專利名稱：熒光酶分析方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測或表征酶的熒光組合物和方法及其各種用途。
背景技術(shù)：
對于研究和檢測用于生物和工業(yè)應(yīng)用的酶而言，酶分析是重要的工具。在活的生物體內(nèi)，酶進行著多種工作，例如核酸的合成和復(fù)制、多肽的修飾和降解、代謝物的合成、以及許多其它功能。在工業(yè)中酶也被用于許多用途，例如在洗衣用洗滌劑中的所用的蛋白酶、用來制備特制(specialty)化學品例如氨基酸和維生素的代謝酶，和制備對映體上純的藥物的手性特殊酶。在醫(yī)學檢測中，酶是人類患者健康或疾病的重要指示劑。
雖然已發(fā)展出用來分析酶的眾多方法，仍然存在很大的需求，以發(fā)現(xiàn)能被用來便宜而方便地檢測和表征多種多樣的酶的新分析設(shè)計。例如，蛋白激酶構(gòu)成介導(dǎo)大量基本細胞過程的一大類酶。新近得到幾乎完整的人類基因組序列使得鑒定許多蛋白激酶候選物成為可能，這些蛋白激酶候選物將需要多年的研究，以揭示它們的各種代謝作用(參見例如J.C.Venter等，Science2911304-1351(2001))。借助于適合高處理量篩選的新分析方法，這樣的研究可被大大促進。然而，目前已有的分析操作不方便、昂貴，或是有其它缺陷。
發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供在樣本中檢測一個或更多蛋白激酶的磷酸化活性的方法。該方法提供了包含樣本和至少一個激酶底物的混合物，其中所述激酶底物包含(a)一個蛋白激酶識別部分，該部分包含至少一個能被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化殘基，(b)一個疏水部分，和(c)一個熒光部分。將混合物置于當在樣本中存在蛋白激酶時足以使非磷酸化的殘基磷酸化的條件下，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號。檢測到熒光信號的增大指示樣本中存在蛋白激酶。
所要檢測的蛋白激酶可以是本領(lǐng)域已知的任何蛋白激酶。例如，在一個實施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶A。在另一個實施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶C。在另一個實施方式中，蛋白激酶是蛋白激酶候選物，并且該方法被用來證實和/或表征候選物的激酶活性。
可對蛋白激酶底物進行設(shè)計，使其對特殊的蛋白激酶或一組蛋白激酶具有反應(yīng)性，或?qū)ζ溥M行設(shè)計，以測定底物特異性和/或其它催化特征，例如測定kcat或Km值。蛋白激酶識別部分中的非磷酸化殘基可以是能夠被蛋白激酶磷酸化的任何基團。在一個實施方式中，例如，殘基是酪氨酸殘基。在另一個實施方式中，殘基是絲氨酸殘基。在另一個實施方式中，殘基是蘇氨酸殘基。
除了具有一個或更多能夠被磷酸化的非磷酸化殘基之外，識別部分可包括促進結(jié)合特異性、親和力和/或加快被待檢測蛋白激酶磷酸化的速率的額外氨基酸殘基(或其類似物)。在有些實施方式中，識別部分包含至少3、4、5、6或7個氨基酸殘基。
底物的疏水部分能夠?qū)⒌孜镎先胛F(micelle)。在一個實施方式中，疏水部分包含一個烴部分，該烴部分包含6到30個飽和碳原子。其它實施方式在下面進一步進行討論。優(yōu)選選擇在底物磷酸化后促進熒光部分的熒光增強的疏水部分，使得增強幅度比用缺乏疏水部分的相同底物結(jié)構(gòu)所獲得的要大。
底物可被設(shè)計成在非磷酸化狀態(tài)下具有特定的凈電荷。在一個實施方式中，當在pH 8下測量時，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0、或大約為0，使得添加一個磷酸根(phosphate)基團生成凈電荷為負2的產(chǎn)物。在另一個實施方式中，底物具有的凈電荷不為0，例如-1、-2或+1。在一個實施方式中，底物的凈電荷是0或更少。在另一個實施方8式中，凈電荷是-1或更少。
熒光部分可以是根據(jù)本發(fā)明可進行操作的任何熒光實體。在一個實施方式中，熒光部分包含熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含磺基熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含羅丹明。也可使用其它熒光部分。
將蛋白激酶識別部分、疏水部分和熒光部分以任何允許它們行使各自功能的方式連接。在一個實施方式中，疏水部分和熒光部分通過蛋白激酶識別部分彼此連接。例如，可將疏水部分和熒光部分連接于包含識別部分的底物部分的相對末端。在另一實施方式中，疏水部分和識別部分通過熒光部分彼此連接。在另一實施方式中，一個三價接頭連接疏水部分、熒光部分和識別部分。
混合物可包括單一激酶底物，或其可包括多種不同激酶底物。當混合物包含多種不同激酶底物時，底物可在它們的蛋白激酶識別部分、疏水部分和/或熒光部分中的任一或更多個方面彼此不同。一個具體例子為，混合物可包括兩個激酶底物，該兩個激酶底物至少在它們的熒光部分上彼此不同。在一個實施方式中，可選擇不同熒光部分，使得它們的熒光光譜彼此可分辨。例如，可選擇第一激酶底物上的熒光部分在光譜的綠色區(qū)域發(fā)熒光，并且可選擇第二激酶底物上的熒光部分在光譜的紅色區(qū)域發(fā)熒光。在此實施方式中，當對不同激酶或激酶家族特異的底物與特定的熒光信號相關(guān)時，激酶底物也可在它們的激酶識別部分的特異性上彼此不同，使其能以“復(fù)合”(multiplexed)方式實施所述方法。當使用帶有這樣的光譜上可分辨的熒光部分的激酶底物時，可選擇具有不同吸收或激發(fā)光譜或最大值的熒光部分，或可選擇具有類似的吸收或激發(fā)光譜或最大值的全部或一個亞群(subset)，從而使得它們可用單一激發(fā)源同時激發(fā)。
當使用多種不同激酶底物時，雖然對于操作不是必需的，仍可選擇一個或更多底物上的熒光部分，從而當這些部分彼此非常接近時，它們會淬滅一個或更多其它底物上的熒光部分的熒光，例如通過碰撞淬滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、或通過另一機制(或機制的組合)。具體例子為，可選擇第一激酶底物的熒光部分，使其所具有的吸收光譜與第二激酶底物的熒光部分的發(fā)射光譜充分重疊，從而第一熒光部分在與第二熒光部分十分接近，例如當兩種激酶底物被整合入同一微團時，會基本上淬滅第二熒光部分的熒光。另一個具體例子為，可選擇兩個(或更多個)不同激酶底物的熒光部分，使得它們在十分接近時會淬滅彼此的熒光。
雖然對于操作不是必需的，混合物可任選包括一或更多個兩親性淬滅分子，當激酶底物和淬滅分子彼此十分接近，例如當激酶底物和淬滅分子被整合入同一微團時，該兩親性淬滅分子能夠淬滅激酶底物的熒光部分的熒光。這樣的淬滅分子通常包含一個能夠?qū)⒋銣绶肿诱先胛F的疏水部分和一個淬滅部分。疏水部分的具體實施方式
可包括與激酶底物一起討論的疏水部分中的任何一個。
淬滅部分可以是能夠淬滅激酶底物的熒光部分的熒光的任何部分。在有些實施方式中，淬滅部分自身可以是一個熒光部分，該部分在非常接近處能，例如通過碰撞淬滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或通過其它機制(或機制的組合)來淬滅激酶底物的熒光部分的熒光。一個具體例子為，淬滅部分可以是一個熒光部分，該部分所具有的吸收光譜與激酶底物的熒光部分的發(fā)射光譜充分重疊，使得當淬滅部分和激酶底物的熒光部分彼此十分接近時，例如當淬滅分子和激酶底物被整合入同一微團時，淬滅部分會基本上淬滅激酶底物的熒光部分的熒光。在另一個實施方式中，淬滅部分是無熒光的(non-fluorescent)。淬滅分子可任選包括蛋白激酶識別部分。
在另一方面，本發(fā)明提供在樣本中檢測一個或更多蛋白磷酸酶的磷酸酶活性的方法。在所述方法中，提供包含樣本和至少一個磷酸酶底物的混合物，其中磷酸酶底物包含(a)一個磷酸酶識別部分，該部分包含至少一個能夠被磷酸酶脫磷酸化(水解)的磷酸化殘基，(b)一個疏水部分，和(c)一個熒光部分?；旌衔锉恢糜谠跇颖局写嬖诹姿崦笗r有效使得磷酸化的殘基脫磷酸的條件下，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號。在混合物中檢測到熒光信號的增大指示樣本中存在磷酸酶。
所要檢測的磷酸酶可以是本領(lǐng)域已知的任何磷酸酶。此外，磷酸酶可以是磷酸酶候選物，并且該方法被用來證實和/或表征候選物的磷酸酶活性。
可對磷酸酶底物進行設(shè)計，使其對特殊的磷酸酶或一組磷酸酶具有反應(yīng)性，或?qū)ζ溥M行設(shè)計，以測定底物特異性和其它催化特征，例如測定kcat或Km值。磷酸酶識別部分中的磷酸化殘基可以是能夠被磷酸酶脫磷酸化的任何基團。在一個實施方式中，例如，殘基是磷酸酪氨酸殘基。在另一個實施方式中，殘基是磷酸絲氨酸殘基。在還有另一個實施方式中，殘基是磷酸蘇氨酸殘基。
除了具有一個或更多能夠被脫磷酸化的磷酸化殘基之外，識別部分可包括促進結(jié)合特異性、親和力和/或加快被磷酸酶脫磷酸化的速率的額外的氨基酸殘基(或其類似物)。在有些實施方式中，識別部分包含至少3、4、5、6或7個氨基酸殘基。
底物的疏水部分能夠?qū)⒌孜镎先胛F。在一個實施方式中，疏水部分包含一個烴部分，該烴部分包含6到30個飽和碳原子。其它實施方式在下面進一步進行討論。優(yōu)選選擇在底物磷酸化后促進熒光部分的熒光增強的疏水部分，使得增強幅度比用缺乏疏水部分的相同底物結(jié)構(gòu)所獲得的要大。
底物可被設(shè)計成在磷酸化狀態(tài)下具有特定的凈電荷。在一個實施方式中，當在pH 8下測量時，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0、或大約為0，使得除去一個磷酸根基團會生成凈電荷為+2的產(chǎn)物。在其它實施方式中，底物具有不為0的凈電荷，例如+1、+2或-1。在一個實施方式中，底物的凈電荷是0或更多。在另一個實施方式中，凈電荷是+1或更多。
磷酸酶底物的熒光部分可以是根據(jù)本發(fā)明可進行操作的任何熒光實體。在一個實施方式中，熒光部分包含熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含磺基熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含羅丹明。也可使用其它熒光部分。
將磷酸酶識別部分、疏水部分和熒光部分以任何允許它們行使它們各自的功能的方式連接，連接方式類似于上面對蛋白激酶底物所討論的設(shè)計構(gòu)想。
混合物可包括單一磷酸酶底物，或其可包括多種不同磷酸酶底物。當混合物包括多種不同磷酸酶底物時，底物可在它們的磷酸酶識別部分、疏水部分和/或熒光部分中的任一或更多方面彼此不同。一個具體例子為，混合物可包括兩個磷酸酶底物，該兩個磷酸酶底物至少在它們的熒光部分上彼此不同。在一個實施方式中，可選擇熒光光譜彼此可分辨的不同熒光部分。例如，可選擇第一磷酸酶底物上的熒光部分在光譜的綠色區(qū)域發(fā)熒光，并且可選擇第二磷酸酶底物上的熒光部分在光譜的紅色區(qū)域發(fā)熒光。在此實施方式中，當對不同磷酸酶或磷酸酶家族特異的底物與特定的熒光信號相關(guān)時，磷酸酶底物也可在它們的磷酸酶識別部分的特異性上彼此不同，使其能以“復(fù)合”方式實施所述方法。當使用帶有這樣的光譜上可分辨的熒光部分的磷酸酶底物時，可選擇具有不同吸收或激發(fā)光譜或最大值的熒光部分，或可選擇具有類似的吸收或激發(fā)光譜或最大值的全部或一個亞群，從而使得它們可用單一激發(fā)源同時激發(fā)。
當使用多種不同磷酸酶底物時，雖然對于操作不是必需的，仍可選擇一或更多個底物上的熒光部分，從而當這些部分彼此非常接近時，它們能，例如通過碰撞淬滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、或通過其它機制(或機制的組合)來淬滅一個或更多其它底物上的熒光部分的熒光。一個具體例子為，可選擇第一激酶底物的熒光部分，使其所具有的吸收光譜與第二磷酸酶底物的熒光部分的發(fā)射光譜充分重疊，從而第一熒光部分在與第二熒光部分十分接近，例如當兩種磷酸酶底物被整合入同一微團時，會基本上淬滅第二熒光部分的熒光。作為另一個具體例子，可選擇兩個(或更多個)不同磷酸酶底物的熒光部分，使它們在十分接近時會淬滅彼此的熒光。
雖然對于操作不是必需的，混合物可以選擇性地包括一個或更多兩親性淬滅分子，當磷酸酶底物和淬滅分子彼此十分接近，例如當磷酸酶底物和淬滅分子被整合入同一微團時，該兩親性淬滅分子能夠淬滅磷酸酶底物的熒光部分的熒光。這樣的淬滅分子通常包含一個能夠?qū)⒋銣绶肿诱先胛F的疏水部分和一個淬滅部分。疏水部分的具體實施方式
可包括與磷酸酶底物一起討論的疏水部分中的任何一個。
淬滅部分可以是能夠淬滅磷酸酶底物的熒光部分的熒光的任何部分。在有些實施方式中，淬滅部分可本身是一個熒光部分，該部分在非常接近處能，例如通過碰撞淬滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或通過另一機制(或機制的組合)來淬滅磷酸酶底物的熒光部分的熒光。一個具體例子為，淬滅部分可以是一個熒光部分，其所具有的吸收光譜與磷酸酶底物的熒光部分的發(fā)射光譜充分重疊，從而當淬滅部分和磷酸酶底物的熒光部分彼此十分接近時，例如當淬滅分子和磷酸酶底物被整合入同一微團時，淬滅部分會基本上淬滅磷酸酶底物的熒光部分的熒光。在其它實施方式中，淬滅部分是非熒光的。淬滅分子可以選擇性地包括磷酸酶識別部分。
在一個更廣泛的方面，本發(fā)明提供檢測或測量酶活性的方法。在所述方法中，提供包含樣本和所述酶的一個底物的混合物。底物包含(a)一個酶識別部分，該部分包含能夠被所述酶以改變底物凈電荷的方式加以修飾的化學反應(yīng)位點，(b)一個疏水部分，和(c)一個熒光部分?；旌衔锉恢糜谟行沟盟雒笇λ龌瘜W反應(yīng)位點進行修飾，以產(chǎn)生熒光上可檢測的產(chǎn)物的條件下，所述熒光上可檢測的產(chǎn)物包含修飾的酶識別部分、疏水部分和熒光部分，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號。檢測到熒光信號的增大指示樣本中磷酸酶的存在。
在一個實施方式中，所述酶是蛋白激酶。在另一個實施方式中，所述酶是蛋白磷酸酶。
在一個實施方式中，酶識別部分包含一個多肽片段，該片段包含在分析過程中被所述酶加以化學改變的基團，以導(dǎo)致熒光信號的增大。在一些實施方式中，識別部分包含至少3、4、5、6或7個氨基酸殘基。
底物的疏水部分能夠?qū)⒌孜镎先胛F。在一個實施方式中，疏水部分包含一個烴部分，該烴部分包含6到30個飽和碳原子。其它實施方式在下面進一步進行討論。優(yōu)選選擇在底物磷酸化后促進熒光部分的熒光增強的疏水部分，使得增強幅度比用缺乏疏水部分的相同底物結(jié)構(gòu)所獲得的要大。
底物可被設(shè)計成在與酶反應(yīng)前具有特定的凈電荷。在一個實施方式中，當在pH 8下測量時，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0、或大約為0。在其它實施方式中，底物具有不為0的凈電荷，例如-1、-2或+1或+2。在一個實施方式中，底物的凈電荷是0或更少。在另一個實施方式中，凈電荷是-1或更少。在其它實施方式中，底物的凈電荷是0或更多，或+l或更多。
在一個實施方式中，酶與底物反應(yīng)，以加上或除去一個導(dǎo)致底物電荷改變的基團。例如，底物與酶的反應(yīng)可導(dǎo)致底物凈電荷幅度的增高，使得產(chǎn)物與底物相比具有較多負電荷或較多正電荷。
熒光部分可以是根據(jù)本發(fā)明可進行操作的任何熒光實體。在一個實施方式中，熒光部分包含熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含磺基熒光素。在另一個實施方式中，熒光部分包含羅丹明。也可使用其它熒光部分。
將酶識別部分、疏水部分和熒光部分以任何允許它們行使它們各自的功能的方式連接。在一個實施方式中，疏水部分和熒光部分通過酶識別部分彼此連接。例如，疏水部分和熒光部分可被連接于包含識別部分的底物部分的相對末端。在另一實施方式中，疏水部分和識別部分通過熒光部分彼此連接。在另一實施方式中，通過一個三價接頭連接疏水部分、熒光部分和識別部分。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，酶作用足以形成一種在反應(yīng)混合物中比底物更具熒光的產(chǎn)物，使得酶識別部分、疏水部分和熒光部分保留在產(chǎn)物中(沒有從產(chǎn)物上切割下來)。
混合物可包括單一的酶底物或多種酶底物，其方式可以與上面與激酶底物和磷酸酶底物一起描述的方式類似。如上面所討論的，混合物可還包括一個或更多淬滅分子。
本文將進一步討論本發(fā)明可包括熒光底物和組合物和包含它們的試劑盒。
本文將進一步討論本發(fā)明的方法和組合物還可被用于檢測、篩選和/或表征酶活性的底物、抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑(modulator)。
從詳細說明中本發(fā)明的這些和其它特征在此將變得更加明白。
附圖簡述

圖1顯示在存在不同濃度(0.15μM，0.3μM，和0.6μM)的本發(fā)明熒光蛋白激酶底物時，蛋白激酶A的動力學數(shù)據(jù)(熒光對時間)。
圖2顯示用來自圖1的數(shù)據(jù)生成的雙倒數(shù)作圖(1/V作為1/S的函數(shù)進行作圖)。
圖3顯示在存在本發(fā)明的熒光磷酸酶底物時磷酸酶的動力學數(shù)據(jù)(熒光對時間)。
圖4顯示在不存在(最低痕量(lowest trace))或存在抑制劑星形孢菌素(5mM，中等痕量)或PKA特異性抑制劑TYADFIASGRTGRRNAI(20nM，最高痕量)時、在幾種濃度的ATP(50、10、3和2μM)下，以雙倒數(shù)作圖(1/V作為1/S的函數(shù)進行作圖)的形式得到的蛋白激酶A的動力學數(shù)據(jù)。
圖5顯示在不同濃度的抑制劑星形孢菌素存在下(痕跡A0nM，B2nM，C5nM，和D10nM)，蛋白激酶C-βII與PKC-βII底物(化合物8)反應(yīng)的熒光時間圖。獲得最低痕量(E)作為無酶對照。
圖6顯示pp60c-src-相關(guān)蛋白酪氨酸激酶與熒光底物(化合物9)反應(yīng)的熒光時間作圖(一式三份)。也進行了在無酶情況下的兩個對照反應(yīng)(底部的兩條痕跡)。
圖7A顯示在ATP＝10μM時以30秒讀數(shù)間隔得到的PKC的原始動力學數(shù)據(jù)。
圖7B顯示在ATP＝10μM時PKC的起始速率(velocity)數(shù)據(jù)。系列1至10代表0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100nM星形孢菌素濃度。以相同方式排列線性方程式。
圖8A顯示在ATP＝50μM時以30秒讀數(shù)間隔得到的PKC的原始動力學數(shù)據(jù)。
圖8B顯示在ATP＝50μM時PKC的起始速率數(shù)據(jù)。系列1至10代表0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100nM星形孢菌素濃度。以相同方式排列線性方程式。
圖9顯示在ATP＝10、50、100和200μM時PKC的IC50。
圖10顯示在ATP＝10、50、100和200μM時PKC的IC50。

發(fā)明內(nèi)容
定義除非另外說明，本文所使用的如下術(shù)語和用語旨在具有如下意義“檢測(detect)”和“測定(detection)”具有其標準的意義，旨在包含選定的酶或酶活性的檢測、測量和表征。例如，酶活性可以在檢測、篩選、或表征酶活性的抑制劑、激活劑和調(diào)節(jié)劑的過程中被“檢測”。
“微團”具有其標準意義，旨在指水中或水環(huán)境中兩親性分子所形成的聚集體，使得它們的極性末端或部分與水或水環(huán)境接觸，并且它們的非極性末端或部分在聚集體內(nèi)部。微團可采取任何形狀或形式，包括但不限于，不包圍(enclose)一部分水或水環(huán)境的非層狀聚集體，或包圍一部分水或水環(huán)境的單層或多層泡樣聚集體，例如脂質(zhì)體。
“淬滅”具有其標準意義，并且在熒光信號的上下文中，旨在指在一特定檢測波長下，熒光強度的可測量的降低或減少，而不管其發(fā)生的機制為何。通過不帶有限制作用的舉例說明，當一個熒光信號在一個特殊檢測波長下其強度被降低25％、50％、75％、80％、90％、95％或甚至更多時，熒光信號被淬滅。
多肽序列以N末端到C末端的定向(左到右)提供，其中氨基酸殘基用標準3個字母或1個字母代碼(例如Strver.L.，Biochemistry.第二版，W.H.Freeman and Co.，San Francisco，CA，第16頁(1981))代表。
酶底物組合物本發(fā)明提供酶底物，該底物可被設(shè)計為用來檢測各種各樣不同酶中的任何酶。底物包含能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分。底物還包含熒光部分，在與目的酶反應(yīng)后該熒光部分的熒光增大，而無需淬滅基團在底物與酶反應(yīng)前抑制熒光部分的熒光。有利地，本發(fā)明的底物能夠在連續(xù)監(jiān)測狀態(tài)下被實時使用，使得用戶能迅速確定樣本中是否有酶活性存在，并且任選地，確定酶的量或特異活性。
通過例證的方式，下面根據(jù)蛋白激酶、將其作為將要被檢測的例證性酶而對本發(fā)明進行討論。除了發(fā)揮重要的生化作用外，蛋白激酶也用于舉例說明使酶底物凈電荷增加的酶，這種增加是通過向羥基上添加磷酸根基團以形成磷酸化底物而實現(xiàn)的。在堿性條件下，底物的磷酸化導(dǎo)致添加兩個負電荷，電荷的凈變化為-2。也討論了實現(xiàn)相反反應(yīng)的酶，蛋白磷酸酶，該酶在堿性條件下導(dǎo)致+2的電荷凈增長。在任何一種情況下，酶底物上凈電荷的幅度是增加的。例如，在如上面所描述磷酸化酶底物之后，酶底物上的凈負電荷的幅度增加到-2。另一方面，在酶底物被磷酸酶去磷酸化之后，酶底物上的凈正電荷的幅度增加到+2。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測或表征樣本中一個或更多蛋白激酶的激酶底物。在化合物的一個示例性分類中，激酶底物至少包含(a)至少包含一個非磷酸化的殘基的蛋白激酶識別部分，該非磷酸化殘基能夠被蛋白激酶所磷酸化，(b)能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分，和(c)熒光部分。
蛋白激酶識別部分一般包括氨基酸側(cè)鏈，該氨基酸側(cè)鏈包含能夠被蛋白激酶磷酸化的基團。在一個實施方式中，可被磷酸化的基團是羥基。通常所提供的羥基為酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基的側(cè)鏈的一部分，但也可以使用任何其它天然或非天然氨基酸側(cè)鏈或其它包含可磷酸化的羥基基團的實體?？杀涣姿峄幕鶊F也可以是氮原子，例如賴氨酸ε氨基基團中的氮原子，組氨酸的咪唑氮原子，或精氨酸的胍基氮原子?？杀涣姿峄幕鶊F也可以是天冬氨酸或谷氨酸殘基中的羧基基團。
蛋白激酶識別部分還可包含一個片段，通常是多肽片段，該片段包含一個或更多亞單位或殘基(除了可被磷酸化的殘基)，該亞單位或殘基賦予底物鑒別特性，使底物與將被檢測或表征的蛋白激酶的底物特異性相適應(yīng)。
在過去幾十年中，已表征了各種各樣的蛋白激酶，并且鑒定出許多種類(參見，例如，S.K.Hanks等，Science24142-52(1988)；B.E.Kemp和R.B.Pearson，Trends Biochem.Sci.15342-346(1990)；S.S.Taylor等，Ann.Rev.Cell Biol.8429-462(1992)；Z.Songyang等，Current Biology4973-982(1994)；和Chem.Rev.1012209-2600，“Protein Phosphorylationand Signaling”(2001))。示例性的蛋白激酶種類包括cAMP依賴的蛋白激酶(也稱為蛋白激酶A家族，A-蛋白，或PKA)，cGMP依賴的蛋白激酶，蛋白激酶C酶(PKC，包括二?；视图せ畹拟}依賴的PKC)，Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶I或II，蛋白酪氨酸激酶(例如，PDGF受體，EGF受體，和Src)，有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶(例如，ERK1，KSS1，和MAP激酶I型)，依賴細胞周期蛋白的激酶(CDK，例如Cdk2和Cdc2)，以及受體絲氨酸激酶(例如TGF-β)。示例性的各種蛋白激酶的共有序列示于下面表1。這些各種共有序列可被用來設(shè)計蛋白激酶識別部分，該蛋白激酶識別部分具有對特定激酶和/或激酶家族的理想特異性。
也可以設(shè)計具有對特定激酶和/或激酶家族的理想特異性的蛋白激酶識別部分，例如使用在Brinkworth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(1)74-79(2003)中所描述的方法和/或示例性序列。

a參見，例如，B.E.Kemp和R.B.Pearson，Trends Biochem.Sci.15342-346(1990)；Z.Songyang等，Current Biology4973-982(1994)；J.A.Adams，Chem Rev.1012272(2001)以及其中所引用的參考文件；X指任何氨基酸殘基，“/”指示互換殘基；并且Z是疏水氨基酸，例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。
bGraff等，J.Biol.Chem.26614390-14398(1991)cLee等，Proc.Natl.Acad.Sci.916413-6417(1994)dStokoe等，Biochem.J.296843-849(1993)蛋白激酶識別序列通常包含L-氨基酸殘基的序列。然而，也可以使用各種具有不同骨架或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的氨基酸中的任何一個，例如D-氨基酸多肽、通過硫代酸酯或磺?；鶊F連接的烷基骨架部分、羥基酸酯(相當于用酯鍵替代酰胺鍵)、用氮代替α碳以形成氮雜類似物、由氨基甲酸酯基團連接的烷基骨架部分、聚乙烯亞胺(PEI)和氨基醛，其導(dǎo)致由仲胺組成的聚合物。更詳細的骨架列表包括N-取代的酰胺(-CON(R)-代替-CONH-鍵)、酯(-CO2-)、酮亞甲基(-COCH2-)、亞甲基氨基(-CH2NH-)、硫代酰胺(-CSNH-)、次膦酸鹽(-PO2RCH2-)、亞膦酰胺(phosphonamidate)和亞膦酰胺酯(-PO2RNH2)、逆肽(retropeptide)(-NHC(O)-)，反式烯(-CR＝CH-)、氟烯(例如-CF＝CH-)、二亞甲基(-CH2CH2-)、硫醚(例如-CH2SCH2-)、羥基乙烯(-CH(OH)CH2-)、亞甲基氧(-CH2O-)、四唑(-CN4-)、逆硫代酰胺(retrothioamide)(-NHC(S)-)、逆還原的(-NHCH2-)、亞磺酰氨基(-SO2NH-)、亞甲基亞磺酰氨基(-CHRSO2NH-)、逆氨磺酰(-NHS(O2)-)、和類肽(peptoid)(N-取代的甘氨酸)、以及帶有丙二酸鹽和/或偕-二氨基烷基亞單位的骨架，如M.D.Fletcher等，Chem.Rev.98763(1998)和其中所引用的參考文件所綜述。也可以使用類肽骨架(N-取代的甘氨酸)(例如H.Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32543(1993)；R.N.Zuckermann，Chemtracts-Macromol.Chem.480(1993)；和Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.899367(1992))。
識別部分可包含多肽片段，該多肽片段包含將被磷酸化的基團或殘基。在一個實施方式中，多肽片段具有的多肽長度等于或少于30個氨基酸殘基、25個殘基、20個殘基、15個殘基、10個殘基或5個殘基。在另一個實施方式中，多肽片段具有的多肽長度在3-30個殘基、或3-25個殘基、或3-20個殘基、或3-15個殘基、或3-10個殘基、或3-5個殘基、或5-30個殘基、或5-25個殘基、或5-20個殘基、或5-15個殘基、或5-10個殘基、或10-30個殘基、或10-25個殘基、或10-20個殘基、或10-15個殘基范圍內(nèi)。在另一實施方式中，多肽片段包含3-30個殘基、或3-25個殘基、或3-20個殘基、或3-15個殘基、或3-10個殘基、或3-5個殘基、或5-30個殘基、或5-25個殘基、或5-20個殘基、或5-15個殘基、或5-10個殘基、或10-30個殘基、或10-25個殘基、或10-20個殘基、或10-15個殘基。在另一實施方式中，多肽片段包含至少3、4、5、6或7個氨基酸殘基。
底物的疏水部分能夠在用來檢測酶的分析條件下將底物整合入微團。優(yōu)選選擇在底物磷酸化后促進熒光部分的熒光增強的疏水部分，使得增強幅度比用缺乏疏水部分的相同底物結(jié)構(gòu)所獲得的要大。
可改變疏水部分的精確長度、大小和/或組成以獲得所期望的結(jié)果。在一個實施方式中，疏水部分包含烴(由碳和氫原子組成)，所述烴包含6-30個碳原子、或6-25個碳原子、或6-20個碳原子、或6-15個碳原子、或8-30個碳原子、或8-25個碳原子、或8-20個碳原子、或8-15個碳原子、或12-30個碳原子、或12-25個碳原子、或12-20個碳原子。烴可以是線性、分枝或環(huán)狀的，或其任何組合。示例性的完全飽和的線性烴基團包括C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、C24和C26正-烷基(n-alkyl)鏈。此外，烴可包含環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。在一個實施方式中，疏水部分是完全飽和的。在另一個實施方式中，疏水部分可以包含一個或更多可以是順式或反式的碳-碳雙鍵，和/或一個或更多碳-碳三鍵。在有些情況下，疏水部分可以具有一個或更多芳基環(huán)或芳香基烷基，例如1或2個苯環(huán)。如在實施例3中對下面方案3中的化合物進行的舉例說明那樣，通過制備具有不同疏水部分的幾個底物化合物，可以進行最優(yōu)化測試。
在另一實施方式中，疏水部分是不具有環(huán)狀芳族π電子系統(tǒng)的非芳族部分。在另一實施方式中，如果疏水部分包含一個或更多不飽和的碳-碳鍵，那些碳-碳鍵不是共軛的。在另一實施方式中，疏水部分的結(jié)構(gòu)不能通過FRET或堆集(stacking)相互作用與熒光部分相互作用，來淬滅熒光部分的熒光。本發(fā)明還包含涉及前述實施方式中任何兩個或更多個的組合的實施方式。
對于其中疏水部分與熒光部分相連接的實施方式，應(yīng)該理解為疏水部分與熒光部分截然不同，因為疏水部分不包括熒光部分中的任何原子，該熒光部分是產(chǎn)生熒光信號的芳族或共軛π電子系統(tǒng)的部分。因此，如果疏水部分與呫噸環(huán)的4位連接，疏水部分不包括呫噸環(huán)的任何芳族環(huán)原子。
雖然熒光增大的基本原理還不能肯定，預(yù)期本發(fā)明的熒光底物由于疏水部分的存在能夠在反應(yīng)混合物中形成微團，使得熒光部分由于它們非常接近和高局部濃度而彼此淬滅。光散射的增加和/或熒光部分最大吸光度的位移可以作為微團形成的證據(jù)。在為支持本發(fā)明所進行的實驗中，已發(fā)現(xiàn)包含疏水部分在有些情形下導(dǎo)致熒光部分的最大吸光度的大幅度紅移(大約20nm)。然而，有可能由底物實際形成微團對于本發(fā)明的可操作性不是必需的。
底物中的熒光部分可以是提供熒光信號的任何實體，所述熒光信號可以被用來追蹤酶介導(dǎo)的磷酸化。通常熒光部分包含熒光染料，該熒光染料繼而包含對吸收事件作出響應(yīng)而在第一波長吸收光和在第二波長發(fā)射光的共振離域系統(tǒng)或芳香環(huán)系統(tǒng)。本領(lǐng)域已知多種多樣的這種熒光染料分子。例如，熒光染料可選自各種各樣種類的熒光化合物中的任何一種，例如呫噸、羅丹明、熒光素、花青、酞菁(phthalocyanine)、方酸(squaraine)和bodipy染料。
在一個實施方式中，染料包含呫噸類型的染料，該染料包含如下形式的融合三環(huán)系統(tǒng) 此呫噸母環(huán)可以是非取代的(即所有的取代基是H)，或者可以是用例如下面描述的各種相同或不同取代基中的一個或更多取代。
在一個實施方式中，染料包含具有如下一般結(jié)構(gòu)的呫噸母環(huán) 在上面所描述的呫噸母環(huán)中，A1是OH或NH2，A2是O或NH2+。當A1是OH并且A2是O時，呫噸母環(huán)是熒光素型呫噸環(huán)。當A1是NH2并且A2是NH2+時，呫噸母環(huán)是羅丹明型呫噸環(huán)。當A1是NH2并且A2是O時，呫噸母環(huán)是對甲氨基酚類型呫噸環(huán)。在上面所描述的呫噸母環(huán)中，A1和A2的一個或兩個氮(當存在時)和/或位置C1、C2、C4、C5、C7、C8和C9的碳原子中的一個或更多可用各種相同或不同取代基獨立取代。在一個實施方式中，典型的取代包括，但不限于，-X，-R，-OR，-SR，-NRR，全鹵(C1-C6)烷基，-CX3，-CF3，-CN，-OCN，-SCN，-NCO，-NCS，-NO，-NO2，-N3，-S(O)2O-，-S(O)2OH，-S(O)2R，-C(O)R，-C(O)X，-C(S)R-，-C(S)X，-C(O)OR，-C(O)O-，-C(S)OR，-C(O)SR，-C(S)SR，-C(O)NRR，-C(S)NRR和-C(NR)NRR，其中每一X獨立地是鹵素(優(yōu)選-F或Cl)，并且每一R獨立地是氫、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基(alkanyl)、(C1-C6)鏈烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)芳香烷基、(C5-C20)芳香芳基、雜芳基、6-26元雜芳香烷基、5-20元雜芳-雜芳基、羧基、?；?、磺酰基、亞磺酰基、砜、磷酸鹽或膦酸鹽。此外，C1和C2取代基和/或C7和C8取代基可以被加在一起形成取代或非取代的丁[1，3]二烯并(dieno)橋或(C5-C20)亞芳并(aryleno)橋。一般地，優(yōu)選不傾向于淬滅呫噸母環(huán)的熒光的取代基，但在有些實施方式中可能需要淬滅取代基。傾向于淬滅呫噸母環(huán)的熒光的取代基是吸電子基團，例如-NO2、-Br和-I。在一個實施方式中，C9是非取代的。在另一個實施方式中，C9是用苯基取代的。在另一個實施方式中，C9是用苯基之外的取代基取代的。
當A1是NH2和/或A2是NH2+時，這些氮可以被包括在涉及相同氮原子或相鄰碳原子的一個或更多橋中，例如(C1-C12)亞烷基(alkyldiyl)、(C1-C12)亞烷基并(alkyleneo)橋、2-12元雜亞烷基(heteroalkyldiyl)和/或2-12元雜亞烷基并橋。
碳C1、C2、C4、C5、C7、C8、C9上的取代基中的任何一個和/或C3和/或C6上的氮原子(當存在時)可用相同或不同取代基中的一個或更多進一步取代。典型的取代包括，但不限于，-X，-R’，-OR’，-SR’，-NR’R’，-CX3，-CN，-OCN，-SCN，-NCO，-NCS，-NO，-NO2，-N3，-NHOH，-S(O)2O-，-S(O)2OH，-S(O)2R’，-P(O)(O-)2，-P(O)(OH)2，-C(O)R’，-C(O)X，-C(S)R’，-C(S)X，-C(O)OR’，-C(O)O-，-C(S)OR’，-C(O)SR’，-C(S)SR’，-C(O)NR’R’，-C(S)NR’R’和-C(NR)NR’R’，其中每個X獨立地是鹵素(優(yōu)選-F或-Cl)，并且每個R’獨立地是氫、(C1-C6)烷基、2-6元雜烷基、(C5-C14)芳基或雜芳基、羧基、?；?、磺酰基、亞磺?；?、砜、磷酸鹽或膦酸鹽。
示例性的呫噸母環(huán)包括，但不限于，羅丹明型的呫噸母環(huán)和熒光素型呫噸母環(huán)。
在一個實施方式中，染料包含羅丹明型呫噸染料，該呫噸染料包括如下環(huán)系統(tǒng) 在上面所描述的羅丹明型呫噸環(huán)中，如例如上面對呫噸母環(huán)所做的描述那樣，一個或兩個氮和/或位置C1、C2、C4、C5、C7或C8上的碳中的一個或更多可用各種各樣相同或不同取代基獨立取代。C9可以用氫或其它取代基取代，例如鄰羧基苯基或鄰(磺酸)苯基基團。示例性的羅丹明型呫噸染料包括，但不限于，在美國專利5,936,087、5,750,409、5,366,860、5,231,191、5,840,999、5,847,162和6,080,852(Lee等)、PCT公開WO 97/36960和WO99/27020，Sauer等，J.Fluorescence 5(3)247-261(1995)，Arden-Jacob，NeueLanwellige Xanthen-Farbstoffe für Fluorescence und Farbstoff Laser，VerlagShaker，Germany(1993)，和Lee等，Nucl.Acids Res.202471-2483(1992)中所描述的羅丹明染料的呫噸環(huán)。在定義“羅丹明型呫噸環(huán)”中還包括的是在1999年6月3日提交的美國申請系列號09/325,243中所描述的擴展羅丹明染料中的擴展(extended)共軛呫噸環(huán)。
在另一實施方式中，染料包含具有如下結(jié)構(gòu)的熒光素型呫噸母環(huán) 在上面所描述的熒光素型呫噸母環(huán)中，如上面對呫噸母環(huán)所做的描述那樣，位置C1、C2、C4、C5、C7、C8和C9上的一個或更多碳可用各種各樣的相同或不同取代基獨立取代。C9可以用氫或其它取代基取代，例如鄰羧基苯基或鄰(磺酸)苯基基團。示例性的熒光素型呫噸母環(huán)包括，但不限于，在美國專利4,439,356、4,481,136、4,933,471(Lee)、5,066,580(Lee)、5,188,934、5,654,442和5,840,999、WO 99/16832和EP050684中所描述的熒光素染料的呫噸環(huán)。在定義“熒光素型呫噸母環(huán)”中還包括的是在美國專利5,750,409和5,066,580中所描述的熒光素染料的擴展呫噸環(huán)。
在另一實施方式中，染料包含羅丹明染料，該羅丹明染料包含羅丹明型呫噸環(huán)，其中C9碳原子用鄰羧基苯基取代基(側(cè)鏈(pendent)苯基)取代。此化合物在此也稱為鄰羧基羅丹明。在這樣的羅丹明中，通常使用如下的編號規(guī)則
特別優(yōu)選的羅丹明染料的亞類為4，7，-二氯羅丹明。典型的羅丹明染料包括，但不限于，羅丹明B，5-羧基羅丹明，羅丹明X(ROX)，4，7，-二氯羅丹明X(dROX)，羅丹明6G(R6G)，4，7，-二氯羅丹明6G，羅丹明110(R110)，4，7，-二氯羅丹明(dR110)，四甲基羅丹明(TAMRA)和4，7，-二氯-四甲基羅丹明(dTAMRA)。另外的羅丹明染料可見，例如美國專利5,366,860(Bergot等)、5,847,162(Lee等)、6,017,712(Lee等)、6,025,505(Lee等)，6,080,852(Lee等)、5,936,087(Benson等)、6,111,116(Benson等)、6,051,719(Benson等)、5,750,409、5,366,860、5,231,191、5,840,999和5,847,162，美國專利6,248,884(Lam等)、PCT公開WO 97/36960和WO99/27020、Sauer等，1995，J.Fluorescence5(3)247-261、Arden-Jacob，1993，Neue Lanwellige Xanthen-Farbstoffe fürFluorescence und Farbstoff Laser，Verlag Shaker，Germany(1993)和Lee等，Nucl.Acids Res.20(10)2471-2483(1992)、Lee等，Nucl.Acids Res.252816-2822(1997)和Rosenblum等，Nucl.Acids Res.254500-4504(1997)。在一個實施方式中，染料包含4，7-二氯-鄰羧基羅丹明。
在另一實施方式中，染料包含熒光素染料，該熒光素染料包含熒光素型呫噸環(huán)，其中C9碳原子用鄰羧基苯基取代基(側(cè)鏈苯基)取代。在這樣的熒光素染料中，通常使用如下的編號規(guī)則 熒光素型染料的優(yōu)選亞類是4，7-二氯-熒光素。典型的熒光素染料包括，但不限于，5-羧基熒光素(5-FAM)、6-羧基熒光素(6-FAM)。另外的典型熒光素染料可在，例如美國專利5,750,409、5,066,580、4,439,356、4,481,136、4,933,471(Lee)、5,066,580(Lee)、5,188,934(Menchen等)、5,654,442(Menchen等)、6,008,379(Benson等)和5,840,999、PCT公開WO 99/16832和EPO公開050684中找到。在另一個實施方式中，染料包含4，7-二氯-鄰羧基熒光素。
在其它實施方式中，染料可以是花青、酞菁、方酸或bodipy染料，例如在如下參考文獻和其中所引用的參考文獻中所描述的專利號5,863,727(Lee等)、5,800,996(Lee等)、5,945,526(Lee等)、6,080,868(Lee等)、5,436,134(Haugland等)、US 5,863,753(Haugland等)、6,005,113(Wu等)和WO 96/04405(Glazer等)。
在其它的實施方式中，熒光部分可包括一染料網(wǎng)絡(luò)，其中的染料例如通過FRET或另一機制彼此協(xié)作以提供大的Stoke位移。這樣的染料網(wǎng)絡(luò)通常包括熒光給體部分和熒光受體部分，并且可包括既作為熒光受體也作為熒光給體的部分。熒光給體和受體部分可包含前面描述的可彼此協(xié)同作用的染料中的任何染料。在一個特定的實施方式中，熒光部分包含包含熒光染料的熒光給體部分，以及包含熒光素或羅丹明染料的熒光受體部分。
將蛋白激酶識別部分、疏水部分和熒光部分以允許它們行使各自功能的方式連接。在一個實施方式中，疏水部分和識別部分通過熒光部分彼此連接。在另一實施方式中，疏水部分和熒光部分通過蛋白激酶識別部分彼此連接。例如，疏水部分和熒光部分可被連接于包含識別部分的底物部分的相對末端。在另一實施方式中，疏水部分、熒光部分和識別部分通過三價接頭連接。
下面的方案1舉例說明了一個底物的實施方式，其中疏水部分和識別部分通過熒光部分彼此連接。在圖解的化合物(化合物1)中，疏水棕櫚酰基通過氨甲基苯甲酰氨甲基接頭與熒光素呫噸環(huán)的4碳連接。蛋白激酶識別部分通過N-端磷酸絲氨酸殘基連接于熒光素的側(cè)鏈苯環(huán)的5-羰基基團。更通常地，疏水部分和識別部分可附著于熒光部分的不同位點(例如，呫噸環(huán)的1’、2’、4’、5’、7’或8’碳，或羅丹明或熒光素結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈苯環(huán)的4、5、6或7位置，或羅丹明的3’或6’氮原子)，任選如果適當?shù)脑捦ㄟ^接頭。
下面的方案2描述了一個實施方式，其中疏水部分和熒光部分可通過蛋白激酶識別部分彼此連接(當位置7的絲氨酸處于非磷酸化狀態(tài)時)。疏水部分連接于N末端亮氨酸。熒光部分連接于賴氨酸的ε氨基基團，該賴氨酸鄰近識別部分的C末端?；蛘撸杷糠趾蜔晒獠糠种械囊粋€或兩個可附著于多肽片段內(nèi)的內(nèi)部殘基。而且，疏水部分可連接于識別部分的一個位點，該位點與熒光部分附著的位點相比更偏向N端。
方案3還舉例說明了一個實施方式，其中疏水部分、熒光部分和識別部分通過三價接頭連接。在舉例說明的化合物組中(化合物3-6和3P-6P)，疏水部分(CH3(CH2)X-C(O)-基團)連接于2，3-二氨基丙酸殘基(在此也稱為α-氨甲基氨基乙酸殘基，縮寫為“Dpr”)的2-氮上，而染料連接于2，3-二氨基丙酸殘基的3-氮上。因此，2，3-二氨基丙酸殘基是三價接頭。這種底物的例子在實施例3-6中提供。
底物可設(shè)計成在非磷酸化狀態(tài)下具有特定的凈電荷。在一個實施方式中，當在pH 8下測量時，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0，或約為0，使得添加磷酸根基團所生成的產(chǎn)物具有負2的凈電荷。在另一實施方式中，底物具有不為0的凈電荷，例如-1、-2或+1。在一個實施方式中，底物的凈電荷是0或更少。在另一實施方式中，凈電荷是-1或更少。通過由于磷酸化將底物的凈負電荷的幅度提高到-2，形成在微團形式中不如底物穩(wěn)定的磷酸化產(chǎn)物。相應(yīng)地，產(chǎn)物比底物更具有熒光，所以能很容易地檢測酶活性。
通過在底物中包括適當數(shù)量的帶負電荷和帶正電荷的基團，可以確立底物的凈電荷。例如，為了確立凈中性電荷(凈電荷＝0)，底物被設(shè)計成包含相等數(shù)量的帶正電荷和帶負電荷的基團。賴氨酸和精氨酸包含在生理pH(pH＝6至8)下攜帶一個正電荷的側(cè)鏈。天冬氨酸和谷氨酸包含具有一個負電荷的羧基側(cè)鏈。磷酸絲氨酸殘基在磷酸根基團上攜帶兩個負電荷。組氨酸的咪唑側(cè)鏈具有大約為7的pK，使得其在大約6或更小的pH下攜帶完全的正電荷。半胱氨酸具有大約8的pK，因此其在pH為約9或更高時攜帶完全的負電荷。此外，熒光基團也可包含帶電基團，該帶電基團應(yīng)被認為獲得了底物的特定凈電荷。至于下面的方案1-4，關(guān)于底物電荷狀態(tài)的指導(dǎo)將在第III部分中予以提供。
本發(fā)明的底物可通過本領(lǐng)域已知的合成方法很容易地形成。多肽可通過自動合成儀在固體支持物上進行制備(PerkinJ.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963))，該制備通過任何已知方法，例如Fmoc或BOC(例如Atherton.Chem.Soc.538-546(1981)；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.APractical Approach，Chan，Weng C.和White，Peter D.編輯，Oxfoford UnicersityPress，New York，2000)?？赏ㄟ^一個氨基酸的α碳羧基基團和另一個氨基酸的氨基基團之間的縮合反應(yīng)，用合成的方法形成多肽。用適當?shù)呐悸?lián)劑將激活的氨基酸偶聯(lián)到氨基酸的延長鏈上。可用氨基酸單體單位合成多肽，其α氨基基團被Fmoc(芴基甲氧基羰基)保護?；蛘?，可進行肽合成的BOC方法，以制備本發(fā)明的肽軛合物。
具有反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸可進一步用適當?shù)谋Ｗo基團保護。將要被標記的賴氨酸側(cè)鏈上的氨基可用Mtt保護基保護，該保護基可選擇性地用在二氯甲烷中的5％三氟乙酸來除去?？墒褂么罅康牟煌Ｗo基團策略來有效制備多肽。
示例性的固體支持物包括聚環(huán)氧乙烷/聚苯乙烯(polyethyleneoxy/polystyrene)移植共聚支持物(TentaGel，Rapp PolymereGmbH，Tubingen，Germany)和帶有可用酸斷裂的接頭的低交聯(lián)、高膨脹Merrifield型聚苯乙烯支持物(Applied Biosystems)，雖然其它的也可以被使用。
多肽通常以3-50μmol范圍內(nèi)的規(guī)模在商業(yè)上可購的合成儀上合成。用在二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶溶液，典型的是30％哌啶，將Fmoc基團從肽鏈末端除去，需要若干分鐘以完成去保護。氨基酸單體、偶聯(lián)劑和激活劑被遞送入合成室或柱中，同時用渦流或搖動來。通常偶聯(lián)劑是HBTU，激活劑是1-羥基苯并三唑(HOBt)。偶聯(lián)溶液也可包含二異丙基乙基胺或另一有機堿，來將pH調(diào)整到最適水平，以快速和有效偶聯(lián)。
或者通過典型的固相肽合成方法用433A型肽合成儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)和Fmoc/HBTU化學(Fields，(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35161-214)在氯三苯甲基聚苯乙烯樹脂上制備肽。樹脂上的粗制的受保護肽可用在二氯甲烷中的1％三氟乙酸(TFA)斷裂大約10分鐘。濾液立即用有機胺堿，例如4-二甲基氨基嘧啶，提升至pH 8。在將揮發(fā)性試劑蒸發(fā)后，得到粗制的受保護肽，該肽可用另外的基團標記。
合成后，將固相支持物(樹脂)上的肽去保護，并從支持物上斷裂。去保護和斷裂可以任何順序進行，這取決于保護基、肽和支持物之間的連接，以及標記策略。斷裂和去保護后，可通過凝膠過濾、沉淀或其它方法將肽脫鹽和分析。用于本發(fā)明的肽和肽軛合物的典型分析方法包括質(zhì)譜分析、吸收光譜法、HPLC和Edman降解測序。本發(fā)明的肽和肽軛合物可用反向HPLC、凝膠過濾、電泳或透析來純化。
可用熒光染料偶聯(lián)或“標記”多肽，以提供底物的熒光部分。通常熒光染料標記試劑攜帶親電子連接部分，該部分與多肽，例如氨基末端上的親核基團，或氨基酸的側(cè)鏈親核體(nucleophile)反應(yīng)?；蛘撸玖峡梢跃哂杏H核部分，例如氨基或硫羥連接部分，該部分與肽上的親電子基團，例如氨基酸的羧基末端的NHS或羧基側(cè)鏈反應(yīng)。在標記反應(yīng)中多肽可以在固體支持物，例如合成樹脂上?；蛘?，多肽可以在標記前被斷裂。
用報道分子例如熒光染料標記來修飾蛋白質(zhì)是免疫學、組織化學和細胞生物學的強有力工具(Means，G E.和Feeney，R.E.(1971)ChemicalModification of Proteins，Holden-Day，San Francisco，CA；Means(1990)Bioconjugate Chem.12；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work編輯)American Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，Vols.I和II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985)Chemical Modification of Proteins，In Modern Methods in Protein Chemistry.H.Tschesche編輯，Walter DeGryter，Berlin and New York；Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation andCross-linking，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L)。
多肽可包含許多反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈。某些氨基酸側(cè)鏈可用熒光染料標記試劑的激活形式進行標記。天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、酪氨酸和其它氨基酸具有用于標記的反應(yīng)性官能度。通過適當選擇保護基，肽上的某些反應(yīng)性官能度可選擇性地暴露于標記試劑反應(yīng)?？赏ㄟ^反應(yīng)性側(cè)鏈的化學修飾將特定反應(yīng)部分引入多肽。反應(yīng)性側(cè)鏈可以天然地是蛋白質(zhì)的一部分，或在肽合成過程中或通過合成后修飾，例如通過去保護(Coull，美國專利號6,197,513)來人工引入。它們起“柄”的作用，用來附著各種各樣的分子，包括標記或其它蛋白。胺(賴氨酸，α-氨基基團)是蛋白質(zhì)最通常的反應(yīng)性基團，例如氨基酸賴氨酸的脂肪族ε胺。賴氨酸通常在某種程度上存在，并且常非常豐富。賴氨酸胺(pKa＝9.2)在中性或堿性條件下，例如高于pH 8.0，是相當好的親核體(Fasman，G.D編輯(1989)Practical Handbook of Bilchemistry and Molecular Biology，p13，CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)L)，并且因此與各種試劑反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵(反應(yīng)式1)。
(1)在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的其它反應(yīng)性胺是N末端氨基酸的α-氨基基團，該氨基酸比賴氨酸堿性小，在大約pH 7具有反應(yīng)性。有時，它們可在賴氨酸存在下被選擇性修飾。在蛋白質(zhì)中通常至少有一個α-氨基酸，在蛋白質(zhì)具有多條肽鏈或幾個亞基的情況下，可有更多α-氨基酸(每個是一個肽鏈或亞基)。
硫醇(硫氫基、巰基)是胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸側(cè)鏈的另一反應(yīng)性基團。半胱氨酸包含游離硫醇基，該基團比胺更具親核性，通常是蛋白質(zhì)中最具反應(yīng)性的功能基。它和與前面部分所討論的胺一樣的修飾試劑中的一些反應(yīng)，并此外可與并不與胺非常具有反應(yīng)性的試劑反應(yīng)。硫醇在中性pH下是有反應(yīng)性的，在某些條件下在胺存在時可選擇性地與其它分子偶聯(lián)(反應(yīng)式2)。
(2)由于游離硫醇基團是相對具反應(yīng)性的，具有硫醇的蛋白質(zhì)在它們的氧化形式中通常作為二硫化物連接的寡聚體存在，或具有內(nèi)部跨接的二硫化物基團。用試劑例如二硫蘇糖醇(DTT)對二硫鍵進行還原對于生成反應(yīng)性游離硫醇是必需的。除了胱氨酸和半胱氨酸，有些蛋白質(zhì)還具有氨基酸甲硫氨酸，該氨基酸在甲基硫醚形式中包含硫。
在水和非水條件下胺反應(yīng)性標記試劑可與蛋白質(zhì)和肽中的賴氨酸和α-氨基基團反應(yīng)。反應(yīng)性酯，特別是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯，屬于最常用的用于修飾多肽胺基團的胺反應(yīng)性試劑。這些試劑對脂肪族胺具有高度選擇性。它們與芳香胺、醇(絲氨酸、蘇氨酸)、酚(酪氨酸)和組氨酸的反應(yīng)速率相對低。所形成的脂肪族胺產(chǎn)物非常穩(wěn)定。商業(yè)上可得到的NHS酯是具有磺化基團的，并具有增高的水溶性(參見Brinkley，1992，BioconjugateChem.32)。
在能在蛋白質(zhì)氨基基團上進行的許多反應(yīng)中，一個對標記用途有用的反應(yīng)是?；蚩杀徽J為類似于?；姆磻?yīng)。?；磻?yīng)可通過下面的一般方案進行描述
其中P是蛋白質(zhì)，X是離去基團，R是被引入的官能團(funetion)，例如熒光染料?；钚栽噭-CO-R可通過激活劑，例如碳二亞胺的作用，在標記試劑的游離羧酸上原位產(chǎn)生?；蛘?，穩(wěn)定活性酯可作為固體試劑儲存。其它胺反應(yīng)性標記試劑，X-CO-R，具有親電子功能基團，例如異硫氰酸鹽(例如FITC，熒光素異硫氰酸鹽)，磺酰鹵化物和二氯三嗪。硫醇反應(yīng)性標記試劑包括碘乙酰和馬來酰亞胺衍生物。碘乙酰和馬來酰亞胺試劑也可被用于胺修飾，但需要較高pH(＞9.0)和較長反應(yīng)時間。
熒光染料標記試劑包括反應(yīng)性連接基團，或“連接部分”，它在取代位置之一將染料共價附著于多肽上。能夠形成共價鍵的連接部分通常是能夠與親核分子反應(yīng)的親電子官能基團，例如醇、醇鹽、胺、羥基胺和硫醇。親電子連接部分的例子包括琥珀酰亞胺酯、異硫氰酸鹽、磺酰氯、磺化酯、甲硅烷基鹵化物、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、亞氨基磷酸酯(phosphoramidite)、馬來酰亞胺、碘乙酰胺、鹵乙酰、環(huán)氧化物、烷基鹵化物、烯丙基鹵化物、醛、酮、酰疊氮和酐。
酯N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和更水溶性的磺化形式(NHSS)，由于它們作為試劑的穩(wěn)定性而具有高效率，由于它們與蛋白氨基基團的反應(yīng)性而具有方便的反應(yīng)時間(通常是0.5-2小時)，并且相對容易合成。染料的NHS酯形式通過如下結(jié)構(gòu)示例 其中F是熒光部分。連接L可以是一個鍵，或者一個不帶電荷的接頭，例如C1-C30亞烷基(alkyldiyl)，氧烷基，萜，類脂，脂肪酸，或甾族化合物。接頭可以具有功能基團，包括-C(O)-，-C(O)O-，-O-，-S-，-S-S-，-C(O)-NR，-OC(O)NR，-NRC(O)NR，和-NRC(S)NR；其中R選自H、C1-C6烷基和C5-C14芳基。
染料的激活的酯，例如NHS或HOBt酯，可被預(yù)制、分離、純化和/或表征，或者它可以甾原位形成，并與多肽的親核基團反應(yīng)。通常熒光染料的羧基取代基通過與如下有些組合反應(yīng)而被激活(1)碳二亞胺試劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺，二異丙基碳二亞胺，或脲鹽(uronium)試劑，例如TSTU(O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鹽四氟硼酸鹽，HBTU(O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鹽六氟磷酸鹽)，或HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鹽六氟磷酸鹽)；(2)激活劑，例如1-羥基苯并三唑(HOBt)或1-羥基氮雜苯并三唑(HOAt)；并且(3)N-羥基琥珀酰亞胺，以得到染料的NHS酯。
其它激活和偶聯(lián)試劑包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲鹽六氟磷酸鹽)，TFFH(N，N’，N”，N-四甲基脲鹽-2-氟-六氟磷酸鹽)，PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸鹽)，EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉)，DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)；DIPCDI(二異丙基碳二亞胺)，MSNT(1-(1，3，5三甲基苯-2-磺?；?-3-氮-1H-1，2，4-三唑)，和芳基磺?；u化物，例如三異丙基苯磺酰氯。
合成熒光染料標記的多肽的一個途徑具體為在除去其它保護基團和從樹脂上釋放標記肽之前，將熒光染料試劑偶聯(lián)至樹脂結(jié)合的肽的N末端。每個固定肽的胺通常使用大約5當量的胺反應(yīng)性熒光團。呫噸熒光團，包括熒光素和對甲氨基酚，在用BOC方法合成后對氟化氫(HF)以及大多數(shù)其它酸相當穩(wěn)定。對于那些用來對用FMOC化學合成的肽去保護的試劑，這些熒光團也穩(wěn)定。(Haugland，1996，Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
在另一方面，發(fā)明提供在樣本中檢測一個或更多蛋白磷酸酶的磷酸酶活性的方法。在所述方法中，提供包含樣本和磷酸酶底物的混合物，其中磷酸酶底物包含(a)磷酸酶識別部分，該部分包含至少一個能夠被磷酸酶去磷酸化(水解)的磷酸化的殘基，(b)能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分，和(c)熒光部分。當樣本中存在磷酸酶時，將混合物置于有效允許磷酸化殘基去磷酸化的條件下，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號。在混合物中檢測到熒光信號增大指示樣本中磷酸酶的存在。
將要被檢測的磷酸酶可以是本領(lǐng)域已知的任何磷酸酶。同時，磷酸酶可以是磷酸酶候選物，并且該方法被用來證實和/或表征候選物的激酶活性。
各種各樣蛋白磷酸酶已被鑒定(例如，參見P.Cohen，Ann.Rev.Biochem.58453-508(1989)，Molecular Biology of the Cell，3rdedition，Alberts等，編輯，Garland Publishing，NY(1994)，和Chem.Rev.1012209-2600，″ProteinPhosphorylation and Signaling″(2001))。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶代表一大類酶，該類酶逆轉(zhuǎn)例如蛋白激酶A酶的作用。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶被分成四組，稱為I、IIA、IIB和IIC。蛋白酪氨酸激酶也是一個重要種類的磷酸酶，并且組氨酸、賴氨酸、精氨酸和天冬氨酸磷酸酶也是已知的(例如，參見P.J.Kennelly，Chem Rev.1012304-2305(2001)和其中所引用的參考文獻。在有些情況下，磷酸酶僅對一個或幾個蛋白質(zhì)具有高度特異性，但在其它情況下，磷酸酶是相對非特異性的，能作用于大范圍的蛋白靶向。相應(yīng)地，可設(shè)計本發(fā)明的磷酸酶底物，以通過適當選擇磷酸酶識別部分來檢測特定磷酸酶。能被磷酸酶活性去磷酸化的肽序列的例子在P.J.Kennelly，Chem.Rev.1012291-2312(2001)中加以描述。
磷酸酶底物可被設(shè)計成與一種特殊磷酸酶或一組磷酸酶具有反應(yīng)性，或者其可被設(shè)計用來確定底物特異性和其它催化特征，例如確定kcat或Km值。磷酸酶識別部分中的磷酸化殘基可以是能夠被磷酸酶去磷酸化的任何基團。在一個實施方式中，殘基是磷酸酪氨酸殘基。在另一個實施方式中，殘基是磷酸絲氨酸殘基。在另一個實施方式中，殘基是磷酸蘇氨酸殘基。
除了具有一個或更多能被去磷酸化的磷酸化殘基之外，識別部分可包括額外的氨基酸殘基(或其類似物)，其能增進結(jié)合特異性，和/或加快被磷酸酶去磷酸化的速度。
識別部分可包含多肽片段，該片段包含將要被去磷酸化的基團或殘基。在一個實施方式中，多肽片段具有等于或小于30個氨基酸殘基、25個殘基、20個殘基、15個殘基、10個殘基、或5個殘基的多肽長度。在另一實施方式中，多肽片段具有在3-30個殘基、或3-25個殘基、或3-20個殘基、或3-15個殘基、或3-10個殘基、或3-5個殘基、或5-30個殘基、或5-25個殘基、或5-20個殘基、或5-15個殘基、或5-10個殘基、或10-30個殘基、或10-25個殘基、或10-20個殘基、或10-15個殘基范圍內(nèi)的多肽長度。在另一實施方式中，多肽片段包含3-30個氨基酸殘基、或3-25個殘基、或3-20個殘基、或3-15個殘基、或3-10個殘基、或3-5個殘基、或5-30個殘基、或5-25個殘基、或5-20個殘基、或5-15個殘基、或5-10個殘基、或10-30個殘基、或10-25個殘基、或10-20個殘基、或10-15個殘基。在另一實施方式中，多肽片段包含至少3、4、5、6或7個氨基酸殘基。
底物中的疏水部分能夠?qū)⒌孜镎先胛F。疏水部分的特征可以與上面所描述的蛋白激酶底物的疏水部分相同的特征。優(yōu)選選擇在底物磷酸化后促進熒光部分的熒光增強的疏水部分，使得增強幅度比用缺乏疏水部分的相同底物結(jié)構(gòu)所獲得的要大。
底物可被設(shè)計成在磷酸化狀態(tài)具有特定的凈電荷。在一個實施方式中，當在pH 8下測量時，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0，或大約為0，使得除去磷酸基生成具有凈電荷為+2的產(chǎn)物。在另一實施方式中，底物具有不為0的凈電荷，例如+1、+2或-1。在一個實施方式中，底物的凈電荷是0或更大。在另一實施方式中，凈電荷是+1或更大。
磷酸酶底物的熒光部分可以是按照本發(fā)明起作用的任何熒光實體。在一個實施方式中，熒光部分包含熒光素。在另一實施方式中，熒光部分包含磺基熒光素。在另一實施方式中，熒光部分包含羅丹明。也可使用在蛋白激酶底物方面與上面所討論的相同類型的其它熒光部分。
將磷酸酶識別部分、疏水部分和熒光部分以任何允許它們行使相應(yīng)功能的方式連接、該方式在蛋白激酶底物方面與在此所討論的設(shè)計理由類似。
更通常地，可設(shè)計用于檢測酶，例如蛋白激酶、磷酸酶、或其它酶的底物可以被設(shè)計成具有下述特征中的任何特征，包括其任何組合。在一個實施方式中，酶反應(yīng)產(chǎn)物的熒光在摩爾摩爾基礎(chǔ)上是底物熒光的至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。在另一實施方式中，底物的分子量小于5000道爾頓，或小于4000道爾頓，或小于3000道爾頓，或小于2000道爾頓。在另一實施方式中，底物排除(不包含)其中熒光部分結(jié)合于脫輔基酶或脫輔基蛋白的結(jié)構(gòu)。
方法將要被測試的樣本可以是用戶所選擇的任何合適樣本。樣本可以是天然存在的或人制造的。例如，樣本可以是血液樣本、組織樣本、細胞樣本、口腔(buccal)樣本、皮膚樣本、尿樣本、水樣本、或土壤樣本。樣本可以來自活的生物體，例如真核細胞、原核細胞、哺乳動物、人、酵母、或細菌。在與本發(fā)明的底物接觸前，可以用本領(lǐng)域已知的任何方法將樣本進行加工。例如，可以對樣本實行沉淀步驟、柱層析步驟、熱步驟，等等。在有些情況下，樣本是純化的或用合成方法制備的酶，該酶被用來篩選或表征酶底物、抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑。
如果樣本既包含激酶也包含磷酸酶，使得一個的活性可能干擾另外一個的活性，則可將一種滅活試劑(例如一種針對活性位點的不可逆抑制劑)加入樣本，來滅活任何一個不需要的活性。
反應(yīng)混合物通常包括緩沖液，例如在2000-2001 Sigma目錄的“生物學緩沖液”部分所描述的緩沖液。示例性的緩沖液包括MES，MOPS，HEPES，Tris(Trizma)，N-二羥乙基甘氨酸，TAPS，CAPS，等等。緩沖液以足夠生成和維持所需pH的量存在。反應(yīng)混合物的pH根據(jù)所要檢測的酶的活性的pH依賴性加以選擇。例如，pH可以是2-12，4-11，或6-10。反應(yīng)混合物也包含酶的任何需要的輔因子和/或輔底物(例如對蛋白激酶而言的ATP，對鈣依賴性激酶而言的Ca2+離子，和對蛋白激酶A而言的cAMP)。額外的混合物成分在下面第IV部分中加以討論。在一個實施方式中，反應(yīng)混合物不包含洗滌劑或基本上沒有洗滌劑。
在有些實施例中，可能需要將離子強度保持在盡可能低，以幫助避免掩蔽反應(yīng)混合物中的帶電荷基團，使得產(chǎn)物分子的微團形成是不利的并且是不穩(wěn)定的。例如，高鹽濃度(例如1M NaCl)可能是不合適的。此外，可能需要避免反應(yīng)混合物中可能對產(chǎn)物的熒光特性產(chǎn)生不利影響的某些其它成分的高濃度。關(guān)于離子種類，例如金屬離子的影響的指導(dǎo)可在Surfactants andInterfacial Phenomena，2ndEd.，M.J.Rosen，John Wiley&Sons，NewYork(1989)，特別是第3章中找到。例如，濃度為1mM的Mg2+離子在下面所提供的實施例中是有用的，但更高濃度可能導(dǎo)致較差效果。
在實施本發(fā)明的某些方面時，本發(fā)明的酶底物與包含酶的樣本混合，該酶是要被檢測的，或被用來篩選、檢測或表征底物、抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑活性的化合物。酶與底物反應(yīng)導(dǎo)致底物凈電荷絕對幅度的增大(對于電荷更大的種類)，使得已反應(yīng)的底物的熒光大于未反應(yīng)的底物的熒光。在一個實施方式中，底物具有的凈電荷(凈中性電荷)為0，并且底物與酶的反應(yīng)使得底物或者(1)帶凈負電荷，通過(1A)在底物上加入或生成新的帶負電荷基團，或(1B)除去或阻斷底物上的帶正電荷的基團；或者(2)帶凈正電荷，通過(2A)在底物上加入或生成新的帶正電荷基團，或(2B)除去或阻斷底物上的帶負電荷的基團。如果底物具有正的或負的凈電荷，倘若產(chǎn)物比在反應(yīng)混合物中的底物具有更強的熒光，使得酶活性可被檢測的話，則酶作用于底物能將凈電荷改變?yōu)樨撔栽黾踊蜇撔詼p少。
例如，通過在底物的羥基基團上加上磷酸根基團(例如用蛋白激酶，將中性帶電基團變?yōu)閹в?2電荷的基團)，通過斷裂羧酸酯或酰胺以產(chǎn)生羧基基團(例如，使用酯酶或酰胺酶，將中性帶電基團變?yōu)閹в?1電荷的基團)可以完成反應(yīng)(1A)。通過將底物中的氨基或肼基與乙?；阜磻?yīng)來產(chǎn)生中性乙酰酯基，與N-氧化酶反應(yīng)以生成中性N-氧化物，與氨裂合酶反應(yīng)以除去氨，或與引起氧化脫氨的氧化酶反應(yīng)，可完成反應(yīng)(1B)。例如，通過用酰胺酶處理底物中的酰胺基團來生成底物中的帶正電氨基基團，可以完成反應(yīng)(2A)。例如，使用脫羧酶以除去羧酸或通過將羧基與甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)以形成羧酸酯，可完成反應(yīng)(2B)。各種能夠?qū)嵭羞@種轉(zhuǎn)化的酶在文獻中是已知的(例如，參見C.Walsh，Enzymatic Reaction Mechanisms，WH Freeman andCo.，New York(1979)，Worthington產(chǎn)品目錄(Worthington酶)，Sigma生命科學目錄，和其它商品化酶的供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄)。
在另一實施方式中，酶底物在與酶反應(yīng)前具有凈負電荷，例如-1、-2、-3、-4或更多，但由于未反應(yīng)的底物的熒光足夠低，所以與酶反應(yīng)造成的底物凈負電荷增加使熒光有可檢測的增強。
或者，在另一實施方式中，酶底物在與酶反應(yīng)前可具有+1、+2、+3、+4或更高的凈正電荷，但由于未反應(yīng)的底物的熒光足夠低，所以與酶反應(yīng)造成的底物凈正電荷增加使熒光有可檢測的增強。
方案1方案1舉例說明了一種可被用來檢測測蛋白激酶A的示例性底物(化合物1)?；衔?的結(jié)構(gòu)可表示為X-L-染料-SereOPO32-)LeuArgArgArgArgPheSrLys(ε-N-Ac)Gly(NH2)，其中是C-16脂肪?；?棕櫚?；?，L是將X連接于染料的接頭(對NHCH2C6H4C(＝O)NHCH2)，染料是熒光部分(在此情況下，是熒光素)，ε-N-Ac是乙?；鶊F，Ser、Leu、Arg、Phe、Lys和Gly分別是絲氨酸、亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和甘氨酸的標準三字母代碼，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺?；衔?的示例性合成在實施例1A中加以描述。
如所能看出的，化合物1在染料部分中包含酚鹽陰離子和羧基陰離子，和在N末端絲氨酸殘基中的具有兩個額外負電荷的磷酸根基團，使得總負電荷為-4。這被四個精氨酸殘基中的總共四個正電荷的胍基抵銷。因此，化合物的凈電荷在PH 8下約為0。
化合物1還包括多肽形式的蛋白激酶識別部分，該多肽包含被蛋白激酶A識別的氨基酸序列。識別部分也包含非磷酸化的絲氨酸，該絲氨酸能夠被激酶磷酸化。磷酸化后，底物的凈電荷從中性變?yōu)?2，從而導(dǎo)致熒光增強。
雖然熒光增強的基礎(chǔ)還不肯定，而且發(fā)明人不希望被束縛于某一特定理論，預(yù)期本發(fā)明的熒光底物由于疏水部分而能在反應(yīng)混合物中形成微團，使得熒光部分由于它們非常接近而彼此淬滅。當?shù)孜飵е行噪姾苫蚓哂形⑿〉呢搩綦姾苫蛭⑿〉恼齼綦姾蓵r，特別有利于微團形成，使得微團形成不因為相互的電荷排斥而受阻礙。假定的微團可以與溶液中單分子、無聯(lián)系的種類處于平衡狀態(tài)，但微團形式是主要形式。然而酶反應(yīng)的產(chǎn)物具有增加的凈電荷(總共凈負或總共凈正)，使得不利于底物的微團形成。游離底物發(fā)出明亮熒光，因為它與溶液中其它熒光底物分子保持相對游離。
圖1顯示使用實施例1B所描述的方法，在蛋白激酶A存在下，從化合物1得到的動力學數(shù)據(jù)。在恒定量的酶的存在下，隨時間監(jiān)測含有三個不同濃度的化合物1(0.15，0.30，和0.60μM)的反應(yīng)混合物的熒光信號。如所看到的，熒光增強的速度與反應(yīng)混合物中的化合物的量成比例。此外，數(shù)據(jù)顯示熒光信號的顯著增大伴隨低噪音，使得信噪比高。初始速率的雙倒數(shù)作圖(見圖2)得到Km值為0.3μM，與酶對底物的磷酸化一致。
這些結(jié)果證明，通過使凈負電荷幅度增加，通過將具有凈0電荷的底物轉(zhuǎn)變成具有-2的凈負電荷的產(chǎn)物，可導(dǎo)致熒光的顯著增加，以檢測酶活性。
方案2方案2顯示用來檢測堿性磷酸酶活性的示例性底物(化合物2)。化合物可用X-LeuArgArgArgArgPheSer(OPO32-)Lys(ε-N-染料)Gly-NH2代表，其中X是C-16脂肪酰基(棕櫚?；?，染料是連接至賴氨酸殘基的ε氨基基團的熒光部分(熒光素)，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺?；衔?的示例性合成在實施例2A中加以描述。在此結(jié)構(gòu)中，疏水X基團通過酰胺鍵直接連于多肽片段的N末端氨基，而不使用額外接頭原子。然而，應(yīng)意識到，如果需要，也可包括包含一個或更多連接鏈原子的接頭。
在用磷酸酶反應(yīng)前，底物包含由四個精氨酸側(cè)鏈提供的總共四個正電荷，和四個負電荷，該四個負電荷由熒光染料部分中(一個酚鹽陰離子和一個羧基陰離子)的兩個負電荷以及磷酸根基團中的兩個額外負電荷所提供，導(dǎo)致在pH 8下總凈電荷大約為0。在將磷酸基從與苯丙氨酸殘基相鄰的磷酸化的絲氨酸上水解下來以后，由于丟失磷酸根基團上的兩個負電荷，所得到的產(chǎn)物具有+2的凈正電荷。相應(yīng)地，由于微團不穩(wěn)定性，產(chǎn)物預(yù)期比未反應(yīng)形式的熒光更明亮。
圖3顯示根據(jù)實施例2B描述的方法，在堿性磷酸酶存在下，從化合物2得到的動力學數(shù)據(jù)。如所看到的，與化合物2反應(yīng)導(dǎo)致熒光隨時間立即并顯著增強，并具有高信-噪比。這些結(jié)果證明，通過導(dǎo)致凈電荷幅度增高，在這種情況下通過將具有凈0電荷的底物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?2的凈正電荷的產(chǎn)物，可導(dǎo)致熒光顯著增強，以檢測酶活性。
化合物1和2結(jié)構(gòu)的一個區(qū)別在于化合物2中的疏水部分和熒光部分位于多肽骨架的相反末端，而化合物1中的疏水部分和熒光部分在多肽骨架的相同末端上相對靠攏。如從圖1-3所示數(shù)據(jù)所看到的，兩種設(shè)計都適于分析本發(fā)明的酶。
方案3
表1

方案3中舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的酶底物的另一設(shè)計(見化合物3-6和3P-6P)。方案3顯示一組具有不同長度烷基?；?X)的化合物，作為通過熒光檢測檢測蛋白激酶A的可能底物。這些底物的一般結(jié)構(gòu)可用X-Y(染料)-LeuArgArgAlaSer(OR)LeuGly-NH2代表，其中X是CH3(CH2)xC(＝O)-形式的脂肪?；?，x如表1中所定義，Y是2-氨甲基甘氨酸，染料是4，7-二氯熒光素染料，該染料通過與染料的側(cè)鏈苯環(huán)的5-羰基連接附著于Y的2-氨基，R是H或PO32-(參見表1)，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺。實施例3A顯示了化合物3的示例性合成。
這些底物中的每一個包含來自兩個精氨酸側(cè)鏈的總共兩個正電荷，和來自熒光素染料部分的兩個負電荷(一個酚鹽陰離子合一個羧基陰離子)，使得在pH 8下的總凈電荷大約為0。底物包含一個非磷酸化的絲氨酸殘基，該殘基能夠被激酶磷酸化。磷酸化后，底物的凈電荷從中性變?yōu)?2。
為了達到有效，不僅底物應(yīng)與酶反應(yīng)以形成所需的修飾產(chǎn)物，產(chǎn)物也應(yīng)比底物熒光更強，才能觀察到熒光有可檢測的增強。一般地，只要能達到足夠低的信-噪比，熒光的較大改變提供更好的分析敏感性。因此，可能需要測試多種底物變體，以發(fā)現(xiàn)具有最適熒光特性的底物。
實施例3描述了一項研究，其中以磷酸化和非磷酸化形式制備了具有方案3種所示結(jié)構(gòu)的幾種化合物。底物結(jié)構(gòu)在其疏水部分(X)的烴“尾”長度上有所不同，鏈長為1、8、11和15飽和碳原子。結(jié)果示于表2。

1對底物的非磷酸化(非磷酸化)或磷酸化(磷酸化)形式以任意單位進行的熒光測量。
2熒光(磷酸化)/熒光(非磷酸化)的四舍五入值如在表2中所看到的，對化合物3和3P而言，實際上在非磷酸化(非磷酸化)和磷酸化形式之間沒有觀察到熒光的差異。這指示乙?；鶊F太小，不足以有利于非磷酸化底物的微團形成。然而，對于較長的X基團則觀察到熒光的顯著區(qū)別。十二烷?；?化合物5，5P)似乎提供了磷酸化后最大的增加(大約900％的增加)，但十四烷?；鶊F(化合物6，6P)也非常有效，顯示大約600％的增加。壬?；?化合物4，4P)所觀察到的熒光指示此底物也可能有用。結(jié)果證明，能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分的存在有效導(dǎo)致非磷酸化底物的熒光淬滅，顯然是由于自我淬滅微團形式占優(yōu)勢，而磷酸化底物在微團和游離形式之間的平衡向有利于游離形式的方向偏移，使得來自磷酸化底物的信號較少自我淬滅。
表2還顯示，隨著疏水部分長度增加，每一化合物的兩種形式的熒光信號幅度都降低。一個可能的解釋是，較長的疏水鏈可導(dǎo)致形成微團的磷酸化產(chǎn)物的比例增加，使得產(chǎn)物的有些熒光信號因為自我淬滅而受抑制。然而，如果產(chǎn)物的游離和微團形式之間的平衡常數(shù)大于非磷酸化底物的相應(yīng)平衡常數(shù)，則酶催化的磷酸化可導(dǎo)致熒光有可觀察的增強。例如，基于熒光檢測，已發(fā)現(xiàn)化合物5是大腸桿菌蛋白激酶A的有效底物(數(shù)據(jù)未示)。
根據(jù)本發(fā)明的酶底物的另一實施方式包括其中疏水部分可以被至少一個鹵素原子(例如氟)取代的底物。這樣的酶底物的例子顯示于方案4和方案5。方案4顯示用來檢測蛋白激酶A活性的示例性底物(化合物7)。該化合物可用X-Lys(ε-N-染料)LeuArg-ArgAlaSerLeuGly-NH2代表，其中X是n-(1H，1H，2H，2H全氟癸基-1-硫羥-2-乙酰基團，染料是連接于賴氨酸殘基的ε氨基基團的熒光部分(5-羧基磺基熒光素)(5-carboxysulfofluorescein)，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺。實施例4A中描述了化合物7的示例性合成。在此結(jié)構(gòu)中，疏水X基團通過硫羥-2-乙?；鶊F連接于多肽片段的N末端氨基基團。然而，應(yīng)該意識到，如果需要，也可包括可選擇的接頭。
方案4如所看到的，化合物7在染料部分包含總負電荷為-2的一個酚鹽陰離子和一個磺酸鹽陰離子。染料中的此負電荷被兩個精氨酸殘基中的兩個帶正電荷的胍基抵銷。因此，pH 8下化合物7的凈電荷大約為0。
化合物7還包括多肽形式的蛋白激酶識別部分，該多肽包含被蛋白激酶A識別的氨基酸序列。識別部分也包括能夠被激酶磷酸化的非磷酸化絲氨酸。磷酸化后，底物的凈電荷從中性變?yōu)?2，從而導(dǎo)致熒光增強?；衔?的熒光數(shù)據(jù)可見實施例4B。
方案5顯示用來檢測蛋白激酶A活性的另一示例性底物(化合物8)。化合物可表示為染料-Lys(ε-N-X)LeuArg-ArgAlaSerLeuGly-NH2，其中X是連接于賴氨酸殘基的ε氨基基團的N-全氟辛酰脯氨酸，染料是熒光部分(5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基熒光素)(5-carboxy-2’，7’-dipyridyl-sulfofluorescein)，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺。實施例5A描述了化合物8的示例性合成。在此結(jié)構(gòu)中，疏水X基團通過脯氨酸連接于賴氨酸殘基的ε氨基基團。應(yīng)該意識到，如果需要，也可包括可選擇的接頭。此外，熒光染料通過酰胺鍵直接連于多肽片段的N末端氨基基團，而不使用額外的接頭原子。然而，應(yīng)該意識到，如果需要，也可包括包含一個或更多連接鏈原子的接頭。
方案5如所看到的，化合物8在染料部分包含總負電荷為-2的一個酚鹽陰離子和一個磺酸鹽陰離子。染料中的這個負電荷被總共兩個正電荷抵銷，此兩個正電荷由兩個精氨酸殘基中的兩個帶正電荷的胍基提供。因此，pH8下化合物8的凈電荷大約為0。
化合物8還包括多肽形式的蛋白激酶識別部分，該多肽包含被蛋白激酶A識別的氨基酸序列。識別部分也包含能夠被激酶磷酸化的非磷酸化絲氨酸。磷酸化后，底物的凈電荷從中性變?yōu)?2，從而導(dǎo)致熒光增大?；衔?的熒光數(shù)據(jù)可在實施例5B中找到。
在還有另一個實施方式中，本發(fā)明包含包括進一步的間隔基的酶底物。方案6顯示本實施例所設(shè)想的用來檢測蛋白激酶A活性的示例性底物(化合物9)?；衔锟杀硎緸镹-Ac-ArgGlyArgProArgThrSerSerPheAlaGluGly-OOOLys(ε-N-染料)Lys(ε-N-X)-NH2，其中X是連接于賴氨酸殘基ε氨基基團的十八烷?；鶊F，染料是連接于賴氨酸殘基ε氨基基團的熒光素部分(5-羧基-磺基熒光素)，O是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙?；鶊F所提供的接頭，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺。實施例6A描述了化合物9的示例性合成。在此結(jié)構(gòu)中，疏水X基團連接于賴氨酸殘基的ε氨基基團，而無需任何進一步的接頭原子。然而，應(yīng)該意識到，如果需要，也可包括包含一個或更多連接鏈原子的接頭。此外，熒光染料通過酰胺鍵直接連于賴氨酸殘基的ε氨基基團，而不使用額外的接頭原子。然而，應(yīng)該意識到，如果需要，也可包括包含一個或更多連接鏈原子的接頭。
方案6如所看到的，化合物9包含在染料部分中的一個酚鹽陰離子和一個磺酸鹽陰離子，以及在谷氨酸殘基側(cè)鏈上的羧酸鹽，使總負電荷為-3。染料中的此負電荷被三個精氨酸殘基中的三個帶正電荷的胍基抵銷。因此，pH 8下化合物9的凈電荷大約為0。
化合物9還包括多肽形式的蛋白激酶識別部分，該多肽包含被蛋白激酶A識別的氨基酸序列。識別部分也包含兩個非磷酸化的絲氨酸殘基和一個非磷酸化的蘇氨酸殘基，其中至少一個能夠被激酶磷酸化?；衔?的熒光數(shù)據(jù)可見實施例6B。
表3中顯示了激酶底物的其它例子，其中摻入了接頭。

在表3中，每一“O”代表由2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙?；鶊F提供的接頭；“染料2”是由5-羧基-2’，7’-二吡啶基-砜熒光素(5-carboxy-2’7’-dipyridyl-sulfonefluorescein)提供的熒光部分；“tet”是由2’，7’，4，7一四氯-5-羧基熒光素(2’，7’-二氯-5-羧基-4，7-二氯熒光素)提供的熒光部分；并且NH2指示C末端氨基酸殘基的羧基基團是酰胺化了的。
如從表3中的數(shù)據(jù)所能看到的，在磷酸化測試條件下，幾個種類的激酶顯示出類似的熒光增大。實施例7中描述了這些底物中的一個示例性成員(化合物10，方案7)的示例性合成。
方案7
化合物可表示為N-X-OOOLys(ε-N-染料)ArgArgGluGly-SerPheArg-NH2，其中X是通過接頭-OOO-連接于賴氨酸殘基的α-氨基基團的十六烷?；鶊F，染料是與賴氨酸殘基的ε氨基基團連接的熒光部分(5-羧基-2’7’-二吡啶基-磺基熒光素)，O是2-氨基乙氧基-2-乙氧基乙?；鶊F所提供的接頭，NH2指示C末端甘氨酸的羧基基團是酰胺。實施例7A中描述了化合物10的示例性合成。在此結(jié)構(gòu)中，疏水X基團通過接頭-OOO-連接于賴氨酸殘基的α氨基基團。應(yīng)該認識到，如果需要，也可包括交替的接頭。此外，熒光染料通過酰胺鍵直接連于多肽片段的N末端氨基基團，而不使用額外的接頭原子。然而，應(yīng)該認識到，如果需要，也可以包括包含一個或更多個連接鏈原子的接頭。
如所看到的，化合物10包含在染料部分的一個酚鹽陰離子和一個磺酸鹽陰離子、以及在谷氨酸殘基側(cè)鏈上的羧酸鹽，使總負電荷為-3。這被三個精氨酸殘基中的胍基抵銷，后者總共帶三個正電荷。因此，在pH 8下化合物的凈電荷大約為0。
在此所舉例說明的激酶底物的各種示例性實施方式中，任何末端羧基都是酰胺化的。例如，在化合物1、2、3、4、5、6、7、8和10中，激酶識別部分的C末端是酰胺化的。在化合物9中，連接疏水部分的賴氨酸殘基的游離C末端是酰胺化了的。當被酰胺化了的時候，在pH 8下這樣的C末端羧基不對底物的凈電荷作出貢獻。應(yīng)該認識到，其它基團可被用來“遮蔽”末端羧基(如果需要的話，以及側(cè)鏈羧基)的電荷效應(yīng)。例如，這樣的羧基可以是酯化的?；蛘?，這樣的羧基可以是非遮蔽的，并被用來對底物的總凈電荷作出貢獻。
本發(fā)明預(yù)期不僅檢測靶酶，還檢測涉及如下的方法(1)在樣本中對酶活性進行篩選和/或定量，(2)測定一種酶或酶混合物對所選擇的底物的kcat和/或km，(3)對酶底物進行檢測、篩選和/或表征，(4)對酶活性的抑制劑、激活劑和/或調(diào)節(jié)劑進行檢測、篩選和/或表征，和(5)測定針對選定的酶的底物特異性和/或底物共有序列或底物共有結(jié)構(gòu)。
例如，在篩選酶活性時，將包含或可能包含一種特別的酶活性的樣本與本發(fā)明的底物相混合，并測量熒光以確定是否出現(xiàn)熒光增強?？稍诙嗫谆蚨喾磻?yīng)板或設(shè)備中同時對許多樣本進行篩選，以提高產(chǎn)率?？赏ㄟ^標準方法測定Kcat和Km，如例如在Fersht，Enzyme Structure and Mechanism，2ndEdition，W.H.Freeman and Co.，New York，(1985))中所描述的。
在有些實施方式中，反應(yīng)混合物可包含兩個或更多不同酶。這對例如同時篩選多種酶、以確定是否酶中的至少一種具有特殊酶活性是有利的。
通過將一種酶與具有不同酶識別部分的不同底物反應(yīng)，可測定酶的底物特異性，并且基于它們熒光的增強可測定酶對底物的活性。例如，通過將酶與具有幾種不同蛋白激酶識別部分的幾種不同底物反應(yīng)，可制備一種激酶的優(yōu)選底物的共有序列。
每個不同底物可在不同反應(yīng)混合物中分別測試，或者兩個或更多底物可在一個反應(yīng)混合物中同時存在。在不同底物同時存在于反應(yīng)混合物中的實施例中，底物可包含相同的熒光部分，在這種情況下所觀察到的熒光信號是酶與兩種底物反應(yīng)的信號之和?；蛘?，不同底物可包含不同的、熒光上可區(qū)別的熒光部分，從而能分別監(jiān)測和/或檢測酶與同時存在相同混合物中的每一不同底物的反應(yīng)?？蓪晒獠糠诌M行選擇，來用同一激發(fā)源激發(fā)它們中的全部或其亞群，或者可用不同激發(fā)源激發(fā)它們。也可對它們進行選擇以使其具有額外的特性，例如當其非常接近時，通過例如碰撞淬滅、FRET或另一機制(或機制的組合)彼此淬滅的能力。
雖然對于本方法的操作不是必需的，測試混合物可以選擇性包括一種或多種兩親的淬滅化合物，該化合物被設(shè)計來淬滅底物(和/或當混合物中存在多于一種底物時為多個底物)的熒光部分的熒光。這樣的兩親的淬滅分子通常包含一個疏水部分和一個淬滅部分，該疏水部分能夠?qū)⒋銣缁衔镎先胛F。疏水部分可以是任何能夠?qū)⒒衔镎先胛F的部分，并且特定的、非限制性的示例性實施例可包含前面與例如激酶底物一起描述的疏水部分中的任何一種。
淬滅部分可包括能夠淬滅在分析中所使用的酶底物(或者如果使用多種底物，為底物中的一種或多種)的熒光部分的熒光的任何部分。能夠淬滅上面所討論的各種不同類型的熒光染料的熒光的化合物是已知的，這些熒光染料例如呫噸、熒光素、羅丹明、花青、酞菁和方酸染料。這樣的淬滅化合物可以是非熒光的(也稱為“暗淬滅劑”(dark quencher)或“黑洞淬滅劑”(black hole quencher))，或者，它們自身可以是熒光的?？砂銣绮糠值倪m宜的非熒光暗淬滅劑的例子包括，但不限于，Dabcyl、美國專利號6,080,868(Lee等)中所描述的各種非熒光淬滅劑、和在WO 03/019145(Ewing等)中所描述的各種非熒光淬滅劑。適宜的熒光淬滅劑的例子包括，但不限于，上面與激酶底物一起描述的各種熒光染料。
淬滅劑淬滅特定熒光部分的熒光的能力可取決于各種不同因素，例如淬滅發(fā)生的作用機制。淬滅的機制對于成功并不是決定性的，可例如通過碰撞、通過FRET、通過另一機制或機制的組合發(fā)生。針對一個特殊用途的淬滅劑的選擇可根據(jù)經(jīng)驗容易地確定。一個具體例子為，暗淬滅劑Dabcyl和熒光淬滅劑TAMRA已被顯示可有效淬滅各種不同熒光團的熒光。在一個特定實施方式中，選擇淬滅劑可基于光譜上其與熒光部分光譜重疊的光譜重疊特性。例如，可選擇一種淬滅劑，它的吸收光譜與熒光部分的發(fā)射光譜充分重疊，使得淬滅劑淬滅與之彼此十分靠近的熒光部分的熒光，例如當淬滅劑分子和包括淬滅劑部分的底物被整合入同一微團時。
在分析中存在多種底物的實施例中，例如上面所描述的復(fù)合實施例中，可能需要選擇一種淬滅部分，該淬滅部分能淬滅分析中存在的所有底物的熒光部分的熒光。
可將疏水和淬滅部分以允許它們行使各自功能的任何方式連接。一個具體例子為，疏水部分可不借助于接頭直接被連接于淬滅部分。這樣的淬滅化合物的非限制性的例子包括其中包含伯氨基基團(或其它適宜的基團)的染料(例如，一種羅丹明或熒光素染料)被脂肪酸?；说姆肿印Ａ硪粋€具體例子為，連接可通過接頭的方式介導(dǎo)。接頭的特性不是決定性的，并可包括肽片段(或其類似物)。雖然在許多實施方式中肽片段將不包括被所測試的一個或更多酶識別的酶識別部分，其可任選包括這樣的一個或多個部分。一個具體例子為，淬滅劑分子可以是本文所描述的激酶或其它酶底物中的任何一個的衍生物或類似物，其中熒光部分被淬滅部分所取代，并且酶識別部分的序列被修飾，使得其不再被樣品中所分析的一種或多種酶所識別。
與酶底物一樣，淬滅劑分子可被設(shè)計成具有特定的電荷特性。
檢測、篩選和/或表征酶活性的抑制劑、激活劑和/或調(diào)節(jié)劑，可以通過形成包含這樣的已知或潛在的抑制劑、激活劑和/或調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)混合物、并確定熒光信號相對于在沒有抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑時觀察到的信號增大或減小(如果有的話)的程度?？蓽y定這些物質(zhì)的不同量，以確定例如Ki(抑制常數(shù))、KH(希爾系數(shù))、Kd(解離常數(shù))等參數(shù)，以表征這種物質(zhì)對酶活性具有濃度依賴的效應(yīng)。
實施例8描述了用蛋白激酶A進行的抑制研究(還參見圖4)。在不存在(最低痕量)或存在抑制劑星形孢菌素(5mM，中等痕量)或PKA特異性抑制劑TYADFIASGRTGRRNAI(20nM，最高痕量)時、在不同濃度的ATP(50、10、3和2μM三磷酸腺苷)存在下，將來自大腸桿菌的PKA進行溫育。磷酸化的熒光底物具有結(jié)構(gòu)N-棕櫚酰-α-2-氨甲基-Gly(5-羧基-砜熒光素)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH2(N-palmitoyl-alpha-2-aminomethyl-Gly(5-carboxy-sulfonefiuorescein)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH2)(化合物11)，其中疏水部分(棕櫚酰)和熒光部分(染料)均與激酶識別部分的N-末端殘基連接，類似于上面方案3中所示結(jié)構(gòu)。染料5-羧基-砜熒光素通過5-羰基基團和2-氨甲基基團的2-氨基氮之間形成的酰胺鍵連接于N-末端殘基。棕櫚?；鶊F經(jīng)由α氨基氮偶聯(lián)至N-末端殘基。該結(jié)構(gòu)示于方案8，并在實施例8A中提供了合成過程。
方案8 以雙倒數(shù)作圖(1/V作為1/S的函數(shù))的形式將分析的結(jié)果(實施例8B)示于圖4。如所看到的，當與無抑制劑的對照相比時，酶介導(dǎo)的磷酸化的速率被兩種抑制劑抑制。由于抑制劑曲線與無抑制劑對照曲線的y-截距不相交，兩種抑制劑都不是ATP結(jié)合的競爭性抑制劑(參見例如A.Fersht，EnzymeStructure and Mechanism，2ndEdition，W.H.Freeman and Co.，New York，第3章(1985))。此結(jié)果與這些抑制劑結(jié)合于激酶的位點不同于ATP結(jié)合位點的事實是相一致的。
實施例9中描述了對蛋白激酶C-βII的抑制研究。制備PKC底物(化合物12)，該底物具有類似于上面方案4中所示的PKA底物的通式結(jié)構(gòu)，不同之處在于蛋白激酶識別部分含有被設(shè)計來與PKC-βII反應(yīng)的肽序列。特別地，底物包含能被PKC-βII磷酸化的C-末端酪氨酸殘基(Y)。一式兩份制備反應(yīng)混合物，該混合物在不同量的抑制劑星形孢菌素(痕跡A-D 0、2nM、5nM和10nM)存在下包含化合物12。也進行了無酶對照(痕跡E)。結(jié)果示于圖5。如所看到的，隨著抑制劑濃度增大，激酶活性降低。
實施例10描述了對pp60c-src相關(guān)蛋白酪氨酸激酶的分析。在此研究中，制備底物(化合物13)，該底物具有與化合物12類似的通式結(jié)構(gòu)，不同之處在于蛋白激酶識別部分含有為pp60c-src激酶設(shè)計的肽序列，并且磷酸化位點是內(nèi)在地位于識別部分內(nèi)的酪氨酸。針對單一底物濃度一式三份進行酶反應(yīng)，并且還進行兩個無酶對照。分析結(jié)果示于圖6。如所看到的，在三個相同的底物反應(yīng)觀察到幾乎同樣的熒光圖形，證明分析條件所提供的熒光信號有可重復(fù)性并且快速。此研究的另一值得注意的特征在于盡管反應(yīng)體積非常小(5μL)、并且底物濃度低(2.5μM)，觀察到具有高信-噪比的強熒光信號。這證明使用本發(fā)明可獲得高敏感性。
熒光信號的檢測可以任何適宜的方式進行。有利的是，可在連續(xù)監(jiān)測期實時地使用本發(fā)明的底物，以使得用戶快速確定樣本中是否存在酶活性，并可任選確定酶的量或特異活性。從至少兩個不同時間點測量熒光信號，通常直到能測定一個初始速率(速度)(rate)。可連續(xù)或在幾個選定的時間點監(jiān)測信號?；蛘撸稍谝粋€終點(end-point)實施例中測定熒光信號，其中在在特定量的時間后測量信號，并且將該信號與對照信號(在反應(yīng)開始前)、閾限信號或標準曲線進行比較。
實施例11描述了星形孢菌素蛋白激酶C的抑制研究，以測定星形孢菌素在各種固定的ATP濃度下的IC50。來自上面描述的實施例7的化合物10是此研究所用的底物。每一輪以固定的ATP濃度(10、20、50或100μM)、在一系列星形孢菌素濃度下(0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50和100nM)進行分析。10μM ATP下的未加工過的動力學數(shù)據(jù)示于圖7A。在圖7A中觀察到的熒光信號的起始躍升是由于溫度改變所造成的，該溫度改變是當使反應(yīng)從孵育溫度(在添加ATP前使反應(yīng)所保持的溫度)0℃升溫至環(huán)境溫度時發(fā)生的。結(jié)果是，熒光信號在大約最初的200秒內(nèi)迅速升高。出于此原因，圖7B中所示的線性配合是由獲自3.5至13.5分鐘之間的數(shù)據(jù)構(gòu)建的。此范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)被用來計算在不同星形孢菌素濃度下的斜率，并從斜率獲得起始速率。當線性配合的斜率是負值時，(分別為50和100nM的高星形孢菌素濃度)應(yīng)用為0的斜率。
圖8A和8B顯示在50Mm ATP，在相同范圍的星形孢菌素濃度時原始動力學數(shù)據(jù)(圖8A)和起始速率數(shù)據(jù)(圖8B)。如從圖8A中所看到的，信-噪比相對于圖7A有所改善。同樣，在這種情況下，用獲自2.5至13.5分鐘之間的數(shù)據(jù)來進行線性配合(圖8B)。
可用本領(lǐng)域已知的方法從起始速率計算IC50。IC50數(shù)據(jù)示于圖9。對此特定分析而言，發(fā)現(xiàn)在10、50、100和200μM ATP濃度下的IC50分別為5、6、10和16μM。這些IC50數(shù)值與文獻中所找到的那些數(shù)值對應(yīng)得很好。
或者，可以用終點分析測定IC50數(shù)值。圖10用圖解說明用此方法所得到的IC50值。在1小時反應(yīng)時間后測量熒光強度。這些數(shù)值通常比用初始速率測定的IC50數(shù)值高出4倍。
表4中顯示將分別用自起始速率和終點數(shù)據(jù)得到的IC50值進行比較。

IV.試劑盒本發(fā)明還提供了用于進行本發(fā)明的方法的試劑盒。在一個實施方式中，試劑盒包含至少一個用來檢測靶酶的酶底物，和用來制備便于酶反應(yīng)的反應(yīng)混合物的緩沖液。緩沖液可在容器中以干的形式或液體形式提供。特定緩沖液的選擇可取決于多種因素，例如所要檢測的酶的最適pH，底物中熒光部分的溶解度和熒光特性，以及從其中獲得靶酶的樣本的pH。通常將足夠在混合物中產(chǎn)生某一特定pH的量的緩沖液加入反應(yīng)混合物。在有些實施方式中，以儲存溶液的形式提供緩沖液，該儲存溶液具有預(yù)先選定的pH和緩沖液濃度。如上面所討論的，在與樣本混合后，緩沖液產(chǎn)生一個對酶分析來說適宜的最終pH。反應(yīng)混合物的pH也可用酸或堿滴定以達到一個最終的、所需要的pH。試劑盒可額外地包括對酶活性有利的其它成分，例如鹽(例如KCl，NaCl，或NaOAc)，金屬鹽(例如Ca2+鹽例如CaCl2，MgCl2，MnCl2，ZnCl2，或Zn(OAc)，洗滌劑(例如TWEEN20)，和/或可對特定酶有益的其它成分。這些其它成分可以彼此分開提供，或以干的或液體形式混合在一起。
酶底物也可以干的或液態(tài)形式與緩沖液一起或與緩沖液分開提供。為了促進在反應(yīng)混合物中溶解，酶底物可在易于與反應(yīng)混合物中的其它成分混合的水溶液、部分水溶液、或非水儲存溶液中提供。例如，除了水之外，底物溶液可還包含共溶劑例如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、甲醇或乙醇，通常是在1％-10％(v∶v)范圍內(nèi)。
對于檢測蛋白激酶活性來說，試劑盒可還包含一個磷酸鹽供給基團，例如ATP、GTP、ITP(肌苷三磷酸)或其它三磷酸核苷或三磷酸核苷類似物，它能被激酶用來對底物磷酸化。
根據(jù)下面的非限制性實施例，可進一步理解本發(fā)明的操作，這些實施例對本發(fā)明的多個方面進行了舉例說明。
實施例材料和方法A.試劑用于肽合成的樹脂和試劑，F(xiàn)moc氨基酸，5-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯獲自Applied Biosystems(Foster City，CA)。Fmoc-Lys(Mtt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(OPO(OBzl(OH)-OH和Fmoc-Dpr(ivDde)獲自Novabiochem。蛋白激酶A和蛋白激酶C獲自Promega(Madison，WI)。星形孢菌素和ATP獲自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)?；钚詓rc和蛋白激酶CβII獲自Upstate，Inc.(Lake Placid，NY)。所有其它化學藥品和緩沖液獲自Sigma/Aldrich。
B.儀器在Applied Biosystems 433A型肽合成儀上進行肽合成。在Agilent1100系列HPLC上進行HPLC。在Cary 3E UV-Vis分光光度計上進行UV-Vis測量。使用電霧化電離自PE Sciex API 150EX質(zhì)譜儀上獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
C.吸光度測量通過將純化的肽稀釋到1M pH 9 AMPSO(3-[1，1-二甲基-2-羥乙基]氨基)-2-羥基丙磺酸)緩沖液(5μL)中的三氟乙醇(500μL)、并且在染料的最大吸光度(對5-羧基熒光素來說是497nm)測量其吸光度來測定染料標記的肽的濃度。5-羧基熒光素的消光系數(shù)假定為80m000cm-1M-1。
D.分析反應(yīng)在環(huán)境溫度下進行酶分析反應(yīng)。在384孔、NBS、黑平板(Corning，NY)中進行蛋白激酶C分析反應(yīng)。
實施例1蛋白激酶檢測A.蛋白激酶底物(化合物1)如下述制備用于檢測蛋白激酶A的示例性酶底物棕櫚酰-FAM-S(OPO32-)LRRRRFSK(Ac)G-酰胺。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-L(R(Pmc))4FS(tBu)K(Mtt)G，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，并用二氯甲烷(DCM)中的5％三氟乙酸(TFA)1mL處理，生成特征性的黃色三苯甲基的顏色。通過加入0.1mL甲醇并洗滌(3×1mL二甲基甲酰胺，DMF)來沉淀樹脂。向樹脂中加入二異丙基乙胺(50μL)和封端溶液(1mL乙酸酐溶液(0.5M)和在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的羥基苯并三唑(0.015M))，將混合物攪拌10分鐘。洗樹脂(3×1mL DMF)，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)處理。4分鐘后，用DMF(6×1mL)洗樹脂。并用Fmoc-Ser(OPO(OBzl)OH)-OH(10mg)、偶聯(lián)溶液(50μL的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲鹽六氟磷酸鹽，0.45M)溶液)和HOBT(1-羥苯并三唑，0.45M)和二異丙基乙胺(20μL)處理樹脂。攪拌35分鐘后，用DMF(3×1mL)洗樹脂，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)處理。5分鐘后，樹脂用DMF洗(6×1mL)，并用4’-(對-(Fmoc-NHCH2)C6H4C(＝O)NHCH2)-5-FAM琥珀酰亞胺基酯)(10mg)和二異丙基乙胺(35μL)處理。攪拌1小時后洗樹脂(6×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶)處理。5分鐘后，樹脂用NMP洗(6×1mL)，并用棕櫚酰氯(5μL)和二異丙基乙胺(35μL)處理。攪拌16分鐘后，洗樹脂(3×1mLNMP，1×1mL 1∶1甲醇/DCM)，在真空離心機中干燥。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物溶解在水(0.5mL)中，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的10％-40％梯度在10分鐘的時間里(using a 10％to40％ gradient over 10min of 0.1％TFA in acetonitrile vs.0.1％TFA inwater)通過反向HPLC(Metachem Technologies柱150×4.6mm，PolarisC18，5μm)來純化。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝2141。
B.蛋白激酶活性的檢測制備包含20mM Tris緩沖液pH 8.5、Mg-ATP(1Mm)、cAMP(1μM)、和不同濃度的化合物1(0.15μM、0.3μM和0.6μM)的反應(yīng)混合物(1001μL)，隨后向其中加入蛋白激酶A的催化亞單位(2單位)。以500nm激發(fā)和530nm發(fā)射，以及5nm的隙縫寬度在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上監(jiān)測熒光。初始速率以雙倒數(shù)作圖進行作圖得到化合物1的Km的值為0.3μM。結(jié)果示于圖1和2。
實施例2磷酸酶檢測A.磷酸酶底物(化合物2)下面描述了示例性染料標記的肽，化合物2，棕櫚酰-LRRRRFS(OPO32-)K(5-FAM)G-酰胺的合成。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-LR(Pmc)4FS(OPO(OBzl)OH)K(Mtt)G，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。帶有羧基端的肽用Fmoc-Gly-PEG-PS樹脂構(gòu)建。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管，并用二氯甲烷(DCM)中的5％三氟乙酸(TFA)1mL處理，生成特征性的黃色三苯甲基的顏色。通過加入0.1mL甲醇并洗滌(3×1mL二甲基甲酰胺，DMF)來沉淀樹脂。向樹脂中加入5-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(5mg，10μmol)、二異丙基乙胺(30μL，173μmol)和DMF(100μL)，將混合物輕輕攪拌2-10小時。洗樹脂(5×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶1mL)處理5分鐘。樹脂用NMP(3×1mL NMP)洗。向樹脂中加入棕櫚酰氯(5μL)和二異丙基乙胺(35μL)，將混合物攪拌10分鐘。洗樹脂(3×1mL NMP，1×1mL 1∶1甲醇/DCM)，在真空離心機中干燥。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物溶解在水(0.5mL)中，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的10％-40％梯度在10分鐘的時間里通過反向HPLC(Metachem Technologies柱150×4.6mm，Polaris C18，5μm)來純化。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝1850。
B.磷酸酶活性的檢測在包含化合物2(20μM)、pH 9的TrisHCl緩沖液(50mM)和MgCl2(1mM)的100μL反應(yīng)混合物中進行磷酸酶反應(yīng)。通過加入在1-5μL中的0.5單位的大腸桿菌堿性磷酸酶來啟動反應(yīng)。以480nm激發(fā)和525nm發(fā)射，以及5nm的隙縫寬度在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上監(jiān)測熒光。結(jié)果示于圖3。
實施例3熒光的動態(tài)范圍此實施例描述了一項研究，以測定蛋白激酶A底物的磷酸化和非磷酸化形式之間在熒光上的不同。目的是為了確定化合物在將非磷酸化的形式進行磷酸化后能夠以良好信噪比提供熒光信號增大的程度。
A.候選底物(化合物3、3P、4、4P、5、5P、6和6P)既以磷酸化也以非磷酸化形式制備具有不同長度烷基酰基基團的一系列化合物(上面的方案3)，由下式代表X-Y(染料)LRRAS(OR)LG-NH2，其中X是CH3(CH2)xC(＝O)-形式的脂肪酸?；鶊F，x是0、7、10或14，Y是α-氨甲基甘氨酸，染料是通過與染料的側(cè)鏈苯環(huán)進行5-羰基連接而附著于Y的2-氨基氮原子的4，7-二氯熒光素，并且R是H或PO32-。
對化合物3-6而言，使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-L(R(Pmc)2AS(tBu)LG，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。下面是化合物4的代表性合成。
將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，并用哌啶(在DMF中的20％哌啶1mL)處理。5分鐘后，樹脂用DMF洗(6×1mL)，并用Fmoc-Dpr(ivDde)(20mg)、偶聯(lián)溶液(100μL，組成見上)和二異丙基乙胺(40μL)處理。攪拌20分鐘后，洗樹脂(4×1mL DMF)，并用哌啶(在NMP中的20％哌啶1mL)處理。洗樹脂(4×1mL NMP)，并周壬酰氯(5μL)和二異丙基乙胺(30μL)處理。攪拌20分鐘后，洗樹脂(5×1mL NMP)，并用肼(在DMF中的2％，1mL)處理。5分鐘后，洗樹脂(5×1mL DMF)，并用4，7-二氯-5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(4mg)和二異丙基乙胺(30μL)處理。1小時后，洗樹脂(10×1mL DMF，1×1mL 1∶1甲醇∶二氯甲烷)，在真空離心機中干燥。如上述將肽從樹脂上切割、純化和分析。
除了用乙酸酐(化合物3)、月桂基氯(化合物5)或棕櫚酰氯(化合物6)取代壬酰氯之外，以同樣方式制備化合物3、5和6。除了使用PAL樹脂上的肽fmocLR(Pmc)2AS(OPO(OBzl)OH)LG外，類似于化合物3-6制備化合物3P、4P、5P和6P。
B.熒光的動態(tài)范圍將不同化合物的溶液稀釋到100mM TrisHCl緩沖液pH 8.5中至終濃度5μM。通過稀釋到三氟乙醇來測定儲備溶液的濃度，并假定染料的消光系數(shù)為80,000cm-1M-1。以500nm激發(fā)和546nm發(fā)射在Perkin-ElmerLS-50B熒光分光計上測量熒光。隙縫寬度對稀釋溶液來說是5nm，對大多數(shù)高度熒光的溶液來說是3nm、具有衰減因數(shù)4.4。結(jié)果示于上面表2。
實施例4蛋白激酶檢測(化合物7)A.蛋白激酶A底物(化合物7)下面描述了示例性染料標記的肽，化合物7，N-(1H，1H，2H，2H-全氟癸基-1-硫羥-2-乙?；?-K-(5-羧基磺基熒光素)LRRASLG-酰胺。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-K(ivDde)LRRASLG，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)處理20分鐘，以除去FMOC保護基。樹脂隨后用3×1mL DMF、接著用3×1mL二氯甲烷(DCM)洗?；旌系庖宜?2.5mg，13μmol)、在乙酸乙酯(EtOAc)(70μL，13μmol)中的0.2M二環(huán)己基碳二亞胺、在EtOAc(200μL，40μmol)中的0.2M N-羥基琥珀酰亞胺、和DMF(100μL)，使其靜置30分鐘。將此混合物加入樹脂，輕輕攪拌3小時。用5×1mL DMF，隨后用5×1mL DCM洗樹脂。將在100μL DMF中的1H，1H，2H，2H-全氟癸基-1-硫醇(35mg，75μmol)加入樹脂，輕輕攪拌15小時。用5×1mLDMF，隨后用5×1mL DCM洗樹脂。用DMF中的10％肼(500μL)處理樹脂20分鐘以除去ivDde保護基團。用3×1mL DMF，隨后用3×1mL DCM洗樹脂。將5-羧基磺基熒光素(5mg，10μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μl，18μmol)、2M在NMP中的二異丙基乙胺(20μL，40μmol)和DMF(100μL)加入樹脂，將混合物輕輕攪拌3小時。用5×1mL DMF，隨后用5×1mLDCM洗樹脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物用3×1mL己烷洗來進行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分鐘時間內(nèi)用反向HPLC(Agilent柱150×4.6mm，300Extend，5μM)來純化。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝1814。
B.蛋白激酶活性的檢測在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上收集熒光數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)包含化合物7(1μM)、Tris緩沖液pH 8.1(20mM)、MgCl2(1mM)和蛋白激酶A(35單位)的100μL溶液在480nm激發(fā)和520nm發(fā)射的熒光為35熒光單位。將ATP加至終濃度0.5mM，并監(jiān)測熒光，熒光在6分鐘后達到最大值180熒光單位，或增強5倍。
實施例5蛋白激酶檢測(化合物8)A.蛋白激酶A底物(化合物8)下面是示例性激酶底物，化合物8，(5-羧基-2，7-二吡啶基-磺基熒光素)-K-(N-全氟-辛酰基-脯氨酸)-LRRASLG-酰胺的合成。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-K(ivDde)LRRASLG，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)處理20分鐘，以除去FMOC保護基。用3×1mL DMF，隨后用3×1mL DCM洗樹脂。向樹脂中加入5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基熒光素(5mg，9μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μl，18μmol)、NMP(20μL，40μmol)中的2M二異丙基乙胺和DMF(100μL)，將混合物輕輕攪拌3小時。用5×1mL DMF，隨后用5×1mL DCM洗樹脂。用DMF中的10％肼(500μL)處理樹脂20分鐘以除去ivDde保護基團。樹脂用3×1mL DMF、隨后用3×1mL DCM洗。將N-全氟-辛?；?L-脯氨酸(25mg，49μmol)(通過Curran和Luo，JACS 1999，121，9069-9072的方法制備)、0.45M HOBT/HBTU(40μL，18μmol)和2M DIPEA/NMP(20μl，40μmol)加入樹脂，輕輕攪拌15小時。用5×1mL DMF，隨后用5×1mL DCM洗樹脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物用3×1mL己烷洗來進行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分鐘時間內(nèi)用反向HPLC純化(Agilent柱150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝1940。
B.蛋白激酶活性的檢測在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上收集熒光數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)包含化合物8(1μM)、Tris緩沖液pH 8.1(20mM)、MgCl2(1mM)和蛋白激酶A(35單位)的100μL溶液在520nm激發(fā)和550nm發(fā)射的熒光為140熒光單位。將ATP加至終濃度0.5mM，并監(jiān)測熒光，熒光在5分鐘后達到最大值493熒光單位，或增強3.5倍。
實施例6蛋白激酶檢測(化合物9)
A.蛋白激酶A底物(化合物8)下面描述了示例性底物，化合物9，N-乙?；鵕GRPRTSSFAEGOOOK(N-5-羧基磺基熒光素)K(N-十八?；?-酰胺的合成，其中O是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙?；鶊F所提供的接頭。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽N-乙?；鵕GRPRTSSFAEG(AEEA)3K(ivDde)K(Mtt)，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管，用二甲基甲酰胺(DMF)中的5％三氟乙酸(TFA)處理(4×200μL，每次處理等待5分鐘)，以除去mtt保護基團。然后用3×1mLDMF、再用3×1mL二氯甲烷(DCM)洗樹脂，并且用硬脂酸(25mg，88μmol)、0.45M HOBT/HBTU(100μl，45μmol)、NMP中的2MDIPEA(40μL，80μmol)和DMF(200μL)處理樹脂。輕輕攪拌混合物2小時，用3×1mL DMF、隨后用3×1mL DCM洗樹脂。用DMF中的10％肼(500μL)處理樹脂20分鐘以除去ivDde保護基團，隨后用3×1mL DMF和3×1mLDCM洗樹脂。向樹脂中加入5-羧基-磺基熒光素(5mg，9μmol)、0.45MHOBT/HBTU(40μl，18μmol)、NMP中的2M二異丙基乙胺(20μL，40μmol)和DMF(100μL)，將混合物輕輕攪拌3小時。用5×1mL DMF、隨后用5×1mL DCM洗樹脂。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物用3×1mL己烷洗來進行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分鐘時間內(nèi)用反向HPLC(Agilent柱150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)來純化。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝2714。
B.蛋白激酶活性的檢測在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上收集熒光數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)包含化合物9(1μM)、Tris緩沖液pH 8.1(20mM)、MgCl2(1mM)和ATP(0.5mM)的100μL溶液在480nm激發(fā)和520nm發(fā)射的熒光為50熒光單位。加入蛋白激酶A(7單位)，并監(jiān)測熒光，熒光在3分鐘后達到最大值420熒光單位，或增強8倍。
實施例7蛋白激酶檢測(化合物10)A.蛋白激酶C底物(化合物10)下面描述了(N-棕櫚酰)-Lys(N-5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基熒光素)-OOO-RREGSFR-酰胺的合成?？s寫O描述的是2-氨基乙氧基-2-乙氧乙?；鶊F所提供的接頭。使用標準FastMocTM化學法在625mg的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.16mmol/g經(jīng)由固相肽合成構(gòu)建肽Fmoc-OOOK(ivDde)RREGSFR，該樹脂是生成羧基酰胺肽的固體支持物。將最終受保護的肽-樹脂的一部分(20mg，2μmol肽)轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，并用二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶(500μL)處理20分鐘，以除去fmoc保護基。用3×1mL DMF、隨后用3×1mL DCM洗樹脂。向樹脂中加入棕櫚酸(20mg，78μmol)、0.45M HOBT/HBTU(100μl，45μmol)、2M二異丙基乙胺/NMP(40μL，80μmol)，輕輕攪拌2小時，隨后進行上述洗滌。通過用DMF中的10％肼(500μL)處理樹脂20分鐘以除去ivDde保護基團。用3×1mL DMF、隨后用3×1mL DCM洗樹脂。
向樹脂中加入5-羧基-2’，7’-二吡啶基-磺基熒光素(5mg，9μmol)、0.45M HOBT/HBTU(40μL，18μmol)、NMP中的2M DIEPA(20μL，40μmol)和DMF(100μL)，將混合物輕輕攪拌3小時。用5×1mL DMF，隨后用5×1mL DCM洗樹脂。然后用DMF中的20％哌啶(500μL)、隨后用5×1mLDCM洗樹脂，以除去染料相關(guān)的雜質(zhì)。用1mL切割溶液(950μL TFA，50μL水，25μL三異丙硅烷，和25μL苯硫基甲烷)將肽從樹脂上切割。1.5至2小時后，將混合物過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機上將濾液濃縮至干燥。殘余物用3×1mL己烷洗來進行研制，其一部分用乙腈中0.1％TFA相對于水中0.1％TFA的25％-70％梯度、在25分鐘時間內(nèi)用反向HPLC(Agilent柱150×4.6mm，300 EXTEND，5μm)來純化。染料標記的肽通過ESI質(zhì)譜儀進行分析，其得到所期望的M/z＝2255。
B.蛋白激酶C分析操作將蛋白激酶C反應(yīng)混合物等分部分(每份9μL)加入384孔平板的孔中，該等分部分包含2μL 5×緩沖液(由100mM Tris，pH 8.1+25mM MgCl2，和0.5％v/vβ-巰基乙醇組成)、1μL Upstate類脂活化劑、0.05μL Promega蛋白激酶C、5.55μL去離子水和0.4μL底物。通過向每孔中加入1μLSigma-A1drich ATP來啟動反應(yīng)。在Molecular Devices Gemini平板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上收集數(shù)據(jù)，該讀數(shù)儀設(shè)置為500nm激發(fā)和550nm發(fā)射。結(jié)果示于表3。
實施例8蛋白激酶A的抑制A.蛋白激酶A底物具有N-棕櫚?；?α-(2-氨甲基)甘氨酸(5-羧基-砜熒光素)LeuArgArgAlaSer(OH)LeuGly-NH2(N-pahnitoyl-alpha-(2-aminomethyl)glycine(5-carboxy-sulfonefluorescein)LeuArgArgAlaSer(OH)Leu-Gly-NH2)結(jié)構(gòu)的熒光PKA底物(化合物11)通過與制備上面化合物6所用的方法類似的方法制備，但有如下改變。不是將棕櫚酰氯，而是將棕櫚酸(5mg)、偶聯(lián)溶液(100μL)、和二異丙基乙胺(30μL)添加到疏水部分。此外，附著熒光染料的反應(yīng)涉及使用5-羧基砜熒光素(5mg)、偶聯(lián)溶液(50μL)和二異丙胺(20μL)。這導(dǎo)致熒光染料附著到N末端α-(2-氨甲基)甘氨酸殘基的α-氨基基團，并且5-羧基-砜熒光素通過與染料的5-羰基基團進行酰胺連接而附著到同一殘基的2-氨甲基基團的2-氨基氮。
B.激酶活性的抑制制備包含20mM Tris-HCl pH 8.1、1mM MgCl2、1μM化合物和3單位蛋白激酶A的反應(yīng)混合物(100μL)。加入ATP至終濃度50、10、3和2μM以啟動反應(yīng)。以480nm激發(fā)和520nm發(fā)射在Perkin-Elmer LS-50B熒光分光計上收集熒光數(shù)據(jù)。在星形孢菌素(5nM)或PKA特異性肽抑制劑(20nM)TYADFIASGRTGRRNAI存在下重復(fù)該分析。結(jié)果示于圖4。
實施例9蛋白激酶C-βII的抑制A.蛋白激酶C-βII底物制備具有如下結(jié)構(gòu)(化合物12)的PKC底物α-棕櫚?；?Lys(ε-N-5-羧基-砜熒光素)S(OPO32-)KLKRQGSFKY-酰胺(alpha-palmitoyl-Lys(ε-N-5-carboxy-sulfonefluorescein)S(OPO32-)KLKRQGSFKY-amide)，其中棕櫚?；ㄟ^酰胺鍵連接于N末端賴氨酸殘基的α氨基基團，并且熒光素染料通過與染料的5-羧基基團之間的酰胺鍵連接于同一賴氨酸殘基的ε氮原子。合成步驟與上面描述的PKA底物的合成步驟類似，只是在PAL樹脂上形成Fmoc-S(PO(OBzl)OH)KLKRQGSFKY，并且Fmoc-Dpr(ivDde)被Fmoc-Lys(ivDde)代替。
B.PKC活性的抑制制備反應(yīng)混合物(100μL)，該反應(yīng)混合物包含20mM Tris-HCl pH 8.1、1mM MgATP、10μL Upstate類脂活化劑、2.5μM PKC-βII底物(化合物8)和各種劑量的抑制劑星形孢菌素(0、2、5和10nM)。通過加入8ng PKC-βII酶以啟動反應(yīng)。在Molecular Devices Gemini平板讀數(shù)器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上收集數(shù)據(jù)，該讀數(shù)器設(shè)置為動態(tài)模式的485nm激發(fā)和520nm發(fā)射。結(jié)果示于圖5。
實施例10pp60c-src相關(guān)的蛋白酪氨酸激酶的檢測A.蛋白酪氨酸激酶底物制備具有如下結(jié)構(gòu)的底物(化合物13)N-棕櫚酰基-Lys(ε-N-5-羧基-砜熒光素)KVEKIGEGTYGVVKK-酰胺(N-palmitoyl-Lys(ε-N-5-carboxy-sulfonefluorescein)KVEKIGEGTYGVVKK-amide)。合成步驟類似于合成化合物8所使用的步驟，只是使用了肽樹脂F(xiàn)moc-Lys(ivDde)-KVEKIGEGTYGVVKK。結(jié)果示于圖6。
B.酪氨酸激酶活性在Molecular Devices Gemini平板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上追蹤熒光信號，該讀數(shù)器設(shè)置為動態(tài)模式的485/520nm激發(fā)/發(fā)射波長。使用Corning 384孔平板中的5孔，將非結(jié)合表面和低容量孔涂黑(black with a non-binding surfacee and low volume wells)(目錄號3676)(Corning，Inc.，Acton，MA)。每孔包含5μL溶液，該溶液包含化合物9(2.5μM)、MgCl2(1mM)、Tris緩沖液pH 8.2(20mM)和活性src(1單位，目錄號14-326)。通過在其中的3孔中加入1.25μL ATP(200μM)至終濃度50μM來啟動激酶反應(yīng)。結(jié)果示于圖6。
實施例11
星形孢菌素的蛋白激酶CIC50A.蛋白激酶C底物實施例7中描述的化合物10是此研究所使用的底物。
B.蛋白激酶C分析酶濃度為10μL體積中的0.15ng/μl，其包含20mM Tris-HCl pH 8.1，1mM Mg2+，10％類脂活化劑，具有圖9圖例中所指定的ATP濃度。所使用的底物是化合物10，終濃度對所有反應(yīng)來說都是3μM。用MolecularDevice平板讀數(shù)器上的515nm截止濾波器在480nm激發(fā)樣本而在520nm監(jiān)測熒光強度。
本文中所提及的所有公開和專利申請均在此引入作為參考，就如同每一公開和專利申請都特別地和逐個地被指示引入作為參考。
雖然本發(fā)明參照了某些例證性的實施方式和實施例來進行描述，應(yīng)被理解為可對其進行各種修飾和改變，而不偏離本發(fā)明的保護范圍和精神。
權(quán)利要求
1.一種底物化合物，該底物化合物包含能夠?qū)⑺龌衔镎先胛F的疏水部分、熒光部分和酶識別部分。
2.權(quán)利要求1的底物化合物，所述底物化合物在pH為大約pH8的水溶液中具有凈中性電荷。
3.權(quán)利要求1的底物化合物，其中所述酶識別部分包含蛋白激酶識別序列，所述蛋白激酶識別序列包括至少一個能被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化殘基。
4.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述至少一個非磷酸化殘基是酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
5.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶識別序列被TK激酶、AGC激酶、CAMK激酶、CMGC激酶、STE激酶、TKL激酶、CKI激酶或?qū)儆凇捌渌钡慕M的激酶所識別。
6.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶識別序列被蛋白激酶A、蛋白激酶C、Src激酶、Lyn激酶、Fyn激酶、Akt激酶、MAP激酶、MAPKAP2激酶或cAMP依賴性激酶所識別。
7.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述蛋白激酶識別序列包含選自如下的肽序列-R-R-X-S/T-Z- (SEQ ID NO1)；-R-X-X-S/T-F-F- (SEQ ID NO2)；-S/T-P-X-R/K- (SEQ ID NO3)；-P-X-S/T-P- (SEQ ID NO4)；-K-K-K-K-R-F-S-F-K- (SEQ ID NO5)；-X-R-X-X-S-X-R-X- (SEQ ID NO6)；-L-R-R-L-S-D-S-N-F- (SEQ ID NO7)；-K-K-L-N-R-T-L-T-V-A- (SEQ ID NO8)；-E-E-I-Y-E/G-X-F- (SEQ ID NO9)；-E-I-Y-E-X-I/V- (SEQ ID NO10)-I-Y-M-F-F-F- (SEQ ID NO11)；-Y-M-M-M- (SEQ ID NO12)；-E-E-E-Y-F- (SEQ ID NO13)；-L-R-R-A-S-L-G- (SEQ ID NO14)；-R-Q-G-S-F-R-A- (SEQ ID NO15)；-R-I-G-E-G-T-Y-G-V-V-R-R-(SEQ ID NO16)；-R-P-R-T-S-S-F- (SEQ ID NO17)；-P-R-T-P-G-G-R- (SEQ ID NO18)；-R-L-N-R-T-L-S-V-(SEQ ID NO19)；和其類似物和保守性突變體，其中X代表任何殘基，并且Z代表疏水殘基。
8.權(quán)利要求3的底物化合物，所述底物化合物在pH為大約pH8的水溶液中具有凈中性電荷。
9.權(quán)利要求3的底物化合物，所述底物化合物具有如下結(jié)構(gòu) 其中m是4到28的整數(shù)；n是3到15的整數(shù)；p是1到6的整數(shù)；L1是任選的接頭；染料是熒光染料，所述熒光染料任選包括將染料連接到圖示的相鄰羰基基團的接頭；每個X1是不依賴于其它的氨基酸側(cè)鏈；并且X2是OR或NH2，其中R是氫或包含1到8個碳原子的烷基，附帶條件是底物化合物的圖示-[NH-CH(X1)C(O)]n-X2部分包括至少一個能被蛋白激酶磷酸化的殘基。
10.權(quán)利要求9的底物化合物，其中L1是-[CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2C(O)NH]q-，其中q是0、1、2或3。
11.權(quán)利要求9的底物化合物，其中所述染料包含熒光素或羅丹明染料。
12.權(quán)利要求11的底物化合物，其中所述染料包含選自如下的任選取代的結(jié)構(gòu) 和 其中X3是-C(O)O-或-SO3-，并且虛線指示與圖示結(jié)構(gòu)余下部分的附著點。
13.權(quán)利要求12的底物化合物，其中所述染料具有染料2結(jié)構(gòu)
14.權(quán)利要求9的底物化合物，其中所述底物化合物的圖示-[NH-CH(X1)C(O)]n-部分是選自如下的肽LRRASLG (SEQ ID NO14)；RQGSFRA (SEQ ID NO15)；RIGEGTYGVVRR (SEQ ID NO16)；RPRTSSF (SEQ ID NO17)；PRTPGGR (SEQ ID NO18)；和RLNRTLSV (SEQ ID NO19)。
15.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分包含具有6到30個碳原子的取代或非取代的、飽和或不飽和的烴。
16.權(quán)利要求15的底物化合物，其中所述烴是線性的、分枝的或環(huán)狀的、飽和的或不飽和的烷基。
17.權(quán)利要求16的底物化合物，其中所述烴是含有10到26個碳原子的線性烷基。
18.權(quán)利要求17的底物化合物，其中所述烷基是完全飽和的正烷基。
19.權(quán)利要求17的底物化合物，其中所述烷基包括一個或更多碳-碳雙鍵和/或一個或更多碳-碳三鍵，其中每一個所述碳-碳雙鍵可以不依賴于其它的是順式或反式構(gòu)型。
20.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分含有至少一個帶正電荷的基團。
21.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分含有至少一個帶負電荷的基團。
22.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述熒光部分包含一種選自如下的染料呫噸染料、羅丹明染料、熒光素染料、花青染料、酞菁染料、方酸染料和bodipy染料。
23.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述熒光部分包含熒光給體部分和熒光受體部分。
24.權(quán)利要求23的底物化合物，其中所述熒光給體部分包含熒光素染料。
25.權(quán)利要求23的底物化合物，其中所述熒光受體部分包含熒光素或羅丹明染料。
26.權(quán)利要求25的底物化合物，其中所述熒光給體部分包含熒光素染料。
27.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述熒光部分包含少于150個的原子。
28.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分和所述酶識別部分通過所述熒光部分彼此連接。
29.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分和所述熒光部分通過所述酶識別部分彼此連接。
30.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分、所述熒光部分和所述酶識別部分經(jīng)由三價接頭彼此連接。
31.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分通過接頭連接于所述熒光部分，所述接頭不包括所述酶識別部分的一部分。
32.權(quán)利要求3的底物化合物，其中所述疏水部分通過接頭連接于所述熒光部分，所述接頭包括所述酶識別部分的至少一部分。
33.權(quán)利要求1的底物化合物，其中所述酶識別部分包含磷酸酶識別序列，所述磷酸酶識別序列包括至少一個能夠被磷酸酶脫磷酸化的磷酸化殘基。
34.權(quán)利要求33的底物化合物，所述底物化合物在pH為大約pH8的水溶液中具有凈中性電荷。
35.檢測樣本中存在的酶的活性的方法，包含如下步驟將樣本與包含根據(jù)權(quán)利要求1的底物化合物的組合物接觸，其中所述底物化合物的酶識別部分被所述酶識別，其有效條件是在所述酶存在于樣本中時可修飾所述底物化合物，從而導(dǎo)致所述底物化合物的熒光部分產(chǎn)生的熒光信號增大；并且檢測熒光信號，其中熒光信號增大指示樣本中酶的存在和/或數(shù)量。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述底物化合物以等于或高于其臨界微團濃度的濃度存在。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述熒光信號作為時間的函數(shù)被檢測。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述組合物還包含淬滅化合物，所述淬滅化合物包含能夠?qū)⑺龃銣缁衔镎先胛F的疏水部分，和能夠淬滅所述底物化合物的熒光部分的熒光的淬滅部分。
39.權(quán)利要求35的方法，所述方法還包含確定所述樣本中酶的Km值或Kcat值。
40.鑒定調(diào)節(jié)酶活性的化合物的方法，包含如下步驟在候選調(diào)節(jié)劑化合物存在時，將所述酶與包含根據(jù)權(quán)利要求1的底物化合物的組合物接觸，其中所述底物化合物中的酶識別部分被所述酶所識別，其有效條件是允許所述酶修飾所述底物化合物，從而導(dǎo)致所述底物化合物的熒光部分產(chǎn)生的熒光信號增大；并且檢測熒光信號，其中與對照反應(yīng)或標準曲線相比熒光信號的增大或減小指示所述候選調(diào)節(jié)劑化合物調(diào)節(jié)所述酶的活性。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑化合物是所述酶活性的已知調(diào)節(jié)劑，并且所述方法被用來評價所述調(diào)節(jié)劑化合物對所述酶活性的影響。
42.權(quán)利要求40的方法，所述方法被實施來鑒定酶活性的抑制劑，其中與對照反應(yīng)或標準曲線相比熒光信號的減小指示所述候選調(diào)節(jié)劑化合物抑制所述酶的活性。
43.權(quán)利要求42的方法，所述方法還包含確定所述抑制劑化合物的Ki。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑化合物是所述酶的活性的已知抑制劑，并且所述方法被用來確定所述化合物的Ki。
45.檢測樣本中一個或更多蛋白激酶的磷酸化活性的方法，包含如下步驟將樣本與包含蛋白激酶底物的組合物接觸，該蛋白激酶底物包含(1)蛋白激酶識別部分，所述蛋白激酶識別部分含有至少一個能夠被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化殘基，(2)能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分，和(3)熒光部分，其有效條件是在當樣本中存在所述蛋白激酶時使得所述殘基磷酸化，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號；并且檢測熒光信號，其中熒光信號增大指示樣本中所述蛋白激酶的磷酸化活性的存在和/或量。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述蛋白激酶底物是根據(jù)權(quán)利要求3-32任一項的底物化合物。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述熒光信號作為時間的函數(shù)被檢測。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述組合物還包含淬滅化合物，所述淬滅化合物包含能夠?qū)⑺龃銣缁衔镎先胛F的疏水部分，和能夠淬滅所述蛋白激酶底物的熒光部分的熒光的淬滅部分。
49.權(quán)利要求45的方法，所述方法還包含確定所述樣本中蛋白激酶的Km值或Kcat值。
50.鑒定調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化活性的化合物的方法，包含如下步驟在候選化合物存在時，將蛋白激酶與包含蛋白激酶底物的組合物接觸，所述蛋白激酶底物包含(1)蛋白激酶識別部分，所述蛋白激酶識別部分含有至少一個能夠被蛋白激酶磷酸化的非磷酸化殘基，(2)能夠?qū)⒌孜镎先胛F的疏水部分，和(3)熒光部分，其有效條件是允許所述殘基被蛋白激酶磷酸化，從而增大熒光部分所產(chǎn)生的熒光信號；并且檢測熒光信號，其中與對照反應(yīng)或標準曲線相比熒光信號增大或減小指示所述候選化合物調(diào)節(jié)所述蛋白激酶的活性。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述候選化合物是所述蛋白激酶磷酸化活性的已知調(diào)節(jié)劑，并且所述方法被用來評價所述化合物對所述蛋白激酶磷酸化活性的影響。
52.權(quán)利要求50的方法，所述方法被實施來鑒定所述蛋白激酶磷酸化活性的抑制劑，其中與對照反應(yīng)或標準曲線相比熒光信號的減小指示所述候選化合物抑制所述蛋白激酶的磷酸化活性。
53.權(quán)利要求50的方法，所述方法還包含確定所述抑制劑化合物的Ki。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述候選化合物是所述蛋白激酶磷酸化活性的已知調(diào)節(jié)劑，并且所述方法被用來確定所述化合物的Ki。
55.權(quán)利要求50的方法，其中所述組合物還包含淬滅化合物，所述淬滅化合物包含能夠?qū)⑺龃銣缁衔镎先胛F的疏水部分，和能夠淬滅所述蛋白激酶底物的熒光部分的熒光的淬滅部分。
全文摘要
披露了檢測和/或表征酶的熒光組合物和方法及其各種用途。
文檔編號C12Q1/00GK1697880SQ03825013
公開日2005年11月16日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日
發(fā)明者羅納德·J·格雷厄姆, 林達·G·李, 理查德·L·諾布爾, 孫洪業(yè) 申請人:阿普爾拉股份有限公司