專利名稱：與人胰腺癌相關(guān)的基因和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是癌癥研究領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及參與細(xì)胞增殖機(jī)制的新基因C1958V1和C1958V2以及該基因編碼的多肽。本發(fā)明的基因和多肽可以在診斷細(xì)胞增殖性疾病時(shí)使用，并作為開(kāi)發(fā)針對(duì)該疾病的靶分子。
背景技術(shù)：
胰腺癌患者的死亡率比其他任何類(lèi)型的惡性腫瘤的死亡率都要更糟，5年生存率僅為4％(Greenlee等，2001)。此惡性瘤的不良愈后效果反應(yīng)出早期診斷的艱難和現(xiàn)有療法的治療效果一般都較差(DiMagno等，1999；Greenlee等，2001)。特別是無(wú)法獲得在早期和潛在治療期用于臨床檢測(cè)該疾病的腫瘤標(biāo)記物。外科切除術(shù)是目前唯一的可行療法，但那些診斷可實(shí)施外科切除的患者占此癌癥患者的少于20％(DiMagno等，1999；Klinkenbijl等，1999)。內(nèi)鏡超聲(EUS)、內(nèi)鏡逆行膽管胰管造影術(shù)(ERCP)和螺旋(spiral)CT可用于篩選具有家族性胰腺癌危險(xiǎn)的個(gè)體(Brentnall等，1999)，但從時(shí)間和篩選每個(gè)無(wú)癥狀個(gè)體的成本效益上來(lái)講，這些方法都是不實(shí)際的。因此，必須開(kāi)發(fā)對(duì)胰腺癌敏感且特異的腫瘤標(biāo)記物。
幾乎所有的晚期患者都無(wú)法醫(yī)治。為了克服此情況，一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)嘗試在分子技術(shù)的基礎(chǔ)上建立治療策略。所述試驗(yàn)包括例如MMP抑制劑、抑制Ras法尼基轉(zhuǎn)移酶的藥物和基于抗體的方法(Hao和Rowinsky，2002；Laheru等，2001；Rosenberg，2000)。但是這些試驗(yàn)對(duì)此疾病并沒(méi)有明顯的效果。
cDNA芯片技術(shù)已經(jīng)能獲得正常和惡性細(xì)胞中基因表達(dá)的全面圖譜，并可對(duì)惡性和相應(yīng)正常細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行比較(Okabe等，Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。該方法能揭示癌細(xì)胞的復(fù)雜特性，并幫助理解致癌機(jī)理。腫瘤中失調(diào)基因的鑒定能使個(gè)體癌癥的診斷更精確和正確，并能開(kāi)發(fā)出新的治療靶標(biāo)(Bienz和Clevers，Cell 103311-20(2000))。為了從基因組角度揭示腫瘤潛在機(jī)理，發(fā)現(xiàn)診斷用靶分子和開(kāi)發(fā)新的治療性藥物，本發(fā)明已經(jīng)利用23040個(gè)基因的cDNA芯片對(duì)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行了分析(Okabe等，Cancer Res612129-37(2001)；Kitahara等，Cancer Res 613544-9(2001)；Lin等，Oncogene 214120-8(2002)；Hasegawa等，Cancer Res 627012-7(2002))。
意欲揭示致癌機(jī)理的研究已經(jīng)促進(jìn)了抗腫瘤劑分子靶的鑒定。通過(guò)分析肝細(xì)胞癌(HCC)的表達(dá)譜，例如在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到VANGL1基因的頻繁上調(diào)，說(shuō)明用反義寡核苷酸抑制該基因的表達(dá)能明顯地降低HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡(Yagyu等，2002)。此外，利用相同的基因組寬度(genome-wide)cDNA芯片(microarray)已經(jīng)分離出了許多參與結(jié)腸內(nèi)腫瘤發(fā)生的其他基因，如AF17(Lin等，2001)，AXUD1(Ishiguro等，2001)，HELAD1(Ishiguro等，2002)，ENC1(Fujita等，2002)和APCDD1(Takahashi等，2002)。這些基因的表達(dá)水平與T-細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(Tcf-LEF)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的活性有關(guān)，并在結(jié)腸癌細(xì)胞中顯著提高。此外，最初用來(lái)抑制與Ras相關(guān)的生長(zhǎng)信號(hào)通路的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTIs)，其活性由轉(zhuǎn)譯后法尼基化決定，能有效治療動(dòng)物模型中的Ras依賴性腫瘤(He等，Cell 99335-45(1999))。使用組合藥物或抗腫瘤藥物和抗HER2單克隆抗體，曲妥珠單抗(trastuzumab)已經(jīng)能使人臨床試驗(yàn)拮抗原致癌基因受體HER2/neu；并獲得了改善的臨床療效，使乳腺癌患者全部存活(Lin等，Cancer Res 616345-9(2001))。酪氨酸激酶抑制劑STI-571，其能選擇性地使bcr-abl融合蛋白失活，該抑制劑已開(kāi)發(fā)用于治療慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的基本活性在白細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。將此類(lèi)型的試劑設(shè)計(jì)為抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujita等，Cancer Res 617722-6(2001))。因此，一般在瘤細(xì)胞中上調(diào)的基因產(chǎn)物可以作為開(kāi)發(fā)新抗癌試劑的潛在靶標(biāo)。
已經(jīng)證明CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)能識(shí)別衍生自存在于MHC I類(lèi)分子和裂解腫瘤細(xì)胞中腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的表位肽。自從MAGE家族成為發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TAAs實(shí)例以來(lái)，已經(jīng)利用免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了許多的其它TAAs(Boon，Int J Cancer 54177-80(1993)；Boon和van der Bruggen，J ExpMed 183725-9(1996)；van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))?，F(xiàn)在，某些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TAAs正處于作為免疫治療靶標(biāo)的臨床開(kāi)發(fā)階段。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的TAAs包括MAGE(van der Bruggen等，Science 2541643-7(1991))，gp100(Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994))，SART(Shichijo等，J Exp Med 187277-88(1998))，和NY-ESO-1(Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997))。另一方面，已證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)的基因產(chǎn)物可以作為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶標(biāo)被識(shí)別。所述基因產(chǎn)物包括p53(Umano等，Brit J Cancer 841052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka等，Brit J Cancer 8494-9(2001))，CEA(Nukaya等，Int J Cancer 8092-7(1999))等。
盡管在TAAs的基礎(chǔ)和臨床研究方面取得了重大進(jìn)步(Rosenbeg等，Nature Med 4321-7(1998)；Mukherji等，Proc Natl Acad Sci USA 928078-82(1995)；Hu等，Cancer Res 562479-83(1996))，僅有少量的候選TAAs是可獲得的。在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)受到癌癥細(xì)胞的限制的TAAs將可能作為免疫治療靶標(biāo)的候選物。另外，預(yù)期對(duì)誘導(dǎo)有效的和特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAAs的鑒定可以增強(qiáng)肽疫苗策略在各種類(lèi)型的癌癥中的臨床效用(Boon和can der Bruggen，J Exp Med 183725-9(1996)；van derBruggen等，Science 2541643-7(1991)；Brichard等，J Exp Med 178489-95(1993)；Kawakami等，J Exp Med 180347-52(1994)；Shichijo等，J Exp Med187277-88(1998)；Chen等，Proc Natl Acad Sci USA 941914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 881442-5(1996)；Butterfield等，Cancer Res 593134-42(1999)；Vissers等，Cancer Res 595554-9(1999)；van der Burg等，J Immunol1563308-14(1996)；Tanaka等，Cancer Res 574465-8(1997)；Fujie等，Int JCancer 80169-72(1999)；Kikuchi等，Int J Cancer 81459-66(1999)；Oiso等，Int J Cancer 81387-94(1999))。
已經(jīng)多次報(bào)道了在51Cr-釋放分析中，肽刺激的來(lái)自某些健康捐獻(xiàn)者的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)能引起有效量的IFN-γ應(yīng)答該肽，但很少會(huì)在HLA-A24或-A0201限制性方式中表現(xiàn)出對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Kawano等，Cancer Res 603550-8(2000)；Nishizaka等，Cancer Res 604830-7(2000)；Tamura等，Jpn J Cancer Res 92762-7(2001))。但是，在日本人和白種人(Caucasion)中，HLA-A24和HLA-A0201都是一種常見(jiàn)的HLA等位基因(Date等，Tissue antigens 4793-101(1996)；Kondo等，J Immunol 1554307-12(1995)；Kubo等，J Immunol 1523913-24(1994)；Imanishi等，Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams等，Tissueantigen 49129(1997))。因此，由這些HLAs呈遞的癌癥抗原性肽尤其在日本人和白種人中治療癌癥是有利的。另外，通常體外低親合性CTL的誘導(dǎo)獲自使用高濃度的肽，在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)中產(chǎn)生高水平的特異性肽/MHC絡(luò)合物，該絡(luò)合物將能有效地激活這些CTL(Alexander-Miller等，ProcNatl Acad Sci USA 934102-7(1996))。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供參與胰腺癌細(xì)胞增殖機(jī)制的新蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的基因，以及制備和在診斷和治療胰腺癌中利用該蛋白質(zhì)和基因的方法。
為了揭示胰腺致癌機(jī)制并鑒定出新的診斷標(biāo)記物和/或治療該腫瘤的藥物靶標(biāo)，本發(fā)明利用含有23040個(gè)基因的全基因組(genome-wide)cDNA芯片對(duì)胰腺致癌過(guò)程中的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。從藥理學(xué)角度看，抑制致癌信號(hào)比激活腫瘤抑制效應(yīng)在實(shí)踐中更易行。因此，本發(fā)明人對(duì)胰腺致癌過(guò)程中上調(diào)的基因進(jìn)行了研究。
從這些上調(diào)基因中鑒定出了一種新的人基因C1958，該基因在能獲得表達(dá)數(shù)據(jù)的胰腺癌例中明顯上調(diào)70％。通過(guò)對(duì)由胰腺癌細(xì)胞系Capan-1制成的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了三個(gè)變異轉(zhuǎn)錄物。通過(guò)Northern印跡分析，這三個(gè)變體中編碼76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的C1958V1和編碼20個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的C1958V2在胰腺癌細(xì)胞系中特異性表達(dá)。另外，免疫組織化學(xué)染色顯示此C1958V1產(chǎn)物位于COS7細(xì)胞的胞質(zhì)器官上。此外，C1958V1翻譯為比由Western印跡分析預(yù)測(cè)的基因產(chǎn)物尺寸更大的基因產(chǎn)物，說(shuō)明它可能是通過(guò)翻譯后修飾產(chǎn)生的。
另外，由于轉(zhuǎn)染了C1958V1或C1958V2的特異性反義S-寡核苷酸或小型干擾性RNAs使得C1958V1或C1958V2的表達(dá)降低，而抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。許多抗癌藥物，如DNA和/或RNA合成抑制劑，代謝抑制劑，和DNA嵌入劑不僅對(duì)癌細(xì)胞有毒，而且對(duì)正常的生長(zhǎng)細(xì)胞也有毒。但由于基因的正常表達(dá)主要在胎盤(pán)中觀察到，而很少在肝、甲狀腺、氣管或骨髓中觀察到的事實(shí)，抑制C1958V1或C1958V2表達(dá)的試劑可能并不會(huì)對(duì)其他器官產(chǎn)生不利影響，因此這些試劑對(duì)于治療癌癥來(lái)說(shuō)就是非常重要的。
因此，本發(fā)明提供了分離的新基因，C1958V1和C1958V2，其為癌癥診斷標(biāo)記物的候選物而且可能作為開(kāi)發(fā)診斷新策略的潛在靶標(biāo)和有效的抗癌劑。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了由這些基因編碼的多肽，以及所述多肽的制備和用途。更具體地，本發(fā)明提供如下本申請(qǐng)?zhí)峁┝诵碌娜硕嚯?，C1958V1和C1958V2或其功能等同物，該多肽促進(jìn)細(xì)胞增殖并在細(xì)胞增殖性疾病如胰腺癌中上調(diào)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，C1958V1多肽包括與推測(cè)蛋白質(zhì)[大鼠(Rattusnorvegicus)](XP_226536)有約59％同一性的推測(cè)的76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。C1958V1由SEQ ID NO1的開(kāi)放閱讀框編碼。C1958V1多肽優(yōu)選包括顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列。本申請(qǐng)還提供了至少由部分C1958V1多核苷酸序列編碼的分離蛋白質(zhì)，或與顯示于SEQ ID NO1的序列至少15％，優(yōu)選至少25％，或更優(yōu)選60％，或更優(yōu)選70％或更優(yōu)選90％互補(bǔ)的多核苷酸序列。
另一方面，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，C1958V2多肽包括SEQ ID NO3的開(kāi)放閱讀框編碼的推測(cè)的20個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。C1958V2多肽優(yōu)選包括顯示于SEQ ID NO4的氨基酸序列。本申請(qǐng)還提供了至少由部分C1958V2多核苷酸序列編碼的分離蛋白質(zhì)，或與顯示于SEQ ID NO3的序列至少15％，優(yōu)選至少25％，或更優(yōu)選60％，或更優(yōu)選70％或更優(yōu)選90％互補(bǔ)的多核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了新的人基因，C1958V1和C1958V2，與相應(yīng)正常胰腺細(xì)胞相比其在大多數(shù)胰腺癌中的表達(dá)顯著提高。分離的C1958V1基因包括如SEQ ID NO1所描述的多核苷酸序列。更具體地，C1958V1 cDNA包括含有228個(gè)核苷酸(SEQ ID NO1)的開(kāi)放閱讀框的881個(gè)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括與顯示于SEQ ID NO1的多核苷酸序列雜交或與顯示于SEQID NO1的多核苷酸序列至少15％，優(yōu)選至少25％，或更優(yōu)選60％，或更優(yōu)選70％或更優(yōu)選90％互補(bǔ)，并且編碼C1958V1蛋白或其功能等同物的多核苷酸。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO1的簡(jiǎn)并序列和等位突變體。另一方面，分離的C1958V2基因包括如SEQ ID NO3所描述的多核苷酸序列。更具體地，C1958V2 cDNA包括含有60個(gè)核苷酸(SEQ ID NO3)的開(kāi)放閱讀框的893個(gè)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括與顯示于SEQ ID NO3的多核苷酸序列雜交或與顯示于SEQ ID NO3的多核苷酸序列至少15％，優(yōu)選至少25％，或更優(yōu)選60％，或更優(yōu)選70％或更優(yōu)選90％互補(bǔ)，并且編碼C1958V2蛋白或其功能等同物的多核苷酸。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO3的簡(jiǎn)并序列和等位突變體。
在本文中，分離的基因是結(jié)構(gòu)與天然存在的多核苷酸結(jié)構(gòu)不同的多核苷酸或與長(zhǎng)度大于3個(gè)獨(dú)立基因的天然存在的基因組多核苷酸的任何片段的結(jié)構(gòu)不同的多核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括，例如(a)具有在天然存在的生物體基因組內(nèi)天然存在的基因組DNA分子部分序列的DNA；(b)以使所得分子不同于任何天然存在的載體或基因組DNA的方式，插入載體中或插入原核生物或真核生物基因組DNA中的多核苷酸；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備的片段、或限制性片段；和(d)重組的核苷酸序列也就是部分雜合基因，即編碼融合多肽的基因。
因此，一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離多核苷酸。分離的多肽優(yōu)選包括與SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列。分離的多肽更優(yōu)選包括與SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高同一性的核苷酸序列。一旦分離的多核苷酸比參考序列如SEQ ID NO1或3的長(zhǎng)度長(zhǎng)或者與參考序列如SEQ ID NO1或3的長(zhǎng)度相等，就用全長(zhǎng)參考序列進(jìn)行比較。分離的多核苷酸比參考序列如SEQ ID NO1或3的長(zhǎng)度短，就用相同長(zhǎng)度的部分參考序列(不包括任何同源性計(jì)算所需的環(huán))進(jìn)行比較。
本發(fā)明還提供了通過(guò)用編碼C1958V1或C1958V2蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞制備蛋白和表達(dá)所述多核苷酸序列的方法。此外，本發(fā)明還提供了含有編碼C1958V1或C1958V2蛋白的核苷酸序列的載體，和含有編碼C1958V1或C1958V2蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞。所述載體和宿主細(xì)胞可用于制備C1958V1或C1958V2蛋白。
本申請(qǐng)還提供了識(shí)別C1958V1或C1958V2蛋白的抗體。在某種程度上，還提供了C1958V1或C1958V2基因的反義多核苷酸(例如反義DNA)、核糖酶和siRNA(小型干擾RNA)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷細(xì)胞增殖疾病的方法，包括檢測(cè)抽樣生物樣品中的基因表達(dá)水平，將C1958V1或C1958V2基因的表達(dá)水平與正常樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，并將樣品中C1958V1或C1958V2基因的高表達(dá)水平定義為患有細(xì)胞增殖疾病如癌癥。適合用C1958V1或C1958V2的表達(dá)水平診斷的疾病是胰腺癌。
此外，提供了篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的方法。該方法包括將C1958V1或C1958V2多肽與待測(cè)化合物接觸，選出與C1958V1或C1958V2多肽結(jié)合的待測(cè)化合物。
本發(fā)明還提供了篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中該方法包括將C1958V1或C1958V2多肽與待測(cè)化合物接觸，選出抑制C1958V1或C1958V2多肽表達(dá)水平或生物活性的待測(cè)化合物。
本申請(qǐng)還提供了治療細(xì)胞增殖性疾病如癌癥的藥物組合物。該藥物組合物可以是例如抗癌劑。可以將該藥物組合物描述為至少是部分C1958V1或C1958V2多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸或siRNA。適合的siRNA由包括選自作為靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO25，26或28的一組核苷酸組成。由包括作為靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO25，26或28的一組核苷酸組成的C1958V1 siRNA適用于治療胰腺癌。該藥物組合物還可以是那些包括用本發(fā)明篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法選出的化合物的藥物組合物。
該藥物組合物的理想作用途徑是抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。可以將該藥物組合物施給包括人和家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明提供的藥物組合物治療細(xì)胞增殖性疾病的方法。
此外，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括施用C1958V1或C1958V2多肽的步驟。期望通過(guò)施用C1958V1或C1958V2多肽來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性。因此，本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括施用C1958V1或C1958V2多肽，以及治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的步驟，其中所述組合物含有C1958V1或C1958V2多肽。
應(yīng)該理解前面的發(fā)明概述和隨后的詳細(xì)描述均為優(yōu)選的實(shí)施方案，其并不限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它可選實(shí)施方案。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1(a)描述了C1958的Cy5/Cy3信號(hào)強(qiáng)度比，其結(jié)果是在來(lái)自18名胰腺癌患者的腫瘤細(xì)胞中通過(guò)芯片分析測(cè)出的。圖1(b)描述了在來(lái)自胰腺癌患者的腫瘤細(xì)胞(PC1，PC4，PC5，PC6，PC7，PC8，PC13，PC14，PC15，PC16，PC17，PC18)和胰腺癌細(xì)胞系(Panc-1，Aspc-1，Miapaca-2，Capan-1和Capan-2)中C1958表達(dá)的半定量RT-PCR分析。
圖2描述了C1958的3個(gè)不同轉(zhuǎn)錄變體的基因組結(jié)構(gòu)。黑色箭頭表示終止密碼子，空白箭頭代表起始密碼子。括號(hào)內(nèi)數(shù)字說(shuō)明各外顯子的長(zhǎng)度。
圖3描述了在各種人組織(a-1，a-2，a-3)和胰腺癌細(xì)胞系(b)中C1958轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析。分子大小顯示在左側(cè)。
圖4(a)描述了在COS7細(xì)胞中，Myc-標(biāo)記的C1958V1的亞細(xì)胞定位。圖4(b)描述了利用Western印跡分析，C1958V1變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。箭頭顯示C1958V1特異性條帶。
圖5描述了供在胰腺癌細(xì)胞中降低C1958V1表達(dá)的小型干擾RNAs(siRNAs)的生長(zhǎng)抑制效力。圖5(a)描述了半定量RT-PCR分析，該分析顯示在將siRNAs導(dǎo)入KLM-1細(xì)胞后，在含有新霉素的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后，胰腺癌細(xì)胞(KLM-1)中C1958V1內(nèi)源表達(dá)的抑制。β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)作為內(nèi)部對(duì)照。圖5(b)說(shuō)明了在用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP治療后，KLM-1細(xì)胞的Gimza染色結(jié)果的照片。圖5(c)描述了用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP轉(zhuǎn)染的KLM-1細(xì)胞的MTT分析結(jié)果。圖5(d)說(shuō)明了在用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP治療后，PK59細(xì)胞的Gimza染色結(jié)果的照片。圖5(e)描述了用psiU6BX-C1958V1或psiU6BX-EGFP轉(zhuǎn)染的PK59細(xì)胞的MTT分析結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了5次。
發(fā)明詳述除非另外特別說(shuō)明，本文中所用″a″，″an″和″the″意為“至少一個(gè)”。
本申請(qǐng)鑒定出了新的人基因C1958V1和C1958V2，相比于相應(yīng)無(wú)腫瘤組織，其表達(dá)在胰腺癌中顯著提高。C1958V1 cDNA由含有SEQ ID NO1所示的228個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框的881個(gè)核苷酸組成。該開(kāi)放閱讀框編碼推測(cè)的76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。另一方面，C1958V2 cDNA由含有SEQ IDNO3所示的60個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框的893個(gè)核苷酸組成。該開(kāi)放閱讀框編碼推測(cè)的20個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
一貫地，C1958V1或C1958V2到細(xì)胞中的外源表達(dá)可以使細(xì)胞生長(zhǎng)增加，而用反義抗S-寡核苷酸或小型干擾RNA(siRNA)抑制C1958V1或C1958V2的表達(dá)則顯著抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。此發(fā)現(xiàn)說(shuō)明C1958V1和C1958V2賦予癌細(xì)胞致癌活性，且抑制這些蛋白的活性可能是治療癌癥的期望策略。
本發(fā)明包括新的人基因C1958V1，該基因包括SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列以及其簡(jiǎn)并體和變體，只要它們編碼C1958V1蛋白，該蛋白包括顯示于SEQ ID NO2的氨基酸序列或其功能等同物。C1958V1多肽功能等同物的例子包括，例如與人C1958V1蛋白相應(yīng)的其它生物體的同源蛋白，以及人C1958V1蛋白的變體。
本發(fā)明包括新的人基因C1958V2，該基因包括SEQ ID NO3所示的多核苷酸序列以及其簡(jiǎn)并體和變體，只要它們(to the extent)編碼C1958V2蛋白，該蛋白包括顯示于SEQ ID NO4的氨基酸序列或其功能等同物。C1958V2多肽功能等同物的例子包括，例如與人C1958V2蛋白相應(yīng)的其它生物體的同源蛋白，以及人C1958V2蛋白的變體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“功能等同物”是指目的多肽具有與C1958V1或C1958V2蛋白同樣的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性并能使癌細(xì)胞具有致癌活性。目的多肽是否具有細(xì)胞增殖性可以通過(guò)將編碼目的多肽的DNA引入表達(dá)相應(yīng)多肽的細(xì)胞中，測(cè)定細(xì)胞增殖的促進(jìn)或菌落形成活性的增加來(lái)確定。所述細(xì)胞包括如NIH3T3細(xì)胞，COS7細(xì)胞。
制備與給定蛋白功能等同的多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，該方法包括已知的誘導(dǎo)蛋白突變的方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用定點(diǎn)誘變對(duì)蛋白中任何氨基酸序列誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)耐蛔儊?lái)制備與人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽(Hashimoto-Gotoh等，Gene 152271-5(1995)；Zoller和Smith，Methods Enzymol 100468-500(1983)；Kramer等，NucleicAcids Res.129441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Methods Enzymol 154350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol 852763-6(1988))。也可以自然發(fā)生氨基酸突變。本發(fā)明多肽包括那些含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變的人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列的蛋白，條件是所得突變多肽與人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同。通常在所述突變體中的突變氨基酸數(shù)量為10個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選6個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸和更少。
突變或修飾的蛋白，含有某氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)過(guò)取代、缺失、插入和/或添加的修飾氨基酸序列的蛋白已知還保存原有的生物活性(Mark等，Proc Natl Acad Sci USA 815662-6(1984)；Zoller和Smith，Nucleic Acids Res 106487-500(1982)；Dalbadie-McFarl和等，Proc Natl AcadSci USA 796409-13(1982))。
優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變?yōu)椴煌陌被?，且其仍保存該氨基酸?cè)鏈特性(此過(guò)程稱為保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子是疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)，親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和一般含有下述功能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。說(shuō)明括號(hào)內(nèi)字母表示氨基酸單字母符號(hào)。
將人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽的例子是含有人C1958V1或C1958V2蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人C1958V1或C1958V2蛋白與其它肽或蛋白融合，且其包括在本發(fā)明中?？刹捎帽绢I(lǐng)域所熟知的技術(shù)制備融合蛋白，如將編碼本發(fā)明的C1958V1或C1958V2蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA連接，從而使其框架匹配，將融合DNA插入表達(dá)載體并在宿主中表達(dá)。對(duì)于與本發(fā)明的蛋白融合的肽或蛋白并無(wú)限制。
已知可用作與本發(fā)明的蛋白融合的肽包括，例如FLAG(Hopp等，Biotechnology 61204-10(1988))，含6個(gè)His(組氨酸)殘基的6×His，10×His，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18HIV片段，T7-tag，HSV-tag，E-tag，SV40T抗原片段，lck-tag，α-微管蛋白片段，B-tag，蛋白C片段等?？梢耘c本發(fā)明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)，流感凝集素(HA)，免疫球蛋白恒定域。β-半乳糖苷酶，MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)等。
可以通過(guò)將編碼上述融合肽或蛋白的商購(gòu)DNA與編碼本發(fā)明的多肽的DNA融合，使制備的融合DNA表達(dá)來(lái)制備融合蛋白。
分離功能等同多肽的本領(lǐng)域已知的其它方法是，例如利用雜交技術(shù)的方法(Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地分離出與編碼人C1958V1或C1958V2蛋白(即SEQ ID NO1或3)的全部DNA序列或部分DNA序列具有高同源性的DNA，并從分離的DNA中分離出人C1958V1或C1958V2蛋白的功能等同多肽。本發(fā)明的多肽包括由與編碼人C1958V1或C1958V2蛋白的全部DNA序列或部分DNA序列雜交的DNA編碼的多肽，和與人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括與衍生自人的蛋白相應(yīng)的哺乳動(dòng)物同源物(如猴、鼠、兔和?；蚓幋a的多肽)。在分離與編碼人C1958V1或C1958V2蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，尤其優(yōu)選使用胎盤(pán)、肝、甲狀腺、導(dǎo)管或骨髓組織。
分離編碼與人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽的DNA的雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。例如，雜交條件如下使用“Rapid-hyb緩沖液”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃進(jìn)行30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間的預(yù)雜交，加入標(biāo)記探針，68℃加熱1小時(shí)或更長(zhǎng)。例如在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行接下來(lái)的洗滌步驟。低嚴(yán)格條件是例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或優(yōu)選50℃，2X SSC，0.1％ SDS。更優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。高嚴(yán)格條件是例如在室溫條件下用2X SSC，0.01％ SDS洗滌20分鐘，洗滌3次，然后在37℃用1x SSC，0.1％ SDS洗滌20分鐘，洗滌3次，和在50℃用1x SSC，0.1％ SDS，洗滌20分鐘，洗滌2次。然而，許多因素如溫度和鹽濃度會(huì)影響雜交的嚴(yán)格性，本領(lǐng)域技術(shù)人員能合適地選出獲得所需嚴(yán)格性的因素。
除雜交之外，可采用基因擴(kuò)增法，例如聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，利用以蛋白編碼DNA(SEQ ID NO1或3)的序列信息為基礎(chǔ)合成的引物，分離出與人C1958V1或C1958V2蛋白功能相同的多肽的編碼DNA。
由采用上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)分離得到的DNA編碼的與人C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽通常與人C1958V1或C1958V2蛋白的氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常是指40％的同源性或更高，優(yōu)選60％或更高，更優(yōu)選80％或更高，甚至更優(yōu)選95％或更高。多肽的同源性可根據(jù)“Wilbur和Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80726-30(1983)”中的運(yùn)算法則確定。
可以采用本領(lǐng)域熟知的方法，以重組蛋白或天然蛋白制備本發(fā)明多肽。重組蛋白可以通過(guò)如下方式制備將DNA插入合適的表達(dá)載體中，其中所述DNA編碼本發(fā)明的多肽(例如，含有SEQ ID NO1或3核苷酸序列的DNA)，將該載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，獲得提取物，對(duì)提取物進(jìn)行層析，例如利用結(jié)合有本發(fā)明蛋白對(duì)應(yīng)抗體的柱子進(jìn)行離子交換層析、反向?qū)游?、凝膠過(guò)濾或親和層析，或者組合使用多于一種的前述柱子使多肽純化。
而且，當(dāng)本發(fā)明的多肽在宿主細(xì)胞(例如動(dòng)物細(xì)胞和E.coli)中以與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白融合的蛋白或添加多組氨酸的重組蛋白表達(dá)時(shí)，可以使用谷胱甘肽柱或鎳柱對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化。另外，當(dāng)本發(fā)明的多肽以標(biāo)記有c-myc、多組氨酸或FLAG的蛋白表達(dá)時(shí)，可分別使用c-myc、His或FLAG抗體對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和純化。
在對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化后，還可以根據(jù)需要用凝血因子或Xa因子切割除去目的多肽之外的區(qū)域。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法分離天然蛋白，例如將親和柱與表達(dá)本發(fā)明多肽的組織或細(xì)胞的提取物接觸，在所述親和柱中結(jié)合有與后面所述C1958V1或C1958V2蛋白結(jié)合的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的部分肽。所述部分肽含有對(duì)本發(fā)明多肽特異的氨基酸序列并至少由7個(gè)氨基酸，優(yōu)選8個(gè)或更多氨基酸，更優(yōu)選9個(gè)或更多氨基酸組成。可以用部分肽制備針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體，篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物和篩選本發(fā)明多肽的抑制劑。
可以采用基因工程技術(shù)、已知的肽合成法，或用合適的肽酶裂解本發(fā)明多肽來(lái)制備本發(fā)明的部分多肽。對(duì)于肽合成法，可以使用如固相合成法或液相合成法。
另外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于體內(nèi)或體外制備本發(fā)明多肽，或者在由編碼本發(fā)明蛋白的基因的基因異常所致疾病的基因治療中使用?？梢允褂萌魏涡问降谋景l(fā)明的多核苷酸，只要它編碼本發(fā)明的多肽，包括mRNA，RNA，cDNA，基因組DNA，化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列的DNA及其簡(jiǎn)并序列，只要獲得的DNA編碼本發(fā)明的多肽。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備本發(fā)明的多核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以如下制備獲得從表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，利用本發(fā)明的DNA(如SEQ ID NO1或3)的部分序列作為探針進(jìn)行雜交。cDNA文庫(kù)可以利用，如Sambrook等，分子克隆，冷泉港出版社(1989)中所描述的方法來(lái)制備；或者使用可商購(gòu)的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)還可以如下制備獲得從表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞中提取RNA，在本發(fā)明的DNA序列(例如SEQ ID NO1或3)的基礎(chǔ)上合成寡核苷酸，利用該寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出編碼本發(fā)明蛋白的cDNA。
此外，通過(guò)對(duì)獲得的cDNA的核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以常規(guī)地測(cè)定出由cDNA編碼的翻譯域，并能很容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。另外，通過(guò)利用所得cDNA或其部分作為探針對(duì)基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，可以分離出基因組DNA。
更具體的是，可以首次從表達(dá)本發(fā)明的目的多肽的細(xì)胞、組織或器官(如胎盤(pán)、肝、甲狀腺、導(dǎo)管或骨髓)中制備出mRNA。可以是使用已知方法分離mRNA例如可以利用胍超離心法(Chirgwin等，Biochemistry185294-9(1979))或AGPC法(Chomczynski和Sacchi，Anal Biochem162156-9(1987))制備總RNA。此外，可以利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中對(duì)mRNA進(jìn)行純化，或者利用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接對(duì)mRNA進(jìn)行純化。
利用逆轉(zhuǎn)錄酶，用所得mRNA合成cDNA?？梢允褂每缮藤?gòu)試劑盒，如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Kogyo)合成cDNA。另外，可以按照5’-RACE法(Frohman等，Proc Natl Acad Sci USA 858998-9002(1988)；Belyavsky等，Nucleic Acids Res 172919-32(1989))合成和擴(kuò)增cDNA，該方法利用本文所述引物和類(lèi)似物，5’-Ampli FINDER RACEKit(Clontech)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
從PCR產(chǎn)物制得所需DNA片段，并將該片段與載體DNA連接。利用該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，從所選菌落中獲得所需重組載體。可以利用傳統(tǒng)方法，如雙脫氧鏈終止法測(cè)定所需DNA的核苷酸序列。
可以通過(guò)計(jì)算在用于表達(dá)的宿主中密碼使用的頻率(Grantham等，NucleicAcids Res 943-74(1981))，對(duì)本發(fā)明多核苷酸的核酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，而使該核酸序列更有效地表達(dá)?？梢圆捎蒙藤?gòu)試劑盒或常規(guī)方法改變本發(fā)明的多核苷酸序列。比如，可以通過(guò)用限制性酶消化，插入合成的寡核苷酸或合適的多核苷酸片段，添加接頭，或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA，TGA或TAG)來(lái)使序列改變。
更具體的說(shuō)，本發(fā)明的多核苷酸包含含核酸序列SEQ ID NO1或3的DNA。
另外，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有SEQ ID NO1或3的核酸序列的多核苷酸雜交，并且編碼與上述本發(fā)明C1958V1或C1958V2蛋白功能等同的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇嚴(yán)謹(jǐn)條件。例如，可以使用低嚴(yán)謹(jǐn)條件。更優(yōu)選使用高嚴(yán)謹(jǐn)條件。這些條件與前面所述的條件相同。上述雜交的DNA優(yōu)選是cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了一種載體，其中本發(fā)明的多核苷酸插入該載體內(nèi)。本發(fā)明的載體對(duì)在宿主細(xì)胞中保持本發(fā)明的多核苷酸，尤其是DNA表達(dá)本發(fā)明的多肽是有用的。
當(dāng)大腸桿菌是宿主細(xì)胞時(shí)，載體在大腸桿菌(如JM109，DH5α，HB101或XL1 Blue)中擴(kuò)增并大量繁殖。該載體應(yīng)含有可使載體在大腸桿菌中擴(kuò)增的″ori″，和用于選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如，利用藥物如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13系載體，pUC系載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等。此外，pGEM-T，pDIRECT和pT7以及上述載體還可以用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)用載體制備本發(fā)明的蛋白時(shí)，優(yōu)選使用表達(dá)載體。例如，能在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具有前面描述的特性，從而能使載體在大腸桿菌中表達(dá)。當(dāng)用大腸桿菌如JM109，DH5α，HB101或XL1 Blue作為宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)含有啟動(dòng)子，例如lacZ啟動(dòng)子(Ward等，Nature 341544-6(1989)；FASEB J 62422-7(1992))，araB啟動(dòng)子(Better等，Science 2401041-3(1988))，或T7啟動(dòng)子等，從而使所需基因在大腸桿菌中有效表達(dá)。這樣，可以用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIA表達(dá)系統(tǒng)”(Qiagen)，pEGFP和pET(在這種情況下，宿主細(xì)胞優(yōu)選為表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)代替上述載體。此外，載體還可以包含適合多肽分泌的信號(hào)序列。指導(dǎo)多肽分泌到大腸桿菌周質(zhì)的可用信號(hào)序列是pelB信號(hào)序列(Lei等，J Bacteriol 1694379(1987))。將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的方法包括，例如氯化鈣法和電穿孔法。
除了大腸桿菌之外，可以用例如源自哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)5322(1990))，pEF，pCDM8)，源自昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體(如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，源自動(dòng)物病毒的表達(dá)載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，源自植物的表達(dá)載體(如pMH1，pMH2)，源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(如pZIpneo)，源自酵母的表達(dá)載體(如“Pichia表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)和源自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(如pPL608，pKTH50)制備本發(fā)明的多肽。
為了使載體在動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)，載體應(yīng)含有在所述細(xì)胞中表達(dá)所需的啟動(dòng)子，如SV40啟動(dòng)子(Mulligan等，Nature277108(1979))，MMLV-LTR啟動(dòng)子，EF1α啟動(dòng)子(Mizushima等，NucleicAcids Res 185322(1990))，CMV啟動(dòng)子等，并優(yōu)選含有選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因(如利用藥物選擇的藥物抗性基因(如新霉素，G418))。具有所述特性的已知載體的例子包括如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
此外，可以用本發(fā)明的方法穩(wěn)定地表達(dá)基因，并同時(shí)在細(xì)胞中擴(kuò)增出大量基因。例如可以將含有互補(bǔ)DHFR基因的載體(如pCHO I)導(dǎo)入CHO細(xì)胞，其中在該CHO細(xì)胞中除去了核酸合成途徑，然后利用氨甲喋呤(MTX)擴(kuò)增。此外，一旦基因瞬時(shí)表達(dá)，就可以使用將含有復(fù)制起始點(diǎn)SV40的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化入在染色體上含有SV40T抗原表達(dá)基因的COS細(xì)胞中的方法。
如上獲得的本發(fā)明多肽可以是從宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基)分離出的，并純化為基本純的同源多肽。本文中所用術(shù)語(yǔ)對(duì)給定多肽來(lái)講“基本純的”是指多肽基本不含其他生物大分子?；炯兊亩嚯氖且愿芍赜?jì)至少為75％(如至少80，85，95或99％)純的多肽?？捎萌魏芜m合的常規(guī)方法測(cè)定純度，例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。分離和純化多肽的方法并不限于任何特定的方法，事實(shí)上，任何常規(guī)方法都可以使用。
例如，可以將柱層析、過(guò)濾、超慮、鹽析、溶劑沉淀(solvent precipitation)、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、滲析和重結(jié)晶進(jìn)行合適地選擇和組合來(lái)分離并純化多肽。
層析的例子包括如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification和CharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。這些層析可通過(guò)液態(tài)層析進(jìn)行，如HPLC和FPLC。這樣，本發(fā)明提供了通過(guò)上述方法制備的高度純化的多肽。
本發(fā)明的多肽，在純化前或純化后，可用合適的蛋白修飾酶處理，從而使多肽任選地修飾或部分去除。可用的蛋白修飾酶包括，但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酸內(nèi)肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。可以以任何形式利用本發(fā)明的抗體，如單克隆或多克隆抗體，所述抗體包括通過(guò)用本發(fā)明多肽免疫動(dòng)物如兔而獲得的抗血清、所有類(lèi)型的多克隆和單克隆抗體、人抗體和通過(guò)基因重組制得的人源化抗體。
作為可獲得抗體的抗原的本發(fā)明多肽可以源自任何動(dòng)物，但優(yōu)選源自哺乳動(dòng)物如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選源自人。人源多肽可以獲自本文所公開(kāi)的核苷酸或氨基酸序列。
-根據(jù)本發(fā)明，欲作為免疫抗原的多肽可以是完整蛋白或蛋白的部分肽。部分肽可以包括，例如本發(fā)明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。
此處，將抗體定義為與本發(fā)明多肽全長(zhǎng)或片段反應(yīng)的蛋白。
可以將編碼本發(fā)明多肽的基因或其片段插入已知的表達(dá)載體，然后如本文所述將該載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？梢圆捎萌魏纬Ｒ?guī)方法從宿主細(xì)胞的外部或內(nèi)部進(jìn)行所需多肽或其片段的回收，隨后將該多肽或其片段作為抗原使用。另外，可以將表達(dá)多肽的完整細(xì)胞或其裂解物，或化學(xué)合成的多肽作為抗原。
任何哺乳動(dòng)物都可以用抗原免疫接種，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常使用嚙齒類(lèi)(Rodentia)、兔類(lèi)(Lagomorpha)或靈長(zhǎng)類(lèi)(primate)動(dòng)物。嚙齒類(lèi)動(dòng)物包括如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。兔類(lèi)動(dòng)物包括如兔子。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物包括如狹鼻亞目(Catarrhini)猴(舊大陸猴)，如食蟹猴(Macacafascicularis)、獼猴(rhesus monkey)、阿拉伯狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫接種動(dòng)物的方法為本領(lǐng)域所熟知。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是哺乳動(dòng)物免疫接種的常規(guī)方法。更具體地，抗原的稀釋和懸浮可以使用合適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水等。如果需要的話，將抗原懸浮液與適量的常規(guī)佐劑如弗氏(Freund’s)完全佐劑混合，制成乳劑，然后施給哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，隨后每4-21天進(jìn)行與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原的多次給藥。還可以將適合的載體用于免疫接種。在上述免疫接種后，利用所需抗體量增加的常規(guī)方法檢測(cè)血清。
針對(duì)本發(fā)明多肽的多克隆抗體的制備可以通過(guò)從免疫動(dòng)物中收集血液，該免疫動(dòng)物已檢出其血清中所需抗體增加，并通過(guò)采用任何常規(guī)方法從血液中分離血清來(lái)進(jìn)行。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，而且含有多克隆抗體的級(jí)分可以分離自血清?？梢詮闹蛔R(shí)別本發(fā)明多肽的級(jí)分中制得免疫球蛋白G或M，利用例如結(jié)合有本發(fā)明多肽的親和柱，并進(jìn)一步用蛋白A或蛋白G柱對(duì)此級(jí)分進(jìn)行純化。
為了制備單克隆抗體，免疫細(xì)胞收集自用抗原免疫且如上所述對(duì)血清中所需抗體的增長(zhǎng)水平已進(jìn)行核查的哺乳動(dòng)物，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選獲自脾。其它優(yōu)選的與上述免疫細(xì)胞融合的親本細(xì)胞包括，例如哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具有適合用藥物選擇融合細(xì)胞的所需特性的骨髓瘤細(xì)胞。
上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合可以按照已知方法進(jìn)行，如Milstein等的方法(Galfre和Milstein，Methods Enzymol 733-46(1981))。
利用細(xì)胞融合獲得的雜交瘤可以通過(guò)在常規(guī)選擇性培養(yǎng)基，如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)而選出。通常將細(xì)胞培養(yǎng)物繼續(xù)在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾天至幾周，直至可以使除所需雜交瘤之外的所有其它細(xì)胞(未融合細(xì)胞)全部死亡。然后，用常規(guī)限度稀釋法(limiting dilution)篩選并克隆產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。
除上述方法外，其中該方法用抗原免疫接種非人類(lèi)動(dòng)物來(lái)制備雜交瘤，可以將人淋巴細(xì)胞，如EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞用多肽、多肽表達(dá)細(xì)胞或其體外裂解物免疫接種。然后，將免疫接種的淋巴細(xì)胞與能無(wú)限分裂的人源骨髓瘤細(xì)胞，如U266融合，從而獲得制備所需人抗體的雜交瘤，即能獲得與所述多肽結(jié)合的抗體(未審查的日本公開(kāi)專利申請(qǐng)(JP-A)Sho63-17688)。
隨后，將所得雜交瘤移植至小鼠腹腔內(nèi)，并抽取腹水。所得單克隆抗體可以利用，例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或加有本發(fā)明多肽的親和層析柱進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體不但可以用于純化和檢測(cè)本發(fā)明的多肽，而且可以作為本發(fā)明多肽的拮抗劑的候選物。此外，該抗體可以在與本發(fā)明多肽的相關(guān)疾病的抗體治療中使用。當(dāng)將所得抗體對(duì)人體給藥(抗體治療)時(shí)，人抗體或人源化抗體是可優(yōu)選的，以降低免疫原性。
例如，可以用選自多肽、多肽表達(dá)細(xì)胞或其裂解物的抗原免疫接種含人抗體基因庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然后，從該動(dòng)物中收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞，并將該抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤，從該雜交瘤中可以制得針對(duì)所述多肽的人抗體(參見(jiàn)WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
另外，可以利用癌基因?qū)a(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，如免疫接種的淋巴細(xì)胞永生化，并用于制備單克隆抗體。
所得的單克隆抗體還可以是利用基因工程技術(shù)(參見(jiàn)如Borrebaeck和Larrick Therapeutic Monoclonal Antibodies由英國(guó)MacMillan Publishers LTD(1990)出版)重組制成的。例如，可以從免疫細(xì)胞，如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或免疫接種的淋巴細(xì)胞中克隆出編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而制備重組抗體。本發(fā)明還提供了上述重組抗體。
此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其能與一種或多種本發(fā)明的多肽結(jié)合。比如，抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)，其中重鏈和輕鏈Fv片段由合適的接頭連接(Huston等，ProcNatlAcad Sci USA 855879-83(1988))。更具體地，抗體片段可以是用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生的。另外，編碼抗體片段的基因可以是構(gòu)建的，將該基因插入表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)如Co等，J Immunol 1522968-76(1994)；Better和Horwitz，Methods Enzymol178476-96(1989)；Pluckthun和Skerra，Methods Enzymol 178497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121652-63(1986)；Rousseaux等，MethodsEnzymol 121663-9(1986)；Bird和Walker，Trends Biotechnol 9132-7(1991))。
抗體可以通過(guò)與各種分子，如聚乙二醇(PEG)結(jié)合進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供了所述修飾的抗體。所述修飾抗體可以是通過(guò)對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾而獲得的。這些修飾方法是本領(lǐng)域常用的。
另外，本發(fā)明的抗體可以以連接衍生自非人類(lèi)抗體的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)的嵌和抗體，或人源化抗體來(lái)獲得，其中人源化抗體含有衍生自非人類(lèi)抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、衍生自人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)和恒定區(qū)。所述抗體可以利用已知技術(shù)加以制備。
可以將如上所得的抗體純化為均一性抗體。例如，抗體的分離和純化可以根據(jù)常規(guī)蛋白所用的分離和純化方法進(jìn)行。例如，抗體可以通過(guò)合適選擇和組合使用柱層析，如親和層析、過(guò)濾、超濾、鹽析、滲析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)聚焦等(AntibodiesA Laboratory Manual。EdHarlow和David Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988))進(jìn)行分離，但并不限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以作為親和柱使用。可用的示例性蛋白A柱包括，如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除親和層析之外，示例性層析包括，例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1996))。層析步驟可以采用液相層析如HPLC和FPLC進(jìn)行。
例如，吸光度量法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和/或免疫熒光法可用于測(cè)定本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，將本發(fā)明的多肽加至平板內(nèi)，然后，加入含有所需抗體的樣品，如抗體產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后，加入可識(shí)別第一抗體的二抗，且該二抗是用酶如堿性磷酸酶標(biāo)記的，對(duì)平板進(jìn)行孵育。接著，在洗滌后，將酶底物如對(duì)硝基苯磷酸加至平板中，并測(cè)量吸光度，從而評(píng)價(jià)樣品的抗原結(jié)合活性?？梢詫⒍嚯钠?，如C-末端或N-末端片段作為評(píng)價(jià)抗體結(jié)合活性的抗原?？梢允褂肂IAcore(Pharmacia)評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的活性。
通過(guò)將本發(fā)明的抗體與假定含有本發(fā)明的多肽的樣品接觸，檢測(cè)或測(cè)定抗體和多肽所形成的免疫復(fù)合物，上述方法能夠?qū)Ρ景l(fā)明的多肽進(jìn)行測(cè)定和檢測(cè)。
由于本發(fā)明多肽的檢測(cè)或測(cè)定方法能夠特異性地檢測(cè)或測(cè)定多肽，該方法對(duì)于使用該多肽的各種實(shí)驗(yàn)都是有用的。
本發(fā)明還提供了與編碼人C1958V1或C1958V2蛋白(SEQ ID NO1或3)的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸，其至少含有15個(gè)核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是與編碼本發(fā)明多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文中所用術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”是指在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，不明顯與編碼其它蛋白的DNA發(fā)生交叉雜交。所述多核苷酸包括探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(如反義寡核苷酸和核酶)，其與編碼本發(fā)明的多肽的DNA或其互補(bǔ)鏈特異性雜交。此外，所述多核苷酸可以用于制備DNA芯片。
本發(fā)明包括與SEQ ID NO1或3核苷酸序列中任何位點(diǎn)雜交的反義寡核苷酸。此反義寡核苷酸優(yōu)選針對(duì)SEQ ID NO1或3核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。甚至更優(yōu)選在該上面提及的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸中含有一個(gè)起始密碼子的反義寡核苷酸。
反義寡核苷酸的修飾產(chǎn)物或衍生物可以用作反義寡核苷酸。所述修飾產(chǎn)物的例子包括低級(jí)烷基磷酸酯修飾物，如甲基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型、硫代磷酸酯修飾物和氨基磷酸酯修飾物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“反義寡核苷酸”不僅是指那些其與由DNA或mRNA特異性區(qū)域組成的核苷酸相一致的核苷酸完全互補(bǔ)的反義寡核苷酸，而且是指那些含有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配核苷酸的反義寡核苷酸，只要該DNA或mRNA和反義寡核苷酸能與SEQ ID NO1或3的核苷酸序列特異性地雜交。
所述多核苷酸包括在，在“至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸序列區(qū)”中，有至少70％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選90％或更高，甚至更優(yōu)選95％或更高同源性的多核苷酸之中。本文所規(guī)定的算法可以用于測(cè)定同源性。所述多核苷酸對(duì)于作為分離或檢測(cè)編碼本發(fā)明的多肽的DNA的探針，如在隨后實(shí)施例中所述，或作為擴(kuò)增引物是有用的。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物能對(duì)產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞起作用，通過(guò)將該衍生物與編碼所述多肽的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促使所述mRNA降解，并抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而能抑制所述多肽的功能。
通過(guò)將本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物與適合的堿性物質(zhì)混合，該堿性物質(zhì)無(wú)法使所述衍生物失活，可以將本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物制成外用制劑，如擦劑或膏藥。
而且，在需要的時(shí)候，通過(guò)添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑和類(lèi)似物，可以將該衍生物制成片劑、粉劑、顆粒、膠囊、脂質(zhì)膠囊、注射劑、溶液、滴鼻藥劑和凍干劑。它們可以通過(guò)下述常規(guī)方法制備。
反義寡核苷酸衍生物通過(guò)下述方法施給患者將其直接涂在病痛處或注射入血管內(nèi)，從而使其能到達(dá)病患處。反義封固介質(zhì)可用于增加耐久性和膜滲透性。例如脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂褐質(zhì)或其衍生物。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物的用量可以根據(jù)患者的情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，并以所需量使用。例如，施用的劑量為0.1-100mg/kg，優(yōu)選0.1-50mg/kg。
本發(fā)明還包括小型干擾RNA(siRNA)其包括SEQ ID NO1或3核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合。更具體地，抑制C1958V1表達(dá)的所述siRNA包括那些其有義鏈含有作為靶序列的SEQ ID NO25，26或28核苷酸序列的siRNA。術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？捎贸Ｒ?guī)技術(shù)將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，包括那些將DNA作為轉(zhuǎn)錄為RNA的模板的細(xì)胞。siRNA包括編碼人C1958V1或C1958V2蛋白(SEQ ID NO1或3)的多核苷酸的有義核酸序列和反義核苷酸序列。構(gòu)建SiRNA，從而使單一轉(zhuǎn)錄物(雙鏈RNA)含有來(lái)自靶基因有義序列和互補(bǔ)的反義序列，如發(fā)夾。
例如由于細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，可利用方法改變細(xì)胞的基因表達(dá)，即使C1958V1或C1958V2的表達(dá)上調(diào)。在靶細(xì)胞中siRNA與C1958V1或C1958V2轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白減少。寡核苷酸的長(zhǎng)度至少為10個(gè)核苷酸，并且可以與天然存在的轉(zhuǎn)錄物等長(zhǎng)。優(yōu)選地，寡核苷酸長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，寡核苷酸長(zhǎng)度小于75，50，25個(gè)核苷酸。C1958V1 siRNA寡核苷酸的例子，該siRNA寡核苷酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制表達(dá)，包括含有SEQ ID NO25，26或28之一作為靶序列的寡核苷酸。
siRNA的核酸序列可以利用可從Ambion網(wǎng)站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)獲得的siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序?qū)ζ溥M(jìn)行設(shè)計(jì)。以下述協(xié)議為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)程序可以選出siRNA的核酸序列siRNA靶位點(diǎn)的選擇
1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼開(kāi)始，向下游尋找“AA”二核苷酸序列，并記下出現(xiàn)的每個(gè)AA和其3’端相鄰的19個(gè)核苷酸，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)，不要針對(duì)5’和3’端的非編碼區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼的區(qū)域(75個(gè)堿基范圍內(nèi))，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA。
2.將潛在的靶位點(diǎn)和人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列明顯同源的所有靶序列?？梢岳肂LAST進(jìn)行同源性檢索，其基于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3.選出合適的靶序列進(jìn)行合成。按照Ambion，優(yōu)選沿基因長(zhǎng)度，選出多個(gè)靶序列進(jìn)行評(píng)價(jià)。
本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而其可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。而且，由于它們能抑制本發(fā)明多肽的生物活性，因此含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑是有用的。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細(xì)胞增殖性疾病如癌癥。
另外，本發(fā)明提供了診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，該方法利用本發(fā)明多肽的表達(dá)水平作為診斷標(biāo)記物。
該診斷方法包括以下步驟(a)測(cè)定本發(fā)明的C1958V1或C1958V2基因的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的提高與細(xì)胞增殖性疾病如癌癥相聯(lián)系。
在特定樣品中，C1958V1或C1958V2基因的表達(dá)水平可以通過(guò)對(duì)與C1958V1或C1958V2基因相應(yīng)的mRNA或由C1958V1或C1958V2基因編碼的蛋白進(jìn)行定量來(lái)測(cè)定。進(jìn)行mRNA定量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，與C1958V1或C1958V2基因相應(yīng)的mRNA的水平可以通過(guò)Northern印跡或RT-PCR進(jìn)行測(cè)定。由于C1958V1或C1958V2基因的全長(zhǎng)核酸序列顯示于SEQ ID NO1或3，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員都能設(shè)計(jì)出可以對(duì)C1958V1或C1958V2基因進(jìn)行定量的探針或引物的核酸序列。
而且，C1958V1或C1958V2基因的表達(dá)水平可以是在該基因編碼的蛋白活性或數(shù)量的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析的。測(cè)定C1958V1或C1958V2蛋白量的方法如下所示。例如，免疫分析法對(duì)生物材料中的蛋白測(cè)定是有用的。任何生物材料都可用來(lái)進(jìn)行蛋白或其活性的測(cè)定。例如，對(duì)血液樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)血清標(biāo)記物編碼蛋白的分析。另一方面，根據(jù)各待分析蛋白的活性，可以選擇合適的方法進(jìn)行C1958V1或C1958V2基因編碼蛋白的活性測(cè)定。
對(duì)樣品(待測(cè)樣品)中的C1958V1或C1958V2基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并與正常樣品中的C1958V1或C1958V2基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。當(dāng)該比較顯示靶基因的表達(dá)水平高于正常樣品的靶基因表達(dá)水平時(shí)，就判定該受試對(duì)象患有細(xì)胞增殖性疾病。可以同時(shí)對(duì)正常標(biāo)本和受試對(duì)象樣品中的C1958V1或C1958V2基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。另外，表達(dá)水平的正常范圍可以在對(duì)事先采自對(duì)照組樣品中的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析而獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)確定。將通過(guò)比較受試對(duì)象的樣品獲得的結(jié)果與正常范圍進(jìn)行比較；當(dāng)結(jié)果不落在正常范圍內(nèi)時(shí)，就判定受試對(duì)象患有細(xì)胞增殖性疾病。在本發(fā)明中，優(yōu)選診斷的細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。更優(yōu)選，當(dāng)對(duì)C1958V1或C1958V2基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定并與正常樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行比較時(shí)，診斷出的細(xì)胞增殖性疾病是胰腺癌。
在本發(fā)明中，還提供了用于診斷細(xì)胞增殖性疾病如癌癥，包括胰腺癌的診斷劑。本發(fā)明的診斷劑含有與本發(fā)明的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，將與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體作為所述化合物。
另外，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的多肽篩選治療細(xì)胞增殖性疾病化合物的方法。該篩選方法的實(shí)施方案包括以下步驟(a)將待測(cè)化合物與本發(fā)明的多肽接觸，(b)測(cè)定本發(fā)明的多肽與檢待測(cè)化合物間的結(jié)合活性，和(c)選出與本發(fā)明的多肽結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽或源自天然的蛋白，或其部分肽?？梢允褂萌魏未郎y(cè)化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物的提取物、植物提取物、純化的或粗蛋白、肽、非肽類(lèi)化合物、合成的微分子化合物和天然化合物。與待測(cè)化合物接觸的本發(fā)明多肽可以是，例如純化的多肽、可溶蛋白、與載體結(jié)合的形式、或與其它多肽融合的融合蛋白。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用許多已知方法作為篩選蛋白的方法，例如利用本發(fā)明的多肽，與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白。所述篩選可通過(guò)如免疫沉淀法，特別是以下述方式進(jìn)行。編碼本發(fā)明多肽的基因在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其后通過(guò)將基因插入外源基因表達(dá)載體中，如pSV2neo、pcDNA I和pCD8。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是常規(guī)是使用的任何啟動(dòng)子，包括，如SV40早期啟動(dòng)子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-1α啟動(dòng)子(Kim等，Gene 91217-23(1990))，CAG啟動(dòng)子(Niwa等，Gene 108193-200(1991))，RSV LTR啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 152684-704(1987))，SRα啟動(dòng)子(Takebe等，Mol CellBiol 8466(1988))，CMV立即早期啟動(dòng)子(Seed和Aruffo，Proc Natl Acad SciUSA 843365-9(1987))，SV40晚期啟動(dòng)子(Gheysen和Fiers，J Mol Appl Genet1385-94(1982))，腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufman等，Mol Cell Biol 9946(1989))，HSV TK啟動(dòng)子等。可根據(jù)任何方法使基因?qū)氡磉_(dá)外源基因的動(dòng)物細(xì)胞中，例如電穿孔法(Chu等，Nucleic Acids Res 151311-26(1987))，磷酸鈣法(Chen和Okayama，Mol Cell Biol 72745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopata等，Nucleic Acids Res 125707-17(1984)；Sussman和Milman，MolCell Biol 41642-3(1985))，脂轉(zhuǎn)染法(Derijard，B Cell 71025-37(1994)；Lamb等，Nature Genetics 522-30(1993)；Rabindran等，Science 259230-4(1993))等。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)將單克隆抗體的表位導(dǎo)入本發(fā)明多肽的N-或C-末端，以含有單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)(表位)的融合蛋白表達(dá)，其中單克隆抗體表位的其特異性已經(jīng)被公開(kāi)。可使用商購(gòu)的表位抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 1385-90(1995))。通過(guò)利用多克隆位點(diǎn)，表達(dá)與例如β-半乳糖苷酶，麥芽糖結(jié)合蛋白，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，綠色熒光蛋白(GFP)和類(lèi)似物融合的蛋白的載體是可商購(gòu)的。
還報(bào)導(dǎo)了通過(guò)僅將由幾個(gè)至12個(gè)氨基酸組成的小型表位導(dǎo)入，而不改變本發(fā)明多肽的特性，制得的融合蛋白?？梢允褂帽砦?，如多組氨酸(His-tag)，流感凝集素HA，人c-myc，F(xiàn)LAG，水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7-tag)，人簡(jiǎn)單皰疹病毒糖蛋白(HSV-tag)，E-tag(一種在單克隆噬菌體上的表位)和類(lèi)似物，和識(shí)別它們的單克隆抗體作為篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的表位抗體體系(Experimental Medicine 1385-90(1995))。
在免疫沉淀反應(yīng)中，通過(guò)將這些抗體加至利用合適的去污劑制備的細(xì)胞裂解物中形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由本發(fā)明的多肽，具有與本發(fā)明多肽結(jié)合活性的多肽，和抗體組成。除了利用針對(duì)上述表位的抗體外，其中表位的抗體可以如上所述制備而成，還可以利用針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。
例如當(dāng)抗體是鼠IgG抗體時(shí)，可以利用蛋白A瓊脂糖或蛋白G瓊脂糖對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行沉淀。如果本發(fā)明的多肽是以與表位融合的融合蛋白制備而成的話，如GST，就可以以針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體所用的相同方式，利用與這些表位，如谷胱甘肽-瓊脂糖4B特異性結(jié)合的物質(zhì)形成免疫復(fù)合物。
可按照或根據(jù)，如文獻(xiàn)(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold SpringHarbor Laboratory publications，New York(1988))中的方法進(jìn)行免疫沉淀。
SDS-PAGE常用于對(duì)免疫沉淀的蛋白進(jìn)行分析，利用具有合適濃度的凝膠，可以對(duì)結(jié)合蛋白的蛋白分子重量進(jìn)行分析。由于與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白很難用常規(guī)染色方法，如Coomassie染色或銀染色檢測(cè)出來(lái)，可以采用在含有放射性同位素，35S-蛋氨酸或35S-cystein的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并對(duì)蛋白進(jìn)行測(cè)定，來(lái)提高檢測(cè)蛋白的敏感性。當(dāng)知道蛋白的分子量后，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，并測(cè)定其序列。
作為利用本發(fā)明多肽篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的方法，可以使用如West-Western印跡分析(Skolnik等，Cell 6583-90(1991))。特別是，與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白可以通過(guò)下述方法獲得利用噬菌體載體(如ZAP)，從細(xì)胞、組織、器官(如胎盤(pán)、肝臟、甲狀腺、氣管或骨髓)或預(yù)期將表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞中制備cDNA文庫(kù)，在LB-瓊脂糖上表達(dá)蛋白，將表達(dá)的蛋白固定在濾器上，將純化的和標(biāo)記的本發(fā)明多肽與上述濾器反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)記對(duì)表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的空斑進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的多肽可以利用生物素和抗生物素蛋白間的結(jié)合，或利用與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，或與本發(fā)明多肽融合的肽或多肽(如GST)進(jìn)行標(biāo)記。利用放射性同位素或熒光和類(lèi)似物的方法也是可以使用的。
另外，在本發(fā)明的篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交體系(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybridsystem”(Clontech)；“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；文獻(xiàn)“Dalton and Treisman，Cell 68597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，TrendsGenet 10286-92(1994)”)。
在雙雜交體系中，本發(fā)明的多肽與SRF-結(jié)合域或GAL4-結(jié)合域融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期將表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞中制備cDNA文庫(kù)，從而在表達(dá)時(shí)，該文庫(kù)可以與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合。然后，將該cDNA文庫(kù)導(dǎo)入上述酵母細(xì)胞中，并從測(cè)定的陽(yáng)性克隆(當(dāng)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，兩者的結(jié)合將會(huì)激活報(bào)道基因，并使陽(yáng)性克隆可測(cè))中分離出衍生自文庫(kù)的cDNA。cDNA編碼的蛋白可以通過(guò)將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌中，并使蛋白表達(dá)來(lái)制備。
除了HIS3基因之外，可使用例如Ade2基因，lacZ基因，CAT基因，熒光酶基因等作為報(bào)道基因。
還可以利用親和層析篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。例如，可將本發(fā)明的多肽固定在親和柱的載體上，將含有能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的待測(cè)化合物加到柱上。本文中的待測(cè)化合物可以是，例如細(xì)胞提取物，細(xì)胞裂解物等。在將待測(cè)化合物上樣后，對(duì)柱子進(jìn)行洗滌，并制得與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。
當(dāng)待測(cè)化合物是蛋白時(shí)，對(duì)獲得的蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，在該序列的基礎(chǔ)上合成寡核苷酸，并利用該寡核苷酸作為獲得編碼該蛋白的DNA的探針對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。
利用表面電漿共振(surface plasmon resonance)現(xiàn)象的生物傳感器可以作為對(duì)本發(fā)明中的結(jié)合化合物進(jìn)行測(cè)定或定量的手段。當(dāng)使用該生物傳感器時(shí)，僅利用微量且未標(biāo)記的多肽(例如，BIAcore，Pharmacia)，可以通過(guò)表面電漿共振信號(hào)對(duì)本發(fā)明多肽與待測(cè)化合物間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。因此，利用生物傳感器如BIAcore，能夠?qū)Ρ景l(fā)明多肽和待測(cè)化合物之間的結(jié)合進(jìn)行評(píng)價(jià)。
當(dāng)固定的本發(fā)明多肽暴露時(shí)，對(duì)會(huì)與合成的化學(xué)化合物，或天然物質(zhì)庫(kù)，或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)結(jié)合的分子進(jìn)行篩選的方法，和在組合化學(xué)技術(shù)(Wrighton等，Science 273458-64(1996)；Verdine，Nature 38411-13(1996)；Hogan，Nature 38417-9(1996))的基礎(chǔ)上，利用高通量篩選，從而使與本發(fā)明的蛋白結(jié)合的蛋白和化學(xué)化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)分離的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
另外，本發(fā)明的篩選方法可包括下述步驟
a)將候選化合物與細(xì)胞接觸，該細(xì)胞已導(dǎo)入了含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域和報(bào)道基因的載體，該載體在控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的條件下表達(dá)，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自C1958V1或C1958V2；b)測(cè)定所述報(bào)道基因的活性；和c)與對(duì)照對(duì)比，選出降低所述報(bào)道基因表達(dá)水平的化合物。
適合的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域所熟知的。進(jìn)行篩選所需的報(bào)道基因構(gòu)建體可以利用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域來(lái)加以制備。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域是本領(lǐng)域已知的時(shí)，可利用現(xiàn)有序列信息來(lái)制備報(bào)道基因構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域還未確定時(shí)，可以以標(biāo)記基因的核苷酸序列信息為基礎(chǔ)，從基因組文庫(kù)中分離出含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域的核苷酸片段。
經(jīng)篩選分離獲得的化合物是抑制本發(fā)明多肽活性、治療或預(yù)防屬于例如細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的疾病的候選藥物。通過(guò)添加、缺失和/或取代是保守的，化合物的部分結(jié)構(gòu)是用本發(fā)明的篩選方法獲得的，并具有與本發(fā)明多肽結(jié)合活性的化合物，包括在經(jīng)本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物之中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選劑的方法，該候選劑是治療細(xì)胞增殖性疾病的潛在靶。如上所討論的，通過(guò)控制C1958V1或C1958V2的表達(dá)水平，人們可以控制胰腺癌的進(jìn)攻和發(fā)展。因此，候選劑，其中候選劑是治療細(xì)胞增殖性疾病的潛在靶，是可以通過(guò)利用C1958V1或C1958V2的表達(dá)水平和活性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選而鑒定出的。在本發(fā)明正文中，所述篩選可以包括，例如下述步驟a)將候選化合物與表達(dá)C1958V1或C1958V2的細(xì)胞接觸；和b)與當(dāng)待測(cè)化合物不存在時(shí)測(cè)定的表達(dá)水平相比，選出降低C1958V1或C1958V2表達(dá)水平的化合物。
至少能表達(dá)C1958V1或C1958V2之一的細(xì)胞包括，如自胰腺癌建立的細(xì)胞系，所述細(xì)胞能在上述本發(fā)明的篩選方法中使用?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的方法評(píng)價(jià)表達(dá)水平。在篩選方法中，可以將C1958V1或C1958V2中至少一種的表達(dá)水平降低的化合物選作候選劑。
在篩選用于治療本發(fā)明的細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法利用本發(fā)明多肽的生物活性作為指標(biāo)。由于本發(fā)明的C1958V1或C1958V2蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖性的活性，因此促進(jìn)或抑制本發(fā)明所述蛋白之一的細(xì)胞增殖性活性的化合物可以是利用此活性作為指標(biāo)篩選獲得的。該篩選方法包括步驟(a)將待測(cè)化合物與本發(fā)明多肽接觸；(b)測(cè)定步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)與當(dāng)待測(cè)化合物不存在時(shí)測(cè)定的生物活性相比，選出抑制此多肽生物活性的化合物。
任何多肽都可以用于篩選，只要它們具有C1958V1或C1958V2蛋白的生物活性。所述生物活性包括人C1958V1或C1958V2蛋白的細(xì)胞增殖性。例如，可以使用人C1958V1或C1958V2蛋白，而且可以使用此蛋白的多肽功能等同物。所述多肽可以是細(xì)胞內(nèi)源或外源表達(dá)的。
可以使用任何待測(cè)化合物，如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物的提取物、植物提取物、純化的或粗蛋白、肽、非肽類(lèi)化合物、合成的微分子化合物、天然化合物。
通過(guò)此篩選方法分離的化合物是本發(fā)明多肽的拮抗劑的候選物。術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指通過(guò)與本發(fā)明多肽結(jié)合而抑制本發(fā)明多肽的功能的分子。另外，通過(guò)此篩選方法分離的化合物是抑制本發(fā)明多肽與分子(包括DNA和蛋白)體內(nèi)相互作用的候選物。
當(dāng)本方法中待測(cè)的生物活性是細(xì)胞增殖性時(shí)，可以通過(guò)制備表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞，在存在待測(cè)化合物的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，和測(cè)定該細(xì)胞增殖的速度，測(cè)量細(xì)胞周期等，以及通過(guò)測(cè)量菌落形成活性來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖性。
通過(guò)上述篩選方法分離獲得的化合物是抑制本發(fā)明多肽活性的藥物候選物，并且該化合物可用于治療與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病，如細(xì)胞增殖性疾病，包括癌癥。更具體地，當(dāng)C1958V1或C1958V2蛋白的生物活性作為指標(biāo)時(shí)，就將經(jīng)本發(fā)明的方法篩得的化合物作為治療胰腺癌藥物的候選物。
另外，通過(guò)添加、缺失和/或取代改變抑制C1958V1或C1958V2蛋白活性的化合物部分結(jié)構(gòu)的化合物，也包括在通過(guò)本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物之中。
當(dāng)將利用本發(fā)明的方法分離獲得的化合物作為治療細(xì)胞增殖性疾病(如癌癥)的藥物，對(duì)人和其它哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、荷蘭豬(guinea-pigs)、兔、雞、貓、狗、羊、豬、牛、猴、狒狒(baboon)、黑猩猩給藥時(shí)，該分離獲得的化合物是可以直接施用的，或者利用已知的藥物制備方法配成劑型。例如，根據(jù)需要，該藥物可以以糖衣片劑、膠囊、酏劑(elixirs)和微囊口服使用，或以無(wú)菌液或水懸浮液，或任何其它藥學(xué)上可接受液體的注射形式非口服使用。例如，可以以一般公認(rèn)的藥物施用所需的單位劑型，將該化合物與藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)，特別是無(wú)菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、載體、防腐劑、粘合劑和類(lèi)似物混合。對(duì)制劑中的活性成分進(jìn)行控制，從而使在給定范圍內(nèi)獲得合適劑量。
可與片劑、膠囊等混合的添加劑包括，粘合劑如凝膠、玉米淀粉、黃芪膠和阿拉伯樹(shù)膠；賦形劑如結(jié)晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和藻酸；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖和糖精；調(diào)味劑如薄荷、腺毛白珠樹(shù)(Gaultheria adenothrix)油和櫻桃。當(dāng)單位劑型為膠囊形式時(shí)，可進(jìn)一步將液體載體如油同上述添加劑一起使用。可根據(jù)常規(guī)制藥方法利用載體如注射用的蒸餾水制備注射用無(wú)菌組合物。
可用生理鹽水，葡萄糖和包括其它助劑(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉)的等滲溶液作為注射用的液體溶液。并可與合適的助溶劑如醇，尤其是乙醇，聚醇如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50結(jié)合使用。
芝麻油或豆油可作為油性液體，并可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結(jié)合使用，并可緩沖液如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)靜劑如鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)；穩(wěn)定劑如苯甲醇、苯酚；和抗氧化劑結(jié)合使用。制備的注射物可添加到合適的安培瓶中。
可用本領(lǐng)域熟知的方法對(duì)患者給藥，如動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮膚注射和鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)或口服給藥。給藥劑量和方法依賴于患者的年齡和體重而異；但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能對(duì)其進(jìn)行常規(guī)地選擇。如果所述藥物可被DNA編碼，則可將該DNA插入用于基因治療的載體，并施用該載體進(jìn)行治療。給藥劑量和方法依賴于患者的體重、年齡和癥狀而異，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可適合地對(duì)其進(jìn)行選擇。
例如，雖然依賴于癥狀而異，在對(duì)正常成人(體重60kg)口服給藥時(shí)，與本發(fā)明多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物劑量為約0.1mg-約100mg/天，優(yōu)選約1.0mg-約50mg/天，更優(yōu)選約1.0-約20mg/天。
當(dāng)對(duì)正常成人(體重60kg)非胃腸道給藥時(shí)，注射形式依賴于患者、靶器官、癥狀和給藥方法而異，但優(yōu)選靜脈注射劑量為約0.01mg-約30mg/天，優(yōu)選約0.1mg-約20mg/天，更優(yōu)選約0.1mg-約10mg/天。對(duì)于其它動(dòng)物種類(lèi)，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
另外，本發(fā)明提供了利用針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的方法。根據(jù)該方法，施用了針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體的藥學(xué)有效量。由于C1958V1或C1958V2蛋白的表達(dá)在癌癥細(xì)胞中上調(diào)，抑制這些蛋白的表達(dá)將會(huì)降低細(xì)胞增殖性，因此認(rèn)為通過(guò)將這些蛋白與抗體結(jié)合就能治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病。因此，以足以降低本發(fā)明蛋白的活性的劑量施用針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體，每天為0.1-約250mg/kg。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選約5mg-約10g/天，更優(yōu)選每天約100mg-約3g/天。
另外，可以將與細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)合的抗體用作藥物傳遞工具，其中該細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)腫瘤細(xì)胞是特異性的。例如，以足以損害腫瘤細(xì)胞的劑量施用與細(xì)胞毒性劑共軛的抗體。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，包括施用C1958V1或C1958V2蛋白或其免疫活性片段，或編碼該蛋白的多核苷酸或其片段的步驟。C1958V1或C1958V2蛋白或其免疫活性片段作為針對(duì)細(xì)胞增殖性疾病的疫苗是有利的。在某些情況下，可以將所述蛋白或其片段以與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的形式或由抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞(DC)或B-細(xì)胞呈遞的形式給藥。由于樹(shù)突細(xì)胞的強(qiáng)呈遞能力，在APCs中更優(yōu)選使用DC。
在本發(fā)明中，針對(duì)細(xì)胞增殖性疾病的疫苗是指在接種動(dòng)物后，具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性功能的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為由SEQ ID NO1或3編碼的多肽是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，它們能誘導(dǎo)有效的和針對(duì)胰腺癌細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，該胰腺癌細(xì)胞表達(dá)C1958V1或C1958V2。通常，抗腫瘤免疫性包括如下免疫應(yīng)答-誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識(shí)別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞因子產(chǎn)生。
因此，當(dāng)將某個(gè)蛋白給動(dòng)物接種后，該蛋白能誘導(dǎo)任一種所述免疫應(yīng)答時(shí)，就認(rèn)為該蛋白具有抗腫瘤免疫誘導(dǎo)效力。由該蛋白引起的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)是通過(guò)在體內(nèi)或體外對(duì)該宿主免疫系統(tǒng)針對(duì)該蛋白的應(yīng)答進(jìn)行觀察來(lái)測(cè)定的。
例如，用于測(cè)定誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法是已知的。進(jìn)入活體的外源物質(zhì)是由抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞的。由于抗原的刺激以及隨后的增殖(也就是由于T細(xì)胞的激活)，以抗原特異性方式，對(duì)APC呈遞的抗原起反應(yīng)的T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL)。因此，某肽引起的CTL誘導(dǎo)可以通過(guò)用APC將該肽呈遞給T細(xì)胞，并測(cè)定CTL的誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。另外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的效力。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫性中也是很重要的，則可利用這些細(xì)胞的激活效力作為指示劑，對(duì)該肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
利用樹(shù)突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)評(píng)價(jià)CTL誘導(dǎo)作用的方法是本領(lǐng)域已知的。樹(shù)突細(xì)胞是在抗原呈遞細(xì)胞中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的典型抗原呈遞細(xì)胞。在該方法中，先將待測(cè)多肽與樹(shù)突細(xì)胞接觸，然后將此樹(shù)突細(xì)胞與T細(xì)胞接觸。在T細(xì)胞與此樹(shù)突細(xì)胞接觸后，對(duì)具有針對(duì)感興趣細(xì)胞的細(xì)胞毒性效力的T細(xì)胞測(cè)定顯示該待測(cè)多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。例如，利用51Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞裂解物作為指示劑，對(duì)CTL的抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)定。另外，利用3H-胸腺嘧啶核苷吸收活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指示劑，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞損壞程度的方法也是已知的。
除樹(shù)突細(xì)胞之外，可以用外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為抗原呈遞細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，在存在GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)PBMC能提高CTL的誘導(dǎo)性。相似地，在存在匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7的條件下，培養(yǎng)PBMC能夠誘導(dǎo)CTL。
利用此方法證實(shí)具有CTL誘導(dǎo)活性的該待測(cè)多肽是具有樹(shù)突細(xì)胞激活效力和CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，能誘導(dǎo)CTL抗腫瘤細(xì)胞的多肽可作為抗腫瘤疫苗。另外，經(jīng)與該多肽接觸而獲得誘導(dǎo)CTL抗腫瘤活性的APC可作為抗腫瘤疫苗。另外，由于APC對(duì)該多肽抗原的呈遞而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可作為抗腫瘤疫苗。利用由APC和CTL引起的抗腫瘤免疫活性進(jìn)行的所述腫瘤治療方法稱為細(xì)胞免疫療法。
通常，當(dāng)用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫療法時(shí)，通過(guò)將具有不同結(jié)構(gòu)的多種多肽進(jìn)行組合，并與DC接觸而使CTL誘導(dǎo)效力增加是已知的。因此，當(dāng)用蛋白片段對(duì)樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行刺激時(shí)，優(yōu)選使用多種類(lèi)型的片段混合物。
另外，由多肽引起的抗腫瘤免疫活性可以通過(guò)對(duì)抗體產(chǎn)物針對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)進(jìn)行觀察來(lái)確定。例如，當(dāng)針對(duì)多肽的抗體已在用該多肽免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且當(dāng)此抗體能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，就斷定該多肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的能力。
通過(guò)施用本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫活性，而且抗腫瘤免疫活性的誘導(dǎo)能治療和預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病如胰腺癌?？拱┋煼ɑ虬┌Y攻擊的預(yù)防包括如下任一步驟如抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、癌癥衰退和抑制癌癥發(fā)生?；及﹤€(gè)體死亡率的降低、血液中腫瘤標(biāo)記物的減少、癌癥并發(fā)可測(cè)癥狀的緩和等都包括在癌癥治療和預(yù)防的范圍內(nèi)。其治療和預(yù)防效力優(yōu)選是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的。例如，觀察到的顯著性水平為5％或更低，其中抗細(xì)胞增殖性疾病疫苗的治療或預(yù)防效力是與未施用疫苗的對(duì)照進(jìn)行比較獲得的。例如，可利用Student T檢測(cè)法，Mann-Whitney U檢測(cè)法或ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
可以將上述具有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的載體與佐劑組合。佐劑是指在與具有免疫活性的蛋白聯(lián)合(或相繼)給藥時(shí)，能提高針對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答的化合物。佐劑的例子包括霍亂毒素、沙門(mén)氏菌毒素、礬等，但并不限于此。另外，可以將本發(fā)明的疫苗與藥學(xué)上可接受的載體適當(dāng)組合。所述載體的例子是無(wú)菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、培養(yǎng)液等。另外，如果需要疫苗可以包括穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等。疫苗采用全身性或局部給藥。疫苗給藥可以采用一次注射，或采用多次注射的加強(qiáng)給藥。
當(dāng)利用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時(shí)，可以通過(guò)體外方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集接受過(guò)治療或預(yù)防的受試對(duì)象的PBMC，在體外將該細(xì)胞與所述多肽接觸，并接著對(duì)APC或CTL進(jìn)行誘導(dǎo)，可以將該細(xì)胞施給受試對(duì)象。還可以在體外通過(guò)將編碼該多肽的載體導(dǎo)入PBMCs中，而使APC誘導(dǎo)?？梢栽诮o藥前，對(duì)體內(nèi)誘導(dǎo)的APC或CTL進(jìn)行克隆。通過(guò)對(duì)具有高破壞靶細(xì)胞活性的細(xì)胞進(jìn)行克隆和培養(yǎng)，能夠更有效地進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。另外，以此方式分離的APC和CTL可用于細(xì)胞免疫治療，該細(xì)胞免疫治療不僅針對(duì)該細(xì)胞所來(lái)自的個(gè)體，而且針對(duì)來(lái)自其他個(gè)體的相似類(lèi)型腫瘤。
另外，提供了含有藥學(xué)有效量的本發(fā)明多肽的治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病如癌癥的藥物組合物。該藥物組合物可用于提高抗腫瘤免疫性。C1958V1或C1958V2的正常表達(dá)主要在胎盤(pán)中觀察到，而很少在肝、甲狀腺、氣管或骨髓中觀察到。所以，抑制C1958V1或C1958V2基因可能并不會(huì)對(duì)其他器官產(chǎn)生不利影響。因此，優(yōu)選用C1958V1或C1958V2多肽治療細(xì)胞增殖性疾病，尤其是胰腺癌。在本發(fā)明中，將該多肽或其片段以足以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的劑量給藥，其范圍為0.1mg-10mg，優(yōu)選0.3mg-5mg，更優(yōu)選0.8mg-1.5mg?？梢灾貜?fù)給藥。例如，每隔兩周施用1mg肽或其片段，共4次，從而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫活性。
下述實(shí)施例意在闡明本發(fā)明，并幫助普通技術(shù)人員能夠制造和使用相同的發(fā)明。實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所一般理解具有相同的意思。雖然，在實(shí)踐和檢測(cè)本發(fā)明時(shí)，可以使用與本文所述方法和材料相似或等同的方法和材料，但適合的方法和材料在下面進(jìn)行描述。將本文引證的任何專利、專利申請(qǐng)和公開(kāi)物都引入以供參考。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式通過(guò)下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不限制到這些實(shí)施例。
1.材料和方法(1)細(xì)胞系和臨床材料人胰腺癌細(xì)胞系Capan-1，Capan-2，Panc-1，Aspc-1和MIApaca-2，KLM-1和PK59是由Dr.Jae-Gahb Park(韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù)，Tumor ResearchInstitute，Seoul National University College of Medicine，韓國(guó))惠贈(zèng)的。將所有細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如培養(yǎng)Capan-1，Capan-2和Aspc-1的RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)；培養(yǎng)MIApaca-2，Panc-1，COS7的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在各培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清(Cansera)和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。將細(xì)胞保存于37℃，空氣濕度為5％CO2。臨床樣本(胰腺癌和正常胰導(dǎo)管)獲自外科樣本，所用樣品所有患者均表示同意。
(2)在我們的cDNA芯片中以點(diǎn)#C1958表示的新人基因的分離cDNA微分析載玻片的制造已有描述(Ono等，2000)。為了對(duì)各表達(dá)譜進(jìn)行分析，制備出含有23,040個(gè)cDNA點(diǎn)的載玻片復(fù)制體(dupl.icate sets ofslides)，從而降低實(shí)驗(yàn)的波動(dòng)性。簡(jiǎn)單的講，從各激光微切細(xì)胞樣本中分離出總RNA，進(jìn)行以T7為基礎(chǔ)的RNA擴(kuò)增，從而獲得用于芯片實(shí)驗(yàn)所需的足夠RNA量。利用逆轉(zhuǎn)錄，分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)對(duì)從胰腺癌細(xì)胞和正常胰導(dǎo)管細(xì)胞擴(kuò)增出的RNA等分試樣進(jìn)行標(biāo)記。如現(xiàn)有技術(shù)(Ono等，2000)所述進(jìn)行雜交，洗滌和測(cè)定。在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)上調(diào)的基因中，發(fā)明人聚焦于自定義鑒定號(hào)為C1958的基因，因?yàn)樵诙嘤?0％的信息性胰腺癌例中，該基因的表達(dá)率大于5.0。
(3)Northern印跡分析將人多個(gè)組織的Northern印跡(Clontech，Palo Alto，CA)與[α32P]-dCTP-標(biāo)記的C1958擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，其中C1958擴(kuò)增產(chǎn)物是利用RT-PCR(見(jiàn)下)制得的。按照提供商的推薦方案進(jìn)行預(yù)雜交，雜交和洗滌。于-80℃，用強(qiáng)化掩蔽(intensifying screens)對(duì)印跡進(jìn)行10天自顯影。利用如下的特異性引物對(duì)5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO5)和5’-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3’(SEQ ID NO6)，通過(guò)PCR制備C1958外顯子4的特異性探針。
(4)半定量的RT-PCR分析將從激光微切的細(xì)胞臨床樣品中提取獲得的總RNAs加至350μl RLT裂解緩沖液(QIAGEN，Hilden，Germany)中，在1單位Rnase抑制劑(TOYOBO，Osaka，Japan)存在的條件下，將提取的RNAs用DNase I(Roche，Basel，Switzerland)處理，以去除所有污染的基因組DNA。在用DNase I處理后，按照制造商的推薦方案，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)對(duì)RNA進(jìn)行純化。對(duì)所有用DNase I處理的RNA都進(jìn)行以T7為基礎(chǔ)的RNA擴(kuò)增。按照制造商的方案，利用TTIzol試劑(Invitrogen)從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。每個(gè)提取的RNA都用DNase I(Roche)進(jìn)行處理。
利用隨機(jī)引物(Roche)或寡(dT)16引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche)，將擴(kuò)增的RNA或總RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNAs。通過(guò)監(jiān)測(cè)作為定量對(duì)照的微管蛋白，alpha 3(TUBA3)，制得適合用于隨后PCR擴(kuò)增的各單鏈cDNA稀度。引物序列為5′-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3′(SEQ ID NO7)和5′-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3′(SEQ ID NO8)，TUBA3所用；5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO9)和5’-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3’(SEQ ID NO10)，C1958所用。所有反應(yīng)包括在Gene Amp PCR system 9700(PE Applied Biosystems)上，在94℃進(jìn)行首次變性2分鐘，接著進(jìn)行如下22個(gè)循環(huán)(用于TUBA3)或28個(gè)循環(huán)(用于C1958)94℃30秒，58℃30秒和72℃1分鐘。
(5)表達(dá)載體的構(gòu)建用引物C1958V1-正向(5’-CCGGAATTCGACATGGGGCTTAAGATGTCC-3’(SEQ ID NO11))和C1958V1-反向(5’-CCGCTCGAGGGCTTCTGGGTCGATTTCTCC-3’(SEQ IDNO12))RT-PCR擴(kuò)增出C1958V1 cDNA的完整編碼序列。將該產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+).myc.his(Invitrogen)的EcorI和XhoI位點(diǎn)，其攜帶細(xì)胞巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和新霉素抗性基因。利用DNA測(cè)序?qū)υ摻Y(jié)構(gòu)(pcDNA3.1(+)-C1958-myc-his)進(jìn)行確定。
(6)免疫細(xì)胞化學(xué)染色按照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用Fugene6(Roche)，將pcDNA3.1(+)-C1958V1-myc-his瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞，然后用含4％多聚甲醛的PBS固定COS7細(xì)胞15分鐘，在4℃用含0.1％Triton X-100的PBS通透2.5分鐘。在4℃，在PBS中用3％BSA將該細(xì)胞封閉12小時(shí)，阻斷非特異性雜交，用1∶1000稀釋的小鼠抗-myc抗體(Sigma)進(jìn)行孵育。在用PBS洗后，細(xì)胞用FITC結(jié)合的抗小鼠二抗(organon Teknika)染色。核仁用4’，6’-聯(lián)脒-2’-苯基吲哚二鹽酸(4’，6’-diamidine-2’-phenylindoledihydrochloride，DAPI)復(fù)染。在ECLIPSE E800顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)下獲得熒光圖像。
(7)Western印跡分析按照制造商的說(shuō)明書(shū)，利用FuGene 6(Roche)，將pcDNA3.1(+)-C1958-myc-his瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞，然后用PBS洗兩次，并在裂解緩沖液(150mM NaCl，1％ Triton X-100，50mM Tris-HCl pH 7.4，1mM DTT，和1X完全蛋白酶抑制劑Cocktail(Boehringer))中收集。在細(xì)胞勻漿后，以10,000xg離心30分鐘，利用Bradford法(Bio-Rad)測(cè)定上清液的蛋白濃度。用12％SDS-PAGE將蛋白分開(kāi)，并用鼠抗-myc(SANTA CRUZ)抗體進(jìn)行免疫印跡。
(8)psiU6X3.0的構(gòu)建由于snRNAU6基因已知能夠被RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，其在3’末端產(chǎn)生具有尿苷的短轉(zhuǎn)錄物，我們利用引物對(duì)5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQ ID NO13)，和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQ ID NO14)，以人胎盤(pán)DNA作為模板，對(duì)含有其啟動(dòng)子域的snRNA U6基因的基因組片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化產(chǎn)物，并按照供應(yīng)商的方案(Invitrogen)，利用TA cloning kit將產(chǎn)物克隆至pCR質(zhì)粒載體內(nèi)。純化含有snRNA U6基因的BamHI，XhoI片段，并克隆至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的1257至56核苷酸片段內(nèi)，其用引物對(duì)5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ ID NO15)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用連接的DNA作為PCR模板，引物為5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQ IDNO17)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQ IDNO18)。用HindIII消化產(chǎn)物，隨后其自連獲得psiU6BX3.0載體質(zhì)粒。對(duì)于對(duì)照，通過(guò)將雙鏈寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO19)和
5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO20)克隆至psiU6BX3.0載體的BbsI位點(diǎn)內(nèi)，制得psiU6BX-EGFP。
(9)C1958V1的基因沉默效應(yīng)通過(guò)將雙鏈寡核苷酸克隆至表達(dá)psiU6BX3.0載體內(nèi)制得siRNAs質(zhì)粒。C1958的靶序列是5’-CGACAAGCACCTGGACGTG-3’(SEQ ID NO25)，5’-ATGTGTGTCAGCAGCAGCA-3’(SEQ ID NO26)，5’-TCCAGCCTGTCCACTTCCA-3’(SEQ ID NO27)和5’-GTTGTTTTACAGATACGGA-3’(SEQ ID NO28)。將來(lái)自KLM-1和PK59細(xì)胞系的人胰腺細(xì)胞種在10-cm培養(yǎng)皿上(KLM-1；2.5×105細(xì)胞/皿，PK59；5×105細(xì)胞/皿)，并按照供應(yīng)商的推薦方案(Roche)，利用FuGene 6試劑，轉(zhuǎn)染psiU6BX-EGFP，或psiU6BX-C1958V1。在轉(zhuǎn)染7天后，提取細(xì)胞總RNA，然后利用C1958V1和β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)的特異性引物作為內(nèi)參；C1958的引物為5’-GTCCTGAAAGTCAAGCACCTG-3’(SEQ ID NO21)和5’-GAAGTTCTTGTTGGTGCTTATGG-3’(SEQ ID NO22)，ACTB的引物為5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ ID NO23)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ ID NO24)，通過(guò)半定量RT-PCR確定siRNAs的擊倒(konckdown)作用。另外，利用KLM-1和PK59細(xì)胞系，表達(dá)siRNAs的轉(zhuǎn)染子在含0.6mg/ml新霉素的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)9天。在用4％的多聚甲醛固定后，用Giemsa溶液使轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色來(lái)測(cè)定克隆形成。用MTT法量化細(xì)胞活性。在含新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，加入濃度為0.5mg/ml的MTT溶液(3-(4，5-二甲噻基-2-基)-2，5-二苯基四唑溴鹽)(Sigma)。在37℃孵育4小時(shí)，加入酸性-SDS(0.01N HCl/10％SDS)；劇烈攪拌懸浮液，然后，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使黑藍(lán)晶體溶解。用Microplate Reader550(Biorad)測(cè)定570nm吸光度。
2.結(jié)果(1)鑒定C1958在胰腺癌細(xì)胞中為上調(diào)基因當(dāng)利用代表23,040個(gè)人基因(Nakamura等，2003)的cDNA芯片，對(duì)獲自18名胰腺癌患者的癌細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行分析時(shí)，鑒定出一般有265個(gè)基因在胰腺癌細(xì)胞中是上調(diào)的。在這些基因中，本發(fā)明人重點(diǎn)關(guān)注自定編號(hào)為C1958的基因，該基因符合NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的ESTHs.40530(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)。與正常胰導(dǎo)管相比，該基因的表達(dá)在9個(gè)胰腺癌中有7個(gè)是提高的，比芯片中的基值(cut-off)具有更高的信號(hào)強(qiáng)度(圖1(a))。隨后與正常胰導(dǎo)管相比，半定量RT-PCR分析證實(shí)12個(gè)胰腺癌中有10個(gè)，5個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中有2個(gè)表達(dá)是提高的(圖1(b))。
利用從胰腺癌細(xì)胞系Capan-1制得的cDNA文庫(kù)，通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)將C1958基因分離。有3種不同的轉(zhuǎn)錄變體，由4個(gè)，4個(gè)和2個(gè)外顯子組成(圖2，分別為(a)C1958V1(GenBank登錄號(hào)AB115764)，(b)C1958V2(GenBank登錄號(hào)AB115765)和(c)C1958V3(GenBank登錄號(hào)AB115766))，位于染色體16q，基因組長(zhǎng)度約為43kb。外顯子1和3有差異，外顯子2是C1958V1和C1958V2共有的，外顯子4是所有變體共有的。C1958V2變體的外顯子1b比C1958V1 5’端的外顯子1a長(zhǎng)34bp，外顯子3b比C1958V1 5’端的外顯子3a短22bp，在外顯子3b內(nèi)部產(chǎn)生了新終止密碼子。C1958V1(SEQ ID NO1)和C1958V2(SEQ ID NO3)變體的全長(zhǎng)cDNA序列分別包括881和893個(gè)核苷酸。C1958V1和C1958V2的開(kāi)放閱讀框從外顯子2內(nèi)部開(kāi)始，但翻譯的起始位點(diǎn)位于C1958V3變體的外顯子3c內(nèi)。
利用cDNA片段C1958作為探針，對(duì)多種組織印跡的Northern分析(參見(jiàn)Material and Method，圖2)顯示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物約為1.8kb和1.2kb(圖3(a1-3))。1.8kb轉(zhuǎn)錄物在淋巴結(jié)中表達(dá)相對(duì)高些，在胃、導(dǎo)管和骨髓中表達(dá)較弱。另外，1.2kb轉(zhuǎn)錄物在胎盤(pán)中表達(dá)非常豐富，在肝、甲狀腺、導(dǎo)管和骨髓中則較弱。另外，利用相同的探針，對(duì)胰腺癌細(xì)胞系印跡的Northern印跡分析顯示轉(zhuǎn)錄物約為1.2kb(圖3(b))。
為了研究C1958V1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)C1958V1蛋白的質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-C1958V1-myc-his)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中。如圖4(a)所示，免疫組織化學(xué)染色顯示該C1958V1產(chǎn)物位于COS7細(xì)胞的細(xì)胞器中。另外，C1958V1翻譯得到的基因產(chǎn)物比Western印跡分析預(yù)測(cè)的基因產(chǎn)物更長(zhǎng)，表明這可能是因?yàn)榉g后修飾產(chǎn)生的(圖4(b))。
(2)意欲降低C1958表達(dá)的小型干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效力為了對(duì)C1958V1的生長(zhǎng)促進(jìn)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，我們利用以哺乳動(dòng)物載體為基礎(chǔ)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)，在KLM-1和PK59細(xì)胞(胰腺癌細(xì)胞系)中敲除了內(nèi)源C1958的表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了檢測(cè)(參見(jiàn)材料和方法Materials and Methods)。如圖5(a)所示，導(dǎo)入psiU6BX-C1958V1(Si8-5和Si 11-3)使C1958V1轉(zhuǎn)錄物在KLM-1細(xì)胞系中的表達(dá)明顯降低，而用對(duì)照質(zhì)粒(psiU6BX-EGFP siRNA表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中則未觀察到任何作用。為了確定由psiU6BX-C1958V1引起的基因特異性生長(zhǎng)降低，我們對(duì)相同的兩種細(xì)胞系進(jìn)行了克隆形成分析；如圖5(b)和5(d)所示，導(dǎo)入psiU6BX-C1958V1(Si 8-5)明顯抑制KLM-1和PK59細(xì)胞的生長(zhǎng)，與上述降低表達(dá)的結(jié)果相一致，psiU6BX-C1958V1(Si 11-3)也中度抑制兩種細(xì)胞系的生長(zhǎng)，psiU6BX-C1958V1(Si 1-8)也抑制PK59細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，MTT法也顯示當(dāng)利用psiU6BX-C1958V1(Si 1-8，Si 8-5和Si 11-3)抑制C1958V1表達(dá)時(shí)，會(huì)抑制KLM1和/或PL59細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5(c)，5(e))。每個(gè)結(jié)果都用3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了核實(shí)。
工業(yè)實(shí)用性與非癌性胰腺組織相比，新的人基因C1958V1或C1958V2的表達(dá)在胰腺癌中顯著提高。因此，這些基因可以作為癌癥的診斷性標(biāo)記物，且其編碼的蛋白可以在癌癥的診斷性分析中使用。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)被相應(yīng)于C1958V1或C1958V2基因的反義寡核苷酸或小型干擾RNA所抑制。該發(fā)現(xiàn)說(shuō)明C1958V1或C1958V2蛋白均刺激致癌活性。因此，這些新的致癌蛋白均是抗癌藥物開(kāi)發(fā)的有用靶。例如，封閉C1958V1或C1958V2表達(dá)或阻止其活性的試劑可以發(fā)現(xiàn)其作為抗癌癥劑，尤其是胰腺癌治療的抗癌癥劑的治療效用。所述抗癌癥劑的例子包括反義寡核苷酸、小型干擾RNA和識(shí)別C1958V1或C1958V2的抗體。
雖然已經(jīng)詳細(xì)并以其特定的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下對(duì)其進(jìn)行各種改變和修改。
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序列表<110>腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO<120>與人胰腺癌相關(guān)的基因和多肽<130>ONC-A0217Y1P2<150>US 60/414,872<151>2002-09-30<150>US 60/450,889<151>2003-02-28<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>881<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(163)..(390)<223>
<400>1gggccatgac ccccgctgct ctgtcttgca ggctcgtcgc cgcggccccc cgagcccgac 60cgccgccgcc accaccacca gcgcccgggc gggcctcgcg cgcctcgggc gcggctccgc 120agtgagccca ccaagaagga agcggcctgc agaggtgccg ac atg ggg ctt aag174Met Gly Leu Lys1atg tcc tgc ctg aaa ggc ttt caa atg tgt gtc agc agc agc agc agc 222Met Ser Cys Leu Lys Gly Phe Gln Met Cys Val Ser Ser Ser Ser Ser5 10 15 20agc cac gac gag gcc ccc gtc ctg aac gac aag cac ctg gac gtg ccc 270Ser His Asp Glu Ala Pro Val Leu Asn Asp Lys His Leu Asp Val Pro25 30 35gac atc atc atc acg ccc ccc acc ccc acg ggc atg atg ctg ccg agg 318Asp Ile Ile Ile Thr Pro Pro Thr Pro Thr Gly Met Met Leu Pro Arg40 45 50gac ttg ggg agc aca gtc tgg ctg gat gag aca ggg tcg tgc cca gat 366Asp Leu Gly Ser Thr Val Trp Leu Asp Glu Thr Gly Ser Cys Pro Asp
55 60 65gat gga gaa atc gac cca gaa gcc tgaggaggtg tcctgggttt ggctggctgg 420Asp Gly Glu Ile Asp Pro Glu Ala70 75ctcctgctcc agcggcccgg cttcaggtgt ccgggggcgt ggctgcctgg agcaggtgtg 480ctgaataccc tggatgggaa ctgagcgaac ccgggcctcc gctcagagag acgtggcagg 540accagcgagg aatccagcct gtccacttcc agaacagtgt ttcccaggcc ccgctgagtg 600gaccggacct ctgacacctc caggttcttg ctgactccgg cctggtgaaa gggagcgcca 660tggtcctggc tgttggggtc ccagggagag gctctcttct ggacaaacac accctcccag 720cccccagggc tgtgcaaaca catgcccctg ccataagcac caacaagaac ttcttgcagg 780tggagtggct gttttttata agttgtttta cagatacgga aacagtccaa aatgggattt 840ataatttctt ttttgcatta taaataaaga tcctctgtaa c 881<210>2<211>76<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Leu Lys Met Ser Cys Leu Lys Gly Phe Gln Met Cys Val Ser1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Ser His Asp Glu Ala Pro Val Leu Asn Asp Lys His20 25 30Leu Asp Val Pro Asp Ile Ile Ile Thr Pro Pro Thr Pro Thr Gly Met35 40 45Met Leu Pro Arg Asp Leu Gly Ser Thr Val Trp Leu Asp Glu Thr Gly50 55 60Ser Cys Pro Asp Asp Gly Glu Ile Asp Pro Glu Ala65 70 75<210>3<211>893<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(197)..(256)
<223>
<400>3ccgcgggagg cgcgcggctg cccgagcgcc ggccgggcca tgacccccgc tgctctgtct 60tgcaggctcg tcgccgcggc cccccgagcc cgaccgccgc cgccaccacc accagcgccc 120gggcgggcct cgcgcgcctc gggcgcggct ccgcagtgag cccaccaaga aggaagcggc 180ctgcagaggt gccgac atg ggg ctt aag atg tcc tgc ctg aaa gca gca gca 232Met Gly Leu Lys Met Ser Cys Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10gca gcc acg acg agg ccc ccg tcc tgaacgacaa gcacctggac gtgcccgaca 286Ala Ala Thr Thr Arg Pro Pro Ser15 20tcatcatcac gccccccacc cccacgggca tgatgctgcc gagggacttg gggagcacag 346tctggctgga tgagacaggg tcgtgcccag atgatggaga aatcgaccca gaagcctgag 406gaggtgtcct gggtttggct ggctggctcc tgctccagcg gcccggcttc aggtgtccgg 466gggcgtggct gcctggagca ggtgtgctga ataccctgga tgggaactga gcgaacccgg 526gcctccgctc agagagacgt ggcaggacca gcgaggaatc cagcctgtcc acttccagaa 586cagtgtttcc caggccccgc tgagtggacc ggacctctga cacctccagg ttcttgctga 646ctccggcctg gtgaaaggga gcgccatggt cctggctgtt ggggtcccag ggagaggctc 706tcttctggac aaacacaccc tcccagcccc cagggctgtg caaacacatg cccctgccat 766aagcaccaac aagaacttct tgcaggtgga gtggctgttt tttataagtt gttttacaga 826tacggaaaca gtccaaaatg ggatttataa tttctttttt gcattataaa taaagatcct 886ctgtaac 893<210>4<211>20<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Gly Leu Lys Met Ser Cys Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr1 5 10 15Arg Pro Pro Ser20
<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>5gtcctgaaag tcaagcacct g21<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>6gaagttcttg ttggtgctta tgg 23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>7cttgggtctg taacaaagca ttc 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>8aaggattatg aggaggttgg tgt 23<210>9<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>9gtcctgaaag tcaagcacct g21<210>10<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>10gaagttcttg ttggtgctta tgg 23<210>11<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>11ccggaattcg acatggggct taagatgtcc 30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>12ccgctcgagg gcttctgggt cgatttctcc 30<210>13<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>13
ggggatcagc gtttgagtaa 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>14taggccccac ctccttctat 20<210>15<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>15tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30<210>16<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>16ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca29<210>17<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>17tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct40<210>18
<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>18tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca 37<210>19<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成靶序列<400>19caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>20<211>51<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成靶序列<400>20aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c 51<210>21<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>21gtcctgaaag tcaagcacct g21<210>22<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>22gaagttcttg ttggtgctta tgg 23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>23catccacgaa actaccttca act 23<210>24<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于RT-PCR的人工合成的引物序列<400>24tctccttaga gagaagtggg gtg 23<210>25<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的靶序列<400>25cgacaagcac ctggacgtg 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的靶序列<400>26atgtgtgtca gcagcagca 19
<210>27<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的靶序列<400>27tccagcctgt ccacttcca 19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的靶序列<400>28gttgttttac agatacgga 19
權(quán)利要求
1.一種基本純的多肽，選自(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述多肽的分離的多核苷酸。
3.一種含有權(quán)利要求2所述多核苷酸的載體。
4.一種含有權(quán)利要求2所述多核苷酸或權(quán)利要求3所述載體的宿主細(xì)胞。
5.一種制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞；(b)使宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和(c)收集表達(dá)的多肽。
6.與權(quán)利要求1所述多肽結(jié)合的抗體。
7.一種與權(quán)利要求2所述的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)的多核苷酸，且其含有至少15個(gè)核苷酸。
8.針對(duì)權(quán)利要求2所述多核苷酸的反義多核苷酸或小型干擾RNA。
9.權(quán)利要求8所述的小型干擾RNA，其中有意義鏈選自含有核苷酸序列SEQ ID NO25，26和28的核苷酸。
10.一種診斷胰腺癌的方法，所述方法包括以下步驟(a)測(cè)定生物標(biāo)本樣品中編碼氨基酸序列SEQ ID NO2或4的基因的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的上升與疾病相聯(lián)系。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中表達(dá)水平通過(guò)下述任一方法進(jìn)行測(cè)定(a)測(cè)定編碼氨基酸序列SEQ ID NO2或4的mRNA，(b)測(cè)定含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的蛋白，和(c)測(cè)定含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的蛋白的生物學(xué)活性。
12.一種篩選治療胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將待測(cè)化合物與多肽接觸，所述多肽選自(1)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性；(b)測(cè)定多肽和待測(cè)化合物的結(jié)合活性；和(c)選出與多肽結(jié)合的化合物。
13.一種篩選治療胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與表達(dá)一種或多種多核苷酸的細(xì)胞接觸，所述多核苷酸含有核苷酸序列SEQ ID NO1或3；和(b)與待測(cè)化合物不存在時(shí)測(cè)定的表達(dá)水平相比，選出降低一種或多種多核苷酸表達(dá)水平的化合物，所述多核苷酸含有核苷酸序列SEQ ID NO1或3。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。
15.一種篩選治療胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將待測(cè)化合物與多肽接觸，所述多肽選自(1)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性；(b)測(cè)定步驟(a)所述多肽的生物學(xué)活性；和(c)與待測(cè)化合物不存在時(shí)測(cè)定的生物學(xué)活性相比，選出抑制該多肽生物學(xué)活性的化合物。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖活性。
17.一種篩選治療胰腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將候選化合物與導(dǎo)入了含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域和報(bào)道基因的載體的細(xì)胞接觸，所述報(bào)道基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)調(diào)控下表達(dá)，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因含有選自由SEQ IDNO1或3組成的任一核苷酸序列，(b)測(cè)定所述報(bào)道基因的活性；和(c)與對(duì)照相比，選出降低所述報(bào)道基因表達(dá)水平的化合物。
18.一種治療胰腺癌的組合物，所述組合物含有藥學(xué)有效量的作為活性成分的針對(duì)多核苷酸的反義多核苷酸或小型干擾RNA，和藥學(xué)上可接受的載體，所述多核苷酸編碼選自下述的多肽(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
19.一種治療胰腺癌的組合物，所述組合物含有藥學(xué)有效量的作為活性成分的針對(duì)多肽的抗體，和藥學(xué)上可接受的載體，所述多肽選自(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
20.一種治療胰腺癌的組合物，所述組合物含有藥學(xué)有效量的作為活性成分的化合物，和藥學(xué)上可接受的載體，所述化合物是經(jīng)權(quán)利要求12-17中任一方法選出的。
21.一種治療胰腺癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的針對(duì)多核苷酸的反義多核苷酸或小型干擾RNA的步驟，所述多核苷酸編碼選自下述的多肽(1)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(2)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ IDNO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(3)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
22.一種治療胰腺癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的針對(duì)多肽的抗體的步驟，所述多肽選自(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
23.一種治療胰腺癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的經(jīng)權(quán)利要求12-17所述任一方法選出的化合物的步驟。
24.一種治療或預(yù)防胰腺癌的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的選自(a)-(c)組的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；和(c)由多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
25.一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括將選自(a)-(c)組的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a該多肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；(c)由多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
26.權(quán)利要求25所述的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的方法，其中該方法還包括將抗原呈遞細(xì)胞施給受試者的步驟。
27.一種治療或預(yù)防胰腺癌的藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)有效量的作為活性成分的選自(a)-(c)的多肽或編碼該多肽的多核苷酸，和藥學(xué)上可接受的載體(a)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；(b)含有氨基酸序列SEQ ID NO2或4的多肽或其片段，其中該多肽被取代、缺失、插入和/或添加有一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的蛋白等同的生物學(xué)活性；(c)由多核苷酸編碼的多肽或其片段，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO1或3組成的多核苷酸雜交，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO2或4組成的多肽等同的生物學(xué)活性。
28.權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述多核苷酸被并入表達(dá)載體內(nèi)。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N新的人基因C1958V1或C1958V2，與相應(yīng)非癌組織相比，其在胰腺癌中的表達(dá)顯著提高。該基因和該基因編碼的多肽可以例如在診斷胰腺癌中使用，作為靶分子或開(kāi)發(fā)抵抗疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1703524SQ0382550
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者中村佑輔, 片桐豐雅 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司, 國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)