位點(diǎn)的所有已知多態(tài)性。
26.權(quán)利要求16的方法，其中每個(gè)標(biāo)記都含有多態(tài)性位點(diǎn)，而且對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，提供了多個(gè)對(duì)應(yīng)的探針，所述探針與所述標(biāo)記序列互補(bǔ)，除了位于多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸之外，以致位于該多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸一起提供了所有的四種堿基A，C，G和T/U。
27.權(quán)利要求16的方法，其中的多態(tài)性標(biāo)記包括單核苷酸多態(tài)性。
28.權(quán)利要求16的方法，其中的多態(tài)性標(biāo)記包括STR。
29.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括在使所述標(biāo)記和序列于探針接觸之前，同時(shí)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記和靶序列的步驟。
30.權(quán)利要求15的方法，其中的方法包括分析多個(gè)靶序列，而且第一組探針包括用于與所述多個(gè)靶序列雜交的寡核苷酸探針。
31.一種分析從患者樣本獲得的靶核酸序列的方法，所述方法還提供了使所述分析與所述樣本唯一地聯(lián)系起來的方法，該方法包括以下步驟(a)提供第一組探針，其含有與從用于遺傳測(cè)試的患者樣本獲得的靶核酸序列雜交的寡核苷酸探針，其中的探針連接到珠子上，所述的珠子帶有能唯一確定連接到所述珠子上的探針的化學(xué)或物理學(xué)可區(qū)分特性；(b)使所述寡核苷酸探針與含有靶核苷酸序列的溶液接觸，而使靶序列與相應(yīng)的探針雜交；(c)使用能唯一確定所述靶溶液的分子標(biāo)記對(duì)溶液進(jìn)行標(biāo)記，通過探測(cè)所述的標(biāo)記來確定患者身份，可以在把所述溶液引入到寡核苷酸中之前，或之后，或同時(shí)，把其中的標(biāo)記添加到所述樣本中；和(d)檢測(cè)所述探針與靶序列的雜交。
32.權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)分子標(biāo)記來鑒定患者的步驟。
33.權(quán)利要求31的方法，其中樣本的標(biāo)記包括添加一種或多種熒光標(biāo)簽，所述標(biāo)簽因此成為與靶溶液相關(guān)。
34.權(quán)利要求31的方法，其中靶溶液的標(biāo)記包括添加寡核苷酸標(biāo)簽。
35.權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括設(shè)計(jì)一組探針與對(duì)應(yīng)的序列標(biāo)簽雜交，所述序列標(biāo)簽探針連接到珠子上，其中所述的珠子被編碼能唯一確定連接到所述珠子上的探針。
36.一種確定靶核酸序列中串聯(lián)核苷酸重復(fù)數(shù)的方法，所述串聯(lián)重復(fù)每一側(cè)旁臨都有非重復(fù)旁臨序列，該方法包括以下步驟(a)提供一組連接到珠子上的寡核苷酸探針，所述的每個(gè)珠子都帶有能唯一確定連接到其上的探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性，其中的每個(gè)探針都能與靶序列退火并含有探測(cè)位點(diǎn)，其中所述的探針含有的核苷酸重復(fù)數(shù)不同，以致當(dāng)探針與靶序列退火形成雜交復(fù)合物時(shí)，每個(gè)探針的探測(cè)位點(diǎn)與位于串聯(lián)重復(fù)內(nèi)或串聯(lián)重復(fù)外的靶位點(diǎn)連接；(b)使靶序列與所述寡核苷酸探針接觸，以使所述靶序列與所述探針形成雜交復(fù)合物；(c)平行探測(cè)靶序列與該組中的探針之間的每個(gè)雜交復(fù)合物，來確定探針的探測(cè)位點(diǎn)終止于靶重復(fù)的外面或靶重復(fù)的里面；和(d)確定靶序列中的重復(fù)數(shù)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(c)包括使雜交復(fù)合物與序列特異性聚合酶和標(biāo)記的核苷三磷酸接觸，以致核苷三磷酸整合到一個(gè)或多個(gè)探針序列中，該標(biāo)記根據(jù)探針-靶復(fù)合物的構(gòu)象而不同。
38.權(quán)利要求36的方法，其中的珠子以空間編碼的方式裝配排列到平面中，并通過直接成象檢測(cè)光學(xué)信號(hào)的改變和確定顆粒身份。
39.一種在靶核酸序列分析中產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)的序列特異性擴(kuò)增的方法，該方法允許實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增的信號(hào)，并包括以下步驟(a)提供一溫度控制的樣本密封裝置，其允許實(shí)時(shí)記錄在所述裝置中產(chǎn)生的光學(xué)檢測(cè)信號(hào)，和溫度控制裝置用于控制所述裝置的溫度；(b)提供位于所述樣本安全裝置內(nèi)的一組探測(cè)寡核苷酸探針，所述探針能與靶核酸形成雜交復(fù)合物，而且連接到珠子上，其中所述的每個(gè)珠子都帶有能確定連接到其上的探針的化學(xué)或物理可區(qū)分特性；(c)使所述寡核苷酸探針與靶序列接觸，以形成探針與靶序列之間的雜交復(fù)合物；(d)使所述雜交復(fù)合物與第二寡核苷酸探針接觸，所述的第二探針含有標(biāo)記并能與包含在雜交復(fù)合物內(nèi)的探測(cè)探針連接；(e)提供使所述第二標(biāo)記的寡核苷酸探針與雜交復(fù)合物內(nèi)的探測(cè)探針連接的方法；(f)實(shí)時(shí)檢測(cè)來自固定探針組的光學(xué)信號(hào)；(g)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)退火-連接-檢測(cè)-變性循環(huán)，每個(gè)循環(huán)以算術(shù)級(jí)數(shù)增加延伸的探針數(shù)量，并包括以下步驟(i)提供用于形成雜交復(fù)合物第一溫度；(ii)提供用于探測(cè)探針與第二標(biāo)記的探針發(fā)生連接酶催化連接的第二溫度，其中的連接與珠子的光學(xué)信號(hào)變化相關(guān)，所述珠子帶有連接的探針；(iii)描繪和/或記錄來自探針的光學(xué)信號(hào)；和(iv)提供用于使全部雜交復(fù)合物變性的第三溫度。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于有機(jī)體遺傳測(cè)試，并使遺傳測(cè)試的結(jié)果與能明確鑒定有機(jī)體的唯一標(biāo)記相關(guān)的組合物和方法。該標(biāo)記可以是內(nèi)部標(biāo)記，如例如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，短串聯(lián)重復(fù)(STR)，或基因組基因座內(nèi)的其它位點(diǎn)?？蛇x擇地，標(biāo)記可以是外部的，以便它們能在測(cè)試之前單獨(dú)添加到遺傳樣本中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1694969SQ03824835
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
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