專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)von willebrand 因子切割酶的抗體及利用所述抗體的分析系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及倫理藥物領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)。具體地，本發(fā)明涉及特異于參與血液凝固的von Willebrand因子(von Willebrand因子在下文中也稱(chēng)為vWF)的切割酶(在下文中也稱(chēng)為ADAMTS-13)的全長(zhǎng)或部分片段及其抗體。通過(guò)本發(fā)明提供的針對(duì)ADAMTS-13的抗體開(kāi)發(fā)了有效制備高純度酶的可能性，該酶可用于診斷酶的缺失和降低，例如血栓性血小板減少性紫癜(在下文中也稱(chēng)為T(mén)TP)、或用于診斷該酶蛋白質(zhì)的自身抗體-陽(yáng)性患者、以及用于酶替代療法患有與此相關(guān)的疾病的患者。在另一個(gè)方面，它能夠鑒別由于彌漫性血管內(nèi)凝血(在下文中也縮寫(xiě)為DIC)等造成的血小板降低和由于先天性或獲得性的TTP造成的血小板降低，并且在血小板注射時(shí)提供指標(biāo)。此外，可以展望其用作新的抗-ADAMTS-13的藥物。
背景技術(shù)：
vWF是由血管內(nèi)皮細(xì)胞或骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生的血液凝固因子，并且以通過(guò)S-S鍵結(jié)合的由具有2,050個(gè)氨基酸殘基的單一類(lèi)型亞基(單體為大約250kDa)以及組成的多聚體結(jié)構(gòu)(分子量為500至20,000kDa)存在。血液濃度是大約10μg/ml，并且一般地分子量越高的分子特異活性越高。
vWF作為血液凝固因子有2個(gè)主要功能；一個(gè)功能是作為結(jié)合和穩(wěn)定血液凝固因子VIII的載體蛋白質(zhì)，而另一個(gè)功能是容許血小板粘附和聚集至損傷的血管壁處血管內(nèi)皮細(xì)胞下的組織并且形成血小板栓。
血栓性血小板減少性紫癜(TTP)是在機(jī)體組織小動(dòng)脈和遍及機(jī)體的毛細(xì)血管中形成血小板栓的疾病，盡管近代醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，與該疾病相關(guān)的致死率在1971至1991間增加了大約3倍。病理學(xué)上TTP被認(rèn)為是由血管內(nèi)皮細(xì)胞紊亂和血管中血小板凝集所引起的，并且在形成的血小板栓中觀察到免疫組織學(xué)顯著數(shù)量的vWF，推測(cè)vWF在其起源中扮演重要角色。在患有TTP的患者中，vWF的多聚體結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)于正常的或高分子的vWF，特別地，推測(cè)在高剪切應(yīng)力下很少觀察到的異常大的vWF多聚體(ULvWFM)和大的vWF多聚體(LvWFM)在促進(jìn)血小板凝集和微血栓形成中扮演重要角色。同時(shí)，已知在高剪切應(yīng)力下，健康人的循環(huán)血液中，在vWF切割酶(vWF-切割蛋白酶)的作用下，vWF在842Tyr-843Met的位置分解。因此，就TTP而言，在假定的情況下，通過(guò)一些原因降低血漿中上述酶的活性，ULvWFM至LvWFM的增加增強(qiáng)了血小板凝集，由此導(dǎo)致在血管中形成血小板栓。
編碼具有這種酶活性的活性主要部分的vWF切割酶的基因亦稱(chēng)為ADAMTS-13，是由本申請(qǐng)的申請(qǐng)人在2001年克隆的(WO 02/088366)。關(guān)于ADAMTS-13分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)概括如下。
就ADAMTS-13的結(jié)構(gòu)域組成而言，信號(hào)肽后是前肽，隨后是弗林蛋白酶裂解基序的RQRR序列，其后是包含由HEXXHXXGXXHD共有序列組成的reprolysin型鋅螯合區(qū)域的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域(至P285終止)。通過(guò)在蛇毒金屬蛋白酶中發(fā)現(xiàn)的解聚素-樣結(jié)構(gòu)域(至W387終止)，它與由大約50至60個(gè)殘基組成的第一個(gè)Tsp1基序(Tsp1-1)連接，一般認(rèn)為該基序?qū)τ诜肿幼R(shí)別是很重要的(至Q449終止)，并且進(jìn)一步地延伸至包括了RGDS序列，一種細(xì)胞粘附基序的富含Cys的區(qū)域(至T581終止)。隨后，經(jīng)過(guò)大約130個(gè)氨基酸殘基組成的、不包含半胱氨酸殘基的間隔結(jié)構(gòu)域(至W688終止)，再接附加的7個(gè)Tsp1基序(Tsp1-2至8)，以及延伸為CUB結(jié)構(gòu)域-1和-2，已知該結(jié)構(gòu)域首先是在補(bǔ)體成分C1r或C1s中發(fā)現(xiàn)的。
但尚未建立對(duì)于這個(gè)酶的有效的和高純度的純化方法，也未建立用于定性和/或定量診斷這個(gè)酶的存在數(shù)量的方法。此外，還未建立用于診斷該酶的自身抗體-陽(yáng)性患者的方法，并且也沒(méi)有鑒定對(duì)該酶活性表達(dá)必不可少的結(jié)構(gòu)域。
發(fā)明公開(kāi)既然如此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供對(duì)ADAMTS-13具有高選擇性的免疫活性抗體。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于制備該抗體的方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供該抗體的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供能夠鑒定上述抗體或來(lái)源于自身抗體-陽(yáng)性患者抗體的存在或其識(shí)別區(qū)域的全長(zhǎng)或部分缺失的ADAMTS-13分子。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供用于制備這種全長(zhǎng)或修飾分子的方法。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供這種全長(zhǎng)或修飾分子的應(yīng)用。
作為治療患有先天性缺乏特異的vWF切割酶的患者以及該酶的后天性抗體陽(yáng)性患者的方法，迄今只是進(jìn)行血漿替代治療并且需要用純的酶，例如該酶的純化產(chǎn)物或重組體建立替代治療。據(jù)報(bào)道患有家族性TTP的患者先天性缺乏特異的vWF切割酶，而非家族性的TTP是由于產(chǎn)生對(duì)該酶的自身抗體而后天引起的。因此，用該酶進(jìn)行替代治療對(duì)于家族性的TTP患者(實(shí)際上進(jìn)行血漿施用)是合乎需要的，而通過(guò)血漿交換除去自身抗體并且補(bǔ)充這種酶對(duì)于非家族性的病例是符合需要的。
因此，需要有效的制備方法或?qū)@種酶的診斷等，但是不能通過(guò)根據(jù)由本申請(qǐng)人的在前申請(qǐng)(WO 02/088366)所描述的方法或其他方法(參見(jiàn)，例如，Kokame，K.等，″Proc.N.A.S.USA″，2002，vol.99，pp.11902-11907；Fujikawa，K.等，″Blood″，2001，vol.98，pp.1662-1666)，從血漿或表達(dá)重組體的上清液純化酶的方法預(yù)期得到足夠純度和產(chǎn)率的vWF切割酶。此外，迄今為止還未存在用于測(cè)定這種酶的數(shù)量，特別是測(cè)定該酶作為適量抗原的數(shù)量的技術(shù)。此外，在血小板減少癥的情況下，當(dāng)此狀況不是由DIC而是由TTP作為原發(fā)性疾病所引起時(shí)，存在例如由血小板注射引起的惡化病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，本發(fā)明旨在提供針對(duì)vWF切割酶的抗體來(lái)解決這些問(wèn)題。這些抗體能夠定量和純化vWF。
在上述情況下，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究來(lái)實(shí)現(xiàn)vWF切割酶的分離和鑒定，結(jié)果是我們已經(jīng)成功地純化和分離尚未有報(bào)道的所需要的vWF切割酶，并且已經(jīng)鑒定了成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的基因(WO 02/088366)。
為了鑒定被認(rèn)為對(duì)表達(dá)活性必不可少的區(qū)域，我們制備從C-末端側(cè)面的CUB結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生連續(xù)缺失的修飾分子，并且測(cè)定vWF切割活性。從該研究中證實(shí)在由SEQ ID No.1中從第688位的附近到N-末端的氨基酸組成的分子中仍可定性地保持酶活性，該區(qū)域被稱(chēng)為間隔結(jié)構(gòu)域。另一方面，證實(shí)在由達(dá)到第581位附近的氨基酸組成的分子中，妨礙了正常的分泌，并且觀察到其分泌到培養(yǎng)上清液中但是酶活性是微弱的，或者在由達(dá)到第449位附近的氨基酸組成的分子中沒(méi)有觀察到分泌，這些發(fā)現(xiàn)表明了對(duì)本發(fā)明的酶分子活化所必要的結(jié)構(gòu)域。因此能夠制備為獲得可以中和這種酶活性的抗體或可以檢測(cè)具有活性的該酶分子的抗體所必需的表位區(qū)域。
可使用根據(jù)獲得的ADAMTS-13的氨基酸序列等制備的肽作為常規(guī)的免疫方法制備單克隆和多克隆抗體的抗原等(Current Protocols inMolecular Biology，Edited by F.M.Ausbel等(1987)，AntibodyEngineeringA PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY等(1996)，AntibodiesA Laboratory Mannual，Edited by Harlow DavidLane(1988)or ANTIBODY ENGINEERING，second edition，Edited byCarl A.K.BORREBAECK(1995))。備選地，可以利用噬菌體展示技術(shù)通過(guò)抗原制備方法來(lái)生產(chǎn)結(jié)合上述蛋白質(zhì)的抗體(Phage Display ofPeptides and ProteinsA Laboratory Manual Edited by Brian K.Kay等(1996)，Antibody EngineeringA PRACTICAL APPROACH Edited byJ.McCAFFERTY等(1996)，or ANTIBODY ENGINEERING secondedition edited by Carl A.K.BORREBAECK(1995))。備選地，也可根據(jù)這些技術(shù)從針對(duì)該酶活性的自身抗體-陽(yáng)性的TTP患者的樣品中分離針對(duì)該酶活性的中和抗體或簡(jiǎn)單的結(jié)合抗體。利用這些抗體能夠用于診斷和治療伴隨該酶數(shù)量變化的疾病，例如TTP等。備選地，如此制備的抗體可用于制備針對(duì)例如小鼠ADAMTS-13的抗體，并且可通過(guò)將抗體導(dǎo)入到小鼠中或通過(guò)將其中整合入該抗體基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到小鼠中來(lái)產(chǎn)生自身抗體-陽(yáng)性模型的小鼠。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明如下進(jìn)行說(shuō)明。
針對(duì)蛋白質(zhì)或肽的抗體，其中該蛋白質(zhì)或肽由構(gòu)成von Willebrand因子切割酶(在下文中也稱(chēng)為ADAMTS-13)的全長(zhǎng)氨基酸序列、在所述氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)上述氨基酸序列的部分序列、或包括所述的全長(zhǎng)氨基酸序列的多肽鏈組成。
根據(jù)[1]的抗體，其中ADAMTS-13來(lái)源于靈長(zhǎng)類(lèi)或嚙齒類(lèi)。
針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成SEQ ID No.1所示的ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)所述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13氨基酸序列的多肽鏈組成。
識(shí)別構(gòu)成如SEQ ID No.1所示的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽的一部分的抗體，其中所述的部分是從間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端的區(qū)域、或從金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域或富含Cys的區(qū)域到間隔結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
根據(jù)[1]至[4]中任何一項(xiàng)所述的適用于親合純化蛋白質(zhì)的抗體，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)上述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽鏈組成。
根據(jù)[1]至[4]中任何一項(xiàng)所述的能夠抑制或中和蛋白質(zhì)酶活性的抗體，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)所述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽鏈組成。
根據(jù)[6]所述的抗體，其中該抗體識(shí)別從ADAMTS-13的間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域或解聚素-樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
由包括如SEQ ID Nos.2和3所示的ADAMTS-13的部分肽的免疫原制備的抗體。
通過(guò)用表示為全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度的如SEQ ID No.1所示的多肽鏈進(jìn)行免疫，或通過(guò)將能夠表達(dá)所述多肽鏈的表達(dá)載體直接轉(zhuǎn)染到動(dòng)物中而制備的抗體。
根據(jù)[1]至[9]中任何一項(xiàng)所述的抗體，其是多克隆抗體。
根據(jù)[1]至[9]中任何一項(xiàng)所述的抗體，其是單克隆抗體，以及編碼所述抗體的基因。
根據(jù)[9]的單克隆抗體，其是由選自雜交瘤系WH10、WH63.1、WHS40.3、Pep4-34.1、WH2-22-1A、WH2-1-1、WH2-11-1、Pep6-6A和Pep4-5B-1的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體，以及編碼該單克隆抗體的基因，其中WH10、WH63.1、WHS40.3和Pep4-34.1分別于2002年9月4日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(AIST)(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏號(hào)為FERM BP-8174、FERM BP-8175、FERM BP-8176和FERM BP-8177，而WH2-22-1A、WH2-1-1、WH2-11-1、Pep6-6A和Pep4-5B-1分別于2003年4月22日和2003年9月10日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(AIST)(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，其保藏號(hào)為FERM BP-8483、FERM BP-8484、FERMBP-8485、FERM BP-8474和FERM BP-8475。
可結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合由[1]至[12]中任何一項(xiàng)所述的抗體識(shí)別的ADAMTS-13的表位的抗體。
藥物組合物或診斷性的藥物，包括[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體。
經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，其包含[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體作為組分。
經(jīng)分離的細(xì)胞，其可產(chǎn)生[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體的。
根據(jù)[16]所述的細(xì)胞，其是雜交瘤。
根據(jù)[17]所述的細(xì)胞，其選自雜交瘤系WH10(保藏號(hào)FERM BP-8174)、雜交瘤系WH63.1(保藏號(hào)FERM BP-8175)、雜交瘤系WHS40.3(保藏號(hào)FERM BP-8176)、雜交瘤系Pep4-34.1(保藏號(hào)FERM BP-8177)、雜交瘤系WH2-22-1A(保藏號(hào)FERM BP-8483、雜交瘤系WH2-1-1(保藏號(hào)FERM BP-8484)、雜交瘤系WH2-11-1(保藏號(hào)FERMBP-8485)、雜交瘤系Pep6-6A(保藏號(hào)FERM BP-8474)和雜交瘤系Pep4-5B-1(保藏號(hào)FERM BP-8475)。
免疫測(cè)定試劑盒，其包含[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體。
用于制備抗體的方法，其包括下列步驟用包括部分或全部ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽免疫和致敏溫血?jiǎng)游?，以及從所述的?jīng)免疫和致敏的溫血?jiǎng)游锏捏w液提取如[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體。
用于制備如[20]所述的抗體的方法，其中用于免疫和致敏溫血?jiǎng)游锏亩嚯陌ㄗ鳛锳DAMTS-13的一部分的、部分或完整的序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
用于制備抗體的方法，包括下列步驟體內(nèi)或體外培養(yǎng)可以產(chǎn)生[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述抗體的經(jīng)分離的細(xì)胞，以及從體液或培養(yǎng)物中提取所述的抗體。
權(quán)利要求[22]所述的制備抗體的方法，其中可以產(chǎn)生抗體的分離細(xì)胞是雜交瘤。
[20]至[23]中任何一項(xiàng)所述的制備抗體的方法，其中通過(guò)一種或多種選自鹽析、透析、過(guò)濾、濃縮、離心、分級(jí)沉淀、凝膠過(guò)濾色譜法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、親和色譜法、凝膠電泳和等電聚焦的純化方法來(lái)提取抗體。
檢測(cè)ADAMTS-13的方法，其特征在于將[1]至[13]中任何一項(xiàng)所述的抗體與分析靶物接觸并通過(guò)免疫反應(yīng)檢測(cè)ADAMTS-13。
根據(jù)[25]所述的檢測(cè)方法，其是利用權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體，通過(guò)放射免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定或熒光免疫分析進(jìn)行的。
根據(jù)[25]或[26]所述的檢測(cè)方法，其中的分析靶物是從活體提取的生物樣品。
用于純化ADAMTS-13的方法，其包括下列步驟將權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體與包含ADAMTS-13和雜質(zhì)的混合物接觸使所述蛋白質(zhì)吸附在抗體上，以及使所述的被吸附的蛋白質(zhì)從抗體釋放出來(lái)。
根據(jù)[28]所述的純化方法，其中該抗體結(jié)合不溶于水的載體。
診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體。
根據(jù)[30]所述的診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，包括作為主要成分的、從ADAMTS-13的間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端、從金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域的區(qū)域、或富含Cys的區(qū)域到間隔結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
一種試劑、診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，其用于檢測(cè)針對(duì)包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體的多肽鏈的抗體。
用于檢測(cè)抗體或分析表位的抗原的用途和制備方法，該抗原包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體。
在此公開(kāi)了可結(jié)合ADAMTS-13的抗體?？衫帽绢I(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)修飾這些抗體。也可通過(guò)組合在此公開(kāi)的方法和已知的方法制備與在此首次說(shuō)明的抗體相似的抗體。產(chǎn)生抗體的這些方法包括用ADAMTS-13或其片段免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或猴子)，或使可重組表達(dá)ADAMTS-13的表達(dá)載體進(jìn)行皮下地、皮內(nèi)地或肌內(nèi)注射轉(zhuǎn)染?？衫帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)從免疫的動(dòng)物獲得抗體，并且優(yōu)選地可利用結(jié)合目標(biāo)抗原進(jìn)行抗體篩選?？赏ㄟ^(guò)屠宰動(dòng)物的步驟實(shí)現(xiàn)從該動(dòng)物分離抗體和/或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
備選地，除用ADAMTS-13免疫哺乳動(dòng)物外，可利用例如λ噬菌體或在表面上顯示功能性的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體纖絲，從表達(dá)免疫球蛋白的可變域的重組體產(chǎn)生文庫(kù)獲得針對(duì)ADAMTS-13的特異抗體。該文庫(kù)可以從獲得自沒(méi)有用任何ADAMTS-13(或片段)免疫的生物體的序列天然構(gòu)建，或可以從獲得自已經(jīng)暴露于目標(biāo)抗原的生物體的序列構(gòu)建。
可通過(guò)由Kohler和Milstein首次描述的方法，Nature，256495，1975，或重組的方法(參見(jiàn)Mage和Lamoyi，Monoclonal Antibody ProductionTechniques和Applications，pp.79-97，Marcel Dekker，New York，1987)制備在此使用的單克隆抗體。
在雜交瘤方法中，為了衍生出產(chǎn)生或可以產(chǎn)生可以與用于免疫的ADAMTS-13特異結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞，用抗原以皮下的、腹膜內(nèi)的或肌內(nèi)的途徑免疫合適的宿主溫血?jiǎng)游?，例如小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或猴子。備選地，可以體外免疫淋巴細(xì)胞。隨后，利用合適的助融劑，例如聚乙二醇等，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞[參見(jiàn)Goding，Monoclonal antibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986)]。
用于免疫的抗原包括從人或非人的哺乳動(dòng)物的血液分離的天然ADAMTS-13，和利用遺傳工程技術(shù)制備的重組ADAMTS-13，也可能來(lái)源于人或其他的哺乳動(dòng)物。不僅可使用全長(zhǎng)的ADAMTS-13，而且可使用酶促切割片段或從編碼ADAMTS-13的DNA片段遺傳工程化的重組ADAMTS-13的部分肽。ADAMTS-13片段的實(shí)例包括包含從間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端、或從金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域或富含Cys的區(qū)域到間隔結(jié)構(gòu)域的片段。
可以在優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞復(fù)制或存活的物質(zhì)的合適培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)如此制備的雜交瘤細(xì)胞。例如，當(dāng)親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)時(shí)，用于培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基一般包含次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT培養(yǎng)基)，并且這些物質(zhì)抑制HGPRT缺陷細(xì)胞的復(fù)制。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合并支持由所選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定和高水平表達(dá)抗體的骨髓瘤細(xì)胞，其對(duì)培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基具有敏感性。
可根據(jù)針對(duì)ADAMTS-13產(chǎn)生單克隆抗體來(lái)分析用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，通過(guò)固相酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定特異的結(jié)合。本發(fā)明的單克隆抗體特異地結(jié)合ADAMTS-13或其部分的片段。
可通過(guò)表達(dá)如下所述的缺失C-末端的變體ADAMTS-13分子來(lái)描繪結(jié)合抗體的表位的圖譜。因此，本發(fā)明包括可以結(jié)合ADAMTS-13表位的抗體，該ADAMTS-13表位結(jié)合所闡述的抗體。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，單克隆抗體可能具有微摩爾以上的更大親合力，或當(dāng)通過(guò)例如Scatchard分析(參見(jiàn)Munson，Pollard，Anal.Biochem.107220，1980)測(cè)定時(shí)為更大的親合力(即，大于10-6mol的親合力)。
在鑒定產(chǎn)生具有所需要的特異性和親合力的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，通過(guò)有限稀釋克隆來(lái)進(jìn)行亞克隆，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。適于該目的的培養(yǎng)基包括Dulbecco′s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可在動(dòng)物中以腹水腫瘤體內(nèi)增殖雜交瘤細(xì)胞。
通過(guò)體外培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞，可以獲得包含所需要的抗體的培養(yǎng)上清液。此外，可以通過(guò)將這個(gè)雜交瘤移植到哺乳動(dòng)物，例如小鼠的腹腔而獲得包含所需要抗體的腹水。
優(yōu)選地通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，例如用蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法從培養(yǎng)基、腹水或血清分離由雜交瘤分泌的單克隆抗體。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如利用可以特異結(jié)合編碼嚙齒類(lèi)抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針容易地分離和測(cè)序編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核酸。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是編碼抗體或其片段的核酸的優(yōu)選供應(yīng)源。分離后，可以將核酸連接至表達(dá)載體或克隆載體，然后轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，以及培養(yǎng)重組的宿主細(xì)胞以便生長(zhǎng)的細(xì)胞可以產(chǎn)生單克隆抗體。
可生產(chǎn)具有所需要的結(jié)合特性的抗體的雜交瘤包含編碼抗體(包括抗體片段)的核酸，并且可表達(dá)這些抗體的宿主細(xì)胞都落入本發(fā)明的范圍。此外，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)抗體的方法，包括在其產(chǎn)生并且優(yōu)選分泌該抗體的條件下培養(yǎng)可以產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
可以通過(guò)多種方法改進(jìn)本發(fā)明的抗體。此外，術(shù)語(yǔ)″抗體″應(yīng)被解釋為涵蓋具有顯示所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所有結(jié)合物質(zhì)。因此，本發(fā)明涵蓋抗原或表位、包含合成分子和與可以結(jié)合這里的ADAMTS-13具有相似形式的分子的抗體片段、該抗體的衍生物和功能等同物和同系物。
可以結(jié)合抗原或其他結(jié)合對(duì)的抗體片段的實(shí)例是由VL、VH、C1和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；和包含分離的CDR結(jié)構(gòu)域和F(ab′)2片段以及在鉸鏈結(jié)構(gòu)域中通過(guò)二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段。也包含單鏈的Fv片段。
產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以受到遺傳變異或其他的變化的影響。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解該單克隆抗體可以經(jīng)過(guò)重組DNA技術(shù)而用于產(chǎn)生保持原始抗體特異性的另一個(gè)抗體、人源化的抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體免疫球蛋白的可變域或互補(bǔ)決定域(CDR)的DNA導(dǎo)入到連接另一個(gè)免疫球蛋白的骨架區(qū)域的恒定結(jié)構(gòu)域或不變結(jié)構(gòu)域中。
由本發(fā)明提供的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤包括WH10、WH63.1、WHS40.3、Pep4-34.1、WH2-22-1A、WH2-1-1、WH2-11-1、Pep6-6A和Pep4-5B-1。
免疫測(cè)定本發(fā)明的抗體可以多種分析形式用于本發(fā)明的檢測(cè)或診斷方法。可使用該抗體作為特異結(jié)合ADAMTS-13的結(jié)合劑，并且例如能夠體外檢測(cè)樣品中的ADAMTS-13。在另一個(gè)方面，可在與分析靶物接觸后使用其作為顯影劑來(lái)確定被vWF切割酶占據(jù)的結(jié)合劑結(jié)合位點(diǎn)的部份，其是待分析靶物中的被分析物(分析的靶物)。也就是說(shuō)，本發(fā)明的抗體在結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合分析靶物并且通過(guò)測(cè)定結(jié)合待分析靶的數(shù)量，可確定待分析靶的本發(fā)明抗體的數(shù)量，因此本發(fā)明的抗體可用作驗(yàn)證被分析物存在的顯影劑。
該抗體的用途，特別是在分析中該抗體作為顯影劑的用途包括用可以直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)的、以及優(yōu)選為可測(cè)定的信號(hào)的標(biāo)記物質(zhì)或報(bào)告分子標(biāo)記它們。此外，本發(fā)明的抗體也包括標(biāo)記的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)將標(biāo)記物質(zhì)或報(bào)告分子與抗體偶聯(lián)來(lái)進(jìn)行標(biāo)記，可以例如通過(guò)經(jīng)肽鍵的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵直接或間接地形成這種偶聯(lián)。可以通過(guò)重組表達(dá)編碼抗體和報(bào)告分子的融合基因獲得借助于肽鍵的偶聯(lián)。可使用本領(lǐng)域已知的分別將抗體與可檢測(cè)部分結(jié)合的任何方法，包括Hunter等人，Nature，144945，1962；David等人，Biochemistry 131014，1974；Pain等人，J.Immunol.Meth.40219，1981；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30407，1982描述的方法。
標(biāo)記物質(zhì)或報(bào)告分子包括熒光染料、熒光基團(tuán)或激光染料等，其具有利用光譜方法加以分離的吸收或熒光，并且這些物質(zhì)可通過(guò)共價(jià)鍵與抗體偶聯(lián)。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、蟲(chóng)熒光素、藻紅蛋白和德克薩斯紅。合適的顯色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其他可檢測(cè)的標(biāo)記包括放射性同位素標(biāo)記，例如3H、14C、32P、35S、125I或99mTc，以及催化產(chǎn)生可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)并且可以擴(kuò)增信號(hào)的酶標(biāo)記，例如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行這些酶的標(biāo)記，包括利用生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素的結(jié)合。
另一個(gè)報(bào)告分子包括顆粒物質(zhì)，例如顯色的聚合物膠體顆?；颍缛橐褐?，其可以直接或間接地產(chǎn)生可目測(cè)觀察、電學(xué)檢測(cè)或用其它方式記錄的可檢測(cè)信號(hào)。此外，也可使用磁性的或順磁的顆粒。此外，報(bào)告分子可以是催化例如顯色反應(yīng)、脫色反應(yīng)或改變電特性的反應(yīng)的酶。這些分子可能具有通過(guò)在能級(jí)之間帶電躍遷而產(chǎn)生特征性光譜吸收或熒光的分子活性。此外，這些分子可以包括用于與生物傳感器組合的化學(xué)實(shí)體。
此外，既然該抗體比存在于樣品中的其他物質(zhì)可以更優(yōu)先地特異結(jié)合ADAMTS-13，可使用該抗體作為結(jié)合劑。優(yōu)選地，將結(jié)合劑固定以便在分析中可以在固相支持物上，例如容易地在特異性位點(diǎn)進(jìn)行操作?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行固定，例如物理吸附或化學(xué)吸附，并且可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素，例如用于使抗體化學(xué)結(jié)合到固態(tài)的支持材料(固相支持物)上。一般地，在適宜條件下將結(jié)合試劑和樣品接觸，以便存在于樣品中的ADAMTS-13可以結(jié)合至結(jié)合劑。隨后，可以利用顯影劑測(cè)定結(jié)合劑結(jié)合位點(diǎn)部份的占據(jù)比。也就是說(shuō)，通過(guò)測(cè)定結(jié)合至樣品中的待分析靶物的抗體的數(shù)量來(lái)測(cè)定待分析靶物的數(shù)量。
當(dāng)利用本發(fā)明的抗體作為上述的顯影劑時(shí)，對(duì)顯影劑進(jìn)行標(biāo)記(使用例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記)，以使得可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。因此，可以利用閃爍計(jì)數(shù)器或其他的放射性計(jì)數(shù)裝置檢測(cè)放射性標(biāo)記，利用激光或共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光標(biāo)記，以及利用底物上的酶標(biāo)記作用檢測(cè)酶標(biāo)記，一般地這種作用導(dǎo)致顏色變化。顯影劑可被用于競(jìng)爭(zhēng)性的方法，其中該顯影劑與被分析物競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)結(jié)合劑的結(jié)合位點(diǎn)，或可被用于非競(jìng)爭(zhēng)性的方法，其中標(biāo)記的顯影劑與已經(jīng)結(jié)合至結(jié)合劑或占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的被分析物結(jié)合。通過(guò)任何一個(gè)方法，顯示由被分析物占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)部份，并且由此與例如利用包含已知濃度的被分析物的樣品獲得的標(biāo)準(zhǔn)相比顯示樣品中被分析物的濃度。
利用來(lái)自患者的生物樣品進(jìn)行診斷分析。這些樣品也可直接使用而不經(jīng)過(guò)預(yù)處理，也可能受到處理，例如除去樣品中可能例如由進(jìn)行分析前的離心或過(guò)濾而產(chǎn)生干擾的物質(zhì)。合適的生物樣品的實(shí)例包括血液、尿、汗、組織或其提取液體、或血清。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷具有TTP或TTP-樣疾病或依賴(lài)于vWF血栓(由vWF所引起的血栓)的危險(xiǎn)的患者是否患有這些疾病的方法，或評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)或評(píng)估是否存在患有這些疾病的任何風(fēng)險(xiǎn)，該方法包括下列步驟(a)將從患者獲得的生物樣品與其上已經(jīng)固定有可特異結(jié)合ADAMTS-13的抗體的固態(tài)支持材料接觸；(b)將其上已經(jīng)固定有抗體，并且已經(jīng)與樣品接觸的固態(tài)支持材料與可與抗體上未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)、已經(jīng)結(jié)合到抗體上的結(jié)合ADAMTS-13或該抗體上已占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記顯影劑接觸；以及(c)檢測(cè)步驟(b)中特異結(jié)合的顯影劑標(biāo)記，以獲得相應(yīng)于樣品中ADAMTS-13濃度的值。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于診斷患者依賴(lài)于vWF血栓的方法，該方法包括下列步驟(a)將從患者獲得的生物樣品與任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗-ADAMTS-13的抗體接觸；以及(b)測(cè)定樣品中ADAMTS-13與抗-ADAMTS-13抗體的結(jié)合。
該方法進(jìn)一步包括下列步驟使相應(yīng)于樣品中ADAMTS-13濃度的值與從已知的標(biāo)準(zhǔn)物獲得的值聯(lián)系起來(lái)，例如測(cè)定具有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，將通過(guò)測(cè)定未知濃度的物質(zhì)所獲得的觀測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，由此計(jì)算濃度。
本發(fā)明的抗體可用于所有已知的免疫學(xué)-測(cè)定方法，例如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析、直接和間接的夾層分析和免疫沉淀分析[參見(jiàn)Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，1987)]。
夾層分析使用2種抗體，其可分別結(jié)合ADAMTS-13待檢測(cè)的不同免疫位點(diǎn)或表位。使待分析靶物的被分析物與固定在固態(tài)支持材料上的第一抗體結(jié)合，在夾層分析中容許第二抗體與被分析物結(jié)合以形成不溶的3部分的復(fù)合物(抗原、第一抗體和第二抗體)。在可檢測(cè)的部分(標(biāo)記物質(zhì)或報(bào)告分子)標(biāo)記第二抗體或利用已經(jīng)在可檢測(cè)的部分標(biāo)記的抗-免疫球蛋白的抗體進(jìn)行測(cè)定(間接的夾層分析)。例如，夾層分析的一種模型是ELISA分析，其可檢測(cè)的部分是酶。
本發(fā)明也包括包含本發(fā)明抗體的免疫測(cè)定試劑盒。當(dāng)該試劑盒是以酶免疫分析為基礎(chǔ)時(shí)，該試劑盒可包括其上已經(jīng)有固相抗體的載體或該抗體可能預(yù)先結(jié)合該載體。當(dāng)這個(gè)試劑盒是以利用例如乳液的載體的濃縮方法為基礎(chǔ)時(shí)，該試劑盒可能包括其上吸附有抗體的載體。該試劑盒也可適當(dāng)?shù)匕?biāo)準(zhǔn)樣品、封閉溶液、反應(yīng)溶液、反應(yīng)終止液、用于處理樣品的試劑等。
本發(fā)明的抗體可用于體內(nèi)成像，其中用可檢測(cè)的部分，例如放射性同位素標(biāo)記該抗體，將其施用于宿主，優(yōu)選地施用到血流中，并且測(cè)定標(biāo)記抗體在宿主中的存在和定位。該抗體可以結(jié)合其中存在或定位有ADAMTS-13的組織或器官等?？梢栽谒械牟糠謽?biāo)記抗體，其可通過(guò)核磁共振、X射線熒光檢查、或其他本領(lǐng)域已知的檢測(cè)方式加以檢測(cè)，并且利用根據(jù)檢測(cè)部分的特異檢測(cè)方式測(cè)定標(biāo)記抗體的存在和定位，即可以檢測(cè)ADAMTS-13的存在和定位。
此外，本發(fā)明的抗體作為用于親和色譜法中親合純化的試劑也是有用的。在這個(gè)方法中，利用本領(lǐng)域眾所周知的方法將抗體固定在支持物，例如合成樹(shù)脂，如Cellulofine和濾紙上。隨后，在將待純化的包含ADAMTS-13的樣品與固定的抗體接觸后，用可以完全除去樣品中除了結(jié)合于固定的抗體的ADAMTS-13外的所有物質(zhì)的溶劑洗滌支持物。最后，用可以從抗體釋放ADAMTS-13的溶劑，例如甘氨酸緩沖溶液，pH3至5洗滌支持物，分離和純化ADAMTS-13。
可以將本發(fā)明的抗體或ADAMTS-13分子或其變體混合到藥理學(xué)組合物中。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明包括包含本發(fā)明抗體或ADAMTS-13分子或其變體的藥理學(xué)組合物。在此，變體是在氨基酸序列片段中缺失、取代或加入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的分子，該片段包含在ADAMTS-13分子的完整分子或氨基酸序列中顯示藥理學(xué)效果的部分(它不是必然的保持活性的修飾)。
本發(fā)明的抗體包含可以抑制或中和ADAMTS-13酶活性的抗體。優(yōu)選地，這種抗體識(shí)別并結(jié)合存在于ADAMTS-13的域結(jié)構(gòu)中從間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端的表位。該抗體也識(shí)別并結(jié)合存在于金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域，或Cys-間隔區(qū)域的表位。
藥理學(xué)組合物可以包含藥理學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖溶液、穩(wěn)定劑、或除上述抗體、ADAMTS-13分子或其變體之外的本領(lǐng)域眾所周知的另外物質(zhì)。這種物質(zhì)是無(wú)毒的并且不干擾活性成分的效果。載體或另外物質(zhì)的嚴(yán)格特性依賴(lài)于給藥途經(jīng)、例如口服的、靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)或皮下的、經(jīng)鼻的、肌內(nèi)的或皮下地、腹腔內(nèi)途徑，并且可以根據(jù)給藥途經(jīng)選擇合適的載體或物質(zhì)。
用于口服的藥理學(xué)組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑或液體形式。片劑可以包含固體類(lèi)型的載體，例如白明膠或佐劑。液體類(lèi)型的藥理學(xué)組合物通?？梢允禽d體，例如水、石油、動(dòng)物油、植物油、礦物油或合成油。也包括鹽水、葡萄糖或其他糖溶液、或甘醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
就靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)或皮下的注射、或注射至疼痛部分來(lái)說(shuō)，活性成分可能不包含任何發(fā)熱因子并且可能是含水溶劑的形式，其中該含水溶劑可以是非腸胃道可接受的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用等滲性培養(yǎng)基制備合適的溶液，例如氯化鈉液體、Ringer′s溶液、乳酸化的Ringer′s溶液等。如果需要也可包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖溶液、抗氧化劑、和/或其他添加劑。
針對(duì)本發(fā)明的ADAMTS-13的抗體，ADAMTS-13分子或其變體可以用鹽水、緩沖溶液等稀釋和配制以制備藥物組合物。制劑的pH優(yōu)選是接近體液的pH的弱酸至中性區(qū)域的pH，并且優(yōu)選最低為5.0至6.4和優(yōu)選最高為pH 6.4至8.0。也可提供可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存的形式，例如是凍干的形式等，并且在這種情況下，可以在使用的時(shí)候用水、鹽水、緩沖溶液等溶解和使用，以成為所需要的濃度。本發(fā)明的制劑可能包含通常用于藥品的藥物學(xué)上可接受的添加劑(例如，載體、賦形劑、稀釋劑等)、穩(wěn)定劑、或藥理學(xué)上必需的成分。作為穩(wěn)定劑，可以是例如葡萄糖的單糖、例如蔗糖和麥芽糖的二糖、例如甘露糖醇和山梨糖醇的糖醇、例如氯化鈉的中性鹽、例如甘氨酸的氨基酸、非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧化丙烯共聚物(Pluronic)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酸酯(Tween)、人白蛋白等，并且優(yōu)選加入大約1至10w/v％。
可以通過(guò)靜脈注射、肌肉注射、皮下注射等以有效量施用本發(fā)明的藥物組合物，并且為一次性或若干次給藥。給藥的數(shù)量隨狀況、年齡、重量等而變化，但是每次0.001mg至100mg是優(yōu)選的。
本說(shuō)明書(shū)引入由日本專(zhuān)利申請(qǐng)Nos.2002-279924和2002-377569的說(shuō)明書(shū)和/或附圖所公開(kāi)的內(nèi)容，上述申請(qǐng)是本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示用于制備確定抗體表位的C-末端缺失變體的方法；圖2通過(guò)在非還原的條件下利用抗-FLAG抗體的Western印跡證明制備的C-末端缺失變體的瞬時(shí)表達(dá)；圖3通過(guò)還原條件下的SDS-PAGE證明制備的C-末端缺失變體瞬時(shí)表達(dá)的vWF切割活性；圖4顯示給出結(jié)果證明PoAb1表位的非還原條件下的Western印跡；圖5顯示給出結(jié)果證明PoAb2表位的非還原條件下的Western印跡；圖6顯示給出結(jié)果證明MoAb Pep 4-34-1表位的非還原條件下的Western印跡；圖7顯示給出結(jié)果證明MoAb WH10表位的非還原條件下的Western印跡；圖8顯示給出結(jié)果證明MoAb WH63-1表位的非還原條件下的Western印跡；圖9顯示給出結(jié)果證明MoAb WHS 40-3表位的非還原條件下的Western印跡；圖10概括了對(duì)多種抗體活性表達(dá)重要的結(jié)構(gòu)域和識(shí)別區(qū)域；圖11通過(guò)用ADAMTS-13的部分肽免疫獲得的兔抗血清的方式，顯示表明健康人和TTP患者血漿中的ADAMTS-13的還原條件下的Western印跡結(jié)果；圖12是通過(guò)聯(lián)合多克隆抗體和單克隆抗體構(gòu)建的ELISA系統(tǒng)的圖解以及該分析的流程圖；圖13是通過(guò)針對(duì)各個(gè)結(jié)構(gòu)域所制備的抗體構(gòu)建ELISA方法的概念圖；圖14是通過(guò)聯(lián)合單克隆抗體和單克隆抗體構(gòu)建的ELISA系統(tǒng)的圖解以及該分析的流程圖；圖15是通過(guò)用來(lái)自利用人胚腎細(xì)胞系293作為宿主的培養(yǎng)基的抗體柱的親合純化而純化的重組ADAMTS-13的SDS-PAGE的電泳圖譜；圖16是通過(guò)用來(lái)自收集的人血漿的FI糊狀物的抗體柱的親合純化而純化的重組ADAMTS-13的SDS-PAGE的電泳圖譜；圖17顯示利用抗體評(píng)估中和能力(非還原條件下vWF切割活性的SDS-PAGE)；圖18顯示患有獲得性TTP的患者血漿中抗-ADAMTS-13抗體的檢測(cè)(ELISA方法)；以及圖19顯示小鼠血漿中ADAMTS-13的檢測(cè)(Western印跡方法)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將通過(guò)下列的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)地描述，但是本發(fā)明不以任何方式只限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1(多克隆抗體(PoAb)的制備)根據(jù)常規(guī)方法將從人血漿部分純化的抗原蛋白質(zhì)、或具有結(jié)合合適的載體物質(zhì)(KLH等)的氨基酸序列部分(由SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的肽例證性說(shuō)明)的合成肽(在N-或C-末端附加Cys以便于加入KLH的肽)、或被導(dǎo)入重組蛋白質(zhì)或編碼重組蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)載體按常規(guī)方法皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)地轉(zhuǎn)染小鼠或兔子(Current Protocols in MolecularBiologyChapter 11 immunology，Antibody EngineeringA PRACTICALAPPROACH Edited by J.McCAFFERTY等，或ANTIBODYENGINEERING second edition Edited by Carl A.K.BORREBAECKetc.)以建立表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤以及產(chǎn)生多克隆抗體(PoAb)。對(duì)于PoAb，通過(guò)轉(zhuǎn)染下列描述的表達(dá)全長(zhǎng)、Q449終止或P285終止的載體來(lái)制備三種抗體，即PoAb1、PoAb2和PoAb3。
實(shí)施例2(單克隆抗體(MoAb)的制備)
用重組衍生的ADAMTS-13和利用KLH作為載體的SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的肽，在存在弗氏完全佐劑時(shí)，第一次免疫Balb/c小鼠的后腿。可通過(guò)WO 02/088366中所描述的方法制備ADAMTS-13。
一次性免疫接種1μg至10μg等量的所制備抗原一周后，根據(jù)常規(guī)方法從小鼠后腿的股骨淋巴結(jié)或脾臟取樣細(xì)胞。將從兩只小鼠獲得的細(xì)胞分別以1比1-2個(gè)細(xì)胞的比率與骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8U.1(P3U1)(ATCC保藏號(hào)CRL-1597Curr.Top.Microbiol.Immunol.，vol.81，p.1(1978))混合，離心(1,500rpm，5分鐘)除去上清液，使沉淀的細(xì)胞塊充分松散，邊攪動(dòng)邊加入預(yù)先在37℃溫?zé)岬?ml聚乙二醇溶液(45％聚乙二醇4000，55％RPMI培養(yǎng)基)。在37℃溫育5分鐘后，緩慢加入RPMI培養(yǎng)基，以使得液體的總量為50ml。離心后(1,300rpm，7分鐘)，除去上清液，并輕輕地松散細(xì)胞。向其加入50ml的S-Clone CM-B培養(yǎng)基(Sanko Junyaku Co.，Ltd.的產(chǎn)品)，利用移液管輕輕地使細(xì)胞懸浮。將100μl的這種細(xì)胞懸浮液置入96-孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的4或5個(gè)每個(gè)孔，并在含有5％二氧化碳的CO2恒溫箱中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。次日，向每個(gè)孔加入100μl HAT培養(yǎng)基(補(bǔ)充有1×10-4M的次黃嘌呤、1.5×10-3M的胸苷和4×10-7M的氨喋呤的S-Clone CM-B培養(yǎng)基)，并在含有5％二氧化碳的CO2恒溫箱中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于其中雜交瘤生長(zhǎng)充分的克隆，將該培養(yǎng)基置換為HT培養(yǎng)基(除了除去氨喋呤的上述的HAT培養(yǎng)基)，取樣部分的培養(yǎng)上清液，通過(guò)下列描述的篩選分離靶雜交瘤。
組合下列ELlSA方法和Western印跡方法來(lái)分離靶雜交瘤。
(1)ELISA方法將與以上述相似的方式制備的合成肽抗原或純化的抗原(蛋白質(zhì)濃度0.5至2μg/ml)以50μl/孔加入96-孔微測(cè)定平板，并且通過(guò)在4℃孵育過(guò)夜而進(jìn)行固定。此外，加入300μl的1％BSA(牛血清白蛋白)溶液，并且以相似的方式孵育以進(jìn)行有效封閉。向如此制備的固定抗原的平板，加入通過(guò)細(xì)胞融合方法獲得的雜交瘤的培養(yǎng)上清液和克隆后的雜交瘤，并且在4℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后用TBS洗滌平板3次，并且加入100μl/孔的過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的抗-小鼠免疫球蛋白抗體溶液(Cappel的產(chǎn)品，稀釋5,000-倍)。在4℃孵育1小時(shí)后，用TBS洗滌3次，然后加入TMBZ底物溶液，以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行顯色，并在450nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光率。由此選擇出與純化的抗原反應(yīng)的雜交瘤克隆。這個(gè)方法也可用于檢測(cè)人血漿中ADAMTS-13的自身抗體。
(2)Western印跡方法通過(guò)Western印跡方法篩選由ELISA獲得的陽(yáng)性克隆。利用8％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)純化的抗原進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且將膜切成0.4至0.5cm寬。將每個(gè)小條浸入雜交瘤培養(yǎng)上清液，并且在37℃孵育1小時(shí)。然后用TBST(含有0.05％Tween)洗滌3次后，在以1∶2000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-小鼠IgG(TAGO Inc.的產(chǎn)品)溶液中于37℃孵育1小時(shí)。用TBST洗滌3次后，利用BCIP/NBT的顯色劑(Bio-Rad的產(chǎn)品)使其顯色，選擇顯示純化抗原的色帶的雜交瘤，并進(jìn)行克隆。以相同的技術(shù)分揀克隆后的雜交瘤克隆。通過(guò)上述的分揀方法獲得了產(chǎn)生所需要的單克隆抗體的大約30個(gè)克隆的雜交瘤。這個(gè)方法也可用于檢測(cè)人血漿中ADAMTS-13的自身抗體。
實(shí)施例3(ADAMTS-13的C-末端缺失變體的制備)通過(guò)圖1所示的策略，利用全長(zhǎng)vWF切割酶基因克隆載體(pCR2.1vWFCP)，利用全長(zhǎng)的和序列表中的SEQ ID Nos.4至18的引物制備表達(dá)變體的基因，該變體中從C-末端逐一缺失結(jié)構(gòu)域(完全的1427終止、T1135終止、W1016終止、W897終止、W808終止、W746終止、W688終止、T581終止、Q449終止、W387終止、P285終止其中每個(gè)數(shù)字表示從由起始密碼予ATG編碼的Met至終止密碼子的氨基酸殘基的數(shù)目，表明了添加FLAG表位的位點(diǎn)(DNA序列g(shù)actacaaggacgatgacgataagtga(序列表中的SEQ ID No.19)、氨基酸序列Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(序列表中的SEQ ID No.20)))，并整合到pCAG表達(dá)載體中(Niwa，H.，等Gene vol.108，193-199)，并利用Hela細(xì)胞以下列步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
可通過(guò)WO 02/088366中所描述的方法獲得載有全長(zhǎng)ADAMTS-13基因的載體(pCR2.1cWFCP)的全長(zhǎng)。
首先，將細(xì)胞以1-3×105個(gè)細(xì)胞/35mm碟進(jìn)行接種，次日，將2μg的上述表達(dá)載體加入10μl的聚胺轉(zhuǎn)染試劑TransIT(TAKARA的產(chǎn)品)，并加入200μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如Opti-MEM，根據(jù)試劑所附的用法說(shuō)明制備DNA復(fù)合物，滴加到上述制備的多種細(xì)胞上，培養(yǎng)6小時(shí)，然后在將培養(yǎng)基變?yōu)锳SF104無(wú)血清培養(yǎng)基(Ajinomoto Co.，Inc.的產(chǎn)品)后，在37℃培養(yǎng)72小時(shí)，并收集上清液。利用抗-FLAG-M2抗體(KODAK的產(chǎn)品)，在抗-小鼠的Ig-堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體系統(tǒng)中染色，通過(guò)Western印跡方法進(jìn)行檢測(cè)(如圖2所示的結(jié)果證明了所觀察到的表達(dá))。這組修飾的分子具有附加的FLAG標(biāo)記，并且能夠以常規(guī)方法，利用固定抗-FLAG標(biāo)記的抗體的瓊脂糖輕易地進(jìn)行純化。
實(shí)施例4(確證ADAMTS-13 C-末端缺失變體的vWF切割活性)vWF的制備通過(guò)將溶解在20mL緩沖液中(0.01％ Tween-80/50mM Tris-HCl/100mM NaCl pH 7.4)的2g血漿冷凍部分在Sephacryl S-500HR(Amersham-Pharmacia)的2.6×90cm柱上凝膠過(guò)濾來(lái)制備vWF(參見(jiàn)WO02/088366)。
vWF切割反應(yīng)通過(guò)WO 02/088366的方法進(jìn)行vWF切割活性的分析。也就是說(shuō)，將加入終濃度為10mM氯化鋇的樣品在37℃預(yù)孵育5分鐘以激活蛋白酶。將緩沖液(15至20mL的1.5M尿素/5mM Tris-HCl pH 8.0)置入50mL的falcon管。然后，使由Millipore Corp.制造的膜濾器(0.025μm)浮起，并加入100μL的激活樣品，其中已經(jīng)加入并混合了50μL的vWF底物溶液。在恒溫箱中于37℃靜置過(guò)夜，次日從濾器收集樣品。根據(jù)下列SDS-PAGE小節(jié)所示的vWF切割模式評(píng)估收集的樣品。
SDS-PAGE室內(nèi)制備并使用SDS-5％聚丙烯酰胺凝膠。用于電泳的樣品是煮沸3分鐘的、vWF切割活性分析小節(jié)中所描述的10μL樣品和2μL的SDS電泳緩沖液(存在或缺乏還原劑2-巰基乙醇時(shí))。在30mA電泳1小時(shí)后，用Gel Code Blue Stain試劑(PIERCE)染色凝膠。
因此，如圖3所示，全長(zhǎng)分子至W688終止分子可清楚地識(shí)別vWF切割活性。此外，當(dāng)考慮到如上所述的抗-FLAG抗體到上清液中的表達(dá)模式，其中在上清液中未識(shí)別到T581終止的表達(dá)，證實(shí)接近這個(gè)區(qū)域(從富含Cys的區(qū)域到間隔結(jié)構(gòu)域)的切割可能導(dǎo)致分泌的紊亂，因此可以理解為了保持該酶的活性而包括這個(gè)結(jié)構(gòu)域是很重要的。
實(shí)施例5(利用Western印跡分析抗體的表位)
為了鑒定按照常規(guī)方法進(jìn)行Western印跡的已建立的多克隆抗體(PoAb1 and PoAb2)和認(rèn)為其識(shí)別位點(diǎn)相互之間是非競(jìng)爭(zhēng)性的幾個(gè)單克隆抗體(先前由本發(fā)明人制備的克隆號(hào)WH10(FERM BP-8174)以及WH63.1(FERM BP-8175)、WHS40.3(FERM BP-8176)和Pep4-34.1(FERMBP-8177))的識(shí)別區(qū)域，利用實(shí)施例4的部分缺失的修飾分子的瞬時(shí)表達(dá)培養(yǎng)上清液進(jìn)行Western印跡(圖4至9)。
除此之外，對(duì)于新建立的克隆WH2-22-1A(FERM BP-8483)、WH2-1-1(FERM BP-8484)、WH2-11-1(FERM BP-8485)、Pep6-6A(FERM BP-8474)和Pep4-5B-1(FERM BP-8475)進(jìn)行相似的分析。在圖10中概括了抗體的識(shí)別區(qū)域和被認(rèn)為對(duì)活性表達(dá)重要的區(qū)域。從圖4推測(cè)出PoAb1的識(shí)別區(qū)域從Q449終止延伸至W688終止或跨越全長(zhǎng)，并且如圖5中所示，同時(shí)認(rèn)為PoAb2識(shí)別從P285終止至W387終止和至Tsp1-以后，認(rèn)為本多克隆抗體PoAb1具有中和的活性(如下所述)，PoAb2以及PoAb3也中和ADAMTS-13的酶活性。證實(shí)從間隔結(jié)構(gòu)域至N-末端、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域或Cys-間隔域的區(qū)域在體外分析中是功能性重要的，它們可能成為中和的區(qū)域。
實(shí)施例6(利用ELISA鑒定抗-ADAMTS-13抗體的表位區(qū)域)將100μL的抗-FLAG抗體以10μg/mL固定到免疫模塊(immunodule)的96孔平板上后，再固定多肽鏈添加了FLAG的ADAMTS-13野生型或各種上述的缺失變體，或備選地將ADAMTS-13的變體直接固定到平板上，在100μL適當(dāng)稀釋的MoAb與通過(guò)已知的方法進(jìn)行封閉操作的平板發(fā)生反應(yīng)后，用含有例如Tween的表面活性劑的緩沖液洗滌平板，在與抗-小鼠的共軛IgHRP于37℃反應(yīng)1小時(shí)后，進(jìn)行洗滌并通過(guò)TMBZ顯色，由此以與實(shí)施例5中相似的方法搜索表位區(qū)域。因此支持實(shí)施例5中所示的結(jié)果。此外，證實(shí)這個(gè)方法對(duì)于存在于人血漿中的抗-ADAMTS-13抗體的檢測(cè)和表位分析是有效的。
實(shí)施例7(利用已建立的抗體通過(guò)Western印跡檢測(cè)人血漿中的ADAMTS-13)然后，利用通過(guò)上述各種方法制備的抗體，按照常規(guī)方法通過(guò)Western印跡方法檢測(cè)本發(fā)明的酶(例如Current Protocols in MolecularBiologyChapter 10 analysis of proteins and Chapter 11 immunology)。利用連接至KLH的ADAMTS-13 C-末端的肽序列(SEQ ID No.2)Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser作為免疫原所獲得的肽抗體在還原條件下，對(duì)來(lái)自健康人和TTP患者的血漿進(jìn)行檢測(cè)，盡管對(duì)于一些來(lái)自TTP患者的血漿不很清楚，還是證實(shí)了推測(cè)為來(lái)源于ADAMTS-13的信號(hào)的條帶一般是大約250kDa(圖11)。
實(shí)施例8(利用已建立的抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定對(duì)人血漿中ADAMTS-13的檢測(cè)和確定1)利用由所獲得的多克隆抗體和單克隆抗體的組合(MoAb-PoAb系統(tǒng))構(gòu)建的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)對(duì)各種樣品中的本發(fā)明的酶進(jìn)行定量(圖12)(對(duì)于識(shí)別表位，參見(jiàn)圖10)。測(cè)定過(guò)程的步驟如下所示1.使每種試劑溫?zé)嶂潦覝亍?br> 2.向固定有WH10 MoAb的平板加入100μL/孔的樣品，37℃，1小時(shí)。
3.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
4.用稀釋溶液(1％的BSA-TBS)稀釋PoAb1或PoAb2，使其成為1μg/ml，并以100μL/孔加入平板，37℃，1小時(shí)。
5.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
6.用稀釋溶液(1％的BSA-TBS)將抗-兔的IgG-HRP標(biāo)記的共軛物稀釋到10000-倍，并以100μL/孔加入平板，37℃，1小時(shí)。
7.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
8.向平板加入100μL/孔的TMB底物溶液(在使用前于室溫立即混合2種液體而制備)(陽(yáng)性孔變?yōu)樗{(lán)色)；于室溫下，在大約10分鐘內(nèi)向平板加入100μL/孔的反應(yīng)終止液體(0.5M硫酸)(以便于當(dāng)反應(yīng)終止后，所附作為標(biāo)準(zhǔn)的100ng/ml重組產(chǎn)物的顏色在OD450nm處可能最終大約為1)(陽(yáng)性孔變?yōu)辄S色)。
9.用平板讀出器在450nm和650nm處測(cè)定平板用于定量的標(biāo)準(zhǔn)物是通過(guò)用下述的抗體親合純化重組的ADAMTS-13而獲得的。因此，顯示健康個(gè)體的血漿中ADAMTS-13的濃度隨所使用的抗體而變化，這表明該酶以多種分子形式存在于血漿中(表1)。由此認(rèn)為，作為理想的ELISA系統(tǒng)，根據(jù)表2中所示的PoAb-PoAb(生物素酰化的PoAb-鏈霉抗生物素HRP直接固定在ELISA平板上，其中PoAb用蛋白質(zhì)G等純化)構(gòu)建利用一組識(shí)別各個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體并使分解模式能夠進(jìn)行確切分析的系統(tǒng)或幾乎不受這些影響的系統(tǒng)是優(yōu)選的(圖13)。在圖13所示的系統(tǒng)中，固定具有針對(duì)N-末端(例如金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域)的識(shí)別表位的多克隆抗體(PoAb)或單克隆抗體(MoAb)，具有針對(duì)各個(gè)結(jié)構(gòu)域的不同表位的MoAbs作為檢測(cè)方面的第二抗體，由此捕獲ADAMTS-13的所有變體。備選地，可固定具有這些多種表位的MoAbs或觀察使用PoAb和PoAb等的夾層ELISA。在這些系統(tǒng)中可能觀察到病理狀況和血漿中存在的分子形式之間的相關(guān)性。
表1

表2

實(shí)施例9(利用已建立的抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定對(duì)人血漿中ADAMTS-13的檢測(cè)和確定2)利用由所獲得的單克隆抗體的組合(MoAb-MoAb系統(tǒng))構(gòu)建的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)定量幾個(gè)樣品的人血漿中的該酶(圖14)。測(cè)定過(guò)程的步驟如下所示1.使每種試劑溫?zé)嶂潦覝亍?br> 2.向固定有WH10 MoAb的平板加入100μL/孔的樣品，37℃，1小時(shí)3.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
4.用稀釋溶液(1％的BSA-TBS)稀釋生物素化的抗體，使其成為1μg/ml，并以100μL/孔加入平板，37℃，1小時(shí)。
5.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
6.用稀釋溶液(1％的BSA-TBS)將鏈霉抗生物素-HRP標(biāo)記的共軛物稀釋至10000-倍，并以100μL/孔加入平板，37℃，1小時(shí)7.用0.05％的Tween-20-TBS洗滌平板3次。
8.向平板加入100μL/孔的TMB底物溶液(在使用前于室溫立即混合2種液體而制備)(陽(yáng)性孔變?yōu)樗{(lán)色)；于室溫下，在大約10分鐘內(nèi)向平板加入100μL/孔的反應(yīng)終止液體(0.5M硫酸)(以便于當(dāng)反應(yīng)終止后，所附作為標(biāo)準(zhǔn)的100ng/ml重組產(chǎn)物的顏色在OD450nm處可能最終大約為1)(陽(yáng)性孔變?yōu)辄S色)。
9.用平板讀出器在450nm和650nm處測(cè)定平板與上述實(shí)施例5的結(jié)果比較，這個(gè)組合的系統(tǒng)顯示最低的定量值(表3)。此外，在這個(gè)組合中沒(méi)有檢測(cè)到從下述的收集的人血漿的FI糊狀物純化的該酶。由此可見(jiàn)構(gòu)建多種系統(tǒng)的重要性，其中考慮到定量值依賴(lài)于抗體組合而變化的事實(shí)，改變抗體的組合(圖13)。
表3

實(shí)施例10
(重組ADAMTS-13的表達(dá))利用人胚腎細(xì)胞系293-細(xì)胞，通過(guò)下列方法(WO 02/088366)產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)ADAMTS-13的細(xì)胞系。正如所列出的，按照下列步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先，以1-3×105個(gè)細(xì)胞/35mm碟接種細(xì)胞，次日，將2μg的上述表達(dá)載體加入10μl的聚胺轉(zhuǎn)染試劑TransIT(TAKARA的產(chǎn)品)，并加入200μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如Opti-MEM，根據(jù)試劑所附的用法說(shuō)明制備DNA復(fù)合物，滴加到上述制備的多種細(xì)胞上，培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)3天后將培養(yǎng)基變換為加入G418的選擇培養(yǎng)基，再變換培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)3天，通過(guò)有限稀釋方法和上述MoAb(WH10)-PoAb1的ELISA系統(tǒng)從所選擇的克隆群建立表達(dá)克隆(克隆號(hào)VWFCP-293-35和293-2-4)。
實(shí)施例11(利用抗體從重組體的培養(yǎng)上清液純化重組的ADAMTS-13)利用WH10作為所獲得抗體的實(shí)例來(lái)說(shuō)明一個(gè)實(shí)施例。通過(guò)使該抗體結(jié)合至合適的固定載體來(lái)制備親合柱，并用于純化酶。在親合柱的制備中，利用由Chisso Corp.制造的NHS活化的Cellulofine，根據(jù)所附的用法說(shuō)明固定抗體。使用大約1ml的如此制備的溶脹載體，在施加了利用實(shí)施例9中所示作為宿主的293-細(xì)胞而獲得的重組酶的表達(dá)培養(yǎng)上清液后，用50mM Tris-HCl 0.1M NaCl pH7.5(下文中為T(mén)BS)洗滌柱子，并用0.1M甘氨酸pH3緩沖液洗脫。用1M Tris-HCl pH8.5中和洗脫的級(jí)分，并用TBS透析。所得到的純化酶的SDS-PAGE顯示在圖15中。也證實(shí)在所獲得的純化級(jí)分中存在vWF切割活性。并且從片段的N-末端氨基酸序列分析證實(shí)伴隨該重組酶片段vWF的切割點(diǎn)是842Tyr-843Met的位置。
然后測(cè)定衍生自純化重組體的ADAMTS-13的部分氨基酸序列。SDS-PAGE后，通過(guò)常規(guī)方法有效地轉(zhuǎn)移至PVDF膜，通過(guò)由PE AppliedBiosystems Co.制造的自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)序儀492分析空氣干燥的膜。從而顯示含有作為部分N-末端序列的Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-。這個(gè)序列與從基因結(jié)構(gòu)推測(cè)的成熟酶的N-末端序列一致。
實(shí)施例12(利用抗體從來(lái)自收集的人血漿FI糊狀物純化ADAMTS-13)FI糊狀物的溶解將FI糊狀物分為12g的小份，并且儲(chǔ)存為冷凍狀態(tài)。在使用前一天將其置于4℃并溶解，次日，加入120mL的溶解緩沖液(0.05％疊氮化物、50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaCl)，使其為10mg/mL，并于37℃攪拌2小時(shí)。在10000rpm離心10分鐘后，收集上清液并按順序經(jīng)過(guò)預(yù)濾器、5.0-μm濾器和0.8-μm濾器過(guò)濾以獲得溶解的樣品。
ADAMTS-13的凝膠過(guò)濾色譜法使溶解的FI糊狀物在Sephacryl S-300HR 5×90cm柱(Amersham-Pharmacia)上進(jìn)行第一次凝膠過(guò)濾。使用與溶解緩沖液相同的0.05％疊氮化物、50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaCl(以下為洗脫緩沖液)，流速為5mL/min，收集相應(yīng)于推測(cè)分子量為100k至300kDa的級(jí)分，滴加小部分的飽和硫酸銨溶液至終濃度相當(dāng)于33％的飽和度。進(jìn)一步使其在4℃靜置過(guò)夜。次日，在10000rpm離心10分鐘，收集沉淀的目標(biāo)活性級(jí)分。進(jìn)行5批的溶解、凝膠過(guò)濾和用硫酸銨沉淀的步驟，在-20℃使產(chǎn)品貯藏為冷凍狀態(tài)。
將通過(guò)硫酸銨沉淀第一次凝膠過(guò)濾物而獲得的2至3批沉淀物溶解在50mL的洗脫緩沖液中，并以與第一次相同的方式通過(guò)Sephacryl S-300HR柱(5×90cm)進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾。洗脫溶液、條件和操作都與第一次的相同。這個(gè)操作進(jìn)行兩次。
將通過(guò)硫酸銨沉淀第二次凝膠過(guò)濾物而獲得的兩批沉淀物溶解在50mL的洗脫緩沖液中，并以與第一次和第二次相同的方式通過(guò)SephacrylS-300HR柱(5×90cm)進(jìn)行第三次凝膠過(guò)濾。洗脫溶液、條件和操作都與第一次和第二次的相同。收集相應(yīng)于推測(cè)分子量為100k至300kDa的級(jí)分。通過(guò)與上述重組ADAMTS-13純化相同的步驟，利用固定克隆號(hào)WH10單克隆抗體的柱子純化這個(gè)收集的樣品。從而純化了圖16所示的SDS-PAGE中具有105kDa至160kDa大小的幾乎單一的ADAMTS-13。分析其的N-末端氨基酸序列，并且獲得與重組體相同的結(jié)果。
實(shí)施例13(通過(guò)抗體中和酶的活性)評(píng)估上述兔多克隆抗體對(duì)vWF切割酶活性的中和活性。將正常的兔血清、由利用連接至KLH的C-末端區(qū)域肽序列(SEQ ID No.2)Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser作為抗原而獲得的兔抗血清和通過(guò)由全長(zhǎng)ADAMTS-13表達(dá)載體表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫來(lái)源的抗血清(PoAb1)各自按照體積稀釋至1∶1或1∶10倍，而與1至10μg/ml(通過(guò)Bradford方法估計(jì))的重組ADAMTS-13以1比1的比率在37℃預(yù)先反應(yīng)1小時(shí)，對(duì)抗血清進(jìn)行上述的vWF切割活性分析以評(píng)估其活性的抑制。
結(jié)果是，如圖17所示制備對(duì)該酶具有抑制活性的抗體(使用金屬蛋白酶的抑制劑EDTA作為抑制的陽(yáng)性對(duì)照)。此外，從具有中和活性的多克隆抗體(PoAb1)表位分析的結(jié)果猜測(cè)(圖4)，中和表位可能由ADAMTS-13域結(jié)構(gòu)中的間隔結(jié)構(gòu)域指向N-末端而存在。此外，證實(shí)PoAb2和PoAb3也具有中和能力。由此推測(cè)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域等是具有中和能力的結(jié)構(gòu)域?？扇绱水a(chǎn)生中和抗體表明也可以構(gòu)建具有針對(duì)ADAMTS-13的自身抗體的獲得性TTP患者類(lèi)似的模型。
實(shí)施例14(檢測(cè)人血漿中抗-ADAMTS-13的抗體)使用實(shí)施例6中所顯示的方法，并且檢測(cè)獲得性TTP患者的血漿中抗-ADAMTS-13的抗體。將100μL的抗-FLAG抗體以2μg/mL固定到免疫模塊的96孔平板上后，F(xiàn)LAG標(biāo)記的ADAMTS-13野生型開(kāi)始發(fā)生反應(yīng)。此后，稀釋5、10、50倍的100μL樣品血漿在37℃反應(yīng)1小時(shí)，用含有0.05％的Tween20的Tris-緩沖液洗滌平板，在與抗-人的IgHRP共軛物于37℃反應(yīng)1小時(shí)后，進(jìn)行洗滌，并通過(guò)TMBZ等進(jìn)行顯色。如圖18中顯示的結(jié)果所證實(shí)的，與正常的血漿(正常)和先天性的TTP血漿(先天的)相比，只有獲得性的TTP患者(后天的)的血漿在450nm處顯示顯著的值，并且具有抗-ADAMTS-13的抗體。
實(shí)施例15(產(chǎn)生抗-小鼠的ADAMTS-13多克隆抗體(PoAb))以與人中相似的方式，通過(guò)常規(guī)方法將導(dǎo)入編碼小鼠所述酶的基因(WO 02/088366)的表達(dá)載體皮下地、皮內(nèi)地或肌內(nèi)地轉(zhuǎn)染到兔中以產(chǎn)生多克隆抗體(PoAb)。利用所得到的抗體，從小鼠血漿免疫沉淀并檢測(cè)所述的酶(圖19)?？烧J(rèn)識(shí)到所述酶的分子大小根據(jù)小鼠的品系而變化。此外，該多克隆抗體在平板上是固相的，并且進(jìn)一步的被生物素?；詷?gòu)建具有PoAb和PoAb的夾層ELISA(表4)。由此甚至可以在小鼠中分析測(cè)定所述酶的血液水平。
表4

對(duì)于在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物，在本說(shuō)明書(shū)中引入其全部?jī)?nèi)容。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易的理解對(duì)于本發(fā)明的各種改進(jìn)和變化都可能是有效的，而不背離所附的權(quán)利要求書(shū)中描述的本發(fā)明的技術(shù)理念和范圍。旨在本發(fā)明也包括這種改進(jìn)和變化。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的抗體顯示對(duì)ADAMTS-13的特異的免疫反應(yīng)性。因此，能夠快速檢測(cè)ADAMTS-13酶的數(shù)量、診斷與該酶的變化相關(guān)的疾病、有效的純化ADAMTS-13、或中和ADAMTS-13的酶活性。因此，本發(fā)明的抗體也具有多種應(yīng)用，包括檢測(cè)和純化ADAMTS-13?？梢酝ㄟ^(guò)制備本發(fā)明抗體的方法容易地獲得所需要量的如此有用的本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明顯示出如此顯著的作用和效果，并且可以被認(rèn)為是對(duì)本領(lǐng)域產(chǎn)生巨大貢獻(xiàn)的發(fā)明。此外，本發(fā)明的ADAMTS-13的部分缺失變體也可用于確定功能性重要的結(jié)構(gòu)域等。此外，能夠利用這些酶分子判斷針對(duì)樣品中存在的酶的抗體的存在或缺乏，并且提供對(duì)血小板減少癥原因進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)研究的方法，由此可以避免無(wú)意中錯(cuò)誤注射血小板的危險(xiǎn)。
序列表<110>JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE<120>針對(duì)von Willebrand因子切割酶的抗體及利用所述抗體的分析方法<130>PH-1893-PCT<150>JP 2002/279924<151>2002-09-25<150>JP 2002/377569<151>2002-12-26<160>19<210>1<211>1427<212>PRT<213>人源<400>1Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val1 5 10 15Ala Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro20 25 30Ser His Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala35 40 45Val Ser Ser Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro50 55 60Pro Ser Pro Gly Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala65 70 75Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro80 85 90Asp Val Phe Gln Ala His Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu95 100 105Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu110 115 120Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu Val Lys Met Val lle Leu Thr125 130 135Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser Ser140 145 150Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr Ile Asn Pro Glu Asp155 160 165Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu Tyr Ile Thr Arg170 175 180Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val Arg Gly Val
185 190 195Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu Ile200 205 210Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His Glu215 220 225Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser230 235 240Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala245 250 255Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu260 265 270Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro275 280 285Pro Arg Pro Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln290 295 300Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe305 310 315Gly Pro Lys Ala Val Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp320 325 330Met Cys Gln Ala Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser335 340 345Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys350 355 360Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val365 370 375Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His Gly Arg Trp Ser Ser Trp380 385 390Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Val395 400 405Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly Gly410 415 420Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met Cys Asn Thr425 430 435Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln Gln Cys440 445 450Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala455 460 465Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Pro His Ser Gln Gly Asp470 475 480Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile485 490 495Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro500 505 510Ser Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly
515 520 525Ser Cys Arg Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln530 535 540Val Trp Asp Arg Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys545 550 555Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr560 565 570Val Thr Phe Leu Thr Val Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile575 580 585Ala Asn His Arg Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly590 595 600G1y Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr605 610 615Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly Arg Val Glu Tyr Arg Val620 625 630Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile635 640 645Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln Val Tyr Arg Arg650 655 660Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp Ile Thr Phe665 670 675Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp Ala Ala680 685 690Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp695 700 705Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu710 715 720Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu725 730 735Ala Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp740 745 750Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg755 760 765Pro Val Arg Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu770 775 780Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala785 790 795Leu Glu Thr Cys Asn Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val800 805 810Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala815 820 825Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala830 835 840Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala
845 850 855Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His860 865 870Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp Gly875 880 885Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val Trp Thr Pro Ala890 895 900Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu Leu905 910 915Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val Gln Glu920 925 930Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val935 940 945Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala950 955 960Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu965 970 975Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu980 985 990Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu99510001005Ala Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser101010151020Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg102510301035Ser Val Ala Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val104010451050Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val105510601065Pro Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr107010751080Trp Met Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg108510901095Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala110011051110Asp Phe Cys Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys111511201125Trp Ala Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro113011351140His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala114511501155Gly Ala Ser Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser116011651170Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn
117511801185Ser Val Gln Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr119011951200Gly Thr Ile Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val120512101215Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu122012251230Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp123512401245Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met125012551260Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys126512701275Gly Arg Pro Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu128012851290Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly129513001305Pro Trp Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser131013151320Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala132513301335Arg Ile Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr134013451350Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser135513601365Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu137013751380Ser Glu Ser Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu138513901395Lys Ala Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser1400140514l0Trp Val Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu141514201425Gly Thr1427<210>2<211>22<212>PRT<213>人源<400>2Phe Ser Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln1 5 10 15Glu Asn Ser Val Gln Ser Ser
20<210>3<211>18<212>PRT<213>人源<400>3Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu1 5 10 15Gln Glu Asp<210>4<211>30<212>DNA<213>人源<400>4ctggagcacg acggcgcgcc cggcagcggc30<210>5<211>30<212>DNA<213>人源<400>5atgtgcaaca ctcaggcctg cgagaagacc30<210>6<211>30<212>DNA<213>人源<400>6ccaacctgac cagtgtctac attgccaacc30<210>7<211>21<212>DNA<213>人源<400>7ctggagccct gcccacctag g 21<210>8<211>62<212>DNA<213>人源<400>8
tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgtcccacac gcagcgcgcc60cg 62<210>9<211>62<212>DNA<213>人源<400>9tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgcgcccatg cactgctgct60at 62<210>10<211>62<212>DNA<213>人源<400>10gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cttgcgacat gaactccagc60tg 62<210>11<211>62<212>DNA<213>人源<400>11gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccaggttggg ggtaactgtc60ag 62<210>12<211>62<212>DNA<213>人源<400>12tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccacccaggc ctgccgtggc60tt 62<210>13<211>62<212>DNA<213>人源<400>13tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgtagggagg gcagggttcg60ag 62<210>14
<211>62<212>DNA<213>人源<400>14tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccctggcagg gcagggctgg 60gg 62<210>15<211>62<212>DNA<213>人源<400>15gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccacgtgtgc agcttgagcc 60cc 62<210>16<211>62<212>DNA<213>人源<400>16gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccctaggtgg gcagggctcc 60ag 62<210>17<211>62<212>DNA<213>人源<400>17gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt caccctgtcc cacacagggc 60cc 62<210>18<211>60<212>DNA<213>人源<400>18tccaagcttg tcgactctta tcacttatcg tcatcgtcct tgtagtcggt tccttccttt 60<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA
<400>19gactacaagg acgatgacga taagtga 27<210>20<211>8<212>RPT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<400>20Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1權(quán)利要求
1.針對(duì)蛋白質(zhì)或肽的抗體，其中該蛋白質(zhì)或肽由構(gòu)成von Willebrand因子切割酶(在下文中也稱(chēng)為ADAMTS-13)的全長(zhǎng)氨基酸序列、在所述氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)上述氨基酸序列的部分序列、或包括所述的全長(zhǎng)氨基酸序列的多肽鏈組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中ADAMTS-13來(lái)源于靈長(zhǎng)類(lèi)或嚙齒類(lèi)。
3.針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成SEQ ID No.1所示的ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)所述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13氨基酸序列的多肽鏈組成。
4.識(shí)別構(gòu)成如SEQ ID No.1所示的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽的一部分的抗體，其中所述的部分是從間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端的區(qū)域、或從金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域或富含Cys的區(qū)域到所述間隔結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的抗體，其適用于親合純化蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)上述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽鏈組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的抗體，其能夠抑制或中和蛋白質(zhì)酶活性，其中該蛋白質(zhì)由在構(gòu)成ADAMTS-13的氨基酸序列中通過(guò)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的經(jīng)修飾的氨基酸序列，或任何一個(gè)所述氨基酸序列的部分序列、或包含所述的ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽鏈組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其中該抗體識(shí)別從ADAMTS-13的間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域或解聚素-樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
8.由包括如SEQ ID Nos.2和3所示的ADAMTS-13的部分肽的免疫原制備的抗體。
9.通過(guò)用表示為全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度的如SEQ ID No.1所示的多肽鏈進(jìn)行免疫，或通過(guò)將能夠表達(dá)所述多肽鏈的表達(dá)載體直接轉(zhuǎn)染到動(dòng)物中而制備的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的抗體，其是多克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的抗體，其是單克隆抗體，以及編碼所述抗體的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的單克隆抗體，其是由選自雜交瘤系WH10(保藏號(hào)FERM BP-8174)、雜交瘤系WH63.1(保藏號(hào)FERM BP-8175)、雜交瘤系WHS40.3(保藏號(hào)FERM BP-8176)、雜交瘤系Pep4-34.1(保藏號(hào)FERM BP-8177)、雜交瘤系WH2-22-1A(保藏號(hào)FERM BP-8483)、雜交瘤系WH2-1-1(保藏號(hào)FERM BP-8484)、雜交瘤系WH2-11-1(保藏號(hào)FERM BP-8485)、雜交瘤系Pep6-6A(保藏號(hào)FERM BP-8474)和雜交瘤系Pep4-5B-1(保藏號(hào)FERM BP-8475)的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體，以及編碼所述單克隆抗體的基因。
13.可結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合由權(quán)利要求1至12中任何一項(xiàng)所述的抗體識(shí)別的ADAMTS-13的表位的抗體。
14.藥物組合物或診斷性的藥物，其包括權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體。
15.經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，其包含權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體作為組分。
16.經(jīng)分離的細(xì)胞，其可產(chǎn)生權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其是雜交瘤。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其選自雜交瘤系WH10(保藏號(hào)FERM BP-8174)、雜交瘤系WH63.1(保藏號(hào)FERM BP-8175)、雜交瘤系WHS40.3(保藏號(hào)FERM BP-8176)、雜交瘤系Pep4-34.1(保藏號(hào)FERM BP-8177)、雜交瘤系WH2-22-1A(保藏號(hào)FERM BP-8483、雜交瘤系WH2-1-1(保藏號(hào)FERM BP-8484)、雜交瘤系WH2-11-1(保藏號(hào)FERM BP-8485)、雜交瘤系Pep6-6A(保藏號(hào)FERM BP-8474)和雜交瘤系Pep4-5B-1(保藏號(hào)FERM BP-8475)。
19.免疫測(cè)定試劑盒，其包含權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體。
20.用于制備抗體的方法，其包括下列步驟用包括部分或全部ADAMTS-13的氨基酸序列的多肽免疫和致敏溫血?jiǎng)游?，以及從所述的?jīng)免疫和致敏的溫血?jiǎng)游锏捏w液提取如權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體。
21.用于制備如權(quán)利要求20所述的抗體的方法，其中用于免疫和致敏溫血?jiǎng)游锏亩嚯陌ㄗ鳛锳DAMTS-13的一部分的、部分或完整的序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
22.用于制備抗體的方法，包括下列步驟體內(nèi)或體外培養(yǎng)可以產(chǎn)生權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述抗體的經(jīng)分離的細(xì)胞，以及從體液或培養(yǎng)物中提取所述的抗體。
23.權(quán)利要求22所述的制備抗體的方法，其中可以產(chǎn)生抗體的分離細(xì)胞是雜交瘤。
24.權(quán)利要求20至23中任何一項(xiàng)所述的制備抗體的方法，其中通過(guò)一種或多種選自鹽析、透析、過(guò)濾、濃縮、離心、分級(jí)沉淀、凝膠過(guò)濾色譜法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、親和色譜法、凝膠電泳和等電聚焦的純化方法來(lái)提取抗體。
25.檢測(cè)ADAMTS-13的方法，其特征在于將權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體與分析靶物接觸并通過(guò)免疫反應(yīng)檢測(cè)ADAMTS-13。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的檢測(cè)方法，其是利用權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體，通過(guò)放射免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定或熒光免疫分析進(jìn)行的。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的檢測(cè)方法，其中的分析靶物是從活體提取的生物樣品。
28.用于純化ADAMTS-13的方法，其包括下列步驟將權(quán)利要求1至13中任何一項(xiàng)所述的抗體與包含ADAMTS-13和雜質(zhì)的混合物接觸使所述蛋白質(zhì)吸附在抗體上，以及使所述的被吸附的蛋白質(zhì)從抗體釋放出來(lái)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的純化方法，其中該抗體結(jié)合不溶于水的載體。
30.診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，包括作為主要成分的、從ADAMTS-13的間隔結(jié)構(gòu)域到N-末端、從金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚素-樣結(jié)構(gòu)域、Tsp1-1結(jié)構(gòu)域的區(qū)域、或富含Cys的區(qū)域到間隔結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
32.一種試劑、診斷性的藥品或藥物產(chǎn)品，其用于檢測(cè)針對(duì)包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體的多肽鏈的抗體。
33.用于檢測(cè)抗體或分析表位的抗原的用途和制備方法，該抗原包括作為主要成分的ADAMTS-13的全長(zhǎng)序列或其部分缺失的變體。
全文摘要
提供對(duì)ADAMTS－13顯示有選擇的免疫反應(yīng)性的抗體，以及該抗體在表位分析或ADAMTS－13自身抗體－陽(yáng)性患者診斷中的應(yīng)用。備選地，為了應(yīng)用于藥物產(chǎn)品，提供用于生產(chǎn)和使用部分缺失的修飾的ADAMTS－13分子的方法。特異于ADAMTS－13的抗體可從用包含部分或完整的ADAMTS－13氨基酸序列的多肽免疫和致敏的溫血?jiǎng)游铽@得；用于生產(chǎn)抗體的方法包括用包含部分或完整的ADAMTS－13氨基酸序列的多肽免疫和致敏溫血?jiǎng)游锏牟襟E；上述抗體的用途包括檢測(cè)和純化ADAMTS－13的方法；以及提供部分缺失的修飾的ADAMTS－13分子。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1701117SQ0382539
公開(kāi)日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月25日
發(fā)明者副島見(jiàn)事, 三村法子, 前田浩明, 野崎周英, 濱本高義, 中垣智弘 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所