專利名稱：使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(Gram-positive bacteria)的唾液酸苷酶(neuraminidase)產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的病毒載體的方法。
背景技術(shù)：
含有唾液酸的糖蛋白存在于大多數(shù)細(xì)胞的表面。某些病毒類型具有能與這種唾液酸結(jié)合的蛋白作為包膜成分，這促進(jìn)了病毒粒子粘著于細(xì)胞上。例如，流感病毒通過(guò)被稱做血凝素(HA)的包膜蛋白與存在于細(xì)胞表面上的唾液酸結(jié)合。然而，在宿主細(xì)胞表面與唾液酸d結(jié)合需要在病毒復(fù)制步驟中在出芽后解離，在這一步驟中流感病毒的唾液酸苷酶蛋白(NA)起了重要作用。此外，NA被報(bào)道在自我聚集的抑制中起作用(Compans R.W.等，J.Virol.，4528-534(1969)；Palese P.等，Virology 61397-410(1974)；GriffinJ.A.等，Virology 125324-334(1983)；Liu C等，J.Virol.691099-1106(1995))。
HA蛋白的結(jié)合活性已被確認(rèn)，且在HA假型病毒的制備中適用于改善基因?qū)肽芰?。然而，這些假型病毒以不具有唾液酸苷酶的低病毒效價(jià)為特征(Hatziioannou T等，J.Virol.725313-5317(1998))。通過(guò)外源提供NA給載體生成系統(tǒng)，可能促進(jìn)HA蛋白摻入病毒粒子，并因此提高效價(jià)(DongJ等，J.Virol.667374-7382(1992)；Negre D.等，Gene Ther.71613-1623(2000)；Morse K.M.等，美國(guó)基因治療協(xié)會(huì)第五次年會(huì)TheAmerican Society of Gene Therapy’s 5th Annual Meeting(2002)；WO01/92508)。然而，迄今為止，目前可獲得的使用純化的NA產(chǎn)生的HA假型病毒的效價(jià)不能令人滿意。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶，產(chǎn)生含有作為包膜成分的與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體的方法。
常規(guī)的HA假型病毒產(chǎn)生方法常常使用來(lái)自被分類為革蘭氏陰性菌的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的NA。但是，使用來(lái)自霍亂弧菌的NA產(chǎn)生的載體的效價(jià)很低。而且，大規(guī)模工業(yè)產(chǎn)生這種載體仍是一個(gè)難題。為了開(kāi)發(fā)低成本產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的高效價(jià)病毒載體的技術(shù)，本發(fā)明人找到了能用于病毒產(chǎn)生的一種新的NA。本發(fā)明人公開(kāi)了，通過(guò)使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA，他們能成功地產(chǎn)生具有明顯高于用來(lái)自霍亂弧菌的NA產(chǎn)生的病毒的效價(jià)的病毒。因此使用來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA將能以有效而經(jīng)濟(jì)的方式大規(guī)模地工業(yè)產(chǎn)生假型載體。
因此，本發(fā)明涉及使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶，產(chǎn)生含有作為包膜成分的與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及(1)產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體的方法，所述方法包括在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下培養(yǎng)產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，并回收產(chǎn)生的病毒的步驟；(2)如(1)所述的方法，其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是放線菌(Actinomycete)；(3)如(2)所述的方法，其中所述放線菌屬于小單孢菌科(Micromonosporaceae)；(4)如(3)所述的方法，其中所述屬于小單孢菌科的放線菌是綠色小單孢菌(Micromonospora viridifaciens)；(5)根據(jù)(1)-(4)中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體；(6)如(5)所述的方法，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體(lentiviralvector)；(7)根據(jù)(1)-(6)中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述與唾液酸結(jié)合的膜蛋白是單鏈負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白；(8)如(7)所述的方法，其中所述單鏈負(fù)鏈RNA病毒是屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)或正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒；(9)根據(jù)(1)-(6)中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述與唾液酸結(jié)合的膜蛋白是流感病毒HA蛋白；和(10)使用根據(jù)(1)-(9)中的任何一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的病毒載體。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生含有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的病毒載體的方法。本文中，“病毒載體”是指能將核酸分子導(dǎo)入宿主的病毒粒子或與之等同的感染性微粒。本發(fā)明的方法包括這樣的步驟，即在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下培養(yǎng)產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，并收集產(chǎn)生的病毒。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶的存在顯著提高了從產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中收集的病毒的量。衍生自放線菌的唾液酸苷酶是優(yōu)選使用的。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于產(chǎn)生含有衍生自胞漿膜的包膜的所需病毒載體。例如，本發(fā)明的方法可優(yōu)選用于產(chǎn)生負(fù)鏈RNA病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、皰疹病毒等。具體地，本發(fā)明的方法適用于反轉(zhuǎn)錄病毒等慢病毒的產(chǎn)生。
任何有復(fù)制能力的病毒或復(fù)制缺陷型病毒都可以制備。例如，復(fù)制缺陷型病毒可通過(guò)從病毒基因組中缺失參與感染性病毒粒子的形成或其釋放的部分或全部病毒基因而制備。具體地，適于將所需基因?qū)爰?xì)胞的復(fù)制缺陷型重組病毒載體可通過(guò)改變病毒基因組，使編碼包膜等的基因缺失，但保持病毒基因組摻入病毒粒子和病毒核酸導(dǎo)入靶細(xì)胞所需的核苷酸序列完整而產(chǎn)生。例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒可通過(guò)自病毒基因組RNA除去部分或全部編碼病毒蛋白的基因，例如gag、pol和env，而僅保留病毒包裝和基因?qū)氚屑?xì)胞所必需的序列(例如LTR的一部分)而產(chǎn)生。為了產(chǎn)生病毒粒子，可以使缺失的基因中形成病毒粒子所需的基因在產(chǎn)病毒的細(xì)胞中表達(dá)。包含缺失了至少部分病毒基因的野生型病毒基因組的這種病毒粒子也包括在本發(fā)明的病毒載體中。
具體地，本發(fā)明適合于重組病毒的產(chǎn)生?！爸亟M病毒”是指使用重組多核苷酸產(chǎn)生的病毒。重組多核苷酸是指多核苷酸，其中一或兩個(gè)末端不是以與自然狀態(tài)相同的方式連接。具體地，重組多核苷酸是改變(切斷或組合)了多核苷酸鏈的連接的多核苷酸。重組多核苷酸可以聯(lián)合使用多核苷酸合成、核酸酶處理、連接酶處理、以及重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中通常已知的方法制備。重組蛋白是使用重組多核苷酸產(chǎn)生的蛋白，或者是人工合成的蛋白。例如，重組蛋白可通過(guò)表達(dá)編碼它的重組多核苷酸而產(chǎn)生。重組病毒可通過(guò)使遺傳工程構(gòu)建的編碼病毒基因組的多核苷酸表達(dá)和重建病毒來(lái)產(chǎn)生。
使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒載體在其病毒包膜中包含與唾液酸結(jié)合的蛋白。這種病毒載體可以是包含與唾液酸自然結(jié)合的蛋白的病毒，或者是一種自然情況下不包含這種蛋白，而是通過(guò)基因工程使蛋白包含于包膜中的病毒。經(jīng)過(guò)基因改造在其包膜中包含天然病毒包膜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(根本沒(méi)有或包含很少)的蛋白的病毒，被稱做該蛋白的假型病毒。包含不同包膜蛋白的假型病毒可通過(guò)例如在產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白來(lái)產(chǎn)生。這類方法特別適合于本發(fā)明，以產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的假型病毒。
與唾液酸結(jié)合的膜蛋白包括胞外區(qū)含有唾液酸結(jié)合區(qū)域的蛋白。這樣的蛋白不限于任何具體的一種；它可以是天然蛋白或人工蛋白。例如，在許多病毒包膜蛋白中發(fā)現(xiàn)與唾液酸自然結(jié)合的膜蛋白。具有這種能力的蛋白可通過(guò)誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集(HA)的活性鑒別。具有HA活性的病毒蛋白常常被稱做血凝素。這種具有HA活性的病毒蛋白特別適合于制備本發(fā)明的病毒。
HA活性可見(jiàn)于多種病毒。具有這些病毒的HA活性的蛋白可以以其本來(lái)的形式用于制備本發(fā)明的病毒，或通過(guò)制備具有其它蛋白的嵌合蛋白進(jìn)行改變后用于制備本發(fā)明的病毒。HA活性可用各種生物的紅細(xì)胞來(lái)檢測(cè)。常用于檢測(cè)HA活性的紅細(xì)胞種類和最適溫度根據(jù)病毒類型適當(dāng)控制。例如，據(jù)報(bào)道鈣離子是使用風(fēng)疹病毒等進(jìn)行反應(yīng)所必需的。同樣地，在蟲(chóng)媒病毒的情況下，反應(yīng)的最佳pH有嚴(yán)格限制。在腸道病毒、風(fēng)疹病毒等中，病毒粒子本身是含有HA活性的蛋白。在蟲(chóng)媒病毒和腺病毒等病毒中，含有HA活性的蛋白也以小于病毒粒子的顆粒存在。痘病毒血凝素以區(qū)別于病毒粒子的含脂類的顆粒存在。這些含有HA活性的蛋白可用于產(chǎn)生具有HA活性的病毒。腺病毒III亞群誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞的不完全凝集，即部分血細(xì)胞凝集。這種蛋白也可用做含有HA活性的膜蛋白。
具體的病毒蛋白的HA活性(HA效價(jià))可使用通常已知的方法檢測(cè)(國(guó)立預(yù)防衛(wèi)生研究所學(xué)友會(huì)編，改訂二版，病毒實(shí)驗(yàn)學(xué)總論，214-225，丸善株式會(huì)社)。紅細(xì)胞可從例如雞(包括幼體和成體)、鵝、大鼠、豚鼠、獼猴(rhesusmonkey)、綠猴或人制備。反應(yīng)溫度可以是0℃、4℃、室溫或37℃，是適合于各種蛋白的條件。用不同病毒進(jìn)行血細(xì)胞凝集反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)條件的例子描述于下文中。
例如，與腺病毒有關(guān)的HA反應(yīng)通常不受pH影響，在37℃進(jìn)行。腺病毒I亞群，例如3、7、11、14、16、20、21、25和28型，例如可使用獼猴紅細(xì)胞。腺病毒II亞群，例如8、9、10、13、15、17、19、22、23、24、26和27型，例如可使用大鼠紅細(xì)胞。腺病毒III亞群，例如1、2、4、5和6型，可使用大鼠紅細(xì)胞誘導(dǎo)不完全凝集。
與腸道病毒有關(guān)的HA反應(yīng)通常不依賴于pH。其中柯薩奇病毒A7型可使用小雞血細(xì)胞，并在室溫誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集?？滤_奇病毒A20、A21和A24型可使用O型人血細(xì)胞，在4℃誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集。柯薩奇病毒B1、B3和B5型可使用O型人血細(xì)胞，在37℃誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集。Echo病毒3、6、7、11、12、13、19、20、21、24和29型可使用O型人血細(xì)胞，在4℃誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集。
與呼腸孤病毒病毒(reovirus)有關(guān)的HA反應(yīng)通常不依賴于pH，在室溫進(jìn)行。例如，1型和2型可使用人O型血細(xì)胞，3型可使用牛血細(xì)胞。
與負(fù)鏈RNA病毒有關(guān)的HA反應(yīng)，例如與流感病毒有關(guān)的HA反應(yīng)在約pH 7.2進(jìn)行。對(duì)于A型和B型流感病毒，血細(xì)胞可從小雞、人或豚鼠制備，并在室溫誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集。對(duì)于C型流感病毒，可使用小雞血細(xì)胞，反應(yīng)在4℃進(jìn)行。對(duì)于腮腺炎病毒和新城疫病毒(NDV)，例如可使用小雞紅細(xì)胞，且反應(yīng)在室溫、pH 7.2進(jìn)行。對(duì)于副流感病毒，HA反應(yīng)通常是不依賴pH的，小雞或人紅細(xì)胞可用于1型，小雞紅細(xì)胞可用于2型病毒。反應(yīng)在例如4℃進(jìn)行。對(duì)于副流感病毒3型，反應(yīng)可在4℃-室溫用人或豚鼠紅細(xì)胞進(jìn)行。對(duì)于麻疹病毒，反應(yīng)可用例如來(lái)自綠猴的紅細(xì)胞在37℃進(jìn)行。
在蟲(chóng)媒病毒(arbovirus)的情況中，反應(yīng)可以用鵝或小雞的紅細(xì)胞在37℃、嚴(yán)格酸性條件中進(jìn)行。彈狀病毒(rhabdovirus)可使用鵝的紅細(xì)胞?？袢〔《緝?yōu)選在pH 6.4、0℃進(jìn)行反應(yīng)。水泡性口炎病毒(VSV)可優(yōu)選在例如pH 5.8、0℃進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于痘苗病毒(vaccinia virus)和天花病毒等痘病毒，反應(yīng)通常不依賴于pH，可使用小雞紅細(xì)胞在室溫-37℃進(jìn)行。風(fēng)疹病毒可使用雞或鵝的紅細(xì)胞在4℃、pH約6.2或7.2進(jìn)行反應(yīng)。多瘤病毒可在4℃、pH 7.2使用豚鼠紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。大鼠病毒(RV)可在室溫、pH 7.2使用豚鼠紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。上述任何含有HA活性的病毒蛋白，或其改變的蛋白可用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒。這里，改變的蛋白是指天然蛋白缺失、取代和/或插入一或多個(gè)氨基酸所得的蛋白。這種蛋白只要是與唾液酸結(jié)合的膜蛋白就可以利用。改變的蛋白可優(yōu)選包含原始蛋白的部分氨基酸序列，更優(yōu)選包含原始蛋白的8個(gè)或更多氨基酸，更優(yōu)選9個(gè)或更多，更優(yōu)選10個(gè)或更多，最優(yōu)選15個(gè)或更多。換句話說(shuō)，改變的蛋白在氨基酸序列水平上相對(duì)于原始蛋白的同一性可以是70％或更高，更優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，最優(yōu)選90％或更高。改變的蛋白可以是原始蛋白或它的一部分結(jié)合有其它蛋白。
在包含于病毒載體包膜、并與唾液酸結(jié)合的多種膜蛋白中，特別適用于本發(fā)明的蛋白的具體例子包括副粘病毒HN蛋白、正粘病毒HA蛋白、披膜病毒(Togavirus)E1蛋白、痘苗病毒A27L、H3L和D8L蛋白、黃病毒M和E蛋白、冠狀病毒E1和E2蛋白以及本楊病毒(Bunyavirus)G1蛋白。特別優(yōu)選單鏈負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白；尤其優(yōu)選正粘病毒HA蛋白。
“單鏈負(fù)鏈RNA病毒”是指具有單鏈負(fù)鏈((-)鏈)RNA作為其基因組的病毒。例子包括副粘病毒科病毒如副粘病毒屬(Paramyxovirus)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)、腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)、及肺病毒屬(Pneumovirus)，彈狀病毒科病毒例如水泡性病毒屬(Vesiculovirus)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus)和Ephemerovirus，絲狀病毒科(Firoviridae)病毒，正粘病毒科病毒如流感病毒A、B、C和thogoto樣病毒，本楊病毒科病毒如本楊病毒屬、漢坦病毒屬(Hantavirus)、納伊羅病毒屬(Nairovirus)和白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)，和沙粒病毒科(Arenaviridae)病毒。具體地，優(yōu)選使用正粘病毒科病毒HA蛋白；優(yōu)選流感病毒HA蛋白。仙臺(tái)病毒、狂犬病病毒或麻疹病毒的HN(或H)蛋白也適用。這些蛋白可與其它蛋白結(jié)合使用。所述蛋白可衍生自病毒的天然株、野生型病毒、病毒的突變株、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)株、人工構(gòu)建株等。所述蛋白可以是通過(guò)改變天然蛋白產(chǎn)生的蛋白。
與唾液酸結(jié)合的膜蛋白除具有唾液酸結(jié)合活性外還可具有另一種活性。例如，副粘病毒的HN蛋白除具有唾液酸結(jié)合活性(HA活性)外還具有唾液酸苷酶(NA)的活性。雖然HN蛋白的NA活性本身能促進(jìn)病毒的產(chǎn)生，但有可能將這種蛋白與來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA一起按本發(fā)明方法更有效地產(chǎn)生病毒。而且，在本發(fā)明中與唾液酸結(jié)合的兩種或更多種膜蛋白可結(jié)合使用。例如，在本發(fā)明方法中，正粘病毒HA蛋白和副粘病毒的HN蛋白可一起用于產(chǎn)生這兩種蛋白的假型病毒。HN蛋白的NA活性以及衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA蛋白使細(xì)胞能以較高效率釋放病毒。
本發(fā)明的方法通過(guò)在產(chǎn)生病毒載體的步驟中，在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下，培養(yǎng)產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生含有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體。即，產(chǎn)病毒的細(xì)胞在含有來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，所產(chǎn)生的病毒從細(xì)胞中回收。病毒可通過(guò)例如收集產(chǎn)病毒的細(xì)胞的培養(yǎng)上清回收。還可以包括從培養(yǎng)上清中回收病毒的步驟?？梢赃M(jìn)行離心、吸附、過(guò)濾等步驟，以便進(jìn)一步提純或濃縮培養(yǎng)上清中的病毒。
唾液酸苷酶(NA)(EC 3.2.1.18)是能切斷唾液酸糖苷鍵(本文稱NA活性)的蛋白。具體地，NA是能切斷細(xì)胞膜糖蛋白或糖脂中唾液酸糖苷鍵的蛋白(Schauer R.Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.40131-234(1982)；Cabezas J.A.Biochem.J.278311-312(1991))。NA活性用單位(U)定義，1個(gè)單位是在37℃、pH 5.0、用N-乙酰神經(jīng)氨酸乳糖(NANA-乳糖)或牛頜下粘蛋白作底物、在1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)所需的酶量(Cassidy J.T.等，J.Biol.Chem.2403501(1965))。NA也稱唾液酸酶。
本文中，衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA是指革蘭氏陽(yáng)性菌所具有的NA，或與之結(jié)構(gòu)相當(dāng)?shù)腘A，或其變化形式。例如，衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA包括可以從革蘭氏陽(yáng)性菌獲得的NA。例如，它包括從革蘭氏陽(yáng)性菌培養(yǎng)物中提純的NA，或其重組形式。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA的重組形式可通過(guò)表達(dá)編碼同種或異種生物NA的基因來(lái)產(chǎn)生。衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA包括從其它原料獲得的NA，只要它們與從革蘭氏陽(yáng)性菌獲得的NA蛋白相同。另外，衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA包括在來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的野生型NA中缺失、取代和/或插入一或多個(gè)氨基酸而被修飾的蛋白，只要該蛋白保持NA活性。被改變的氨基酸沒(méi)有數(shù)量限制，只要保留了NA活性，但優(yōu)選是70個(gè)或更少氨基酸，更優(yōu)選50個(gè)或更少，更優(yōu)選30個(gè)或更少，更優(yōu)選20個(gè)或更少，更優(yōu)選10個(gè)或更少，更優(yōu)選5個(gè)或更少，最優(yōu)選3個(gè)或更少。改變的NA在氨基酸序列水平上相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌野生型NA的同一性為50％或更高，優(yōu)選60％或更高，更優(yōu)選70％或更高，更優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，最優(yōu)選90％或更高。氨基酸序列同一性可通過(guò)例如BLAST測(cè)定，它是由Karlin和Altschul開(kāi)發(fā)的算法(Karlin S.和Altschul S.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877(1993))。BLAST程序可使用缺省參數(shù)運(yùn)行。通常這種分析的具體步驟是公知的(參見(jiàn)NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)的BLAST網(wǎng)站(Basic Local Alignment Search Tool))。例如，blast2sequence程序是用于比較兩序列的程序，可用它產(chǎn)生兩序列的對(duì)比，并確定它們的同一性(Tatiana A等.FEMS Microbiol.Lett.174247-250(1999))?？障?gap)可按錯(cuò)配處理，相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌野生型NA的完整氨基酸序列的同一性可計(jì)算得到。在改變氨基酸的過(guò)程中，希望改變除BNR(細(xì)菌唾液酸苷酶重復(fù)；Pfam登錄號(hào)PF02012(也稱“Asp盒”))外的區(qū)域的氨基酸，以免破壞對(duì)NA活性有重要作用的BNR(Roggentin P等，Glycoconj.J.6349-353(1989)；Copley R.R.等Protein Sci.10285-292(2001))。優(yōu)選BNR多個(gè)拷貝反復(fù)出現(xiàn)，且每個(gè)重復(fù)彼此相距40個(gè)或更多氨基酸。預(yù)計(jì)改變野生型NA的N-和/或C-末端氨基酸，即使對(duì)活性有影響也極小。
本文中，衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA包括來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌野生型NA的具有NA活性的部分蛋白。該部分蛋白優(yōu)選包含革蘭氏陽(yáng)性菌野生型NA完整氨基酸序列的60％或更多連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選70％或更多，更優(yōu)選75％或更多，更優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選85％或更多，更優(yōu)選90％或更多。此外，來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA可包括具有NA活性的蛋白，其中，革蘭氏陽(yáng)性菌的野生型NA或其部分蛋白附加有其它蛋白。制備具有其它蛋白且保持活性的部分蛋白或融合蛋白是本領(lǐng)域常規(guī)操作。
革蘭氏陽(yáng)性菌是指革蘭氏染色呈陽(yáng)性的細(xì)菌或其它真菌。革蘭氏染色呈陽(yáng)性通常是指，在堿性染色液(例如結(jié)晶紫)中染色，接著用Lugol’s溶液(I2-KI溶液)處理，再用極性溶劑(乙醇、丙酮等)簡(jiǎn)單洗滌后，細(xì)菌不被脫色。洗滌后經(jīng)過(guò)復(fù)染(例如用番紅(safranin)溶液或稀釋的石炭酸品紅溶液)，革蘭氏陰性菌變紅，革蘭氏陽(yáng)性菌變紫。通常，革蘭氏陽(yáng)性菌具有相對(duì)厚的細(xì)胞壁(15-80nm)，它們中的許多在外層中缺乏脂多糖。另外，它們中的許多對(duì)溶菌酶高度敏感。革蘭氏陽(yáng)性菌的具體的例子包括葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和放線菌。本發(fā)明中，衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA優(yōu)選是來(lái)自放線菌的NA。
放線菌是指放線菌目的細(xì)菌，以及其它放線細(xì)菌。放線菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌類群。放線菌目包括弗蘭克氏菌科(Frankiaceae)、小單孢菌科、丙酸菌科(Propionibacteriaceae)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、鏈霉菌科(Steptomycetaceae)、鏈孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、高溫單孢菌科(Thermomonosporaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、放線菌科、微球菌科(Micrococcaceae)、束絲放線菌科(Actinosynnemataceae)、擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)和糖霉菌科(Glycomycetaceae)。例如，放線菌NA見(jiàn)登錄號(hào)L06898(蛋白AAA21932、A49227)和X62276(蛋白CAA44166)(粘放線菌(Actinomyces viscosus)NA)。棒狀桿菌NA例如見(jiàn)登錄號(hào)NC-003450(蛋白NP-600771)和AP005278(蛋白BAB98949)(谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)NA)。鏈霉菌NA例如是登錄號(hào)NC-003155(蛋白NP-823018)(除蟲(chóng)鏈霉菌(Streptomyces avermitilis))和NC-003888(蛋白NP-630638)(天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyes coelicolor))。
本發(fā)明中使用的唾液酸苷酶優(yōu)選衍生自放線菌科的細(xì)菌，更優(yōu)選衍生自小單孢菌科，最優(yōu)選衍生自小單孢菌屬。小單孢菌屬的細(xì)菌包括桔橙小單孢菌(M.aurantiaca)、棕褐小單孢菌(M.brunnea)、淺棕褐小單孢菌(M.brunnescens)、炭樣小單孢菌(M.carbonacea)、M.cellulolyticum、青銅小單孢菌(M.chalcea)、切氏小單孢菌(M.chersinia)、檸檬小單孢菌(M.citrea)、青藍(lán)小單孢菌(M.coerulea)、棘橙小單孢菌(M.echinoaurantiaca)、棘棕褐小單孢菌(M.echinobrunnea)、棘孢小單孢菌(M.echinospora)、佛州小單孢菌(M.floridensis)、暗黃綠小單孢菌(M.fulviviridis)，暗黃絳紅小單孢菌(M.fulvopurpureus)、暗黃紫小單孢菌(M.fulvoviolaceus)、渾圓小單孢菌(M.globosa)、灰略紅小單孢菌(M.griseorubida)、鹽生植小單孢菌(M.halophytica)、肌醇小單孢菌(M.inositola)、伊紐小單孢菌(M.inyoensis)、M.lacustris、黑孢小單孢菌(M.megalomicea)、黑孢小單孢菌(M.melanospora)、M.narashino、橄欖星孢小單孢菌(M.olivasterospora)、波賽小單孢菌(M.peucetica)、絳紅小單孢菌(M.purpurea)、絳紅產(chǎn)色小單孢菌(M.purpureochromogenes)、紅橙小單孢菌(M.rhodorangea)、薔薇小單孢菌(M.Rosaria)、M.rosea、相模原小單孢菌(M.sagamiensis)、綠色小單孢菌(M.viridifaciens)、玉龍小單孢菌(M.yulongensis)、和茲昂小單孢菌(M.zionensis)，但不限于此。特別優(yōu)選的NA衍生自綠色小單孢菌(ATCC 31146)。綠色小單孢菌NA基因(nedA)的核苷酸序列見(jiàn)登錄號(hào)D01045(SEQ ID NO1)，編碼的蛋白的氨基酸序列描述于Q02834(SEQ ID NO2)(Sakurada K.等.J.Bacteriol.174(21)6896-6903(1992))。
此外，另一種小單孢菌屬細(xì)菌的NA基因可使用綠色小單孢菌NA基因作為探針進(jìn)行分離。例如，可以選出在嚴(yán)格條件下與下列序列雜交的核酸核苷酸序列SEQ ID NO1和/或其互補(bǔ)序列的30個(gè)或更多核苷酸，更優(yōu)選為50個(gè)或更多，更優(yōu)選100個(gè)或更多，更優(yōu)選150個(gè)或更多，最優(yōu)選全長(zhǎng)序列。這種核酸可通過(guò)從包含核苷酸序列SEQ ID NO1的核酸或雜交的靶核酸制備探針、并檢測(cè)探針與其它核酸的雜交而鑒定。嚴(yán)格條件可以是在含有5xSSC(1xSSC150mM NaCl和15mM檸檬酸鈉)、7％(w/v)SDS(十二烷基磺酸鈉)、100μg/ml變性鮭精DNA和5x Denhardt′s溶液(1x Denhardt′s0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清清蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中，在48℃、優(yōu)選50℃、更優(yōu)選55℃、最優(yōu)選60℃進(jìn)行雜交，隨后在2xSSC、0.1％(w/v)的SDS中采用與雜交相同的溫度攪拌清洗2小時(shí)。更優(yōu)選，清洗可以是在1xSSC、0.1％(w/v)的SDS中，更優(yōu)選在0.5xSSC、0.1％(w/v)的SDS中，最優(yōu)選在0.1xSSC、0.1％(w/v)的SDS中攪拌2小時(shí)。
在本發(fā)明產(chǎn)生病毒的方法中，產(chǎn)病毒的細(xì)胞在上述衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA存在的情況下培養(yǎng)，產(chǎn)生的病毒從培養(yǎng)物中收集。當(dāng)病毒從細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中時(shí)，可通過(guò)收集培養(yǎng)上清回收病毒。在產(chǎn)生唾液酸結(jié)合蛋白的假型病毒時(shí)，表達(dá)該蛋白的細(xì)胞在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA存在的情況下培養(yǎng)以便產(chǎn)生病毒，并且回收產(chǎn)生的病毒。來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA可通過(guò)添加到培養(yǎng)基中供給，或者可使用NA的表達(dá)載體從產(chǎn)病毒的細(xì)胞或者與產(chǎn)病毒的細(xì)胞共培養(yǎng)的其它細(xì)胞中分泌。在培養(yǎng)產(chǎn)病毒的細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程中，至少部分時(shí)間里NA必須存在。在NA存在的情況下培養(yǎng)產(chǎn)病毒的細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間可以是1小時(shí)或更長(zhǎng)，例如，優(yōu)選3小時(shí)或更長(zhǎng)，更優(yōu)選5小時(shí)或更長(zhǎng)，更優(yōu)選10小時(shí)或更長(zhǎng)，最優(yōu)選20小時(shí)或更長(zhǎng)。在從培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的病毒之前，優(yōu)選產(chǎn)病毒的細(xì)胞在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA存在的情況下培養(yǎng)1小時(shí)或更長(zhǎng)，更佳地優(yōu)選3小時(shí)或更長(zhǎng)，更優(yōu)選5小時(shí)或更長(zhǎng)，更優(yōu)選10小時(shí)或更長(zhǎng)，最優(yōu)選20小時(shí)或更長(zhǎng)。在這段時(shí)間中，病毒在培養(yǎng)上清中積累。
可以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)物中來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶的量以便使病毒產(chǎn)量最大。培養(yǎng)基中革蘭氏陽(yáng)性菌NA的濃度例如是0.1mU/ml-1000U/ml，優(yōu)選0.2mU/ml-500U/ml，更優(yōu)選0.5mU/ml-100U/ml，最優(yōu)選1mU/ml-50U/ml。尤其，來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA是極好的，因?yàn)榧词乖?0U/ml或更低濃度，它仍能產(chǎn)生具有足夠效價(jià)的病毒。例如，在低濃度(例如1U/ml或更低，0.1U/ml或更低，0.05U/ml或更低，或0.01U/ml或更低)，它能從產(chǎn)病毒的細(xì)胞中釋放高效價(jià)的病毒。
除上述唾液酸結(jié)合蛋白外，使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒載體在包膜中可含有另一種蛋白。例如，除具有HA活性的包膜蛋白外，還可包含例如負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白，參與膜融合的另一種包膜蛋白例如負(fù)鏈RNA病毒的F蛋白。此外，還可包含所需病毒的包膜蛋白。例如，可適當(dāng)使用能感染人細(xì)胞的病毒的包膜蛋白。這樣的蛋白不限于任何具體的一種；它包括反轉(zhuǎn)錄病毒的雙嗜性包膜蛋白和水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白。另外，它包括皰疹病毒蛋白，例如單純皰疹病毒的gB、gD、gH、和gp85蛋白，和例如EB病毒的gp350和gp220蛋白。它還包括嗜肝DNA病毒的蛋白，例如乙型肝炎病毒的S蛋白。
例如，包含反轉(zhuǎn)錄病毒雙嗜性包膜蛋白(雙嗜性env)和負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白的載體可根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生。此外，本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒可包含例如VSV-G蛋白，這是水泡性口炎病毒(VSV)表面的糖蛋白。VSV-G被認(rèn)為作為受體與存在于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞中的磷脂結(jié)合。因此，使用含有VSV-G蛋白和唾液酸結(jié)合蛋白的載體顯著提高了基因?qū)氲募?xì)胞類型，也提高了導(dǎo)入效率(WO01/92508)。這樣的例子是包含VSV-G蛋白和負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白的載體。這種載體可進(jìn)一步含有負(fù)鏈RNA病毒的F蛋白。因此，本發(fā)明可用于產(chǎn)生包含反轉(zhuǎn)錄病毒雙嗜性包膜蛋白、F蛋白、和HA(或HN)蛋白的載體，以及包含VSV-G蛋白、F蛋白和HA(或HN)蛋白的載體。此外，這種載體可含有負(fù)鏈RNA病毒的M蛋白。因此，本發(fā)明適用于產(chǎn)生包含反轉(zhuǎn)錄病毒雙嗜性包膜蛋白、F蛋白、HA(或HN)蛋白和M蛋白的載體，以及包含VSV-G蛋白、F蛋白、HA(或HN)蛋白和M蛋白的載體。上述這類載體在將基因高效導(dǎo)入常規(guī)方法難以導(dǎo)入基因的細(xì)胞(例如含有粘液的細(xì)胞、含有造血干細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分等)時(shí)是極好的。另外，由于VSV-G蛋白作為由單個(gè)糖蛋白形成的穩(wěn)定三聚體存在于膜上，這種載體顆粒在純化過(guò)程中不易破壞，因此，可通過(guò)離心將其高度濃縮(Yang Y.等，Hum.Gene Ther.6(9)1203-1213(1995年9月))。
用于產(chǎn)生假型病毒的負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白不限于任何特有的一種。特別是，可適當(dāng)?shù)厥褂谜巢《究坪透闭巢《究频牟《镜鞍?。具體地，例如，可適當(dāng)?shù)厥褂昧鞲胁《竞拖膳_(tái)病毒的包膜蛋白。例如，使用在產(chǎn)病毒的細(xì)胞中表達(dá)的流感病毒HA蛋白產(chǎn)生的假型病毒將能感染包括人類細(xì)胞在內(nèi)的寬范圍的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白等等可用所需病毒株制備。例如，致病性病毒的蛋白可衍生自減毒株或強(qiáng)化株。例如，仙臺(tái)病毒的HN、F、和M蛋白可衍生自Z株。相似地，流感病毒的包膜蛋白可衍生自所需的分離株。
另外，反轉(zhuǎn)錄病毒雙嗜性包膜蛋白可衍生自鼠白血病病毒(MuLV)4070A株。也可使用MuLV 10A1株的包膜蛋白(例如，Pcl-10A1(Imgenex))(Naviaux R.K.等J.Virol.705701-5705(1996))。親嗜性包膜蛋白可衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMuLV)。VSV-G蛋白可衍生自例如Indiana血清型病毒株(J.Virol.39519-528(1981))。此外，也可使用衍生自任何所需病毒株的蛋白。
上述包膜蛋白，例如負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)、F、G和M蛋白或反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白，可包含野生型病毒中表達(dá)的完整蛋白，或可含有自然發(fā)生的或人工誘導(dǎo)的突變。例如，可以分析包膜蛋白中可成為細(xì)胞表面抗原分子的表位。然后，可使用該信息選出具有減弱的抗原性的蛋白用于產(chǎn)生病毒。
例如，將HA或HN蛋白等與唾液酸結(jié)合的病毒包膜蛋白或其它包膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)通過(guò)缺失、取代和/或添加進(jìn)行改變，用改變后的蛋白制備假型病毒載體，就有可能產(chǎn)生具有較高基因?qū)胄实妮d體。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生假型病毒載體的方法，所述載體包含將唾液酸結(jié)合型天然膜蛋白胞質(zhì)區(qū)的部分或完整區(qū)域通過(guò)缺失、取代和/或添加進(jìn)行改變而得到的蛋白。具體地，可以將負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)和/或F蛋白的胞質(zhì)區(qū)經(jīng)過(guò)缺失或取代或被其它膜蛋白(例如，慢病毒包括反轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白)胞質(zhì)區(qū)結(jié)合而改變后得到的蛋白，適當(dāng)用于產(chǎn)生高導(dǎo)入效率的病毒載體。特別是，可以將與唾液酸結(jié)合的野生型病毒包膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)通過(guò)取代、缺失和/或添加而改變后得到的蛋白，用于產(chǎn)生具有提高的感染效率的假型病毒。例如，反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)的取代或結(jié)合可適合于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
具體地，用負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白胞質(zhì)區(qū)被SIV等反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)取代所得到的蛋白，和負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白與慢病毒等反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)結(jié)合所得的蛋白，來(lái)制備假型反轉(zhuǎn)錄病毒，可以將外源基因高效導(dǎo)入人細(xì)胞等廣泛多種細(xì)胞。缺失的胞質(zhì)區(qū)長(zhǎng)度，以及結(jié)合的反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)長(zhǎng)度沒(méi)有具體限制；全部或部分胞質(zhì)區(qū)都可以缺失、取代和/或結(jié)合。
上述這類病毒載體可進(jìn)一步包含改變的負(fù)鏈RNA病毒F蛋白。例如，可使用負(fù)鏈RNA病毒F蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失后的蛋白，以及上述缺失的F蛋白與SIV等反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)結(jié)合的蛋白。具體地，可構(gòu)建質(zhì)粒用于表達(dá)例如F蛋白胞質(zhì)區(qū)氨基酸缺失的那些蛋白。缺失的長(zhǎng)度沒(méi)有具體限制；全部或部分胞質(zhì)區(qū)都可缺失。例如，其中缺失胞質(zhì)區(qū)、沒(méi)有留下或僅留下數(shù)個(gè)氨基酸的F蛋白被認(rèn)為適合于產(chǎn)生假型反轉(zhuǎn)錄病毒。這種缺失的F蛋白可與其它病毒包膜蛋白(例如慢病毒包膜蛋白)胞質(zhì)區(qū)的全部或部分結(jié)合，并作為F蛋白胞質(zhì)區(qū)為其它肽取代所得的蛋白用于產(chǎn)生病毒。這種蛋白的例子可以是與SIV包膜蛋白胞質(zhì)區(qū)5’-側(cè)11個(gè)氨基酸結(jié)合的蛋白。因此，本發(fā)明還涉及進(jìn)一步使用負(fù)鏈RNA病毒F蛋白產(chǎn)生假型病毒的方法，其中蛋白的天然胞質(zhì)區(qū)的全部或部分通過(guò)取代、缺失和/或結(jié)合被改變。具體地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生假型病毒的方法，其中F蛋白的胞質(zhì)區(qū)為慢病毒等反轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的部分或全部胞質(zhì)區(qū)取代。
此外，病毒包膜蛋白的胞外區(qū)可用具有細(xì)胞粘附活性的膜蛋白(例如粘附分子、配體、或受體、或抗體或其片段)取代以產(chǎn)生嵌合蛋白。這種嵌合蛋白可用于產(chǎn)生能感染廣泛多種組織或特異性組織作為其靶的載體。
本發(fā)明的方法特別適用于產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒是具有(+)有義鏈RNA基因組的病毒，特征是包含反轉(zhuǎn)錄酶。它在感染靶細(xì)胞時(shí)用反轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA，并整合進(jìn)入靶細(xì)胞的染色體。這類病毒總稱“反轉(zhuǎn)錄病毒”。本發(fā)明中，反轉(zhuǎn)錄病毒可以是野生型反轉(zhuǎn)錄病毒的改變形式。這種改變形式的病毒在病毒粒子所含RNA中含有至少部分的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA，并以感染性病毒粒子的形式存在，它是在病毒粒子形成過(guò)程中通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的作用以序列依賴性方式摻入RNA所產(chǎn)生的。更具體地，反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA優(yōu)選包含摻入病毒粒子時(shí)所必需的包裝信號(hào)序列。在反轉(zhuǎn)錄蛋白存在的情況下，對(duì)兩端都具有LTR且包含這種信號(hào)序列的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致形成含有所述RNA的病毒粒子。
本文中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括那些衍生自腫瘤病毒(oncovirus)的載體。術(shù)語(yǔ)“腫瘤病毒”是指屬于腫瘤病毒亞科的反轉(zhuǎn)錄病毒。腫瘤病毒包括與腫瘤發(fā)生有關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒，例如肉瘤病毒、白血病毒和乳腺腫瘤病毒。例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)是最早開(kāi)發(fā)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體之一，它已通過(guò)許多改進(jìn)措施被修飾，并被廣泛使用。本發(fā)明的方法可適用于使用唾液酸結(jié)合蛋白例如負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)蛋白產(chǎn)生MoMLV的假型病毒載體。另外，特別地，鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)適合用做載體將基因?qū)胙?xì)胞、造血細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的。例如，使用具有HA活性的，用負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白制備的假型MSCV，可高效地將基因?qū)雭?lái)自骨髓的包含造血干細(xì)胞的CD34陽(yáng)性細(xì)胞。
本文中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體還包括那些衍生自慢病毒的載體。術(shù)語(yǔ)“慢病毒(Lentivirus)”是指屬于慢病毒亞科的反轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒的例子包括人類免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、Maedi-Visna病毒、馬感染性貧血病毒(EIAV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)等。反轉(zhuǎn)錄病毒可衍生自所需病毒株或亞型。例如，HIV-1包括各個(gè)主要(M)亞型(包括A到J)、N、和另外的(O)(Hu，D.J.等，JAMA1996；275210-216；Zhu，H.等，Nature 1998，5；391(6667)594-7；Simon，F(xiàn).等，Nat.Med.1998，4(9)1032-7)。分離的SIV病毒株包括，例如，SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsnm、SIVsyk等。
慢病毒的優(yōu)勢(shì)是它們感染未分裂的細(xì)胞，并且病毒基因組可整合進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。核轉(zhuǎn)位信號(hào)以及由gag和vpr編碼的整合酶被認(rèn)為是造成整合的原因。當(dāng)使用這一特征，根據(jù)本發(fā)明的方法基于慢病毒構(gòu)建病毒載體時(shí)，可以將基因引入活組織中未分裂的細(xì)胞和幾乎不分裂的細(xì)胞中，例如各種組織的干細(xì)胞中，這允許有效產(chǎn)生能進(jìn)行長(zhǎng)期基因表達(dá)的載體。
人類免疫缺陷病毒(HIV)先于任何其它慢病毒用于構(gòu)建載體，它也可優(yōu)選在本發(fā)明的方法中使用。此外，在猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla，E.M.等，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal，L.等，Arch.Virol.，143(4)，684-95，1998)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了載體。本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生這些載體。
猴免疫缺陷病毒(SIV)作為衍生自猴的HIV-樣病毒被發(fā)現(xiàn)，它與HIV一起形成靈長(zhǎng)類慢病毒類群(E.Ido和M.Hayamizu，“Gene，Infection andPathogenicity of Simian Immunodeficiency Virus”，Protein，Nucleic acid andEnzyme，Vol.39，No.8，1994)。這一類群進(jìn)一步粗略地分成4個(gè)亞群(1)HIV-1亞群，包括引起人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的HIV-1和從黑猩猩分離出的SIVcpz；(2)HIV-2亞群，包括從Sooty Mangabey(Cercocebus atys)分離的SIVsmm、從獼猴(Macaca mulatta)分離的SIVmac、和對(duì)人致病性較小的HIV-2(Jaffar，S.等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)；(3)SIVagm亞群，代表是非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)分離的SIVagm；和(4)SIVmnd亞群，代表是從山魈(Papio sphinx)分離的SIVmnd。
目前尚無(wú)報(bào)道提示SIVagm和SIVmnd在天然宿主中的致病性(Ohta，Y.等，Int.J.Cancer，1541(1)，115-22，1988；Miura，T.等，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；M.Hayamizu，Nippon Rinsho，47，1，1989)。具體地，以前的報(bào)道描述，根據(jù)感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，作為SIVagm亞群的一員、并在本發(fā)明實(shí)施例中使用的TYO-1株在食蟹猴(Macaca faciularis)、獼猴(Macaca mulatta)或其它天然宿主中沒(méi)有致病性(Ali，M.等，(Gene Therapy，1(6)，367-84，1994；Honjo，S等，J.Med.Primatol，19(1)，9-20，1990)。沒(méi)有關(guān)于SIVagm感染人及其發(fā)病的報(bào)道，因此人們認(rèn)為SIVagm可能對(duì)人沒(méi)有致病性。通常，靈長(zhǎng)類中的慢病毒具有嚴(yán)格的種特異性，很少有關(guān)于用來(lái)自天然宿主的SIVagm進(jìn)行種間交叉感染及發(fā)病的病例報(bào)道；即使有，通常發(fā)病頻率很低且疾病進(jìn)展緩慢(Novembre，F(xiàn).J.等，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，基于SIVagm制備的病毒載體，尤其是SIVagm TYO-1，被認(rèn)為比基于HIV-1或其它慢病毒制備的載體更安全，因此它是優(yōu)選的在本發(fā)明中產(chǎn)生的病毒。
此外，本發(fā)明中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括衍生自泡沫病毒(spumavirus)的載體。泡沫病毒(Spumavirus)包括，例如，泡沫病毒(foamyvirus)(DE4318387；9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。衍生自泡沫病毒的載體可用于將外源基因進(jìn)入導(dǎo)人細(xì)胞，特別是在基因治療和重組疫苗給藥中。
本發(fā)明中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體可在LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)中被修飾。LTR是存在于病毒基因組兩端的反轉(zhuǎn)錄病毒特異性序列。5’LTR充當(dāng)啟動(dòng)子，它促進(jìn)mRNA從前病毒的轉(zhuǎn)錄。因此，在表達(dá)將被摻入病毒載體的RNA的載體(本文中稱做基因?qū)胼d體)中，顯示5’LTR啟動(dòng)子活性的部分被另一個(gè)具有更強(qiáng)啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子取代，可使基因?qū)胼d體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，這可提高包裝效率并因此增加載體效價(jià)。而且，例如，在慢病毒的情況下，5’LTR的轉(zhuǎn)錄活性已知被病毒tat蛋白增強(qiáng)，并因此，用不依賴于tat蛋白的啟動(dòng)子替代5’LTR，允許從表達(dá)病毒包裝所需的病毒基因的載體(本文中稱做包裝載體)中除去tat。感染細(xì)胞的病毒的細(xì)胞內(nèi)RNA被反轉(zhuǎn)錄后，在兩端的LTR結(jié)成形成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)結(jié)合部位和病毒整合酶之間的相互作用整合進(jìn)入細(xì)胞的染色體。轉(zhuǎn)錄自前病毒的mRNA對(duì)應(yīng)于從5’LTR中的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到位于下游的3’LTR的多聚腺苷酸序列之間的區(qū)域；5’LTR啟動(dòng)子部分沒(méi)有包裝到病毒粒子中。因此，即使該啟動(dòng)子為另一個(gè)序列所代替，整合進(jìn)入靶細(xì)胞染色體的部分也沒(méi)有改變。基于上文描述的事實(shí)，5’LTR啟動(dòng)子的取代可提供具有更高效價(jià)的更安全的載體。所以，在基因?qū)胼d體中，5’末端的啟動(dòng)子的取代可提高可包裝的載體的效價(jià)。
安全性可使用自我不活化載體(SIN載體)提高，該載體通過(guò)部分除去3’LTR序列而制備，以防止靶細(xì)胞中其全長(zhǎng)載體mRNA的轉(zhuǎn)錄。被整合進(jìn)入靶細(xì)胞染色體的慢病毒的前病毒具有與其5’末端結(jié)合的3’LTR的U3部分。因此，在靶細(xì)胞的染色體中，基因?qū)胼d體在5’末端包含U3，因而覆蓋整個(gè)基因?qū)胼d體的RNA的轉(zhuǎn)錄從那里開(kāi)始。如果在靶細(xì)胞中具有慢病毒或相關(guān)蛋白，基因?qū)胼d體將被重新包裝并感染其它細(xì)胞。此外，位于病毒基因組3’末端鄰近的宿主基因有被3’LTR啟動(dòng)子表達(dá)的可能(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，Retroviral Pathogenesis。Retroviruses.Cold SpringHarbor Laboratory Press，475-585，1997)。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是反轉(zhuǎn)錄病毒載體有問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)了溶液形式的SIN載體來(lái)克服這種問(wèn)題(Yu，S.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(10)，3194-8，1986)。當(dāng)基因?qū)胼d體的3’LTR缺失U3部分時(shí)，5’LTR或3’LTR都不存在于靶細(xì)胞中。在這種情況下，全長(zhǎng)病毒RNA或宿主基因都沒(méi)有被轉(zhuǎn)錄，而感興趣的基因用內(nèi)部啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；這種載體可以是具有更高安全性的過(guò)量表達(dá)載體。這種載體也可根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生。用于產(chǎn)生SIN載體的基因?qū)胼d體可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法構(gòu)建(WO01/92508)。
可通過(guò)在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄含有包裝信號(hào)的基因?qū)胼d體DNA，并在gag和pol蛋白以及包膜蛋白存在的情況下允許病毒粒子的形成，以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒?；?qū)胼d體DNA可以是質(zhì)粒等DNA載體，或者是被整合進(jìn)入包裝細(xì)胞的染色體的DNA。只要可以保持基于包裝信號(hào)序列形成的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選整合由基因?qū)胼d體DNA編碼的該序列，但需要將載體DNA中包裝信號(hào)與另一個(gè)提供gag和pol蛋白的包裝載體之間的序列同源性減到最小，來(lái)減少由于載體類型之間的重組形成野生型病毒的頻率。因此，優(yōu)選使用盡可能短的含有包裝所需序列的序列來(lái)構(gòu)建基因?qū)胼d體DNA，以滿足包裝效率和安全性的雙重標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)于包裝信號(hào)的類型沒(méi)有限制，只要在引入了包裝載體的細(xì)胞中可以進(jìn)行包裝；可依據(jù)包裝載體的類型使用衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、免疫缺陷病毒等的包裝信號(hào)。
例如，就SIVagm-衍生的包裝載體來(lái)說(shuō)，提供所用信號(hào)序列的病毒類型僅限于SIV，因?yàn)镠IV載體是未被包裝。然而，當(dāng)使用HIV-衍生的包裝載體時(shí)，SIV-衍生的基因?qū)胼d體也可包裝。因此，在將來(lái)自不同類型慢病毒的基因?qū)胼d體和包裝載體聯(lián)合用于形成載體顆粒時(shí)，重組病毒形成的頻率可被降低。在這種情況下，優(yōu)選使用靈長(zhǎng)類慢病毒的組合(例如HIV和SIV)。
在優(yōu)選的基因?qū)胼d體DNA中，gag蛋白因被修飾所以不被表達(dá)。病毒gag蛋白在活體中可被檢測(cè)為外源物質(zhì)，所以是潛在的抗原。換句話說(shuō)，該蛋白可影響細(xì)胞功能。為了防止gag蛋白表達(dá)，可通過(guò)增加或缺失gag起始密碼子下游的核苷酸而導(dǎo)入移碼突變。缺失gag蛋白的部分編碼區(qū)也是優(yōu)選的。通常，已知gag蛋白編碼區(qū)的5’部分是病毒包裝必需的。因此，在基因?qū)胼d體中，優(yōu)選缺失gag蛋白編碼區(qū)的C末端。在不顯著影響包裝效率的前提下，優(yōu)選缺失盡可能大的gag編碼區(qū)部分。另外，優(yōu)選gag蛋白的起始密碼子(ATG)用除ATG外的密碼子取代。可適當(dāng)?shù)剡x擇這種用于取代的密碼子，以不顯著影響包裝效率。含有基因?qū)胼d體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的病毒載體可通過(guò)將所構(gòu)建的含有包裝信號(hào)的基因?qū)胼d體DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。產(chǎn)生的病毒載體顆粒可從包裝細(xì)胞的培養(yǎng)上清等中回收。
對(duì)于所用的包裝細(xì)胞類型沒(méi)有限制，只要該細(xì)胞系通常用于產(chǎn)生病毒。當(dāng)用于人的基因治療目的時(shí)，衍生自人或猴的細(xì)胞是優(yōu)選的。用做包裝細(xì)胞的人細(xì)胞系包括，例如，293細(xì)胞、293T細(xì)胞、293EBNA細(xì)胞、SW480細(xì)胞、u87MG細(xì)胞、HOS細(xì)胞、C8166細(xì)胞、MT-4細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HT1080細(xì)胞、TE671細(xì)胞等。猴細(xì)胞系包括，例如，COS1細(xì)胞、COS7細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、BMT10細(xì)胞等。此外，可使用以前確定的包裝細(xì)胞。這種包裝細(xì)胞包括，例如，Bosc23細(xì)胞、PE501細(xì)胞等。
對(duì)插入到載體中的外源基因類型沒(méi)有限制，它包括，例如，不編碼任何蛋白的核酸，例如反義或核酶序列，以及編碼蛋白的核酸。
近幾年，人們已開(kāi)始注意各種干細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞，作為基因治療的目標(biāo)(Y.Hanazomo，Molecular Medicine，36卷，7號(hào)，1999)。包含具有負(fù)鏈RNA病毒血凝素活性的包膜蛋白的假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體可高效地將基因?qū)胙苌匀斯撬璧腃D34-陽(yáng)性細(xì)胞(WO01/92508)；近幾年，這種含有CD-34陽(yáng)性細(xì)胞的部分作為含有造血干細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分受到重視。以前的報(bào)道描述，在用包甲基纖維素的培養(yǎng)基進(jìn)行的集落分析中，CD34-陽(yáng)性細(xì)胞顯示多潛能(Kirshenbaum，A.S.等，J.Immunol.，148(3)，772-7，1992)，并且將CD34-陽(yáng)性細(xì)胞移植到聯(lián)合免疫缺陷型NOD/SCID小鼠中，導(dǎo)致細(xì)胞定位在小鼠骨髓中并導(dǎo)致重建造血系統(tǒng)(Larochelle，A.等，Nat.Med.，2(12)，1329-37，1996)。所以認(rèn)為干細(xì)胞樣未成熟細(xì)胞至少存在于CD34-陽(yáng)性細(xì)胞級(jí)分中。CD34-陽(yáng)性細(xì)胞級(jí)分中的造血干細(xì)胞處于未分裂狀態(tài)。通常，使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)將基因?qū)脒@類細(xì)胞的效率很低(Kiem，H.P.等，Curr.Opin.Oncol.，7(2)，107-14，1995)；然而，使用含負(fù)鏈RNA病毒血凝素活性的包膜蛋白的假型載體，可大大提高感染效率。具體地，通過(guò)使用慢病毒載體，例如HIV或SIV載體，預(yù)期基因?qū)敕欠至鸭?xì)胞的效率進(jìn)一步提高。本發(fā)明中，使用與唾液酸結(jié)合的蛋白產(chǎn)生假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法可用于產(chǎn)生將基因?qū)胙?xì)胞或造血細(xì)胞的載體。因此，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的病毒產(chǎn)生方法產(chǎn)生將基因?qū)胙?xì)胞或造血細(xì)胞時(shí)的載體的方法。它還涉及將基因?qū)胙?xì)胞或造血細(xì)胞的方法，包括使血細(xì)胞或造血細(xì)胞與使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體接觸，并用本方法產(chǎn)生的載體將基因?qū)胙?xì)胞或造血細(xì)胞。將外源基因?qū)胙?xì)胞或造血細(xì)胞的效率可通過(guò)，例如，使用抗各種已知細(xì)胞表面抗原的抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析、集落分析、以及通過(guò)將造血細(xì)胞移植到造血系統(tǒng)已遭破壞的小鼠中重建造血系統(tǒng)來(lái)評(píng)估。
用具有唾液酸結(jié)合活性的蛋白制備的假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體可將基因高效導(dǎo)入血細(xì)胞和造血細(xì)胞，并因此可用于靶向血細(xì)胞的基因治療，如腺苷酸脫氨酶(ADA)缺乏癥(Blaese，R.M.，Pediatr，Res.，33(1Suppl)，S49-53，1993)、血友病(Kay，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(18)，9973-5，1999)和Fanconi貧血等。給藥可通過(guò)回體(ex vivo)方法進(jìn)行。
具體地，可以應(yīng)用本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體靶向造血細(xì)胞的基因療法的例子包括，例如，使用藥物抗性基因MDRI在抗癌化療中保存干細(xì)胞(Licht，T.等，Gene Ther.(2000)7，4，348-58)；引入正常FANCC基因治療Fanconi貧血(Liu，J.M.等，Hum.Gene Ther.(1999)10，14，2337-46)；引入一組細(xì)胞因子(血小板生成素、白細(xì)胞介素6和11，和Flt-3配體)增加干細(xì)胞的回體增殖(WO 99/07831)；表達(dá)嵌合蛋白，例如Flt-3激動(dòng)劑，以治療血細(xì)胞減少癥(WO 98/46750)；引入人β珠蛋白基因以治療β地中海貧血癥(WO9741141)；用IL-6拮抗劑和自殺基因表達(dá)組合療法治療IL-6-依賴性多發(fā)性骨髓瘤(德國(guó)專利DE19704979號(hào))；引入含有造血因子組合的受體激動(dòng)劑等基因[白細(xì)胞介素(GM-CSF、G-CSF-Ser17，M-CSF、紅細(xì)胞生成素、IL-1、IL-14、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-15)，白血病抑制因子(LIF)，flt-3/flk2配體，人促生長(zhǎng)素(somatotropin)、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B細(xì)胞分化因子、紅細(xì)胞分化因子(EDF)或干細(xì)胞因子(SCF)](WO97/12985)，在干細(xì)胞培養(yǎng)和造血疾病的基因療法中使用的c-mpl受體激動(dòng)劑(WO97/12978)，用于人造血祖細(xì)胞增殖的IL-6和IL-6可溶性受體融合蛋白(Nat.Biotechnol.(1997)15，2，142-45)，用于造血祖細(xì)胞增殖的IL-6超激動(dòng)劑和超拮抗劑(WO 96/18648)，用于血液疾病治療的因子-X(J.Cell.Bioche.(1995)Suppl.21A，410)，用于人造血祖細(xì)胞增殖的干細(xì)胞因子、IL-6和可溶性IL-6受體復(fù)合物(Gene Ther.(1995)2，9，694)，以RNA病毒為靶的核酶，和用于預(yù)防HIV感染和細(xì)胞免疫的反義RNA和/或誘騙(decoy)RNA(WO 96/22368)。本發(fā)明涉及產(chǎn)生編碼上述任何物質(zhì)或其任何組合的病毒載體的方法，其中該病毒載體在其包膜中包含結(jié)合唾液酸(cyalicacid)的膜蛋白。
另外，通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體對(duì)含粘液的細(xì)胞，例如鼻腔粘膜上皮細(xì)胞和肺支氣管粘膜上皮細(xì)胞具有高感染力。使用常規(guī)病毒載體很難將基因?qū)牒骋旱募?xì)胞，例如氣管上皮粘膜細(xì)胞，并且導(dǎo)入時(shí)必需進(jìn)行排除物理障礙的處理。例如，使用VSV-G假型的HIV載體進(jìn)行基因?qū)氩粫?huì)產(chǎn)生足夠的導(dǎo)入效率，除非組織被二氧化硫或類似物質(zhì)破壞(Johnson L.G.等，Gene Therapy 7568-574(2000))。然而，本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體能在不破壞細(xì)胞或組織的情況下，將基因高效導(dǎo)入曾經(jīng)難以導(dǎo)入的含粘液的細(xì)胞中(WO01/92508)。因此，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的病毒產(chǎn)生方法產(chǎn)生將基因?qū)牒骋旱募?xì)胞的載體的方法。它還涉及將基因?qū)牒骋旱募?xì)胞的方法，包括使含粘液的細(xì)胞與用本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體接觸，并用本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體將基因?qū)牒骋旱募?xì)胞。含粘液的細(xì)胞包括粘膜上皮細(xì)胞，具體如鼻腔或肺支氣管粘膜上皮細(xì)胞。
具體應(yīng)用實(shí)例包括，利用高濃度的抗原呈遞細(xì)胞(APC)將基因(例如IL-2、IFN-γ、和TGF-β)導(dǎo)入皮膚和粘膜來(lái)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)(WO95/05853)，通過(guò)口服基因?qū)⑤啝畈《疽呙鐚?dǎo)入粘膜(J.V.irol.72(7)5757-5761(1998))，粘膜給藥治療自免疫疾病(WO97/46253)，粘膜給藥預(yù)防傳染性疾病(WO96/21356)，將基因?qū)肱陨称鞴僬衬?lái)預(yù)防性傳播疾病或由乳頭瘤病毒感染引起的宮頸癌(Infect.Immun.66(1)322-329(1998))，以及通過(guò)粘膜給藥使給藥簡(jiǎn)化并且提高安全性(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.3686Meet.，418(1995))。
具體地，本發(fā)明產(chǎn)生重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法包括如下步驟，例如，(a)提供細(xì)胞(產(chǎn)生病毒的細(xì)胞)，在其中轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA，并表達(dá)gag和pol蛋白以及與唾液酸結(jié)合的膜蛋白，和(b)在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，并回收產(chǎn)生的病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA可以基于野生型病毒基因組而變化，只要它被包裝進(jìn)入病毒粒子并整合進(jìn)入靶細(xì)胞染色體。例如，它可以是在兩端都具有LTR并包含包裝信號(hào)序列的RNA?；蚪MRNA中可以插入所需基因。這種插入的外源基因可通過(guò)LTR的啟動(dòng)子活性表達(dá)，或通過(guò)將另一啟動(dòng)子插入基因組內(nèi)部來(lái)啟動(dòng)表達(dá)。
在產(chǎn)生病毒的細(xì)胞中表達(dá)的gag和pol蛋白，以及基因組RNA可衍生自其它病毒，只要它們裝配形成病毒。例如，表達(dá)HIV病毒蛋白的包裝細(xì)胞可用于包裝SIV基因組RNA。在這種應(yīng)用中，與唾液酸結(jié)合的膜蛋白可在包裝細(xì)胞中瞬間表達(dá)或組成型表達(dá)。通過(guò)在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下培養(yǎng)上述產(chǎn)生病毒的細(xì)胞，包膜中具有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的反轉(zhuǎn)錄病毒被釋放到培養(yǎng)基中。可回收培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清以獲得產(chǎn)生的病毒。
例如，本發(fā)明中反轉(zhuǎn)錄病毒載體可如下產(chǎn)生。下文具體的產(chǎn)生病毒載體的方法顯示為實(shí)施例，本領(lǐng)域任何熟練的技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行修改。
為了用質(zhì)粒載體表達(dá)使重組病毒假型化所用的病毒包膜蛋白，可以將編碼蛋白的基因插入pCAGGSA載體(Niwa H.等，Gene 108193-200(1991))等來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體。例如將編碼負(fù)鏈RNA病毒(例如流感病毒或仙臺(tái)病毒)HA(或HN)、F和M蛋白的基因插入表達(dá)載體。例如，構(gòu)建流感病毒HA蛋白(H1N1)的表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，HA蛋白的ORF用pDREF HisD質(zhì)粒(Microbiol.Immunol.44(8)677-685(2000)作為模板、并用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的片段用Notl消化，插入載體的NotI位點(diǎn)，該載體中pCAGGS帶有XhoI-NotI位點(diǎn)。由此獲得表達(dá)HA蛋白的pCAGGS-HA質(zhì)粒(WO01/92508)。另一方面，可如下制備仙臺(tái)病毒包膜蛋白的表達(dá)質(zhì)粒例如，從pSeV18+b(+)(仙臺(tái)病毒Z株的完整基因組DNA(Hasan M.K.等，J.GeneralVirol.782813-2820(1997)))切下編碼F、HN和M蛋白的基因，并插入pCAGGS的XhoI位點(diǎn)以構(gòu)建仙臺(tái)病毒F、HN和M蛋白的表達(dá)載體(分別稱pCAGGS F、pCAGGS HN和pCAGGS M)(WO01/92508)。
在產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，用例如人胚腎衍生細(xì)胞系293T細(xì)胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396(1993)作為產(chǎn)病毒的細(xì)胞。293T細(xì)胞在含有10％已滅活的胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco BRL)中培養(yǎng)。用LIPOFECTAMINE PLUS(Gibco BRL)按照說(shuō)明書導(dǎo)入DNA載體。例如，將293T細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，在CO2氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)(37℃、10％CO2)。導(dǎo)入前30分鐘，培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白(Gibco BRL)/孔的800μl DMEM代替，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
基因?qū)胼d體不限于任何具體的病毒；例如，可使用鼠干細(xì)胞病毒(MSCV；Clontech)(Hawley R.G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9310297-10302(1996)；Hawley R.G.等，Gene Therapy 1136-138(1994))。將要表達(dá)的所需基因插入到載體中。就DNA導(dǎo)入量而言，每孔可使用700ng基因?qū)胼d體和300ng包裝載體(pCL-Eco，Pcl-Ampho(MuLV 4070A)，都可從IMGENEX獲得)(Naviaux，R.K.等，J.Virol.705701-5705(1996))，除了這些，用于負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的200ng上述表達(dá)載體可單獨(dú)或以任何組合使用。將DNA溶于100μl OptiMEM，向其中加入6μl PLUS試劑(GibcoBRL)，混合后，溶液在室溫靜置15分鐘。向DNA和PLUS試劑(Gibco BRL)的混合物中加入4μl LIPOFECTAMINE在100μl OptiMEM中的稀釋液，混合后將該混合物在室溫再培養(yǎng)15分鐘。將含有如上述制備的DNA和LIPOFECTAMINE混合物的溶液滴加到6孔板的293T細(xì)胞培養(yǎng)物中，然后輕微混合，培養(yǎng)物CO2氣體培養(yǎng)箱中培育3小時(shí)(37℃、10％CO2氣體)。然后，每孔培養(yǎng)物中加入含1％牛血清清蛋白(Gibco BRL)和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM(Gibco BRL)，在CO2氣體培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24小時(shí)(37℃、10％CO2)。隨后，每孔培養(yǎng)基用含1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和0.01U革蘭氏陽(yáng)性菌唾液酸苷酶的2ml DMEM代替，培養(yǎng)物繼續(xù)培育24小時(shí)。然后，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)0.45μm過(guò)濾器(例如，DISMIC-25CS過(guò)濾器(ADVANTEC))過(guò)濾獲得載體溶液。革蘭氏陽(yáng)性菌唾液酸苷酶可以是從放線菌衍生的NA，例如，具體地從綠色小單孢菌衍生的NA。NA的量可適當(dāng)調(diào)整。具有負(fù)鏈RNA病毒的HA活性包膜蛋白的假型反轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)含粘液的細(xì)胞，例如肺支氣管粘膜上皮細(xì)胞具有高感染力。因此，如上述產(chǎn)生的這種載體可用于將基因?qū)牒骋旱募?xì)胞。此外，這種能將基因?qū)肴斯撬鐲D34陽(yáng)性細(xì)胞和CD34陰性細(xì)胞的病毒載體可用于將基因?qū)朐煅?xì)胞。
另外，基于莫洛尼鼠肉瘤病毒的假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體可在本發(fā)明中適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生。而且，可制備進(jìn)一步含有VSV-G蛋白作為包膜蛋白的載體。例如，使用上述pMSCV EGFP，或在莫洛尼鼠肉瘤病毒LTR控制下表達(dá)LacZ的pLZRNL載體(Yee J.-K.等，Methods In Cell Biology 4399-112(1994)；Xu L.等，Virology 171331-341(1989))作為基因?qū)胼d體，具有各種包膜蛋白的假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體可如下制備。
在37℃、10％CO2氣體的條件下，在含有10％已滅活的小牛血清(BIOWHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培養(yǎng)293T細(xì)胞。細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2中培育48小時(shí)。然后，每孔培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)入。在每孔中，將700ng基因?qū)胼d體(pMSCV EGFP或pLARNL)與100ng VSV-G表達(dá)質(zhì)粒pVSV-G(衍生自Indiana血清型株；Clontech)，200ng負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白各自的表達(dá)質(zhì)粒(用pCAGGS構(gòu)建)，和300ng鼠反轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCL-Eco和pCL-Ampho(Imgenex)(Naviaux R.K.等，J.Virol.705701-5705(1996))以任何組合混合，并溶于100μl OptiMEM中。加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)后，攪拌混合物，在室溫靜置15分鐘。將在100μl OptiMEM中稀釋的4μl LIPORECTAMINE試劑(Gibco BRL)加入混合物中并充分混合，進(jìn)一步在室溫培育15分鐘。然后，將混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕微混合，培養(yǎng)物在37℃、10％CO2氣體條件下培育3小時(shí)。然后，各孔培養(yǎng)物中加入含有1％牛血清清蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM，在37℃、10％CO2氣體條件下再培育24小時(shí)。隨后，各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)、和0.01U衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(例如放線菌)的唾液酸苷酶的2ml DMEM代替，培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，收集培養(yǎng)上清，并通過(guò)孔徑大小為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾獲得載體溶液。
此外，本發(fā)明尤其可用于慢病毒載體的產(chǎn)生。下文顯示了用VSV-G蛋白產(chǎn)生假型慢病毒載體的實(shí)施例。
為了構(gòu)建載體，可使用例如SIVagm TYO-1株，一種非洲綠猴免疫缺陷病毒的非病原性克隆。攜帶SIVagm TYO-1作為插入片段的質(zhì)粒可從例如pSA212構(gòu)建(J.Virol.64307-312(1990))?；?qū)胼d體和包裝載體的構(gòu)建可使用公開(kāi)的文獻(xiàn)作為參考進(jìn)行(WO01/92508)。具體地，構(gòu)建提供病毒粒子形成所必需的蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(包裝載體)，其中g(shù)ag、pol、tat、rev、vif、vpr/x序列都位于啟動(dòng)子的下游。為了避免產(chǎn)生野生型病毒，優(yōu)選除去包裝信號(hào)ψ和env的絕大部分?？梢詫D序列插入gag上游，并將RRE序列插入和tat/rev的第一個(gè)外顯子的下游，以表達(dá)包裝載體中所有的基因。而且，可缺失全部的nef序列，該序列被認(rèn)為對(duì)于載體包裝不是必需的。
構(gòu)建基因?qū)胼d體，該載體提供包裝在該載體中的RNA，從而可以攜帶基因組兩端的LTR序列、SD序列、ψ和RRE作為插入片段。而且，基因?qū)胼d體的5’-LTR啟動(dòng)區(qū)可用外源啟動(dòng)子取代。此外，3’-LTR的序列可部分缺失以制備自我不活化載體(SIN載體)，該載體防止靶細(xì)胞中編碼完整載體的mRNA的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于這種SIN載體，例如可插入CMV啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子，而所需外源基因被插入該啟動(dòng)子的下游。
VSV-G表達(dá)載體可用做提供衣殼蛋白的載體以形成假型載體顆粒。例如，用于提供VSV-G的載體可以是實(shí)際上用于使反轉(zhuǎn)錄病毒載體和HIV載體假型化的pVSV-G(Burns.J.C.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037)。
下文中提供了更具體的描述。
<包裝載體的構(gòu)建>
使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)，以pSA212作為模板，通過(guò)PCR制備對(duì)應(yīng)于含有vif和tat/rev的第一個(gè)外顯子的區(qū)域(5337-5770)的DNA片段。將限制性內(nèi)切酶EcoRI的位點(diǎn)加入PCR引物之一，由此制備在3’末端含有EcoRI位點(diǎn)的DNA片段。PCR片段用BgIII和EcoRI消化，并使用瓊脂糖凝膠電泳和Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)純化。如上所述制備的DNA片段以及編碼gag/pol區(qū)(從XhoI位點(diǎn)(356)到BgIII位點(diǎn)(5338))的另一個(gè)DNA片段連接進(jìn)入XhoI和EcoRI位點(diǎn)之間的pBluescript KS+(Stratagene)。然后，Rev效應(yīng)元件(RRE)和與包含tat/rev的第二個(gè)外顯子的區(qū)域一致的DNA片段使用PCR擴(kuò)增。使用例如pSA212作為模板通過(guò)PCR將NotI位點(diǎn)加入3’末端。獲得的PCR片段用EcoRI和NotI雙消化，隨后純化。該片段被插入在EcoRI和NotI位點(diǎn)之間含有g(shù)ag-tat/rev的pBluescript KS+中。
合成的在其5’和3’末端分別具有XhoI位點(diǎn)和SaII位點(diǎn)、并含有剪接供體(SD)位點(diǎn)序列的DNA片段，被插入上述含有g(shù)ag-RRE-tat/rev的pBluescriptKS+的XhoI位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒用XhoI和NotI消化。含有SD-gag-RRE-tat/rev的片段被純化。通過(guò)在EcoRJ位點(diǎn)將XhoI/NotI接頭插入pCAGGS(Gene，108卷，193-200，1991)制備質(zhì)粒，然后在XhoI/NotI位點(diǎn)插入上述SD-gag-RRE-tat/rev片段。通過(guò)上述方法獲得的質(zhì)粒被用做包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev(WO01/92508)。
<基因?qū)胼d體的構(gòu)建>
使用pSA212作為模板，使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增SIVagmTYO1衍生的5’LTR區(qū)(8547到9053+1到982；在5’和3’末端分別含有KpnI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn))；3’LTR區(qū)(8521-9170；在5’末端含有NotI和BamII位點(diǎn)，在3’末端含有SacI位點(diǎn))；和RRE序列(7380-7993；在5’和3’末端分別含有EcoRI和SacII位點(diǎn))。衍生自pEGFPN2(Clontech)的CMV啟動(dòng)區(qū)(1-600；在5’和3’末端分別含有SacII和NotI位點(diǎn))使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)擴(kuò)增。DNA片段在其末端被消化。純化后，通過(guò)連接，5’LTR、RRE、CMV啟動(dòng)子和3’LTR以這樣的次序在KpnI-SacI位點(diǎn)插入pBIuescript KS+。例如，含有衍生自pCMVβ(Clontech)的β-半乳糖苷酶基因的NotI片段使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)分別插入5’和3’末端的位點(diǎn)。衍生自pEGFPN2(Clontech)CMV啟動(dòng)區(qū)(1-600；在5’和3’末端分別含有SacII和NotI位點(diǎn))使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)擴(kuò)增。DNA片段在其末端被消化。純化后，通過(guò)連接，5’LTR、RRE、CMV啟動(dòng)子和3’LTR以這樣的次序在KpnI-SacI位點(diǎn)插入pBluescript KS+。例如，含有衍生自pCMVβ(Clontech)的β-半乳糖苷酶基因的NotI片段作為報(bào)道基因插入NotI位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒用KpnI和SacI消化以獲得含有從5’LTR到3’LTR區(qū)域的DNA片段。在KpnI-SacI位點(diǎn)將該片段插入控制載體pGL3(Promega)。獲得的質(zhì)粒被用做基因?qū)胼d體pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMV Fβ-gal/WT 3’LTR。
此外，衍生自pEGFPC2(Clontech)的CMV啟動(dòng)區(qū)以及編碼EGFP的區(qū)域(1-1330；包含位于5’末端的SacII位點(diǎn)和位于3’末端的NotI、BamHI位點(diǎn)和翻譯終止密碼子)使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)并使用pEGFPC2作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增。四種類型的PCR片段分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI、EcoRI和SacII、BamHI和SacI、以及SacII和BamHI消化。純化后，通過(guò)連接，將5’LTR的片段、RRE、CMV啟動(dòng)子EGFP和3’LTR以這樣的次序在KpnI和SacI位點(diǎn)之間插入pBluescript KS+(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT 3’LTR)。質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR用KpnI和SacI消化以制備含有從5’LTR到3’LTR的區(qū)域的DNA片段。該片段作為控制載體在KpnI-SacI位點(diǎn)被插入pGL3(Promega)以構(gòu)建載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。
<5’LTR的修飾>
含有5’LTR的TATA框下游的gag區(qū)(9039到9170+1到982)的片段使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)并使用pSA212作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增。巨細(xì)胞病毒的CMV L啟動(dòng)子(衍生自pCI(Promega)；核苷酸1-72)使用PCR擴(kuò)增。含有5’LTR的TATA框下游區(qū)域的片段與含有啟動(dòng)子的片段結(jié)合。含有啟動(dòng)子和5’LTR的嵌合啟動(dòng)子的DNA片段使用混合物作為模板，且一個(gè)引物置于啟動(dòng)子的5’側(cè)，另一個(gè)引物位于5’LTR的3’側(cè)通過(guò)PCR制備。獲得的DNA片段在KpnI-EcoRI位點(diǎn)被插入基因?qū)胼d體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3’LTR)以制備pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR。簡(jiǎn)言之，通過(guò)上述PCR試驗(yàn)獲得的DNA片段還可插入載體pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR的KpnI-EcoRI位點(diǎn)以制備pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT 3’LTR。
<3’LTR-修飾的SIN載體(自我不活化載體)的制備>
含有5’末端27bp、3’末端15bp、以及來(lái)自3’LTR的U3區(qū)域的R區(qū)域的DNA片段使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)并使用pSA212作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增。該片段被插入基因?qū)胼d體 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI的位點(diǎn)(制備該載體使之包含上一部分中所述的嵌合啟動(dòng)子)，以制備pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3’LTRΔU3。簡(jiǎn)言之，該片段在SalI-SacI位點(diǎn)還被插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR以制備pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3’LTRΔU3(WO01/92508)。
構(gòu)建的質(zhì)粒通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化為DH5α(Toyobo)，并在瓊脂平板上培育。使用新生集落(emerging colonies)作為模板進(jìn)行PCR以證實(shí)正確的結(jié)構(gòu)。確定的克隆在100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(QIAGEN)純化質(zhì)粒。
<病毒載體的回收>
293T細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，在37℃、10％CO2氣體條件下培養(yǎng)48小時(shí)。然后，培養(yǎng)基用每孔800μl OptiMEM(如果使用HA則包含1％BSA)取代用于導(dǎo)入。對(duì)于每一個(gè)加樣孔，600ng上述基因?qū)胼d體和300ng上述包裝載體與包膜蛋白的表達(dá)質(zhì)?；旌希缫匀我饨M合、并溶于100μl OptiMEM中的100ng到300ng負(fù)鏈RNA病毒HA(或HN)和F蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(在pCAGGS中構(gòu)建)，和100ng VSV-G蛋白(pVSV-G；Clontech)的表達(dá)質(zhì)粒。加入6μl PLUS試劑后(Gibco BRL)，攪拌混合物，并在室溫靜置15分鐘。將與4μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)混合的100μl OptiMEM加入混合物中，徹底混合，再在室溫培育15分鐘。然后，混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕柔混合，并在37℃、10％CO2氣體條件下培育3小時(shí)。然后，將1ml含有20％已滅活的小牛血清的DMEM(或者如果使用HA則用含有1％BSA和5μg/ml胰蛋白酶代替)加入各個(gè)加樣孔的培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物在37℃、10％CO2氣體條件下繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。隨后，各個(gè)加樣孔的培養(yǎng)基用含有10％已滅活的小牛血清(或者如果使用HA，在衍生自M.viridifaciens的NA存在的情況下，用含有1％牛血清清蛋白和5μg/ml胰蛋白酶代替)的DMEM替換，培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，回收培養(yǎng)上清，并通過(guò)孔徑為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾。
<SIVagm載體介導(dǎo)的基因?qū)?amp;gt;
293T細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度置于6-孔塑料培養(yǎng)平板中，在10％CO2、37℃的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。除去培養(yǎng)基，1ml其中包含以8μg/ml終濃度加入了聚凝胺(polybrene)(Sigma)的載體溶液的溶液覆蓋于細(xì)胞上。細(xì)胞在10％CO2、37℃培育3小時(shí)以完成載體導(dǎo)入。3小時(shí)后，1ml培養(yǎng)基加入細(xì)胞中。第二天，改變培養(yǎng)基。第三天，當(dāng)使用的載體是β-Gal表達(dá)載體時(shí)，使用β-Gal染色試劑盒(Invitrogen)用X-gal作為底物進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡觀察到靶細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的表達(dá)。然而，當(dāng)使用的載體是EGFP表達(dá)載體時(shí)，在熒光顯微鏡下分析表達(dá)。
<載體滴定>
通過(guò)計(jì)算使用1ml載體溶液導(dǎo)入基因的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行載體滴定。293T細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度置于6-孔塑料培養(yǎng)平板中，并培養(yǎng)48到72小時(shí)。通過(guò)與上述相同的步驟，用系列稀釋的載體溶液進(jìn)行細(xì)胞感染。感染后48小時(shí)進(jìn)行X-gal染色。例如，一個(gè)視野內(nèi)包含導(dǎo)入基因的細(xì)胞的數(shù)量的平均值從光學(xué)顯微鏡下200倍放大的三個(gè)不同的視野確定，并乘以系數(shù)854.865確定，該系數(shù)基于視野的面積和平板的面積確定以確定滴度。這樣計(jì)算的病毒載體滴度單位定義為導(dǎo)入單位(T.U.)/ml。
這樣制備的SIVagm載體高效地介導(dǎo)基因?qū)肱囵B(yǎng)細(xì)胞和其它體內(nèi)和體外細(xì)胞。野生型病毒粒子重組的可能性在許多獨(dú)立質(zhì)粒共導(dǎo)入后包裝的載體中假定非常低，例如上述基因?qū)胼d體、包裝載體和包膜表達(dá)載體。此外，用做載體基礎(chǔ)的SIVagm TYO-1本身，已被證實(shí)就天然和試驗(yàn)感染來(lái)說(shuō)都顯示沒(méi)有致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer41，115-22，1988；Miura，T.等，J.Med.Primatol.18(3-4)，255-9，1989；Honjo，S.等，J.Med.Primatol.19(1)，9-20，1990)。另外，該載體可以是高度安全的，因?yàn)橥ǔＢ《臼歉叨确N特異性的，并且除對(duì)于它們?cè)嫉陌蟹N類外，對(duì)動(dòng)物種類僅具有微弱的致病性(Novembre，F(xiàn).J.等，J.Virol71(5)，4086-91.1997)。
在這個(gè)載體產(chǎn)生系統(tǒng)中，包裝信號(hào)序列從包裝載體構(gòu)建物中除去，因此編碼病毒蛋白的RNA沒(méi)有被包裝成顆粒。rev蛋白與RRE的結(jié)合誘導(dǎo)RNA導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)并抑制剪接，導(dǎo)致病毒蛋白的表達(dá)以及全長(zhǎng)RNA包裝成為病毒粒子。因此，包裝載體和基因?qū)胼d體中插入的RRE可介導(dǎo)包裝載體的mRNA的剪接，這因此可允許全部基因的表達(dá)。然后，基因?qū)胼d體的mRNA可被導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)，并包裝成載體顆粒。有一些vif和vpr/x從HIV-1載體中除去的例子(Dull，T.等，J.Virol，72(11)，8463-71.1998)，這說(shuō)明蛋白對(duì)于載體顆粒的包裝和行使功能非必需的可能性。人們認(rèn)為vpr是負(fù)責(zé)對(duì)不分裂細(xì)胞的感染性的因子(Heinzinger，N.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(15)，7311-5，1994)；報(bào)道描述HIV-1載體可將基因?qū)氲募?xì)胞的類型依賴于vpr的存在而改變(Kim，V.N.等，J.Virol，72(1)，811-6，1998)。還已報(bào)道，如上文中描述的完全從包裝載體中除去的nef，基于猴感染試驗(yàn)獲得的證據(jù)，可以是引起SIV-介導(dǎo)的免疫缺陷的蛋白(von Gegerfelt，A.S.等，J.Virol.73，6159-65，1999；Kestler，H.W.3d.，Y.N.，Kodama，T.，King，N.W.，Daniel，M.D.，Li，Y.，Desrosiers，R.C.猿免疫缺陷病毒的感染性分子克隆對(duì)于發(fā)病機(jī)理研究的用途，J.Med.Primatol.18(3-4)305-9，1989)。相應(yīng)的序列完全從如上所述構(gòu)建的SIVagm載體中除去；因此，即使形成含有衍生自包裝載體的病毒基因的重組病毒粒子，這種顆粒的致病風(fēng)險(xiǎn)將進(jìn)一步下降。
基于慢病毒的載體可將基因?qū)爰?xì)胞周期停滯培養(yǎng)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，因?yàn)樵嫉穆《緦?duì)不分裂的細(xì)胞具有感染性(Naldini，L.等，Science272263-267，1996；Sutton，R.E.等，J.Viroi.，73(5)，3649-60，1999)。當(dāng)這樣的載體是由VSV-G制成的假型載體時(shí)，不象原始的SIV，該載體的感染性不限于感染CD4-和趨化因子受體-陽(yáng)性細(xì)胞。已知VSV-G的受體是磷脂酰絲氨酸，它是一種磷脂，其分子存在于各種類型的細(xì)胞表面(Schlegel，R.等，Cell，32(2)，639-46，1983)。因此，由VSV-G制成的假型SIVagm載體具有較寬范圍的感染性。人們預(yù)測(cè)當(dāng)用具有唾液酸結(jié)合活性的膜蛋白制成的假型病毒基于這種載體制備時(shí)，它們能高效地將基因?qū)霂缀跛蓄愋偷膭?dòng)物細(xì)胞。
在病毒載體的制備中用于導(dǎo)入細(xì)胞的質(zhì)粒載體的量可適當(dāng)調(diào)節(jié)。例如，可使用下列方法，雖然并不限于這些方法。
1.細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞(人胚腎衍生細(xì)胞系)在37℃、10％CO2的條件下，在含有10％已滅活的小牛血清(BIO WHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培養(yǎng)。
2.載體的構(gòu)建293T細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2的條件下培育48小時(shí)。然后，各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替用于導(dǎo)入。對(duì)于各個(gè)加樣孔，1200ng基因?qū)胼d體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRAU3，或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3LTRAU3)和360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)與任何組合的包膜蛋白的表達(dá)質(zhì)粒混合120ng VSV-G表達(dá)質(zhì)粒pVSV-G(Clontech)，和240ng負(fù)鏈RNA病毒(在pCAGGS中)HA(或HN)、F和M蛋白的各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，并溶于100μlOptiMEM中。加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)后，攪拌混合物，并在室溫靜置15分鐘。在100μl OptiMEM中稀釋的4μl LIPOFECTAMINE試劑(GibcoBRL)加入混合物中，徹底混合，再在室溫培育15分鐘。然后，混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕柔混合，在37℃、10％CO2的條件下培育3小時(shí)。然后，將含有1％BSA和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(如果使用HA，則用10μg/ml胰蛋白酶替代)的1ml DMEM加入各個(gè)加樣孔的培養(yǎng)物中，并在37℃、10％CO2的條件下培育24小時(shí)。隨后，各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用2ml DMEM替代，該DMEM含有1％牛血清清蛋白、7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(5μg/ml胰蛋白酶用于HA)，和衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(例如放線菌)的0.01U的NA，且該培養(yǎng)物繼續(xù)培育24小時(shí)。然后，回收培養(yǎng)上清，并通過(guò)孔徑為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾以獲得載體溶液。
載體的大規(guī)模制備及其濃縮如下進(jìn)行。例如，293T細(xì)胞以5×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的密度置于直徑為15cm的塑料培養(yǎng)皿中，在37℃、10％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。各個(gè)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用10ml含有1％牛血清清蛋白的DMEM代替，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行導(dǎo)入。對(duì)于各個(gè)培養(yǎng)皿，8μg的基因?qū)胼d體和2.4μg的包裝載體與任何組合的0.8μg的VSV-G表達(dá)質(zhì)粒pVSV-G(Clontech)和1.6μg的負(fù)鏈RNA病毒(pCAGGS)HA(或HN)和F蛋白的各個(gè)表達(dá)質(zhì)?；旌希⑷苡?.5ml OptiMEM中。將40μl PLUS試劑((GibcoBRL)加入質(zhì)粒溶液中，混合，混合物在室溫靜置15分鐘。將在1.5mlOptiMEM中稀釋的60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)加入混合物中，徹底混合，并在室溫再培育15分鐘。然后，該混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕柔混合，并在37℃、10％CO2的條件下培育3小時(shí)。然后，將10ml含有1％BSA和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM加入各個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)物中，并在37℃、10％CO2的條件下培育24小時(shí)。隨后，各個(gè)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用20ml DMEM替換，該DMEM含有1％牛血清清蛋白、7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(如果使用HA則為5μg/ml胰蛋白酶)，和衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(例如放線菌)的大約0.05到0.5U的NA。在37℃、10％CO2的條件下再培育24小時(shí)后，回收培養(yǎng)上清，通過(guò)孔徑為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾，并在4℃以42,490xg離心90分鐘(如果使用F/HN則為16,000xg)(TOMY SRX-201，TA21BH)。沉淀溶于PBS(含有5％FCS，2μg/ml聚凝胺)中，在-80℃保存直至使用。
在另一個(gè)實(shí)施例中，具有流感HA蛋白的假型慢病毒載體可被濃縮。濃縮可如下進(jìn)行。293T細(xì)胞以5×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的密度置于直徑為15cm的塑料培養(yǎng)皿中，在37℃、10％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。各個(gè)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用10ml含有1％牛血清清蛋白的DMEM替換，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行導(dǎo)入。對(duì)于各個(gè)培養(yǎng)皿，8μg的基因?qū)胼d體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF LacZ/3’LTRΔU3)與2.4μg的包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和1.6μg的流感HA蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA混合，并溶于1.5ml OptiMEM中(Gibco BRL)。將40μl PLUS試劑(Gibco BRL)加入質(zhì)粒溶液中，混合，在室溫靜置15分鐘。將在1.5mlOptiMEM中稀釋的60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)加入混合物中，徹底混合，再在室溫培育15分鐘。然后，混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕柔混合，并在37℃、10％CO2的條件下培育3小時(shí)。然后，含有1％BSA和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的10ml DMEM加入各個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)物中，并在37℃、10％CO2的條件下培育16-24小時(shí)。隨后，各個(gè)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用20ml DMEM替換，該DMEM含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)，和衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(例如放線菌)的大約0.05到0.5U的NA。再培育24小時(shí)后，回收培養(yǎng)上清，通過(guò)孔徑為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾，并在4℃以16,000xg離心1小時(shí)(Beckman J-25I，JA-18)。沉淀重懸浮于PBS(含有5％FCS，2μg/ml聚凝胺)中，在-80℃儲(chǔ)存。流感病毒HA的使用使之能在沒(méi)有其它包膜蛋白例如VSV-G共表達(dá)的情況下進(jìn)行基因?qū)?。HA假型載體可通過(guò)離心高度濃縮。
此外，假型慢病毒載體可使用兩種或多種唾液酸結(jié)合蛋白制備。下面描述的是用流感病毒和仙臺(tái)病毒的包膜蛋白產(chǎn)生假型慢病毒載體的實(shí)施例。
<細(xì)胞培養(yǎng)>
在37℃、10％CO2的條件下，在含有10％已滅活的小牛血清(BIOWHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培養(yǎng)293T細(xì)胞(人胚腎衍生細(xì)胞系)。
<載體構(gòu)建>
293T細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2的條件下培育48小時(shí)。各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，該培養(yǎng)物用于導(dǎo)入。對(duì)于各個(gè)加樣孔，1200ng基因?qū)胼d體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，和240ng仙臺(tái)病毒HN蛋白(pCAGGS-HN)和HA蛋白的各個(gè)表達(dá)質(zhì)?；旌?，并溶于100μlOptiMEM(Gibco BRL)中。將6μl PLUS試劑(Gibco BRL)加入質(zhì)粒溶液，混合，并在室溫靜置15分鐘。將在100μl OptiMEM中稀釋的4μlLIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)加入混合物中，徹底混合，再在室溫培育15分鐘。然后，混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕柔混合，在37℃、10％CO2的條件下培育3小時(shí)。然后，將含有1％BSA和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM加入各個(gè)加樣孔的培養(yǎng)物中，并在37℃、10％CO2的條件下培育16-24小時(shí)。隨后，各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白和5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的2ml DMEM替換，且該培養(yǎng)物繼續(xù)培育24小時(shí)。此外，各個(gè)加樣孔中的培養(yǎng)基用含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌(例如放線菌)的0.01U的NA的2ml DMEM替換，該培養(yǎng)物繼續(xù)培育24小時(shí)。然后，回收培養(yǎng)上清，并通過(guò)孔徑為0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾以獲得載體溶液。
通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的載體可使用通常已知的病毒純化方法純化。純化可通過(guò)公眾已知的純化和分離方法進(jìn)行，例如上述離心、過(guò)濾、吸附、和柱純化，或它們的組合。由此可獲得基本上純化的含有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體。本文中，基本上純化的病毒載體是指，該病毒載體基本上不含能將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的其它病毒載體?；旧霞兓牟《据d體優(yōu)選不含產(chǎn)病毒的細(xì)胞的任何碎片或其它污染物。
通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒載體可通過(guò)適當(dāng)?shù)貙⑵渑c藥物可接受的載體組合作為組合物提供。本文中，短語(yǔ)“藥物可接受的載體”是指能與載體一起給予、并且不顯著抑制載體-介導(dǎo)的基因?qū)氲奈镔|(zhì)。具體地，例如，可使用無(wú)菌水、鹽水、培養(yǎng)基、血清或磷酸緩沖鹽水(PBS)與載體混合用于產(chǎn)生藥物。此外，也可任選地包括其它物質(zhì)，例如穩(wěn)定劑或抗生素。本發(fā)明的組合物可以以水溶液、膠囊、懸浮液、糖漿等形式存在。含有通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒載體的這種組合物可以用作試劑(regent)或藥物。例如，該組合物可用做用于體內(nèi)或體外基因?qū)敫鞣N細(xì)胞的試劑，或用于回體或體內(nèi)基因治療的藥物。通常，組合物通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的方法給予患者例如動(dòng)脈注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射、腸道給予、口服、鼻部給藥、或回體給予。具體地，通過(guò)鼻或支氣管粘膜給藥，以及回體給藥進(jìn)入血細(xì)胞和造血細(xì)胞是適當(dāng)?shù)摹］d體給予的量可根據(jù)疾病、患者的體重、年齡、性別、癥狀、給藥的目的、給藥組合物的配方、給藥方法以及被導(dǎo)入的基因而變化，但本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)能適當(dāng)?shù)卮_定。
通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒載體可應(yīng)用于各種遺傳疾病的基因療法。目標(biāo)疾病不限于任何具體的一種。潛在的目標(biāo)疾病及其單一責(zé)任基因的例子包括Gaucher氏病、β-腦苷酶(染色體20)；血友病，凝結(jié)因子VIII(染色體X)和凝結(jié)因子IX(染色體X)；腺苷酸脫氨酶缺乏癥，腺苷酸脫氨酶；苯丙酮尿癥，苯丙氨酸羥化酶(染色體12)；Duchenne型肌肉萎縮癥，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(染色體X)；家族性高膽固醇血癥，LDL受體(染色體19)；和囊性纖維化，CFTR基因。這種基因可使用本發(fā)明的病毒載體整合進(jìn)入染色體。此外，牽涉多基因的潛在的目標(biāo)疾病包括神經(jīng)變性疾病，例如Alzheimer氏病和Parkinson氏病，缺血性腦病，癡呆，和難控制的傳染性疾病例如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。通過(guò)如下步驟進(jìn)行基因治療是可能的，從AIDS患者的體內(nèi)取出造血干細(xì)胞，體外引入通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的基于SIV的載體，在HIV感染發(fā)生前加強(qiáng)衍生自SIV的基因組的轉(zhuǎn)錄，將細(xì)胞放回患者體內(nèi)，并因此除去HIV的轉(zhuǎn)錄因子。此外，在治療慢性病的應(yīng)用中，該載體可用于在缺血性心臟病中抑制VEGF和FGF-2基因的表達(dá)，或抑制與例如生長(zhǎng)因子(例如PDGF和TGF-β)、依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶、或用于動(dòng)脈硬化的基因療法等的基因有關(guān)的細(xì)胞增殖。在糖尿病中，BDNF基因可以是候選基因。另外，該方法能應(yīng)用于，例如互補(bǔ)療法，其中編碼腫瘤抑制基因的基因(其突變引起癌)，例如p53基因，被整合進(jìn)入染色體，或超出癌癥藥物療法的限制，通過(guò)體外引導(dǎo)多個(gè)藥物抗性基因進(jìn)入骨髓造血干細(xì)胞，并放回患者血液進(jìn)行治療。對(duì)于自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE、和腎小球腎炎的基因治療，可通過(guò)反義表達(dá)抑制T細(xì)胞受體、各種粘附分子(例如ICAM-1、LFA-1、VCAM-1和LFA-4)、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體(例如TNF、IL-8、IL-6和IL-1)、生長(zhǎng)因子(例如PDGF和TGF-β)、效應(yīng)分子(例如MMP)的表達(dá)。對(duì)于過(guò)敏性疾病的基因治療，可通過(guò)反義表達(dá)抑制IL-4、FcεR-I等的表達(dá)。對(duì)于涉及組織移植的基因治療，可通過(guò)人源化非-人動(dòng)物供體的組織相容性抗原提高異種移植術(shù)的成功率。此外，可通過(guò)引導(dǎo)外源基因進(jìn)入人ES細(xì)胞的染色體，治療性的援助循環(huán)酶、生長(zhǎng)因子等的缺乏，并因此補(bǔ)充否則在胚胎中缺乏的那些基因。
例如，白細(xì)胞介素-4(IL-4)促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞分化為Th2淋巴細(xì)胞。Th2淋巴細(xì)胞反過(guò)來(lái)分泌調(diào)節(jié)與哮喘有關(guān)的炎癥的IL-4、IL-5、IL-9、和IL-13、細(xì)胞因子。IL-4是涉及呼吸障礙的一種分子，它誘導(dǎo)肺粘膜的粘膜分泌。IL-4介導(dǎo)VCAM-1的表達(dá)，它是與存在于嗜酸性粒細(xì)胞表面的VLA4分子相互作用的細(xì)胞粘附分子。通過(guò)這種相互作用，嗜酸性粒細(xì)胞可從血流中遷移到肺部組織的炎癥位點(diǎn)。IL-4誘導(dǎo)B細(xì)胞的增強(qiáng)和引發(fā)變態(tài)反應(yīng)所需的抗原特異性IgE的產(chǎn)生?？乖禺愋訧gE誘導(dǎo)炎性介質(zhì)例如組胺和白細(xì)胞三烯從肥大細(xì)胞釋放，這導(dǎo)致支氣管收縮。由于IL-4的這些作用，表達(dá)可溶性IL-4受體的載體可用于針對(duì)哮喘患者的治療。


圖1包括一對(duì)照片，顯示使用衍生自綠色小單孢菌(NA，右側(cè))并使用產(chǎn)生的病毒進(jìn)行基因?qū)氲慕Y(jié)果。作為對(duì)照，簡(jiǎn)單地用另外的方法使用衍生自霍亂弧菌的NA產(chǎn)生病毒，用相同體積的產(chǎn)病毒的細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行基因?qū)?vcNA，左側(cè))。
圖2包括一組照片，顯示使用不同數(shù)量的衍生自霍亂弧菌的NA產(chǎn)生的病毒的滴度。在相同條件下使用相同體積的產(chǎn)病毒的細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行基因?qū)?。各個(gè)系列上的數(shù)量表明增加的NA的量(單位)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文中通過(guò)參考實(shí)施例詳細(xì)闡述了本發(fā)明，但不能認(rèn)為僅限于此。這里引用的參考文獻(xiàn)作為本文的一個(gè)部分結(jié)合在本文的描述中。
使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA制備具有流感病毒包膜的假型SIV載體。
細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞(人胚腎衍生細(xì)胞系)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396(1993))在37℃、10％CO2的條件下，在添加了10％已滅活的小牛血清(BIOWHITTAKER)并具有豐富葡萄糖(Gibco BRL)的DMEM中培養(yǎng)。
載體構(gòu)建293T細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度接種于6-孔塑料培養(yǎng)平板中，并在37℃、10％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)基用每孔中含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)入。對(duì)于各個(gè)培養(yǎng)孔，1200ng基因?qū)胼d體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3、360ng包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev、和240ngHA蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA溶于100μl Opti MEM(Gibco BRL)中，然后加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)，混合，并在室溫培育15分鐘(WO01/92508)。然后，將以100μl Opti MEM稀釋的4μl LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)加入溶液中，徹底混合，并在室溫進(jìn)一步培育15分鐘。混合物逐滴加入上述293T細(xì)胞的培養(yǎng)物中，輕微混合，培養(yǎng)物在37℃、10％CO2的氣體條件下培育3小時(shí)。然后，含有1％牛血清清蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM加入各個(gè)加樣孔中，培養(yǎng)物在37℃、10％CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)16-24小時(shí)。然后，各個(gè)加樣孔的培養(yǎng)基用2ml含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(GibcoBRL)、和0.01U從綠色小單孢菌純化的唾液酸苷酶的DMEM代替。培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，并通過(guò)0.45μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾備用。作為對(duì)照，使用0.05單位的從霍亂弧菌(Roche)純化的唾液酸苷酶通過(guò)類似的方法產(chǎn)生載體。
用SIVagm載體介導(dǎo)的基因?qū)?93T細(xì)胞、靶細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔的密度接種于6-孔塑料培養(yǎng)平板中，并在37℃、10％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。從培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基，添加了8μg/ml(終濃度)聚凝胺(Sigma)的1ml載體溶液覆蓋在培養(yǎng)物上，并在37℃、10％CO2的條件下培育3小時(shí)用于載體感染。然后，將添加了20％已滅活的胎牛血清(BIO WHITTAKER)的1ml培養(yǎng)基加入培養(yǎng)物中，在37℃、10％CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。
載體的滴定通過(guò)計(jì)算用1ml載體溶液成功獲得基因?qū)氲募?xì)胞數(shù)量測(cè)定載體的滴度。如上所述，用1ml載體溶液感染細(xì)胞，并且，72小時(shí)后，在放大200倍的倒置熒光顯微鏡(DMIRB(SLR)；Leica)上檢驗(yàn)。計(jì)算各個(gè)視野中基因?qū)爰?xì)胞(GFP陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)量，并得到三個(gè)視野的平均數(shù)。該平均數(shù)乘以854.865，這是一個(gè)從視野與平板的面積獲得系數(shù)，以計(jì)算滴度。滴度的單位以導(dǎo)入單位(TU)/ml表示。結(jié)果顯示當(dāng)用衍生自霍亂弧菌的NA(VcNA)獲得的滴度為2.8×104(TU/ml)時(shí)，用衍生自綠色小單孢菌的NA(MvNA)獲得的滴度是1.1×105，后者明顯高于用VcNA獲得的滴度(圖1)。
增加的衍生自霍亂弧菌的NA的劑量對(duì)HA假型SIV載體的產(chǎn)生的影響如上所述，通過(guò)加入變化量的衍生自霍亂弧菌的NA，進(jìn)行HA假型SIV載體的產(chǎn)生，并檢測(cè)影響。結(jié)果顯示用以0.01到0.1U(0.005到0.05U/ml)加入的NA獲得的病毒滴度沒(méi)有明顯區(qū)別。因此，結(jié)果證明使用衍生自霍亂弧菌的NA產(chǎn)生的載體的滴度低是由于使用的NA的數(shù)量少的可能性是站不住腳的。
工業(yè)適用性本發(fā)明提供了使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶產(chǎn)生包含與包膜中的唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體的新方法。衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶不僅能低價(jià)購(gòu)買到，還能以低劑量產(chǎn)生具有高滴度的病毒。因此，本發(fā)明的方法在大規(guī)模的病毒工業(yè)產(chǎn)生中將獲得極好的性能價(jià)格比。產(chǎn)生的載體適合于臨床應(yīng)用，包括基因治療。
序列表<110>株式會(huì)社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶產(chǎn)生包含與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的病毒載體的方法<130>D3-A0204P<150>JP 2002-258576<151>2002-09-04<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1941<212>DNA<213>Micromonospora viridifaciens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1941)<223>
<400>1atg act gcg aat ccg tac ctc cgc cgc ctg ccc cgg cgc cga gcc gtc48Met Thr Ala Asn Pro Tyr Leu Arg Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ala Val1 5 10 15agc ttc ctg ctc gca cca gcg ctg gcg gcc gcc acg gtc gcc ggc gcg96Ser Phe Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Gly Ala20 25 30tcc ccc gca cag gcc atc gcc ggg gca ccc gtc ccg ccc ggc ggc gag144Ser Pro Ala Gln Ala Ile Ala Gly Ala Pro Val Pro Pro Gly Gly Glu35 40 45ccg ctc tac acg gag cag gac ctc gcc gtg aac ggc agg gag ggc ttt192Pro Leu Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Ala Val Asn Gly Arg Glu Gly Phe50 55 60ccg aac tac cgc atc cca gcg ctg acc gtc acg ccc gac ggg gac ctg240Pro Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Val Thr Pro Asp Gly Asp Leu65 70 75 80ctg gcc tcg tac gac ggc cgc ccg acc ggt atc gac gcg ccc ggc ccc288
ctg gcc tcg tac gac ggc cgc ccg acc ggt atc gac gcg ccc ggc ccc288Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Arg Pro Thr Gly Ile Asp Ala Pro Gly Pro85 90 95aac tcc atc ctc caa cgc cgc agc acc gac ggc ggc cgg acg tgg ggc336Asn Ser Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr Trp Gly100 105 110gag caa cag gtc gtc agc gcc ggc cag acc acc gcg ccg atc aag ggg384Glu Gln Gln Val Val Ser Ala Gly Gln Thr Thr Ala Pro Ile Lys Gly115 120 125ttc tcc gac ccc agc tac ctt gtc gac cgg gaa acc ggg acc atc ttc432Phe Ser Asp Pro Ser Tyr Leu Val Asp Arg Glu Thr Gly Thr Ile Phe130 135 140aac ttc cac gtc tac tcc cag cgg cag ggc ttc gcc ggc agc cgg ccc480Asn Phe His Val Tyr Ser Gln Arg Gln Gly Phe Ala Gly Ser Arg Pro145 150 155 160ggc acc gac ccg gca gac ccc aac gtg ctc cac gcc aac gtc gcg acc528Gly Thr Asp Pro Ala Asp Pro Asn Val Leu His Ala Asn Val Ala Thr165 170 175tcg acc gac ggc ggt ctg acc tgg tcg cac cgg acc atc acg gcc gac576Ser Thr Asp Gly Gly Leu Thr Trp Ser His Arg Thr Ile Thr Ala Asp180 185 190atc acc ccg gat ccg ggc tgg cgc agc cgc ttc gcc gcc tcc ggc gaa624Ile Thr Pro Asp Pro Gly Trp Arg Ser Arg Phe Ala Ala Ser Gly Glu195 200 205ggc atc cag ctc cgc tat gga ccc cac gcc ggt cga ctc atc cag cag672Gly Ile Gln Leu Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Ile Gln Gln210 215 220tac acg atc atc aac gct gcc ggc gcc ttc cag gcg gtg agc gtg tac720Tyr Thr Ile Ile Asn Ala Ala Gly Ala Phe Gln Ala Val Ser Val Tyr225 230 235 240agc gac gac cac gga agg acc tgg cgc gcc ggc gaa gcc gtc ggg gtc768Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Ala Gly Glu Ala Val Gly Val245 250 255ggc atg gac gag aac aag acc gtg gaa ctc tcc gat ggc cgg gtc ctg816Gly Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg Val Leu260 265 270ctc aac agc cgc gac tcg gcc cgc agc gga tac cgt aag gtg gcc gtc864
Leu Asn Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Lys Val Ala Val275 280 285tcc act gac ggc ggc cac agc tac ggc ccg gtg acc atc gac cgc gac912Ser Thr Asp Gly Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Thr Ile Asp Arg Asp290 295 300ctc ccc gac ccg acg aac aac gca tcg atc atc cgg gcc ttc cct gac960Leu Pro Asp Pro Thr Asn Asn Ala Ser Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asp305 310 315 320gcc ccg gcc ggc tcc gcg cgg gcc aag gtc ctg ctc ttc tcc aac gcc1008Ala Pro Ala Gly Ser Ala Arg Ala Lys Val Leu Leu Phe Ser Asn Ala325 330 335gcc agc cag acc tcg cgc agt cag ggc acc atc cgg atg tcc tgc gac1056Ala Ser Gln Thr Ser Arg Ser Gln Gly Thr Ile Arg Met Ser Cys Asp340 345 350gat ggc cag acc tgg ccg gtt tcg aag gtc ttc cag ccc ggc tcg atg1104Asp Gly Gln Thr Trp Pro Val Ser Lys Val Phe Gln Pro Gly Ser Met355 360 365tcg tac tcc acc ctg acc gca ctg ccc gac ggc acc tac ggg ctg ctg1152Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Thr Tyr Gly Leu Leu370 375 380tac gag ccg ggc acc ggc atc aga tac gcc aac ttc aac ctc gcc tgg1200Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ile Arg Tyr Ala Asn Phe Asn Leu Ala Trp385 390 395 400ctg ggc ggc atc tgc gcg ccc ttc acg att ccg gat gtg gcg ctc gag1248Leu Gly Gly Ile Cys Ala Pro Phe Thr Ile Pro Asp Val Ala Leu Glu405 410 415ccg ggc cag cag gtc act gtt ccg gtg gcc gtc acg aac cag tcc ggt1296Pro Gly Gln Gln Val Thr Val Pro Val Ala Val Thr Asn Gln Ser Gly420 425 430atc gcg gta ccg aag ccg agc ctt cag ctc gac gca tcg ccg gac tgg1344Ile Ala Val Pro Lys Pro Ser Leu Gln Leu Asp Ala Ser Pro Asp Trp435 440 445cag gtt cag ggt tcc gtc gag ccc ctc atg ccc gga cgg cag gcc aag1392Gln Val Gln Gly Ser Val Glu Pro Leu Met Pro Gly Arg Gln Ala Lys450 455 460ggc cag gtg acc atc acg gtt ccc gcc ggc acc acc ccc ggt cgc tac1440Gly Gln Val Thr Ile Thr Val Pro Ala Gly Thr Thr Pro Gly Arg Tyr
465 470 475 480cgg gtc ggt gcg acg ctg cgc acc tcc gcg ggt aac gcg tcg acg acc1488Arg Val Gly Ala Thr Leu Arg Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Thr Thr485 490 495ttc acg gtc acg gtt gga ctg ctc gac cag gcc cgg atg agc atc gcg1536Phe Thr Val Thr Val Gly Leu Leu Asp Gln Ala Arg Met Ser Ile Ala500 505 510gac gtc gac agc gag gag acc gcc cgc gaa gac ggg cgg gcg agc aac1584Asp Val Asp Ser Glu Glu Thr Ala Arg Glu Asp Gly Arg Ala Ser Asn515 520 525gtg atc gac ggc aac ccc tcg acg ttc tgg cac acc gaa tgg tcg cgt1632Val Ile Asp Gly Asn Pro Ser Thr Phe Trp His Thr Glu Trp Ser Arg530 535 540gcc gat gct cct ggc tac ccg cac cgc atc agc ctc gac ctc ggt ggc1680Ala Asp Ala Pro Gly Tyr Pro His Arg Ile Ser Leu Asp Leu Gly Gly545 550 555 560acg cac acg atc agc ggc ctc cag tac acc cga cgg cag aac agc gcc1728Thr His Thr Ile Ser Gly Leu Gln Tyr Thr Arg Arg Gln Asn Ser Ala565 570 575aac gag cag gtc gcg gac tac gag atc tac acc agc ctg aac ggc acg1776Asn Glu Gln Val Ala Asp Tyr Glu Ile Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr580 585 590acc tgg gat ggc ccg gtt gcc agc ggg cgc ttc acc acg tcc ctc gcg1824Thr Trp Asp Gly Pro Val Ala Ser Gly Arg Phe Thr Thr Ser Leu Ala595 600 605ccg cag cgc gcg gtc ttc ccg gcg cgg gac gcc agg tac atc cgg ttg1872Pro Gln Arg Ala Val Phe Pro Ala Arg Asp Ala Arg Tyr Ile Arg Leu610 615 620gtg gcc ctc agc gag cag acc ggg cac aag tac gcc gcg gtc gct gag1920Val Ala Leu Ser Glu Gln Thr Gly His Lys Tyr Ala Ala Val Ala Glu625 630 635 640ctg gag gtg gaa ggc cag cgc1941Leu Glu Val Glu Gly Gln Arg645<210>2<211>647
<212>PRT<213>綠色小單孢菌(Micromonospora viridifaciens)<400>2Met Thr Ala Asn Pro Tyr Leu Arg Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ala Val1 5 10 15Ser Phe Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Gly Ala20 25 30Ser Pro Ala Gln Ala Ile Ala Gly Ala Pro Val Pro Pro Gly Gly Glu35 40 45Pro Leu Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Ala Val Asn Gly Arg Glu Gly Phe50 55 60Pro Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Val Thr Pro Asp Gly Asp Leu65 70 75 80Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Arg Pro Thr Gly Ile Asp Ala Pro Gly Pro85 90 95Asn Ser Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr Trp Gly100 105 110Glu Gln Gln Val Val Ser Ala Gly Gln Thr Thr Ala Pro Ile Lys Gly115 120 125Phe Ser Asp Pro Ser Tyr Leu Val Asp Arg Glu Thr Gly Thr Ile Phe130 135 140Asn Phe His Val Tyr Ser Gln Arg Gln Gly Phe Ala Gly Ser Arg Pro145 150 155 160Gly Thr Asp Pro Ala Asp Pro Asn Val Leu His Ala Asn Val Ala Thr165 170 175
Ser Thr Asp Gly Gly Leu Thr Trp Ser His Arg Thr Ile Thr Ala Asp180 185 190Ile Thr Pro Asp Pro Gly Trp Arg Ser Arg Phe Ala Ala Ser Gly Glu195 200 205Gly Ile Gln Leu Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Ile Gln Gln210 215 220Tyr Thr Ile Ile Asn Ala Ala Gly Ala Phe Gln Ala Val Ser Val Tyr225 230 235 240Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Ala Gly Glu Ala Val Gly Val245 250 255Gly Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg Val Leu260 265 270Leu Asn Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Lys Val Ala Val275 280 285Ser Thr Asp Gly Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Thr Ile Asp Arg Asp290 295 300Leu Pro Asp Pro Thr Asn Asn Ala Ser Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asp305 310 315 320Ala Pro Ala Gly Ser Ala Arg Ala Lys Val Leu Leu Phe Ser Asn Ala325 330 335Ala Ser Gln Thr Ser Arg Ser Gln Gly Thr Ile Arg Met Ser Cys Asp340 345 350Asp Gly Gln Thr Trp Pro Val Ser Lys Val Phe Gln Pro Gly Ser Met355 360 365Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Thr Tyr Gly Leu Leu
370 375 380Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ile Arg Tyr Ala Asn Phe Asn Leu Ala Trp385 390 395 400Leu Gly Gly Ile Cys Ala Pro Phe Thr Ile Pro Asp Val Ala Leu Glu405 410 415Pro Gly Gln Gln Val Thr Val Pro Val Ala Val Thr Asn Gln Ser Gly420 425 430Ile Ala Val Pro Lys Pro Ser Leu Gln Leu Asp Ala Ser Pro Asp Trp435 440 445Gln Val Gln Gly Ser Val Glu Pro Leu Met Pro Gly Arg Gln Ala Lys450 455 460Gly Gln Val Thr Ile Thr Val Pro Ala Gly Thr Thr Pro Gly Arg Tyr465 470 475 480Arg Val Gly Ala Thr Leu Arg Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Thr Thr485 490 495Phe Thr Val Thr Val Gly Leu Leu Asp Gln Ala Arg Met Ser Ile Ala500 505 510Asp Val Asp Ser Glu Glu Thr Ala Arg Glu Asp Gly Arg Ala Ser Asn515 520 525Val Ile Asp Gly Asn Pro Ser Thr Phe Trp His Thr Glu Trp Ser Arg530 535 540Ala Asp Ala Pro Gly Tyr Pro His Arg Ile Ser Leu Asp Leu Gly Gly545 550 555 560Thr His Thr Ile Ser Gly Leu Gln Tyr Thr Arg Arg Gln Asn Ser Ala565 570 575
Asn Glu Gln Val Ala Asp Tyr Glu Ile Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr580 585 590Thr Trp Asp Gly Pro Val Ala Ser Gly Arg Phe Thr Thr Ser Leu Ala595 600 605Pro Gln Arg Ala Val Phe Pro Ala Arg Asp Ala Arg Tyr Ile Arg Leu610 615 620Val Ala Leu Ser Glu Gln Thr Gly His Lys Tyr Ala Ala Val Ala Glu625 630 635 640Leu Glu Val Glu Gly Gln Arg64權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生含有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白的病毒載體的方法，所述方法包括在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶存在的情況下，培養(yǎng)能產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，并回收產(chǎn)生的病毒的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述革蘭氏陽(yáng)性菌是放線菌。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述放線菌屬于小單孢菌科。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述屬于小單孢菌科的放線菌是綠色小單孢菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述與唾液酸結(jié)合的膜蛋白是單鏈負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述單鏈負(fù)鏈RNA病毒是屬于副粘病毒科或正粘病毒科的病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述與唾液酸結(jié)合的膜蛋白是流感病毒HA蛋白。
10.一種使用根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供使用衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的唾液酸苷酶(NA)，產(chǎn)生含有與唾液酸結(jié)合的膜蛋白作為包膜成分的病毒載體的方法。該方法包括在衍生自革蘭氏陽(yáng)性菌的NA存在的情況下培養(yǎng)能產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞，并回收產(chǎn)生的病毒的步驟。本發(fā)明的方法能以高的性價(jià)比產(chǎn)生滴度高的病毒。這種病毒載體能高效地將基因?qū)胗矛F(xiàn)有方法不易導(dǎo)入基因的細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞和造血細(xì)胞以及包括粘膜上皮細(xì)胞在內(nèi)的含有粘液的細(xì)胞，并因此可用做基因療法中的載體。
文檔編號(hào)C12N15/867GK1694956SQ03824920
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者小林雅典, 上田泰次, 長(zhǎng)谷川護(hù) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所