專利名稱：通過法夫酵母生產(chǎn)角黃素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葉黃素類胡蘿卜素的生產(chǎn)，尤其涉及通過法夫酵母(Phaffia)屬的微生物來生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮。
更特別的，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)葉黃素類胡蘿卜素的方法，尤其是通過遺傳修飾的法夫酵母屬的重組微生物來生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的方法。
采用本發(fā)明的方法，可以在法夫酵母屬的重組微生物中生產(chǎn)除了蝦青素之外的其他有用的葉黃素類胡蘿卜素，如作為主要葉黃素類胡蘿卜素的角黃素和海膽烯酮。
任何能生產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株都可作為合適的宿主菌株。當(dāng)選擇的宿主菌株是能從β-胡蘿卜素中生產(chǎn)蝦青素的常規(guī)法夫酵母菌株時(shí)，在編碼β-胡蘿卜素酮酶的基因被導(dǎo)入和表達(dá)后，可產(chǎn)生蝦青素和其他葉黃素類胡蘿卜素的混合物。另一方面，當(dāng)不能產(chǎn)生蝦青素和可積累β-胡蘿卜素的菌株被選擇作為所述的宿主菌株時(shí)，可以預(yù)期產(chǎn)生最高水平的葉黃素類胡蘿卜素如角黃素和海膽烯酮，并且無蝦青素的積累?？赏ㄟ^誘變累積蝦青素的紅法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)獲得累積β-胡蘿卜素的宿主菌株。可選的，還可通過失活蝦青素合成酶來獲得累積β-胡蘿卜素的宿主菌株，蝦青素合成酶是一種涉及從β-胡蘿卜素中合成蝦青素的生物合成過程的酶，其公開于美國(guó)專利US 6,365,386中。蝦青素合成酶基因的破壞是酶失活最常規(guī)的方法之一。
此外，還可通過公共典型培養(yǎng)物保存中心獲得這類累積β-胡蘿卜素的宿主菌株。例如，可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)購(gòu)買累積β-胡蘿卜素的紅法夫酵母P.rhodozyma ATCC96815菌株。分離一種新的β-胡蘿卜素累積紅法夫酵母菌株，它可以是從自然環(huán)境中產(chǎn)生蝦青素基因的菌株之衍生物或自發(fā)突變體，這將是制備本發(fā)明宿主菌株的另一種途徑。
一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)β-胡蘿卜素酮酶的重組法夫酵母菌株。
所述的β-胡蘿卜素酮酶催化β-胡蘿卜素中的β-紫羅蘭酮環(huán)上的4和4′位置上的亞甲基轉(zhuǎn)化為酮基基團(tuán)，從而經(jīng)海膽烯酮產(chǎn)生葉黃素、角黃素。已從許多物種中分離得到編碼該酶的基因，例如從海洋細(xì)菌中分離的crtW(橙黃瓊脂桿菌(Agrobacterium aurantiacum)和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.))，從Paracoccus marcusii中分離的crtW(GenBank登記號(hào)No.Y15112)，從Paracoccus carotinifaciens sp.nov.中分離的crtW，和從雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中分離的bkt基因(GenBank登記號(hào)No.D45881)。
在本發(fā)明中，編碼具有β-胡蘿卜素酮酶活性的蛋白的任何基因均可采用。
優(yōu)選的，所述β-胡蘿卜素酮酶基因可從選自如下屬微生物組的微生物中獲得土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產(chǎn)堿菌屬、副球菌屬(Paracoccus)、和具有β-胡蘿卜素酮酶基因的紅球藻(Haematococcus)。
更優(yōu)選，所述β-胡蘿卜素酮酶基因可從選自如下組的微生物中獲得橙黃瓊脂桿菌(GenBank登記號(hào)No.D58420)、產(chǎn)堿菌PC-1(GenBank登記號(hào)No.D58422)、Paracoccus marcusii MH1(GenBank登記號(hào)No.Y15112)、格蘭氏陰性菌E-396(FERM BP-4283)(日本專利JP-A昭和10-155497的說明書中記載了來源于該微生物的β-胡蘿卜素酮酶基因的DNA序列)、和攜帶β-胡蘿卜素酮酶基因的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)(GenBank登記號(hào)No.D45881)，其中GenBank登記號(hào)表示來源于不同微生物的各自的β-胡蘿卜素酮酶基因的DNA序列。
更優(yōu)選，所述的β-胡蘿卜素酮酶基因可來源于產(chǎn)堿菌PC-1，或者其基本上同源的DNA序列。
術(shù)語(yǔ)“基本上同源的DNA序列”是指所述編碼β-胡蘿卜素酮酶的DNA序列為編碼氨基酸序列的DNA序列，其中該氨基酸序列與產(chǎn)堿菌PC-1的crtW氨基酸序列相比具有超過60％，優(yōu)選超過70％，更優(yōu)選超過80％，和最優(yōu)選超過90％的同源性，并且該多肽的氨基酸序列與產(chǎn)堿菌PC-1的crtW編碼的酶具有相同類型的酶活性。
通過利用β-胡蘿卜素酮酶基因，可以使法夫酵母屬的微生物具有生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的能力?？刹捎霉闹亟M技術(shù)來制備表達(dá)β-胡蘿卜素酮酶基因的法夫酵母重組微生物。
用于分離和克隆編碼本發(fā)明β-胡蘿卜素酮酶DNA的技術(shù)為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，其包括從基因組DNA中的分離?？赏ㄟ^聚合酶鏈反應(yīng)(下文中稱作PCR)來實(shí)現(xiàn)由這種基因組DNA來克隆本發(fā)明的DNA序列。
分離或克隆的編碼β-胡蘿卜素酮酶的DNA在克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體后可優(yōu)選的用于在宿主微生物法夫酵母中表達(dá)所述酶。
“表達(dá)載體”包括能表達(dá)所含的DNA序列的載體，其中所述的序列可操縱的與其他序列，如能影響所述DNA序列在法夫酵母屬的微生物中表達(dá)的調(diào)控序列相連接。術(shù)語(yǔ)“可操縱的連接”是指一種并列方式，其中所述的元件間呈以允許其按照其預(yù)期的方式行使功能的關(guān)系。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”包括，最小程度，是指感興趣基因表達(dá)所需的元件；并且還可包括其他的有用元件。一般而言，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、終止子，和在某些情況下包括增強(qiáng)子、反式激活蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。組成型啟動(dòng)子，如來源于紅法夫酵母(P.rhodozyma)(WO 97/23,633)的甘油醛-3-脫氫酶(GAP)基因啟動(dòng)子可用于實(shí)現(xiàn)組成型表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子還可被用于實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)施例之一為編碼熱休克蛋白或淀粉酶基因及其類似物的啟動(dòng)子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可被用于構(gòu)建所述的表達(dá)載體。
它的含義是，雖然沒有清楚的闡述，即所述表達(dá)載體必須以游離基因的方式或作為整合至染色體DNA的一部分的方式在宿主有機(jī)體中進(jìn)行復(fù)制。通常，在后一種情況下可以預(yù)計(jì)所述基因具有更高的穩(wěn)定性。為了通過同源重組的方式將表達(dá)載體整合至宿主微生物染色體上，制備含有與宿主基因組DNA同源的DNA片段的至少一部分的載體?；诖耍诜ǚ蚪湍笇俚奈⑸镏锌捎行У牟捎胷DNA基因片段。所述的rDNA為一種在基因組中以多拷貝方式存在的衛(wèi)星DNAs。通過采用rDNA片段作為表達(dá)載體上的靶DNA，所述載體上的待表達(dá)目的DNA可被整合至宿主基因組上，并且也可以多拷貝的形式存在。這可提高基因用量效果，從而有助于目標(biāo)酶的超表達(dá)。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述的rDNA片段可以方便的用于該目的。本發(fā)明試圖包括那些具有等效功能，并在以后公開的其他形式的表達(dá)載體。
可采用各種方式來操縱編碼β-胡蘿卜素酮酶的分離的DNA序列以實(shí)現(xiàn)多肽表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體的需要，在插入表達(dá)載體之前，可取的或必須的可對(duì)編碼所述β-胡蘿卜素酮酶的核酸序列進(jìn)行操作。修飾用于克隆方法的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
克隆于表達(dá)載體中的含有所述β-胡蘿卜素酮酶的重組DNA可被導(dǎo)入宿主微生物中。將外源DNA導(dǎo)入真菌細(xì)胞(包括法夫酵母屬的微生物)中的方法是本領(lǐng)域公知的。其包括，例如，通過LiCl方法轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體融合，電穿孔，通過采用DNAs包裹的粒子進(jìn)行轟擊的粒子槍方法。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用粒子槍方法作為紅法夫酵母的轉(zhuǎn)化方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知粒子槍方法的操作步驟。
從而獲得的重組有機(jī)體可超表達(dá)編碼β-胡蘿卜素酮酶的DNA序列。因此，本發(fā)明的重組有機(jī)體可用于葉黃素類胡蘿卜素，尤其是角黃素和海膽烯酮的生產(chǎn)過程。
本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的生物方法，其包括在需氧條件下，在含有生產(chǎn)類胡蘿卜素底物的水溶液營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)法夫酵母重組微生物，并從所述重組微生物或從培養(yǎng)基中分離獲得的類胡蘿卜素。
包括葉黃素的類胡蘿卜素通常通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)法夫酵母菌株來生產(chǎn)，其中所述培養(yǎng)基含有細(xì)胞所需的適量的大量和微量營(yíng)養(yǎng)元素，如作為細(xì)胞生長(zhǎng)所需的碳源和生產(chǎn)類胡蘿卜素的底物的糖蜜、蔗糖或葡萄糖，以及氮源如玉米浸出液、酵母提取物、硫酸氫二銨、磷酸銨、氫氧化銨或尿素，以及磷源如磷酸銨和磷酸，和添加的微量營(yíng)養(yǎng)元素或無機(jī)鹽，如硫酸鎂、硫酸鋅和生物素或脫硫生物素。
培養(yǎng)的優(yōu)選條件為4至8的pH范圍，溫度為15至26℃，培養(yǎng)24至500小時(shí)。更優(yōu)選的培養(yǎng)條件為5至7的pH范圍，溫度為18至22℃，培養(yǎng)48至350小時(shí)。
在培養(yǎng)過程中，通氣和攪拌通常有助于獲得更好的類胡蘿卜素生產(chǎn)效果。
當(dāng)采用本發(fā)明的方法，通過培養(yǎng)重組法夫酵母菌株生產(chǎn)得到類胡蘿卜素后，當(dāng)其分泌至培養(yǎng)基中時(shí)，可從培養(yǎng)基中分離類胡蘿卜素，或從微生物細(xì)胞中分離；并且當(dāng)只需要一種特定類胡蘿卜素時(shí)，如果需要，可采用本領(lǐng)域公知的方法將其與其他類胡蘿卜素分離開。
按照本發(fā)明方法生產(chǎn)得到的類胡蘿卜素可用于食品或飼料的加工。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知該過程。這類復(fù)合食品或飼料可進(jìn)一步包括常規(guī)用于該目的、且本領(lǐng)域公知的添加劑或組分。
如下實(shí)施例用于進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，且其不用于限制本發(fā)明的范圍。
在下述實(shí)施例中采用如下材料和方法菌株紅法夫酵母ATCC96594菌株(按照布達(dá)佩斯條約于1998年4月8日進(jìn)行再保藏，保藏號(hào)No.ATCC 74438)紅法夫酵母ATCC96815菌株(按照布達(dá)佩斯條約于1999年2月18日進(jìn)行再保藏，保藏號(hào)No.ATCC 74486)E.coli TOP10F-，mcrA，δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，δ(lacZ M15)，δ(lacX74)，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)pGEM-T(Promega公司，USA)方法限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)于Takara Shuzo(Ohtsu，JP)。利用Perkin Elmer2400型熱循環(huán)儀進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。每個(gè)PCR條件均在實(shí)施例中記載。從商業(yè)提供商處購(gòu)得PCR引物。用于DNA測(cè)序的熒光DNA引物購(gòu)于Pharmacia。采用自動(dòng)熒光DNA測(cè)序儀(ALFred，Pharmacia)進(jìn)行DNA測(cè)序。
β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)于WAKO(Osaka，日本)。葉黃素和海膽烯酮購(gòu)于Roche Vitamins AG(Basle，瑞士)。
實(shí)施例1表達(dá)載體元件的制備制備了表達(dá)載體元件G418抗性基因，紅法夫酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(下稱GAP)的啟動(dòng)子和終止子區(qū)域，和P.rhodozyma的rDNA片段。
按如下方法制備G418抗性基因盒。將Sac I-接頭連接至攜帶有G418抗性基因盒的pUC-G418(US專利No.6,365,386 B1)載體的特定Hind III位點(diǎn)，將得到的載體命名為pG418Sa512。
將從pG418Sa512上切下的1.7kb KpnI/Sac I片段用作G418抗性基因盒。
利用紅法夫酵母ATCC 96594的基因組DNA作為模板，通過PCR得到GAP基因的每一啟動(dòng)子和終止子以及rDNA片段。為了獲得基因組DNA，使用了QIAGEN血液&細(xì)胞培養(yǎng)DNA中型試劑盒(QIAGEN，德國(guó))和通過在YPD(Difco實(shí)驗(yàn)室)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)得到的P.rhodozyma ATCC 96594細(xì)胞。
采用制備的基因組DNA作為模板，利用Advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH實(shí)驗(yàn)室，Inc.，USA)和熱循環(huán)儀(Perkin Elmer 2400，USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
用于擴(kuò)增GAP啟動(dòng)子序列的合成引物為GAP#1(SEQ ID NO1)(具有Not I位點(diǎn)GCGGCCGC)和GAP#5(SEQ ID NO2)(具有Sma I位點(diǎn)CCCGGGG)。
開始的模板變性步驟包括94℃5分鐘。重復(fù)25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)94℃30秒，55℃30秒，和72℃1分鐘。在72℃下反應(yīng)另外10分鐘后，將反應(yīng)混合物在4℃下保存。通過該反應(yīng)，擴(kuò)增得到了含GAP啟動(dòng)子(398bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司，USA)將該擴(kuò)增的GAP啟動(dòng)子與pCR2.1-TOPO載體連接并導(dǎo)入E.coli TOP 10細(xì)胞中。挑選了幾個(gè)克隆子用于測(cè)序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的GAP啟動(dòng)子序列。將顯示出具有與紅法夫酵母GAP啟動(dòng)子序列(GenBank登記號(hào)No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-pGAP2#1。從pTOPO-pGAP2#1上切下的一398bp NotI/Sma I片段被用作GAP啟動(dòng)子表達(dá)盒。
用于擴(kuò)增GAP終止子的兩條合成引物為GAP#33(SEQ ID NO3)(具有BamH I-Sal I位點(diǎn)GGATCCGTCGAC)和GAP#4(SEQ ID NO4)(具有Kpn I位點(diǎn)GGTACC)。
其PCR反應(yīng)條件與上述GAP啟動(dòng)子的反應(yīng)條件相同。通過該反應(yīng)，擴(kuò)增獲得了含GAP終止子(302bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆試劑盒將擴(kuò)增的GAP終止子與pCR2.1-TOPO載體連接并導(dǎo)入E.coli TOP 10細(xì)胞中。挑選了幾個(gè)克隆子用于測(cè)序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的GAP終止子序列。將顯示出具有與紅法夫酵母GAP終止子序列(GenBank登記號(hào)No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-tGAP#1。從pTOPO-tGAP#1上切下的一302bp BamHI/Kpn I片段被用作GAP終止子表達(dá)盒。
用于擴(kuò)增rDNA片段的的兩條合成引物為R#1(SEQ ID NO5)(具有Sac I位點(diǎn)GAGCTC)和R#2(SEQ ID NO6)(具有NotI-Sac I位點(diǎn)GCGGCCGCGAGCTC)。
其PCR反應(yīng)條件與上述GAP啟動(dòng)子的反應(yīng)條件相同。通過該反應(yīng)，擴(kuò)增獲得了含rDNA(3126bp)的DNA片段。采用TOPO TA克隆試劑盒將擴(kuò)增的rDNA片段與pCR2.1-TOPO載體連接并導(dǎo)入E.coli TOP 10細(xì)胞中。挑選了幾個(gè)克隆子用于測(cè)序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的rDNA序列。將顯示出具有與紅法夫酵母rDNA序列(GenBank登記號(hào)No.D31656,AF139632)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-rDNA#1。從pTOPO-rDNA#1上切下的一1960bp SacII/Not I片段被用作rDNA表達(dá)盒。
實(shí)施例2攜帶β-胡蘿卜素酮酶基因(crtW)的表達(dá)載體的構(gòu)建及其在角黃素和海膽烯酮的生產(chǎn)中的用途通過逆向翻譯氨基酸序列(GenBank登記號(hào)D58422)，采用基于PCR的基因合成方法獲得了編碼產(chǎn)堿菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素酮酶的人工crtW基因。詳細(xì)的方法記載于US 6,124,113專利的實(shí)施例中。在該情況下，設(shè)計(jì)了兩條末端引物用于分別向crtW基因的5′-末端和3′-末端導(dǎo)入限制性酶切位點(diǎn)Sma I和BamH I。
采用pGEM-T做為主鏈，按順序連接rDNA表達(dá)盒和GAP啟動(dòng)子表達(dá)盒(實(shí)施例1中獲得的)，以及上述構(gòu)建的crtW基因，和GAP終止子表達(dá)盒和G418抗性基因表達(dá)盒(實(shí)施例1中獲得的)，從而構(gòu)建攜帶crtW基因的表達(dá)載體。
采用如EP 1,158,051中所述的粒子槍方法將獲得的表達(dá)載體導(dǎo)入紅法夫酵母ATCC 96815中。
將獲得的P.rhodozyma ATCC 96815的crtW-重組菌株首先在盛有7ml種子培養(yǎng)基的試管(直徑21mm)中在20℃下震蕩培養(yǎng)3天，然后將其接種至盛有50ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中在20℃下震蕩培養(yǎng)7天。取適量體積的培養(yǎng)物用于細(xì)胞生長(zhǎng)分析和類胡蘿卜素生產(chǎn)。
培養(yǎng)基組分如下種子培養(yǎng)基葡萄糖30.0g/l，NH4Cl 4.83g/l，KH2PO41.0g/l，MgSO4-7H2O 0.88g/l，NaCl 0.06g/l，CaCl2-2H2O 0.2g/l，KH phtalate 20.0g/l，F(xiàn)eSO4-7H2O 28mg/l，微量元素溶液0.3ml，維生素貯存液1.5ml，(調(diào)節(jié)pH5.4-5.6)微量元素溶液4NH2SO4100ml/l，檸檬酸-H2O 50.0g/l，ZnSO4-7H2O16.7g/l，CuSO4-5H2O 2.5g/l，MnSO4-4，5H2O 2.0g/l，H3BO32.0g/l，Na2MoO42.0g/l，KI 0.5g/l，用于種子培養(yǎng)基的維生素貯存液4N-H2SO417.5ml/l，肌醇40.0g/l，煙酸2.0g/l，D-泛酸鈣(Ca-D-Pantothenate)2.0g/l，維生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-對(duì)氨基苯甲酸1.2g/l，維生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液8.0ml生物素貯存液通過向50ml乙醇中添加4N-H2SO4至總體積100ml來制備。然后，加入400mg的D-生物素。
生產(chǎn)培養(yǎng)基葡萄糖22.0g/l，KH2PO414.25g/l，MgSO4-7H2O 2.1g/l，CaCl2-2H2O 0.865g/l，(NH4)2SO43.7g/l，F(xiàn)eSO4-7H2O 0.28g/l，微量元素溶液4.2ml，維生素貯存溶液9.35ml，(調(diào)節(jié)pH至5.5)用于生產(chǎn)培養(yǎng)基的維生素貯存溶液4N H2SO417.5ml/l，煙酸2.0g/l，D-泛酸鈣3.0g/l，維生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-對(duì)氨基苯甲酸1.2g/l，維生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液30.0ml一部分種子培養(yǎng)物(2.5ml)被轉(zhuǎn)移至盛有47.5ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的500ml的錐形瓶中。然后在20℃下以200rpm的速度旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)。在發(fā)酵后第二天，向培養(yǎng)基中加入50％葡萄糖溶液5ml并繼續(xù)發(fā)酵。在發(fā)酵的第四天，取2ml培養(yǎng)物并再次向培養(yǎng)基中加入5ml 50％葡萄糖溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)3天。在第七天，取部分培養(yǎng)物用于類胡蘿卜素產(chǎn)量和細(xì)胞生長(zhǎng)的分析。
為了進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)分析，采用UV-1200光度計(jì)(Shimadzu Corp.，Kyoto，日本)測(cè)量660nm處的光密度。
為了進(jìn)行β-胡蘿卜素，角黃素和海膽烯酮含量的分析，將提取的培養(yǎng)基與溶劑混合物(乙基乙醇，己烷和乙基乙酸鹽)混合，并通過加入玻璃珠劇烈震蕩從P.Rhodozyma的細(xì)胞和培養(yǎng)物中提取類胡蘿卜素。提取后，通過離心除去破裂的細(xì)胞和玻璃珠，取獲得的上清液利用HPLC進(jìn)行類胡蘿卜素含量分析。
使用的HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)；溫度室溫；洗脫液丙酮/己烷(18/82)加到1ml/l水用于洗脫；注射體積10μl；流速2.0ml/min；檢測(cè)450nm UV。
序列表<110>Roche Vitamins AG<120>通過法夫酵母生產(chǎn)角黃素<130>NDR5224<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工的<400>1gcggccgctg gtgggtgcat gtatgtac 28<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<400>2cccggggatg gtaagagtgt tagaga 26<210>3<211>33<212>DNA<213>人工的<400>3gga tccgtcg actaaacggt tctctccaaa ccc 33<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<400>4ggtaccttga tcagataaag atagagat 28<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<400>5gagctctcga gtggacggtg 20
<210>6<211>28<212>DNA<213>人工的<400>6gcggccgcga gctcatcccg cttcactc 28
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的方法，其包括在需氧條件下，在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Xanthophyllomyces(法夫酵母Phaffia)屬的表達(dá)β-胡蘿卜素酮酶基因的重組微生物，并從所述重組微生物細(xì)胞或從液體培養(yǎng)物中分離得到的類胡蘿卜素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組微生物來源于Xanthophyllomyces dendrorhous(紅法夫酵母Phaffia rhodozyma)ATCC96815，或其突變體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿卜素酮酶基因來源于選自如下的微生物土壤桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、副球菌屬、和紅球藻，其具有β-胡蘿卜素酮酶基因。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿卜素酮酶基因來源于選自橙黃瓊脂桿菌、產(chǎn)堿菌PC-1、Paracoccus marcusii MH1、革蘭氏陰性菌E-396(FERM BP-4283)、和雨生紅球藻，其攜帶β-胡蘿卜素酮酶基因的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿卜素酮酶基因來源于產(chǎn)堿菌PC-1或與其基本上同源的β-胡蘿卜素酮酶基因的DNA序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的β-胡蘿卜素酮酶基因在使用了調(diào)控序列的重組微生物中表達(dá)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)在pH4至8的范圍和15至26℃的溫度范圍中培養(yǎng)24至500小時(shí)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中培養(yǎng)在pH5至7的范圍和18至22℃的溫度范圍中培養(yǎng)48至350小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)角黃素和海膽烯酮的方法，其包括在需氧條件下，在水溶液營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種來源于Xanthophyllomyces(法夫酵母)屬的、表達(dá)β－胡蘿卜素酮酶基因的重組微生物，并從所述的重組微生物細(xì)胞中或從培養(yǎng)基中分離得到類胡蘿卜素。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1788091SQ03825474
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者星野達(dá)雄, 尾島和之, 瀨戶口豐 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)公司